NL9201288A - Transgeneplanten die polyhydroxyalkanoaten produceren. - Google Patents

Description

Korte aanduiding: Transgeneplanten die polyhydroxyalkanoaten produceren.

Deze uitvinding heeft betrekking op het introduceren en tot expressie brengen van bepaald genetisch informatie dragend materiaal, dat wil zeggen DNA dat genen bevat die coderen voor eiwitachtige materialen en/of genen die de produktie daarvan reguleren of anderszinds beïnvloeden, in cellen van hogere planten en het opkweken van vruchtbare planten uit de genetisch gemodificeerde cellen. Het doel van deze genetische interventie is om het vermogen polymere materialen bestaande uit lineaire polyesters of hydroxy-zuren te produceren van microbiële organismen over te brengen naar hogere planten. Deze klasse verbindingen wordt algemeen polyhydroxyalkanoaten genoemd. Het hier getoonde specifieke voorbeeld is de produktie van polyhydroxybuty-raat (PHB).

Vele soorten bacteriën hopen granulen bestaande uit polyesters uit hydroxyacylmonomeren op, die dienen als koolstofreserves. Het voorkomen, metabolisme, metabolische rol, en industrieel gebruik van bacteriële polyhydroxyalkanoaten is recentelijk beschreven (Anderson, A. and Dawes, E. A., Microbiol. Rev. 54:450-472 (1990)). De meest voorkomende verbinding van deze soort is poly(D(-)-3-hydroxybut-yraat). Sommige soorten hopen echter copolymeren van verschillende hydroxyalkanoaten zoals 3-hydroxypentanoaat op (Wallen, L. L. and Rohwedder, W. K., Environ. Sci. Technol. 8:576-579 (1974)). Tenminste 11 korte keten 3-hydroxyzuren zijn gevonden als bestanddelen van polymeren uit zeesediment. Studies van de polyhydroxyalkanoaatproduk-tie van Alcaliqenes eutronhus hebben aangetoond dat als de bacteriën gekweekt worden in een medium dat -alleen glucose als koolstofbron bevat, er alleen PHB wordt opgehoopt. Als echter zowel glucose als propionzuur als koolstofbronnen worden verschaft, hoopt de bacterie random copolymeren van 3-hydroxypentanoaat en 3-hydroxybutyraat op (Holmes, P. A., Phys. Technol. 16:32-36 (1985); Holmes, P. A., Wright, L. F. en Collins, S. H. Europese octrooien 0 069 497, januari 1983 en 0 052 459, december 1985). Bovendien als A. eutrop-hus voorzien wordt van verscheidene andere koolstofbronnen, worden polyesters gevormd die 4-hydroxybutyraat en 5-hydroxyvaleraat monomeren bevatten (Tabel I in Anderson, A. J. and Dawes, A. E., Microbiol. Rev. 54:450-472 (1990)). Het blijkt dat de samenstelling van het polymeer in zekere mate gereguleerd wordt door de verkrijgbaarheid van alternatieve substraten voor de enzymen die de synthese van het polymeer uit de monomeren katalyseren.

PHB hoopt zich in bacteriecellen op als granulen met een diameter van ongeveer 0,24-0,5 μπι. Op basis van het bepalen van het molecuulgewicht van de PHB monomeren is geschat dat elke granule tenminste 1000 polymeerketens bevat. Er is voorgesteld dat de granulen een membraan hebben bestaande uit vet en eiwit die respectievelijk ongeveer 0,5 en 2% uitmaken van het gewicht van de granule (Anderson, A. and Dawes, E. A., Microbiol. Rev. 54:450-472 (1990)). Men meent dat de activiteit van het PHB synthase enzym geassocieerd is met deze membraan. De toestand van het PHB binnen de granule is een onderwerp van grote onzekerheid. Recente resultaten suggeren dat het polymeer binnen de granulen aanwezig is in een amorfe toestand. Het is niet bekend wat de grootte van de PHB granulen in enig organisme reguleert.

In de meeste organismen wordt PHB gesynthetiseerd uit acetylcoenzym A (acetyl-CoA) door middel van drie opeenvolgende reacties die gekatalyseerd worden door 3-ketothiolase (acetyl-CoA acetyltransferase; EC 2.3.1.9), acetoacetyl-CoA reductase (hydrobutyryl-CoA dehydrogenase; EC 1.1.1.36 en poly(3-hydroxybutyraat)synthase. Deze weg is weergegeven in figuur 1. In Rhodospirillum -rubrum wordt PHB gesynthetiseerd door het omzetten van L (+)-3-hydroxy-butyryl-CoA in crotonyl-CoA in D (-)-3-hydroxybutyryl-CoA.

Het 3-ketothiolase is uit verscheidene PHB synthetiserende bacteriën geïsoleerd en is bestudeert in verscheidene soorten hogere planten. Men denkt dat de rol van het enzym in hogere planten gelegen is in de produktie van acetoace-tyl-CoA voor mevalonaatproduktie en ook voor het afbreken van vetzuren. Het acetoacetyl-CoA reductase is aangetoond in een aantal PHB synthetiserende bacteriën. Verscheidene soorten, omvattende A. eutrophus. lijken 2 isoenzymen te hebben die verschillen met betrekking tot de substraatspe-cificiteit en eisen aan de cofactoren. Het NADH reductase uit A. eutrophus is actief met C4 tot CIO D(-)- en L(+)-3-hydroxyacyl-CoAs, terwijl het NADPH reductase alleen actief is met C4 en C5 D(-)-3-hydroxyacyl-CoAs. Een enzym van deze soort is nooit waargenomen in hogere planten. PHB synthase activiteit is waargenomen in PHB ophopende bacteriën zowel in de vorm van een oplosbaar enzym als in de vorm van een-granule gebonden activiteit, afhankelijk van de groeiom-standigheden. Beide vormen van het enzym zijn gedeeltelijk geïsoleerd maar zijn tot nu toe nog niet homogeen gezuiverd als gevolg van hun instabiliteit. De PHB synthase van A. eutrophus zijn specifiek voor D(-)-enantiomeren en als zij getest werden met 3-hydroxyacyl-CoAs, bleek deze alleen actief te zijn met C4 en C5 substraten, hetgeen klopt met de waarneming dat alleen C4 en C5 3-hydroxyzuurmonomeereen-heden door dit organisme in het polymeer worden opgenomen. Het mechanisme van de PHB synthase activiteit blijft onduidelijk. Aangenomen wordt dat de ketenoverbrengrol die gespeeld wordt door het synthase op zekere wijze het molecuulgewicht van het geproduceerde polymeer moet beheersen, dat karakteristiek is voor een gegeven organisme. Er is nooit PHB synthase activiteit waargenomen in enige plant.

Verscheidene onderzoeksgroepen hebben onafhankelijk van elkaar de genen die betrokken zijn bij de biosyn-these van· PHB door A. eutrophus gekloneerd - en tot expressie gebracht in E. coli (Slater, S. C., et al. J. Bacteriol. 170:4431-4436 (1988): Schubert, P., et al., J. Bacteriol.

170:5837-5847 (1988)). Recombinante E. coli stammen die een 5,2 kbp fragment uit A. eutronhus bevatten bleken in staat te zijn aanzienlijke hoeveelheden PHB als intracellulaire granulen op te hopen. De nucleotide volgorde van het 5,2 kbp fragment was ook onafhankelijk bepaald door 2 groepen (Janes, B. B., et al., In Dawes, E. A. (ed) Novel Biodegra-dable Microbial Polymers, Kluwer Academie Publishers, pp 175-190 (1990); Peoples, 0. P. en Sinskey, A. J., J. Biol. Chem. 264:15293-15297 (1989); Peoples, 0. P. en Sinskey, A.-J., J. Biol. Chem. 264:15298-15303 (1989)). De analyse van de afgeleide aminozuur sequenties van de open afleesframes toonden, samen met bewijs gebaseerd op genetische comple-menteringsstudies, aan dat het 5,2 kbp fragment 3 sterk met elkaar verbonden genen bevat die coderen voor de 3 enzymen die nodig zijn voor de PHB produktie. Een octrooi dat betrekking heeft op het gebruik van de gekloneerde genen om een overmaat aan biosynthetische enzymen in bacteriën te bewerkstelligen is ingediend (Peoples, O. P. en Sinskey, A. J., Octrooi WO 89/00202, januari 1989).

Bepaalde soorten bacteriën bezitten het vermogen om enzymen uit te scheiden en PHB en gerelateerde polyhy-droxyalkanoaten af te breken (Beschreven door Anderson, A. en Dawes, E. A., Microbiol. Rev. 54:450-472 (1990)). Vanwege het veelvuldig voorkomen van deze bacteriesoorten in vele natuurlijke omgevingen wordt PHB snel afgebroken in grond en actief slib. Daarom zijn PHB en daaraan verwante polyhydroxyalkanoaten van belang als hernieuwbare grondstoffen voor biologisch afbreekbaar thermoplastic. In 1982 begon de - industriële PHB produktie met behulp van op grote schaal kweken van bacteriën. Het PHB dat op deze wijze wordt geproduceerd wordt door ICI plc op de markt gebracht onder de handelsnaam Biopol. Omdat de kosten die verband houden met het kweken en oogsten van grote bacterieculturen hoog zijn, is het PHB echter veel kostbaarder om te produceren dan polymere materialen zoals zetmeel.die tot in hoge concentraties opgehoopt worden in vele soorten hogere planten. Daarom kan het voordelig zijn om met behulp van genetische modificatie lijnen van hogere planten te ontwikkelen die PHB ophopen.

Figuur 1 toont de biochemische weg voor het produceren van polyhydroxybutyraat (PHB). In A. eutrophus wordt PHB geproduceerd door de achtereenvolgende werking van 3 enzymen: 3-ketothiolase, dat acetyl-CoA omzet in acetoacetyl-CoA; acetoacetyl-CoA reductase, dat acetoace-tyl-CoA omzet in D(-)-3-hydroxybutyryl-CoA; PHB synthase, dat D(-)-3-hydroxybutyryl-CoA omzet in polydrydroxybuty-raat. In planten en dieren is acetoacetyl CoA een precursor bij de produktie van mevalonaat.

Figuur 2 toont de nucleotide volgorde van het PHB operon uit A. eutrophus. De sequentie was verkregen van Janes, B., Hollar, J. en Dennis, D. in Dawes, E. A. (ed), Novel Biodegradable Polymers, Kluwer Academie Publishers, 175-190 (1990). Het open afleesframe van nucleotide 842 tot> 2611 codeert voor het PHB synthase (phbC gen) (aminozuren SI tot S589). Het open afleesframe van nucleotide 2696 tot 3877 codeert voor het enzym 3-ketothiolase (phbA gen) (aminozuur Tl tot T393). Het open afleesframe van nucleotide 3952 tot 4692 codeert voor het enzym acetoacetyl-CoA reductase (phbB gen) (aminozuur-R1 tot R246). De sequenties voor de restrictie enzymen Ddel, BstBI, PstI, SacI en Tthllll zijn onderstreept. Deze restrictie enzymen werden gebruikt voor het subcloneren van de PHB genen.

Figuur 3 toont een schematische samenvatting van de stappen die betrokken zijn bij het maken van de plasmi-den pUC-THIO en pBI-THIO. Het doel van deze laatste plasmi-de is om het 3-ketothiolase gen uit A. eutrophus onder de transcriptionele controle van de CaMV 35s promoter te plaatsen zo dat het overgeschreven zal worden in hogere planten. Het bovenste schema toont het A. eutrophus PHB operon met ongeveer de plaats van de open afleesframes die coderen voor het PHB synthase, 3-ketothiolase en acetoace-tyl-GoA "reductase. De horizontale pijltjes geven de richting van de transcriptie aan. Het onderste schema toont de belangrijkste componenten van de van pBI121 afgeleide plasmiden: NPT II, neomycine fosfotransferase II gen dat codeert voor kanamycine resitentie; CaMV 35S bloemkool mosaiek virus 35S promotor; poly A, polyadenylatie volgorde; RB rechter aangrenzende volgorde van T-DNA; LB, linker aangrenzende volgorde van T-DNA. Het onderste diagram is niet op schaal. Afkortingen voor de aangrijpingspunten voor de restrictie enzymen: D, Ddel; P, PstI; B, BstBI; T. Tthllll; BH, BamHI; S, SacI; H, HindlII.

Figuur 4 toont een schematische samenvatting van de stappen die optreden bij het maken van de plasmiden pUC-SYN en pBI-SYN. Het doel van deze laatste plasmide is om het PHB synthase gen uit A. eutroohus onder transcriptione-le controle van de CaMV 35S promoter te plaatsen zodat het overgeschreven zal worden in hogere planten. Schema's en afkortingen zijn beschreven bij figuur 3.

Figuur 5 toont een schematische samenvatting van de stappen die nodig zijn voor het maken van de plasmiden pUC-REC en pBI-RED. Het doel van deze laatste plasmide is om het acetoacetyl CoA reductase gen uit A. eutrophus onder transcriptionele controle van de CaMV 35S promoter te plaatsen zodat het tot expressie zal komen in hogere planten. De bovenste en onderste - schema' s en afkortingen zijn beschreven bij figuur 3. Het middelste schema is een vergroting van het genetisch gebied van acetoacetyl-CoA reductase gen. De lokatie en volgorde van de PCR primer #1 en #2 zijn aangegeven. De laatste nucleotide aan het 3' einde van de PCR primer #1 komt overeen met nucleotide 3952 in figuur 2 en is de eerste nucleotide van het initiatie codon voor het reductase gen. De laatste nucleotide aan het 3' uiteinde van PCR primer #2 is complementair met nucleo-! tide 4708 van figuur 2. De additionele BamHI en Kpnl restrictie enzymplaatsen die gemaakt worden door de PCR primers zijn aangegeven.

Figuur 6 toont een "Southern blot" ananlyse van niet getransformeerde controle en transgene A. thaliana planten. Eén gram genetisch DNA van niet getransformeerd A. thaliana van de stam Rschew en van transgene planten werd gedigesteerd met het restrictie enzym HindlII, de fragmenten werden gescheiden door agarose gel elektroforese en overgebracht naar nylonmembranen. Er "werden filters gehy-bridiseerd tot met 32p gemerkte DNA fragmenten van de genen (A) phbA. (B) PhbB en (C) phbC. De geanalyseerde genomische DNA's waren: wild type A. thaliana stam Rschew (laan a) en transgenen T4-3A (laan b), T3-2A (laan σ), T4-2A (laan d), T4-3B (laan e), RedB-2G (laan f), RedB-2B (laan g), RedB-2E (laan h), RedB-2C (laan i), RedD-3A (laan j), RedB-2A (laan k), RedB-2D (laan-1), S12-3A (laan m) , S8-1-2C (laan n) ·, S8-1-2A (laan o) en S8PUC-2B (laan p). De getallen aan de linkerkant geven de lengte in kilobasen pare aan.

Figuur 7 toont de "Northern blot" analyse van niet getransformeerde controle en transgene A. thaliana planten. Het totale DNA van wild type A. tahliana van de stam Rschew (10 /ig) en van transgene planten (20 μg) werden verkregen door elektroforese in formaldehyde bevattende agarose gels en overgebracht op nylonmembranen. Er werden filters gehybridiseerd voor 32P gemerkte DNA fragementen van de genen (A) phbA. (B) phbC en (C) phbB. De geanalyseerde RNAs zijn afkomstig van de planten: T3-2A (laan a), T4-2A (laan b), T4-2B (laan c), T4-3A (laan d), wild type A. thaliana (lanen e, j en r), S8PUC-2B (laan f), S8-1-2C (laan g), S12-3A (laan h), S8-1-2A (laan i), RedB-2D (laan k), RedB-2E (laan 1), RedB-2G (laan m), RedB-2A (laan n), RedB-2B (laan o), RedB-2C (laan p) en RedDB-3A (laan g). De getallen geven de lengte in kilobase paren aan.

Figuur 8 toont het gaschromatogram (GC) van gezuiverd PHB en plantenextracten. GC spectra van verester-de chloroform extracten van bladeren van niet getransformeerd wild type A. thaliana van de stam Rschew (B) en F1 hybriden tussen transgene planten S8-1-2A en RedB-2C (C) werden vergeleken met het chromatogram van veresterd commercieel PHB (A) . De pijlen geven de plaats van de -i ethylhydroxybytyraatpiek aan.

Figuur 9 toont het gaschromatogram-massa spectrum analyse van ethylhydroxybutyraat verkregen van een PHB

standaard en van PHB uit planten extracten. (A) massa spectrum van omgeëstert commercieel PHB; (B) massa spectrum van de GC piek van chloroform extract uit de bladeren van de F1 hybride tussen S8-1-2A en RedB-2C met een retentie tijd overeenkomend met ethylhydroxybutyraat (zoals weergegeven in figuur 8C).

Figuur 10 toont transmissie elektronen foto's (TEM) van blad en zaad van transgene A. thaliana planten die positief zijn voor PHB. De transgene planten S8-1-2A en S8-1-2C werden kruisbestoven met transgenen planten RedB-2D of RedB-2A. De resulterende F1 zaden werden gezaaid in grond en bladermonsters van 2-3 weken oude planten werden geanalyseerd met behulp van TEM (foto's a tot e) . Sommige F1 zaden werden ook geweekt in water gedurende 24 uur, waarna het embryo uit de zaadmantel verwijderd werd en de cotyledons geanalyseerd werden met behulp van TEM (foto f) (a) Twee naast elkaar liggende mesofielcellen uit bladeren van RedB-2D X S8-1-2A F1 hybriden tonen ophopingen van voor-elektronen transparanten granulen in de kern. (b) Een sterke vergroting van de kern van de cel recht boven weergegeven in foto a. (c) De kern van een mesofielcel uit een blad van een RedB-2D X S8-1-2A F1 hydride die een ophoping van granulen toont, (d) Een mesofielcel uit een blad van een RedB-2A X S8-1-2A F1 hybride die voor elektronen transparante granulen in de kern (N) en de vacuole (V) heeft, (e) Een mesof ielcel uit een blad van een RedB-2A X S8-1-2A F1 hydride die voor elektronen transparante granulen heeft in het cytoplasma. (f) Cotyledoncellen van een RedB-2A X S8-1-2C F1 hydride zaad dat granules heeft in de kern. Pijlen geven het ophopingen van voor elektronen transparante granulen aan. De lijn is 1 μιη voor foto a, bf c, d en f. De lijn is 0,25 /im voor foto e.

De onderhavige uitvinding heeft betrekking op transgeen plantmateriaal dat vreemd DNA bevat dat zorgt voor-de produktie van een polyhydroxyalkanoaat.

De onderhavige uitvinding heeft bovendien betrekking op transgeen plantmateriaal dat vreemd DNA bevat dat codeert voor een peptide dat 3-ketothiolase activiteit vertoont.

De onderhavige uitvinding heeft ook betrekking tot transgeen plantmateriaal dat vreemd DNA bevat dat codeert voor een peptide dat acetocetyl-CoA reductase activiteit vertoont.

De onderhavige uitvinding heeft ook betrekking op transgeen plantmateriaal dat vreemd DNA bevat dat codeert voor een peptide dat een vreemde PHB synthase activiteit vertoont.

De onderhavige uitvinding heeft betrekking op een werkwijze voor het opnemen van bacterieel DNA dat codeert voor de eiwitten die nodig zijn voor de synthese van een polyhydroxyalkanoaat in een plant, dat omvat het paren door geslachtelijke bevruchting van twee planten, die geen PHB produceren, die elk vreemd DNA bevatten dat codeert, voor één of meer verschillende enzymen van een weg die leidt tot het polymeriseren van hydroxyalkyl-CoA door polyhydroxyalkanoaat synthase om een plant te verkrijgen die codeert voor polyhydroxyalkanoaat.

Derhalve verschaft de onderhavige uitvinding een werkwijze voor het produceren van genetisch gemodificeerde hogere planten die PHB of verwante polyhydroxyalkanoaten produceren en ophopen. In één uitvoeringsvorm worden de PHB producerende planten verkregen door het stabiel opnemen van bacteriegenen die coderen voor de enzymen acetoacetyl-CoA reductase (hydroxybutyryl-CoA dehydrogenase) en poly (3-hydroxybutyraat) synthase in de planten met behulp van door Ti plasmide overgebrachte transformatie. Omdat bacterie genen normaal in planten niet worden overgeschreven, worden de genen zodanig gemodificeerd dat ze onder het transcrip-tionele controle van een DNA volgorde (dat wil zeggen een promoter) vallen die transcriptie in plantencellen induceert. De genen worden ook gemodificeerd door het opnemen van een geschikte DNA sequentie aan het.niet coderende 3' gebied van de genen zodat de overgeschreven codes die geproduceerd worden in de plantencellen geschikt gepolyade- nyleerd zijn.

In één uitvoeringsvorm van de uitvinding worden PHB producerende planten verkregen door geslachtelijke kruising tussen twee ouder lijnen die geen PHB produceren. Dit wordt verkregen door het kruisbestuiven van een transgene plantenlijn die homozygoot is voor ectope kopiën van een gemodificeerd PHB synthase gen met een transgene plantenlijn die homozygoot is voor ectope kopiën van een gemodificeerd acetoacetyl-CoA reductase gen. In deze context refereert de term 11 ectope genen" naar genen die normaal niet aanwezig zijn in een organisme maar stabiel zijn opgenomen in het genoom door genetische modificatie. Om homozygoot te zijn voor ectope kopiën betekent dat in een diploid organisme beide homologe chromosomen het ectrope gen opgenomen hebben op dezelfde lokatie binnen het chromosoom.

Voordat de uitvinding in nadere detail wordt beschreven is het handig om definities te geven van-bepaal-de temen die hierna zullen worden gebruikt.

Transformatie betekent het proces van het veranderen van het genotype van een ontvangend organisme door het stabiel introduceren van DNA op wat voor wijze dan ook.

Een transgene plant is een plant die DNA volgorden bevat die normaal niet in de soort aanwezig zijn maar opgenomen werden door transformatie.

Transcriptie betekent het vormen van een RNA keten in overeenstemming met de genetische informatie die opgenomen is in het DNA.

Tranlatie betekent het proces waarmee de genetische informatie aanwezig in een mRNA molecuul de specifieke aminozuur volgorde tijdens de eiwitsynthese reguleert.

Een promoter is een DNA fragment dat zorgt voor de transcriptie van genetisch materiaal. Voor de hierin beschreven doelen wordt de promoter gebruikt om DNA fragmenten aan te geven die transcriptie in plantencellen mogelijk maken. De CaMV 35S promoter is een DNA fragment van het bloemkool mosaiek virus dat relatief hoge trans criptie niveaus in vele verschillende weefsels van vele soorten hogere planten veroorzaakt (Benfey, P. N. en Chua, N. H. Science 250:959-966 (1990)).

Een poly-A additieplaats is een nucleotide volgorde die er voor zorgt dat bepaalde enzymen het mRNA splitsen op een specifieke plaats en dat een volgorde van adenylyl-zuur residuen aan het 3' end van het mRNA wordt bevestigd.

phbC, phbA, phbB zijn de genetische symbolen gegeven aan de A. eutrophus genen voor respectievelijk PHB synthase, 3-ketothiolase en acetoacetyl-CoA reductase (Peoples, 0. P. en Sinskey, A. J., J. Biol. Chem. 264:15298-15303 (1989)).

Bij het beschrijven van het nageslacht van transgene planten is het nuttig om een conventie aan te nemen die aangeeft hoeveel generaties van zelfbestuiving voorbij gegaan zijn sinds het opnemen van het DNA. Hierbij geven we de oorspronkelijke 'transgene plant aan als de TO generatie^ Het nageslacht afkomstig uit het zelfbestuiven van deze generatie is aangegeven als de Tl generatie en zo verder.

In geval van het kruisbestuiven tussen twee verschillende ouder planten, heet het resulterende nageslacht van de oorspronkelijke kruisbestuiving de F1 genera-· tie.

Hoewel de hierna gegeven experimenten betrekking hebben op de plantensoort Arabidopsis thaliana (L.) Heyn-hold, is het beschreven proces in het algemeen toepasbaar op elke hogere plant waarvoor de werkwijze voor het transformeren beschikbaar is. Op gelijke wijze is, hoewel de hierin beschreven werkwijze betrekking heeft op het gebruik van genen van A. eutrophus, de beschreven werkwijze in het algemeen toepasbaar op het gebruik van genen van elk organisme dat in staat is PHB te synthetiseren. Het is ook duidelijk, dat, hoewel de beschreven werkwijze betrekking heeft op de productie van PHB, de werkwijze in het algemeen toepasbaar is op de produktie van elk polyhydroxyalkanoaat dat normaal geproduceerd wordt in microorganismen door de activiteit van polyhydroxyalkanoaat (PHA) synthase (dat PHB

synthase omvat), en waarvoor het geschikte hydroxyalkyl-CoA substraat geproduceerd wordt in de betreffende plant.

EXPERIMENTELE DETAILS Experimenteel ontwerp

De produktie van PHB in het nageslacht van getransformeerde planten omvat het voltooien van een van de volgende stappen: (1) het vervaardigen van een serie bacteriële plasmiden die promoterfusies bevatten, (2) het overzetten van deze plasmiden in Aqrobacterium tumefaciens. (3) het gebruik van A. tumefaciens om deze genen op te nemen in cellen van de plant (dat wil zeggen A. thialana in dit voorbeeld), (4) het regeneren van transgene planten, (5) het selecteren van de planten die homozygoot zijn voor de ectope genen, (6) het analyseren van de functie van de ectope genen in de getransformeerde planten om zeker te stellen dat ze tot expressie komen en dat de produkten van de genen functioneel zijn, (7) het produceren van hybride planten die 2 of meer verschillende ectope genen bevatten door geslachtelijke kruising, (8) het analyseren van het-hybride materiaal op de aanwezigheid van PHB. Deze stappen worden in detail beschreven in de volgende paragrafen.

Constructie van transcriptionele fusies

Om transcriptie van de bacteriële genen in hogere planten te verkrijgen moeten de bacteriële genen worden aangepast door het toevoegen van een plantpromoter zodat ze overgeschreven worden als ze opgenomen worden in hogere planten. Bovendien is het gebruikelijk om een poly-A additieplaats toe te voegen aan de 3* plaats van de bacte-riegenen om een goede expressie van de genen in hogere planten te bewerkstelligen. Aan deze beide voorwaarden werd voldaan door het doneren van de phbC, phbA, en phbB genen van plamide pTZ18U-PHB in de binaire Ti plasmide vector pBI121 (Clonetech, California, USA). De nucleotide volgorde van de phbC, phbA en phbB genen die opgenomen worden in de plasmide pTZ18U-PHB is weergegeven in figuur 2. De relevante restrictie enzymplaatsen die gebruikt worden voor het doneren' zijn ook aangegeven, evenals het afgeleide open afleesframe voor de drie genen.

Een CaMV 35S-phbA gen fusie werd verkregen door het digesteren van de pTZ18U-PHB plasxnide met restrictie enzymen PstI en Ddel. Het 1,3 kb restrictiefragment dat de sequentie coderend voor het 3-ketothiolase gen bevatte, werd afgescheiden van de andere DNA fragmenten door middel van agarose gel elektroforese. Het DNA fragment werd verkregen uit de agarose met behulp van een DEAE cellulose membraan (Schleicher & Schuell NA-45 DEAE membraan). De ruwe einden van het DNA fragment werden aangevuld door het incuberen van het gezuiverde restrictiefragment met T4 DNA polymerase en deoxynucleotide trifosfaten. Het stompe uiteinde werd vervolgens gedoneerd in het—Smal -gebied van het plasmide pUC18 om de plasmide püC-THIO op te leveren. Het 1,3 kb restrictie fragment werd door digestie met BamHI-en SacI uit het pUC-THIO plasmide verwijderd, gezuiverd met behulp van elektroforese onder gebruik van DEAE cellulose membraan en opgenomen in de plasmide pBI121 die van te voren was gedigesteerd met dezelfde twee enzymen. De resulterende plasmide, die pBI-THIO genoemd werd bleek het A. eutronhus 3-ketothiolase gen in de correctie oriëntatie te bevatten, in vergelijking met de CaMV 35S promoter en de poly-A additieplaats van pBI121, zodat verwacht werd dat het tot expressie kon komen in hogere planten. Een schematische samenvatting van de benodigde stappen bij de constructie van pBI-THIO is weergegeven in figuur 3.

Een CaMV 35S-phbC genfusie werd verkregen door het digesteren van de plasmide pTZ18U-PHB met de restrictie enzymen BstBI en Tthllll. Het 1,9 kb restrictiefragment dat de sequentie coderend voor het PHB synthase gen bevatte, werd afgescheiden van de andere DNA fragmenten door agarose gelelektroforese. Het DNA fragment werd -uit de agarose verkregen met behulp van een DEAE cellulose membraan. De ruwe uiteinden van het DNA fragment werden aangevuld door het gezuiverde restrictiefragment te incuberen met T4 DNA polymerase en deoxynucleotide trifosfaten. Het stompe uiteinde werd vervolgens gedoneerd in de Smal plaats van de plasmide pUC18 om de plasmide püC-SYN te verkrijgen. Het 1,9 kb restrictie fragment werd uit pUC-SYN verwijderd door een complete digestie met BamHI en partiële digestie met SacI, gezuiverd met behulp van elektroforese met gebruik van DEAE cellulose membranen en opgenomen in de plasmide pBI121 die van te voren was gedigesteerd met dezelfde twee enzymen. De resulterende plasmide, die pBI-SYN genoemd werd, bleek het A. eutroohus PHB synthase gen in de correcte oriëntatie, in vergelijking met de CaMV 35S promoter en de poly-A additie plaats van pBI121 te bevatten, zodat verwacht werd dat het tot expressie kon komen in hogere planten. Een schematische samenvatting van de benodigde stappen bij het maken van pBI-SYN is weergegeven in figuur 4.

Een CaMV 35S phbB genfusie werd verkregen door gebruik te maken van een paar synthetische oligonuleotiden als primers in een polymerase kettingreactie (PCR) om het phbB gen te vergroten uit de plasmide pTZ18U PHB. De volgorde van de oligonucleotide primers is weergegeven in figuur 5 waar zij aangegeven zijn als PCR primer #1 en PCR primer #2. De oligonucleotiden werden op zodanige wijze ontworpen dat de vergrote DNA sequentie een synthetische BamHI plaats bevatte dichtbij het 5' einde van de coderende sequentie en een synthetische Kpnl plaats bij het 31 uiteinde van de sequentie. Het produkt van de polymerase kettingreactie, dat 790 base paren bevatte, werd afgescheiden en gezuiverd uit de agarosegel, onderworpen aan een restrictie met BamHI en Kpnl en opgenomen in de plasmide pUC18, die daarvoor ook was onderworpen aan een restrictie met dezelfde twee enzymen, om de plasmide pUC-RED op te leveren. Het restrictiefragment werd verwijderd uit pUC-RED door digestie'met BamHIi en SacI, gezuiverd door elektroforese met behulp van een DEAE cellulose membraan en opgenomen in de plasmide pBI121 die van te voren was gedigesteerd met dezelfde twee enzymen. De resulterende plasmide die aangegeven werd met pBI-RED bleek de A. eutrophus acetoace-tyl CoA reductase gen in de correcte oriëntatie, in vergelijking met de CaMV 35S promoter en de poly-A additieplaats van pBI121, te bevatten, zodat verwacht werd dat het tot uitdrukking zou kunnen komen in hogere planten. Een schematische samenvatting van de benodigde stappen bij het maken van pBI-RED is weergegeven in figuur 5.

De plasmiden pBI-SYN pBI-THIO en pBl-RED werden overgebracht in Aorobacterium tumefaciens stam C58 pGV 3850 door middel van elektroporatie. Plasmide bevattende kolonies werden verkregen door selecteren op de expressie van het gen dat resistentie ten opzichte van kanamycine veroorzaakt dat aanwezig is op de uitgangsplasmide pBI121.

Productie van transgene planten

Cellen van A. thaliana werden getransformeerd door het incuberen van steriel wortelweefsel met culturen van A.· tumefaciens die de recominante binaire Ti plasmiden zoals beschreven in de voorgaan de paragraaf bevatten. Wortels, van steriele zaailingen van A. thaliana van de stam Rschew werden getransformeerd zoals beschreven door Valvekens, D. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5536-5540 (1988). Elk van de drie stammen A. tumefaciens die één van de gemodificeerde PHB genen bevatte werd gebruikt om stukj es wortel van A. thaliana mee te infecteren. Dit resulteerde in elk geval in een opbrengst van ongeveer 50 stukjes kanamycine resistenten callus weefsels. Van deze resulteerde 10-25% in vruchtbare scheuten die zaden produceerden. Elke plant die zaden produceerde werd een verschillend nummer gegeven om aan te geven dat het om een afzonderlijke transformatie ging.

Elf mogelijk transgene planten werden verkregen uit weefsels behandeld met A. tumefaciens dat de plasmide pBI-RED-bevatten. Deze werden aangegeven als RedB-2A, -2B, -2C, -2D, -2E, -2F, -2G, -2H, -3A, -5A en RedD-3A. Al deze transgene plantlijnen, behalve RedB-2F, -2H en -5A werden in detail geanalyseerd zoals beschreven in de volgende paragrafen.

In totaal 5 mogelijk transgene planten werden verkregen uit weefsels behandeld met A. tumefaciens dat de plasmide pBI-THIO bevatte. Deze werden aangegeven als T3-2A, T4-2A, T4-3A, T4-3B en T4-3C. Al deze transgene plant-lijnen, behalve T4-3C, werden in detail geanalyseerd zoals beschreven in de volgende paragrafen.

Een totaal van 4 mogelijk transgene planten werd verkregen uit weefsel behandeld met A. tumefaciens dat de plasmide pBI-SYN bevatte. Deze werden aangegeven als S8-1-2A, S8-1-2C, S12-3A en S8 pUC-2A. Al deze transgene plan-tenlijnen werden in detail geanalyseerd zoals beschreven in de volgende paragrafen.

De aanwezigheid van T-DNA in de mogelijk transgene planten werd geverifieerd door zaad van de transgene planten te zaaien op met agar verhard mineraal medium dat 50 microgram/ml kanamycine bevatte. Deze concentratie, kanamycine voorkomt de groei van niet getransformeerde A. thaliana planten maar maakt het de planten die het NPTII gen bevatten dat aanwezig is op pBI121 of van pBI121 afkomstige plasmiden mogelijk om normaal te groeien. De, zaden van de transgene planten T4-2A, RedD-3A en S8-1-2A zijn verkrijgbaar bij "The American Type Culture Collecti-on, Rockville, MD 20852".

Isolatie van moceli-ik homozvaote transgene liinen

Het minimale criterium dat gebruikt werd om homozygote transgene lijnen te verkrijgen was dat al het nageslacht van een homozygote plant kanamycine resistent moet zijn. Omdat de aanwezigheid van vele ectope kopiën van het NPTII gen van pBI121 op verschillende plaatsen in het genoom een zelfde fenotype kan opleveren, is dit criterium buitengewoon nuttig als de primaire transformatie de insertie omvat van T-DNA op slechts ~één chromosomale plaats.

Om mogelijk homozygote lijnen te identificeren werden verscheidene kanamycine resistente Tl planten van elke transgene lijn opgegroeid tot volwassenheid in reproductieve isolatie. De frequentie van kanamycine resistentie werd vervolgens bepaald in monsters van ongeveer 50 T2 zaden van elk lijn. Als alle T2 zaden van een bepaalde plant kanamycine resistent waren werd de lijn voorlopig als homozygoot aangemerkt.

Analyse van de integratie van de PHB genen irt transgene planten

Om na te gaan of de PHB genen op de juiste wijze geïntegreerd waren in de verschillende transgene plantelij-nen, werd het genomisch DNA van de transgene planten geanalyseerd. DNA met een hoog molecuulgewicht werd geïsoleerd uit niet getransformeerde planten ter controle en uit T3 transgene planten getransformeerd met de plasmiden pBI-THIO, pBI-RED en pBI-SYN. De DNA's werden gedigesteerd met het restrictie enzym HindlII, waarna de fragmenten -werden· gescheiden door agarosegelelektroforese en overgebracht op een nylon filter. Het restrictie enzym HindlII knipt slechts één maal bij het 5' einde van het CaMV 35S promoter in de plasmiden pBI-THIO, pBI-RED en pBI-SYN (figuren 3, 4 en 5) . Fragmenten die gedetecteerd worden met behulp van probes die specifiek zijn voor het PHB gen stellen derhalve junctie fragmenten van de Ti vectoren met het genomisch DNA van de plant voor, of interne fragmenten van geconcatameri-seerde Ti vectoren. De opgenomen stukken in de plasmiden pUC-THIO, pUC-RED en pUC-SYN werden verwijderd door behandeling met EcoRI en HindlIIv gezuiverd met behulp van agarose gelelektroforese onder gebruik van DEAE cellulose membranen en gemerkt met 32P-deoxyribonucleotiden door "random priming". De gemerkte PHB genfragmenten werde gebruikt om de nylonfilters mee te behandelen. De filters werden gehybridiseerd en vervolgens onder hoog stringente condities gewassen. Het resultaat van -deze filter hybridi-saties is weergegeven in figuur 6. Geen enkele van de 3 PHB genen kan gedetecteerd worden in de niet getransformeerde controle planten (figuren 6A, B en C, laan a). Het phbA gen werd gedetecteerd in vier van de transgene lijnen die verkregen worden door transformatie met de* pBI-THIO plasmi-de (figuur 6A, lanen B tot E). Het phbB gen werd waargenomen in zeven van de transgene planten die verkregen werden door transformatie met de pBI-RED plasmide (figuur 6B, lanen f tot 1). Het phbC gen werd tenslotte in drie van de transgene planten verkregen door transformatie met de pBI-SYN plasmide waargenomen (figuur 6c, lanen n tot p). Hoewel de plantenlijn S12-3A resistent was voor 50 μg/ml kanamyci-ne, hetgeen het opnemen van het NPTII gen suggereert, konden geen phbC genen worden waargenomen. Het is waarschijnlijk dat alleen het fragment van de Ti vector dat het NPTII gen bevat, en niet het phbC gen, is opgenomen in het genomisch DNA van plantenlijn S12-3A.

Analyse van de expressie van de PHB genen in transgene planten

Om te bepalen of de PHB genen van A. eutrophus tot expressie komen in de verschillende transgene lijnen,* werden de gedoneerde genen die aanwezig zijn in de plasmi-den pUC-THIO, pUC-RED en pUC-SYN gebruikt als probes in filterhybridisatieexperimenten. Er werd totaal RNA geëxtraheerd uit een niet getransformeerde controle en uit T3 transgene planten. Het RNA werd opgelost met behulp van elektroforese in formaldehyde bevattende agarose gels en overgebracht op nylon filters volgems van bekende werkwijzen. De opgenomen stukken van de plasmiden pUC-THIO, pUC-RED en püC-SYN werden verwijderd door behandeling met EcoRI en HindlII, gezuiverd met behulp van elektroforese onder gebruik van DEAE cellulose membranen en gemerkt met 32P deoxyribonucleotiden door middel van "random priming". De gemerkte PHB genen werden gebruikt om de nylon filters mee te onderzoeken. Deze experimenten toonden dat geen van de drie PHB probes hybridiseerde met enig--RNA van de niet getransformeerde controleplant (figuur 7, lanen e, j en r). In contrast daarmee bezaten transgene planten die verkregen worden door transformatie met pBI-THIO RNA van 1,6 kbp dat complementair was met het 3-ketothiolase gen (figuur 7A, lanen a tot d). De CaMV 35S promoter en de poly-A additie sequenties die aanwezig zijn op de van pBI121 afkomstige plasmide dragen ongeveer 300 basen paren bij aan de uiteindelijke lengten van de mRNA verkregen uit de PHB fusiege-nen. Het niveau van 3-ketothiolase mRNA was laag in plan-tenlijn T4-3A in vergelijking met de andere plantenlijnen. Op gelijke wijze bezaten drie van de transgenen plantenlij nen verkregen door transformatie met pBI-SYN mRNA van 2,1 kbp overeenkomend met het PHB synthase gen (figuur 7B, lanen f, g en i). De transgene lijn S12-3A vertoonde geen waarneembare mRNA hybridisatie met de phbC probes (figuur 7B, laan h). Dit resultaat is in overeenstemming met de "Southern blot" analyse die toont dat het phbC gen niet opgenomen is in het genomisch DNA van lijn S12-3A (figuur 6C, laan n). Tenslotte bevatten 7 transgene lijnen die verkregen zijn door transformatie met de pBI-RED plasmide mRNA van 1,1 kbp dat complementair was met het acetoacetyl-CoA reductase gen (figuur 7C, lanen k tot q) . Voor elk van. de 3 PHB genen werden dus tenminste 3 onafhankelijke transgene planten verkregen die complementair RNA van de verwachte grootte tot expressie brachten.

Hoewel de aanwezigheid van RNA aangeeft dat de genen overgeschreven worden, verschaft dit geen enkele informatie dat zij getransleerd worden of dat het produkt van de translatie functioneel is. Dit werd onderzocht door de transgene planten te onderzoeken op enzymactiviteit.

Transgene planten verkregen door transformatie met pBI-THIO werden onderzocht op 3-ketothiolase activiteit met behulp van een in geringe mate gewijzigde versie van de test beschreven door Senior, P. J. en Dawes, E. A., Bio-chem. J. 134:225-238 (1973). Bevroren bladweefsel van T3 planten werd gehomogeniseerd in een Trisbuffer en het gezuiverde -ruwe extract werd onderzocht op..-3-ketothiolase activiteit. De resultaten van deze experimenten zijn weergegeven in tabel 1. Extracten van niet getransformeerde A. thaliana planten hadden onder de testcondities een zeer lage 3-ketothiolase activiteit. In tegenstelling daarmee bleek elk van de transgene planten waarin'het phbA gen werd overgeschreven een aanzienlijk verhoogde ketothiolase activiteit te vertonen. Dit geeft aan dat het bacteriële thiolase gen functioneel is als het tot expressie wordt gebracht in transgene planten. De specifieke activiteit van 3-ketothiolase die waargenomen werd in de verschillende transgene planten was echter significant lager in vergelijking met extracten bereid uit E. coli dat het phbA gen op de pTZ18U-PHB plasmide bevat.

Tabel 1. 3-ketothiolase activiteit in transgene A. thaliana planten

Monsters 3-ketothiolase _activiteit5_ DH5alpha/PHBb 9,5

Wild type A. thaliana 0,019 T4-3A transgeen 0,057 T3-2A transgeen 0,42 T4-2A transgeen 0,43 T4-3B transgeen 0,54 a het aantal micromol acetoacetyl-CoA dat per minuut per miligram eiwit werd afgebroken. De waarden zijn een gemiddelde van 2 tot 4 metingen.

b E. coli van de stam DH5alfa die de pTZ18U-PHB plasmide bevatten waarop het PHB operon aanwezig is.

Transgene planten verkregen door de transformatie met de pBI-RED plasmide werden onderzocht op acetoacetyl-CoA reductase activiteit door een licht gewijzigde versie van de werkwijze beschreven door Senior, P. J. en Dawes, E. A., Biochem. J. 134:225-238 (1973).- Bladeren van T3 planten werden gehomogeniseerd in kaliumfosfaatbuffer en de geklaarde extracten werden onderzocht op acetoacetyl-CoA

reductase activiteit. De resultaten van deze experimenten zijn weergegeven in tabel 2. Extracten van niet getransformeerde A. thaliana planten hadden geen waarneembare acetoa-cetyl-CoA reductase activiteit onder de proefcondities. In tegenstelling daarmee bleek elk van de transgene planten waarin het phbB gen wordt overgeschreven een hoge acetoace-tyl-CoA reductase activiteit te hebben. Dit geeft aan dat het bacteriële acetoacetyl-CoA reductase gen functioneel is als het tot expressie wordt gebracht in transgene planten. Bovendien blijkt de specifieke activiteit van acetoacetyl-CoA-reductase die waargenome werd in zes van de zeven transgene planten aanzienlijk hoger te zijn dan in extracten van E. coli waarin de phbB genen aanwezig zijn op de PTZ18U-PHB plasmide.

Tabel 2. acetoacetyl-CoA reductase activiteit in transgene A. thaliana planten

Monsters Acetoacetyl-CoA

_reductase activiteit DH5alpha/PHBb 1,4

Wild type A. thaliana < 0,03

RedB-2A transgeen 12,5

RedB-2B transgeen 16,4

RedB-2C transgeen 9,1

RedB-2D transgeen 8,8

RedB-2E transgeen 1,6

RedB-2G transgeen 5,2

RedD-3A transgeen 2,3 a Micromol NADPH dat per minuut gereduceerd wordt per milligram eiwit. De waarde zijn het gemiddelde van 2 tot 4 metingen.

b E. coli DH5 alpha dat de pTZ18U-PHB plasmide bevat waarop het PHB operon aanwezig is.

Transgene planten die verkregen worden door de transformatie met de pBI-SYN plasmide werden niet onderzocht op de aanwezigheid van PHB synthase activiteit vanwege technische moeilijkheden bij het bepalen van de activiteit van dit enzym in afwezigheid van thiolase en reductase activiteit.

Produktie en analyse van hybride planten

Omdat hogere planten een endogene cytoplasmatische 3-ketothiolase activiteit bezitten, zijn de enige extra enzymen die nodig zijn om PHB te produceren acetoacetyl-CoA reductase en PHB syntase. Deze twee genen werden in dezelfde plant samengebracht door kruisbestuiven van een transgene lijn waarvan aangenomen werd dat deze homozygoot was voor het acetoacetyl-CoA reductase gen met een transgene lijn waarvan aangenomen werd dat deze homozygoot was voor het PHB syntase gen. De hybride zaden die voortkwamen uit deze bestuivingen werden gekweekt in grond voor 2 tot 3 weken voordat ze getest werden op de aanwezigheid van PHB.. Om te bepalen of de aanwezigheid in planten van acetoacetyl CoA reductase en PHB synthase genen voldoende was voor de., produktie en ophoping van PHB, werden extracten van in* chloroform oplosbaar materiaal gemaakt van controle planten en hybride planten die deze beide genen bevatten. De aanwezigheid van PHB in deze extracten werd bepaald met behulp van gaschromatografie (GC). Er werden twee werkwijzen gebruikt om plantextracten voor GC analyse te verkrijgen. Deze beide werkwijzen maken gebruik van de hoge polymerisatiegraad van PHB (106 dalton als gemiddelde voor PHB verkregen uit A. eutrophus) en de selectieve oplosbaarheid ervan in gechlooreerde koolwaterstoffen zoals chloroform. In het kort worden bij werkwijze #1 hele bladeren in een 1:1 oplossing van chloroform en water gebracht en door middel van inversie geschud gedurende 16 uur bij 65°c.

• Omdat moleculen groter dan ongeveer 50.000 dalton niet door de celwand van de plant kunnen treden, worden alleen water of chloroform oplosbare produkten met een laag molecuulge- wicht geëxtraheerd uit de bladeren onder deze omstandigheden. Het voor onderstelde PHB met een hoog molecuulgewicht wordt vervolgens geëxtraheerd uit de bladeren door het overblijvende weefsel te homogeniseren om- de celwanden te breken, en vervolgens het opnieuw te extraheren in een oplossing van 1:1 chloroform en water gedurende 12 uur bij 65°C. Bij werkwijze #2 worden monsters van hele bladeren achtereenvolgens gedurende 2 uur geëxtraheerd bij 55 °C in 50% ethanol, gedurende 2 uur bij 55°C in 100% methanol en gedurende 15 minuten bij 20°C in 100% diethylether. Het overblijvende weefsel wordt vervolgens gehomogeniseerd en geëxtraheerd in chloroform bij 100°C gedurende 4 uur. De produkten aanwezig in het uiteindelijk verkregen chloroform extract van deze beide werkwijzen werden omgeësterd met ethanol en zoutzuur en geanalyseerd met behulp van ga-schromatografie. De retentietijd van de omgeëesterde plantenprodukten werd vergeleken met omgeësterd commercieel PHB gezuiverd uit A. eutrophus (Sigma Chemical Co., MO)-.

De transgene planten S8-1-2A en/of S8-1-2C werden kruisbestoven met transgene planten RedB-2A, -2C, -2D, -2G en RedD-3A. De resulterende PI zaden werden in grond gezaaid en bladmonsters of hele scheuten van 2 tot 3 weken oude planten werden verzameld en geanalyseerd op de aanwezigheid van PHB. Een voorbeeld van de resultaten die verkregen werden met behulp van zuiveringswerkwijze #1 is weergegeven in figuur 8. Een produkt aanwezig in de extracten van F1 planten die zowel de acetoacetyl-CoA reductase en PHB synthase genen bevatte had een retentietijd die overeenkomen met die van ethylhydrobutyraat, zoals bepaald in vergelijking met de retentietijd van het omgeësterde produkt van commercieel PHB. Dit nieuwe produkt, dat voorlopig werd geïdentificeerd als ethylhydroxybutyraat, werd alleen waargenomen in hybride F1 planten die zowel een actieve acetoacetyl-CoA reductase transgen als een PHB synthase transgen-bevatten. Een .vergelijkbaar produkt kon niet worden waargenomen in transgene planten met slechts één van de bovengenoemde genen of in ongetransformeerde A^_ thaliana planten. Bovendien kon het produkt niet worden waargenomen in chloroform extracten van plantenweefsels die niet van te voren waren gehomogeniseerd. Dit geeft aan dat het ethylhydroxybutyraat afkomstig is van een precursor met een hoog molecuulgewicht. De identiteit van het nieuwe plantprodukt met een retentietijd overeenkomend met die van ethylhydroxybutyraat werd geanalyseerd met behulp van gaschromatografie-massaspectrometrie (GC-MS). De GC-MS analyse werd uitgevoerd met behulp van de MSU-NIH massa-spectrometrie faciliteit. Figuur 9A toont het massaspectrum van ethylhydroxybutyraat verkregen uit authentiek PHB. figuur 9B toont het massaspectrum van het vooronderstelde ethylhydroxybutyraat geëxtraheerd uit een hybride F1 plant die het resultaat was van een kruising tussen de transgene planten S8-1-2A en RedB-2C. De resultaten geven aan dat het nieuwe plantprodukt dat elueerde met dezelfde retentietijd als ethylhydroxybutyraat ook hetzelfde fragmentatiepatroon vertoonde als een authentiek monster van ethylhydroxybutyraat. Het feit dat dit nieuwe produkt alleen waargenomen kan worden in extracten van bladweefsel dat van te voren gehomogeniseerd is geeft aan dat het ethylhydroxybutyraat afkomstig is van materiaal met een molecuulgewicht groter dan ongeveer 50.000 dalton (ongeveer de porositeit van plantencelwanden). Tezamen geven deze data aan dat transgene planten die zowel het acetoacetyl-CoA reductase gen als het PHB synthase gen bevatten polyhydroxybutyraat ophopen. Tabel 3 toont een samenvatting van de F1 planten die geanalyseerd werden met behulp van GC en GC-MS. Gebaseerd op de GC analyse was de hoeveelheid PHB die opgehoopt werd in de bladeren van F1 hybriden ongeveer 5 μg PHB per gram vers bladgewicht voor F1 hybriden van RedD-3A en S8-1-2C tot ongeveer 100 μg PHB per gram vers bladgewicht van F1 hybriden tussen RedB-2C en S8-1-2A.

Tabel 3. Overzicht van bewijs voor de productie van PHB in hybride F1 planten

Transgene ouderlijna

Transgene ouderliina _ί_

S8-1-2C S8-1-2A

RedD-3A GCb MSC TEM0 (blad)

RedB-2A GC

TEM (zaad) TEM (blad, zaad)

RedB-2G GC

MS

TEM (blad)

RedB-2C GC

MS

TEM (blad)

RedB-2D TEM (blad) a Transgene lijnen die het acetoacetyl-CoA reductase gen bevatten werden kruisbestoven met transgene lijnen die PHB synthase bevatten. De -resulterende F1 hybriden werden geanalyseerd op de produktie van PHB.

b Bewijs voor de produktie van PHB met behulp van analyse door middel van gaschromatografie c Bewijs voor de produktie van PHB met behulp van gaschro-matografie-massaspectrometrie.

d. Waarneming van voor elektronen transparante granulen met behulp van transmissie elektronen microscopie. Het planten-weefsel dat geanalyseerd werd is tussen haakjes aangegeven.

e Alle lege plaatsen geven aan dat de analyse niet is uitgevoerd.

Visueel onderzoek van PHB qranulen in hybride planten

Transmissie elektronen microscopie (TEM) van bacteriën die PHB ophopen toonde voor elektronen transparante granulen met een diameter van 0,2-0,5 μη omgeven door een membraan van ongeveer 2 nm dik (Lundgren, D. G., Pfister. R. M en Merrick, J. M., J. Gen Microbiol. 34:441-446 (1964)). Om na te gaan of vergelijkbare granulen waargenomen konden worden in hybride planten die bij GC-MS analyse positief bleken te zijn voor PHB produktie, werden plantweefsels onderzocht met behulp van transmissie elektronen microscopie. De transgene planten S8-1-2A en/of S8-1-2C werden kruisbestoven met transgene planten RedB-2A , -2C, -2D, -2G en RedD-3A. De resulterende PI hybride zaden en volwassen plantmateriaal werden geschikt gemaakt voor _ analyse met behulp van transmissie elektronen microscopie. In het kort werden de weefsels gefixeerd in 3% glutaaralde-hyde en 1% osmium tetroxyde en opgenomen in epoxyhars., Doorsneden van 80-90 nm werden gekleurd met 5% uranylace-taat en loodcitraat.

In één serie experimenten werden de F1 zaden gezaaid in grond en de bladeren van 2-3 weken oude planten werden verzameld voor TEM analyse. Bestuderen van de cellen aanwezig in de bladeren onthulde de aanwezigheid van ophopingen van elektronen transparante granulen. Deze granulen werden waargenomen in alle geanalyseerde hybride F1 planten die het resultaat waren van kruisingen tussen, transgenen met het PHB synthase gen en transgenen met het acetoacetyl-CoA reductase gen. Voorbeelden zijn weergegeven in figuur 10. Dergelijke granulen werden nooit waargenomen in de transgene ouderlijnen die alleen het PHB synthase gen of het acetoacetyl-CoA reductase gen bezaten, noch werden ze waargenomen in niet getransformeerd A. thaliana. In bladweefsel van F1 hybride werden de granulen waargenomen in mesofielcellen (figuur 10 foto a tot e). Het ophopen van voor electronen transparante granulen werd het vaakst waargenomen in de kern (figuur 10, foto a tot c) maar vergelijkbare structuren werden waargenomen in het cyto-plasma (figuur 10, foto e) en de vacuolen (figuur 10 foto d) van bladweefsel van de F1 hybriden. In de kern en het cytoplasma konden individuele granulen een maximale groote van ongeveer 0,18 μια. bereiken. In de vacuolen waren de granulen in het algemeen groter, en bereikten zij een maximale diameter van ongeveer 0,55 μιη. Bij een hogere vergroting leken de nucleaire granulen omgeven te worden door een elektronen dicht materiaal. Zo wel de grootte als de schijnbare structuur van deze granulen komen sterk overeen met die van granulen zoals waargenomen in bacteriën die PHB ophopen.

In een tweede serie experimenten werden F1 zaden geweekt in water gedurende 24 uur, waarna de embryo's uit de zaadmantel verwijderd werden en de weefsels werden gefixeerd. Analyse van de cotiledons van het embryo tonende aanwezigheid van agglomeraties van voor elektronen transparante granulen in de kern (figuur 10, foto f). Deze granulen konden een maximale diameter hebben van 0,18 μια., De granulen konden alleen worden waargenomen in de kern van hybride F1 embryos die het resultaat waren van kruisingen tussen transgenen met het PHB synthase gen en transgenen met het acetoacetyl-CoA reductase gen. Er konden geen granulen worden waargenomen in de transgene ouderplanten met slechts één van de ectope genen, in niet getransformeerd wild type A. thaliana. Tabel 3 geeft een overzicht van de F1 planten die geanalyseerd werden met behulp van TEM.

De bovengenoemde gegevens tonen een positieve correlatie tussen de waarneming van PHB door GC-MS en de aanwezigheid van granulen op elektronenmicroscopisch niveau. De grootte, vorm en aanwezigheid van elektronen dicht materiaal om de individuele granulen.-.lijkt sterk op de granulen aanwezig en bacteriën die PHB produceren. Tenslotte worden zowel de detectie van PHB door middel van GC-MS als de aanwezigheid van voor elektronen transparante granulen alleen waargenomen in hybride planten die zowel het acetoacetyl-CoA reductase als de PHB synthase genen bevatten. Tesamen geven deze data aan dat de granulen die waargenomen worden in de F1 hybride planten bestaan uit polyhydroxybutyraat.

In deze studie is aangegeven dat bacteriële genen die coderen voor de enzymen nodig voor de PHB synthese permanent opgenomen kunnen worden in een hogere plant op zodanige wijze dat de genen worden overgeschreven en transcripten opleveren van de verwachte grootte. Bovendien is aangetoond dat, in geval van de phbA en phbB genen, de aanwezigheid van deze genen in transgene planten zorgt voor , een toename van respectievelijk de 3-ketothiolase of acetoacetyl-CoA reductase activiteit. Daarom is het duidelijk dat deze twee genprodukten functioneel zijn als ze getransleerd worden in de plant. Vanwege technische moeilijkheden die te maken hebben met een directe bepaling van-de PHB synthase activiteit, was de PHB synthase activiteit, in de transgene planten niet bepaald.

Aangetoond is dat alleen plantextracten van transgene F1 planten die zowel acetoacetyl-CoA reductase. als PHB synthase tot expressie brengen een nieuwe chloroform oplosbare verbinding met een hoog molecuul gewicht produceren, die na omestering met ethanol en zoutzuur ethylhydroxybutyraat oplevert. Deze gegevens tonen aan dat de nieuwe verbinding polyhydroxybutyraat is. Bovendien zijn deze data een indirect bewijs voor de produktie van een functioneel PHB synthase in transgene planten. Dit is belangrijk omdat een in vitro proef voor de PHB synthase activiteit niet kon worden uitgevoerd. Bovendien toont produktie van PHB ook indirect aan dat D(-)-hydroxybutyryl-CoA, het substraat voor de PHB synthase, geproduceerd wordt in planten. Dit hydroxyacyl-CoA komt niet natuurlijk voor -in -planten.

Transmissie electronenmicroscopie geeft meer grond aan de conclusie dat PHB geproduceerd wordt in transgene planten. De analyse van embryocotyledons en volwassen bladeren van transgene Fl planten die zowel acetoacetyl-Coa reductase als 'PHB synthase bevatten vertonen agglomeraten van voor electronen transparante granulen met een grootte en structuur die sterk overeenkomt met die van granulen die voorkomen in bacteriën die PHB produceren, zoals A. eutrop-hus. Deze granulen bleken het vaakst in de kern voor te komen, maar werden ook waargenomen in de -vacuole en het cytoplasma van hybride Fl planten.

In de proeven beschreven in deze aanvrage blijken de produkten van de phbA, phbB, en phbC genen van A. eutrophus het meest waarschijnlijk tot expressie worden gebracht in het cytoplasma, omdat er geen specifieke, aminozuursequenties toegevoegd werden aan de eiwitten om hen specifiek in enig organel te richten. Omdat het cytoplasma van plantencellen als een 3-ketothiolase bevat is alleen de additionele expressie van het acetoacetyl-CoA reductase en PHB synthase nodig om PHB te produceren. Het feit dat de granulen in de kern en in de vacuole worden gevonden is niet noodzakelijk in tegenspraak met het tot expressie komen van de enzymen in het cytoplasma. Omdat kernmembranen tijdens de celdeling ontleden en weer tot elkaar komen kunnen PHB granulen die oorspronkelijk geproduceerd worden in het cytoplasma gevangen worden binnen de nieuwgevormde membranen van de kern. Als alternatief kunnen de PHB granulen als gevolg van hun hydrofobisiteit, door de membranen van de kern of van de vacuole treden.

In een alternatieve benadering kan de PHB produk-tie gelocaliseerd worden in enig · specifiek plantorganel door een gericht tot expressie brengen van de enzymen die betrokken zijn bij de PHB synthese in het organel. In dit geval, als het bedoelde organel geen 3-ketothiolase activiteit heeft, is expressie van een van buiten komend 3-ketothiolase activiteit noodzakelijk, toegevoegd aan de acetoa-cetyl-CoA*reductase en PHB synthase, .voor de produktie van PHB. Het lange termijndoel van PHB of PHA produktie in hogere planten is koolstof te verwijderen van belangrijke opslagverbinding zoals vetten, zetmeel of terpenoiden, om het te kanaliseren in de richting van de PHA synthese. Dit doel benodigd weefselspecifieke expressie evenals mogelijke organelspecifieke expressie van de enzymen die benodigd zijn voor de PHA synthese.

Olieproducerende gewassen zijn geschikte doelen voor genetische modificatie. In de plastiden worden vetten gesynthetiseerd met behulp van acetyl-CoA, dezelfde precur-ser die gebruikt wordt bij de synthese van PHB en andere PHA. Daarom zal de genetische modificatie van olieproducerende gewassen het nodig maken om de PHA biosynthetische enzymen te richten in de plastide. Voorbeelden van olieproducerende gewassen die gemodificeerd kunnen worden voor de PHA produktie zijn raapzaad, zonnebloem en oliepalm. Raapzaad en zonnebloem zijn belangrijke gewassen in Noord-Amerika en kunnen getransformeerd worden met vreemd DNA-. Als alternatief kan de PHA produktie gericht worden in het mesocarp van de vrucht van de - oliepalm. Omdat vetten geproduceerd in het mesocarp niet essentieel zijn voor het. overleven van de boom of het embryo, zou de produktie van PHA geen nadelige effecten op palmbomen moeten hebben. Helaas zijn nog geen transformatietechnieken beschikbaar voor oliepalmen.

De PHA produktie kan ook gericht worden op de wortels en knollen van suikerbieten en aardappelen, gewassen die grote hoeveelheden zetmeel ophopen. Het belangrijkste probleem bij deze benadering is dat omdat zetmeel en PHA niet dezelfde precursers gebruiken, er mogelijk vele modificaties van het koolstofmetabolisme-nodig zullen .zijn voordat koolstof afgeleid kan worden van zetmeel in de richting van PHA.

De meest directe benadering voor de PHA produktie zal wellicht zijn om gewassen te gebruiken die grote hoeveelheden terpenoiden ophopen, zoals de wortel die cartenoiden~-ophoopt, of de mexicaanse—yam die sterolen ophoopt. Omdat terpenoiden dezelfde precursers gebruiken als PHA (acetyl-CoA en acetoacetyl-CoA), moet het richten van koolstof naar PHA produktie eenvoudig te bereiken zijn.

Materialen en werkwijzen

Constructie van DNA Recombinanten E. coli van de stam DH5o; die plasmiden bevatte, werden gekweekt in LB bouillon waaraan kanamycine (50 /Ltg/ml) was toegevoegd of ampiciline (50 μg/ml). Het verkrijgen van plasmide DNA op grote schaal werd uitgevoerd door middel van basische lysis en polyethyleenglycol precipitatie zoals weergegeven door Sambrook, J., Fritsch E. F. en Maniatis, T., Molecular Cloning, a laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989). Het plasmide DNA werd geknipt- met restrictie endonucleases volgens de aanwijzingen van de fabrikant (New England Biolabs, Mass; Promega Corp., WI; Boehringer Mannheim Biochemicals, IN; Stratagene, CA), afgescheiden met behulp van agarose gel electroforese en zichtbaar gemaakt met behulp van een ethidiumbromide kleuring zoals beschreven, door Sambrook, J., Fritsch, E. F. en Maniatis, T., Molecu-lar cloning, a laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989). De DNA fragmenten werden uit de agarose gel gewonnen met DEAE membranen (NA-45-DEAE membraan, Schleicher en Schuell, Ine., NH). In het kort wordt DNA geëlectroforeerd op een stuk NA-45 en het membraan wordt gewassen in 0,15 M NaCl, 0,1 mM EDTA en 20 mM Tris-HC1 (pH 8). Het DNA wordt vervolgens geëlueerd in 1,0 M NaCl, 0,1 mM EDTA en 20 mM Tris-HCl (pH 8) bij 65°C gedurende 1 tot 2 uur. Het DNA wordt verder gezuiverd door middel van fenolchloroform extractie en ethanol precipita-, tie. Bij sommige proeven werden de gerecesseerde 3' uitein-. den van de DNA fragmenten omgezet in stompe uiteinden met behulp van T4 DNA polymerase volgens de werkwijze beschreven in Sambrook, J., Fritsch, E. F. en Maniatis, T., Molecular cloning, a laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989). Het ligeren van-DNA fragmenten met cohesive of stompuiteinden werd uitgevoerd bij 14 °C gedurende 16 uur in een buffer die 50 mM Tris-HCl (pH 7,6), 5 mM MgCl2, 5% (w/v) polyethyleenglycol 8.000, 0,5 mM ATP en 5 mM dithiothreitol bevatten zoals beschreven door Sambrook, J., Fritsch, E. F. en Maniatis, T., Molecular cloning, a laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989). Een gedeelte van de ligatiereactie werd overgebracht in E. Coli met behulp van rubidiumchloride werkwijze zoals beschreven door Hanahan, D., J. Mol, Biol. 166:557-580 (1983). De getransformeerde bacteriën werden, uitgeplaat op agarplaten die LB bouillon en ofwel 50 /xg/ml kanamycine ofwel 50 /zg/ml ampiciline bevatten. Bacterieko-lonies die recombinante plasmiden bevatten werden geïdentificeerd door middel van hybridisatie met 32P-gemerkte DNA probe zoals beschreven door Sambrook, J., Fritsch, E. F. en , Maniatis, T., Molecular cloning, a laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989) , · behalve dat nylon-membranen (Hybond-N, Amersham, IL) gebruikt. werden in. plaats van nitrocellulose membranen. Het maken van radioac-, tief gemerkte probes en de hybridisatie worden beschreven, in een volgende paragraaf. Het op kleine schaal bereidenvan plasmide DNA werd uitgevoerd door middel van de basische lysis werkwijze zoals beschreven door Sambrook, J., Fritsch, E. F. en Maniatis, T., Molecular cloning, a. laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989).

De oligonucleotiden werden gesynthetiseerd op een Applied Biosystems 380A DNA synthesizer volgens de gebruiksaanwijzing van de fabrikant (Applied Biosystems, CA). De oligonucleotiden met een dimethoxytritylgroep gehecht aan het 5' uiteinde werden gezuiverd op - een Varian 5.000. HPLC uitgevoerd met een C18 kolom (Varian Instrument Group, TX). De oligonucleotiden werden opnieuw gesuspendeerd in 0,1 M triethylamine en geïnjecteerd in een C18 kolom die van tevoren in evenwicht gebracht was met 12% acetoni-tril/88% 0,1 M triethylamine-acetaat (pH 7) (oplosmiddel A). De HPLC werd als volgt geprogrammeerd: vloeistofsnel-heid 0,9 ml/min; maximale druk, 200 psi; tijd 0 min, 88% oplosmiddel A/12% oplosmiddel B (acetonitril); tijd 3 min, 88% oplosmiddel A/1% oplosmiddel B; tijd 21 min, 65% oplosmiddel A/35% oplosmiddel B; tijd 25 min, 65% oplosmiddel A/35% oplosmiddel B. De gezuiverde oligonucleotiden werden gedetrileerd in 80% azijnzuur gedurende 10 min en gedroogd onder stikstof. De oligonucleotiden werden opgelost in 10 mM Tris-HCl (pH 7,5) en 0,1 mM ETDA, drie keer geëxtraheerd met gelijke volumes ethylacetaat en neergeslagen met ethanol.

Er werd een polymerase kettingreactie (PCR) uitgevoerd met behulp van een Perkin-Elmer Cetus DNA thermal cycler (Perkin-Elmer, CT). Het reactiemengsel bevatte 100 pmol oligonucleotiden, POT primer #1 en #2 (zie fig. 5), 200 ng pTZ18U-PHB plasmide gelinealiseerd met het restrictie-enzym EcoRI, 125 μΜ dNTP, 50 mM KCl, 10 mM Tris-HCl (pH 8,3), 2,5 mM MgCl2, 0,01% gelatine en 2,5 eenheden Taq polymerase (Perkin-Elmer, CT). Het programma van de DNA thermal cycler was als volgt: 3 min bij 94°C, 40 perioden van de sequentie 1 min bij 94 °C - 3 min bij 55 °C - 3 min bij 72°C en uiteindelijk 7 min bij 72°C. Het PCR produkt werd geïsoleerd met behulp van agarosegel electroforese en elutie met een DEAE cellulose membraan.

Produktie van transgene planten

De plasmidevectoren die gebruikt werden om transgene planten te produceren werden eerst overgebracht in Acrrobacterium tumefaciens stam C58-pGV3850 door electro-poratie (Zabrisky, P. et al., EMBO 2:2143-2150 (1983); en Sambrook, J., Fritsch, E. F. en Maniatis, T., Molecular cloning, a laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)). Arabidopsis thaliana van de stam Rschew werden aseptisch gekweekt op verticale petrischalen die minerale elementen, 0,8% agar (Difco) en 1% sucrose bevatten zoals beschreven door Estelle, Μ. A. en Somerville, C., Mol. Gen. Genet. 206:200-206 (1987) en Schiefelbein, J. W. en Somerville',' C. R., Plant Cell 2:235-243 ,-(1990). Wortels van 10 tot 12 dagen oude planten werden verwijderd en gebruikt voor transformatie zoals beschreven door Valve- kens, D., Van Montagu, M. en Van Lijsebettens, M., Proc. Natl. Acad. Sci USA 85:5536-5540 (1988).

Zaden van T0 en Tl transgene planten werden gekweekt op media die minerale elementen, 1% sucrose, 0,8% agar (Difco) en 50 ^g/ml kanamycine bevatten. Na 10 tot 14 dagen van groei hadden de kanamycine resistente (Kmr) transgene planten groene bladeren terwijl niet getransformeerde kanamycine sensitieve (Kms) planten gele bladeren hadden. In dit stadium konden de Kmr planten verwijderd worden van de agarplaten en overgeplant worden in bemeste grond.

Verwijdering en restrictie endonuclease splitsing van genomisch DNA.

Men liet planten van het wildtype en transgene planten gedurende 2 tot 3 weken groeien in grond en verza-, melde ongeveer 5 g bladermateriaal hetgeen vervolgens werd ingevroren in vloeibare stikstof. DNA met een hoog. mole-i cuulgewicht werd uit het bevroren plantenweefsel gewonnen zoals beschreven door Rogers, S. C. en Bendich, A. J., Plant Molecular Biology Manual A6:1-10 (1988). Restrictie endonuclease splitsing met het enzym HindlII werd uitgevoerd onder de omstandigheden aanbevolen door de fabrikant (New England Biolabs Ine., Mass).

Agarose gel electroforese en hybridisatieprocedure DNA analyse door middel van agarose gel electroforese en het overbrengen naar nylonmembranen (Hybond-N, Amersham, II) werden uitgevoerd volgens bekende werkwijzen beschreven door Southern, E. M., J. Mol. Biol. 38:503-517, (1975) en Sambrook, J., Fritsch, E. F. en Maniatis, T., Molecular cloning, a laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989). Specifiek gedoneerde DNA fragmenten die als probe gebruikt moeten worden werden uit de vector verwijderd met geschikte restrictie endonucleases, de ingezette stukken werden uit de vector -gezuiverd door agarose gel electroforese en electroelutie met behulp van DEAE cellulose membranen. De probes werden gemerkt met 32P- deoxyribonucleotiden door middel van de random primer extensie werkwijze waarbij gebruik werd gemaakt van hexame-ren zoals beschreven door Feinberg, A. P. en Volgelstein, B., Anal. Biochem. 136:6-13 (1983). De nylonfilters werden gehybridiseerd met gemerkte probes en weergegeven op film zoals beschreven door Poirier, Y. en Jolicoeur, P., J. Virol. 63:2088-2098 (1989).

RNA isolatie en electroforese

Het totaal RNA werd geïsoleerd uit bevroren bladermonsters zoals beschreven door Puissant, C. en Houdebine, L. M., BioTechniques 8:148-149 (1990). Het geïsoleerde RNA werd gescheiden door electroforese in agarose gel dat formaldehyde bevatte en overgebracht op nylonmembranen (Hybond-N, Amersham, II) zo ook beschreven door Sambrook, J., Fritsch, E. F. en Maniatis, T.f Molecu-lar cloning, a laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989) . De nylonfilters werden gehybridi-s seerd met gemerkte probes zoals in de vorige paragraaf is beschreven.

Test voor 3-Ketothiolase activiteit 1 g bevroren bladermonster werd gehomogeniseerd in 2 ml ijskoude buffer die 100 mM Tris-HCl (pH 8,0), 40 mM MgCl2 en 5 mM β-mercaptoethanol bevatte. Het homogenaat werd geklaard door centrifugeren bij 10.000 X g voor 2 min en het supernatant werd overgebracht in een verse buis. Het eiwitgehalte van het extract werd bepaald met behulp van de Bradford test onder gebruik van de BioRad eiwit test (BioRad Laboratories, CA). Per test werd tussen 3 en 30 μ% planteiwitextract gebruikt. Er werden ook eiwitextracten uit bacteriën bereid. In dit geval werden vaste bacterieko-lonies door centrifugeren samengeperst, eenmaal gewassen met ijskoude testbuffer en geresuspendeerd in 200 μΐ van deze buffer. De bacterie suspensie -werd-, gelyseerd door middel van trillingen, het homogenaat werd geklaard door middel van centrifugeren en het eiwitgehalte van het extract bepaald door de Bradford test. Tussen 0,2 en 1 μg bacterieel eiwitextract werd per test gebruikt. De activiteit van het 3-ketothiolase enzym in de verschillende extracten werd bepaald volgens de werkwijze van Senior, P. J. en Dawes, E. A., Biochem. J. 134:225-238 (1973).

Test voor acetoacetvl-CoA reductase activiteit 1 g bevroren bladmonster werd gehomogeniseerd in 200 ml ijskoude buffer die 100 mM KH2P04 (pH 5,5), 0,02 mM MgCl2 en 4,0 mM β-mercaptoethanol bevatte. Het homogenaat werd geklaard door centrifugeren bij 10.000X g gedurende 2 min en het supernatant werd overgebracht in een verse buis. Het eiwitgehalte van het extract werd bepaald volgens de Bradford test met behulp van de BioRad eiwitbepalingsset. Tussen 0,8 en 10 μg planteiwitextract werd gebruikt per test. Er werden ook bacterie-extracten in de testbuffer bereid, in wezen zoals beschreven in de voorgaande para-s graaf. De activiteit van het acetoacetyl-CoA reductase enzym werd bepaald volgens de werkwijze van Senior, P. J. en Dawes, E. A., Biochem. J. 134:225-238 (1973).

Gaschromatocrafie en massa Soectroscopv analyse

Er werden twee werkwijzen gebruikt volgens welke men plantextracten voor GC analyse bereidde. In werkwijze #1 extraheerde men tussen 0,005 en 0,05 g vers of bevroren plantmateriaal (bladeren of hele scheuten in 1 tot 2 ml van een 1:1 oplossing van chloroform en water bij 65°C gedurende 16 uur onder constant roeren. Het plantmateriaal werd vervolgens gehomogeniseerd in water en opnieuw geëxtraheerd in een 1:1 oplossing van chloroform en water gedurende 16 uur bij 65°C onder constant roeren. De chloroformfase werd overgebracht in een nieuwe buis en eenmaal geëxtraheerd met een gelijk volume water. Het uiteindelijke volume van de chloroform fase werd op 0,5 ml gebracht en gebruikt voor ‘ omestering**met ethanol en HC1 zoals-hieronder ..zal worden beschreven. In werkwijze #2 extraheerde men tussen 0,005 en 0,15 g bevroren of vers plantenmateriaal achtereenvolgens in 50% ethanol bij 55°C gedurende 2 uur, in 100% methanol bij 55°C gedurende 2 uur en 100% diethylether gedurende 15 min bij kamertemperatuur. Het overblijvende weefsel werd vervolgens gehomogeniseerd in water, gedroogd en geëxtraheerd in 0,5 ml chloroform gedurende 4 uur bij 100°C.

Het uiteindelijke chloroform extract (0,5 ml) verkregen volgens de werkwijzen #1 en #2 werd omgeësterd door 0,2 ml geconcentreerd HC1 en 1,7 ml 100% ethanol toe te voegen en het geheel te verhitten bij 100°C gedurende 2 uur. Het reactiemengsel werd vervolgens afgekoeld tot kamertemperatuur, de chloroformfase werd tweemaal geëxtraheerd met 2 ml 0,9% NaCl (w/v) en de uiteindelijke organische fase werd teruggebracht tot 100 μΐ. Als standaard werd commercieel verkrijgbare PHB (Sigma Chemical Co., Mo.) opgelost in warm chloroform en 1 mg werd omgeësterd zoals boven beschreven.

De chloroformfase die de ethylesters bevatte werd overgebracht in een GC buisje voor injectie van 1 μΐ in een Hewlett Packard 5890 Serie II GC uitgevoerd met een pror grammeerbare automatische monsternemer en een SP-2330 glazen capilaire kolom (Supelco, PA). De lineaire snelheid was ongeveer 20 cm/s met helium als dragergas. De tempera-; tuur van de injectiepoort werd gesteld op 220°C, en die van de vlamionisatiedetectorpoort werd gesteld op 220°C. Het volgende temperatuurprofiel werd gebruikt: 4 min bij 65°C, gevolgd door een toename van de temperatuur met een snelheid van 20°C/min tot aan 195°C, 3,5 minuten bij 195°C, en een temperatuurdalingssnelheid na het lopen van 20°C/min tot aan 65°C.

De identiteit van de belangrijkste pieken werd bepaald met behulp van GC-massaspectrometrie. Gegevens van het electronen inslag massaspectrum werden verkregen op een JEOL JMS-AX505H massaspectrometer gekoppeld met een Hewlett Packard 5890 GC. Er werden de volgende parameters gebruikt: ''brontemperatuur, 200°C; ioniserende stroom,. 100 μΑ; versnellend voltage, 3 keV. Een J & W Scientific Co. kolom van het type DB-225 werd direct in de bron van de massaspectro- meter gestoken en helium werd gebruikt als dragergas. De spleetloze injector werd op 260°C gehouden en de over-drachtlijn op 260°C. Er werd hetzelfde GC temperatuurprofiel gebruikt (zie vorige paragraaf).

Transmissie electronenmicroscopie

Plantenweefsels werden gefixeerd in 3% glutaralde-hyde in 0,1 M fosfaatbuffer (pH 7,2) gedurende 1,5-2 uur bij kamertemperatuur. De monsters werden 4 keer gewassen in 0,1 M fosfaatbuffer (pH 7,2) en gefixeerd in 1% 0s04 in fosfaatbuffer gedurende 2 uur bij kamertemperatuur. De weefsels werden vervolgens ontwaterd in een graduele ethanolserie en ingebed in Spurrs epoxyhars. Doorsneden van 80-90 nm werden afgesneden, op een koperen rooster geplaatst en gekleurd in 5% uranylacetaat gedurende 30 tot 45. minuten, gevolgd door een kleuring met Reynolds loodcitraat gedurende 3 tot 4 minuten. De doorsneden werden bekeken in een JEOL 100 CXII transmissie electronenmicroscoop die gebruikt werd bij 80 kV.

Andere planten

Hoewel het specifieke voorbeeld van de uitvinding zoals hier beschreven betrekking heeft op de plant Arabi-doosis thaliana en genen uit Alcalincrene eutrophus. kan de uitvinding algemeen worden toegepast. De conclusies die betrekking hebben op de produktie van polyhydroxybutyraat en/of polyhydroxalkanoaat in planten is niet beperkt tot Arabidopsis thaliana. of specifiek verbonden met het gebruik van genen uit Alcalicrenes eutrophus. De uitvinding heeft betrekking op een algemene werkwijze voor de produktie van polyhydroxyalkanoaat in planten door het opnemen van vreemd DNA materiaal in plantencellen. Dergelijke planten omvatten de eerder genoemden en bijvoorbeeld wortel, zonnebloem, tabak, tomaat en aardappel.

-De zaden van de verschillende-plantlijnen zijn gedeponeerd onder het Verdrag van Budapest bij American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville,

Maryland 20852. Deze lijnen omvatten RedD-3A (ATCC 75044) dat het acetoacetyl-CoA reductasegen bevat; S8-1-2A (ATCC 75043) dat het'PHB synthasegen bevat en T4-2A (ATCC 75042) dat het 3-ketothiolasegen bevat.

APPENDIX I

(1) Informatie voor SEQ ID NO: 1 (i) Sequentie kenmerken: (A) Lengte: 4980 base paren (B) Type: Door kernzuren gecodeerde

Precursoreiwitten (C) Strengkarakter: Dubbel (D) Topologie: Lineair (ii) Molecule Type:

(A) Beschrijving: Genomisch DNA

(iii) HYPOTHETISCH: No.

(iv) OORSPRONKELIJKE BRON

(A) Organisme: Alcalicrenes eutroohus (vi) TUSSENBRON: (A) Bibliotheek: genoom (vii) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 1 (Zie fig. 2)

Claims (18)

1. Transgeen plantenmateriaal dat vreemd DNA bevat hetgeen leidt tot de produktie van een polyhydroxyalkano-aat, bij voorkeur polyhydroxybutyraat.

2. Plantenmateriaal van conclusie 1 waarin de coderende sequentie van het DNA en RNA voor de produktie van de enzymen die polyhydroxybutyraat produceren zijn. zoals aangegeven in SEQ ID NO: 1. (figuur 2)

3. Transgeen plantenmateriaal dat vreemd DNA bevat coderend voor een eiwit dat 3-ketothiolase activiteit vertoont, bij voorkeur waarin het DNA een open afleesframe. is tussen 2696 en 3877 van SEQ ID NO: 1.

4. Transgeen plantenmateriaal dat vreemd DNA bevat coderend voor een acetoacetyl-CoA reductase activiteit, bij voorkeur waarin het DNA een open afleesframe is tussen 3952 en 4692 van SEQ ID NO: 1.

5. Transgeen plantenmateriaal dat vreemd DNA bevat coderend voor een polypeptide dat PHA synthase activiteit vertoont.

6. Transgeen plantenmateriaal dat vreemd DNA bevat coderend voor één of meer enzymen die leiden tot een synthese van polyhydroxyalkanoaat uit hydroxyalkyl-CoA, bij voorkeur waarin het DNA een open afleesframe is tussen 842 en 2611 van SEQID No: 1.

7. Transgeen plantenmateriaal dat vreemd DNA bevat coderend voor één of meer enzymen die de synthese van hydroxyalkyl-CoA katalyseren.

8. Transgeen plantenmateriaal dat vreemd DNA bevat dat codeert voor één of meer enzymen die leiden tot de produktie van acetoacetyl-CoA uit produkten waarvoor het vreemde DNA codeert.

9. Het plantenmateriaal volgens conclusie 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 of 8 in de vorm van een zaad of voorloper daarvan.

10. Werkwijze voor het introduceren van vreemd DNA dat codeert voor polypeptides die leiden tot de synthese van een polyhydroxyalkanoaat in een plant die omvat het paren door geslachtelijke bevruchting van twee planten die geen polyhydroxyalkanoaten produceren, waarbij elk vreemd DNA bevat dat codeert voor één of meer verschillende enzymen van een weg leidend tot de polymerisatie van hydroxyalkyl-CoA door polyhydroxyalkanoaatsynthase om de plant te verkrijgen die codeert voor het polyhydroxyalkanoaat, waarbij het polyhydroxyalkanoaat bij voorkeur polyhy-droxybutyraat is.

11. Werkwijze volgens conclusie 10, met het kenmerk, dat het polyhydroxyalkanoaat in de vorm van granulen in cellen van de plant voorkomt.

12. Gen segment zoals aanwezig is in een zaad gedeponeerd als ATCC 75042 dan DNA bevat dat codeert voor het 3-ketothiolasegen.

13. Plant die het gensegment van conclusie 12 bevat, waarbij de plant bij voorkeur Arabidopsis thaliana is.

14. Gensegment zoals aanwezig is in een zaad gedeponeerd als ATCC 75044 dat DNA bevat coderend voor het acetoacetyl-CoA reductase gen.

15. Plant die het gensegment van conclusie 14 bevat, waarbij de plant bij voorkeur Arabidopsis thaliana is.

16. ·Gensegment zoals aanwezig.in.een zaad gedeponeerd als ATCC 75043 dat DNA bevat dat codeert voor het PHB synthase gen.

17. Plant die het gensegment van conclusie 16 bevat, waarbij de plant bij voorkeur Arabidopsis thaliana is.

18. Transgeen plantenmateriaal dat vreemd DNA bevat coderend voor één of meer enzymen die leiden tot de produktie van 3-hydroxybutyryl-CoA uit de produkten gecodeerd door het vreemde DNA.