JPH11276180A - ポリエステル合成能を有する植物及びポリエステルの製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 ポリエステル合成能を有する植物及びポリエ
ステルの製造方法の提供。 【解決手段】 ポリエステル合成酵素をコードする遺伝
子及びアセトアセチル-CoAリダクターゼをコードする遺
伝子を含有する発現用組換えベクター、該組換えベクタ
ーを含む形質転換体、及び該形質転換体を培養又は栽培
し、得られる培養物又は栽培物からポリエステルを採取
することを特徴とするポリエステルの製造方法。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、アセトアセチル-C
oAリダクターゼをコードする遺伝子及びポリエステル合
成酵素をコードする遺伝子を含有する発現用組換えベク
ター、ポリエステル合成能を有する形質転換植物並びに
ポリエステルの製造方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】微生物が生合成するポリエステル（例え
ばポリ-3-ヒドロキシアルカン酸）は、熱可塑性を有
し、固いものから粘弾性を有するゴム状のものまで多岐
にわたる生分解性プラスチックである。近年、3-ヒドロ
キシブチレート(3HB) と3-ヒドロキシヘキサノエート(3
HH) との２成分共重合ポリエステル P(3HB-co-3HH)およ
びその製造法について、研究、開発がなされている（例
えば特開平5-93049号公報および特開平7-265065号公
報）。これらの公報に記載の P(3HB-co-3HH)共重合体の
製造法は、土より単離したアエロモナス・キャビエ (Ae
romonas caviae）を用いてオレイン酸やオリーブオイル
から発酵生産するものである。エネルギー貯蔵を目的と
して発酵生産した P(3HB-co-3HH)共重合体は、3HHユニ
ット分率の増加とともに結晶化度が低下するために、柔
軟な高分子材料となり、熱安定性や成形性にも優れ、強
い糸や透明でしなやかなフィルムにも加工できることが
明らかにされている（Y. Doi, S. Kitamura, H. Abe, M
acromolecules 28, 4822-4823 (1995)）。しかも、微生
物から生産されたポリエステルは生物分解が可能である
ことから、環境保護の観点から有用である。従って、微
生物により生産、蓄積されたポリエステルは、多岐にわ
たり応用することができる。

【０００３】しかしながら、微生物にポリエステルを生
産させる場合は、培養装置、培地等の所定の設備が必要
であり、またその稼動には石油エネルギーの消費を要す
るため、生産コストが高くなってしまう。そこで、微生
物の培養手段によることなく、安価で大量に上記特性を
有するポリエステルを製造する手段の開発が望まれる。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、アセトアセ
チル-CoAリダクターゼ遺伝子及びポリエステル合成酵素
遺伝子を含有する発現用組換えベクター、ポリエステル
合成能を有する形質転換植物並びにポリエステルの製造
方法を提供することを目的とする。

【０００５】

【課題を解決するための手段】本発明者は、上記課題を
解決するため鋭意研究を行った結果、ポリエステル合成
酵素をコードする遺伝子及びアセトアセチル-CoAリダク
ターゼをコードする遺伝子を組み込んだベクターを植物
に導入して発現させることにより、植物から有用なポリ
エステルを大量に生産することに成功し、本発明を完成
するに至った。

【０００６】すなわち、本発明は、以下の(a)又は(b)の
タンパク質をコードする遺伝子と、以下の(c)又は(d)の
タンパク質をコードする遺伝子とを含有する発現用組換
えベクターである。

【０００７】(a) 配列番号２で表わされるアミノ酸配列
からなるタンパク質 (b) 配列番号２で表わされるアミノ酸配列において少な
くとも１個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加された
アミノ酸配列からなり、かつポリエステル合成酵素活性
を有するタンパク質 (c) 配列番号４で表わされるアミノ酸配列からなるタン
パク質 (d) 配列番号４で表わされるアミノ酸配列において少な
くとも１個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加された
アミノ酸配列からなり、かつアセトアセチル-CoAリダク
ターゼ活性を有するタンパク質 さらに、本発明は、以下の(e)又は(f)のDNAを含む遺伝
子と、以下の(g)又は(h)のDNAを含む遺伝子とを含有す
る発現用組換えベクターである。

【０００８】(e) 配列番号１で表わされる塩基配列から
なるDNA (f) (e)の塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条
件下でハイブリダイズし、かつポリエステル合成酵素活
性を有するタンパク質をコードするDNA (g) 配列番号３で表わされる塩基配列からなるDNA (h) (g)の塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条
件下でハイブリダイズし、かつアセトアセチル-CoAリダ
クターゼ活性を有するタンパク質をコードするDNA

【０００９】さらに、本発明は、前記発現用組換えベク
ターを含む形質転換体である。該形質転換体としては、
植物体、植物器官、植物組織又は植物培養細胞が挙げら
れる。上記植物としては、例えばナス科、イネ科、アオ
イ科、アブラナ科、キク科、ゴマ科、モクセイ科、フト
モモ科、バラ科、ツバキ科、マメ科、ヤシ科、アオギリ
科及びアカネ科からなる群から選択されるいずれかの科
に属する植物が挙げられるが、これらに限定されるもの
ではない。さらに、本発明は、前記形質転換体を培養又
は栽培し、得られる培養物又は栽培物からポリエステル
を採取することを特徴とするポリエステルの製造方法で
ある。ポリエステルとしては、次式Ｉ：

【００１０】

【化２】

【００１１】（Ｒは水素原子又は炭素数１〜４のアルキ
ル基を表す。）で示される3-ヒドロキシアルカン酸の共
重合体が挙げられる。以下、本発明を詳細に説明する。

【００１２】

【発明の実施の形態】本発明は、ポリエステル合成酵素
をコードする遺伝子（ポリエステル合成酵素遺伝子とも
いう）及びアセトアセチル-CoAリダクターゼをコードす
る遺伝子（アセトアセチル-CoAリダクターゼ遺伝子とも
いう）を同一の発現ベクターに組み込み、得られる発現
用組換えベクターを植物に導入して形質転換体（トラン
スジェニック植物）を作製し、該形質転換体に熱可塑
性、生物分解性及び弾性などの性質を有するポリエステ
ルを大量生産させることを特徴とするものである。

【００１３】１．ポリエステル合成酵素遺伝子及びアセ
トアセチル-CoAリダクターゼ遺伝子のクローニング (1) ポリエステル合成酵素遺伝子のクローニング 本発明において、発現用組換えベクターに組込むための
ポリエステル合成酵素遺伝子は、アエロモナス属に属す
る微生物の菌体から分離される。該遺伝子として、ポリ
ヒドロキシアルカン酸合成酵素をコードする遺伝子（以
下「phaC遺伝子」ともいう）が挙げられる。なお、ポリ
ヒドロキシアルカン酸合成酵素は、3-ヒドロキシブチリ
ル-CoAを基質としてポリ-3-ヒドロキシアルカン酸を生
成する触媒機能を有するほか、3-ヒドロキシペンタノイ
ル-CoA又は3-ヒドロキシヘキサノイル-CoAを基質として
ポリ-3-ヒドロキシアルカン酸を生成する触媒機能を有
する酵素である（図１）。

【００１４】まず、phaC遺伝子を有する菌株、例えばア
エロモナス・キャビエ（Aeromonascaviae) FA440株から
染色体DNAを調製する。染色体DNAの調製は公知の方法を
用いることができる。例えば、アエロモナス・キャビエ
FA440株をLB培地で培養した後、臭化ヘキサデシルトリ
メチルアンモニウム法（Currnt Protocols in Molecula
r Biology,1巻, 2.4.3 頁, John Wiley &Sons出版, 199
4年）等により染色体DNAを調製する。

【００１５】上記手法により得られたDNAを適当な制限
酵素（例えばSau3A1、BamHI、BglII等）で部分分解した
後、アルカリホスファターゼ処理を行い、DNA断片を脱
リン酸化する。これを制限酵素（例えばBamHI、BglII
等）で切断したベクターとライゲーションを行い、ライ
ブラリーを作製する。ベクターには、宿主微生物で自律
的に増殖し得るファージ又はプラスミドが使用される。
ファージベクターとしては、例えばEMBL3 、M13 、λgt
11等が挙げられ、プラスミドベクターとしては、例えば
pBR322、pUC18 、pBluescript II（STRATAGENE社製）等
が挙げられる。さらに、大腸菌及びバチルス・ブレビス
(Bacillus brevis)などの２種以上の宿主微生物で自律
的増殖が可能なベクターのほか、各種のシャトルベクタ
ーを使用することもできる。このようなベクターについ
ても、前記制限酵素で切断し、その断片を得ることがで
きる。

【００１６】DNA断片とベクター断片とを連結させるに
は、公知のDNAリガーゼを用いる。そして、DNA断片とベ
クター断片とをアニーリングさせた後連結させ、組換え
ベクターを作製する。宿主微生物に組換えベクターを導
入するには、公知の方法により行うことができる。例え
ば、宿主微生物が大腸菌の場合はカルシウム法（Lederb
erg,E.M. etal.,J.Bacteriol.119,1072(1974)) やエレ
クトロポレーション法（Current Protocols in Molecul
ar Biology, 1巻，1.8.4 頁, 1994年）を採用すること
ができ、宿主微生物がファージDNAの場合はインビトロ
・パッケージング法（Current Protocols in Molecular
Biology, 1巻，5.7.1 頁, 1994年）等を採用すること
ができる。本発明では、インビトロ・パッケージング用
キット（Gigapack II ； STRATAGENE 社製等) が用いら
れる。

【００１７】次に、phaC遺伝子を含むDNA断片を得るた
めのプローブを調製する。ポリエステル合成酵素のアミ
ノ酸配列については、既に何種類かのものが知られてい
る（Peoples, O.P. and Sinskey, A.J., J.Biol.Chem.,
264, 15293 (1989)；Huisman, G.W. et al., J.Biol.C
hem., 266, 2191 (1991)；Pieper,U. et al., FEMS Mic
robiol.Lett., 96, 73(1992)他）。そこで、これらのア
ミノ酸配列のうち、保存されている２つの領域を選択
し、それをコードする核酸塩基配列を推定してオリゴヌ
クレオチドを設計する。これらオリゴヌクレオチドとし
ては、例えば5'-CC(C/G)CC(C/G)TGGATCAA(T/C)AAGT(T/
A)(T/C)TA(T/C)ATC-3'（配列番号７）、及び5'-(G/C)AG
CCA(G/C)GC(G/C)GTCCA(A/G)TC(G/C)GGCCACCA-3'（配列
番号８）で表される２種類のオリゴヌクレオチドが挙げ
られるがこれらに限定されるものではない。

【００１８】これらのオリゴヌクレオチドをプライマー
とし、アエロモナス・キャビエの染色体DNAを鋳型とし
てポリメラーゼ連鎖反応（PCR；Molecular Cloning, 2
巻，14.2頁, 1989年) を行う。そして、PCRによりポリ
エステル合成酵素遺伝子を部分的に増幅する。次に、こ
の部分増幅断片を適当な試薬を用いて標識し、前記染色
体DNAライブラリーからコロニーハイブリダイゼーショ
ンを行う（Currnt Protocols in Molecular Biology,1
巻, 6.0.3 頁, 1994年) 。

【００１９】コロニーハイブリダイゼーションによりス
クリーニングされた大腸菌からアルカリ法（Currnt Pro
tocols in Molecular Biology,1巻,1.6.1頁, 1994年)
によってプラスミドを回収することにより、ポリエステ
ル合成酵素遺伝子を含むDNA断片が得られる。上記DNA断
片の塩基配列の決定は、公知方法、例えばサンガー法
（Molecular Cloning,2巻, 13.3頁, 1989年) 等によっ
て行うことができ、通常は塩基配列自動分析装置、例え
ば373A DNAシークエンサー (Applied Biosystems社) 等
が使用される。

【００２０】配列番号５にphaC遺伝子の全配列を、配列
番号１にphaC遺伝子のオープンリーディングフレーム(O
RF)の塩基配列を、配列番号２に該ORFによりコードされ
るアミノ酸配列を示すが、当該アミノ酸配列を有するポ
リペプチドがポリエステル合成酵素活性を有する限り、
アミノ酸のいくつかについて欠失、置換、付加等の変異
があってもよい。また、本発明の遺伝子は、配列番号２
で表されるアミノ酸配列又は変異を有するアミノ酸配列
をコードする塩基配列をもつもののほか、縮重コドンに
おいてのみ異なる同一のポリペプチドをコードする縮重
異性体をも包含するものである。

【００２１】例えば、配列番号２で表わされるアミノ酸
配列の少なくとも１個、好ましくは１〜10個程度、さら
に好ましくは１〜５個のアミノ酸が欠失してもよく、配
列番号１若しくは２で表わされるアミノ酸配列に少なく
とも１個、好ましくは１〜10個程度、さらに好ましくは
１〜５個のアミノ酸が付加してもよく、あるいは、配列
番号２で表わされるアミノ酸配列の少なくとも１個、好
ましくは１〜10個程度、さらに好ましくは１〜５個のア
ミノ酸が他のアミノ酸に置換してもよい。

【００２２】なお、上記欠失等の変異は、公知の部位突
然変異誘発方法（Current Protocols in Molecular Bio
logy 1巻, 8.1.1 頁, 1994年）により、あるいは市販の
キット（Takara社のLA PCR in vitro Mutagenesis シリ
ーズキット）を用いて誘発することができる。

【００２３】また、phaC遺伝子には、配列番号1又は5で
表される塩基配列からなるDNAのほか、該DNAとストリン
ジェントな条件下でハイブリダイズし、かつポリエステ
ル合成酵素活性を有するタンパク質をコードするDNAも
含まれる。ストリンジェントな条件とは、例えば、ナト
リウム濃度が500〜1000mM、好ましくは700mMであり、温
度が50〜70℃、好ましくは65℃での条件をいう。

【００２４】一旦phaC遺伝子の塩基配列が確定される
と、その後は化学合成によって、又は当該遺伝子の5'お
よび3'末端の塩基配列をプライマーとし、ゲノムDNA
（配列番号１又は５）を鋳型としたPCRによって、ある
いはphaC遺伝子の塩基配列を有するDNA断片をプローブ
としてハイブリダイズさせることによって、ポリエステ
ル合成酵素遺伝子を得ることができる。なお、アエロモ
ナス・キャビエFA440株から得られたphaC遺伝子は、ア
ルカリゲネス・ユートロファス(Alcaligenes eutrophu
s)に導入され(名称：Alcaligenseutrophus AC32)、工業
技術院生命工学工業技術研究所（茨城県つくば市東1丁
目1番3号）に、平成８年８月12日付でFERM P-15786とし
て寄託されている。

【００２５】(2) アセトアセチル-CoAリダクターゼ遺伝
子のクローニング アセトアセチル-CoAリダクターゼは、アセトアセチル-C
oAを基質として3-ヒドロキシブチリルCo-Aを生成する触
媒機能を有するものである（図１）。本発明では、アセ
トアセチル-CoAリダクターゼ遺伝子(以下「phbB遺伝
子」ともいう）を発現ベクターに組み込むため、該遺伝
子のクローニングを行う。phbB遺伝子は、アルカリゲネ
ス属に属する微生物、例えばアルカリゲネス・ユートロ
ファス(Alcaligenes eutrophus)の菌体（ATCC 17699）
から分離される。

【００２６】phbB遺伝子についても、前記phaC遺伝子を
調製したときと同様に、染色体DNAの調製、ライブラリ
ーの作製、組換えベクターの作製、宿主微生物への組換
えベクターの導入、コロニーハイブリダイゼーション、
塩基配列の決定を行うことによって調製することができ
る。配列番号６にphbB遺伝子の全配列を、配列番号3にp
hbB遺伝子のORFの塩基配列を、配列番号4に該遺伝子に
よりコードされるアミノ酸配列を示すが、当該アミノ酸
配列を有するポリペプチドがアセトアセチル-CoAリダク
ターゼ活性を有する限り、アミノ酸のいくつかについて
欠失、置換、付加等の変異があってもよい。また、本発
明の遺伝子は、配列番号4で表されるアミノ酸をコード
する塩基配列をもつもののほか、縮重コドンにおいての
み異なる同一のポリペプチドをコードする縮重異性体を
も包含するものである。

【００２７】例えば、配列番号4で表わされるアミノ酸
配列の少なくとも１個、好ましくは１〜10個程度、さら
に好ましくは１〜５個のアミノ酸が欠失してもよく、配
列番号4で表わされるアミノ酸配列に少なくとも１個、
好ましくは１〜10個程度、さらに好ましくは１〜５個の
アミノ酸が付加してもよく、あるいは、配列番号4で表
わされるアミノ酸配列の少なくとも１個、好ましくは１
〜10個程度、さらに好ましくは１〜５個のアミノ酸が他
のアミノ酸に置換してもよい。

【００２８】なお、上記欠失等の変異についても、公知
の部位突然変異誘発方法（CurrentProtocols in Molecu
lar Biology 1巻, 8.1.1 頁, 1994年）により、あるい
は市販のキット（Takara社のLA PCR in vitro Mutagene
sis シリーズキット）を用いて誘発することができる。
また、phbB遺伝子には、配列番号3又は6で表される塩基
配列からなるDNAのほか、該DNAとストリンジェントな条
件下でハイブリダイズし、かつアセトアセチル-CoAリダ
クターゼ活性を有するタンパク質をコードするDNAも含
まれる。

【００２９】ストリンジェントな条件については、前記
と同様である。一旦phbB遺伝子の塩基配列が確定される
と、その後は化学合成によって、又は当該遺伝子の5'お
よび3'末端の塩基配列をプライマーとし、ゲノムDNA(配
列番号3又は6)を鋳型としたPCRによって、あるいはphbB
遺伝子の塩基配列を有するDNA断片をプローブとしてハ
イブリダイズさせることによって、phbB遺伝子を得るこ
とができる。

【００３０】２．発現用組換えベクター及び形質転換体
の作製 (1) 発現用組換えベクターの作製 前記１．のようにして調製されたphaC遺伝子及びphbB遺
伝子を、プロモーターとともに適当なベクターに導入す
ることにより本発明の発現用組換えベクターを構築する
ことができる。phaC遺伝子及びphbB遺伝子を挿入するた
めのベクターは、宿主中で複製可能なものであれば特に
限定されず、例えば、プラスミド DNA、ファージ DNA等
が挙げられる。

【００３１】プラスミド DNA（バイナリーベクター）
は、大腸菌やアグロバクテリウムからアルカリ抽出法(B
irnboim,H.C. & Doly,J.(1979) Nucleic acid Res 7: 1
513)等により調製することができる。バイナリーベクタ
ーとしては、例えばpBI121、pBI101等が挙げられる。ま
た、市販のプラスミドとして例えばpUC118（宝酒造社
製）、pUC119 (宝酒造社製）、pBluescript SK+ (Strat
agene 社製）、pGEM-T (Promega 社製)、pCR2.1(Invitr
ogen社製)等を用いてもよい。ファージ DNAとしては、
例えば M13mp18、M13mp19 、M13tv18等が挙げられる。

【００３２】ベクターにプロモーターを挿入するには、
まず、精製されたphaC遺伝子又はphbB遺伝子を適当な制
限酵素で切断し、適当なベクター DNAの制限酵素部位又
はマルチクローニングサイトに挿入してベクターに連結
する方法などが採用される。プロモーターとしては、例
えばカリフラワーモザイクウイルス35Sプロモーター、
アクチンプロモーター、ノパリン合成酵素遺伝子のプロ
モーター等が挙げられる。

【００３３】ここで、発現の目的となる２種類のポリエ
ステル合成酵素遺伝子は、いずれもその遺伝子の機能が
発揮されるようにベクターに組み込まれることが必要で
ある。そこで、本発明の発現用組換えベクターには、上
記プロモーター及び上記遺伝子のほか、ターミネータ
ー、薬物耐性遺伝子等を組み込むことができる。この場
合、ターミネーターとしてはノパリン合成酵素遺伝子の
ターミネーターなどが挙げられ、エンハンサーとしては
タバコモザイクウイルスΩ配列などが挙げられ、薬物耐
性遺伝子としてはカナマイシン耐性遺伝子、ハイグロマ
イシン耐性遺伝子、ビアラホス耐性遺伝子、ブラストサ
イジンS耐性遺伝子などが挙げられる。

【００３４】具体的には、図２に示すように、phbB遺伝
子及びphaC遺伝子をそれぞれカリフラワーモザイクウイ
ルス35Sプロモーター(35S-P)の下流につなぎ、その下流
にノパリン合成酵素遺伝子のターミネーター(Nos-T)を
それぞれつなぐ（それぞれphbB遺伝子カセット及びphaC
遺伝子カセットという）。また、ノパリン合成酵素遺伝
子のプロモーターとターミネーターとの間にカナマイシ
ン耐性遺伝子（NPT II)をつないだカセットも作製する
(NPT IIカセットという）。そして、NPT IIカセット、p
hbB遺伝子カセット及びphaC遺伝子カセットの順で各カ
セットを連結し、本発明の発現用組換えベクター(pBM20
5E)を得ることができる(図2)。

【００３５】(3)形質転換体の作製 本発明の形質転換体（トランスジェニック植物）は、本
発明の組換えベクターを、目的遺伝子が発現し得るよう
に宿主中に導入することにより得ることができる。ここ
で、宿主とは、植物体全体、植物器官(例えば葉、花
弁、茎、根、種子等)、植物組織(例えば表皮、師部、柔
組織、木部、維管束、柵状組織、海綿状組織等)又は植
物培養細胞のいずれをも意味するものである。形質転換
に用いられる植物としては、例えばナス科、イネ科、ア
ブラナ科、キク科、ゴマ科、モクセイ科、フトモモ科、
バラ科、マメ科、ヤシ科又はアカネ科に属する植物が挙
げられる。これらの科に属する植物として例えば以下に
記載するものが挙げられるが、これらの植物に限定され
るものではなく、本発明の発現用組換えベクターを導入
することによりポリエステルを生成し得る能力を有する
限り、任意に植物を選択することができる。

【００３６】ナス科：タバコ（Nicotiana tabacum)、ジ
ャガイモ（Solanum tuberosum) イネ科：トウモロコシ(Zea mays)、イネ(Oryza sativa) アオイ科：ワタ(Gossypium hirsutum)、オクラ(Abelmos
cus esculentum) アブラナ科：シロイヌナズナ(Arabidopsis thaliana)、
ナタネ(Brassica napus) キク科：ヒマワリ(Helianthus annuus) 、キク(Crysant
himum indicum) ゴマ科：ゴマ(Sesame indica) 、ヒマ(Ricinus communi
s) モクセイ科：オリーブ(Olea europaea) 、 フトモモ科：ユーカリ(Eucalyptus globulus)、グアバ
(Psidium guava) バラ科：バラ(Rosa sinnis) ツバキ科：ツバキ(Camellia japonica) マメ科：レンゲソウ(Astragalus sinicus)、ダイズ(Gly
cine max) ヤシ科：ココナツ(Cocos nucifera) アオギリ科：ココア(Theobroma cacao) アカネ科：コーヒーの木(Coffea arabica)

【００３７】植物体、植物器官又は植物組織を宿主とす
る場合、形質転換は、採取した植物切片に本発明の発現
用組換えベクターをアグロバクテリウム法で導入するこ
とにより行うことができる。また、プロトプラストにエ
レクトロポレーション法で導入することもでき、あるい
はパーティクルボンバードメント法で植物器官又は植物
組織に導入することにより行うこともできる。形質転換
の結果得られる腫瘍組織やシュート、毛状根などは、そ
のまま細胞培養、組織培養又は器官培養に用いることが
可能であり、また従来知られている植物組織培養法を用
い、適当な濃度の植物ホルモンの投与などにより植物体
に再生させることができる。

【００３８】植物培養細胞を宿主として用いる場合は、
形質転換は、本発明の発現用組換えベクターをエレクト
ロポレーション法又はアグロバクテリウムのバイナリー
ベクター法等で培養細胞に導入し、以下、前記と同様に
して細胞培養、組織培養、器官培養を行い植物体を得る
ことができる。

【００３９】４．ポリエステルの生産 前記３．のようにして得られた発現用組換えベクターを
含む形質転換体を培養又は栽培すれば、ポリエステルを
生産することができる。形質転換体が植物細胞又は植物
組織である場合は、培養は、通常の植物培養用培地、例
えばMS基本培地(Murashige, T. & Skoog, F. (1962) Ph
ysiol. Plant.15: 473)、LS基本培地(Linsmaier, E. M.
& Skoog, F. (1965) Physiol. Plant.18: 100)、プロ
トプラスト培養培地(LS培地を改変したもの)等を用いる
ことにより行うことができる。培養方法は、通常の固体
培養法でもよいが、液体培養法を採用することが好まし
い。

【００４０】上記培地に、細胞、組織又は器官を0.5〜4
0g新鮮重/l接種し、必要によりNAA、2,4-D、BA、カイネ
チン等を適宜添加して培養する。培養開始時の培地の p
Hは5.6〜5.8に調節し、培養は通常25〜30℃、好ましく
は25℃前後で、20〜120rpm攪拌で1〜8週間培養する。形
質転換体が植物体である場合は、圃場やガラスハウスな
どで栽培又は水耕培養することができる。

【００４１】培養終了後、培養物ポリエステルを採取す
るには、ポリエステルの通常の精製手段を用いることが
できる。そして、培養細胞又は培養組織、植物器官又は
植物体の状態に応じて50％エタノール又はメタノールで
洗浄した後ポリエステルの精製を行う。培養細胞又は培
養組織からポリエステルを採取する場合は、セルラー
ゼ、ペクチナーゼ等の酵素を用いた細胞溶解処理、超音
波破砕処理、磨砕処理等により細胞を破壊し、続いて濾
過又は遠心分離等により不溶物を除去し、粗ポリエステ
ル溶液を得る。

【００４２】上記粗ポリエステル溶液からポリエステル
をさらに精製するには、クロロホルム、酢酸エチル等の
溶媒抽出のほか、通常の精製法を使用することができ
る。例えば、ガスクロマトグラフィー、液体クロマトグ
ラフィー、質量分析、NMR等を、単独又は適宜組み合わ
せることにより行うことができる。植物器官又は植物体
からポリエステルを採取する場合は、超音波破砕処理、
磨砕処理等を行って上記ポリエステルの抽出液を調製
し、クロロホルムを用いて抽出を行い、その後は上記の
精製手法と同様にしてポリエステルを得ることができ
る。

【００４３】以上のようにして得られたポリエステル
は、次式I:

【００４４】

【化３】

【００４５】（Ｒは水素原子又は炭素数１〜４のアルキ
ル基を表す。）で示される3-ヒドロキシアルカン酸の共
重合体（重合度1〜1,000,000）である。

【００４６】例えば、上記共重合体は、次式II：

【００４７】

【化４】

【００４８】（ｎは1〜1,000,000の整数を表す。）で示
されるポリ-3-ヒドロキシブタン酸、あるいは次式III:

【００４９】

【化５】

【００５０】（ｘは0〜1,000,000の整数を表し、ｙは０
〜1,000,000の整数を表し、ｚは０〜1,000,000の整数を
表す。）で示されるポリヒドロキシアルカン酸の構造を
有するものである。

【００５１】

【実施例】以下、実施例により本発明をさらに具体的に
説明する。但し、本発明はこれら実施例にその技術的範
囲が限定されるものではない。 〔実施例１〕ポリエステル合成酵素遺伝子のクローニン
グ (1) アエロモナス・キャビエ由来のポリエステル合成酵
素遺伝子 まず、アエロモナス・キャビエFA440株の染色体DNAライ
ブラリーを作製した。アエロモナス・キャビエFA440株
を100ml のLB培地（１％イーストエキス、0.5％トリプ
トン、0.5 ％塩化ナトリウム、0.1 ％グルコース、ｐＨ
7.5 ）中、30℃で終夜培養した後、臭化ヘキサデシルト
リメチルアンモニウム法（Currnt Protocols in Molecu
lar Biology,1巻, 2.4.3.頁, 1994年; John Wiley & So
ns 出版）により染色体DNAを得た。

【００５２】得られた染色体DNAを制限酵素Sau3AIで部
分分解した。またベクタープラスミドについては、コス
ミドベクターであるpLA2917(ATCC37355)を使用した。こ
のプラスミドを制限酵素Bgl IIで切断し、脱リン酸化処
理（Molecular Cloning,1巻, 5.7.2 頁，1989年; Cold
Spring Harbar Laboratory 出版）を施した後、DNAリガ
ーゼを用いて染色体DNA部分分解断片と連結させた。こ
の連結DNA断片を用いたインビトロ・パッケージング法
（Currnt Protocolsin Molecular Biology,1巻, 5.7.2
頁, 1994年）によって大腸菌S17-1 株を形質転換し、ア
エロモナス・キャビエの染色体DNAライブラリーを得
た。

【００５３】次に、アエロモナス・キャビエのポリエス
テル合成酵素遺伝子を含むDNA断片を得るためのプロー
ブを調製した。これまでに知られている数種のポリエス
テル合成酵素のアミノ酸配列でよく保存されている２つ
の領域を選択し、それをコードする核酸塩基配列を推定
して5'-CC(C/G)CC(C/G)TGGA TCAA(T/C)AAGT(T/A) (T/C)
TA(T/C)ATC-3'（配列番号７）、及び5'-(G/C)AGCCA(G/
C)GC(G/C) GTCCA(A/G)TC(G/C)G GCCACCA-3'（配列番号
８）で表される２種類のオリゴヌクレオチドを合成し
た。

【００５４】これらのオリゴヌクレオチドをプライマー
とし、アエロモナス・キャビエの染色体DNAを鋳型とし
たPCR法によってポリエステル合成酵素遺伝子を部分増
幅した。PCRは、94℃で30秒、50℃で30秒及び72℃で60
秒の反応を１サイクルとしてこれを30サイクル行った。
この部分増幅断片をDIG DNA 標識キット（ベーリンガー
マンハイム社製）によってジゴキシゲニン標識し、プロ
ーブとした。

【００５５】得られたプローブを用いてアエロモナス・
キャビエ染色体DNAライブラリーからコロニーハイブリ
ダイゼーション法によってポリエステル合成酵素遺伝子
を含むプラスミドを有する大腸菌を単離した。この大腸
菌からアルカリ法によってプラスミドを回収することで
ポリエステル合成酵素遺伝子を含むDNA断片を得た。こ
の断片のBglII-EcoRI 断片についてサンガー法によって
塩基配列を決定した。

【００５６】その結果、配列番号5で表わされる3.2kbp
断片の塩基配列が決定された。この3.2kbpの塩基配列中
の第830〜2614番目において、配列番号１で表わされる
塩基配列(1785bp)を含むポリヒドロキシアルカン酸合成
酵素遺伝子を同定することができた。本発明において
は、phaC遺伝子によりコードされるタンパク質(配列番
号2)が、ポリヒドロキシアルカン酸合成酵素活性を有す
る限り、当該遺伝子の塩基配列に欠失、置換、付加等の
変異が生じてもよい。なお、アエロモナス・キャビエFA
440株から得られたphaC遺伝子は、アルカリゲネス・ユ
ートロファス(Alcaligenes eutrophus)に導入され(名
称：Alcaligenseutrophus AC32)、工業技術院生命工学
工業技術研究所（茨城県つくば市東1丁目1番3号）に、
平成８年８月12日付でFERM P-15786として寄託されてい
る。

【００５７】(2)アルカリゲネス・ユートロファス由来
のアセトアセチルCoAリダクターゼ遺伝子 次に、アルカリゲネス・ユートロファス（ATCC 17699）
からphbB遺伝子をクローニングした。クローニング手法
は、(1)記載の方法と同様である。但し、アルカリゲネ
ス・ユートロファスの染色体DNAを鋳型としたPCR法によ
ってアセトアセチルCoAリダクターゼ遺伝子を部分増幅
する際には、プライマーとして以下の配列を有するもの
を使用した。

【００５８】 プライマー1： 5'-AGAGGATCCCAAGGAGTGTACATGACTCAG-3' （配列番号９） プライマー2： 5'-ACTGAGCTCCGCCGGCTGCCGACTGGTTGA-3' （配列番号10） その結果、配列番号６で表わされる2.3kbp断片の塩基配
列が決定された。この2.3kbppの塩基配列中の第1296〜2
036番目において、配列番号３で表わされる塩基配列(74
1bp)を含むアセトアセチルCoAリダクターゼ遺伝子を同
定することができた。なお、本発明においては、phbB遺
伝子によりコードされるタンパク質(配列番号4)が、ア
セトアセチルCoAリダクターゼ活性を有する限り、当該
遺伝子の塩基配列に欠失、置換、付加等の変異が生じて
もよい。

【００５９】〔実施例2〕発現用組換えベクターの構築 ポリヒドロキシアルカン酸合成酵素遺伝子を、phaC特異
的プライマー: プライマー3：AGAGGATCCGTGGGTGAAGGAGAGTACATGAGCC（配列番号11)及び プライマー4：ACTGAGCTCCTACTTCCAGGGATTGTGCG（配列番号12) を用いて増幅した（反応条件は実施例３に記載のものと
同様）。

【００６０】一方、アセトアセチルCoAリダクターゼ遺
伝子を、phbB特異的プライマー： プライマー1: AGAGGATCCCAAGGAGTGTACATGACTCAG（配列番号9)及び プライマー2: ACTGAGCTCCGCCGGCTGCCGACTGGTTGA（配列番号10) を用いて増幅した（反応条件は実施例３に記載のものと
同様）。

【００６１】プラスミドpBI121(クローンテック社)を制
限酵素BamHI及びSacIで切断してβ-グルクロニダーゼ遺
伝子を除いたベクターに、制限酵素BamHI及びSacIで切
断した上記phbB遺伝子断片をT4 DNAリガーゼにより連結
した。このプラスミドを用いて大腸菌JM109株のコンピ
テントセル（宝酒造社）を形質転換して、該形質転換体
からNPT IIカセット及びphbBカセットが順方向に並んだ
プラスミドpBM202を得た。

【００６２】プラスミドpBI121（クローンテック社）の
カリフラワーモザイクウイルス35Sプロモーターの5'側
に位置する制限酵素HindIII部位をEcoRIに変換したプラ
スミドpBI221Eを作製し、これをBamHI及びSacIで切断し
た。この遺伝子断片と、phaC遺伝子断片（phaC特異的プ
ライマーを用いてphaC断片を増幅し、BamHI及びEcoRIで
切断されたもの）とをT4DNAリガーゼにより連結した。
続いて、得られた断片をDNA blunting kit(宝酒造社）
により平滑末端化した後、T4DNAリガーゼにより環状に
し、プラスミドpBM203Eを得た。

【００６３】pBM203Eを制限酵素EcoRIで切断してphaC遺
伝子カセットを取り出し、これを、EcoRIで切断したpBM
202とT4DNAリガーゼにより連結した。得られたプラスミ
ドを用いて大腸菌JM109株のコンピテントセル（宝酒造
社）を形質転換し、得られた形質転換株からNPT IIカセ
ット、phbB遺伝子カセット及びphaC遺伝子カセットが順
方向に並んだプラスミドpBM205Eを得た。

【００６４】〔実施例3〕タバコの形質転換 (1) コンピテントセルの調製 アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacteriu
m tumefaciens) LBA4404株（クローンテック社）を100m
lのYEB培地（0.5％肉エキス、0.1％酵母エキス、0.5％
ペプトン、0.5％スクロース、2mM MgSO₄)で培養した。
菌体を40℃の10mMトリス-塩酸緩衝液(pH8.0)で洗浄した
後YEB培地に懸濁し、コンピテントセルを得た。このコ
ンピテントセルを含む溶液200μlにpBM205溶液(0.1μg/
μl)を12μl添加し、液体窒素中で10分間凍結処理を行
った。次に、30℃で溶解した後30℃で25分インキュベー
トした。これをリファンピシン(20μg/ml）及びカナマ
イシン(100μg/ml）を含むYEB固形培地（1.5％寒天を含
むYEB培地）に塗布し、28℃で3日間培養し、コロニーの
選抜を行った。

【００６５】培養後選抜されたコロニー中に目的の遺伝
子が導入されているか否かを確認するため、プラスミド
を抽出してphbB遺伝子及びphaC遺伝子に特異的なプライ
マーを用いたPCRを行った。PCRの反応液の組成及びプラ
イマーは以下の通りである。

【００６６】 i) phbB遺伝子の増幅 反応液: 10×PCRバッファー 5 μl プラスミド 1 μl プライマー1(配列番号9) 1 μl プライマー2(配列番号10) 1 μl NTP mix （各10mM) 1 μl Taq DNA ポリメラーゼ 0.5 μl 水 40.5 μl 上記反応液を用いて、95℃で1分、60℃で2分及び72℃で
2分の反応を１サイクルとしてこれを30サイクル行っ
た。

【００６７】 ii) phaC遺伝子の増幅 反応液: 10×PCR バッファー 5 μl プラスミド 1 μl プライマー3(配列番号11) 1 μl プライマー4(配列番号12) 1 μl NTP mix （各10mM) 1 μl Taq DNA ポリメラーゼ 0.5μl 水 40.5μl 上記反応液を用いて、95℃で2分、65℃で2分及び72℃で
3分の反応を１サイクルとしてこれを30サイクル行っ
た。次に、反応産物を1.5％アガロース電気泳動にかけ
て遺伝子の検出を行った。その結果、前記選抜されたコ
ロニー中にはphbB及びphaCの両遺伝子が含まれているこ
とが確認された。

【００６８】(2) タバコの形質転換 本実施例では、形質転換用の植物としてタバコ（Nicoti
ana tabacum)の品種であるSumson NN(農林水産省農業生
物資源研究所）を用いた。また、タバコの形質転換はア
グロバクテリウムを用いたリーフディスク法に従って行
った。

【００６９】すなわち、前記(1)により得られたアグロ
バクテリウムのコロニーを、50μg/mlのカナマイシンを
含むYEB培地中、28℃で２日培養した。無菌的に生育さ
せたタバコの葉を１cm角の切片(外植片）にし、この外
植片を前記培養液に10分浸した。過剰な培養液を除いた
後、これらの外植片を固形培地[MS(Murashige and Skoo
g)培地、スクロース30g/L、ナフタレン酢酸(NAA)0.1mg/
L及びベンジルアデニン1mg/L］に移してアグロバクテリ
ウムとの共存培養を2日間行った。

【００７０】次に、クラフォラン(500mg/L)及びカナマ
イシン(100mg/L)を含む前記固形培地に外植片を移植
し、耐性固体の選抜を行った。再生したシュートを、ホ
ルモンを除いた固形培地（MS培地、スクロース30g/L、
クラフォラン500mg/L及びカナマイシン 100mg/L）に移
植し、選抜を続けた。次に、選抜された個体を、園芸培
土を入れた七号鉢に移植して順化させた後、温室でポリ
エステルを抽出できる大きさ（地上茎40〜180cm）まで
生育させた。

【００７１】なお、上記選抜と並行して、カナマイシン
耐性で選抜された形質転換体においてphbB遺伝子及びph
aC遺伝子が発現しているか否かを、RT-PCRにより確認し
た。

【００７２】すなわち、６種類の形質転換体試料(BC1〜
BC6とする)の葉からチオシアン酸グアニジン法によりRN
Aを抽出し、RNA、逆転写酵素及びオリゴｄTプライマー
を含む以下の反応液中、37℃で60分反応させてcDNAを合
成した。

【００７３】 反応液組成: RNA 4 μl 逆転写酵素 1 μl 5×逆転写反応バッファー 4 μl NTP mix 1 μl オリゴdTプライマー 1 μl 水 9 μl 上記のようにして得られたcDNAを鋳型として、phbB遺伝
子及びphaC遺伝子に特異的な以下の各遺伝子検出用プラ
イマーを用いてPCRを行った。

【００７４】 i) phbB遺伝子の増幅 反応液: 10×PCRバッファー 5 μl cDNA 0.5 μl プライマー1(配列番号9) 1 μl プライマー2(配列番号10) 1 μl NTP mix (各10mM) 1 μl Taq DNAポリメラーゼ 0.5 μl 水 41 μl 上記反応液を用いて、95℃で１分、60℃で2分及び72℃
で2分の反応を１サイクルとしてこれを30サイクル行っ
た。

【００７５】 ii) phaC遺伝子の増幅 反応液: 10×PCRバッファー 5 μl cDNA 0.5 μl プライマー3(配列番号11) 1 μl プライマー4(配列番号12) 1 μl NTP mix （各10mM) 1 μl Taq DNA ポリメラーゼ 0.5 μl 水 41 μl 上記反応液を用いて、95℃で２分、65℃で2分及び72℃
で３分の反応を１サイクルとしてこれを30サイクル行っ
た。その結果、BC2、BC3、BC4及びBC5の各形質転換体に
おいてphbB遺伝子及びphaC遺伝子が発現していることが
確認された(図3)。なお、図３において、Nは形質転換さ
せなかったタバコの葉、PはphbB遺伝子又はphaC遺伝子
を含有するプラスミドの陽性対照、並びにM1及びM2は分
子量マーカーを示す。

【００７６】〔実施例4〕 形質転換体中における酵素
活性の確認 (1) ウエスタンブロッティングによるphaC合成酵素の確
認 まず、phaC遺伝子が発現することによりポリヒドロキシ
アルカン酸合成酵素が植物体に蓄積されるか否かをウエ
スタンブロッティングにより確認した。一次抗体とし
て、ポリヒドロキシアルカン酸合成酵素のC末端側の20
個のアミノ酸を有するペプチドをウサギに投与（免疫）
して得られたウサギ抗血清を用い、二次抗体として、抗
ウサギ抗血清をヒツジに投与（免疫）して得られた抗ヒ
ツジ抗体に西洋ワサビ由来パーオキシダーゼを結合させ
たものを用いた。

【００７７】試料の葉(BC2〜5)を、0.1％メルカプトエ
タノールを含む50mMトリス-塩酸緩衝液(pH7.5)中で冷却
しながらホモジナイズし、15,000rpmで20分間遠心した
後、上清を電気泳動用のサンプルとした。このサンプル
を８％のゲルを用いたSDSポリアクリルアミドゲル電気
泳動にかけ、ナイロン膜にエレクトロブロッティングし
た。

【００７８】ナイロン膜を固定し、一次抗体を結合さ
せ、続いて二次抗体を結合させ、市販のキット（ECL-We
stern blotting detection kit; アマシャム社）を用い
た化学発光法により前記酵素を検出した。その結果、BC
3において62kDaの位置にバンドが検出された(図4)。従
って、形質転換植物であるBC3においてポリヒドロキシ
アルカン酸合成酵素が植物体に蓄積されていることが確
認された。

【００７９】(2) アセトアセチル-CoAリダクターゼ活性
の検出 アセトアセチル-CoAリダクターゼは、アセトアセチル-C
oAを基質としてNAD(P)HをNAD(P)+に還元し、3-ヒドロキ
シブチリル-CoAを生成する触媒作用を有する。ポリヒド
ロキシアルカン酸合成酵素又はポリヒドロキシブタン酸
合成酵素が3-ヒドロキシブチリル-CoAを基質として利用
すれば、アセトアセチル-CoAリダクターゼが作用してア
セトアセチル-CoAから3-ヒドロキシブチリル-CoAを生成
することが予想される（図１)。そこで、NAD(P)Hの量を
指標としてアセトアセチル-CoAリダクターゼの酵素活性
の有無を試験した。

【００８０】試料の葉（BC3)を、500μMジチオスレイト
ール及び12μM塩化マグネシウムを含む60mMリン酸緩衝
液(pH7.5)中で冷却しながらホモジナイズし、15,000rpm
で20分遠心した。得られた上清を酵素活性測定に用いる
サンプルとした。アセトアセチル-CoAリダクターゼ活性
を測定する反応液は、100μM NADH又はNADPHを含む上記
緩衝液1.1mlに酵素サンプルを0.1ml加え、30℃で3分保
温したものを用いた。続いて保温後の反応液の1mlにア
セトアセチル-CoAを終濃度100μMとなるように加えて反
応を開始した。

【００８１】アセトアセチル-CoAリダクターゼ反応によ
り消費されるNADH又はNADPHの減少は、340nmでの吸光度
の測定値が減少するか否かによって判断した。なお、対
照として形質転換していないタバコの葉を用いた。その
結果、対照の葉の場合はアセトアセチル-CoAの有無にか
かわらずNADH又はNADPHの減少の程度は同様であったの
に対し、形質転換した葉の場合はアセトアセチル-CoAを
加えると加えないときよりもNADH又はNADPHが大きく減
少した（図5)。従って、形質転換体においてアセトアセ
チル-CoAリダクターゼ活性を有することが示された。

【００８２】〔実施例5〕形質転換体からのポリエステ
ルの生産 (1) ポリエステルの抽出 本発明の発現ベクターが導入されたタバコの組織又は細
胞を再分化することにより植物体とし、この植物体を光
条件が16時間、暗条件が8時間、温度23℃で40日栽培す
ることにより40〜50cm程度の大きさまで生育させた。生
育したタバコ植物体から葉を20〜50g採取し、フラスコ
中で55℃に加温しながら50％エタノール、100％メタノ
ールの順に洗浄を行った。次に、洗浄した葉を乳鉢で磨
砕後、環流装置を付けた丸底フラスコ又はソックスレー
抽出器を使用して60℃でクロロホルム抽出を12〜16時間
行った。抽出画分をエバポレーターで減圧することによ
り濃縮し、冷メタノールを徐々に10倍量まで添加して再
結晶を行った。沈澱物を集め、これをクロロホルムに溶
解して再度メタノールによる再結晶を行った。次に、沈
澱物をクロロホルムに溶解してn-ヘキサンを徐々に10倍
量まで添加して再結晶を行った。得られた結晶化物（5
〜100mg）をポリエステル画分とした。

【００８３】(2) ポリエステルの分析 (1)のようにして得られたポリエステル画分（0.1〜2m
g）をクロロホルムに溶解し、該クロロホルム溶液0.5ml
にエタノール2ml及び濃塩酸0.2mlを添加して試験管を密
封した後、100℃で4時間反応させエタノール溶解を行っ
た。この反応により生じたポリエステル構成成分のエチ
ルエステル(3-ヒドロキシブタン酸エチルエステルなど)
をガスクロマトグラフィー及び質量分析により分析し
た。アエロモナス・キャビエから抽出したポリエステル
を対照として、3-ヒドロキシブタン酸エチルエステルの
溶出時間及びそのピークのマススペクトルを比較した。

【００８４】その結果、形質転換体から抽出したポリエ
ステル及びアエロモナス・キャビエから抽出したポリエ
ステルのいずれの場合も、ガスクロマトグラフィーにお
いて保持時間約4.5分で3-ヒドロキシブタン酸エチルエ
ステルのピークが出現した(図5)。そして、本発明の形
質転換体から得たポリエステルは、アエロモナス・キャ
ビエから抽出したポリエステルとほぼ同程度の量が生成
された(図6)。

【００８５】このピークの画分を分取して質量分析を行
った結果、形質転換体から抽出したポリエステル及びア
エロモナス・キャビエから抽出したポリエステルのいず
れの場合も同様のパターンを示した(図7)。また、得ら
れたポリエステルは、式IIで示されるポリ-3-ヒドロキ
シブタン酸（ｎ＝1000〜10000）であった。従って、本
発明の形質転換体はポリエステルを大量に合成し得るも
のであることが示された。

【００８６】

【発明の効果】本発明により、ポリエステル合成酵素遺
伝子及びアセトアセチル-CoAリダクターゼ遺伝子を含有
する発現用組換えベクター、ポリエステル合成能を有す
る形質転換体及びポリエステルの製造方法が提供され
る。本発明の形質転換体は、石油資源を必要とせずにポ
リエステルを安価かつ大量に合成することができ、しか
も得られるポリエステルは熱可塑性、生物分解性及び弾
性を有しており、幅広い分野に利用できる点で極めて有
用である。

【００８７】

【配列表】

配列番号：1 配列の長さ：1785 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：cDNA to genomic DNA 起源 生物名：アエロモナス・キャビエ（Aeromonas caviae) 株名： FA440 配列の特徴 特徴を表わす記号：CDS 存在位置：1..1785 配列 ATG AGC CAA CCA TCT TAT GGC CCG CTG TTC GAG GCC CTG GCC CAC TAC 48 Met Ser Gln Pro Ser Tyr Gly Pro Leu Phe Glu Ala Leu Ala His Tyr 1 5 10 15 AAT GAC AAG CTG CTG GCC ATG GCC AAG GCC CAG ACA GAG CGC ACC GCC 96 Asn Asp Lys Leu Leu Ala Met Ala Lys Ala Gln Thr Glu Arg Thr Ala 20 25 30 CAG GCG CTG CTG CAG ACC AAT CTG GAC GAT CTG GGC CAG GTG CTG GAG 144 Gln Ala Leu Leu Gln Thr Asn Leu Asp Asp Leu Gly Gln Val Leu Glu 35 40 45 CAG GGC AGC CAG CAA CCC TGG CAG CTG ATC CAG GCC CAG ATG AAC TGG 192 Gln Gly Ser Gln Gln Pro Trp Gln Leu Ile Gln Ala Gln Met Asn Trp 50 55 60 TGG CAG GAT CAG CTC AAG CTG ATG CAG CAC ACC CTG CTC AAA AGC GCA 240 Trp Gln Asp Gln Leu Lys Leu Met Gln His Thr Leu Leu Lys Ser Ala 65 70 75 80 GGC CAG CCG AGC GAG CCG GTG ATC ACC CCG GAG CGC AGC GAT CGC CGC 288 Gly Gln Pro Ser Glu Pro Val Ile Thr Pro Glu Arg Ser Asp Arg Arg 85 90 95 TTC AAG GCC GAG GCC TGG AGC GAA CAA CCC ATC TAT GAC TAC CTC AAG 336 Phe Lys Ala Glu Ala Trp Ser Glu Gln Pro Ile Tyr Asp Tyr Leu Lys 100 105 110 CAG TCC TAC CTG CTC ACC GCC AGG CAC CTG CTG GCC TCG GTG GAT GCC 384 Gln Ser Tyr Leu Leu Thr Ala Arg His Leu Leu Ala Ser Val Asp Ala 115 120 125 CTG GAG GGC GTC CCC CAG AAG AGC CGG GAG CGG CTG CGT TTC TTC ACC 432 Leu Glu Gly Val Pro Gln Lys Ser Arg Glu Arg Leu Arg Phe Phe Thr 130 135 140 CGC CAG TAC GTC AAC GCC ATG GCC CCC AGC AAC TTC CTG GCC ACC AAC 480 Arg Gln Tyr Val Asn Ala Met Ala Pro Ser Asn Phe Leu Ala Thr Asn 145 150 155 160 CCC GAG CTG CTC AAG CTG ACC CTG GAG TCC GAC GGC CAG AAC CTG GTG 528 Pro Glu Leu Leu Lys Leu Thr Leu Glu Ser Asp Gly Gln Asn Leu Val 165 170 175 CGC GGA CTG GCC CTC TTG GCC GAG GAT CTG GAG CGC AGC GCC GAT CAG 576 Arg Gly Leu Ala Leu Leu Ala Glu Asp Leu Glu Arg Ser Ala Asp Gln 180 185 190 CTC AAC ATC CGC CTG ACC GAC GAA TCC GCC TTC GAG CTC GGG CGG GAT 624 Leu Asn Ile Arg Leu Thr Asp Glu Ser Ala Phe Glu Leu Gly Arg Asp 195 200 205 CTG GCC CTG ACC CCG GGC CGG GTG GTG CAG CGC ACC GAG CTC TAT GAG 672 Leu Ala Leu Thr Pro Gly Arg Val Val Gln Arg Thr Glu Leu Tyr Glu 210 215 220 CTC ATT CAG TAC AGC CCG ACT ACC GAG ACG GTG GGC AAG ACA CCT GTG 720 Leu Ile Gln Tyr Ser Pro Thr Thr Glu Thr Val Gly Lys Thr Pro Val 225 230 235 240 CTG ATA GTG CCG CCC TTC ATC AAC AAG TAC TAC ATC ATG GAC ATG CGG 768 Leu Ile Val Pro Pro Phe Ile Asn Lys Tyr Tyr Ile Met Asp Met Arg 245 250 255 CCC CAG AAC TCC CTG GTC GCC TGG CTG GTC GCC CAG GGC CAG ACG GTA 816 Pro Gln Asn Ser Leu Val Ala Trp Leu Val Ala Gln Gly Gln Thr Val 260 265 270 TTC ATG ATC TCC TGG CGC AAC CCG GGC GTG GCC CAG GCC CAA ATC GAT 864 Phe Met Ile Ser Trp Arg Asn Pro Gly Val Ala Gln Ala Gln Ile Asp 275 280 285 CTC GAC GAC TAC GTG GTG GAT GGC GTC ATC GCC GCC CTG GAC GGC GTG 912 Leu Asp Asp Tyr Val Val Asp Gly Val Ile Ala Ala Leu Asp Gly Val 290 295 300 GAG GCG GCC ACC GGC GAG CGG GAG GTG CAC GGC ATC GGC TAC TGC ATC 960 Glu Ala Ala Thr Gly Glu Arg Glu Val His Gly Ile Gly Tyr Cys Ile 305 310 315 320 GGC GGC ACC GCC CTG TCG CTC GCC ATG GGC TGG CTG GCG GCG CGG CGC 1008 Gly Gly Thr Ala Leu Ser Leu Ala Met Gly Trp Leu Ala Ala Arg Arg 325 330 335 CAG AAG CAG CGG GTG CGC ACC GCC ACC CTG TTC ACT ACC CTG CTG GAC 1056 Gln Lys Gln Arg Val Arg Thr Ala Thr Leu Phe Thr Thr Leu Leu Asp 340 345 350 TTC TCC CAG CCC GGG GAG CTT GGC ATC TTC ATC CAC GAG CCC ATC ATA 1104 Phe Ser Gln Pro Gly Glu Leu Gly Ile Phe Ile His Glu Pro Ile Ile 355 360 365 GCG GCG CTC GAG GCG CAA AAT GAG GCC AAG GGC ATC ATG GAC GGG CGC 1152 Ala Ala Leu Glu Ala Gln Asn Glu Ala Lys Gly Ile Met Asp Gly Arg 370 375 380 CAG CTG GCG GTC TCC TTC AGC CTG CTG CGG GAG AAC AGC CTC TAC TGG 1200 Gln Leu Ala Val Ser Phe Ser Leu Leu Arg Glu Asn Ser Leu Tyr Trp 385 390 395 400 AAC TAC TAC ATC GAC AGC TAC CTC AAG GGT CAG AGC CCG GTG GCC TTC 1248 Asn Tyr Tyr Ile Asp Ser Tyr Leu Lys Gly Gln Ser Pro Val Ala Phe 405 410 415 GAT CTG CTG CAC TGG AAC AGC GAC AGC ACC AAT GTG GCG GGC AAG ACC 1296 Asp Leu Leu His Trp Asn Ser Asp Ser Thr Asn Val Ala Gly Lys Thr 420 425 430 CAC AAC AGC CTG CTG CGC CGT CTC TAC CTG GAG AAC CAG CTG GTG AAG 1344 His Asn Ser Leu Leu Arg Arg Leu Tyr Leu Glu Asn Gln Leu Val Lys 435 440 445 GGG GAG CTC AAG ATC CGC AAC ACC CGC ATC GAT CTC GGC AAG GTG AAG 1392 Gly Glu Leu Lys Ile Arg Asn Thr Arg Ile Asp Leu Gly Lys Val Lys 450 455 460 ACC CCT GTG CTG CTG GTG TCG GCG GTG GAC GAT CAC ATC GCC CTC TGG 1440 Thr Pro Val Leu Leu Val Ser Ala Val Asp Asp His Ile Ala Leu Trp 465 470 475 480 CAG GGC ACC TGG CAG GGC ATG AAG CTG TTT GGC GGG GAG CAG CGC TTC 1488 Gln Gly Thr Trp Gln Gly Met Lys Leu Phe Gly Gly Glu Gln Arg Phe 485 490 495 CTC CTG GCG GAG TCC GGC CAC ATC GCC GGC ATC ATC AAC CCG CCG GCC 1536 Leu Leu Ala Glu Ser Gly His Ile Ala Gly Ile Ile Asn Pro Pro Ala 500 505 510 GCC AAC AAG TAC GGC TTC TGG CAC AAC GGG GCC GAG GCC GAG AGC CCG 1584 Ala Asn Lys Tyr Gly Phe Trp His Asn Gly Ala Glu Ala Glu Ser Pro 515 520 525 GAG AGC TGG CTG GCA GGG GCG ACG CAC CAG GGC GGC TCC TGG TGG CCC 1632 Glu Ser Trp Leu Ala Gly Ala Thr His Gln Gly Gly Ser Trp Trp Pro 530 535 540 GAG ATG ATG GGC TTT ATC CAG AAC CGT GAC GAA GGG TCA GAG CCC GTC 1680 Glu Met Met Gly Phe Ile Gln Asn Arg Asp Glu Gly Ser Glu Pro Val 545 550 555 560 CCC GCG CGG GTC CCG GAG GAA GGG CTG GCC CCC GCC CCC GGC CAC TAT 1728 Pro Ala Arg Val Pro Glu Glu Gly Leu Ala Pro Ala Pro Gly His Tyr 565 570 575 GTC AAG GTG CGG CTC AAC CCC GTG TTT GCC TGC CCA ACA GAG GAG GAC 1776 Val Lys Val Arg Leu Asn Pro Val Phe Ala Cys Pro Thr Glu Glu Asp 580 585 590 GCC GCA TGA 1785 Ala Ala

【００８８】配列番号：2 配列の長さ：594 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 配列 Met Ser Gln Pro Ser Tyr Gly Pro Leu Phe Glu Ala Leu Ala His Tyr 1 5 10 15 Asn Asp Lys Leu Leu Ala Met Ala Lys Ala Gln Thr Glu Arg Thr Ala 20 25 30 Gln Ala Leu Leu Gln Thr Asn Leu Asp Asp Leu Gly Gln Val Leu Glu 35 40 45 Gln Gly Ser Gln Gln Pro Trp Gln Leu Ile Gln Ala Gln Met Asn Trp 50 55 60 Trp Gln Asp Gln Leu Lys Leu Met Gln His Thr Leu Leu Lys Ser Ala 65 70 75 80 Gly Gln Pro Ser Glu Pro Val Ile Thr Pro Glu Arg Ser Asp Arg Arg 85 90 95 Phe Lys Ala Glu Ala Trp Ser Glu Gln Pro Ile Tyr Asp Tyr Leu Lys 100 105 110 Gln Ser Tyr Leu Leu Thr Ala Arg His Leu Leu Ala Ser Val Asp Ala 115 120 125 Leu Glu Gly Val Pro Gln Lys Ser Arg Glu Arg Leu Arg Phe Phe Thr 130 135 140 Arg Gln Tyr Val Asn Ala Met Ala Pro Ser Asn Phe Leu Ala Thr Asn 145 150 155 160 Pro Glu Leu Leu Lys Leu Thr Leu Glu Ser Asp Gly Gln Asn Leu Val 165 170 175 Arg Gly Leu Ala Leu Leu Ala Glu Asp Leu Glu Arg Ser Ala Asp Gln 180 185 190 Leu Asn Ile Arg Leu Thr Asp Glu Ser Ala Phe Glu Leu Gly Arg Asp 195 200 205 Leu Ala Leu Thr Pro Gly Arg Val Val Gln Arg Thr Glu Leu Tyr Glu 210 215 220 Leu Ile Gln Tyr Ser Pro Thr Thr Glu Thr Val Gly Lys Thr Pro Val 225 230 235 240 Leu Ile Val Pro Pro Phe Ile Asn Lys Tyr Tyr Ile Met Asp Met Arg 245 250 255 Pro Gln Asn Ser Leu Val Ala Trp Leu Val Ala Gln Gly Gln Thr Val 260 265 270 Phe Met Ile Ser Trp Arg Asn Pro Gly Val Ala Gln Ala Gln Ile Asp 275 280 285 Leu Asp Asp Tyr Val Val Asp Gly Val Ile Ala Ala Leu Asp Gly Val 290 295 300 Glu Ala Ala Thr Gly Glu Arg Glu Val His Gly Ile Gly Tyr Cys Ile 305 310 315 320 Gly Gly Thr Ala Leu Ser Leu Ala Met Gly Trp Leu Ala Ala Arg Arg 325 330 335 Gln Lys Gln Arg Val Arg Thr Ala Thr Leu Phe Thr Thr Leu Leu Asp 340 345 350 Phe Ser Gln Pro Gly Glu Leu Gly Ile Phe Ile His Glu Pro Ile Ile 355 360 365 Ala Ala Leu Glu Ala Gln Asn Glu Ala Lys Gly Ile Met Asp Gly Arg 370 375 380 Gln Leu Ala Val Ser Phe Ser Leu Leu Arg Glu Asn Ser Leu Tyr Trp 385 390 395 400 Asn Tyr Tyr Ile Asp Ser Tyr Leu Lys Gly Gln Ser Pro Val Ala Phe 405 410 415 Asp Leu Leu His Trp Asn Ser Asp Ser Thr Asn Val Ala Gly Lys Thr 420 425 430 His Asn Ser Leu Leu Arg Arg Leu Tyr Leu Glu Asn Gln Leu Val Lys 435 440 445 Gly Glu Leu Lys Ile Arg Asn Thr Arg Ile Asp Leu Gly Lys Val Lys 450 455 460 Thr Pro Val Leu Leu Val Ser Ala Val Asp Asp His Ile Ala Leu Trp 465 470 475 480 Gln Gly Thr Trp Gln Gly Met Lys Leu Phe Gly Gly Glu Gln Arg Phe 485 490 495 Leu Leu Ala Glu Ser Gly His Ile Ala Gly Ile Ile Asn Pro Pro Ala 500 505 510 Ala Asn Lys Tyr Gly Phe Trp His Asn Gly Ala Glu Ala Glu Ser Pro 515 520 525 Glu Ser Trp Leu Ala Gly Ala Thr His Gln Gly Gly Ser Trp Trp Pro 530 535 540 Glu Met Met Gly Phe Ile Gln Asn Arg Asp Glu Gly Ser Glu Pro Val 545 550 555 560 Pro Ala Arg Val Pro Glu Glu Gly Leu Ala Pro Ala Pro Gly His Tyr 565 570 575 Val Lys Val Arg Leu Asn Pro Val Phe Ala Cys Pro Thr Glu Glu Asp 580 585 590 Ala Ala

【００８９】配列番号：3 配列の長さ：741 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：cDNA to genomic DNA 起源 生物名：アルカリゲネス・ユートロファス(Alcaligens
eutrophus) 株名： 配列の特徴 特徴を表わす記号：CDS 存在位置：1..741 配列 ATG ACT CAG CGC ATT GCG TAT GTG ACC GGC GGC ATG GGT GGT ATC GGA 48 Met Thr Gln Arg Ile Ala Tyr Val Thr Gly Gly Met Gly Gly Ile Gly 1 5 10 15 ACC GCC ATT TGC CAG CGG CTG GCC AAG GAT GGC TTT CGT GTG GTG GCC 96 Thr Ala Ile Cys Gln Arg Leu Ala Lys Asp Gly Phe Arg Val Val Ala 20 25 30 GGT TGC GGC CCC AAC TCG CCG CGC CGC GAA AAG TGG CTG GAG CAG CAG 144 Gly Cys Gly Pro Asn Ser Pro Arg Arg Glu Lys Trp Leu Glu Gln Gln 35 40 45 AAG GCC CTG GGC TTC GAT TTC ATT GCC TCG GAA GGC AAT GTG GCT GAC 192 Lys Ala Leu Gly Phe Asp Phe Ile Ala Ser Glu Gly Asn Val Ala Asp 50 55 60 TGG GAC TCG ACC AAG ACC GCA TTC GAC AAG GTC AAG TCC GAG GTC GGC 240 Trp Asp Ser Thr Lys Thr Ala Phe Asp Lys Val Lys Ser Glu Val Gly 65 70 75 80 GAG GTT GAT GTG CTG ATC AAC AAC GCC GGT ATC ACC CGC GAC GTG GTG 288 Glu Val Asp Val Leu Ile Asn Asn Ala Gly Ile Thr Arg Asp Val Val 85 90 95 TTC CGC AAG ATG ACC CGC GCC GAC TGG GAT GCG GTG ATC GAC ACC AAC 336 Phe Arg Lys Met Thr Arg Ala Asp Trp Asp Ala Val Ile Asp Thr Asn 100 105 110 CTG ACC TCG CTG TTC AAC GTC ACC AAG CAG GTG ATC GAC GGC ATG GCC 384 Leu Thr Ser Leu Phe Asn Val Thr Lys Gln Val Ile Asp Gly Met Ala 115 120 125 GAC CGT GGC TGG GGC CGC ATC GTC AAC ATC TCG TCG GTG AAC GGG CAG 432 Asp Arg Gly Trp Gly Arg Ile Val Asn Ile Ser Ser Val Asn Gly Gln 130 135 140 AAG GGC CAG TTC GGC CAG ACC AAC TAC TCC ACC GCC AAG GCC GGC CTG 480 Lys Gly Gln Phe Gly Gln Thr Asn Tyr Ser Thr Ala Lys Ala Gly Leu 145 150 155 160 CAT GGC TTC ACC ATG GCA CTG GCG CAG GAA GTG GCG ACC AAG GGC GTG 528 His Gly Phe Thr Met Ala Leu Ala Gln Glu Val Ala Thr Lys Gly Val 165 170 175 ACC GTC AAC ACG GTC TCT CCG GGC TAT ATC GCC ACC GAC ATG GTC AAG 576 Thr Val Asn Thr Val Ser Pro Gly Tyr Ile Ala Thr Asp Met Val Lys 180 185 190 GCG ATC CGC CAG GAC GTG CTC GAC AAG ATC GTC GCG ACG ATC CCG GTC 624 Ala Ile Arg Gln Asp Val Leu Asp Lys Ile Val Ala Thr Ile Pro Val 195 200 205 AAG CGC CTG GGC CTG CCG GAA GAG ATC GCC TCG ATC TGC GCC TGG TTG 672 Lys Arg Leu Gly Leu Pro Glu Glu Ile Ala Ser Ile Cys Ala Trp Leu 210 215 220 TCG TCG GAG GAG TCC GGT TTC TCG ACC GGC GCC GAC TTC TCG CTC AAC 720 Ser Ser Glu Glu Ser Gly Phe Ser Thr Gly Ala Asp Phe Ser Leu Asn 225 230 235 240 GGC GGC CTG CAT ATG GGC TGA 741 Gly Gly Leu His Met Gly 245

【００９０】配列番号：4 配列の長さ：246 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 配列 Met Thr Gln Arg Ile Ala Tyr Val Thr Gly Gly Met Gly Gly Ile Gly 1 5 10 15 Thr Ala Ile Cys Gln Arg Leu Ala Lys Asp Gly Phe Arg Val Val Ala 20 25 30 Gly Cys Gly Pro Asn Ser Pro Arg Arg Glu Lys Trp Leu Glu Gln Gln 35 40 45 Lys Ala Leu Gly Phe Asp Phe Ile Ala Ser Glu Gly Asn Val Ala Asp 50 55 60 Trp Asp Ser Thr Lys Thr Ala Phe Asp Lys Val Lys Ser Glu Val Gly 65 70 75 80 Glu Val Asp Val Leu Ile Asn Asn Ala Gly Ile Thr Arg Asp Val Val 85 90 95 Phe Arg Lys Met Thr Arg Ala Asp Trp Asp Ala Val Ile Asp Thr Asn 100 105 110 Leu Thr Ser Leu Phe Asn Val Thr Lys Gln Val Ile Asp Gly Met Ala 115 120 125 Asp Arg Gly Trp Gly Arg Ile Val Asn Ile Ser Ser Val Asn Gly Gln 130 135 140 Lys Gly Gln Phe Gly Gln Thr Asn Tyr Ser Thr Ala Lys Ala Gly Leu 145 150 155 160 His Gly Phe Thr Met Ala Leu Ala Gln Glu Val Ala Thr Lys Gly Val 165 170 175 Thr Val Asn Thr Val Ser Pro Gly Tyr Ile Ala Thr Asp Met Val Lys 180 185 190 Ala Ile Arg Gln Asp Val Leu Asp Lys Ile Val Ala Thr Ile Pro Val 195 200 205 Lys Arg Leu Gly Leu Pro Glu Glu Ile Ala Ser Ile Cys Ala Trp Leu 210 215 220 Ser Ser Glu Glu Ser Gly Phe Ser Thr Gly Ala Asp Phe Ser Leu Asn 225 230 235 240 Gly Gly Leu His Met Gly 245

【００９１】配列番号：5 配列の長さ：3187 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：cDNA to genomic DNA 起源 生物名：アエロモナス・キャビエ（Aeromonas caviae) 株名： FA440 配列 AGATCTGGAC CGGGGTGCTG GCCTGGGCCA CGCCGGCGAG GGCCAGCGCG GAGCAACCGA 60 GCAGCAGGGC GAGAGGTTTC ATCGGGATTC CTTGGCAGTC TGAATGACGT GCCAGCCTAT 120 CAGCGCGGCG CCGGTGCGGC GAGGGCGCGC CGGACCCAGT GCGTCACCTC TCGTCTGATC 180 CGCCTCCCTC GACGGGCGTC GCTGACAAAA AAATTCAAAC AGAAATTAAC ATTTATGTCA 240 TTTACACCAA ACCGCATTTG GTTGCAGAAT GCTCAAACGT GTGTTTGAAC AGAGCAAGCA 300 ACACGTAAAC AGGGATGACA TGCAGTACCC GTAAGAAGGG CCGATTGGCC CACAACAACA 360 CTGTTCTGCC GAACTGGAGA CCGATGATGA ATATGGACGT GATCAAGAGC TTTACCGAGC 420 AGATGCAAGG CTTCGCCGCC CCCCTCACCC GCTACAACCA GCTGCTGGCC AGCAACATCG 480 AACAGCTGAC CCGGTTGCAG CTGGCCTCCG CCAACGCCTA CGCCGAACTG GGCCTCAACC 540 AGTTGCAGGC CGTGAGCAAG GTGCAGGACA CCCAGAGCCT GGCGGCCCTG GGCACAGTGC 600 AACTGGAGAC CGCCAGCCAG CTCTCCCGCC AGATGCTGGA TGACATCCAG AAGCTGAGCG 660 CCCTCGGCCA GCAGTTCAAG GAAGAGCTGG ATGTCCTGAC CGCAGACGGC ATCAAGAAAA 720 GCACGGGCAA GGCCTGATAA CCCCTGGCTG CCCGTTCGGG CAGCCACATC TCCCCATGAC 780 TCGACGCTAC GGGCTAGTTC CCGCCTCGGG TGTGGGTGAA GGAGAGCACA TGAGCCAACC 840 ATCTTATGGC CCGCTGTTCG AGGCCCTGGC CCACTACAAT GACAAGCTGC TGGCCATGGC 900 CAAGGCCCAG ACAGAGCGCA CCGCCCAGGC GCTGCTGCAG ACCAATCTGG ACGATCTGGG 960 CCAGGTGCTG GAGCAGGGCA GCCAGCAACC CTGGCAGCTG ATCCAGGCCC AGATGAACTG 1020 GTGGCAGGAT CAGCTCAAGC TGATGCAGCA CACCCTGCTC AAAAGCGCAG GCCAGCCGAG 1080 CGAGCCGGTG ATCACCCCGG AGCGCAGCGA TCGCCGCTTC AAGGCCGAGG CCTGGAGCGA 1140 ACAACCCATC TATGACTACC TCAAGCAGTC CTACCTGCTC ACCGCCAGGC ACCTGCTGGC 1200 CTCGGTGGAT GCCCTGGAGG GCGTCCCCCA GAAGAGCCGG GAGCGGCTGC GTTTCTTCAC 1260 CCGCCAGTAC GTCAACGCCA TGGCCCCCAG CAACTTCCTG GCCACCAACC CCGAGCTGCT 1320 CAAGCTGACC CTGGAGTCCG ACGGCCAGAA CCTGGTGCGC GGACTGGCCC TCTTGGCCGA 1380 GGATCTGGAG CGCAGCGCCG ATCAGCTCAA CATCCGCCTG ACCGACGAAT CCGCCTTCGA 1440 GCTCGGGCGG GATCTGGCCC TGACCCCGGG CCGGGTGGTG CAGCGCACCG AGCTCTATGA 1500 GCTCATTCAG TACAGCCCGA CTACCGAGAC GGTGGGCAAG ACACCTGTGC TGATAGTGCC 1560 GCCCTTCATC AACAAGTACT ACATCATGGA CATGCGGCCC CAGAACTCCC TGGTCGCCTG 1620 GCTGGTCGCC CAGGGCCAGA CGGTATTCAT GATCTCCTGG CGCAACCCGG GCGTGGCCCA 1680 GGCCCAAATC GATCTCGACG ACTACGTGGT GGATGGCGTC ATCGCCGCCC TGGACGGCGT 1740 GGAGGCGGCC ACCGGCGAGC GGGAGGTGCA CGGCATCGGC TACTGCATCG GCGGCACCGC 1800 CCTGTCGCTC GCCATGGGCT GGCTGGCGGC GCGGCGCCAG AAGCAGCGGG TGCGCACCGC 1860 CACCCTGTTC ACTACCCTGC TGGACTTCTC CCAGCCCGGG GAGCTTGGCA TCTTCATCCA 1920 CGAGCCCATC ATAGCGGCGC TCGAGGCGCA AAATGAGGCC AAGGGCATCA TGGACGGGCG 1980 CCAGCTGGCG GTCTCCTTCA GCCTGCTGCG GGAGAACAGC CTCTACTGGA ACTACTACAT 2040 CGACAGCTAC CTCAAGGGTC AGAGCCCGGT GGCCTTCGAT CTGCTGCACT GGAACAGCGA 2100 CAGCACCAAT GTGGCGGGCA AGACCCACAA CAGCCTGCTG CGCCGTCTCT ACCTGGAGAA 2160 CCAGCTGGTG AAGGGGGAGC TCAAGATCCG CAACACCCGC ATCGATCTCG GCAAGGTGAA 2220 GACCCCTGTG CTGCTGGTGT CGGCGGTGGA CGATCACATC GCCCTCTGGC AGGGCACCTG 2280 GCAGGGCATG AAGCTGTTTG GCGGGGAGCA GCGCTTCCTC CTGGCGGAGT CCGGCCACAT 2340 CGCCGGCATC ATCAACCCGC CGGCCGCCAA CAAGTACGGC TTCTGGCACA ACGGGGCCGA 2400 GGCCGAGAGC CCGGAGAGCT GGCTGGCAGG GGCGACGCAC CAGGGCGGCT CCTGGTGGCC 2460 CGAGATGATG GGCTTTATCC AGAACCGTGA CGAAGGGTCA GAGCCCGTCC CCGCGCGGGT 2520 CCCGGAGGAA GGGCTGGCCC CCGCCCCCGG CCACTATGTC AAGGTGCGGC TCAACCCCGT 2580 GTTTGCCTGC CCAACAGAGG AGGACGCCGC ATGAGCGCAC AATCCCTGGA AGTAGGCCAG 2640 AAGGCCCGTC TCAGCAAGCG GTTCGGGGCG GCGGAGGTAG CCGCCTTCGC CGCGCTCTCG 2700 GAGGACTTCA ACCCCCTGCA CCTGGACCCG GCCTTCGCCG CCACCACGGC GTTCGAGCGG 2760 CCCATAGTCC ACGGCATGCT GCTCGCCAGC CTCTTCTCCG GGCTGCTGGG CCAGCAGTTG 2820 CCGGGCAAGG GGAGCATCTA TCTGGGTCAA AGCCTCAGCT TCAAGCTGCC GGTCTTTGTC 2880 GGGGACGAGG TGACGGCCGA GGTGGAGGTG ACCGCCCTTC GCGAGGACAA GCCCATCGCC 2940 ACCCTGACCA CCCGCATCTT CACCCAAGGC GGCGCCCTCG CCGTGACGGG GGAAGCCGTG 3000 GTCAAGCTGC CTTAAGCACC GGCGGCACGC AGGCACAATC AGCCCGGCCC CTGCCGGGCT 3060 GATTGTTCTC CCCCGCTCCG CTTGCCCCCT TTTTCGGGGC AATTTGGCCC AGGCCCTTTC 3120 CCTGCCCCGC CTAACTGCCT AAAATGGCCG CCCTGCCGTG TAGGCATTCA TCCAGCTAGA 3180 GGAATTC 3187

【００９２】配列番号：6 配列の長さ：2328 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：cDNA to genomic DNA 起源 生物名：アルカリゲネス・ユートロファス(Alcaligens
eutrophus) 株名： 配列 CTGCAGGTTC CCTCCCGTTT CCATTGAAAG GACTACACAA TGACTGACGT TGTCATCGTA 60 TCCGCCGCCC GCACCGCGGT CGGCAAGTTT GGCGGCTCGC TGGCCAAGAT CCCGGCACCG 120 GAACTGGGTG CCGTGGTCAT CAAGGCCGCG CTGGAGCGCG CCGGCGTCAA GCCGGAGCAG 180 GTGAGCGAAG TCATCATGGG CCAGGTGCTG ACCGCCGGTT CGGGCCAGAA CCCCGCACGC 240 CAGGCCGCGA TCAAGGCCGG CCTGCCGGCG ATGGTGCCGG CCATGACCAT CAACAAGGTG 300 TGCGGCTCGG GCCTGAAGGC CGTGATGCTG GCCGCCAACG CGATCATGGC GGGCGACGCC 360 GAGATCGTGG TGGCCGGCGG CCAGGAAAAC ATGAGCGCCG CCCCGCACGT GCTGCCGGGC 420 TCGCGCGATG GTTTCCGCAT GGGCGATGCC AAGCTGGTCG ACACCATGAT CGTCGACGGC 480 CTGTGGGACG TGTACAACCA GTACCACATG GGCATCACCG CCGAGAACGT GGCCAAGGAA 540 TACGGCATCA CACGCGAGGC GCAGGATGAG TTCGCCGTCG GCTCGCAGAA CAAGGCCGAA 600 GCCGCGCAGA AGGCCGGCAA GTTTGACGAA GAGATCGTCC CGGTGCTGAT CCCGCAGCGC 660 AAGGGCGACC CGGTGGCCTT CAAGACCGAC GAGTTCGTGC GCCAGGGCGC CACGCTGGAC 720 AGCATGTCCG GCCTCAAGCC CGCCTTCGAC AAGGCCGGCA CGGTGACCGC GGCCAACGCC 780 TCGGGCCTGA ACGACGGCGC CGCCGCGGTG GTGGTGATGT CGGCGGCCAA GGCCAAGGAA 840 CTGGGCCTGA CCCCGCTGGC CACGATCAAG AGCTATGCCA ACGCCGGTGT CGATCCCAAG 900 GTGATGGGCA TGGGCCCGGT GCCGGCCTCC AAGCGCGCCC TGTCGCGCGC CGAGTGGACC 960 CCGCAAGACC TGGACCTGAT GGAGATCAAC GAGGCCTTTG CCGCGCAGGC GCTGGCGGTG 1020 CACCAGCAGA TGGGCTGGGA CACCTCCAAG GTCAATGTGA ACGGCGGCGC CATCGCCATC 1080 GGCCACCCGA TCGGCGCGTC GGGCTGCCGT ATCCTGGTGA CGCTGCTGCA CGAGATGAAG 1140 CGCCGTGACG CGAAGAAGGG CCTGGCCTCG CTGTGCATCG GCGGCGGCAT GGGCGTGGCG 1200 CTGGCAGTCG AGCGCAAATA AGGAAGGGGT TTTCCGGGGC CGCGCGCGGT TGGCGCGGAC 1260 CCGGCGACGA TAACGAAGCC AATCAAGGAG TGGACATGAC TCAGCGCATT GCGTATGTGA 1320 CCGGCGGCAT GGGTGGTATC GGAACCGCCA TTTGCCAGCG GCTGGCCAAG GATGGCTTTC 1380 GTGTGGTGGC CGGTTGCGGC CCCAACTCGC CGCGCCGCGA AAAGTGGCTG GAGCAGCAGA 1440 AGGCCCTGGG CTTCGATTTC ATTGCCTCGG AAGGCAATGT GGCTGACTGG GACTCGACCA 1500 AGACCGCATT CGACAAGGTC AAGTCCGAGG TCGGCGAGGT TGATGTGCTG ATCAACAACG 1560 CCGGTATCAC CCGCGACGTG GTGTTCCGCA AGATGACCCG CGCCGACTGG GATGCGGTGA 1620 TCGACACCAA CCTGACCTCG CTGTTCAACG TCACCAAGCA GGTGATCGAC GGCATGGCCG 1680 ACCGTGGCTG GGGCCGCATC GTCAACATCT CGTCGGTGAA CGGGCAGAAG GGCCAGTTCG 1740 GCCAGACCAA CTACTCCACC GCCAAGGCCG GCCTGCATGG CTTCACCATG GCACTGGCGC 1800 AGGAAGTGGC GACCAAGGGC GTGACCGTCA ACACGGTCTC TCCGGGCTAT ATCGCCACCG 1860 ACATGGTCAA GGCGATCCGC CAGGACGTGC TCGACAAGAT CGTCGCGACG ATCCCGGTCA 1920 AGCGCCTGGG CCTGCCGGAA GAGATCGCCT CGATCTGCGC CTGGTTGTCG TCGGAGGAGT 1980 CCGGTTTCTC GACCGGCGCC GACTTCTCGC TCAACGGCGG CCTGCATATG GGCTGACCTG 2040 CCGGCCTGGT TCAACCAGTC GGCAGCCGGC GCTGGCGCCC GCGTATTGCG GTGCAGCCAG 2100 CGCGGCGCAC AAGGCGGCGG GCGTTTCGTT TCGCCGCCCG TTTCGCGGGC CGTCAAGGCC 2160 CGCGAATCGT TTCTGCCCGC GCGGCATTCC TCGCTTTTTG CGCCAATTCA CCGGGTTTTC 2220 CTTAAGCCCC GTCGCTTTTC TTAGTGCCTT GTTGGGCATA GAATCAGGGC AGCGGCGCAG 2280 CCAGCACCAT GTTCGTGCAG CGCGGCCCTC GCGGGGGCGA GGCTGCAG 2328

【００９３】配列番号：7 配列の長さ：27 配列の型: 核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列 CCSCCSTGGA TCAAYAAGTW YTAYATC 27

【００９４】配列番号：8 配列の長さ：27 配列の型: 核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列 SAGCCASGCS GTCCARTCSG GCCACCA 27

【００９５】配列番号：9 配列の長さ：30 配列の型: 核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列 AGAGGATCCC AAGGAGTGTA CATGACTCAG 30

【００９６】配列番号：10 配列の長さ：30 配列の型: 核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列 ACTGAGCTCC GCCGGCTGCC GACTGGTTGA 30

【００９７】配列番号：11 配列の長さ：34 配列の型: 核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列 AGAGGATCCG TGGGTGAAGG AGAGTACATG AGCC 34

【００９８】配列番号：12 配列の長さ：29 配列の型: 核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列 ACTGAGCTCC TACTTCCAGG GATTGTGCG 29

【図面の簡単な説明】

【図１】ポリエステルの生合成経路を示す図である。

【図２】バイナリーベクターpBM205E の構築図である。

【図３】phbB mRNA 及びphaC mRNA のRT-PCRによる検出
結果を示す電気泳動写真である。

【図４】ウエスタンブロッティングの結果を示す電気泳
動写真である。

【図５】アセトアセチル-CoAリダクターゼ活性の検出結
果を示す図である。

【図６】ポリエステルのガスクロマトグラフィー分析の
結果を示す図である。

【図７】3-ヒドロキシブタン酸エチルエステルのマスス
ペクトルを示す図である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ //(Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｐ 7/62 Ｃ１２Ｒ 1:91） (72)発明者 山口 勇 埼玉県和光市広沢２番１号 理化学研究所 内 (72)発明者 吉岡 啓子 埼玉県朝霞市仲町２−２−38−303 (72)発明者 福居 俊昭 埼玉県和光市広沢２番１号 理化学研究所 内 (72)発明者 土肥 義治 埼玉県和光市広沢２番１号 理化学研究所 内

Claims (8)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 以下の(a)又は(b)のタンパク質をコード
   する遺伝子と、以下の(c)又は(d)のタンパク質をコード
   する遺伝子とを含有する発現用組換えベクター。 (a) 配列番号２で表わされるアミノ酸配列からなるタン
   パク質 (b) 配列番号２で表わされるアミノ酸配列において少な
   くとも１個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加された
   アミノ酸配列からなり、かつポリエステル合成酵素活性
   を有するタンパク質 (c) 配列番号４で表わされるアミノ酸配列からなるタン
   パク質 (d) 配列番号４で表わされるアミノ酸配列において少な
   くとも１個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加された
   アミノ酸配列からなり、かつアセトアセチル-CoAリダク
   ターゼ活性を有するタンパク質
2. 【請求項２】 以下の(e)又は(f)のDNAを含む遺伝子
   と、以下の(g)又は(h)のDNAを含む遺伝子とを含有する
   発現用組換えベクター。 (e) 配列番号１で表わされる塩基配列からなるDNA (f) (e)の塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条
   件下でハイブリダイズし、かつポリエステル合成酵素活
   性を有するタンパク質をコードするDNA (g) 配列番号３で表わされる塩基配列からなるDNA (h) (g)の塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条
   件下でハイブリダイズし、かつアセトアセチル-CoAリダ
   クターゼ活性を有するタンパク質をコードするDNA
3. 【請求項３】 請求項１又は２記載の組換えベクターを
   含む形質転換体。
4. 【請求項４】 形質転換体が植物体、植物器官、植物組
   織又は植物培養細胞である請求項３記載の形質転換体。
5. 【請求項５】 植物が、ナス科、イネ科、アオイ科、ア
   ブラナ科、キク科、ゴマ科、モクセイ科、フトモモ科、
   バラ科、ツバキ科、マメ科、ヤシ科、アオギリ科及びア
   カネ科からなる群から選択されるいずれかの科に属する
   植物である請求項４記載の形質転換体。
6. 【請求項６】 ナス科に属する植物がタバコである請求
   項５記載の形質転換体。
7. 【請求項７】 請求項３〜６のいずれか１項に記載の形
   質転換体を培養又は栽培し、得られる培養物又は栽培物
   からポリエステルを採取することを特徴とするポリエス
   テルの製造方法。
8. 【請求項８】 ポリエステルが、次式Ｉ： 【化１】 （Ｒは水素原子又は炭素数１〜４のアルキル基を表
   す。）で示される3-ヒドロキシアルカン酸の共重合体で
   ある請求項７記載の製造方法。