JPH08242850A - Ｄ−ソルビトールデヒドロゲナーゼ、その製造法、及び該酵素を用いたケトース類の製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 これまでに単離されたものと異なる、Ｄ−ソ
ルビトールからＬ−ソルボースへの酸化を触媒する新規
な酵素の提供。 【解決手段】 Ｄ−ソルビトールからＬ−ソルボースへ
の酸化を触媒する精製形態におけるＤ−ソルビトールデ
ヒドロゲナーゼは、分子量７９，０００±５，０００の
同族サブユニットから成る分子構造、ポリオール類に関
する基質特異性、及び６．０〜７．０の至適ｐＨを有す
る。該Ｄ−ソルビトールデヒドロゲナーゼは、グルコノ
バクテル又はアセトバクテル属に属する微生物、あるい
は細胞中でＤ−ソルビトールデヒドロゲナーゼを生産す
ることができるその突然変異体又は変異株を培養し、例
えば細胞を破壊し、破壊細胞の無細胞抽出物から単離す
ることにより、細胞からそれを単離することを含む方法
により製造される。かくして単離されるＤ−ソルビトー
ルデヒドロゲナーゼは、Ｄ−ソルビトールからＬ−ソル
ボースへの酸化を触媒するのに有用であり、後者はビタ
ミンＣの製造のための重要な中間体である。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】本発明は新規なＤ−ソルビトールデヒドロ
ゲナーゼ、その製造法、及び該酵素を用いたケトース
類、特にＬ−ソルボースの製造法に関する。

【０００２】上記の通り、本発明により提供される新規
なＤ−ソルビトールデヒドロゲナーゼ（後文ではＳＬＤ
Ｈと呼ぶ）はＤ−ソルビトールからＬ−ソルボースへの
酸化を触媒する。Ｌ−ソルボースはビタミンＣの製造に
おける重要な中間体である。

【０００３】Ｄ−ソルビトールからＬ−ソルボースへの
酸化を触媒する酵素は既知である。Ｊ．Ｔ．Ｃｕｍｍｉ
ｎｓ，Ｔ．Ｅ．Ｋｉｎｇ ａｎｄ Ｖ．Ｈ．Ｃｈｅｌｄ
ｅｌｉｎ（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２２４，３２３
−３２９，１９５７）は、アセトバクテル・スボキシダ
ンス（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｓｕｂｏｘｙｄａｎ
ｓ）（グルコノバクテル・スボキシダンス（Ｇｌｕｃｏ
ｎｏｂａｃｔｅｒ ｓｕｂｏｘｙｄａｎｓ）と同義）の
無細胞抽出物がＤ−ソルビトール酸化の経路に関与する
３つの酵素を含むことを報告した。Ｄ−ソルビトールか
らＬ−ソルボースへの酸化を触媒するこれらの酵素の２
つが精製された。１つはニコチンアミドアデニンジヌク
レオチドホスフェート（後文ではＮＡＤＰと呼ぶ）−依
存性Ｌ−ソルボースレダクターゼとして、グルコノバク
テル・メラノゲヌス（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ ｍ
ｅｌａｎｏｇｅｎｕｓ）ＩＦＯ ３２９３の可溶性画分
から、Ｔ．Ｓｕｇｉｓａｗａ，Ｔ．Ｈｏｓｈｉｎｏ ａ
ｎｄ Ａ．Ｆｕｊｉｗａｒａにより単離され（Ａｇｒｉ
ｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，５５，２０４３−２０４
９，１９９１）、他は膜−結合Ｄ−ソルビトールデヒド
ロゲナーゼとして、グルコノバクテル・スボキシダンス
変異株α ＩＦＯ ３２５４から、Ｅ．Ｓｈｉｎａｇａ
ｗａ，Ｋ．Ｍａｔｓｕｓｈｉｔａ，Ｏ．Ａｄａｃｈｉ
ａｎｄ Ｍ．Ａｍｅｙａｍａにより単離された（Ａｇｒ
ｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，４６，１３５−１４１，
１９８２）。

【０００４】しかし、本発明により提供されるＳＬＤＨ
は、酵素のサブユニットの構造、分子量、基質特異性及
び至適ｐＨにおいて、上記の２つの酵素と明白に異な
る。ＮＡＤＰ−依存性Ｌ−ソルボースレダクターゼの分
子量は６０，０００であるが、本発明により提供される
ＳＬＤＨの分子量は、７９，０００±５，０００の分子
量を有する同族（ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ）サブユニット
から成り、反応を触媒するためにＮＡＤＰを必要としな
い。他方、Ｅ．Ｓｈｉｎａｇａｗａ ｅｔ ａｌ．によ
り単離された膜−結合Ｄ−ソルビトールデヒドロゲナー
ゼは、分子量が６３，０００、５１，０００及び１７，
０００の３種のサブユニットから成り、Ｄ−ソルビトー
ルを特異的に酸化し、及びＤ−ソルビトールの場合の５
％の反応速度でＤ−マンニトールも酸化するが、Ｄ−ア
ラビトール又はエリトリトールを酸化しなかった。さら
に彼らは酵素の至適ｐＨが４．５であり、酵素活性がｐ
Ｈ５．０において安定であり、ｐＨ７．０において活性
の９２％が失われることを示した。しかし、本発明のＳ
ＬＤＨはＤ−ソルビトール及びＤ−マンニトールのみで
なくＤ−アラビトール及びエリトリトールも酸化し、至
適ｐＨは６．０であり、ｐＨ８．０においてさえ活性は
安定である。

【０００５】本発明の目的は、Ｄ−ソルビトールに作用
してＬ−ソルボースを製造し（すなわちＤ−ソルビトー
ルからＬ−ソルボースへの酸化を触媒する）且つ以下の
理化学的性質： ａ）分子構造：７９，０００±５，０００の分子量を有
する同族サブニットから成る、 ｂ）基質特異性：ポリオール類に対して活性 ｃ）至適ｐＨ：６．０〜７．０ を有する精製された形態の新規な酵素ＳＬＤＨを提供す
ることである。

【０００６】本発明の他の目的は、グルコノバクテル
（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ）又はアセトバクテル
（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ）属に属する微生物、あるい
は細胞中でＳＬＤＨを生産することができるその突然変
異体を培養し、細胞を破壊し、それを破壊細胞の無細胞
画分から、好ましくは微生物の膜画分から単離及び精製
することにより新規な酵素ＳＬＤＨを製造する方法を提
供することである。本発明のさらに別の目的は、該酵素
ＳＬＤＨを用いてＬ−ソルボースを製造する方法を提供
することである。

【０００７】後述の実施例に従って製造される新規なＳ
ＬＤＨの精製試料の理化学的性質は以下の通りである： １）酵素活性 本発明の新規なＳＬＤＨは、以下の反応式に従い、電子
受容体の存在下におけるＤ−ソルビトールからＬ−ソル
ボースへの酸化を触媒する： Ｄ−ソルビトール＋電子受容体→Ｌ−ソルボース＋還元
電子受容体 酵素は電子受容体として酸素を用いない。これは、可能
な電子受容体として酸素を用いたＤ−ソルビトールから
Ｌ−ソルボースへの変換を酵素が触媒する活性がないこ
とにより確認された。さらに、溶解酸素プローブにより
検出すると、反応混合物において酸素の消費が検出され
なかった。しかし電子受容体として作用する能力を有す
るいずれの従来の化合物も、本発明の酵素と組み合わせ
て用いることができる。電子受容体として、２，６−ジ
クロロフェノールインドフェノール（後文ではＤＣＩＰ
と呼ぶ）、フェナジンメトサルフェート（後文ではＰＭ
Ｓと呼ぶ）、フェリシアニド又はシトクロムｃを用いる
ことができる。

【０００８】酵素アッセイは以下の通りに行った。Ｄ−
ソルビトールデヒドロゲナーゼ活性のアッセイのための
基本的反応混合物は、５０ｍＭのリン酸カリウム緩衝液
（ｐＨ６．０）、０．２５ｍＭのＤＣＩＰ及び０．３２
５ｍＭのＰＭＳから成り、それはアッセイの直前に調製
した。１ｃｍの光路を有するキュベットは０．４ｍｌの
基本的反応混合物、０．１ｍｌの０．４Ｍ Ｄ−ソルビ
トール及び酵素溶液を０．５１ｍｌの合計体積で含ん
だ。参照キュベットは基質以外のすべての成分を含ん
だ。反応はＤ−ソルビトールを用いて２５℃において開
始し、６００ｎｍにおいてＤＣＩＰの初期還元速度とし
て酵素活性を測定した。１酵素単位は、１分当たりに１
μモルのＤＣＩＰの還元を触媒する酵素の量として定義
する。ｐＨ６．０におけるＤＣＩＰの吸光係数は１０．
８ｍＭ^-1であった。

【０００９】２）基質特異性 酵素の基質特異性は、Ｄ−ソルビトールの代わりに種々
の基質溶液（１００ｍＭ）を用いた以外は１）における
上記と同じ酵素アッセイ法を用いて決定した。測定の結
果を表１に示す。調べた基質の中で、Ｄ−ソルビトー
ル、Ｄ−アラビトール、エリトリトール及びグリセロー
ルは高度に酸化され、Ｄ−マンニトール及びＤ−アドニ
トールもＤ−ソルビトールの反応速度の４９．９及び６
６．６％において酸化された。

【００１０】

【表１】

【００１１】ａ）相対的活性は、基質Ｄ−ソルビトール
の場合に得られる反応速度のパーセントとして表す。

【００１２】３）至適ｐＨ ＳＬＤＨの反応速度とｐＨの間の関連性を、種々のｐＨ
及び緩衝液を用いる以外は１）における上記と同じ酵素
アッセイ法を用いて決定した。結果を表２に示す。酵素
は６．０〜７．０の至適ｐＨ値を示し、ｐＨ６．０にお
いて最高活性を示した。

【００１３】

【表２】

【００１４】ａ）データはｐＨ６．０のリン酸カリウム
緩衝液における活性のパーセンテージとして表す。

【００１５】４）ｐＨ安定性 酵素を１℃において種々のｐＨの緩衝液中で１６時間放
置し、次いで残留活性を１）における上記と同じ酵素ア
ッセイ法を用いて測定した。測定の結果を表３に示す。
活性の６０％以上が７．０〜９．０のｐＨにおいて残っ
た。

【００１６】

【表３】

【００１７】ａ）データはｐＨ８．０のＭｃＩｌｖａｉ
ｎ緩衝液における活性のパーセンテージとして表す。

【００１８】５）熱安定性 酵素を０．０１Ｍのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．
０）中で種々の温度において５分間インキュベートする
ことにより、熱安定性を調べた。１）における上記と同
じ酵素アッセイ法を用いて残留活性を測定し、その直後
に処理酵素を氷水中で冷却した。結果を表４に示す。酵
素は３５℃まで安定であり、４０、５０及び６０℃でイ
ンキュベートされた後にそれぞれその活性の約２０、７
０及び９０％を失った。

【００１９】

【表４】

【００２０】ａ）データは２０℃における活性のパーセ
ンテージとして表す。

【００２１】６）至適温度 １）における上記と同じアッセイ法で、２０〜６０℃の
温度において酵素活性を測定した。結果を表５に示す。
酵素は２０〜４０℃において至適温度を示し、３０℃に
おいて最高活性を示した。４５及び５０℃においてその
活性のそれぞれ６０及び７０％の低下が観察され、６０
℃では活性が検出されなかった。

【００２２】

【表５】

【００２３】ａ）データは３０℃における活性のパーセ
ンテージとして示す。

【００２４】７）金属イオン類及び阻害剤の影響 ＳＬＤＨへの金属イオン類及び阻害剤の影響を、１）に
おける上記の同じアッセイ法を用いて活性を測定するこ
とにより調べた。基本的反応混合物に酵素溶液を加えた
後、各金属溶液を撹拌しながら入れ、Ｄ−ソルビトール
を加えて反応を開始した。表６に示される通り、０．９
１及び１．７９ｍＭのＣｏ²⁺の添加により８〜１７％の
活性が刺激された。しかし０．９１ｍＭのＣｕ²⁺及びＦ
ｅ³⁺の添加はそれぞれの場合に強い阻害性であり、Ｚｎ
²⁺の添加は４４〜６８％の阻害率であった。活性への種
々の阻害剤の影響を調べた。表７に示される通り、キニ
ンヒドロクロリド及びモノヨードアセテートはそれぞれ
２５％及び７５％の阻害率であった。

【００２５】

【表６】

【００２６】相対的活性は、表に示されている金属化合
物を含まずに得られる反応速度のパーセンテージとして
表す。

【００２７】

【表７】

【００２８】相対的活性は、表に示されている阻害剤を
含まずに得られる反応速度のパーセンテージとして表
す。

【００２９】８）反応速度への基質濃度の影響 Ｄ−ソルビトールの濃度を０．５〜８０ｍＭに変化させ
た場合の酸化反応の速度を測定し、Ｄ−ソルビトールに
関するＫｍ値を決定した。反応のための電子受容体とし
てＤＣＩＰを用い、見掛けのＭｉｃｈａｅｌｉｓ定数は
１８ｍＭと算出された。

【００３０】９）分子量 寸法排除（ｓｉｚｅ ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ）ゲルカラム
を用いたＨＰＬＣにより、２８０ｎｍにおいて、及び１
分当たり１．０ｍｌの流量において本来のＳＬＤＨの分
子量を決定した。精製ＳＬＤＨは、ナトリウムドデシル
サルフェート（ＳＤＳ）の存在下で７９，０００±５，
０００の分子量を有する同族サブユニットから成った。

【００３１】１０）精製法 ＳＬＤＨの精製は、イオン交換クロマトグラフィー、液
体クロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィー、ゲル
−濾過クロマドラフィー、ゲル−電気泳動、塩析及び透
析などの既知の方法の組み合わせにより行われる。

【００３２】本発明により提供されるＳＬＤＨは、適し
た微生物を培養し、細胞を破壊し、破壊細胞の無細胞抽
出物から、好ましくは微生物の膜成分からそれを単離精
製することにより調製することができる。

【００３３】本発明のために用いられる微生物はグルコ
ノバクテル及びアセトバクテル属に属する微生物であ
る。該微生物の突然変異体及び変異株も本発明で用いる
ことができる。

【００３４】本発明において用いるのが最も好ましい株
の例は、グルコノバクテル・アルビズス（Ｇｌｕｃｏｎ
ｏｂａｃｔｅｒ ａｌｂｉｄｕｓ）ＩＦＯ ３２５０、
グルコノバクテル・アルビズス ＩＦＯ ３２５１、グ
ルコノバクテル・アルビズスＩＦＯ ３２５３、グルコ
ノバクテル・カプスラツス（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅ
ｒ ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ） ＩＦＯ ３４６２、グル
コノバクテル・セリヌス（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ
ｃｅｒｉｎｕｓ） ＩＦＯ ３２６３、グルコノバク
テル・セリヌス ＩＦＯ ３２６４、グルコノバクテル
・セリヌスＩＦＯ ３２６５、グルコノバクテル・セリ
ヌス ＩＦＯ ３２６７、グルコノバクテル・セリヌス
ＩＦＯ ３２７０、グルコノバクテル・ジオキシアセ
トニクス（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ ｄｉｏｘｙａ
ｃｅｔｏｎｉｃｕｓ） ＩＦＯ ３２７１、グルコノバ
クテル・ジオキシアセトニクス ＩＦＯ ３２７４、グ
ルコノバクテル・グルコニクス（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃ
ｔｅｒ ｇｌｕｃｏｎｉｃｕｓ） ＩＦＯ ３１７１、
グルコノバクテル・グルコニクス ＩＦＯ ３２８５、
グルコノバクテル・グルコニクス ＩＦＯ ３２８６、
グルコノバクテル・インズスツリウス（Ｇｌｕｃｏｎｏ
ｂａｃｔｅｒ ｉｎｄｕｓｔｒｉｕｓ）ＩＦＯ ３２６
０、グルコノバクテル・メラノゲヌス（Ｇｌｕｃｏｎｏ
ｂａｃｔｅｒ ｍｅｌａｎｏｇｅｎｕｓ） ＩＦＯ ３
２９２、グルコノバクテル・メラノゲヌス ＩＦＯ ３
２９３、グルコノバクテル・メラノゲヌス ＩＦＯ ３
２９４、グルコノバクテル・ノノキシグルコニクス（Ｇ
ｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ ｎｏｎｏｘｙｇｌｕｃｏｎ
ｉｃｕｓ） ＩＦＯ ３２７６、グルコノバクテル・オ
キシダンス（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ ｏｘｙｄａ
ｎｓ） ＩＦＯ３１８９、グルコノバクテル・オキシダ
ンス亜種スファエリクス（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ
ｏｘｙｄａｎｓ ｓｕｂｓｐ．ｓｐｈａｅｒｉｃｕ
ｓ） ＩＦＯ １２４６７、グルコノバクテル・ロセウ
ス（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒｒｏｓｅｕｓ） ＩＦ
Ｏ ３９９０、グルコノバクテル・ルビギノスス（Ｇｌ
ｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ ｒｕｂｉｇｉｎｏｓｕｓ）
ＩＦＯ ３２４４、グルコノバクテル・スボキシダンス
（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｅｒ ｓｕｂｏｘｙｄａｎｓ）
ＩＦＯ ３１３０、グルコノバクテル・スボキシダン
ス ＩＦＯ ３１７２、グルコノバクテル・スボキシダ
ンス ＩＦＯ ３２５４、グルコノバクテル・スボキシ
ダンス ＩＦＯ ３２５５、グルコノバクテル・スボキ
シダンス ＩＦＯ ３２５６、グルコノバクテル・スボ
キシダンス ＩＦＯ ３２５７、グルコノバクテル・ス
ボキシダンス ＩＦＯ ３２５８、グルコノバクテル・
スボキシダンス ＩＦＯ ３２８９、グルコノバクテル
・スボキシダンス ＩＦＯ ３２９０、グルコノバクテ
ル・スボキシダンス ＩＦＯ ３２９１、アセトバクテ
ル・アセチ亜種アセチ（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ ａｃ
ｅｔｉ ｓｕｂｓｐ．ａｃｅｔｉ） ＩＦＯ ３２８
１、アセトバクテル・アセチ亜種オルレアンシス（ｏｒ
ｌｅａｎｓｉｓ） ＩＦＯ ３２５９、アセトバクテル
・アセチ亜種キシリヌム（ｘｙｌｉｎｕｍ） ＩＦＯ
３２８８、アセトバクテル・アセチ亜種キシリヌム Ｉ
ＦＯ １３７７２及びアセトバクテル・リクエファシエ
ンス（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｌｉｑｕｅｆａｃｉｅ
ｎｓ） ＩＦＯ １２３８８である。本発明の方法にお
いて用いることができるこれらの微生物は、要求に応じ
て誰にでも分譲するための公共の寄託機関（ｃｕｌｔｕ
ｒｅ ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）、例えばＩｎｓｔｉｔｕ
ｔｅ ｏｆ Ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ Ｏｓａｋａ，
Ｊａｐａｎ（ＩＦＯ）に保存されているものも含む。こ
れらの中で、特定の、及び好ましい微生物であるグルコ
ノバクテル・スボキシダンス ＩＦＯ ３２５５は、ブ
タペスト条約の下に、１９９５年２月１２日、Ｄｅｕｔ
ｓｃｈｅ Ｓａｍｍｌｕｎｇ ｖｏｎ Ｍｉｋｒｏｏｒ
ｇａｎｉｓｍｅｎ ｕｎｄ Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ
ＧｍｂＨ（ＤＳＭ），Ｍａｓｃｈｅｒｏｄｅｒ Ｗｅ
ｇ １ｂ，Ｄ−３８１２４ Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉ
ｇ，Ｇｅｒｍａｎｙに寄託された。割り当てられた寄託
番号はＤＳＭ ９７１５である。

【００３５】微生物は適した栄養を補足された水性培地
中において好気的条件下で培養することができる。培養
は３．５〜８．０、好ましくは５．０〜７．５のｐＨに
おいて行うことができる。培養期間は微生物及び、用い
られる栄養培地に依存して変わり、約６〜１００時間が
好ましい。培養を行う好ましい温度範囲は約２０℃〜約
４０℃、好ましくは約２５℃〜約３５℃である。

【００３６】培地は通常：同化可能な炭素源類、例えば
グリセロール、Ｄ−マンニトール、Ｄ−ソルビトール、
エリトリトール、リビトール、キシリトール、イノシト
ール、ズルチトール（ｄｕｌｃｉｔｏｌ）、Ｄ−リボー
ス、Ｄ−フルクトース、Ｄ−グルコース及びスクロー
ス、好ましくはＤ−ソルビトール、Ｄ−マンニトール又
はグリセロール；消化可能な窒素源類、例えばペプト
ン、酵母抽出物、パン酵母及びコーン浸漬液（ｃｏｒｎ
ｓｔｅｅｐ ｌｉｑｕｏｒ）を例とする有機物質、な
らびに硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム及び亜硝酸
カリウムなどの無機物質；ビタミン類；ならびに微量元
素などの栄養を含むことが必要である。

【００３７】以下において、培養の後の微生物からのＳ
ＬＤＨの単離及び精製に関する実施態様を簡単に説明す
る。

【００３８】（１）液体培養ブロスから遠心又は濾過に
より細胞を収穫する。

【００３９】（２）収穫された細胞を水、生理食塩水又
は適したｐＨを有する緩衝溶液を用いて洗浄する。

【００４０】（３）洗浄された細胞を緩衝溶液に懸濁さ
せ、ホモジナイザー、ソニケーター、フレンチプレス又
はリゾチームによる処理などを用いて破壊し、破壊細胞
の溶液を得る。

【００４１】（４）破壊細胞の無細胞抽出物、好ましく
は微生物の膜画分からＳＬＤＨを単離及び精製する。

【００４２】本発明により提供されるＳＬＤＨはＤ−ソ
ルビトールからのＬ−ソルボースの製造のための触媒と
して有用である。反応は約５．５〜約８．０、好ましく
は６．０〜７．０のｐＨ値において、電子受容体、例え
ばＤＣＩＰ、ＰＭＳ、フェリシアニド、シトクロムｃな
どの存在下で、リン酸塩緩衝液、トリス緩衝液、クエン
酸塩緩衝液などの溶媒中で行われなければならない。反
応を行うための好ましい温度範囲は約２０℃〜約５０
℃、好ましくは２０℃〜４０℃である。ｐＨ及び温度が
それぞれ約６．５〜７．５及び３０℃に設定された場合
に、反応は通常特に良い結果を与える。酵素、Ｄ−ソル
ビトール、電子受容体の量、ｐＨ、温度又はエアレーシ
ョン速度などの他の反応条件に依存して、Ｄ−ソルビト
ールは約２〜２４時間以内、好ましくは約１２時間以内
にＬ−ソルボースに完全に変換される。溶媒中のＤ−ソ
ルビトールの濃度は反応条件に依存して変わるが、一般
に約１０〜約３００ｇ／Ｌが適しており、約１０〜約２
００ｇ／Ｌが最も好ましい。

【００４３】上記に加え、培養された細胞もポリオール
類からのケトース類の製造、特にＤ−ソルビトールから
のＬ−ソルボースの製造に有用である。溶媒中でＤ−ソ
ルビトールから製造されるＬ−ソルボースは、遠心及び
濃縮などの従来の方法の組み合わせにより単離される。
しかしＬ−ソルボースを含む溶媒を単離段階を含まず
に、Ｒｅｉｃｈｓｔｅｉｎ法によるビタミンＣの工業的
製造における出発材料として用いることもできる。

【００４４】反応において、酵素を適した担体を用いた
固定化状態で用いることもできる。当該技術分野で一般
に既知の酵素の固定化のためのいずれの手段も用いるこ
とができる。例えば酵素を、官能基を有する樹脂の膜、
顆粒などに直接結合することができ、あるいはそれを二
官能基を有する架橋化合物、例えばグルタルアルデヒド
を介して樹脂に結合することができる。

【００４５】以下の実施例は本発明を例示するものであ
る。

【００４６】

【実施例】実施例１ Ｄ−ソルビトールデヒドロゲナーゼの製造 （１）グルコノバクテル・スボキシダンス ＩＦＯ ３
２５５の培養 グルコノバクテル・スボキシダンス ＩＦＯ ３２５５
（ＤＳＭ ９７１５）はＩｎｓｔｉｔｕｔｅ ｆｏｒ
Ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ，Ｏｓａｋａ（ＩＦＯ）によ
り供給され、本研究を通じて用いた。培地は１リットル
の脱イオン水中に２０ｇのＤ−ソルビトール、３ｇの酵
母抽出物、３ｇのビーフ抽出物、３ｇのコーン浸漬液、
１０ｇのポリペプトン、１ｇのウレア、１ｇのＫＨ₂Ｐ
Ｏ₄、０．２ｇのＭｇＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ及び１ｇのＣａＣ
Ｏ₃を含んだ。ＣａＣＯ₃を加える前に水酸化ナトリウム
を用いてｐＨを７．０に調節した。フラスコにおける培
養を、回転震盪を用いて好気的に１日行うか、あるいは
３０リットルの発酵容器における培養を３０℃で、５０
０ｒｐｍの撹拌及び１５Ｌ／分のエアレーションにおい
て２１．５時間行った。ブロスを４００ｘｇにおいて１
０分間遠心して炭酸カルシウムを除去し、次いで１０，
０００ｘｇにおいて遠心して細胞をペレット化した。細
胞塊（ｃｅｌｌ ｃａｋｅ）を生理食塩水で１回洗浄し
た。かくして無損傷の細胞（湿潤重量２００ｇ）が２０
リットルの培養から得られた。細胞は使用まで−２０℃
において凍結した。

【００４７】（２）膜画分の調製 細胞（湿潤重量１００ｇ）を２００ｍｌの５０ｍＭリン
酸塩緩衝液（ｐＨ７．０）中に懸濁させ、フレンチプレ
スに２０，０００ｐｓｉにおいて通過させた。無損傷の
細胞の除去のための遠心の後、上澄み液（無細胞抽出
物）を８０，０００ｘｇで１時間遠心し、この沈澱を膜
画分と称する（湿潤重量２．２８ｇ）。

【００４８】（３）可溶化 ＳＬＤＨをグルコノバクテル・スボキシダンス ＩＦＯ
３２５５（ＤＳＭ９７１５）の膜画分から単離した。
最初にＥ．Ｓｈｉｎａｇａｗａ，Ｋ．Ｍａｔｓｕｓｈｉ
ｔａ，Ｏ．Ａｄａｃｈｉ ａｎｄ Ｍ．Ａｍｅｙａｍ
ａ，（Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，４６，１３
５−１４１，１９８２）により報告された方法を用いて
ＳＬＤＨを可溶化した。可溶化は膜を、１％のＴｒｉｔ
ｏｎ Ｘ−１００、０．１ＭのＫＣｌ、０．１ＭのＤ−
ソルビトール及び約１０ｍｇ／ｍｌの膜タンパク質を含
む０．０１Ｍの酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．０）を
用いて５℃において２時間処理することにより行った。
しかしＳＬＤＨ活性は膜画分から回収されず、可溶化上
澄み液及び残留膜画分の両方における全活性が上記の条
件で失われた。

【００４９】従ってｐＨ値、緩衝液、界面活性剤及びＫ
Ｃｌの濃度などの可溶化条件の、ＳＬＤＨ活性への影響
を研究した。表８に示す通り、膜画分を１％のＴｒｉｒ
ｏｎＸ−１００及び０．０４ＭのＤ−ソルビトールを含
む０．０５Ｍのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）と
５℃において２時間混合した時に、膜画分から可溶化上
澄み液中へのＳＬＤＨ活性の回収は７４％であった。酵
素はｎ−オクチル−β−Ｄ−グルコピラノシドを用いて
可溶化されず、０．０１ＭのＫＣｌの添加により活性は
失われた。

【００５０】

【表８】

【００５１】グルコノバクテル・スボキシダンス ＩＦ
Ｏ ３２５５（ＤＳＭ ９７１５）の膜画分から単離段
階｛実施例１−（４）｝のためのＳＬＤＨの活性画分を
得るために、凍結膜を解凍し、緩衝液（ｐＨ７．０）に
懸濁させ、約１０ｍｇ／ｍｌのタンパク質を得、次いで
１％のＴｒｉｒｏｎＸ−１００及び０．１ＭのＤ−ソル
ビトールを加えた。懸濁液を１８０ｒｐｍにおいて２時
間震盪し、次いで８０，０００ｘｇにおいて６０分間遠
心し、沈澱を除去した。ＳＬＤＨ活性は可溶化上澄み液
に回収された（２００ｍｌ）。

【００５２】（４）ジエチルアミノエチル（後文ではＤ
ＥＡＥと呼ぶ）−セルロースカラムクロマトグラフィー 実施例１−（３）で得られた可溶化上澄み液（２００ｍ
ｌ）を、０．０５ＭのＤ−ソルビトール及び０．１％の
ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含む緩衝液（ｐＨ７．０）で
平衡化され、洗浄されたＤＥＡＥ−セルロースのカラム
（２．５ｘ３０ｃｍ）上に置いた。酵素の溶離は、同じ
緩衝液中の０．１ＭのＮａＣｌを用いて行った。酵素活
性を有する画分を集めた。

【００５３】（５）ＤＥＡＥ−セファロースカラムクロ
マトグラフィー 前段階からプールされた酵素画分（１２５ｍｌ）を、
０．０５ＭのＤ−ソルビトール及び０．１％のＴｒｉｔ
ｏｎＸ−１００を含む１リットルの緩衝液の２バッチに
対して透析し、同じ緩衝液を用いて平衡化され、洗浄さ
れたＤＥＡＥ−セファロースカラム（１．５ｘ５０ｃ
ｍ）上に置き、ＮａＣｌの直線勾配（０〜０．２Ｍ）を
用いてＳＬＤＨ活性を溶離した。主酵素活性は０．１６
〜０．１８Ｍの範囲のＮａＣｌ濃度において溶離した。

【００５４】６）ヒドロキシルアパタイトカラムクロマ
トグラフィー 前段階からプールされた活性画分（４０ｍｌ）を、０．
０５ＭのＤ−ソルビトール及び０．１％のＴｒｉｔｏｎ
Ｘ−１００を含む５００ｍｌの緩衝液の２バッチに対し
て透析した。酵素の一部（５ｍｌ）を平衡化されたヒド
ロキシルアパタイトカラム（２．５ｘ２０ｃｍ）上に置
いた。酵素活性はカラムの洗浄の間に溶離した。同じ調
製を繰り返した後、酵素活性を有する画分を集めた。活
性画分を緩衝液に対して透析した後、合計体積は５２ｍ
ｌであった。次いで画分を限外濾過（ＰＭ１０、Ａｍｉ
ｃｏｎ）により１０ｍｌに濃縮した。

【００５５】（７）セファクリル（Ｓｅｐｈａｃｒｙ
ｌ）ＨＲ３００カラムクロマトグラフィー 前段階からの酵素画分の一部（２ｍｌ）を、０．０５Ｍ
のＮａＣｌ、０．０５ＭのＤ−ソルビトール及び０．１
％のＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含む緩衝液（ｐＨ７．
０）を用いて平衡化されたセファクリルＨＲ３００カラ
ム（１ｘ１２０ｃｍ）上に置き、展開した。この分別段
階を繰り返し、活性画分を合わせた。緩衝液に対して透
析された活性画分（１３ｍｌ）をプールし、−８０℃に
おいて保存した。

【００５６】酵素の精製段階のまとめを表９に示す。

【００５７】

【表９】

【００５８】（８）単離酵素の純度 タンパク質の１ｍｇ当たり４５．４３単位の比活性を有
する精製酵素（０．２ｍｇ／ｍｌ）を以下の分析に用い
た。

【００５９】本来のＤ−ソルビトールデヒドロゲナーゼ
の分子量を、０．３ＭのＮａＣｌを含む０．１Ｍのリン
酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）を用いて平衡化された
寸法排除ゲルカラム（ＴＳＫゲルＧ３０００ＳＷ_XLカラ
ム、７．８ｘ３００ｍｍ）を用いたＨＰＬＣ（検出、２
５４μｍ；流量、１ｍｌ／分）により決定した。分子量
標準シアノコバラミン（１．３５Ｋ）、ミオグロビン
（１７Ｋ）、オボアルブミン（４４Ｋ）、γ−グロブリ
ン（１５８Ｋ）及びチログロブリン（６７０Ｋ）を用い
た。精製酵素は単一のピークを示し、分子量は約８０
０，０００±５０，０００であると決定された。

【００６０】ナトリウムドデシルサルフェート（ＳＤ
Ｓ）の存在下で、酵素は約７９，０００±５，０００の
分子量の単一のバンドを示した。これらの結果から、精
製ＳＬＤＨは１０個の同族サブユニットから成る。

【００６１】（９）反応生成物の同定 各基質から変換された生成物の同定のために、０．０４
ＭのそれぞれＤ−ソルビトール、Ｄ−マンニトール、Ｄ
−アラビトール、エリトリトール、Ｄ−アドニトール及
びグリセロール、ならびに８ｍＭのＰＭＳを含む反応混
合物を、２．０単位の精製酵素と共に０．２Ｍのリン酸
カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）中で３０℃において４時
間インキュベートした。反応混合物をＨＰＬＣ及び薄層
クロマトグラフィーにより分析した。Ｌ−ソルボース、
Ｄ−フルクトース、Ｄ−キシルロース、エリトルロー
ス、Ｄ−リブロース及びジヒドロキシアセトンがそれぞ
れＤ−ソルビトール、Ｄ−マンニトール、Ｄ−アラビト
ール、エリトリトール、Ｄ−アドニトール及びグリセロ
ールから生成された。

【００６２】実施例２ 精製ＳＬＤＨによるＬ−ソルボース製造 ０．２ｍｌの精製ＳＬＤＨ（０．０４ｍｇタンパク
質）、０．０４ｍｇの０．２Ｍ ＰＭＳ、０．１ｍｌの
０．４Ｍ Ｄ−ソルビトール、０．４ｍｌの０．５Ｍ
リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）及び０．３ｍｌの
水を含む反応混合物（合計体積１．０４ｍｌ）を穏やか
に震盪させながら３０℃でインキュベートした。その結
果、Ｌ−ソルボースが約１．３ｍｇ／時の速度で生成さ
れた。

【００６３】実施例３ 膜−結合Ｄ−ソルビトールデヒドロゲナーゼの分布 種々の酢酸バクテリアにおける膜−結合Ｄ−ソルビトー
ルデヒドロゲナーゼの分布を、本発明により提供される
ＳＬＤＨに対する抗体を用いたイムノブロッティングア
ッセイにより探査した。種々の酢酸バクテリアの各細胞
ホモジネートをＳＤＳで処理し、３〜５μｇのタンパク
質を含む各２０μｌの溶液をＳＤＳポリアクリルアミド
ゲル上に置き、次いで電気泳動を行った。ゲルにおいて
展開されたタンパク質のバンドをニトロセルロース膜に
電気泳動により移し、抗体と反応させた。ニトロセルロ
ース膜をヒツジ抗−ウサギのためのＢｉｏ−Ｒａｄ Ｉ
ｍｍｕｎ−Ｂｌｏｔキットを用いることにより処理し、
どの微生物が分子量（ＭＷ）７９，０００±１，０００
の位置において陽性のバンドを示すかについてそれを調
べた。表１０に示される通り、調べられたグルコノバク
テル株のすべて、ならびにアセトバクテル・アセチ亜種
オルレアンシス ＩＦＯ ３２５９、アセトバクテル・
アセチ亜種キシリヌム ＩＦＯ ３２８８及びアセトバ
クテル・アセチ キシリヌム ＩＦＯ １３７７２は陽
性のバンドを示した。アセトバクテル・アセチ亜種アセ
チ ＩＦＯ ３２８１及びアセトバクテル・リクエファ
シエンス ＩＦＯ １２３８８の細胞ホモジネートは、
ＭＷ７９，０００±１，０００の位置において弱い陽性
のバンドを示した。

【００６４】

【表１０】

【００６５】本発明の主たる特徴及び態様は以下の通り
である。

【００６６】１．Ｄ−ソルビトールのＬ−ソルボースへ
の酸化を触媒し且つ以下の理化学的性質： ａ）分子構造：７９，０００±５，０００の分子量を有
する同族サブニットから成る ｂ）基質特異性：ポリオール類に対して活性 ｃ）至適ｐＨ：６．０〜７．０ を有する精製された形態のＤ−ソルビトールデヒドロゲ
ナーゼ。

【００６７】２．以下の理化学的性質： ａ）分子構造：７９，０００±５，０００の分子量を有
する同族サブニットから成る ｂ）基質特異性：ポリオール類に対して活性 ｃ）至適ｐＨ：６．０〜７．０ ｄ）ｐＨ安定性：７．０〜９．０ ｅ）至適温度：約２０〜４０℃ ｆ）阻害：Ｃｕ²⁺及びＦｅ³⁺による を有する上記１項に記載のＤ−ソルビトールデヒドロゲ
ナーゼ。

【００６８】３．グルコノバクテル（Ｇｌｕｃｏｎｏｂ
ａｃｔｅｒ）又はアセトバクテル（Ａｃｅｔｏｂａｃｔ
ｅｒ）属に属する微生物又はその突然変異体から誘導さ
れる上記１又は２項に記載のＤ−ソルビトールデヒドロ
ゲナーゼ。

【００６９】４．微生物がグルコノバクテル・アルビズ
ス（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ ａｌｂｉｄｕｓ）Ｉ
ＦＯ ３２５０、グルコノバクテル・アルビズス ＩＦ
Ｏ ３２５１、グルコノバクテル・アルビズス ＩＦＯ
３２５３、グルコノバクテル・カプスラツス（Ｇｌｕ
ｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ） ＩＦ
Ｏ ３４６２、グルコノバクテル・セリヌス（Ｇｌｕｃ
ｏｎｏｂａｃｔｅｒ ｃｅｒｉｎｕｓ） ＩＦＯ ３２
６３、グルコノバクテル・セリヌス ＩＦＯ ３２６
４、グルコノバクテル・セリヌス ＩＦＯ ３２６５、
グルコノバクテル・セリヌス ＩＦＯ ３２６７、グル
コノバクテル・セリヌス ＩＦＯ ３２７０、グルコノ
バクテル・ジオキシアセトニクス（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａ
ｃｔｅｒ ｄｉｏｘｙａｃｅｔｏｎｉｃｕｓ） ＩＦＯ
３２７１、グルコノバクテル・ジオキシアセトニクス
ＩＦＯ ３２７４、グルコノバクテル・グルコニクス
（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ ｇｌｕｃｏｎｉｃｕ
ｓ） ＩＦＯ ３１７１、グルコノバクテル・グルコニ
クス ＩＦＯ ３２８５、グルコノバクテル・グルコニ
クス ＩＦＯ ３２８６、グルコノバクテル・インズス
ツリウス（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ ｉｎｄｕｓｔ
ｒｉｕｓ） ＩＦＯ ３２６０、グルコノバクテル・メ
ラノゲヌス（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ ｍｅｌａｎ
ｏｇｅｎｕｓ） ＩＦＯ ３２９２、グルコノバクテル
・メラノゲヌス ＩＦＯ ３２９３、グルコノバクテル
・メラノゲヌス ＩＦＯ ３２９４、グルコノバクテル
・ノノキシグルコニクス（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ
ｎｏｎｏｘｙｇｌｕｃｏｎｉｃｕｓ） ＩＦＯ ３２
７６、グルコノバクテル・オキシダンス（Ｇｌｕｃｏｎ
ｏｂａｃｔｅｒ ｏｘｙｄａｎｓ） ＩＦＯ ３１８
９、グルコノバクテル・オキシダンス亜種スファエリク
ス（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ ｏｘｙｄａｎｓ ｓ
ｕｂｓｐ．ｓｐｈａｅｒｉｃｕｓ） ＩＦＯ １２４６
７、グルコノバクテル・ロセウス（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａ
ｃｔｅｒ ｒｏｓｅｕｓ） ＩＦＯ ３９９０、グルコ
ノバクテル・ルビギノスス（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅ
ｒ ｒｕｂｉｇｉｎｏｓｕｓ） ＩＦＯ ３２４４、グ
ルコノバクテル・スボキシダンス（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａ
ｃｅｒ ｓｕｂｏｘｙｄａｎｓ） ＩＦＯ ３１３０、
グルコノバクテル・スボキシダンス ＩＦＯ ３１７
２、グルコノバクテル・スボキシダンスＩＦＯ ３２５
４、グルコノバクテル・スボキシダンス ＩＦＯ ３２
５５（ＤＳＭ ９７１５）、グルコノバクテル・スボキ
シダンス ＩＦＯ ３２５６、グルコノバクテル・スボ
キシダンス ＩＦＯ ３２５７、グルコノバクテル・ス
ボキシダンス ＩＦＯ ３２５８、グルコノバクテル・
スボキシダンス ＩＦＯ３２８９、グルコノバクテル・
スボキシダンス ＩＦＯ ３２９０、グルコノバクテル
・スボキシダンス ＩＦＯ ３２９１、アセトバクテル
・アセチ亜種アセチ（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ ａｃｅ
ｔｉ ｓｕｂｓｐ．ａｃｅｔｉ） ＩＦＯ ３２８１、
アセトバクテル・アセチ亜種オルレアンシス（ｏｒｌｅ
ａｎｓｉｓ） ＩＦＯ ３２５９、アセトバクテル・ア
セチ亜種キシリヌム（ｘｙｌｉｎｕｍ） ＩＦＯ ３２
８８、アセトバクテル・アセチ亜種キシリヌム ＩＦＯ
１３７７２及びアセトバクテル・リクエファシエンス
（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）
ＩＦＯ １２３８８から成る群より選ばれる上記３項
に記載のＤ−ソルビトールデヒドロゲナーゼ。

【００７０】５．グルコノバクテル又はアセトバクテル
属に属する微生物、あるいは細胞中でＤ−ソルビトール
デヒドロゲナーゼを生産することができるその突然変異
体（ｍｕｔａｎｔ）及び変異株（ｖａｒｉａｎｔ）を培
養し、該Ｄ−ソルビトールデヒドロゲナーゼを細胞から
単離することを含む上記１、２、３及び４項のいずれか
１つに定義されているＤ−ソルビトールデヒドロゲナー
ゼの製造法。

【００７１】６．微生物がグルコノバクテル・アルビズ
ス（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ ａｌｂｉｄｕｓ）Ｉ
ＦＯ ３２５０、グルコノバクテル・アルビズス ＩＦ
Ｏ ３２５１、グルコノバクテル・アルビズス ＩＦＯ
３２５３、グルコノバクテル・カプスラツス（Ｇｌｕ
ｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ） ＩＦ
Ｏ ３４６２、グルコノバクテル・セリヌス（Ｇｌｕｃ
ｏｎｏｂａｃｔｅｒ ｃｅｒｉｎｕｓ） ＩＦＯ ３２
６３、グルコノバクテル・セリヌス ＩＦＯ ３２６
４、グルコノバクテル・セリヌス ＩＦＯ ３２６５、
グルコノバクテル・セリヌス ＩＦＯ ３２６７、グル
コノバクテル・セリヌス ＩＦＯ ３２７０、グルコノ
バクテル・ジオキシアセトニクス（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａ
ｃｔｅｒ ｄｉｏｘｙａｃｅｔｏｎｉｃｕｓ） ＩＦＯ
３２７１、グルコノバクテル・ジオキシアセトニクス
ＩＦＯ ３２７４、グルコノバクテル・グルコニクス
（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ ｇｌｕｃｏｎｉｃｕ
ｓ） ＩＦＯ ３１７１、グルコノバクテル・グルコニ
クス ＩＦＯ ３２８５、グルコノバクテル・グルコニ
クス ＩＦＯ ３２８６、グルコノバクテル・インズス
ツリウス（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ ｉｎｄｕｓｔ
ｒｉｕｓ） ＩＦＯ ３２６０、グルコノバクテル・メ
ラノゲヌス（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ ｍｅｌａｎ
ｏｇｅｎｕｓ） ＩＦＯ ３２９２、グルコノバクテル
・メラノゲヌス ＩＦＯ ３２９３、グルコノバクテル
・メラノゲヌス ＩＦＯ ３２９４、グルコノバクテル
・ノノキシグルコニクス（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ
ｎｏｎｏｘｙｇｌｕｃｏｎｉｃｕｓ） ＩＦＯ ３２
７６、グルコノバクテル・オキシダンス（Ｇｌｕｃｏｎ
ｏｂａｃｔｅｒ ｏｘｙｄａｎｓ） ＩＦＯ ３１８
９、グルコノバクテル・オキシダンス亜種スファエリク
ス（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ ｏｘｙｄａｎｓ ｓ
ｕｂｓｐ．ｓｐｈａｅｒｉｃｕｓ） ＩＦＯ １２４６
７、グルコノバクテル・ロセウス（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａ
ｃｔｅｒ ｒｏｓｅｕｓ） ＩＦＯ ３９９０、グルコ
ノバクテル・ルビギノスス（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅ
ｒ ｒｕｂｉｇｉｎｏｓｕｓ） ＩＦＯ ３２４４、グ
ルコノバクテル・スボキシダンス（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａ
ｃｅｒ ｓｕｂｏｘｙｄａｎｓ） ＩＦＯ ３１３０、
グルコノバクテル・スボキシダンス ＩＦＯ ３１７
２、グルコノバクテル・スボキシダンスＩＦＯ ３２５
４、グルコノバクテル・スボキシダンス ＩＦＯ ３２
５５（ＤＳＭ ９７１５）、グルコノバクテル・スボキ
シダンス ＩＦＯ ３２５６、グルコノバクテル・スボ
キシダンス ＩＦＯ ３２５７、グルコノバクテル・ス
ボキシダンス ＩＦＯ ３２５８、グルコノバクテル・
スボキシダンス ＩＦＯ３２８９、グルコノバクテル・
スボキシダンス ＩＦＯ ３２９０、グルコノバクテル
・スボキシダンス ＩＦＯ ３２９１、アセトバクテル
・アセチ亜種アセチ（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ ａｃｅ
ｔｉ ｓｕｂｓｐ．ａｃｅｔｉ） ＩＦＯ ３２８１、
アセトバクテル・アセチ亜種オルレアンシス（ｏｒｌｅ
ａｎｓｉｓ） ＩＦＯ ３２５９、アセトバクテル・ア
セチ亜種キシリヌム（ｘｙｌｉｎｕｍ） ＩＦＯ ３２
８８、アセトバクテル・アセチ亜種キシリヌム ＩＦＯ
１３７７２及びアセトバクテル・リクエファシエンス
（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）
ＩＦＯ １２３８８から成る群より選ばれる上記５項
に記載の方法。

【００７２】７．微生物を培養し、その後細胞を破壊
し、破壊細胞の無細胞抽出物からＤ−ソルビトールデヒ
ドロゲナーゼを単離及び精製することを含む上記５又は
６項に記載の方法。

【００７３】８．適した栄養分を含む水性培地中で好気
的条件下に、３．５〜８．０、好ましくは５．０〜７．
５のｐＨで、及び約２０℃〜約４０℃、好ましくは約２
５℃〜約３５℃の温度範囲内において微生物の培養を行
うことを含む上記５〜７項のいずれか１つに記載の方
法。

【００７４】９．上記１、２、３及び４項のいずれか１
つで定義されているＤ−ソルビトールデヒドロゲナーゼ
及び電子受容体の存在下に、水性媒体中で好気的条件下
においてＤ−ソルビトールを酸化することを含む、Ｄ−
ソルビトールからＬ−ソルボースを製造する方法。

【００７５】１０．酸化を約５．５〜約８．０、好まし
くは６．０〜７．０のｐＨ値において、及び約２０〜約
５０℃、好ましくは２０〜４０℃の温度範囲内で行う上
記９項に記載のＤ−ソルビトールからＬ−ソルボースを
製造する方法。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:02）

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 Ｄ−ソルビトールのＬ−ソルボースへの
   酸化を触媒し且つ以下の理化学的性質： ａ）分子構造：７９，０００±５，０００の分子量を有
   する同族（ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ）サブニットから成る ｂ）基質特異性：ポリオール類に対して活性 ｃ）至適ｐＨ：６．０〜７．０ を有することを特徴とする精製された形態のＤ−ソルビ
   トールデヒドロゲナーゼ。
2. 【請求項２】 グルコノバクテル（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａ
   ｃｔｅｒ）又はアセトバクテル（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅ
   ｒ）属に属する微生物、あるいは細胞中でＤ−ソルビト
   ールデヒドロゲナーゼを生産することができるその突然
   変異体及び変異株を培養し、該Ｄ−ソルビトールデヒド
   ロゲナーゼを細胞から単離することを特徴とする請求項
   １に記載のＤ−ソルビトールデヒドロゲナーゼの製造
   法。
3. 【請求項３】 請求項１に記載のＤ−ソルビトールデヒ
   ドロゲナーゼ及び電子受容体の存在下に、水性媒体中で
   好気的条件下においてＤ−ソルビトールを酸化すること
   を特徴とするＤ−ソルビトールからＬ−ソルボースを製
   造する方法。