HUT66825A - Transgenic plants producing polyhydroxyalkanoates - Google Patents

Transgenic plants producing polyhydroxyalkanoates Download PDF

Info

Publication number
HUT66825A
HUT66825A HU9400145A HU9400145A HUT66825A HU T66825 A HUT66825 A HU T66825A HU 9400145 A HU9400145 A HU 9400145A HU 9400145 A HU9400145 A HU 9400145A HU T66825 A HUT66825 A HU T66825A
Authority
HU
Hungary
Prior art keywords
phb
plants
transgenic
dna
coa
Prior art date
Application number
HU9400145A
Other languages
English (en)
Other versions
HU9400145D0 (en
Inventor
Christopher Roland Somerville
Yves Poirier
Douglas Edward Dennis
Original Assignee
Univ Michigan State
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=24942760&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=HUT66825(A) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Univ Michigan State filed Critical Univ Michigan State
Publication of HU9400145D0 publication Critical patent/HU9400145D0/hu
Publication of HUT66825A publication Critical patent/HUT66825A/hu

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0006—Oxidoreductases (1.) acting on CH-OH groups as donors (1.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8242—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits
    • C12N15/8243—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits involving biosynthetic or metabolic pathways, i.e. metabolic engineering, e.g. nicotine, caffeine
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/1025—Acyltransferases (2.3)
    • C12N9/1029—Acyltransferases (2.3) transferring groups other than amino-acyl groups (2.3.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/62—Carboxylic acid esters
    • C12P7/625—Polyesters of hydroxy carboxylic acids

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nutrition Science (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
  • Polyesters Or Polycarbonates (AREA)
  • Biological Depolymerization Polymers (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Compounds Of Unknown Constitution (AREA)
  • Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)

Description

A találmány tárgyát bizonyos genetikai információt hordozó anyag, azaz DNS, amely fehérje természetű anyagokat kódoló géneket és/vagy azok termelését szabályozó vagy másképpen befolyásoló géneket tartalmaz, magasabb rendű növények sejtjeibe való bevitele és kifejezése, és termékeny növényeknek a genetikailag transzformált sejtekből való regenerálása képezi. Ennek a genetikai beavatkozásnak a célja az, hogy lineáris poliészterekből és hidroxisavakból álló polimerek szintetizálásának képességét átvigye mikroorganizmusokból magasabb rendű növényekbe. Az anyagoknak ezt a csoportját általában poli(hidroxi-alkanoát)-oknak nevezik. Az itt bemutatásra kerülő specifikus példa a poli(hidroxi-butirát) (PHB) előállítása.
Sok baktériumfaj akkumulál hidroxi-acil monomerekből álló poliészter szemcséket, amelyek tartalék szénforrásként szolgálnak. A bakteriális poli (hidroxi-alkanoát)-ok előfordulásáról, metabolizmusáról, metabolikus szerepéről és ipari felhasználásáról az utóbbi időben referáltak [ Anderson, A. and Dawes, E.A., Microbiol. Rév. 54, 450-472. (1990)] . Ezen csoport legáltalánosabbnak talált vegyülete a poli(D(-)-3-hidroxi-butirát). Néhány faj azonban más hidroxi-alkanoátok, például a 3-hidroxi-pentanoát kopolimerjeit akkumulálja [ Wallen, L.L. and Rnhwedder, W.K.. Environ. Sci. Technoi. 576-579. (1974)] . Legalább 11 rövid szénláncú 3-hidroxisav mutatható ki tengeri üledékből származó polimerek alkotórészeként. Az Alcaligenes eutrophus poli(hidroxi-alkanoát) termelésének vizsgálatai azt mutatták, hogy ha a baktériumo « « · kát olyan táptalajon tenyésztik, amely csak glükózt tartalmaz szénforrásként, akkor csak PHB akkumulálódik. Viszont ha glükózt és propionsavat is adnak szénforrásként, a baktériumokban a 3-hidroxi-pentanoát és 3-hidroxi-butirát véletlenszerű kopolimerjei akkumulálódnak [Holmes, P.A., Phys. Technoi, 16, 32-36. (1985); 0 069 497 és 0 052 459 számú európai szabadalmi leírások] . Továbbá, ha az A. eutrophus-t különböző egyéb szénforrásokkal látják el, 4-hidroxi-butirát és 5-hidroxi-valerát monomereket tartalmazó poliészterek képződnek [ Table I in Anderson, A.J. and Dawes, A.E., Microbiol. Rév. 54, 450-472. (1990)] . Ezek alapján úgy tűnik, hogy a polimer összetételét bizonyos mértékig a monomerekből a polimer szintézisét katalizáló enzimek alternatív szubsztrátjainak felhasználhatósága szabályozza.
A PHB a baktériumsejtekben körülbelül 0,24-0,5 /um átmérőjű szemcsékben akkumulálódik. A PHB monomerek molekulatömegének mérései alapján az egyes szemcsék polimerlánc tartalmát minimálisan 1000-re becsülték. Felvetődött, hogy a szemcsék lipidből és fehérjéből álló membránköpennyel rendelkeznek, ami a szemcse tömegének körülbelül 0,5-2 %-át jelenti [Anderson, A.J. and Dawes, A.E., Microbiol. Rév. 54, 450-472. (1990)] . Úgy gondolják, hogy a PHB szintetáz enzim aktivitása összefüggésben van evvel a meiubráriual. A PHB állapota a szemcsén belül a szubsztanciális bizonytalanság esete. Ennek nyilvánvaló volta azt sugallja, hogy a polimer a szemcsében amorf állapotban van. Egyetlen szervezetnél sem ismert, hogy mi szabályozza a szemcsék méretét.
A PHB a legtöbb szervezetben acetil-koenzim A-ból (AcCoA) szintetizálódik három egymást követő reakcióban, amelyeket a 3-ketotioláz (acetil-koenzim A acetiltranszferáz; EC 2.3.1.9), acetoacetil-koenzim A reduktáz (hidroxi-butiril-CoA dehidrogenáz; EC 1.1.1.36) és poli(3-hidroxi-butirát) szintetáz katalizál. A reakció útvonalat az 1. ábra mutatja be. A Rhodospirillum rubrum-ban a PHB az L( + )-3-hidroxi-butiril-CoA —>krotonil-CoA—>D(-) -3-hidroxi-butiril-CoA átalakulással szintetizálódik. A 3-ketotioláz enzimet tisztán kinyerték különböző PHB-t szintetizáló baktériumokból, és vizsgálták néhány magasabb rendű növénynél. Úgy gondolják, hogy magasabb rendű növényeknél az enzimnek szerepe van az acetoacetil-koenzim A mevalonát képződéshez való termelésében, valamint a zsírsavak lebontásában. Az acetoacetil-CoA reduktázt számos PHB szintetizáló baktériumban kimutatták. Úgy tűnik, hogy néhány fajnak, beleértve az A. eutrophus-t, két izoenzimje van, amelyek szubsztrát specificitásban és kofaktor igényben különböznek egymástól. Az A. eutrophus NADH reduktáz enzimje 4-10 szénatomos D(-)- és L(+)-3-hidroxiacil-CoA-kkal, míg a NADPH reduktáz csak 4 és 5 szénatomos D(-)-3--hidroxiacil-CoA-kkal együtt aktív. Ilyen típusú enzimet eddig még nem írtak le magasabb rendű növényekben. PHB szintetáz aktivitást kimutattak PHB-akkumuláló baktériumokban, a tenyésztés körülményeitől függően oldható enzim vagy szemcséhez kötött aktivitás formájában. Az enzim mindkét formáját részlegesen megtisztították, de az instabilitás miatt nem teljes homogenitásig . Az A.
« · · « · eutrophus PHB szintetáz enzimje a D(-)-enantiomerekre specifikus, és 3-hidroxiacil-CoA enzimekkel tesztelve csak a 4 és szénatomos szubsztrátokkal mutatkozott aktívnak, azokkal a megfigyelésekkel egyezően, amelyek szerint ebben a szervezetben csak 4 és 5 szénatomos 3-hidroxisav monomer egységek épülnek be a polimerbe. A PHB szintetáz működésének mechanizmusa homályban marad. Feltételezik, hogy a szintetáz által játszott láncátvivő (chain transfer) szerepnek valamilyen módon kontrollálnia kell a keletkező polimer molekula tömegét, ami jellemző az adott organizmusra. Növényekben eddig még nem mutattak ki PHB szintetáz aktivitást.
Kutatók néhány csoportja egymástól függetlenül klónozta és E. coli-ban kifejezte a PHB bioszintéziséért felelős A.
eutrophus géneket [ Slater, S.C., et al.
J. Bacteriol.
170,
4431-4436.
(1988); Schubert, P., et al.
J. Bacteriol.
170,
5837-5847.
(1988)] . A. eutrophus-ból származó 5,2 kbp fragmentumot hordozó rekombináns E. coli törzsek képesek voltak jelentős mennyiségű PHB felhalmozására sejten belüli szemcsék formájában. Az 5,2 kbp fragmentum nukleotid szekvenciáját is egymástól függetlenül határozta meg két csoport [ Janes, B.B., et al. , In Dawes, E.A. (ed) Növel
Biodegradable
Microbial
Polymers,
Kluwer
Academic
Publishers, 175-100.
(1990); Pecples, O.P. and Siuskey,
A.J., J. Bioi. Chem. 264, 15293-15297. (1989); Peoples, O.P. and Sinskey, A.J., J. Bioi. Chem. 264, 15298-15303. (1989)] . A nyílt leolvasási keretekből (open reading frames) leszármaztatott aminosav szekvenciák analízise a genetikai komple• · · ♦ * · · · · « • · · · Λ ··· «· ♦ · ·· « ····· ···· ·· ·· · · · 4 mentációs vizsgálatokon alapuló bizonyítékkal egyezően felfedte, hogy az 5,2 kbp fragmentum három, egymáshoz szorosan kapcsolódó gént tartalmaz, amelyek a PHB képződéséhez szükséges három enzimet kódolják. A bioszintetizáló enzimek baktériumokban való termeltetésére szolgáló, klónozott gének használatára vonatkozó szabadalmat már nyújtottak be(Peoples, O.P. and Sinskey, A.J., WO 89/00202 közzétételi számú nemzetközi szabadalmi bejelentés).
Néhány baktériumfaj képes enzimeket kiválasztani, és lebontani a PHB-t és vele rokon poli(hidroxi-alkanoát)-okát [ Anderson, A. and Dawes, E.A., Microbiol. Rév. 54, 450-472.
(1990)] . E baktériumfajok elterjedtsége következtében a természetes környezet nagy részében a PHB gyorsan lebomlik a talajban és az eleveniszapban. így a PHB és vele rokon poli(hidroxi-alkanoát)-ok érdeklődésre tarthatnak számot, mint a biodegradálható, hőre lágyuló műanyagok megújítható forrásai. Az ipari PHB előállítás baktériumok üzemi fermentációs szaporításával 1982-ben kezdődött el. Az ily módon előállított PHB-t az ICI értékesíti Biopol kereskedelmi név alatt. A baktériumok nagyüzemi szaporításával és kinyerésével kapcsolatos költségek miatt azonban a PHB előállítása jóval drágább, mint más polimer anyagok, például a magasabb rendű növények sok fajában nagy mennyiségben akkumulálódó keményítő. Ezért előnyös lehet génsebészeti úton olyan magasabb rendű növények kifejlesztése, amelyek akkumulálják a PHB-t.
«« ’··< ·· · «· · ♦ · · • · ··· ··· · · « ·· · ·«··· ···· «· ·· ··· ·
Az ábrák és táblázatok rövid magyarázata
Az 1. ábra a poli(hidroxi-butirát) (PHB) keletkezésének biokémiai útvonalát mutatja be. Az A. eutrophus-ban a PHB három enzim eredményes működése során termelődik: a 3-ketotioláz az acetil-CoA —> acetoacetil-CoA; az acetoacetil-CoA reduktáz az acetoacetil-CoA —> D(-)-3-hidroxi-butiril-CoA; a
PHB szintetáz a D(-) -3-hidroxi-butiril-CoA —> poli(hidroxi az acetoacetil-CoA prekurzor a mevalonsav képződésben.
A 2. ábra az A. eutrophus-ból származó PHB operon nukleotid szekvenciáját mutatja be. A szekvenciát Janes és munkatársai állapították meg [
Janes,
B., Hollar, J. and
Dennis, D. in
Dawes, E.A.
(ed) ,
Növel Biodegradable
Polymers, Kluwer
Academic Publishers, nukleotid 842-től
2611-ig terjedő nyílt leolvasási kerete (open reading frame) kódolja a PHB szintetázt (phbC gén) (aminosavak S1-S589) . A nukleotid 2696-tól 3877-ig terjedő nyílt leolvasási kerete kódolja a 3-ketotioláz enzimet (phbA gén) (aminosav T1-T393) .
A nukleotid 3952-től 4692-ig terjedő nyílt leolvasási kerete kódolja az acetoacetil-CoA reduktáz enzimet (phbB gén) (aminosav R1-R246). A Ddel, BstBI, PstI,
SacI, és TthlllI restrikciós enzimek hasítási helyeit a szekvenciában aláhúzással jelöltük.
Ezeket a restrikciós enzimeket a phb gének szubklónozásához használtuk.
A 3. ábra a pUC-THIO és pBI-THIO plazmidok felépítéséhez tartozó lépések vázlatos összefoglalását mutatja. Ez utóbbi plazmid (pBI-THIO) szerepe az A. eutrophus-ból szár»·« mazó a 3-ketotioláz gén áthelyezése a CaMV 35S promoter transzkripciós kontrollja alá, hogy az magasabb rendű növényekben átírható legyen. A felső vázlatrajz az A. eutrophus PHB operonját ábrázolja, a PHB szintetázt, a 3-ketotiolázt és az acetoacetil-CoA reduktázt kódoló nyílt leolvasási keretek hozzávetőleges elhelyezkedésével. A vízszintes nyilak mutatják a transzkripció irányát. Az alsó vázlatrajz a pBI121-származék plazmidok fontosabb összetevőit — NPT II, neomycin foszfotranszferáz II gén, amely a kanamycin rezisztenciát kódolja; CaMV 35S, karfiol mozaik vírus 35S promoter; poli A, poliadenilációs szekvencia; RB, a T-DNS jobboldali határ szekvenciája; LB, a T-DNS baloldali határ szekvenciája — ábrázolja. Az alsó vázlat nem méretarányos. A restrikciós enzimek hasítási helyeinek rövidítései: D, Ddel; P, PstI; B, BstBI; T, TthlllI; BH, BamHI; S, SacI; H, Hindin .
A 4. ábra a pUC-SYN és pBI-SYN plazmidok felépítéséhez tartozó lépések vázlatos összefoglalását mutatja. Ez utóbbi plazmád (pBI-SYN) szerepe az A. eutrophus-ból származó PHB szintetáz gén áthelyezése a CaMV 35S promoter transzkripciós kontrollja alá hogy az magasabb rendű növényekben átírható legyen. A vázlatrajzok és rövidítések jelentését a 3. ábránál már megadtuk.
Az 5. ábra a pUC-RED és pBI-RED plazmidok felépítéséhez tartozó lépések vázlatos összefoglalását mutatja. Az utóbbi plazmád (pBI-RED) szerepe az A. eutrophus-ból származó acetoacetil-CoA reduktáz gén áthelyezése a CaMV 35S promoter transzkripciós kontrollja alá, hogy az magasabb rendű növényekben kifejeződjön.
A fölső és alsó vázlatrajzokat és a rövidítéseket a 3.
ábránál már leírtuk középső vázlat az acetoacetil-CoA reduktáz gén kinagyított részlete. Az #1 és #2 PCR primerek helyzetét, és szekvenciáját ábrázolja. Az #1 PCR primer 3' -végén levő utolsó nukleotid megfelel a 2. ábrán levő 3952. nukleotidnak, és ez a reduktáz gén iniciációs kódonjának első nukleotidja. A #2
PCR primer 3' -végén levő utolsó nukleotid komplementere a
2. ábrán levő 4708. nukleotidnak. Jelezzük a PCR primerek által létrehozott további BamHI és KpnI restrikciós enzim hasítási helyeket.
A 6. ábra a nem transzformált kontroll és a transzgenikus A. thaliana növények Southern biot analízisét mutatja. Egy g genomiális DNS-t vontunk ki a nem transzformált A. thaliana Rschew fajból és a transzgenikus növényekből a Hindin restrikciós enzimmel, a fragmentumokat agaróz-gélelektroforézissel választottuk el, és nylon membránra vittük. A filtereket 32p_vej_ jelölt, (A) phbA, (B) phbB és (C) phbC génekből származó DNS fragmentumokkal hibridizáltuk. Az analizált genomiális DNS-ek a következők: vad típusú A. thaliana Rschew faj (a sáv), transzgenikus T4-3A (b sáv), T3-2A (c sáv), T4-2A (d sáv), T4-3B (e sáv), RedB-2G (f sáv) , RedB-2B (g sáv), RedB-2E (h sáv), RedB-2C (i sáv) , RedD-3A (j sáv), RedB-2A (k sáv), RedB-2D (1 sáv), S12-3A (m sáv), S8-1-2C (n sáv), S8-1-2A (o sáv) és S8PUC-2B (p sáv).
·· ··<·· 99 9999 9
9 · · 9· ♦ 9 ·<»· 999* · • · · · ♦ · ···· «<·· ·· 99 9999
A baloldali számok a hosszúságot jelentik kilobázis pár egységben.
A 7. ábra nem transzformált kontroll, és transzgenikus A. thaliana növények Northern biot analízisét mutatja. Vad típusú A. thaliana Rschew faj teljes RNS mennyiségét (10 /ug) és a transzgenikus növényekből 20 /ug-ot választottunk el elektroforézissel formaldehid-tartalmú agaróz gélben, majd nylon membránra vittük. A szűrőket 32p_vej_ jelölt, (A) phbA, (B) phbB és (C) phbC génekből származó DNS fragmentumokkal hibridizáltuk. A növényekből analizált RNS-ek: T3-2A (a sáv), T4-2A (b sáv), T4-3B (c sáv), T4-3A (d sáv), vad típusú A. thaliana (e,j és r sávok), S8PUC-2B (f sáv), S8-12C (g sáv), S12-3A (h sáv), S8-1-2A (i sáv), RedB-2D (k sáv) , RedB-2E (1 sáv), RedB-2G (m sáv), RedB-2A (n sáv), RedB-2B (o sáv) , RedB-2C (p sáv) és RedD-3A (q sáv) . A számok a hosszúságot jelentik kilobázis pár egységben.
A 8. ábra a tisztított PHB és növényi kivonatok gázkromatográfiás (GC) elemzését mutatja. A nem transzformált vad típusú A. thaliana Rschew faj (B) és a két transzgenikus növény S8-1-2A és RedB-2C FI hibridjének (C) leveleiből készült átészterezett kloroformos kivonat GC spektrumát hasonlítottuk össze az átészterezett kereskedelmi PHB (A) kromatogramjávai. A nyilak mutatják az etil-nidroxi-butirát csúcs helyét.
A 9. ábra egy PHB standardból és növényi kivonatokból származó PHB-ból készített etil-hidroxi-butirát preparátumok gázkromatográfia-tömegspektrometriás (GC-MS) analízisét muf 4 ··· *>· 4 ·
4 V · « » ··«· ···« ·· »· ·»· ·
tatja. (A) az átészterezett kereskedelmi PHB tömegspektruma;
(B) az S8-1-2A és RedB-2C FI hibrid leveléből készült kloroformos kivonat GC csúcsának tömegspektruma, amelynek a retenciós ideje egyezik az etil-hidroxi-butirátéval(8C. ábra).
A 10. ábra PHB-pozitív transzgenikus A. thaliana növények levelének és magjának transzmissziós elektronmikroszkópos (TEM) felvételeit mutatja. S8-1-2A és S8-1-2C transzgenikus növényeket RedB-2D vagy RedB-2A transzgenikus növényekkel poroztunk át. A létrejött FI magokat elvetettük talajba, és a 2-3 hetes növények levélmintáit analizáltuk TEM segítségével (felvételek a-tól e-ig). Néhány FI magot vízben is beáztattunk 24 órán keresztül, a maghéjból kibontott csirát és a szikleveleket (cotyledons) TEM segítségével analizáltuk (f jelű felvétel) . (a) A RedB-2D X S8-1-2A hibridből származó két szomszédos levél mezofillum sejtjeinek sejtmagjában levő elektron-fényes szemcsék halmazát mutatja, (b) Az (a) felvételen látható jobb felső sejt sejtmagja nagyobb nagyításban. (c) A RedB-2D X S8-1-2A FI hibridből származó levél mezofillum sejt sejtmagja, szemcsék halmaza látható.
(d) A RedB-2A X S8-1-2A FI hibridből származó levél mezofillum sejt, elektron-fényes szemcsék a sejtmagban(N) és a vakuólumban(V). (e) A RedB-2A X S8-1-2A Fi hibridből való levél mezofillum sejt, elekt;on-íényes szemcsék a cito plazmában, (f) Sziklevél (cotyledon) sejtek a RedB-2A X S81-2C FI hibrid magjából, a sejtmagban szemcsék láthatók. A nyilak az elektron-fényes szemcsék halmazát mutatják.
• ·
Bar = 1/um az a, b, c, d és f felvételeken. Bar = 0,25/um az e felvételen.
Jelen találmány olyan transzgenikus növényi anyagra vonatkozik, amely poli(hidroxi-alkanoát)-ok termelését eredményező idegen DNS-t tartalmaz.
Jelen találmány továbbá olyan. transzgenikus növényi anyagra vonatkozik, amely 3-ketotioláz aktivitást kifejtő peptidet kódoló idegen DNS-t tartalmaz.
Jelen találmány olyan transzgenikus növényi anyagra is vonatkozik, amely acetoacetil-CoA reduktáz aktivitást kifejtő peptidet kódoló idegen DNS-t tartalmaz.
Jelen találmány olyan transzgenikus növényi anyagra is vonatkozik, amely idegen PHB szintetáz aktivitást kifejtő peptidet kódoló idegen DNS-t tartalmaz.
Jelen találmány egy poli(hidroxi-alkanoát) szintéziséhez szükséges fehérjéket kódoló bakteriális DNS növénybe való bejuttatására szolgáló eljárás, amely magában foglalja két olyan növény egymással történő megtermékenyítését, amelyek nem termelnek PHB-t, mindkettő tartalmaz azonban egy vagy több különböző, olyan enzimet kódoló idegen DNS-t, amelyek a hidroxialkil-CoA polimerizációjához vezető útvonalon, poli(hidroxi-alkanoát) szintetáz révén olyan növényt eredményeznek, amely immár kódolja a poli(hidroxi-alkanoát)-ot.
A jelen találmány tehát egy eljárást biztosít olyan genetikailag módosított magasabb rendű növények előállítására, amelyek PHB-t vagy rokon poli(hidroxi-alkanoát)-okát termel13 nek és akkumulálnak. Az egyik megvalósítás szerint a PHB termelő növényeket Ti-plazmid közvetítette transzformációval· nyerjük, a növénybe stabilan bejuttatott olyan bakteriális gének révén, amelyek az acetoacetil-CoA reduktáz (hidroxibutiril-CoA dehidrogenáz) és poli (3-hidroxi-butirát) szintetáz enzimeket kódolják. Mivel bakteriális gének normálisan nem írhatók át növényi sejtekben, a géneket úgy módosítjuk, hogy egy olyan DNS szekvencia (azaz egy promoter) transzkripciós kontrollja alatt legyenek, amely megindítja az átírást a növényi sejtben. A géneket egy alkalmas DNS szekvenciának a nem kódoló 3' -régióhoz való hozzákapcsolásával is módosítjuk úgy, hogy a növényi sejtben keletkező átírások megfelelően poliadeniláltak legyenek.
A találmány egyik megvalósítása szerint PHB termelő növényeket kapunk két olyan szülői vonal ivaros keresztezése révén, amelyeknek egyik tagja sem termel PHB-t. Ezt egy — a módosított PHB szintetáz gén külső (ectopic) másolatára nézve homozigóta — transzgenikus növény, és egy másik — a módosított acetoacetil-CoA reduktáz gén külső másolatára nézve homozigóta — transzgenikus növény átporzásával valósítjuk meg. Ebben az összefüggésben az ectopic gének kifejezés olyan géneket jelent, amelyek normális körülmények között nincsenek jel^n az adott élőlényben, hanem genetikai transzformációval· stabilan bejuttatták azokat a genomba. Gének külső másolatára nézve homozigóta meghatározás azt jelenti, hogy egy diploid organizmusban mindkét homológ kromoszómán belül ugyanarra a helyre épültek be a külső (ectopic) gének.
• · ·· · ····· ···· ♦· ·· ··· ·
A találmány taglalását megelőzően célszerű néhány, a továbbiakban használatos kifejezést megmagyarázni.
Transzformáció, a befogadó organizmus genotípusának megváltoztatására irányuló folyamat, DNS valamilyen módon történő stabil beépítésével.
Transzgenikus növény, olyan DNS szekvenciákat tartalmazó növény, amelyek normálisan nincsenek jelen a fajban, hanem transzformációval lettek beépítve.
Transzkripció, a DNS-ben tárolt genetikai információnak megfelelő RNS lánc képződését jelenti.
Transzláció, azt a folyamatot jelenti, amelynek során a genetikai információ egy mRNS molekula révén irányítja a specifikus aminosavak sorrendjét a fehérjebioszintézis alatt.
Promoter, egy DNS fragmentum, ami kiváltja a genetikai anyag átírását. Az itt leírtak esetében a promotert olyan DNS fragmentumok megjelölésére használjuk, amelyek megengedik az átírást a növényi sejtben. A CaMV 35S promoter egy DNS fragmentum a karfiol mozaik vírusból, amely viszonylag nagymértékben vált ki átírást sok magasabb rendű növényi faj különböző szöveteiben [ Benfey, P.N. and Chua, N.H., Science 250, 959-966. (1990)] .
A poli A toldalék egy olyan nukleotid szekvencia, amely néhány enzimet képessé tesz a mRNS specifikus helyen történő hasítására, és a mRNS 3' -végére történő adenilát-maradék hozzákapcsolására.
* · · ··« • · · phbC, phbA, phbB, az A. eutrophus génjeinek jelölései, amely gének külön-kölön a PHB szintetázért, 3-ketotiolázért és acetoacetil-CoA reduktázért felelősek. [ Peoples, O.P. and Sinskey A.J., J. Bioi. Chem. 264, 15298-15303.(1989)] .
A transzgenikus növények utódainak leírásánál célszerű egyezményes jelet bevezetni, amely megmutatja, hogy a DNS bevitel óta hány önbeporzással keletkezett generáció telt el. A mi esetünkben az eredeti transzformáltat nevezzük T0 generációnak. Ebből önbeporzással keletkező utód a TI generáció, és így tovább.
Bár az ezután tárgyalandó kísérletek az Arabidopsis thaliana (L.) Heynhold növényre vonatkoznak, a vázolt eljárás általánosan használható bármilyen magasabb rendű növénynél, amelynél transzformációs módszer rendelkezésre áll. Fentiekhez hasonlóan, bár az itt leírt eljárás A. eutrophus génekre vonatkozik, általánosan használható bármely más olyan organizmus génjeivel, amely képes PHB-t szintetizálni. Valamint az is nyilvánvaló, hogy bár a leírt folyamat PHB előállítására vonatkozik, az eljárás általánosan használható bármely poli(hidroxi-alkanoát) előállítására, amely normális körülmények között mikroorganizmusokban a poli(hidroxi-alkanoát) (PHA) szintetáz (magában foglalja a PHB szintetázt) aktivitása révén keletkezik, és amely enzim számára a megfelelő hidroxialkil-CoA szubsztrát az adott növényben jelen van.
• ·
KÍSÉRLETI RÉSZLETEK
Kisérlettervezés:
A PHB transzgenikus növények utódaiban történő előállításához a következő egymás utáni lépések megvalósítása szükséges: (1) promoter fúziókat tartalmazó baktérium plazmidok sorozatának összeállítása, (2) ezen plazmidok bejuttatása Agrobacterium tumefaciens-be, (3) A. turnéfaciens felhasználása a gének növényi (azaz, példánkban A. thaliana) sejtbe való bejuttatására, (4) transzgenikus növények regenerálása, (5) olyan növények szelektálása, amelyek a külső (ectopic) génekre nézve homozigóták, (6) a transzformált növények külső (ectopic) génjei működésének analízise a célból, hogy kifejeződnek-e, illetve produktumaik működőképesek-e, (7) két vagy több különböző külső gént tartalmazó hibrid növények előállítása ivaros keresztezéssel, (8) a hibrid anyag analízise PHB jelenléte szempontjából. Ezeket a lépéseket részletezzük a továbbiakban.
Transzkripciós fúziók összeállítása:
Ahhoz, hogy megvalósíthassuk baktérium gének átírását magasabb rendű növényekben, a baktérium géneket növényi promoter segítségével úgy kell módosítanunk, hogy akkor íródjanak át, amikor a magasabb rendű növénybe bekerülnek. Ezen felül általában szokás a baktérium gének 3' -régióját egy poli A toldalékkal ellátni, hogy az átírt gének megfelelően kifejeződjenek a magasabb rendű növényekben. Mindkét fenti kivánalom teljesült a phbC, phbA és phbB gének pTZ18UPHB plazmádból a pBI121 (Clonetech, CA) bináris Ti-plazmid • 4 · vektorba történő klónozásával. A pTZ18U-PHB plazmádban foglalt phbC, phbA és phbB gének nukleotid szekvenciáit mutatja a 2. ábra. Jelezzük még az odatartozó, klónozáshoz használt restrikciós enzimes hasítási helyeket, valamint a három génből levezetett nyílt leolvasási keretet.
CaMV 35S-phbA gén fúziót valósítottunk meg a pTZ18U-PHB plazmád Pstl és Ddel restrákcáós enzámekkel történő kezelésével. A 3-ketotáoláz génjének kódoló szekvenciáját tartalmazó 1,3 kb restrákcáós fragmentumot agaróz gélelektroforézássel választottuk el a többi DNS fragmentumtól. Az agarózból DEAE cellulóz membrán segítségével nyertük vissza a DNS fragmentumot (Schleicher and Schuell NA-45 DEAE membrán). A DNS fragmentum tapadós végeit a megtisztított restrikciós fragmentumnak T4 DNS-polimerázzal és dezoxinukleotid-trifoszfátokkal végzett inkubálásával töltöttük fel. Ezek után a tompa fragmentumot a pUC18 plazmád Smal helyére klónozva kaptuk a pUC-THIO plazmidot. A pUC-THIO plazmádból BamHI és SacI segítségével kivágtuk az 1,3 kb restrikciós fragmentumot, tisztítottuk elektroforézissel és DEAE membrán felhasználásával, és hozzákapcsoltuk a pBI121 plazmádhoz, amelyet előzőleg már emésztettünk ugyanazzal a két enzimmel. Azt találtuk, hogy a létrejött plazmád, jele pBI-THIO, a CaMV 35S promoterhez és a pBI121 poli A toldalékéhoz viszonyítva helyes elrendezésben tartalmazta az A.eutrophus 3-ketotioláz génjét, úgy hogy az várhatóan kifejeződik magasabb rendű növényekben. A pBI-THIO létrehozásához szükséges lépések vázlatos összefoglalását a 3. ábrán mutatjuk be.
CaMV 35S-phbC gén fúziót valósítottunk meg a pTZ18U-PHB plazmid BstBI és TthlllI restrikciós enzimekkel történő kezelésével. A PHB szintetáz génjének kódoló szekvenciáját tartalmazó 1,9 kb restrikciós fragmentumot agaróz gélelektroforézissel választottuk el a többi DNS fragmentumtól. Az agarózból DEAE cellulóz membrán segítségével nyertük vissza a DNS fragmentumot. A DNS fragmentum tapadós végeit a megtisztított restrikciós fragmentumnak T4 DNS-polimerázzal és dezoxinukleotid-trifoszfátokkal végzett inkubálásával töltöttük fel. Ezek után a tompa fragmentumot a pUC18 plazmid Smal helyére klónozva kaptuk a pUC-SYN plazmidot. A pUCSYN plazmidból BamHI enzimes komplett emésztéssel, és Saclgyel végzett részleges emésztéssel kivágtuk az 1,9 kb restrikciós fragmentumot, tisztítottuk elektroforézissel és DEAE membrán felhasználásával, és hozzákapcsoltuk a pBI121 plazmidhoz, amelyet előzőleg már emésztettünk ugyanazzal a két enzimmel. Azt találtuk, hogy a létrejött plazmid, jele pBI--SYN, a CaMV 35S promoterhez és a pBI121 poli A toldalékéhoz viszonyítva helyes elrendezésben tartalmazta az A.
eutrophus
PHB szintetáz génjét, úgy hogy az várhatóan kifejeződik magasabb rendű növényekben.
A pBI-SYN létrehozásához szükséges lépések vázlatos összefoglalását a 4.
ábrán mutatjuk be.
CaMV 35S-phbB gén fúziót hoztunk létre egy szintetikus oligonukleotid pár primerekként való felhasználásával egy polimeráz láncreakcióban (PCR=polymerase chain reaction) a pTZ18U-PHB plazmidból származó phbB gén sokszorozására. Az oligonukleotid primerek szekvenciáját az 5. ábrán mutatjuk be, ahol #1 PCR primer és #2 PCR primer jelölésekkel szerepelnek. Az oligonukleotidokat úgy terveztük meg, hogy a kibővített DNS szekvencia tartalmazott egy szintetikus BamHI helyet a kódoló szekvencia 5' -vége mellett és egy szintetikus KpnI helyet a szekvencia 3' -végén. A polimeráz lánc reakció (PCR) 790 bp termékét szeparáltuk, és tisztítottuk agaróz gélből, emésztettük BamHI és KpnI restrikciós enzimekkel, és hozzákapcsoltuk a pUC18 plazmádhoz — amelyet előzőleg már hasítottunk ugyanezzel a két enzimmel —, hogy megkapjuk a pUC-RED plazmidot. A pUC-RED plazmádból BamHI és SacI enzimekkel történő emésztéssel kivágtuk a restrikciós fragmentumot, tisztítottuk elektroforézissel és DEAE cellulóz membrán felhasználásával, és hozzákapcsoltuk a pBI121 plazmádhoz, amelyet előzőleg már emésztettünk ugyanezzel a két enzimmel. Azt találtuk, hogy a létrejött plazmád, jele pBI-RED, a CaMV 35S promoterhez és a pBI121 poli A toldalékéhoz viszonyítva helyes elrendezésben tartalmazta az A.eutrophus acetoacetil-CoA reduktáz génjét, úgy hogy az várhatóan kifejeződik magasabb rendű növényekben. A pBI-RED létrehozásához szükséges lépések vázlatos összefoglalását az 5. ábrán mutatjuk be.
A pBI-SYN, pBI-THIO és pBI-RED plazmidokat elektroporációval juttattuk be az Agrobacterium tumefaciens C58 pGV3850 törzsbe. A plazmidot tartalmazó telepeket a pBI121 szülői plazmádban meglevő kanamicin rezisztencia gén kifejeződése alapján végzett szelekcióval nyertük ki
Transzgenikus növények előállítása:
A. thaliana sejteket transzformáltunk steril gyökér szövetnek az előző fejezetben leírt rekombináns bináris Ti plazmidokat hordozó A. tumefaciens kultúrával való együttes inkubálása révén. Steril A. thaliana Rschew faj magoncok gyökereit transzformáltuk Valvekens és munkatársai leírása szerint [Valvekens, D. et. al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 5536-5540.(1988)] . A. tumefaciens mindhárom törzsével, amelyek egy-egy módosított phb gént hordoztak, fertőztük az A. thaliana gyökér darabokat. Ez a visszanyerés után körülbelül 50 kanamicin rezisztens kallusz szövetet eredményezett minden egyes esetben. Ezeknek 10-25%-a fejlesztett termékeny új hajtásokat, amelyek magokat termeltek. A magokat termelő mindegyik növényt különböző számmal jelöltük meg, jelezve, hogy különböző transzformációs esetet képvisel.
Összesen 11, feltehetően transzgenikus növényt nyertünk vissza pBI-RED plazmidot hordozó A. tumefaciens törzzsel kezelt szövetekből. Ezek jelölése RedB-2A, -2B, -2C, -2D, -2E, -2F, -2G, -2H, -3A, -5A és RedD-3A. A RedB-2F, -2H és -5A kivételével mindezeket a transzgenikus növényi vonalakat részletesen analizáltuk a következő fejezetekben leírtak szerint.
Összesen 5, feltehetően transzgenikus növényt nyertünk vissza pBI-THIO plazmidot hordozó A. tumefaciens törzzsel kezelt szövetekből. Ezek jelölése T3-2A, T4-2A, T4-3A, T4-3B és T4-3C. A T4-3C kivételével mindezeket a transzgenikus nö21 vényi vonalakat részletesen analizáltuk a következő fejezetekben leírtak szerint.
Összesen 4, feltehetően transzgenikus növényt nyertünk vissza pBI-SYN plazmidot hordozó A. tumefaciens törzzsel kezelt szövetekből. Ezek jelölése S8-1-2A, S8-1-2C, S12-3A és S8PUC-2A. Mindezeket a transzgenikus növényi vonalakat részletesen analizáltuk a következő fejezetekben leírtak szerint.
A T-DNS jelenlétét a feltehetőleg transzgenikus növényekben a transzgenikus növény magjának 50 /ug/ml kanamicint tartalmazó, agarral szilárdított, ásványisós táptalajba történő elvetésével bizonyítottuk. A kanamicin fenti koncentrációja megakadályozza a nem transzformált A.thaliana növények növekedését, viszont lehetővé teszi a pBI121, vagy pBI121-származék plazmádon hordozott NPTII gént tartalmazó növények normális növekedését. A T4-2A, RedD-3A és S8-1-2A transzgenikus növényekből származó magok hozzáférhetők az Amerikai Törzsgyűjteményben (American Type Culture Collection, Rockville, MD 20852).
Feltehetően homozigóta transzgenikus vonalak izolálása:
Homozigóta transzgenikus vonalak előállításának minimális feltétele az volt, hogy egy homozigóta növény minden leszármazottja kanamicin rezisztens legyen. Mivel a pBI121 plazmidból származó NPTII gén többszörös külső másolatainak (ectopic copies) jelenléte a genom különböző helyein eredményezhet hasonló fenotipust, ez a feltétel akkor a leghasználhatóbb, amikor az elsődleges transzformációs esemény a T• · ·
DNS egyetlen kromoszomális helyre való betűzését foglalja magában.
A feltehetően homozigóta vonalak azonosítása érdekében minden transzgenikus vonalból néhány kanamicin rezisztens TI növényt reproduktív izoláció során az érettségig termesztettünk. Ezután meghatároztuk a kanamicin rezisztencia gyakoriságát minden egyes vonalnál körülbelül 50 T2 mag mintából. Amennyiben a kérdéses növény minden T2 magja kanamicin rezisztensnek bizonyult, a vonalat ideiglenesen homozigótának tekintettük.
A phb gének transzgenikus növényekbe való beépülésének analízise:
Bizonyítandó a phb gének megfelelő integrációját az előállított különböző transzgenikus növényi vonalakba, a transzgenikus növények genomiális DNS-ét analizáltuk. A kontroll nem transzformált növényekből és a pBI-THIO, pBIRED valamint a pBI-SYN plazmidokkal transzformált T3 transzgenikus növényekből nagy molekulatömegű DNS-t izoláltunk. A DNS-eket Hindin restrikciós enzimmel emésztettük, a fragmentumokat agaróz-gélelektroforézissel elválasztottuk, és nylon szűrőkre vittük. A HindlII restrikciós enzim csak egyszer hasít a CaMV 35S promoter 5' -végén a pBI-THIO, pBI-RED és pBI-SYN plazmidokban (3., 4. és 5. ábra). Az alkalmazott phb gén specifikus próbákkal kimutatott fragmentumoknak tehát a Ti vektorok növényi genomiális DNS-sel alkotott elágazó fragmentumait, vagy az összefűzött Ti vektorok belső fragmentumait kell reprezentálniuk. A pUC-THIO, pUC-RED és pUC-SYN plazmidok inszertumait EcoRI és HindlII enzimekkel való kezeléssel vágtuk ki, agaróz-gélelektroforézissel tisztítottuk, DEAE membrán felhasználásával, és megjelöltük 32p_ dezoxiribonukleotidokkal való véletlenszerű feltöltéssel·. Az izotóppal megjelölt phb gén fragmentumok azután nylon szűrő próbára kerültek. A szűrőket hibridizáltuk, és azt követően szigorú körülmények között mostuk. Ennek a szűrő hibridizációnak az eredményeit mutatjuk be a 6. ábrán. A három phb gén egyikét sem lehet kimutatni a nem transzformált kontroll növényekben (6A., B és C ábra, a sáv) . A phbA gént kimutattuk négy transzgenikus vonalban, amelyeket a pBI-THIO plazmiddal végzett transzformálással· állítottunk elő (6A. ábra, b-e sávok) . A phbB gént kimutattuk hét transzgenikus vonalban, amelyeket a pBI-RED plazmiddal végzett transzformálással állítottunk elő (6B., f-1 sávok). Végül a phbC gént kimutattuk három transzgenikus vonalban, amelyeket a pBI-SYN plazmiddal végzett transzformálással állítottunk elő (6C., m-p sávok). Jóllehet az S12-3A növényi vonal rezisztens volt 50 /ug/ml kanamicinre, sugallva az NPTII gén beépülését, ugyanakkor phbC gént nem tudtunk kimutatni. Valószínűleg a Ti vektornak csak egy, az NPTII gént rejtő darabja épült be az S12-3A növényi vonal genomiális DNS-ébe, nem pedig a phbC gén.
A phb gének transzgenikus növényekben való kifejeződésének analízise:
Annak kimutatására, hogy az A. eutrophus phb gének kifejeződtek-e a különböző transzgenikus vonalakban, a pUCTHIO, pUC-RED és pUC-SYN plazmidokban jelen levő klónozott géneket használtuk próbaként a szűrő hibridizációs kísérleteknél. Az ossz RNS mennyiséget kivontuk a nem transzformált kontroll és a T3 transzgenikus növényekből. Az RNS-t elektroforézissel elválasztottuk formaldehid-tartalmú agaróz gélekben, és nylon szűrőre vittük a szokásos eljárás szerint. A pUC-THIO, pUC-RED és pUC-SYN plazmidok inszertumait EcoRI és Hindin enzimekkel való kezeléssel vágtuk ki, agaróz-gélelektroforézissel tisztítottuk, DEAE cellulóz membrán felhasználásával, és megjelöltük 32p_^ezoxj_r ibonukleotidokkal való véletlenszerű feltöltéssel. Az izotóppal megjelölt phb gének azután nylon szűrő próbára kerültek. Ezek a kísérletek azt mutatták, hogy a három phb próba egyike sem hibridizált nem transzformált kontroll növényi RNS-sel (7. ábra, e, j és r sávok). Ezzel ellentétben a pBITHIO plazmiddal transzformált transzgenikus növények tartalmaztak 1,6 kbp RNS-t, amely komplementer volt a 3-ketotioláz génnel (7A. ábra, a-d sávok). A pBI121-származék plazmidokon jelen levő CaMV 35S promoter és poli A toldalék szekvenciák körülbelül 300 bp-ral járulnak hozzá a phb fúziós génekből keletkező mRNS-ek végső hosszához. A 3-ketotioláz mRNS szintje a T4-3A növényi vonalban alacsony volt a többi növényi vonalhoz viszonyítva. Hasonlóan, a pBI-SYN plazmiddal
··· ··· · · • * · ··»· transzformált transzgenikus vonalból három tartalmazott a PHB szintetáz génnek megfelelő 2,1 kbp mRNS-t (7B. ábra, f, g és i sávok). Az S12-3A transzgenikus vonalban nem volt detektálható a phbC próbával hibridizáló mRNS (7B. ábra, h sáv) . Ez az eredmény összhangban van a Southern biot analízissel, ami nem mutat phbC gén beépülést az S12-3A vonal genomiális DNS-ébe (6C. ábra, m sáv). Végül a pBI-RED plazmáddal transzformált hét transzgenikus vonal tartalmazott 1,1 kbp mRNS-t, ami komplementer volt az acetoacetil-CoA reduktáz génnel (7C. ábra, k-q sávok). ily módon, a három phb gén mindegyikére legalább három független transzgenikus növényt kaptunk, amelyek kifejezték a várt méretű komplementer RNS-t.
Jóllehet az RNS jelenléte jelzi, hogy a gének átíródtak, de nem nyújt információt arról, hogy a transzláció megtörtént-e, illetve a transzlációs termék működőképes-e. Ezt vizsgáltuk a transzgenikus növények enzimaktivitásának meghatározásával.
A pBI-THIO plazmáddal transzformált transzgenikus növények 3-ketotioláz aktivitását vizsgáltuk a Senior és munkatársai által leírt meghatározás kis módosításával [ Senior, P.J. and Dawes, E.A., Biochem. J. 134, 225-238.(1973)] . T3 növények fagyasztott levélszöveteit homogenizáltuk Trispufferben, és mértük a tisztított, nyers kivonat 3-ketotioláz aktivitását. A mérési eredményeket az 1. táblázatban foglaltuk össze. A nem transzformált A. thaliana növényekből származó kivonatok nagyon alacsony 3-ketotioláz aktivitással *»·# rendelkeztek a meghatározás körülményei között. Ezzel szemben a transzgenikus növények mindegyike, amelyekbe átíródott a phbA gén, jelentősen megnövekedett szintű tioláz aktivitással rendelkezett. Ez azt mutatja, hogy a bakteriális tioláz gén működőképesen kifejezhető transzgenikus növényekben. Ugyanakkor azonban a különböző transzgenikus növényekben kimutatott specifikus 3-ketotioláz aktivitás szignifikánsan alacsonyabb volt az E. coli-bál készített kivonathoz viszonyítva, amelyben a pTZ18U-PHB plazmid magában foglalja a phbA gént.
1. táblázat: 3-ketotioláz aktivitás A. thaliana transzgenikus növényekben
minta 3-ketotioláz aktivitás3
DH5 alfa/PHBb 9,5
vad típusú A.thaliana 0,019
T4-3A transzgenikus 0,057
T3-2A transzgenikus 0,42
T4-2A transzgenikus 0,43
T4-3B transzgenikus 0,54
apercenként lebontott /umol acetoacetil-CoA/mg fehérje, az értékek 2-4 mérés átlagát jelentik ^E.coli DH5 alfa, tartalmazza a pTZ18U-PHB plazmidot, amely magában foglalja a PHB operont • ·4 • ······ • 4«
A pBI-RED plazmáddal transzformált transzgenikus növények acetoacetil-CoA reduktáz aktivitását vizsgáltuk a Senior és munkatársai által leírt meghatározás kis módosításával [Senior, P.J. and Dawes, E.A., Biochem. J. 134, 225238.(1973)] . T3 növényből származó leveleket homogenizáltunk kálium-foszfát pufferben, és a tisztított kivonatok acetoacetil-CoA reduktáz aktivitását mértük. Ezeket a mérési eredményeket az 2. táblázatban foglaltuk össze. A nem transzformált A. thaliana növényekből származó kivonatok nem rendelkeztek kimutatható szintű acetoacetil-CoA reduktáz aktivitással a meghatározás körülményei között. Ezzel szemben a transzgenikus növényeknek mindegyike, amelyekbe átíródott a phbB gén, magas acetoaceti-CoA reduktáz aktivitással rendelkezett. Ez azt mutatja, hogy a bakteriális acetoacetiCoA reduktáz gén működőképesen kifejezhető transzgenikus növényekben. Továbbá, a specifikus acetoaceti-CoA reduktáz aktivitás az analizált hét transzgenikus növényből hatnál szignifikánsan magasabb volt, mint az E. coli-ból készített kivonatban, amely a pTZ18U-PHB plazmidon magában foglalja a phbB géneket.
2. táblázat: Acetoacetil-CoA reduktáz aktivitás A. thaliana transzgenikus növényekben minta acetoacetil-CoA reduktáz aktivitás3
DH5 alfa/PHBb 1,4
vad típusú A.thaliana <0,03
RedB-2A transzgenikus 12,5
RedB-2B transzgenikus 16,2
RedB-2C transzgenikus 9,1
RedB-2D transzgenikus 8,8
RedB-2E transzgenikus 1,6
RedB-2G transzgenikus 5, 2
RedD-3A transzgenikus 2,3
apercenként redukált /umol NADPH/mg fehérje, az értékek 2-4 mérés átlagát jelentik ^E.coli DH5 alfa,tartalmazza a pTZ18U-PHB plazmidot, amely magában foglalja a PHB operont
A pBI-SYN plazmáddal való transzformálás útján nyert transzgenikus növényeket nem vizsgáltuk a PHB szintetáz aktivitás jelenlétére, mivel tioláz és reduktáz enzimek távollétében ennek az enzimnek a mérése technikai nehézségekbe ütközik.
Hibrid növények előállítása és analízise:
Mivel a magasabb rendű növények endogén, citoplazmatikus 3-ketotioláz aktivitással rendelkeznek, a PHB előállításához csak az acetoacetil-CoA reduktáz és a PHB szin-
tetáz enzimek bevitele szükséges. Ezt a két gént vittük be ugyanazon növénybe egy, az acetoacetil-CoA reduktázra nézve homozigótának ítélt transzgenikus vonal, és egy másik, a PHB szintetázra nézve homozigótának ítélt transzgenikus vonal keresztezésével. Ebből a keresztezésből származó hibrid magokat talajban termesztettük 2-3 hétig, majd vizsgáltuk a PHB meglétét.
Annak meghatározására, hogy a növényekben jelen levő acetoacetil-CoA reduktáz és PHB szintetáz gén elegendő-e a PHB előállításához és akkumulálásához, kloroformban oldható kivonatot készítettünk kontroll növényekből és a mindkét gént tartalmazó hibrid növényekből. A PHB jelenlétét a kivonatokban gázkromatográfiásán (GC) határoztuk meg. A növényi kivonatok GC analízisre való előkészítésénél két módszert alkalmaztunk. Ezek a módszerek kihasználják a PHB-nak mind a magas polimerizációs hajlamát (átlagosan 10θ dalton az A. eutrophus által termelt PHB esetén), mind a szelektív oldhatóságát klórozott szénhidrogénekben, például kloroformban. Vázlatosan, az #1 módszernél egész leveleket tettünk 1:1 arányú kloroform : víz elegybe, és oda-vissza rázattuk 16 órán át 65 °C-on. Mivel a molekulák nagyobbak, mint körülbelül 50.000 dalton, nem tudnak átjutni a növényi sejtfalon, csak a kis molekulatömegű, vízben vagy kloroformban oldható termékek extrahálódnak ki a levelekből ilyen körülmények között. Ezek után, a feltehetően nagy molekulatömegű PHB-t a megmaradt szövetet homogenizálva, a sejtfal szétroncsolásával vontuk ki a levelekből, és 1:1 arányú kloroform : víz .’·.···:.·· ···· · «· . *. ί*·. *·· · · •»_ · · · ···· eleggyel oldottuk, amelyben 12 órán át 65 °C-on tartottuk. A #2 módszernél egész levél mintákat extraháltunk egymást követően 2 órán át 55 °C-on, 50%-os etanolban, 2 órán át 55 °C-on, 100%-os metanolban, és 15 percig 20 °C-on, 100%-os dietil-éterben. Utána a visszamaradt szövetet homogenizáltuk, és kloroformban extraháltuk 4 óráig 100 °C-on. Mindkét módszernél az utolsó kloroformos kivonatban levő termékeket etanollal és sósavval átésztereztük, és gázkromatográfiásán vizsgáltuk.
Az átészterezett növényi kivonatok retenciós idejét az A.
eutrophus-ból tisztított, átészterezett kereskedelmi PHB (Sigma Chemical Co. , MO) értékeivel vetettük össze.
S8-1-2A és/vagy S8-1-2C transzgenikus növényeket kereszteztünk RedB-2A, -2C, -2D,
-2G és RedD-3A transzgenikus növényekkel. A keletkezett Fi magokat talajba vetettük el, és a 2-3 hetes növények levélmintáit vagy a teljes új haj tásokat begyűjtöttük, és analizáltuk PHB jelenlétére. A 8. ábrán egy példát mutatunk be az eredményekből, amelyeket az #1 módszernél leírtak szerinti tisztítást követően kaptunk.
Az acetoacetil-CoA reduktáz és a PHB szintetáz transzgéneket egyaránt tartalmazó, FI növények kivonatában jelen levő termék retenciós ideje azonos az etil-hidroxi-butirátéval, amint azt az átészterezett kereskedelmi PHB retenciós idejé vel összevetve meghatároztuk. Ez az új termék, amit kísérletesen etil-hidroxi-butirátként azonosítottunk, kizárólag olyan FI hibrid növényekben volt kimutatható, amelyek mind az acetoacetil-CoA reduktáz, mind a PHB szintetáz transz• ·· • · ·· ··
..., génekkel rendelkeztek. Hasonló termék nem volt kimutatható olyan transzgenikus növényekben, amelyek a fent említett géneknek csak egyikét tartalmazták, vagy a nem transzformált A. thaliana növényekben. Továbbá, ez a termék nem volt kimutatható olyan növényi szövetek kloroformos kivonatában sem, amelyeket előzőleg nem homogenizáltunk. Ez azt jelenti, hogy az etil-hidroxi-butirát egy nagy molekulatömegű prekurzorból származik.
Az új növényi termék — amelynek a retenciós ideje megegyezik az etil-hidroxi-butirátéval — azonosítását gázkromatográfia-tömegspektrometriás (GC-MS) méréssel végeztük. A GC-MS analízist MSU-NIH tömegspektrométer berendezéssel végeztük el. A 9A ábra egy hiteles PHB-ból készített etil-hidroxi-butirát tömegspektrumát mutatja. A 9B ábra az S8-1-2A és RedB-2C transzgenikus növények keresztezésével nyert hibrid FI növényből kivont, feltehetően etil-hidroxi-butirát tömegspektrumát mutatja. Az eredmények azt jelzik, hogy az új növényi termék, amelynek azonos a retenciós ideje az etil-hidroxi-butirátéval, ugyanolyan fragmentálódási képet is mutat, mint a hiteles etil-hidroxi-butirát minta. Az a tény, hogy ez az új termék csak azokban a levélszövet kivonatokban mutatható ki, amelyeket előzőleg homogenizáltunk, azt jelenti, hogy az etil-hidroxi-butirát egy körülbelül 50.000 dalton-nál (ez a növényi sejtfal pórusainak hozzávetőleges mérete) nagyobb molekulatömegű anyagból származik. Ezek az adatok együttesen arra utalnak, hogy az acetoacetil-CoA reduktáz és a PHB szintetáz géneket egyaránt tartalmazó transzgenikus növények poli(hidroxi-butirát)-ot akkumulálnak. A 3. táblázat az FI növények adatait mutatja, amelyeket GC-vel és GC-MS-sel egyaránt analizáltunk. A GC analízis alapján az FI hibridek leveleiben akkumulált PHB mennyisége a RedD-3A és S8-1-2C közötti hibridek leveleiben mért körülbelül 5/ug PHB/g friss tömeg, és a RedB-2C és S8-1-2A közötti hibridek leveleiben mért körülbelül 100/ug PHB/g friss tömeg értékek között mozog.
3. táblázat: FI hibrid növények PHB termelését bizonyító adatok összefoglalása
Szülői transzgenikus vonala
Szülői transzgenikus vonal3 * * * * 8
S8-1-2C S8-1-2A
RedD-3A GCb MSC TEMd(levél)
RedB-2A TEM (mag) GC TEM (levél, mag)
RedB-2G GC MS TEM (levél)
RedB-2C TEM (levél) GC MS
RedB-2D TEM (levél)
3 Transzgenikus vonalakat, amelyek magukban foglalják az acetoacetil-CoA reduktáz transzgént átporoztunk a PHB szintetáz transzgént magukban foglaló transzgenikus vonalakkal. A keletkezett FI hibridek PHB termelését vizsgáltuk.
b Gázkromatográfiásán bizonyított PHB termelés c Gázkromatográfia-tömegspektrometriás méréssel bizonyított PHB termelés
Elektron-fényes szemcsék kimutatása transzmissziós elektronmikroszkóppal, zárójelben a vizsgált növényi szövet.
e Minden üresen hagyott hely azt jelzi, hogy nem volt analízis
PHB szemcsék vizuális vizsgálata hibrid növényekben:
PHB-t akkumuláló baktériumok transzmissziós elektronmikroszkópos (TEM) vizsgálata felfedte elektron-fényes 0,20,5 /um átmérőjű szemcsék jelenlétét, amelyeket egy körülbelül 2 nm vastag membrán köpeny vesz körül [ Lundgren, D.G., Pfister, R.M. and Merrick, J.M., J. Gén. Microibiol. 34, 441-446.(1964)] . Annak megállapítására, hogy ehhez hasonló szemcsék kimutathatók-e hibrid növényekben, megvizsgáltunk olyan növényi szöveteket transzmissziós elektronmikroszkóppal, amelyek a GC-MS analízis alapján PHB termelés szempontjából pozitívnak mutatkoztak. S8-1-2A és/vagy S8-1-2C transzgenikus növényeket átporoztunk RedB-2A, -2C, -2D, -2G és RedD-3A transzgenikus növényekkel. A keletkezett FI hibrid magokat és az érett levélszövetet fixáltuk a transzmissziós elektronmikroszkópos vizsgálathoz. Vázlatosan, a szöveteket 3%-os glutáraldehid és 1%-os ozmium-tetroxid segítségével fixáltuk, és beágyaztuk epoxi gyantába. A 80-90 nm-es metszeteket 5%-os uranil-acetáttal és ólom-citráttal színeztük meg.
Az egyik kisérletsorozatnál az FI magokat talajba vetettük el, és a 2-3 hetes növények leveleit gyűjtöttük be TEM analízisre. A levelek sejtjeinek megfigyelése elektronfényes szemcsék halmazát fedte fel. Ezek a szemcsék minden olyan vizsgált Fi hibrid növényben kimutathatók voltak, amelyek PHB szintetáz gént és acetoacetil-CoA reduktáz gént hordozó transzgenikus növények keresztezésével keletkeztek. Példák a 10. ábrán láthatók. Hasonló szemcséket egyszer sem
mutattunk ki a szülői transzgenikus vonalban, amelyek vagy csak a PHB szintetáz génnel, vagy csak az acetoacetil-CoA reduktáz génnel rendelkeztek, és a nem transzformált A. thaliana-ban sem mutattuk ki. Az FI hibrid levélszöveteiben a mezofillum sejtekben mutattuk ki a szemcséket (10. ábra, a-e felvételek). Az elektron-fényes szemcsék halmazát leggyakrabban a sejtmagban mutattuk ki (10. ábra, a-c felvételek) , de hasonló struktúrákat találtunk az FI hibrid levél szövetének citoplazmájában (10. ábra, e felvétel) és vakuólumában is (10. ábra, d felvétel) . A sejtmagban és a citoplazmában az egyes szemcsék maximálisan a körülbelül 0,18 /um-es méretet érhették el. A vakuólumban a szemcsék általában nagyobbak voltak, elérve egy maximálisan körülbelül 0,55 /um-es átmérőt. Nagyobb nagyításnál úgy tűnik, hogy a sejtmag szemcséi elektron-sűrű anyaggal vannak körülvéve. Ezeknek a szemcséknek mind a mérete, mind a látható szerkezete nagyon hasonló a PHB-t akkumuláló baktériumokban található szemcsékhez.
A második kísérletsorozatnál az FI magokat vízben áztattuk 24 órán át, a maghéjból kibontottuk a csírát, és a szöveteket fixáltuk. A esirasziklevél (cotyledon) analízise a sejtmagban elektron-fényes szemcsék halmazának jelenlétét fedte fel (10. ábra, f felvétel). A szemcsék egy 0,18 /um-es maximális átmérőt érhettek el. Ezeket a szemcséket csak olyan FI hibrid csírák sejtmagjában tudtuk kimutatni, amelyek PHB szintetáz gént és acetoacetil-CoA reduktáz gént hordozó transzgenikus növények közötti keresztezéssel jöttek r·· j ·* · *. !·· ··· létre. Sem a szülői transzgenikus növényekben, amelyek a külső (ectopic) géneknek csak egyikét tartalmazták, sem a nem transzformált vad típusú A. thaliana-ban nem tudtunk szemcséket kimutatni. A 3. táblázat mutatja az FI hibridek TEM analízisének összegzését.
A fent leírt adatok pozitív összefüggést mutatnak a PHB GC-MS-sel történő analízise, és az elektronmikroszkópos szemcsekimutatás között. Az egyes szemcséket körülvevő elektron-sűrű anyag mérete, alakja és jelenléte nagyon hasonlít a PHB-t termelő baktériumokban levő szemcsékhez. Végül, mind a PHB kimutatását GC-MS-sel, mind az elektronfényes szemcsék jelenlétét csak azokban a hibrid növényekben figyelhetjük meg, amelyek az acetoacetil-CoA reduktáz transzgénnel, és a PHB szintetáz transzgénnel egyaránt rendelkeznek. Mindent összevetve, ezek az adatok azt jelzik, hogy az FI hibrid növényekben megfigyelhető szemcsék poli(hidroxi-butirát) lerakódások.
A KÍSÉRLETI EREDMÉNYEK ÖSSZEGZÉSE
Ezekben a vizsgálatokban azt mutattuk be, hogy a PHB szintéziséért felelős enzimeket kódoló bakteriális gének stabilan beépíthetők magasabb rendű növénybe oly módon, hogy a gének átíródnak, és az elvárt méretű transzkripciókat hozzák létre. Továbbá megmutattuk azt is, hogy a phbA és phbB gének esetében, ezen gének jelenléte a transzgenikus növényben a 3-ketotioláz vagy az acetoacetil-CoA reduktáz enzim szintjében kölcsönösen növekedést vált ki. így tehát .··. ···: .·· ι··· .
• · *. :··. ···. j · ···· ·· .«* ...» ···· nyilvánvaló, hogy ennek a két génnek a produktumai az átírás után működőképesek a növényben. A PHB szintetáz aktivitás közvetlen mérésének nehézségei miatt, a transzgenikus növényekben a PHB szintetáz aktivitás mértékét nem határoztuk meg.
Megmutattuk, hogy csak az acetoacetil-CoA reduktázt, és a PHB szintetázt egyaránt kifejezésre juttató FI transzgenikus növények kivonatai eredményeznek egy új, nagy molekulatömegű, kloroformban oldható olyan vegyületet, amelyet etanollal és sósavval átészterezve, etil-hidroxi-butirát keletkezik. Ezek az adatok azt jelzik, hogy az új vegyület poli(hidroxi-butirát). Ezen felül, ezek az adatok indirekt bizonyítékai egy működő PHB szintetáz keletkezésének transzgenikus növényekben. Ez fontos, mivel a PHB szintetáz aktivitás in vitro meghatározását nem tudtuk elvégezni. Továbbá, PHB keletkezése azt is jelzi közvetett módon, hogy D(-)hidroxi-butiril-CoA, a PHB szubsztrátja termelődik a növényekben. Ez a hidroxi-butiril-CoA természetes körülmények között nem található meg növényekben.
A transzmissziós elektronmikroszkópos vizsgálat további megalapozását adja annak a ténynek, hogy transzgenikus növényekben PHB termelődik. Az acetoacetil-CoA reduktázt, és a PHB szintetázt egyaránt kifejezésre juttató FI transzgenikus növények csírasziklevelének és érett leveleinek analízise olyan elektron-fényes szemcsék halmazának felfedéséhez vezetett, amelyek méretükben és szerkezetükben nagyon hasonlítanak a PHB-t termelő baktériumokban, mint például az A.
eutrophus-ban, talált szemcsékhez. Ezeket a szemcséket leggyakrabban az FI hibrid növények sejtmagjában találták, de a vakuolumban és a citoplazmában is kimutatták azokat.
E munkában leírt kísérletekben az A. eutrophus-ból származó phbA, phbB és phbC gének legvalószínűbben a citoplazmában fejeződnek ki, mivel nem adtunk specifikus aminosav szekvenciákat a fehérjékhez, hogy ezáltal vigyük be specifikusan valamelyik sejtalkotórészbe. Mivel a növényi sejt citoplazmája már tartalmaz 3-ketotiolázt, csak a hozzáadott acetoacetil-CoA reduktáz és PHB szintetáz kifejezésre juttatására volt szükség a PHB előállításához. Az a tény, hogy szemcsék találhatók a sejtmagban és a vakuólumokban, nem feltétlen mond ellent az enzim citoplazmában való kifejeződésének. Mivel a magmembránok a sejtosztódás során felbomlanak, majd újra összeépülnek , az eredetileg a citoplazmában képződött szemcsék az újólag felépülő membránon keresztül beléphetnek a sejtmagba. A másik lehetőség, hogy a PHB szemcsék hidrofób jellegüknél fogva képesek átjutni a sejtmagot vagy a vakuólumot körülvevő membránon.
Egy másik megközelítés szerint, a PHB termelődés egy specifikus növényi sejtalkotóra korlátozódhat, a PHB szintézisben résztvevő enzimeknek e sejtalkotóban való célzott kifejezésre juttatásával. Ebben az esetben, amennyiben a célzott sejtalkotó nem fejt ki 3-ketotioláz aktivitást, az acetoacetil-CoA reduktázon és PHB szintetázon kívül még egy exogén 3-ketotiolázra is szükség van a PHB termelődéséhez.
• · ···· · · ···· « • · · * • ·· · ··· · · • ·· · ····· ·· ·· ··· ·
A magasabb rendű növényekben történő PHB vagy PHA termelés távlati célja, hogy elvonjuk a szenet a fő tartaléktároló vegyületekből, mint lipidek, keményítő, vagy terpenoidok, és elvezessük a PHA szintézishez. Ez a cél szükségessé teszi a PHB szintézisben résztvevő enzimeknek a szövetspecifikus kifejezését csakúgy, mint a lehetőség szerinti sejtalkotó- specifikus kifejezését.
Olajtartalmú növényi magok megfelelő célpontjai a génsebészetnek. Lipidek acetil-CoA felhasználásával a plasztidban szintetizálódnak, PHB és más PHA szintézisében ugyanez a felhasznált prekurzor. Ezért olajtartalmú növényi magok génsebészeténél a PHA-t bioszintetizáló enzimeket szükséges bejuttatni a plasztidba. Olajtartalmú növények, amelyeket génsebészeti úton PHA termelésre lehetne bírni, például a repce, napraforgó és az olajpálma. A repcét és a napraforgót nagy mennyiségben termesztik Észak-Amerikában, és transzformálhatok idegen DNS-sel. Egy másik lehetőség, célzott PHA termeltetés az olajpálma gyümölcsének középső terméshéjában (mesocarp). Mivel a mesocarp-ban termelődő lipidek nem feltétlen szükségesek a fa vagy a csíranövény életben maradásához, a PHA termelés nem lenne káros hatású a pálmafákra.
Célzott PHA termeltetés lehetséges lenne cukorrépa gyökerében és burgonya gumójában is, olyan terményekben, amelyek nagy mennyiségű keményítőt akkumulálnak. Ezzel az elképzeléssel az a legnagyobb probléma, hogy mivel a keményítő és a PHA prekurzora nem azonos, lehetséges, hogy többszörös • ·
módosítás szükséges a szén metabolizmusában, mielőtt a szenet el tudnánk vonni a keményítőből a PHA céljára.
A PHA termelésnek talán a legközvetlenebb megközelítése a nagy mennyiségű terpenoidokat akkumuláló termények felhasználása lenne, mint a sárgarépa, amely karotinoidokat, vagy a mexikói batáta, amely szterolokat akkumulál. Mivel terpenoidok képződésénél ugyanazokra a prekurzorokra van szükség, mint PHA-nál (acetil-CoA és acetoacetil-CoA), a szén eltérítése a PHA termeléshez sokkal könnyebben elérhető lenne.
ANYAGOK ÉS MÓDSZEREK
DNS rekombinánsok összeállítása:
Plazmidokat rejtő E. coli DH5 alfa törzset tartottunk fenn kanamicinnel (50/ug/ml) vagy ampicillinnel (50/ug/ml) kiegészített LB táptalajon. A plazmid DNS nagy mennyiségben való kinyerését lúgos feltárással és polietilén-glikolos kicsapással végeztük Sambrook és munkatársai leírása szerint [ Sambrook,J., Fritsch, E.F. and Maniatis, T., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)] . A plazmid DNS-t restrikciós endonukleázzal hasítottuk a gyártó ajánlásai szerint (New England Biolabs, Mass; Promega Corp., WI; Boehringer Mannheim Biochemicals, IN; Stratagene, CA), szeparáltuk gélelektroforézissel és láthatóvá tettük etidium-bromidos festéssel (Sambrook és mtsai szerint; ld. fent). A DNS fragmentumokat DEAE cellulóz membránnal nyertük vissza az agaróz- gélből (NA-45 DEAE membráné, Schleicher and Schuell, Inc., NH) . Röviden, a • ·
DNS-t elektroforézissel egy NA-45 membrán csíkra vittük fel, a membránt mostuk 0,15 M NaCl, 0,1 mM EDTA és 20 mM Tris-HCl (pH=8) oldatában. A DNS-t ezek után eluáltuk 1,0 M NaCl, 0,1 mM EDTA és 20 mM Tris-HCl (pH=8) oldatában 65 °C-on, 1-2 órát. A DNS-t tovább tisztítottuk fenol-kloroformos extrakcióval és etanolos kicsapással. Néhány kísérletnél a DNS fragmentumok fapados 3' -végeit letompítottuk T4 DNS polimeráz használatával (Sambrook és mtsai szerint; ld. fent). A DNS fragmentumok összekötését a fapados vagy tompa végekkel 14 °C-on, 16 órán keresztül, 50 mM Tris-HCl (pH=7,6), 5 mM MgC12, 5% (w/v) polietilén-glikol 8000, 0, 5 mM ATP és 5 mM ditiotreitol tartalmú pufferben végeztük (Sambrook és mtsai szerint ld. fent). A ligációs reakcióból transzformáltunk egy frakciót E. coli-ba a Hanahan által leírt [Hanahan, D., J. Mól. Bioi. 166, 557-580.(1983)] a rubidium-kloridos eljárás szerint. A transzformált baktériumot 50/ug/ml kanamicin vagy 50/ug/ml ampicillin tartalmú, agarral szilárdított LB táptalajra szélesztettük. A rekombináns plazmidot tartalmazó baktérium telepeket 32P-vel jelölt DNS próbákkal végzett hibridizációval azonosítottuk (Sambrook és mtsai szerint; ld. fent) azzal az eltéréssel, hogy nylon membránokat (Hybond-N, Amersham, IL) használtunk nitrocellulóz membránok helyett. Az izotóppal jelölt DNS próbák elkészítését és a hibridizációt a következő fejezetben írjuk le. Kis léptékű plazmid DNS preparációt végeztünk lúgos feltárással (Sambrook és mtsai szerint; ld. fent).
• ·
Oligonukleotidokat szintetizáltunk egy Applied Biosystems 380A DNS szintetizátoron a gyártó utasításai szerint (Applied Biosystems, CA) . Az oligonukleotidokat, az 5' -végeken hozzájuk kapcsolt dimetoxi-tritil csoportokkal ellátva, C^g oszloppal felszerelt Varian 5000 HPLC (Varian Instrument Group, TX) készüléken tisztítottuk meg. Az oligonukleotidokat 0,1 M trietilamin oldattal oldottuk, és injektáltuk a C]_g oszlopra, amelyet előzőleg 12% acetonitril és 88% 0,1 M trietil-amin-acetát(pH=7) (A oldat) elegyével ekvilibráltunk. A HPLC-s mérés programjának menete a következő volt: áramlási sebesség 0,9 ml/min; maximális nyomás 200 psi; idő 0 perc, 88% A oldat/12% B oldat(acetonitril) ; idő 3 perc, 88% A oldat/12% B oldat; idő 21 perc, 65% A oldat/35% B oldat; idő 25 perc, 65% A oldat/35% B oldat. A megtisztított oligonukleotidokat megszabadítottuk a tritil csoportoktól 80%-os ecetsavban történő 10 perces kezeléssel, és nitrogén atmoszférában megszárítottuk. Az oligonukleotidokat feloldottuk 10 mM Tris-HCl (pH=7,5) és 0,1 mM EDTA keverékében, háromszor extraháltuk azonos mennyiségű etil-acetáttal, majd kicsaptuk etanollal.
Polimeráz láncreakciót (PCR) végeztünk egy Perkin-Elmer Cetus DNS thermal cycler (Perkin-Elmer, CT) felhasználásával. A reakcióelegy 100 pmol oligonukleotidot, #1 és #2 PCR prímért (5. ábra), 200 ng EcoRI restrikciós enzimmel linearizáit pTZ18U-PHB plazmidot, 125 /uM dNTP-t, 50 mM KC1ot, 10 mM Tris-HCl puffért (pH=8,3), 2-, 5 mM MgC12~ot, 0,01% zselatint és 2,5 egység Tag polimerázt (Perkin-Elmer, CT) tartalmazott. A DNS thermal cycler programja a következő volt: 3 perc 94 °C-on; 40 ciklus a következő sorrendben: 1 perc 94 °C-on, 3 perc 55 °C-on, 3 perc 72 °C-on és végül 7 perc 72 °C-on. A PCR terméket elválasztottuk agaróz gélelektroforézissel és kimostuk DEAE cellulóz membránon.
Transzgenikus növények előállítása:
A transzgenikus növények előállításához használt Ti pazmid vektorokokat először Agrobacterium tumefaciens C58pGV3850 törzsbe juttattuk be elektroporációval [ Zabrisky, P. et al. , EMBO 2^ 2143-2150.(1983); Sambrook, J., Fritsch, E.F. and Maniatis, T., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)] . Rschew fajba tartozó Arabidopsis thaliana növényt aszeptikus körülmények között termesztettük függőlegesen elhelyezett Petricsészében, ásványi elemeket, 0,8% agart (Difco) és 1% szacharózt tartalmazó lemezen, Estelié és munkatársai leírása alapján [Esteile, M.A. and Somerville, C.R., Mól. Gén. Génét. 206, 200-206.(1987); Schiefelbein, J.W. and
Somerville, C.R., Plánt Cell 2, 235-243.(1990)]. A 10-12 napos növények gyökereit kivágtuk, és Valvekens és munkatársai leírása alapján használtuk a transzformáláshoz [ Valvekens, D. , Van Montagu, M. and Van Lijsebettens, M.,
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 5536-5540. (1988)] .
T0 és TI transzgenikus növényekből származó magokat neveltünk ásványi elemeket, 0,8% agart (Difco) 1% szacharózt és 50 /ug/ml kanamicint tartalmazó táptalajon. 10-14 napos növekedés után a kanamicin rezisztens transzgenikus növények (Kmr)levelei zöldek voltak, míg a nem transzformált, kanamicinre érzékeny növények (Kms) levelei sárgák. Ebben az állapotban a Kmr növényeket kiemelhettük az agar lemezekből, és átültettük trágyázott termőföldbe.
A genomiális DNS extrakciója és kivágása restrikciós endonukleázzal:
Vad típusú és transzgenikus növényeket termesztettünk talajban 2-3 hétig, és körülbelül 5 g levélszövetet gyűjtöttünk, és lefagyasztottuk folyékony nitrogénben. Nagy molekulatömegű DNS-t vontunk ki a fagyasztott növényi szövetekből Rogers és munkatársa leírása szerint [Rogers, S.C. and Bendich, A.J., Plánt Molecular Biology Manual A6, 1-10. (1988)] . A restrikciós endonukleázos hasítást Hindin enzimmel a gyártó (New England Biolabs Inc., Mass) által ajánlott körülmények között végeztük el.
Agaróz-gélelektroforézis és hibridizációs eljárás:
A DNS analízisét agaróz-gélelektroforézissel és nylon membránra (Hybond-N, Amersham, II) való felvitellel, kidolgozott eljárás szerint végeztük el [Southern, E.M., J. Mól. Bioi. 38, 503-517.(1975) és Sambrook,J., Fritsch, E.F. and Maniatis, T., Molecular Cloning; A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)] . Próbaként használandó, specifikusan klónozott DNS fragmentumokat vágtunk ki a vektorból megfelelő restrikciós endonukleázokkal, az inszertumokat a vektortól agaróz-gélelektroforézissel, és elektroelúcióval, DEAE cellulóz membrán felhasználásával választottuk el. A próbákat 82ρ_^θζοχίΓibonukleotidokkal való vélet45 lenszerű feltöltéssel jelöltük meg, hexamereket használva, Feinberg és Vogelstein módszere szerint [ Feinberg, A.P. and Vogelstein, B., Anal. Biochem. 136, 6-13.(1983)] . Nylon szűrőket hibridizáltunk az izotóppal jelölt próbákkal, és filmen exponáltuk Poirier és munkatársa leírása szerint [ Poirier, Y. and Jolicoeur, P., J.Virol. 63, 2088-2098.
(1989)] .
RNS izolálás és elektroforézis:
Ossz RNS-t vontunk ki fagyasztott levélmintákból Puissant és munkatársa leírása szerint [Puissant, C. and Houdebine, L.M., BioTechniques 148-149. (1990)] . Az izolált RNS-t formaldehid-tartalmú agaróz gélben választottuk el elektroforézissel, és nylon membránra vittük (HybondN, Amersham II), Sambrook és munkatársa leírása szerint (ld. előzőekben). A nylon szűrőket izotóppal jelölt próbákkal hibridizáltuk, amint azt már az előző fejezetben leírtuk.
A 3-ketotioláz aktivitás meghatározása:
A fagyasztott levélmintákból 1 grammot homogenizáltunk 2 ml jéghideg pufferben, ami 100 mM Tris-HCl (pH=8,0), 40 mM MgC12 és 5 mM β-merkapto-etanol összetételű volt. A homogenizátumot centrifugálással tisztítottuk 2 percig 10.000 g mellett, és a felülúszót egy friss csőbe tettük. A kivonat fehérjetartalmát Bradford féle meghatározással mértük meg, BioRad protein assay kit (BioRad Laboratories, CA) felhasználásával. Meghatározásonként 3-30 /ug növényi fehérje extraktumot használtunk. Baktériumokból· is vontunk ki fehérjéket. Ez esetben a szaporodás stacioner fázisában levő bak• « tóriumokat centrifugáltuk, egyszer mostuk jéghideg, a meghatározáshoz használatos pufferrel, és felvettük ugyanazon puffer 200 /ul-ében. A baktérium szuszpenziót ultrahanggal feltártuk, a homogenizátumot centrifugálással tisztítottuk, és a kivonat fehérjetartalmát mértük a Bradford féle meghatározás szerint. Meghatározásonként 0,2-1/ug bakteriális fehérje extraktumot használtunk. A 3-ketotioláz enzim aktivitását a különböző extraktumokban Senior és munkatársa eljárása szerint [Senior, P.J. and Dawes, E.A., Biochem. J. 134, 225-238.(1973)] határoztuk meg.
Az acetoacetil-CoA reduktáz aktivitás meghatározása:
A fagyasztott levélmintákból 1 grammot homogenizáltunk 2 ml jéghideg pufferben, ami 100 mM KH2PO4 (pH=5,5), 0,02 mM MgC12 és 4,0 mM β-merkapto-etanol összetételű volt. A homogenizátumot centrifugálással tisztítottuk 2 percig 10.000 g mellett, és a felülúszót egy friss csőbe tettük. A kivonat fehérjetartalmát a Bradford féle meghatározással mértük meg, BioRad protein assay kit felhasználásával. Meghatározásonként 0,8-10 /ug növényi fehérje extraktumot használtunk. Baktérium extraktumokat is készítettünk, lényegében az előző fejezetben leírtak szerint, a meghatározáshoz használatos pufferben.
Az acetoacetil-CoA reduktáz enzim aktivitását
Senior és munkatársa eljárása szerint [Senior, P.J. and
Dawes, E.A., Biochem. J. 134, 225-238.(1973)] határoztuk meg.
Gázkromatográfiás és tömegspektrometriás analízis:
Két módszert használtunk növényi kivonatok készítésére a GC analízishez. Az #1 módszernél 0,005-0,05 g friss, vagy fagyasztott növényi anyagot (levél vagy teljes hajtás) extraháltunk 1-2 ml, kloroform : víz, 1:1 arányú elegyében 65 °C-on, 16 órán át, állandó keverés mellett. Ezután a növényi anyagot vízben homogenizáltuk, és visszaoldottuk kloroform : víz, 1:1 arányú elegyében 65 °C-on, 16 órán át, állandó keverés mellett. A kloroformos fázist egy új csőbe vittük, és újra extraháltuk azonos mennyiségű vízzel. A kloroformos fázis végső mennyiségét 0,5 ml-re beállítva, átésztereztük etanollal és sósavval, amint azt alább leírjuk.
A #2 módszernél 0,005-0,15 g fagyasztott, vagy friss növényi anyagot extraháltunk egymást követően 50%-os etanolban 55 °C-on 2 óráig, 100%-os metanolban 55 °C-on 2 óráig, és 100%os dietil-éterben 15 percig szobahőmérsékleten. A maradék szövetet utána vízben homogenizáltuk, szárítottuk, és extraháltuk 0,5 ml kloroformban 4 órán át 100 °C-on.
Az #1 és 2# módszerrel kapott végső kloroformos extraktumot (0,5 ml) átésztereztük 0,2 ml koncentrált sósav oldat és 1,7 ml 100%-os etanol segítségével, 2 órán keresztül 100 °C-on tartva. Ezután szobahőfokra hűtöttük a reakcióelegyet, a kloroformos fázist kétszer extraháltuk 2 ml 0,9%-os NaCl (w/v) oldattal, és a végső szerves fázist 100 /ul-re pároltuk be. Standardként kereskedelmi PHB-t oldottunk fel meleg kloroformban, és 1 mg-ot átésztereztünk a fentiek szerint.
·· ···· ·· • · · · • · · · * • · · » · •··· ·4 ··
Az etil-észtereket tartalmazó kloroformos fázist egy GC fiolába helyeztük, hogy 1/ul-t injektáljunk egy programozható, automatikus mintavevővel, és egy SP-2330 üvegkapilláris oszloppal ellátott Hewlett Packard 5890 II szériába tartozó GC készülékbe (Supelco, PA) . A közelítőleg lineáris sebesség 20 cm/s volt, héliumot alkalmazva vivőgázként. Az adagolónyílás hőmérsékletét 220 °C-ra, és ennek megfelelően a lángionizációs detektor kapuját is 220 °C-ra állítottuk. A következő hőmérsékleti profilt alkalmaztuk: 4 perc 65 °C, ezt követte egy hőmérséklet-emelés percenként 20 °C-kal egészen 195 °C-ig, 3,5 perc 195 °C-on; a futás utáni hőmérséklet-csökkenési ütem percenként 20 °C-kal, 65 °C-ra.
A fontosnak ítélt csúcsok azonosítását GC-tömegspektrometriás meghatározással végeztük el. Elektron ütköztetéses tömegspektrometriás adatokat nyertünk JEOL JMS-AX505H tömegspektrométer, és Hewlett Packard 5890 GC párosításával. A következő paramétereket alkalmaztuk: forrás hőmérséklet,
200 °C; az aktuális ionizáció, 100 /uA; feszültség növekedés, 3 keV. Egy J & W Scientific Co. DB-225 oszlopot helyeztünk közvetlenül a tömegspektrométer forrásába, és hordozóként héliumot alkalmaztunk. A hasíték nélküli injektort és a vivővonalat egyaránt 260 °C-on tartottuk. A GC-nél ugyanazt a hőmérséklet profilt alkalmzatuk (lásd előző bekezdés). Transzmissziós elektronmikroszkópia:
A növényi szöveteket glutáraldehid 3%-os 0,1 M foszfát pufferes (pH=7,2) oldatában fixáltuk 1,5-2 órán át, szoba·«· • · * ···· • ♦ · · · · hőmérsékleten. A mintákat 4-szer mostuk 0,1 M foszfát pufferben (pH=7,2), és ezután OSO4 1%-os foszfát pufferes oldatában fixáltuk 2 órán át, szobahőmérsékleten. A szöveteket ezután lépcsőzetes etanolos kezeléssel vizmentesítettük, és beágyaztuk Spurrs epoxi gyantába. Réz rostélyra helyezve 80-90 nm-es metszeteket vágtunk, és színeztük 5%-os uranil-acetáttal 30-45 percig, ezt 3-4 perces Reynolds féle ólom-citrátos festés követte. A metszeteket JEOL 100 CXII transzmissziós elektronmikroszkóppal, 80 kV mellett vizsgáltuk.
Egyéb növények:
Bár az itt leírt találmány speciális példája az Arabidopsis thaliana növényt és az Alcaligenes eutrophus génjeit foglalja magában, a találmány általánosan használható. A poli(hidroxi-butirát) és/vagy poli(hidroxi-alkanoát) növényekben történő előállítására vonatkozó igénypontok nem korlátozódnak az Arabidopsis thaliana-ra, és nem kötődnek specifikusan az Alcaligenes eutrophus génjeihez. Az alább vázolt igénypontok egy általános eljárást írnak le poli(hidroxi-alkanoát) növényekben történő előállítására, idegen DNS anyagnak a ,növényi sejtbe történő bejuttatása révén. Ilyen növények, beleértve az előzőekben tárgyalt növényeket, például a sárgarépa, napraforgó, dohány, paradicsom és burgonya.
A különböző növényi vonalakból származó magokat az
American Type Culture Collection-nál (12301 Parklawn Drive,
Rockville, Maryland 20852) a Budapesti Egyezmény értelmében · · · • » • · ··· ··· ·· • · · · · · ···« ···· ·· ·· ··· · letétbe helyeztük. Ezek a vonalak az acetoacetil-CoA reduktáz gént tartalmazó RedD-3A (ATCC 75044); a PHB szintetáz gént tartalmazó S8-1-2A (ATCC 75043) és a 3-ketotioláz gént tartalmazó T4-2A (ATCC 75042).
A fenti specifikus leírás csak tanulmányunk szemléltetésére szolgál, és szándékunk az, hogy a jelen találmány oltalmi körét csak az alábbiakban következő igénypontok korlátozzák.
1. sz. szekvenciavázlat jellemzői
A szekvencia hossza:
A szekvencia típusa:
A szekvencia száltipusa:
Topológia:
A molekula típusa:
Eredeti forrás (származás):
4980 bázis pár prekurzor peptideket kódoló nukleinsav kettős szálú lineáris genomiális DNS
Alcaligenes eutrophus

Claims (18)

  1. Szabadalmi igénypontok
    1. Transzgenikus növényi anyag, azzal jellemezve, hogy egy poli(hidroxi-alkanoát), előnyösen poli(hidroxi-butirát) termelődéséhez vezető, idegen DNS-t tartalmaz.
  2. 2. Az 1. igénypont szerinti növényi anyag, azzal jellemezve, hogy a poli (hidroxi-butirát) szintéziséhez vezető enzimeket kódoló DNS és RNS szekvenciák az 1. számú szekvenciavázlaton bemutatott szekvenciák.
  3. 3. Transzgenikus növényi anyag, azzal jellemezve, hogy 3-ketotioláz aktivitást kifejtő peptidet kódoló idegen DNS-t tartalmaz, amelyben a DNS egy, az 1. számú szekvenciavázlaton bemutatott szekvencia 2696 és 3877 helyzetei közötti nyílt leolvasási keret.
  4. 4. Transzgenikus növényi anyag, azzal jellemezve, hogy acetoacetil-CoA reduktáz aktivitást kódoló idegen DNS-t tartalmaz, amelyben a DNS egy, az 1. számú szekvenciavázlaton bemutatott szekvencia 3952 és 4692 helyzetei közötti nyílt leolvasási keret.
  5. 5. Transzgenikus növényi anyag, azzal jellemezve, hogy PHA szintetáz aktivitást ,kifejtő polipeptidet kódoló idegen DNS-t tartalmaz.
  6. 6. Transzgenikus növényi anyag, azzal jellemezve, hogy hidroxialkil-CoA-ból poli(hidroxi-alkanoát) szintéziséhez vezető, egy vagy több enzimet kódoló idegen DNS-t tartalmaz, • · ·♦*· ·· • · · · • · *·· • * · · « ···· ·· 99 amelyben a DNS egy, az 1. számú szekvenciavázlaton bemutatott szekvencia 842 és 2611 helyzetei közötti nyílt leolvasási keret.
  7. 7. Transzgenikus növényi anyag, azzal jellemezve, hogy hidroxialkil-CoA szintézisét katalizáló, egy vagy több enzimet kódoló idegen DNS-t tartalmaz.
  8. 8. Transzgenikus növényi anyag, azzal jellemezve, hogy egy vagy több enzimet kódoló idegen DNS-t tartalmaz, amelyek az idegen DNS által kódolt termékekből 3-hidroxibutiril-CoA termelődéséhez vezetnek.
  9. 9. Az 1., 2., 3., 4., 5., 6., 7. vagy 8. igénypont szerinti növényi anyag, azzal jellemezve, hogy mag, vagy a mag szaporulata .
  10. 10. Eljárás poli(hidroxi-alkanoát) szintéziséhez vezető polipeptideket kódoló idegen DNS növénybe történő bevitelére, azzal jellemezve, hogy két olyan növényt párosítunk ivaros megtermékenyítéssel, amelyek nem termelnek poli(hidroxi-alkanoát)-ot, viszont mindkettő tartalmaz a hidroxialkil-CoA-nak poli (hidroxi-alkanoát) szintetázzal történő polimerizációjához vezető reakciókhoz egy, vagy több enzimet kódoló idegen DNS-t, és ezáltal olyan növényt hozunk létre, amely tartalmazza a poli(hidroxi-alkanoát) , előnyösen a poli (hidroxi-butirát) kódját.
  11. 11. A 10. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a poli(hidroxi-alkanoát) a növényi sejtekben szemcsékben található.
    .··. ···: .·· • * ··* • · · · · ···· ·· ·» ···» · • · ··· 4 · • ···· *·· 9
  12. 12. Az ATCC 75042 számú, letétbe helyezett magban található gén-szegmens, amely a 3-ketotiolázt kódoló DNS-t tartal mázzá.
  13. 13. Növény, azzal jellemezve, hogy a 12. igénypont szerinti
  14. 14. Az ATCC 75044 számú, letétbe helyezett magban található gén-szegmens, amely az acetoacetil-CoA reduktázt kódoló
    DNS-t tartalmazza.
  15. 15. Növény, azzal jellemezve, hogy a 14. igénypont szerinti
  16. 16. Az ATCC 75043 számú, letétbe helyezett magban található gén-szegmens, amely a PHB szintetázt kódoló DNS-t tartal mázzá.
  17. 17. Növény, azzal jellemezve, hogy a 16. igénypont szerinti
  18. 18. Transzgenikus növényi anyag, azzal vagy több enzimet kódoló idegen DNS-t jellemezve, hogy egy, tartalmaz, amelyek az idegen DNS által kódolt
    3-hidroxibutiril-CoA termelődéséhez vezetnek.
HU9400145A 1991-07-19 1992-07-13 Transgenic plants producing polyhydroxyalkanoates HUT66825A (en)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US73224391A 1991-07-19 1991-07-19

Publications (2)

Publication Number Publication Date
HU9400145D0 HU9400145D0 (en) 1994-05-30
HUT66825A true HUT66825A (en) 1995-01-30

Family

ID=24942760

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
HU9400145A HUT66825A (en) 1991-07-19 1992-07-13 Transgenic plants producing polyhydroxyalkanoates

Country Status (22)

Country Link
US (1) US5650555A (hu)
EP (1) EP0595896B1 (hu)
JP (1) JP3696233B2 (hu)
AT (1) ATE295891T1 (hu)
AU (1) AU671953B2 (hu)
BE (1) BE1006851A5 (hu)
BR (1) BR9206297A (hu)
CA (1) CA2113412C (hu)
CZ (1) CZ10894A3 (hu)
DE (1) DE69233512T2 (hu)
ES (1) ES2046142B1 (hu)
FI (1) FI120353B (hu)
FR (1) FR2679735A1 (hu)
HU (1) HUT66825A (hu)
IT (1) IT1255348B (hu)
MX (1) MX9204245A (hu)
NL (1) NL195045C (hu)
NZ (1) NZ243626A (hu)
PL (1) PL170467B1 (hu)
PT (1) PT100705B (hu)
SK (1) SK6494A3 (hu)
WO (1) WO1993002187A1 (hu)

Families Citing this family (60)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5245023A (en) 1987-06-29 1993-09-14 Massachusetts Institute Of Technology Method for producing novel polyester biopolymers
GB9108756D0 (en) 1991-04-24 1991-06-12 Ici Plc Production of polyalkanoate in plants
US5610041A (en) * 1991-07-19 1997-03-11 Board Of Trustees Operating Michigan State University Processes for producing polyhydroxybutyrate and related polyhydroxyalkanoates in the plastids of higher plants
AU671953B2 (en) * 1991-07-19 1996-09-19 Michigan State University Transgenic plants producing polyhydroxyalkanoates
CA2127807A1 (en) * 1992-11-20 1994-06-09 John Maliyakal Transgenic cotton plants producing heterologous bioplastic
US5942597A (en) * 1995-08-21 1999-08-24 The Procter & Gamble Company Solvent extraction of polyhydroxyalkanoates from biomass
US6083729A (en) * 1995-10-26 2000-07-04 Metabolix, Inc. Methods for isolating polyhydroxyalkanoates from plants
US5849894A (en) * 1995-11-29 1998-12-15 Monsanto Company Rhodospirillum rubrum poly-β-hydroxyalkanoate synthase
US6600029B1 (en) 1995-12-19 2003-07-29 Regents Of The University Of Minnesota Metabolic engineering of polyhydroxyalkanoate monomer synthases
US5821299A (en) * 1996-02-16 1998-10-13 The Proctor & Gamble Company Solvent extraction of polyhydroxy-alkanoates from biomass facilitated by the use of marginal nonsolvent
JP3062459B2 (ja) * 1996-08-14 2000-07-10 理化学研究所 ポリエステル重合酵素遺伝子及びポリエステルの製造方法
AU8473198A (en) * 1997-06-30 1999-01-19 Curators Of The University Of Missouri, The Use of dna encoding plastid pyruvate dehydrogenase and branched chain oxoa cid dehydrogenase components to enhance polyhydroxyalkanoate biosynthesis in p lants
DE69838768T2 (de) 1997-09-19 2008-10-30 Metabolix, Inc., Cambridge Biologische Systeme zur Herstellung von Polyhydroxyalkanoat-Polymeren die 4-Hy droxysäure enthalten
WO1999035278A1 (en) * 1998-01-05 1999-07-15 Monsanto Company Biosynthesis of medium chain length polyhydroxyalkanoates
JP2002500027A (ja) 1998-01-07 2002-01-08 メタボリックス，インコーポレイテッド 動物栄養組成物
US6586658B1 (en) 1998-03-06 2003-07-01 Metabolix, Inc. Modification of fatty acid metabolism in plants
US6143952A (en) * 1998-03-31 2000-11-07 Regents Of The University Of Minnesota Modified pseudomonas oleovorans phaC1 nucleic acids encoding bispecific polyhydroxyalkanoate polymerase
US6103956A (en) * 1998-03-31 2000-08-15 Regents Of The University Of Minnesota Polyhydroxyalkanoate synthesis in plants
AU757682B2 (en) 1998-04-08 2003-02-27 Metabolix, Inc. Methods for separation and purification of biopolymers
JP2000189170A (ja) * 1998-05-08 2000-07-11 Daicel Chem Ind Ltd 光学活性４―ハロ―３―ヒドロキシ酪酸エステルの製造方法
WO2000006747A2 (en) * 1998-07-30 2000-02-10 Metabolix, Inc. Enzymes for biopolymer production
DE19834608A1 (de) 1998-07-31 2000-02-03 Basf Ag Kristallmodifikation der Liponsäure
AU752513B2 (en) 1998-08-04 2002-09-19 Cj Cheiljedang Corporation Polyhydroxyalkanoate production from polyols
US6160199A (en) * 1998-12-21 2000-12-12 The Procter & Gamble Company Absorbent articles comprising biodegradable PHA copolymers
US6077931A (en) * 1998-12-21 2000-06-20 The Procter & Gamble Company Biodegradable PHA copolymers
US6174990B1 (en) 1998-12-21 2001-01-16 The Procter & Gamble Company Films comprising biodegradable PHA copolymers
AU3516100A (en) * 1999-03-05 2000-09-21 Monsanto Technology Llc Multigene expression vectors for the biosynthesis of products via multienzyme biological pathways
ES2243235T3 (es) 1999-03-15 2005-12-01 Universite Laval Metodo para la produccion de polihidroxialcanoatos en organismos recombinantes.
US6451564B1 (en) 1999-07-02 2002-09-17 Massachusetts Institute Of Technology Methods for producing L-isoleucine
US6475734B1 (en) * 1999-09-29 2002-11-05 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Polyhydroxyalkanoate synthase genes
AU2002211615A1 (en) 2000-10-20 2002-05-06 University Of Kentucky Research Foundation Genetic insulator for preventing influence by another gene promoter
US6806401B2 (en) * 2000-12-27 2004-10-19 Pioneer Hi-Bred International, Inc. OAR polynucleotides, polypeptides and their use in PHA production in plants
US6822142B2 (en) 2001-01-05 2004-11-23 Monsanto Company Transgenic plants containing altered levels of steroid compounds
AU2002251830A1 (en) * 2001-01-26 2002-08-06 Colorado State University Research Foundation Analysis of gene expression and biological function using optical imaging
DE10254165A1 (de) 2002-11-20 2004-06-03 Icon Genetics Ag Verfahren zur Kontrolle eines zellulären Prozesses in einem multizellulären Organismus
WO2005099493A2 (en) 2004-04-14 2005-10-27 Philip Morris Products S.A. Reduction of phenolic compound precursors in tobacco
TW200613560A (en) * 2004-06-29 2006-05-01 Procter & Gamble Solvent extraction of polyhydroxyalkanoates from biomass
US20060057691A1 (en) * 2004-09-15 2006-03-16 Karunakaran Narasimhan Process for the extraction of polyhydroxyalkanoates from biomass
AU2006295515A1 (en) * 2005-09-27 2007-04-05 Polybatics Limited Polymer particles and uses thereof
WO2008115840A2 (en) 2007-03-16 2008-09-25 Genomatica, Inc. Compositions and methods for the biosynthesis of 1,4-butanediol and its precursors
US7947483B2 (en) 2007-08-10 2011-05-24 Genomatica, Inc. Methods and organisms for the growth-coupled production of 1,4-butanediol
WO2009145840A2 (en) * 2008-04-04 2009-12-03 Massachusetts Institute Of Technology Cellular production of hydroxyvalerates from levulinate
WO2010030711A2 (en) 2008-09-10 2010-03-18 Genomatica, Inc. Microorganisms for the production of 1,4-butanediol
MY149457A (en) * 2008-12-29 2013-08-30 Eyal Res Integrated methods for processing palm fruit bunches
CN102459138A (zh) * 2009-06-04 2012-05-16 基因组股份公司 分离发酵液成分的方法
MY187676A (en) 2009-06-04 2021-10-08 Genomatica Inc Microorganisms for the production of 1,4-butanediol and related methods
CA2777459A1 (en) * 2009-10-13 2011-04-21 Genomatica, Inc. Microorganisms for the production of 1,4-butanediol, 4-hydroxybutanal, 4-hydroxybutyryl-coa, putrescine and related compounds, and methods related thereto
WO2011066076A1 (en) 2009-11-25 2011-06-03 Genomatica, Inc. Microorganisms and methods for the coproduction of 1,4-butanediol and gamma-butyrolactone
CN102781901B (zh) 2010-02-11 2016-08-03 梅塔玻利克斯公司 用于从经遗传修饰的聚羟基链烷酸酯生物质制备单体组分的方法
US8048661B2 (en) 2010-02-23 2011-11-01 Genomatica, Inc. Microbial organisms comprising exogenous nucleic acids encoding reductive TCA pathway enzymes
US8445244B2 (en) 2010-02-23 2013-05-21 Genomatica, Inc. Methods for increasing product yields
CN103228658A (zh) * 2010-10-08 2013-07-31 卡迪拉保健有限公司 用于通过酶促转化制备西他列汀的中间体的方法
TW201410865A (zh) 2012-06-04 2014-03-16 Genomatica Inc 製造４－羥基丁酸酯、１，４－丁二醇及相關化合物之微生物及方法
US10351665B2 (en) 2016-10-18 2019-07-16 Meredian Bioplastics, Inc. Crystal nucleating agents for polyhydroxyalkanoates
US11584110B2 (en) 2020-07-30 2023-02-21 Pepsico, Inc. Multi-layered packaging films
KR20230095078A (ko) 2020-09-24 2023-06-28 메레디언, 인크. 생분해성 용기 마개 및 이를 위한 수지
EP4217431A2 (en) 2020-09-24 2023-08-02 Meredian, Inc. Biodegradable labels and resin therefor
WO2022066885A1 (en) 2020-09-24 2022-03-31 Meredian Bioplastics, Inc. Pre-forms for making biodegradable containers and resin therefor
EP4217171A1 (en) 2020-09-24 2023-08-02 Meredian, Inc. Biodegradable containers and resin therefor
EP4405156A1 (en) 2021-09-22 2024-07-31 Société des Produits Nestlé S.A. Method for manufacturing a pha container

Family Cites Families (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5229279A (en) * 1987-06-29 1993-07-20 Massachusetts Institute Of Technology Method for producing novel polyester biopolymers
US5250430A (en) * 1987-06-29 1993-10-05 Massachusetts Institute Of Technology Polyhydroxyalkanoate polymerase
US5245023A (en) * 1987-06-29 1993-09-14 Massachusetts Institute Of Technology Method for producing novel polyester biopolymers
AT397771B (de) * 1988-07-25 1994-06-27 Tyrolia Freizeitgeraete Vorrichtung zur montage von skibindungen
ES2131489T3 (es) * 1989-07-10 2003-05-16 Massachusetts Inst Technology Una planta o una celula vegetal recombinante capaz de producir polihidroxibutirato u otro polihidroxialcanoato.
GB9108756D0 (en) * 1991-04-24 1991-06-12 Ici Plc Production of polyalkanoate in plants
GB9115245D0 (en) * 1991-07-16 1991-08-28 Ici Plc Production of polyalkanoate
AU671953B2 (en) * 1991-07-19 1996-09-19 Michigan State University Transgenic plants producing polyhydroxyalkanoates
GB9223332D0 (en) * 1992-11-06 1992-12-23 Ici Plc Production of polyhydroxyalkanoate in plants
GB9306490D0 (en) * 1993-03-29 1993-05-19 Zeneca Ltd Plant gene specifying acetyl,coenzyme a carboxylase and transformed plants containing same

Also Published As

Publication number Publication date
FI940242A (fi) 1994-03-11
ITMI921750A0 (it) 1992-07-17
FR2679735A1 (fr) 1993-02-05
JP3696233B2 (ja) 2005-09-14
ES2046142A1 (es) 1994-01-16
ES2046142B1 (es) 1994-10-01
SK6494A3 (en) 1994-10-05
AU671953B2 (en) 1996-09-19
PT100705A (pt) 1993-10-29
HU9400145D0 (en) 1994-05-30
ITMI921750A1 (it) 1994-01-17
EP0595896A4 (en) 1994-08-24
PL170467B1 (pl) 1996-12-31
CA2113412A1 (en) 1993-02-04
BR9206297A (pt) 1995-10-17
ATE295891T1 (de) 2005-06-15
CA2113412C (en) 2000-01-25
DE69233512T2 (de) 2005-10-13
CZ10894A3 (en) 1994-12-15
NL195045C (nl) 2003-06-27
PL295350A1 (en) 1993-04-05
IT1255348B (it) 1995-10-31
EP0595896B1 (en) 2005-05-18
BE1006851A5 (fr) 1995-01-10
FR2679735B1 (hu) 1995-05-05
AU2323892A (en) 1993-02-23
NL9201288A (nl) 1993-02-16
MX9204245A (es) 1993-02-01
EP0595896A1 (en) 1994-05-11
NZ243626A (en) 1995-03-28
FI120353B (fi) 2009-09-30
DE69233512D1 (de) 2005-06-23
WO1993002187A1 (en) 1993-02-04
JPH06509233A (ja) 1994-10-20
FI940242A0 (fi) 1994-01-18
US5650555A (en) 1997-07-22
PT100705B (pt) 1999-06-30

Similar Documents

Publication Publication Date Title
HUT66825A (en) Transgenic plants producing polyhydroxyalkanoates
US5602321A (en) Transgenic cotton plants producing heterologous polyhydroxy(e) butyrate bioplastic
EP0719342B1 (en) Processes for producing polyhydroxybutyrate and related polyhydroxyalkanoates in the plastids of higher plants
Saruul et al. Production of a biodegradable plastic polymer, poly‐β‐hydroxybutyrate, in transgenic alfalfa
WO1994012014A9 (en) Transgenic cotton plants producing heterologous bioplastic
Poirier et al. Perspectives on the production of polyhydroxyalkanoates in plants
JPH11506323A (ja) 酵母ｓｌｃ遺伝子を用いての植物脂質及び種子油の変更
EP1076095B1 (en) Methods for transformation of plants, transformed plants and processes for preparation of polyesters
US5859342A (en) Antisense nucleotide sequences affecting fatty acid catabolism in plants
MXPA00008674A (es) Modificacion de metabolismo de acidos grasos en plantas.
US7214859B2 (en) Brassica pyruvate dehydrogenase kinase gene
CN109912703B (zh) 蛋白质OsARE1在调控植物衰老中的应用
JP4005745B2 (ja) ポリエステルの製造方法
Rose et al. Function of the HYDROXYCINNAMOYL-CoA: SHIKIMATE HYDROXYCINNAMOYL TRANSFERASE is evolutionarily conserved in embryophytes
Ye et al. Construction of plant seed-specific expression vectors pSCB and pSCAB and the obtainment of transgenic Brassica napus H165 expressing poly-3-hydroxybutyrate synthetic genes
Kriegshauser et al. HYDROXYCINNAMOYL-CoA: SHIKIMATE HYDROXYCINNAMOYL TRANSFERASE is evolutionarily conserved in embryophytes
PL198868B1 (pl) Sposób wytwarzania lnu o podwyższonym poziomie polihydroksymaślanu
CN101544988A (zh) 控制水稻纤维素合成的基因bc1l4作为水稻遗传改良的应用

Legal Events

Date Code Title Description
DFA9 Temporary protection cancelled due to abandonment