FR2679735A1 - Plantes transgeniques produisant des polyhydroxyalcanoates. - Google Patents

Abstract

La présente invention concerne des plants transgéniques qui produisent de l'acide poly-bêta-D-hydroxybutyrique (PHB) et des polyhydroxyalcanoates apparentés (PHA). La production du PHB est réalisée par transformation génétique des végétaux à l'aide de gènes modifiés provenant de microorganismes. Les gènes codent les enzymes nécessaires à la synthèse du PHB à partir de l'acétyl-CoA ou des métabolites apparentés.Le PHB est un polymère très utile qui est biodégradable.

Description

La présente invention concerne l'introduction et l'ex- pression d'un certain matériau d'information génétique, c est-à-dire 1'ADN, qui comprend des gènes codant pour des matières protéiniques et/ou des gènes qui régulent leur production ou autrement agissant sur cette dernière, dans des cellules de végétaux supérieurs, et la régénération de plantes fertiles à partir de cellules ayant subi une transformation génétique. L'objet de cette intervention génétique est de transférer à des végétaux supérieurs, à partir d'organismes microbiens, la capacité de synthétiser des produits polymères composés de polyesters linéaires d'hydroxyacides.

Cette classe de composés est appelée généralement les polyhydroxyalcanoates. L'exemple particulier présenté ici porte sur la production du polyhydroxybutyrate (PH3).

De nombreuses espèces ae bactéries accumulent des granulés de polyesters composés de groupements hydroxyacyle monomères servants de réserve ae carbone. La présence, le métabolisme, le rôle métabolique et les utilisations industrielles des polyhydroxyalcanoates bactériens ont fait récemment l'objet d'une étude (Anderson, A. et Dawes, E.A.,
Microbiol. Rev. 54:450-472 (1990)). Le composé de cette classe le plus fréquemment observé est le poly(D(-)-3hydroxybutyrate). Cependant, certaines espèces accumulent des copolymères de différents hydroxyalcanoates comme le 3hydroxypentanoate (Wallen, L.L. et RchwedCer, W.K., Environ.

Sci. Technol. 8:576-579 (1974)). On trouve au moins 11 3hydroxyacides à courte chaîne en tant que composants de polymères provenant de sédiments marins. Des études portant sur la production de polyhydroxyalcanoates chez Alcaligenes eutrophus ont montré que, quand on cultive les bactéries dans un milieu ne contenant que du glucose en tant que source de carbone, seul le PHB est accumulé. Cependant, quand les sources de carbone mises à disposition sont simultanément le glucose et l'acide propionique, les bactéries accumulent des copolymères statistiques de 3-hydroxypentanoate et de 3-hydroxybutyrate (Holmes, P.A., Phys.

Technol. 16:32-36 (1985) ; Holmes, P.A., Wright, L.F. et
Collins, S.H. brevets européens 0 069 497, janvier 1983, et 0 052 459, décembre 1985). En outre, quand A. eutrophus est mis à disposition avec différentes autres sources de carbone, on a une production de polyesters contenant les monomères 4-hydroxybutyrate et 5-hydroxyvalérate (Tableau I dans
Anderson, A. et Dawes, E.A., Microbiol. Rev. 54:450-472 (1990)). Ainsi, il s'avère que la composition du polymère est dans une certaine mesure régulée par la disponibilité d'autres substrats pour les enzymes qui ont catalysé la synthèse du polymère à partir des monomères.

Le PHB s'accumule dans les cellules bactériennes sous forme de granules ayant un diamètre d'environ 0,24 à 0,5 um.

Sur la base de mesures de la masse moléculaire des PHB monomères, il a été estimé que chaque granule contient au moins 1000 chaînes polymères. Il a été proposé une hypothèse selon laquelle les granules possèdent un enrobage membranaire constitué de lipides et de protéines représentant respectivement environ 0,5 et 2 % de la masse du granule (Anderson,
A. et Dawes, E.A., Microbiol. Rev. 54:450-472 (1990)). L'activite de l'enzyme PHB-synthase serait vraisemblablement associee à cette membrane. L'état du PHB à l'intérieur du granule est grevée d'une forte imprécision. Des preuves récentes donnent à penser que le polymère se trouvant dans les granules y est sous forme amorphe. On ne sait pas ce qui assure la régulation de la grosseur des granules de PHB dans un organisme.

Dans la plupart des organismes, le PHB est synthétisé à partir de l'acétyl-coenzyme A (acétyl-CoA) par une séquence de trois réactions catalysées par la 3-cétothiolase (acétyl
CoA-acétyltransférase ; EC 2.3.1.9), par l'acétoacétyl-CoAréductase (hydroxybutyryl-CoA-déhydrogénase ; EC 1.1.1.36) et la poly(3-hydroxybutyrate)synthase. Le processus réactionnel est présenté sur la Figure 1. Dans Rhodospirillum rubrum, le PHB est synthétisé par conversion du L(+)-3hydroxybutyryl-CoA en crotonyl-CoA puis en D(-)-3-hydroxybutyryl-CoA. La 3-cétothiolase a été purifiée à partir de différentes bactéries synthétisant le PHB, et elle a été étudiée dans plusieurs espèces de végétaux supérieurs. On pense que le rôle de l'enzyme dans les végétaux supérieurs réside dans la production de l'acétoacétyl-CoA, destinée à la production du mévalonate, ainsi que dans la dégradation des acides gras.L'acétoacétyl-CoA-réductase a été détectée dans un certain nombre de bactéries synthétisant le PHB.

Certaines espèces, parmi lesquelles A. eutrophus, se révèlent posséder deux isoenzymes, qui se distinguent l'une de l'autre pour ce qui est des spécificités de substrat et des exigences au niveau des co-facteurs. La NADH-réductase d'A.

eutrophus est active avec (C4 à C10)-D(-)- et L(+)-3hydroxyacyl-CoAs, tandis que la NADPH-réductase est active seulement avec (C4 et C5)-D(-)-3-hydroxyacyl-CoAs. Une enzyme de ce type n'a jamais été mentionnée pour les végétaux supérieurs. L'activité de PHB-synthase a été détectée dans les bactéries accumulant le PHB, tant sous forme d'une enzyme soluble que d'une activité liée à un granule, selon les conditions de croissance. Ces deux formes de l'enzyme ont été partiellement purifiées mais n'ont pas encore été purifiées jusqu'à homogénéité, en raison de leur instabilité.La PHB-synthase de A. eutrophus est spécifique des énantiomères D(-) et, quand elle est étudiée avec la 3hydroxyacyl-CoAs, s'est révélée active seulement avec les substrats en C4 et C5, ce qui est compatible avec l'observa- tion selon laquelle seuls sont incorporés dans le polymère par cet organisme les motifs monomères 3-hydroxyacide en C4 et C5.Le mécanisme d'action de la PHB-synthase reste obscur.

On pense que le rôle de transfert de chaîne joué par la synthase doit d'une certaine manière réguler la masse moléculaire du polymère produit, qui est caractéristique d'un organisme donné. L'activité de PHB-synthase n'a jamais été mentionnée dans un quelconque végétal.

De nombreux groupes de chercheurs ont, d'une manière indépendante, cloné et exprimé dans E. coli, les gènes mis en jeu dans la biosynthèse du PHB par A. eutrophus (Slater,
S.C. et al., J. Bacteriol. 170:4431-4436 (1988) ; Schubert,
P. et al., J. Bacteriol. 170:5837-5847 (1988)). Des souches recombinantes de E. coli, portant un fragment de 5,2 kbp provenant de A. eutrophus, ont pu accumuler d'importantes quantités de PHB sous forme de granules intracellulaires. La séquence nucléotidique du fragment 5,2 kbp a elle aussi, d'une manière indépendante, été déterminée par deux groupes (Janes, B.B. et al., In Dawes, E.A. (ed) Novel Biodegradable
Microbial Polymers, Kluwer Academic Publishers, pp. 175-190 (1990) ; Peoples, O.P. et Sinskey, A.J., J. Biol. Chem.

264:15293-15297 (1989) ; Peoples, O.P. et Sinskey, A.J., J.

Biol. Chem. 264:15298-15303 (1989)). Une analyse des séquences déduites d'acides aminés des cadres de lecture ouverts, en liaison avec une preuve se fondant sur des études de complémentation génétique, a révélé que le fragment 5,2 kbp contenait trois gènes étroitement liés codant les trois enzymes nécessaires à la production du PHB. Un brevet concernant l'utilisation des gènes clonés pour conduire à une surproduction des enzymes de biosynthèse dans les bactéries, a été déposé (Peoples, O.P. et Sinskey, A.J., brevet international WO 89/00202, janvier 1989).

Certaines espèces de bactéries peuvent excréter des enzymes et dégrader le PHB et les polyhydroxyalcanoates apparentés (étude générale dans Anderson, A. et Dawes, E.A.,
Microbiol. Rev. 54:450-472 (1990)). Du fait de la prédominance de ces espèces bactériennes dans de nombreux environnements naturels, le PHB est rapidement dégradé dans le sol et les boues activées. Ainsi, le PHB et les polyhydroxyalcanoates apparentés sont intéressants en tant que sources renouvelables de composés thermoplastiques biodégradables.

C'est en 1982 qu'a commencé la production industrielle du
PHB à partir de cultures de bactéries à l'échelle industrielle. Le PHB obtenu de cette manière a été commercialisé par ICI plc sous la marque Biopol. Cependant, en raison des coûts associés à la culture et à la récolte de grandes quantités de bactéries, le PHB est beaucoup plus cher à produire que les matériaux polymères tels que l'amidon, qui s'accumulent en de grandes quantités dans de nombreuses espèces de végétaux supérieurs. Il peut donc se révéler avantageux de mettre au point, par génie génétique, des lignées de végétaux supérieurs qui accumulent le PHB.

L'invention sera mieux comprise en regard de la description ci-après et des dessins annexés, qui représentent des exemples de réalisation de l'invention, dessins dans lesquels
La Figure 1 présente le processus réactionnel biochimique de la production du polyhydroxybutyrate (PHB). Dans A.

eutrophus, le PHB est produit par l'action successive de trois enzymes : la 3-cétothiolase, qui convertit l'acétyl
CoA en acétoacétyl-CoA ; 1'acétoacétyl-CoA-réductase, qui convertit l'acétoacétyl-CoA en D(-)-3-hydroxybutyryl-CoA la PHB-synthase, qui convertit la D(-)-3-hydroxybutyryl-CoA en polyhydroxybutyrate. Chez les végétaux et les animaux, l'acétoacétyl-CoA est un précurseur lors de la production du mévalonate.

La Figure 2 présente la séquence nucléotidique de l'opéron de PHB à partir de A. eutrophus. La séquence a été obtenue par Janes, B.B., Hollar, J. et Dennis, D., In Dawes,
E.A. (ed) Novel Biodegradable Microbial Polymers, Kluwer
Academic Publishers, pp. 175-190 (1990). Le cadre de lecture ouvert provenant des nucléotides 842 à 2611 code la PHBsynthase (gène phbC) (acides aminés S1 à S589). Le cadre de lecture ouvert provenant des nucléotides 2696 à 3877 code l'enzyme 3-cétothiolase (gène phb A) (acides aminés T1 à
T393). Le cadre de lecture ouvert provenant des nucléotides 3952 à 4692 code l'enzyme acétoacétyl-CoA-réductase (gène phb B) (acides aminés R1 à R246). Sont soulignées les séquences correspondant aux enzyme de restriction DdeI,
BstBI, PstI, SacI et TthlllI.Ces enzymes de restriction ont été utilisées lors du sous-clonage des gènes phb.

La Figure 3 présente un résumé schématique des étapes mises en jeu pour la construction des plasmides pUC-THIO et pBI-THIO. Ce dernier plasmide a pour but de placer le gène de la 3-cétothiolase provenant de A. eutrophus sous contrôle transcriptionnel du promoteur CaMV 35S de façon à pouvoir être transcrit dans les végétaux supérieurs. Le diagramme supérieur représente 1' opéron du PHB de A. eutrophus, avec l'emplacement approximatif des cadres de lecture ouverts codant la PHB-synthase, la 3-cétothiolase et l'acétoacétyl
CoA-réductase. Les flèches horizontales indiquent la direction de la transcription.Le diagramme inférieur présente les principaux composants des plasmides dérivant de pBIl2l
NPT II, gène de la néomycine-phosphotransférase II, codant la résistance à la kanamycine ; CaMV 35S, promoteur 35S du virus de la mosaïque du chou-fleur ; poly A, séquence de polyadénylation; RB, séquence marginale de droite de l'ADNt;
LB, séquence marginale de gauche de l'ADNt. Le diagramme inférieur n'est pas représenté à l'échelle. Les abréviations utilisées pour les sites des enzymes de restriction sont les suivantes : D, DdeI ; P, PstI ; B, BstBI ; T, TthlllI ; BH,
BamHI ; S, SacI ; H, HindîlI.

La Figure 4 présente un résumé schématique des étapes mises en jeu pour la construction des plasmides pUC-SYN et pBI-SYN. Ce dernier plasmide a pour but de placer le gène de la PHB-synthase provenant de A. eutrophus sous contrôle transcriptionnel du promoteur 35S du CaMV, de façon qu'il puisse être transcrit dans les végétaux supérieurs. Les diagrammes et abréviations sont décrits sur la Figure 3.

La Figure 5 présente un résumé schématique des étapes mises en jeu pour la construction des plasmides pUC-RED et pBI-RED. Ce dernier plasmide a pour objet la mise en place du gène de l'acétoacétyl-CoA-réductase provenant de A.

eutrophus sous le contrôle transcriptionnel du promoteur 35S du CaMV de façon qu'il puisse être exprimé dans les végétaux supérieurs. Le diagramme supérieur et le diagramme inférieur, ainsi que les abréviations, sont décrits sur la
Figure 3. Le diagramme central est un agrandissement de la zone du gène de 1'acétoacétyl-CoA-réductase. La localisation et la séquence des amorceurs PCR N" 1 et 2 sont indiquées.

Le dernier nucléotide en l'extrémité 3' de l'amorceur PCR N" 1 correspond au nucléotide 3952 de la Figure 2 et est le premier nucléotide du code de déclenchement du gène de la réductase.Le dernier nucléotide à l'extrémité 3' de l'amorce
PCR N" 2 est complémentaire du nucléotide 4708 de la Figure 2. Les sites d'enzymes de restriction supplémentaires BamHI et KpnI créés par les amorceurs PCR sont indiqués.

La Figure 6 présente l'analyse Southern blot de plants de A. thaliana témoins non transformés et transgéniques. On a digéré avec l'enzyme de restriction HindîlI 1 pg d'ADN génomique provenant de A. thaliana race Rschew non transformé et de plants transgéniques, les fragments ont été séparés par électrophorèse sur gel d'agarose et transférés sur des membranes de Nylon. Les filtres ont été hybridés en fragments d'ADN marqués au 32P provenant des gènes (A) phbA, (B) phbB et (C) phbC.Les ADN génomiques analysés sont les suivants : type sauvage A. thaliana race Rschew (bande a) et
T4-3A transgénique (bande b), T3-2A (bande c), T4-2A (bande d), T4-3B (bande e), RedB-2G (bande f), RedB-2B (bande g),
RedB-2E (bande h), RedB-2C (bande i), RedB-3A (bande j),
RedB-2A (bande k), RedB-2D (bande 1), S12-3A (bande m), S8- 1-2C (bande n), S8-1-2A (bande o) et S8PUC-2B (bande p). Les chiffres situés à gauche correspondent aux longueurs, en kilo(paires de base).

La Figure 7 présente l'analyse Northern blot de plants de A. thaliana, témoins non transformés et transgéniques.

L'ARN total provenant de A. thaliana race Rschew type sauvage (10 pg) et de plants transgéniques (20 pg) a été dissocié par électrophorèse dans des gels d'agarose contenant du formaldéhyde et transféré sur des membranes de Nylon. Les filtres ont été hybridés en fragments d'ADN marqués au 32P à partir des gènes (A) phbA, (B) phbC et (C) phbB. Les ARN analysés proviennent des plants suivants : T3-2A (bande a),
T4-2A (bande b), T4-3B (bande c), T4-3A (bande d), A. thaliana type sauvage (bandes e, j et r), S8PUC-2B (bande f),
S8-1-2C (bande g), S12-3A (bande h), S8-1-2A (bande i),
RedB-2D (bande k), RedB-2E (bande 1), RedB-2G (bande m),
RedB-2A (bande n), RedB-2B (bande o), RedB-2C (bande p) et
RedB-3A (bande q). Les chiffres correspondent aux longueurs, en kilo(paires de base).

La Figure 8 présente le chromatogramme en phase gazeuse (CPG) du PHB purifié et des extraits de végétaux. On a comparé au chromatogramme du PHB transesterifié du commerce (A) les chromatogrammes CPG des extraits transesterifiés, dans le chloroforme, de feuilles de A. thaliana race Rschew type sauvage non transformé (B) et de l'hybride F1 entre les plants transgéniques S8-1-2A et RedB-2C (C). Les flèches indiquent l'emplacement du pic hydroxybutyrate d'éthyle.

La Figure 9 présente l'analyse par chromatographie en phase gazeuse-spectrométrie de masse de l'hydroxybutyrate d'éthyle préparé à partir d'un PHB étalon et d'un PHB provenant d'extraits de végétaux. (A) : spectre de masse du PHB transesterifié du commerce ; (B) : spectre de masse du pic
CPG provenant de l'extrait foliaire dans le chloroforme de l'hybride F1 entreS8-1-2A et RedB-2C, avec un temps de rétention identique à celui de l'hydroxybutyrate d'éthyle (tel que présenté sur la Figure 8C).

La Figure 10 présente des microphotographies obtenues au microscope électronique par transmission (MET) de feuilles et de semences de plants de A. thaliana transgéniques
PHB-positifs. Les plants transgéniques S8-1-2A et S8-1-2C ont subi une pollinisation croisée avec des plants transgéniques RedB-2D ou RedB-2A. Les semences F1 obtenues ont été ensemencées dans le sol, et des échantillons de feuilles provenant de plants de 2-3 semaines ont été analysés par MET (microphotographies a à e). Certaines semences F1 ont aussi été immergées dans de l'eau pendant 24 heures, l'embryon a été extrait par dissection à partir du tégument, et les cotylédons ont été analysés par MET (microphotographie f).

(a) Deux cellules adjacentes du mésophylle foliaire provenant de l'hybride F1 RedB-2D X S8-1-2A, présentant des agglomérations de granules transparents aux électrons dans le noyau.

(b) Avec un grossissement plus important, noyau e la cellule en haut à droite de la microphotographie a.

(c) Noyau d'une cellule d'un mésophylle foliaire provenant de l'hybride F1 RedB-2D X S8-1-2A présentant une agglomération de granules.

(d) Cellules du mésophylle foliaire de l'hybride F1
RedB-2D X S8-1-2A présentant des granules transparents aux électrons dans le noyau (N) et la vacuole (V).

(e) Cellules de mésophylle foliaire provenant d'un hybride F1 RedB-2D X S8-1-2A présentant des granules transparents aux électrons dans le cytoplasme.

(f) Cellules de cotylédon provenant d'une semence de l'hybride F1 RedB-2D X S8-1-2C présentant des granules dans le noyau. Les flèches indiquent des agglomérations de granules transparents aux électrons. Une barre = 1 pm pour les microphotographies a, b, c, d et f. Une barre = 0,25 pm pour la microphotographie e.

La présente invention concerne un matériel végétal transgénique contenant un ADN étranger conduisant à la production d'un polyhydroxyalcanoate.

La présente invention concerne aussi un matériel végétal transgénique contenant un ADN étranger qui code un peptide présentant une activité de 3-cétothiolase.

La présente invention concerne aussi un matériel végétal transgénique contenant un ADN étranger codant un peptide qui présente une activité d'acétoacétyl-CoA-réductase.

La présente invention concerne aussi un matériel végétal transgénique contenant un ADN étranger codant un peptide qui présente une activité de PHB-synthase extérieure.

La présente invention concerne un procédé destiné à introduire un ADN bactérien codant les protéines nécessaires à la synthèse d'un polyhydroxyalcanoate dans un végétal, qui
qui comprend l'appariement, par fertilisation sexuée, de deux végétaux ne produisant pas de PHB, chacun contenant un ADN étranger codant une ou plusieurs enzymes différentes, selon un processus conduisant à une polymérisation de l'hydroxyalkyl
CoA par la polyhydroxyalcanoate-synthase, de façon à produire un végétal codant le polyhydroxyalcanoate.

Ainsi, la présente invention met à disposition un procédé de production de végétaux supérieurs à modification génétique, qui produisent et accumulent du PHB ou des poly hydroxyalcanoates apparentés. Dans une.forme de réalisation, on obtient des végétaux produisant du PHB par introduction stable de gènes bactériens qui codent les enzymes acétoacétyl-CoA-réductase (hydroxybutyryl-CoA-déhydrogénase) et poly(3-hydroxybutyrate)-synthase dans les végétaux par transfor nation par l ifterriaired' -un plasmide Ti. Comme les gènes bactériens ne sont normalement pas transcrits dans les cellules végétales, les gènes sont modifiés de façon à se trouver sous contrôle transcriptionnel d'une séquence d'ADN (c'est-à-dire un "promoteur), qui induit une transcription dans les cellules végétales.Les gènes sont de même modifiés par addition d'une séquence appropriée d'ADN à la région non codante 3' des gènes de façon que les produits de transcription obtenus dans les cellules végétales soient convenablement polyadénylés.

Dans une forme de réalisation de l'invention, des végétaux produisant du PHB sont obtenus par des croisements sexués entre deux lignées parentales ne produisant pas de
PHB. Ce croisement est réalisé par une pollinisation croisée d'une lignée végétale transgénique homozygote pour des copies ectopiques d'un gène de PHB-synthase modifiée, avec une lignée végétale transgénique homozygote pour des copies ectopiques d'un gène d'acétoacétyl-CoA-réductase modifiée.

Dans ce contexte, l'expression "gènes ectopiques" désigne des gènes qui ne sont normalement pas présents dans un organisme, mais qui ont été intégrés d'une manière stable dans le génome par transformation génétique. L'expression "homozygote pour des copies ectopiques" indique que, dans un organisme diploïde, les deux chromosomes homologues possèdent le gene ectopique intégré au meme endroit à l'intérieur du chromosome.

L'invention sera mieux comprise en regard de la description ci-après.

Avant de poursuivre la description de l'invention, il est utile de donner la définition de certains termes ou expressions qui seront utilisés ci-après.

On entend par "transformation"
le processus de modification du génotype d'un organisme récepteur par introduction stable d'ADN par un moyen quelconque.

Un végétal transgénique est un végétal contenant des séquences d'ADN qui ne sont normalement pas présentes dans l'espèce mais ont été introduites par une transformation.

On appellera "transcription" la formation d'une chaîne d'ARN selon l'information génétique contenue dans l'ADN.

On appellera "traduction" le processus par lequel l'information génétique dans une molécule d'ARNm décide de l'ordre des différents acides aminés pendant la synthèse des protéines.

Un promoteur est un fragment d'ADN qui provoque une transcription du matériel génétique. Dans le cadre de l'invention, on parlera de promoteur pour désigner les fragments d'ADN permettant une transcription dans des cellules végétales. Le promoteur 35S du CaMV est un fragment d'ADN provenant du virus de la mosaïque du chou-fleur, qui conduit à des taux relativement élevés de transcription dans de nombreux tissus différents de nombreuses espèces de végétaux supérieurs (Benfey, P.N. et Chua, N.H., Science 250:959-966 (1990)).

Un site d'addition poly-A est une séquence polynucléotidique qui a pour conséquence que certaines enzymes clivent l'ARNm sur un site particulier et ajoutent une séquence de residus d'acide adénylique a l'extrémité 3' de l'ARNm.

phbC, phbA, phbB sont les symboles des genes attribués aux gènes de A. eutrophus respectivement pour la PHBsynthase, la 3-cétothiolase et 1'acétoacétyl-CoA-réductase (Peoples, O.P. et Sinskey, A.J., J. Biol. Chem., 264:1529815303 (1989)).

Pour décrire la descendance des végétaux transgéniques, il est d'usage d'adopter une convention qui indique combien de générations d'auto-pollinisation se sont écoulées depuis l'introduction de l'ADN. Dans le cadre de l'invention, le transformant original sera appelé "génération TO". La descendance résultant d'une auto-pollinisation de cette géné ration est appelée la génération TI, etc.

Dans le cas d'une pollinisation croisée entre deux végétaux parentaux distincts, on appellera génération F1 la descendance résultant de la pollinisation croisée initiale.

Bien que les expériences discutées ici et ci-après concernent l'espèce végétale Arabidopsis thaliana (L.) Heynhold, le processus décrit s'applique d'une maniere générale à tout végétal supérieur pour lequel on dispose d'une méthode de transformation. De même, bien que le processus décrit ici concerne l'utilisation de gènes provenant de A.

eutrophus, le procédé décrit s'applique d'une manière générale à l'utilisation de gènes provenant de tout organisme à même de synthétiser le PHB. Il est de même manifeste que, bien que le processus décrit concerne la production du PHB, le mode opératoire puisse d'une manière générale s'appliquer à la production de tout polyhydroxyalcanoate normalement produit dans des microorganismes par l'activité de la polyhydroxyalcanoate (PHA)-synthase (qui comprend la PHBsynthase), et pour lequel le substrat hydroxyalkyl-CoA approprié est obtenu dans le végétal particulier.

DETAILS EXPERIMENTAUX
Configuration des expériences
La production du PHB dans la descendance de végétaux transformés exige la mise en oeuvre de la séquence d'étapes suivante : (1) la construction d'une série de plasmides bac tériens contenant des fusions de promoteurs, (2) le transfert de ces plasmides dans Agrobacterium tumefaciens, (3) l'utilisation de A, tumefaciens pour introduire les gènes dans les cellules du végétal (c'est-à-dire dans cet exemple
A. thaliana), (4) la régénération de végétaux transgéniques, (5) la sélection des végétaux qui sont homozygotes pour les gènes ectopiques, (6) l'analyse de la fonction des gènes ectopiques dans les végétaux transformés, pour s' assurer qu'ils sont exprimés et que les gènes produits sont fonctionnels, (7) la production de végétaux hybrides contenant au moins deux gènes ectopiques différents, par croisements sexués, (8) l'analyse du matériel hybride pour déterminer la présence du PHB.Ces étapes sont décrites en détail ci-apres.

Construction des fusions transcriptionnelles
Pour obtenir une transcription des gènes bactériens dans des végétaux supérieurs, les gènes bactériens doivent être modifiés par addition d'un promoteur végétal de façon à être transcrits lors de leur introduction dans les végétaux supérieurs. De plus, il est de pratique courante d'ajouter un site d'addition poly-A à la région 3' des gènes bactériens pour obtenir une expression convenable des gènes dans les végétaux supérieurs. Ces deux exigences ont été satisfaites par clonage des gènes phbC, phbA et phbB provenant du plasmide pTZ18U-PHB dans le vecteur du plasmide Ti binaire pBI121 (Clonetech, CA).La Figure 2 présente la séquence nucléotidique des gènes phbC, phbA et phbB se trouvant dans le plasmide pTZ18U-PHB. Les sites d'enzyme de restriction appropriés et utilisés pour le clonage sont indiqués, de même que le cadre de lecture ouvert déduit pour les trois gènes.

On a réalisé une fusion 35S du CaMV-gène phbA par digestion du plasmide pTZ18U-PHB par les enzymes de restriction PstI et DdeI. Le fragment de restriction 1,3 kb contenant la séquence de codage du gene de la 3-cétothiolase a été séparé des autres fragments d'ADN par électrophorèse sur gel d'agarose. Le fragment d'ADN a été récupéré de l'agarose à l'aide d'une membrane en DEAE-cellulose (membrane NA-45
DEAE de Schleicher & Schuell). Les extrémités décalées du fragment d'ADN ont été remplies par incubation du fragment de restriction purifié avec 1'ADN-polymérase T4 et des triphosphates désoxynucléotidiques. Le fragment émoussé a été ensuite cloné dans le site SmaI du plasmide pUC18 pour produire le plasmide pUC-THIO. Le fragment de restriction 1,3 kb a été excisé à partir du plasmide pUC-THIO par digestion avec BamHI et SacI, purifié par électrophorèse utilisant une membrane de DEAE-cellulose et ligaturé dans le plasmide pBI121 qui avait été au préalable digéré par les deux mêmes enzymes. Le plasmide obtenu, appelé pBI-THIO, s'est révélé posséder le gène de la 3-cétothiolase de A. eutrophus selon une bonne orientation par rapport au promoteur 35S du CaMV et du site d'addition poly-A du pli121, de sorte qu'on pourrait s'attendre à ce qu'il soit exprimé dans les végétaux supérieurs. Un récapitulatif schématique des étapes mises en jeu dans la construction du pBI-THIO est présenté sur la
Figure 3.

On a construit une fusion 35S de CaMV-gène phbC par digestion du plasmide pTZ18U-PHB par les enzymes de restriction BstBI et TthlllI. Le fragment de restriction 1,9 kb contenant la séquence de codage du gène de la PHB-synthase a été séparé des autres fragments d'ADN par électrophorèse sur gel d'agarose. Le fragment d'ADN a été récupéré de l'agarose à l'aide d'une membrane en DEAE-cellulose. Les extrémités décalées du fragment d'ADN ont été remplies par incubation du fragment de restriction purifié avec l'ADN-polymérase T4 et des triphosphates désoxynucléotidiques. Le fragment émoussé a été ensuite cloné dans le site SmaI du plasmide pUC18 pour produire le plasmide pUC-SYN.Le fragment de restriction 1,9 kb a été excisé à partir de pUC-SYN par digestion complète par BamHI et digestion partielle par SacI, purifié par électrophorèse à l'aide de membranes de DEAEcellulose et ligaturé dans le plasmide pBI121 qui avait été au préalable digéré par ces deux mêmes enzymes. Le plasmide obtenu, appelé pBI-SYN, s'est révélé posséder le gène de la
PHB-synthase de A. eutrophus selon l'orientation correcte par rapport au promoteur 35S du CaMV et au site d'addition poly-A du pBI121, de sorte que l'on pourrait s'attendre à ce qu'il soit exprimé dans les végétaux supérieurs. Un récapitulatif schématique des étapes mises en jeu dans la construction du pBI-SYN est présenté sur la Figure 4.

On a construit une fusion 35S du CaMV-gène phbB en utilisant une paire d'oligonucléotides synthétiques pour des amorces dans une réaction en chaîne de polymérase (PCR) pour amplifier le gène phbB à partir du plasmide pTZ18U-PHB. La séquence des amorces oligonucléotidiques est présentée sur la Figure 5, et elles sont appelées amorce PCR N" 1 et amorce PCR N" 2. Les oligonucléotides ont été choisis de façon que la séquence d'ADN amplifiée contienne un site
BamHI de synthèse au voisinage de l'extrémité 5' de la séquence codante et un site KpnI de synthèse au niveau de l'extrémité 3' de la séquence.Le produit à 790 paires de bases de la réaction en chaîne de polymérase a été séparé et purifié à partir de gel d'agarose, restreint avec BamHI et
KpnI et ligaturé dans le plasmide pUC18, qui avait été au préalable restreint par ces deux mêmes enzymes, pour produire le plasmide pUC-RED. Le fragment de restriction a été excisé à partir de pUC-RED par digestion avec BamH I et
SacI, purifié par électrophorèse utilisant une membrane de
DEAE-cellulose et ligaturé dans le plasmide pBI121 qui avait été au préalable digéré par ces deux mêmes enzymes.Le plasmide obtenu, appelé pBI-RED, s'est révélé posséder le gène de l'acétoacétyl-CoA-réductase de A. eutrophus selon l'orientation correcte par rapport au promoteur 35S du CaMV et du site d'addition poly-A du pBI121, de sorte qu'on pourrait s'attendre à ce qu'il soit exprimé dans les végétaux supérieurs. Un récapitulatif schématique des étapes mises en jeu dans la construction du pBI-RED est présenté sur la
Figure 5.

Les plasmides pBI-SYN, pBI-THIO et pBI-RED ont été transférés dans Agrobacterium tumefaciens, souche C58 pGV3850, par électroporation. Les colonies contenant les plasmides ont été récupérées par sélection pour expression du gène de résistance à la kanamycine présent dans le plasmide précurseur pBI121.

Production de végétaux transgéniques
Des cellules de A. thaliana ont été transformées par incubation d'un tissu radiculaire stérile avec des cultures de A. tumefaciens portant les plasmides Ti binaires recombinants décrits ci-dessus. Des racines de plants de semis stériles de A. thaliana race Rschew ont été transformées comme décrit par Valvekens, D. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5536-5540 (1988). Chacune des trois souches de A. tumefaciens portant l'un des gènes phb modifiés a été utilisée pour infecter des morceaux de racine de A. thaliana. Il en est résulté la récupérationr dans chaque cas, d'environ 50 tissus de cals résistant à la kanamycine.Sur ces derniers, 10-25 % ont conduit à des pousses fertiles produisant des semences.Chaque plant produisant des semences s'est vu attribuer un numéro différent, pour montrer qu'il représentait un événement de transformation distinct.

On a récupéré en tout 11 plants transgéniques putatifs à partir des tissus traités par A. tumefaciens portant le plasmide pBI-RED. On a les a appelés RedB-2A, -2B, -2C, -2D, -2E, -2F, -2G, -2H, -3A, -5A et RedB-3A. Toutes ces lignées végétales transgéniques, sauf RedB-2F, -2H et -5A, ont été analysées en détail comme décrit ci-après.

On a récupéré en tout 5 plants transgéniques putatifs à partir de tissus traités par A. tumefaciens portant le plasmide pBI-THIO. On les a appelés T3-2A, T4-2A, T4-3A, T4-3B et T4-3C. Toutes ces lignées végétales transgéniques, sauf
T4-3C, ont été analysées en détail comme décrit ci-après.

On a récupéré en tout 4 plants transgéniques putatifs à partir d'un tissu traité par A. tumefaciens portant le plasmide pBI-SYN. On les a appelés S8-1-2A, S8-1-2C, S12-3A et
S8PUC-2A. Toutes ces lignées végétales transgéniques ont été analysées en détail comme décrit ci-après.

La présence d- -XDN-T dans les plants transgéniques putatifs a été vérifiée par ensemencement de semences provenant de plants transgéniques sur un milieu minéral constitué de gélose solidifiée et contenant 50 ,ug/ml de kanamycine. Cette concentration de kanamycine empêche la croissance de plants de A. thaliana non transformés mais permet une croissance normale des végétaux contenant le gène NPTII porté sur les plasmides pBI121 ou dérivant du pBI121. Les semences provenant des plants transgéniques T4-2A, RedD-3A et S8-1-2A sont disponibles auprès de 1'American Type Culture Collection,
Rockville, MD 20852.

Isolement de lignées transgéniques homozygotes putatives
Un critère minimal utilisé pour produire des lignées transgéniques homozygotes a été que la descendance d'un plant homozygote devait être résistante à la kanamycine.

Comme la présence de copies ectopiques multiples du gène
NPTII provenant du pBI121 en différents points du génome peut provoquer un phénotype analogue, ce critère est utile surtout quand l'événement de transformation primaire met en jeu l'insertiond! ADN-T dans seulement un emplacement chromosomique.

Pour identifier les lignées homozyqotes putatives, on a cultivé jusqu'à maturité, separement . plu- sieurs plants Tl résistant à la kanamycine provenant de chaque lignée transgénique. La fréquence de la résistance à la kanamycine a été ensuite déterminée dans des échantillons d'environ 50 semences T2 provenant de chaque lignée. La lignée était provisoirement considérée comme homozygote quand la totalité des semences T2 provenant d'un plant particulier résistait à la kanamycine.

Analyse de l'intégration des gènes phb dans les plants transgéniques
Pour vérifier la bonne intégration des gènes phb dans les différentes lignées végétales transgéniques produites, on a analysé l'ADN génomique des plants transgéniques. On a isolé un ADN à masse moléculaire élevée, à partir de plants témoins non transformés et de plants transgéniques T3 transformés avec les plasmides pBI-THIO, PBI-RED et pBI-SYN. Les
ADN ont été digérés par les enzymes de restriction Hindi Il, les fragments ont été séparés par électrophorèse sur gel d'agarose et transférés sur un filtre de Nylon. L'enzyme de restriction HindIII n'assure de coupure qu'une fois à l'extrémité 5' du promoteur 355 du CaMV dans les plasmides pBI
THIO, pBI-RED et pBI-SYN (Figures 3, 4 et 5).Les fragments détectés à l'aide de sondes spécifiques du gène phb devraient donc représenter des fragments de jonction des vecteurs Ti avec 1'ADN génomique du plant, ou des fragments internes de vecteurs Ti concatamérisés. Les produits d'insertion dans les plasmides pUC-THIO, pUC-RED et pUC-SYN ont été excisés par traitement par EcoRI et HindIII, purifiés par électrophorèse sur gel d'agarose à l'aide de membranes en DEAE-cellulose et marqués par des 32P-désoxyribonucléoti des par amorçage aléatoire. Les fragments de gene phb marqués ont été ensuite utilisés pour sonder les filtres de
Nylon. Les filtres ont été hybridés puis lavés dans des conditions très rigoureuses. Le résultat de ces hybridations sur filtre ressort de la Figure 6.Aucun des trois gènes phb ne peut être détecté dans les plants témoins non transformés (Figures 6A, B et C, bande a). Le gène phbA a été détecté dans quatre des lignées transgéniques produites par une transformation avec le plasmide pBI-THIO (Figure 6A, bandes b à e). Le gène phbB a été détecté dans sept des plants transgéniques produits par transformation avec le plasmide pBI-RED (Figure 6B, bandes f à 1). Enfin, le gène phbC a été détecté dans trois des plants transgéniques produits par transformation avec le plasmide pBI-SYN (Figure 6C, bandes m à p). Bien que la lignée végétale S12-3A fût résistante à 50 lug/ml de kanamycine, ce qui permet de supposer une intégration du gène NPTII, aucun gène phbC n'a pu être détecté.Il est vraisemblable que seul le fragment du vecteur Ti portant le gène NPTII, et non le gène phbC, a été intégré dans l'ADN génomique de la lignée végétale S12-3A.

Analyse de l'expression des gènes phb dans les plants transgéniques
Pour déterminer si les gènes phb de A. eutrophus ont été exprimés dans les différentes lignées transgéniques, les gènes clonés présents dans les plasmides pUC-THIO, pUC-RED et pUC-SYN ont été utilisés comme sondes dans les expériences d'hybridation sur filtre. L'ARN total a été extrait des plants témoins non transformés et des plants transgéniques
T3. L'ARN a été dissocié par électrophorèse dans des gels d'agarose contenant du formaldéhyde et transféré sur des filtres en Nylon par des techniques connues. Les produits d'insertion des plasmides pUC-THIO, pUC-RED et pUC-SYN ont été excisés par traitement par EcoRI et HindîlI, purifiés par électrophorèse utilisant des membranes de DEAE-cellulose et marqués par des 32P-désoxyribonucléotides par amorçage aléatoire.Les gènes phb marqués ont été utilisés comme sondes sur les filtres de Nylon. Ces expériences ont montré qu'au cune des trois sondes phb ne s'est hybridée à un quelconque
ARN dans le végétal témoin non transformé (Figure 7, bandes e, j et r). Inversement, les plants transgéniques produits par transformation par pBI-THIO avaient un ARN de 1,6 kbp, complémentaire du gène de la 3-cétothiolase (Figure 7A, bandes a à d). Les séquences du promoteur 35S du CaMV et les séquences d'addition poly-A présentes sur les plasmides dérivant du pBI121 contribuent approximativement pour 300 bp à la longueur finale des ARNm produits à partir des gènes de fusion phb. Le taux d'ARNm de 3-cétothiolase était faible dans la lignée végétale T4-3A par rapport aux autres lignées végétales.De même, trois des lignées transgéniques produites par transformation avec pBI-SYN avaient un ARNm de 2,1 kbp, ce qui correspond au gène de la PHB-synthase (Figure 7B, bandes f, g et i). La lignée transgénique S12-3A n'avait aucun ARNm décelable subissant une hybridation sur la sonde phbC C (Figure 7B, bande h). Ce résultat est conforme à l'ana- lyse Southern blot, qui ne montre aucune intégration du gène phbC dans 1'ADN génomique de la lignée S12-3A (Figure 6C, bande m). Enfin, sept lignées transgéniques produites par transformation avec le plasmide pBI-RED avaient un ARNm de 1,1 kbp, qui était complémentaire du gène de l'acétoacétyl-
CoA-réductase (Figure 7C, bandes k à q).Ainsi, pour chacun des trois gènes phb, on a obtenu au moins trois plants transgéniques indépendants, qui ont exprimé un ARN complémentaire ayant la taille voulue.

Bien que la présence de l'ARN indique que les gènes ont été transcrits, elle ne donne aucune information selon laquelle ils sont traduits ou encore que le produit de la traduction est fonctionnel.Ce point a été examiné par détermination de l'activité enzymatique des plants transgéniques.

On a déterminé l'activité de 3-cétothiolase de plants transgéniques produits par transformation avec pBI-THIO par de faibles modifications apportées à l'analyse décrite par
Senior, P.J. et Dawes, E.A., Biochem. J. 134:225-238 (1973).

Des tissus foliaires congelés provenant de plants T3 ont été homogénéisés dans un tampon Tris, et on a déterminé l'acti vité de 3-cétothiolase des extraits bruts clarifiés. Les résultats de ces expériences sont présentés sur le Tableau 1. Des extraits de plants non transformés de A. thaliana avaient de très faibles taux d'activité de 3-cétothiolase dans les conditions de l'analyse. Inversement, chacun des plants transgéniques qui se sont révélés transcrire le gène phbA avaient des taux nettement accrus d'activité de thiolase, ce qui a indiqué que le gène bactérien de la thiolase était fonctionnel après expression dans des plants transgéniques.Cependant, l'activité spécifique de 3-cétothiolase détectée dans les différents plants transgéniques était significativement plus faible que celle des extraits préparés à partir de E. coli logeant le gène phbA sur le plasmide pTZ18U-PHB.

Tableau 1.

Taux d'activité de 3-cétothiolase dans des plants
transgéniques de A. thaliana
Echantillon Activité de 3-cétothiolasea
DH5alpha/PHBb 9,5
A. thaliana type sauvage 0,019
T4-3A transgénique 0,057
T3-2A transgénique 0,42
T4-2A transgénique 0,43
T4-3B transgénique 0,54 a Micromoles d'acétoacétyl-CoA dégradés par minute par milligramme de protéine. Les valeurs correspondent à une moyenne de deux à quatre mesures.

b E. coli DHSalpha contenant le plasmide pTZ18U-PHB logeant l'opéron du PHB.

On a déterminé l'activité d'acétoacêtyl-CoA réductase de plants transgéniques produits par transformation avec le plasmide pBI-RED grâce à des modifications mineures de l'analyse décrite par Senior, P.J. et Dawes, E.A., Biochem.

J., 134:225-238 (1973). Des feuilles de plants T3 ont été homogénéisées dans un tampon phosphate de potassium, et les extraits clarifiés ont fait l'objet d'un dosage de leur activité d'acétoacétyl-CoA-réductase. Les résultats de ces expériences sont présentés sur le Tableau 2. Les extraits provenant de plants non transformés de A. thaliana avaient des taux non décelables d'activité d'acétoacétyl-CoAréductase dans les conditions de l'analyse. Inversement, chacun des plants transgêniques se révélant transcrire le gène phbB avaient des taux élevés d'activité d'acétoacétyl
CoA-réductase, ce qui indique que le gène bactérien d'acétoacétyl-CoA-réductase est fonctionnel quand il est exprimé dans des plants transgéniques.En outre, l'activité spécifique de l'acétoacétyl-CoA-réductase, détectée dans six des sept plants transgéniques analysés, était significativement plus élevée que dans les extraits de E. coli logeant les gènes phbB sur le plasmide pTZ18U-PHB.

Tableau 2
Taux d'activité d'acétoacétyl-CoA-réductase dans les plants
transgéniques de A. thaliana
Echantillon Activité d'acétoacétyl CoA-réductasea
DH5alpha/PHBb - 1,4
A. thaliana type sauvage < 0,03
RedB-2A transgénique 12,5
RedB-2B transgénique 16,2
RedB-2C transgénique 9,1
RedB-2D transgénique 8,8
RedB-2E transgénique 1,6
RedB-2G transgénique 5,2
RedD3A transgénique 2,3 a Micromoles de NADPH dégradés par minute par milligramme de protéine. Les valeurs correspondent à une moyenne de deux à quatre mesures.

b E. coli DH5alpha contenant le plasmide pTZ18U-PHB logeant l'opéron du PHB.

Les plants transgéniques obtenus par transformation avec le plasmide pBI-SYN n'ont pas fait l'objet d'une détermination de la présence d'activité de PHB-synthase en raison de difficultés techniques lors de la mesure de l'activité de cette enzyme en l'absence d'activités de thiolase et de réductase.

Production et analyse des plants hybrides
Comme les végétaux supérieurs contiennent une activité cytoplasmique endogène de 3-cétothiolase, les seules enzymes supplémentaires nécessaires à la production du PHB sont l'acétoacétyl-CoA-réductase et la PHB-synthase. Ces deux gènes ont été introduits dans le même plant par pollinisation croisée d'une lignée transgénique qui était jugée homozygote pour le gène de l'acétoacétyl-CoA-réductase avec une lignée transgénique qui était jugée homozygote pour le gène de la PHB-synthase. Les semences hybrides obtenues à partir de ces croisements ont été cultivées dans le sol pendant deux à trois semaines avant détermination de la présence du
PHB.

Pour vérifier si la présence dans les plants des gènes de 1'acétoacétyl-CoA-réductase et de la PHB-synthase était suffisante pour la production et l'accumulation du PHB, on a préparé des extraits d'un produit soluble dans le chloroforme, à partir de plants témoins et de plants hybrides contenant ces deux gènes. La présence de PHB dans ces extraits a été analysée par chromatographie en phase gazeuse (CPG).

On a utilisé deux méthodes pour préparer des extraits de végétaux pour analyse par CPG. Ces méthodes utilisent tant la nature hautement polymérisée du PHB (106 daltons en moyenne pour le PHB produit à partir de A. eutrophus) que sa solubilité sélective dans les hydrocarbure chlorés tels que le chloroforme. En bref, dans la méthode N" 1, des feuilles entières sont placées dans une solution 1:1 de chloroforme et d'eau et secouées par renversement pendant 16 heures à 65"C. Comme les molécules supérieures à environ 50 000 daltons ne peuvent traverser la paroi des cellules végétales, seuls sont extraits des feuilles dans ces conditions des produits à faible masse moléculaire, solubles dans le chloroforme ou l'eau.Le PHB putatif à haute masse moléculaire est ensuite extrait des feuilles par homogénéisation du tissu restant de façon à rompre la paroi cellulaire, et réextraction dans une solution 1:1 de chloroforme et d'eau pendant 12 heures à 65"C. Dans la méthode N" 2, des échantillons de feuilles complètes sont extraits successivement pendant 2 heures à 55"C dans de méthanol à 50 %, pendant 2 heures à 55"C dans du méthanol à 100 % et pendant 15 minutes à 20"C dans du diéthyléther à 100 %. Le tissu restant est ensuite homogénéisé et extrait dans du chloroforme à 100"C pendant 4 heures.Les produits présents dans l'extrait final dans le chloroforme, obtenus par ces deux méthodes, ont été transesterifié à l'méthanol et à l'acide chlorhydrique et analysés par chromatographie en phase gazeuse. Le temps de rétention des produits végétaux transesterifiéSa été comparé à celui d'un PHB transesterifié du commerce purifiés à partir de A. eutrophus (Sigma Chemical Co., MO).

Des plants transgéniques S8-1-2A et/ou S8-1-2C ont subi une pollinisation croisée avec des plants transgéniques
RedB-2A, -2C, -2D, -2G et RedD-3A. Les semences F1 obtenues ont été ensemencées dans le sol, et des édhantillons de feuille ou des pousses complètes de plants de 2-3 semaines ont été recueillis et ont fait l'objet d'une analyse de la présence du PHB. Un exemple des résultats obtenus par la méthode de purification N" 1 est présenté sur la Figure 8.

Un produit présent dans les extraits des plants F1, possédant les gènes transformés de 1' acétoacétyl-CoA-réductase et du
PHB-synthase, a un temps de rétention identique à celui de l'hydroxybutyrate d'éthyle, comme on le détermine par comparaison avec le temps de rétention du PHB transestérifié du commerce. Ce nouveau produit, provisoirement identifié comme étant l'hydroxybutyrate d'éthyle n'a été détecté que dans les plants hybrides F1 ayant simultanément un gène transformé actif d' acétbacétyl-Co-A-reductase -et un gène transformé de PHBsynthase. Un produit analogue n'a pu être détecté dans les plants transgéniques ne possédant que l'un des gènes cidessus, ou encore dans les plants de A. thaliana non transformés.De plus, ce produit n'a pu être détecté dans les extraits chloroforme de tissus végétaux n'ayant pas été au préalable homogénéisés. Cela indique que lthydroxybutyrate d'éthyle dérive d'un précurseur ayant une masse moléculaire élevée.

L'identité du nouveau produit végétal ayant un temps de rétention identique à celui de l'hydroxybutyrate d'éthyle a été analysée par chromatographie en phase gazeuse-spectrométrie de masse (CPG-SM). L'analyse par CPG-SM a été effectuée par l'installation de spectrométrie de masse de MSU
NIH. La Figure 9A présente les résultats de la spectrométrie de masse obtenus sur l'hydroxybutyrate d'éthyle préparé à partir d'un PHB témoin. La Figure 9B présente le spectre de masse de l'hydroxybutyrate d'éthyle putatif extrait d'un plant hybride F1, résultant d'un croisement entre les plants transgéniques S8-1-2A et RedB-2C.Les résultats montrent que le nouveau produit végétal, ayant le même temps de rétention que l'hydroxybutyrate d'éthyle, présente aussi la meme configuration de fragmentation qu'un échantillon témoin d'hydroxybutyrate d'éthyle.

Le fait que ce nouveau produit ne puisse être détecté que dans les extraits de tissus foliaires ayant au préalable été homogénéisés indique que l'hydroxybutyrate d'éthyle dérive d'un produit ayant une masse moléculaire supérieure à environ 50 000 daltons (qui est la porosité approximative des parois des cellules végétales). Globalement, ces résultats montrent que les plants transgéniques contenant tant les gènes de l'acétoacétyl-CoA-réductase que de la PHBsynthase accumulent le polyhydroxybutyrate. Le Tableau 3 présente un récapitulatif des plants F1 ayant été analysés par CPG et CPG-SM. Sur la base de l'analyse CPG, la quantité de PHB accumulée dans les feuilles des hybrides F1 était comprise entre environ 5 pg de PHB par gramme de poids frais de feuilles pour les hybrides F1 entre RedD-3A et S8-1-2C, et environ 100 ijg de PHB par gramme de poids frais de feuilles provenant de l'hybride F1 entre RedB-2C et S8-1-2A.

Tableau 3
Récapitulatif des preuves de la production de PHB dans les
plants hybrides F1
LTP* (a) LTP*(a)
S8-1-2C S8-1-2A
RedD-3A CPG(b), SM(c)
MET(d) (feuilles) RedB-2A CPG
MET(semence) MET (feuilles, semence) RedB- 2G CPG, SM
MET (feuilles)
RedB-2C CPG, SM
MET (feuilles)
REDB-2D MET (feuilles) * LTP = Lignée transgénique parentale a Des lignées transgéniques portant le gène transformé de l'acéto- acétyl-CoA-réductase ont subi une pollinisation croisée avec des lignées transgéniques logeant la PHB-synthase. Les hybrides F1 obtenus ont fait l'objet d'une analyse pour déterminer la production du PHB.

b Preuve de la production de PHB par analyse par chromatographie en phase gazeuse.

c Preuve de la production du PHB par chromatographie en phase gazeuse-spectrométrie de masse.

d Détection des granules transparents aux électrons par microscopie électronique par transmission. Les mots entre parenthèses indiquent le tissu végétal analysé.

e Tous les espaces vides indiquent que l'analyse n'a pas été réalisée.

Inspection visuelle des granules de PHB dans les plants hybrides
Une microscopie électronique par transmission (MET) des bactéries accumulant le PHB a révélé des granules transparents aux électrons, de 0,2 à 0,5 pm de diamètre, entourés d'une membrane de revêtement d'environ 2 nm d'épaisseur (Lundgren, D.G., Pfister, R.M. et Merrick, J.M., J. Gen.

Microbiol., 34:441-446 (1964)). Pour déterminer si des granules analogues pourraient être détectés dans des plants hybrides qui se révèlent positifs vis-à-vis de la production de PHB par analyse par CPG-SM, des tissus végétaux ont été examinés par microscopie électronique par transmission. Des plants transgéniques S8-1-2A et/ou S8-1-2C ont subi une pollinisation croisée pour donner RedB-2A, -2C, -2D, -2G et
RedD-3A transgéniques. Les semences et les feuilles mûres de l'hybride F1 obtenu ont été fixées pour analyse par microscopie électronique par transmission. En bref, les tissus ont été fixés dans du glutaraldéhyde à 3 % et du tétroxyde d'osmium à 1 %, et noyés dans une résine époxyde. Des coupes de 80-90 nm ont été colorées avec de l'acétate d'uranyle et du citrate de plomb à 5 %.

Dans une série d'expériences, les semences Fl ont été ensemencées dans le sol, et on a recueilli pour analyse MET des feuilles de plants de 2-3 semaines. Un examen des cellules présentes sur les feuilles a révélé la présence d'agglomérations de granules transparents aux électrons. Ces granules ont été détectés dans tous les plants hybrides F1 analysés provenant de croisements entre des transgéniques ayant le gène de la PHB-synthase et des transgéniques ayant le gène de l'acétoacétyl-CoA-réductase. Des exemples sont présentés sur la Figure 10. Des granules analogues n'ont jamais été détectés dans les lignées transgéniques parentales ne possédant que les gènes de la PHB-synthase ou de l'acéto- acétyl-CoA-réductase, de même qu'ils n'ont pas été détectés dans A. thaliana non transformé.Dans les tissus foliaires de l'hybride F1, les granules ont été détectés dans les cellules du mésophylle (Figure 10, microphotographies a à e). L'agglomérat de granules transparents aux électrons a été le plus souvent détecté dans le noyau (Figure 10, microphotographies à c), mais des structures analogues ont aussi été détectées dans le cytoplasme (Figure 10, microphotographie e) et la vacuole (Figure 10, microphotographie d) des tissus foliaires de l'hybride F1. Dans le noyau et le cytoplasme, les granules individuels pouvaient atteindre une taille maximale d'environ 0,18 pm. Dans les vacuoles, les granules étaient généralement plus gros, avec un diamètre maximal d'environ 0,55 pm. A un grossissement plus important les granules nucléaires se révèlent entourés d'un matériel dense vis-à-vis des électrons.Tant la taille que la structure apparente de ces granules sont très analogues à celles des granules observés dans les bactéries qui accumulent le PHB.

Dans une deuxième série d'expériences, des semences F1 ont été immergées dans de l'eau pendant 24 heures, les embryons ont été séparés par dissection du tégument et les tissus ont été fixés. Une analyse des cotylédons embryonnaires a révélé la présence d'une agglomération de granules transparents aux électrons dans le noyau (Figure 10, microphotographie f). Les granules ont pu atteindre un diametre maximal de 0,18 pm. Ces granules n'ont pu être détectés que dans le noyau des embryons de l'hybride F1 résultant de croisements entre des transgéniques possédant le gène de la
PHB-synthase et des transgéniques possédant le gene de l'acétoacétyl-CoA-réductase.Aucun granule n'a pu être détecté dans l'un ou l'autre des plants transgéniques parentaux ne possédant que l'un des gênes ectopiques, ou encore dans A. thaliana non transformé, type sauvage. Le Tableau 3 présente un récapitulatif des plants F1 qui ont été analysés par MET.

Les résultats ci-dessus prouvent une corrélation positive entre la détection du PHB par CPG-SM et la présence de granules au niveau du microscope électronique. La taille, la forme et la présence d'un matériel dense aux électrons autour des granules individuels ressemblent très fortement à celles des granules présents dans les bactéries produisant le PHB. Finalement, tant la détection du PHB par CPG-SM que la présence de granules transparents aux électrons ne sont observées que dans les plants hybrides possédant tant le gène transformé de l'acétoacétyl-CoA -réductase que celui de la
PHB-synthase. Globalement, ces résultats montrent que les
granules observés dans les plants hybrides F1 sont composés
de polyhydroxybutyrate.

DISCUSSION
Dans ces études, il a été montré que les gènes bacté
riens codant les enzymes nécessaires à la synthèse du PHB
peuvent être introduits d'une manière stable dans un végétal
supérieur de façon que les gènes soient transcrits et pro
duisent des produits de transcription ayant la taille vou
lue. I1 a en outre été montré que, dans le cas des gènes
phbA et phbB, la présence de ces gènes dans des plants
transgéniques confère une augmentation respectivement de
l'activité de 3-cétothiolase et de l'activité d'acétoacétyl
CoA-réductase. Ainsi, il est clair que ces deux gènes obte
nus sont fonctionnels quand ils sont traduits dans le plant.

En raison de difficultés techniques associées à l'analyse
directe de l'activité de PHB-synthase, la quantité de PHB
synthase dans les plants transgéniques n' a pas été détermi
née.

Il a été montré que seuls les extraits de plants trans
géniques F1 exprimant tant l'acétoacétyl-CoA-réductase que
la PHB-synthase produisent un nouveau composé à masse molé
culaire élevée, soluble dans le chloroforme, qui après
transesterification avec l'méthanol et l'acide chlorhydrique
donne l'hydroxybutyrate d'éthyle. Ces résultats montrent que
le nouveau composé est le polyhydroxybutyrate. De plus, ces
résultats sont une preuve indirecte de la production d'une
PHB-synthase fonctionnelle dans les plants transgéniques. Ce
résultat est important car il n'a pu etre effectué aucune
analyse in vitro portant sur l'activité de PHB-synthase. En
outre, la production de PHB indique aussi d'une manière
indirecte qu'il y a dans les plants production de D(-)
hydroxybutyryl-CoA, qui est le substrat de la PHB-synthase.

Cet hydroxyacyl-CoA ne se trouve pas naturellement dans les
végétaux.

La microscopie électronique par transmission soutient en outre J 1hypotnese selon laquelle le PHB est produit dans des plants transgéniques. Une analyse des cotylédons embryonnaires et des feuilles mûres de plants transgéniques F1 exprimant tant l'acétoacétyl-CoA-réductase que la PHBsynthase a révélé des agglomérats de granules transparents aux électrons ayant une taille et une structure très analogues à celles des granules trouvés dans les bactéries produisant le PHB, comme A. eutrophus. Ces granules se sont révélés le plus souvent présents dans le noyau, mais on les a aussi détectés dans la vacuole et le cytoplasme de plants hybrides F1.

Dans les expériences décrites dans la présente invention, les produits des gènes phbA, phbB et phbC provenant de
A. eutrophus sont le plus vraisemblablement exprimés dans le cytoplasme, car aucune séquence spécifique d'acides aminés n'a été ajoutée aux protéines pour les diriger spécifiquement dans des organelles. Comme le cytoplasme des cellules végétales contient déjà une 3-cétothiolase, seule a été nécessaire pour produire le PHB l'expression supplémentaire de 1'acétoacétyl-CoA-réductase et de la PHB-synthase. Le fait que des granules soient observés dans le noyau et dans les vacuoles n'est pas nécessairement contradictoire avec l'expression des enzymes dans le cytoplasme.Comme les membranes nucléaires se désassemblent et de réas semblent pendant la division cellulaire, des granules de PHB initialement produits dans le cytoplasme pourraient être piégés dans les membranes nouvellement reformées du noyau. Ou bien encore, du fait de leur caractère hydrophobe, des granules de PHB pourraient traverser les membranes du noyau ou de la vacuole.

Dans une autre approche la production de PHB pourrait être localisée dans une organelle spécifique d'une cellule végétale, par expression ciblée des enzymes mises en jeu dans la synthèse du PHB vers l'organelle. Dans ce cas, si l'organelle servant de cible n'exprime pas une 3-cétothiolase active, aucune expression d'une activité exogène de 3cétothiolase ne serait nécessaire, en plus de l'acétoacétyl-
CoA-réductase et de la PHB-synthase, pour la production du
PHB.

L'objectif à long terme de la production du PHB ou du
PHA dans les végétaux supérieurs est de détourner le carbone des principaux composés de stockage tels que les lipides, l'amidon et les terpénoïdes, pour les canaliser vers la synthèse du PHA, Cet objectif va exiger une expression spécifique des tissus, ainsi qu'une expression potentiellement spécifique des organelles, des enzymes mises en jeu dans la synthèse du PHA.

Les cultures oléagineuses sont des cibles éventuelles du génie génétique. Les lipides sont synthétisés dans le plastide à l'aide d'acétyl-CoA, qui est le même précurseur que celui utilisé dans la synthèse du PHB et d'autres PHA.

En conséquence, le génie génétique des plantes oléagineuses va exiger le ciblage, dans le plastide, des enzymes de biosynthèse du PHA. Des exemples de cultures oléagineuses pouvant être utilisées en génie génétique pour produire du PHA sont le colza, le tournesol et le palmier à huile. Le colza et le tournesol sont des cultures importantes en Amérique du
Nord et peuvent être transformées à l'aide d'ADN étranger.

La production du PHA pourrait aussi être ciblée dans le mésocarpe du fruit du palmier. Comme les lipides produits dans le mésocarpe ne sont pas essentiels pour la survie de l'arbre ou de l'embryon, la production du PHA ne devrait avoir aucun effet gênant sur les palmiers. Malheureusement, on ne dispose encore à l'heure actuelle d'aucune technique de transformation de la palme.

La production de PHA pourrait aussi être ciblée vers les racines et les tubercules des betteraves à sucre et des pommes de terre, cultures qui accumulent de grandes quantités d'amidon. Le principal problème lié à cette technique réside dans le fait que, comme l'amidon et le PHA n'utilisent pas les mêmes précurseurs, il faudra vraisemblablement des modifications multiples au niveau du métabolisme du carbone avant de pouvoir détourner le carbone de l'amidon vers le PHA.

Il est vraisemblable que la méthode la plus directe pour produire du PHA serait l'utilisation de cultures accumulant de grandes quantités de terpénoïdes, comme la carotte qui accumule les caroténoïdes, ou l'igname mexicain, qui accumule les stérols. Comme les terpénoïdes utilisent les mêmes précurseurs que le PHA (acétyl-CoA et acétoacétyl
CoA), on pourrait plus facilement détourner le carbone vers la production du PHA.

MATERIEL ET METHODES
Construction des recombinants d'ADN
On a cultivé une souche de E. coli DH5alpha portant des plasmides dans un bouillon LB supplémenté par 50 ,ug/ml de kanamycine ou 50 pg/ml d'ampicilline. On a effectué une préparation à grande échelle d'ADN de plasmide par lyse alcaline et précipitation au polyéthylèneglycol, comme décrit par Sambrook, J., Fritsch, E.F. et Maniatis, T., Molecular
Cloning, a laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory
Press (1989).L'ADN de plasmide a été clivé à l'aide d'endonucléases de restriction selon les recommandations du fabricant (New England Biolabs, Mass. ; Promega Corp., WI ; Boehringer Mannheim Biochemicals, IN ; Stratagene, CA), séparé par électrophorèse sur gel d'agarose et visualisé par une coloration au bromure d'éthidium comme décrit par Sambrook,
J., Fritsch, E.F. et Maniatis, T., Molecular Cloning, a laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989). Les fragments d'ADN ont été récupérés du gel d'agarose à l'aide de membranes en DEAE (membrane DEAE NA-45,
Schleicher and Schuell, Inc., NH).Rapidement, l'ADN subit une électrophorèse sur une bande de NA-45, et 1'ADN est lavé dans NaCl 0,15 M, EDTA 0,1 mM et Tris-HCl 20 mM (pH 8).Puis l'ADN est élué dans NaC1 1,0 M, EDTA 0,1 mM et Tris-HCl 20 mM (pH 8) à 65"C pendant 1 à 2 heures. L'ADN est en outre purifié par extraction au phénol-chloroforme et précipitation à l'éthanol. Dans certaines expériences, les groupes terminaux 3' en retrait des fragments d'ADN ont été convertis en extrémités émoussées à l'aide d'ADN-polymérase T4 en utilisant le protocole décrit dans Sambrook, J., Fritsch,
E.F. et Maniatis, T., Molecular Cloning, a laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989).Une ligature de fragment d'ADN ayant des extrémités cohésives ou émoussées a été effectuée à 14"C pendant 16 heures dans un tampon contenant Tris-HCl 50 mM (pH 7,6), MgCl2 5 mM, 5 % (p/v) de polyéthylèneglycol 8000, ATP 0,5 mM et dithiothréitol 5 mM, comme décrit par Sambrook, J., Fritsch, E.F. et
Maniatis, T., Molecular Cloning, a laboratory manual, Cold
Spring Harbor Laboratory Press (1989). Une fraction de la réaction de ligature a été transférée dans E. coli par la méthode au chlorure de rubidium telle que décrite par Hanahan, D., J. Mol. Biol. 166:557-580 (1983). Les bactéries transformées ont été placées sur des plaques de gélose contenant du bouillon LB et 50 ,ug/ml de kanamycine ou 50 pg/ml d'ampicilline.Les colonies bactériennes contenant des plasmides recombinants ont été identifiées par hybridation avec des sondes à ADN marquées au 32p, comme décrit par Sambrook,
J., Fritsch, E.F. et Maniatis, T., Molecular Cloning, a laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989), sauf que l'on a utilisé des membranes de Nylon (Hybond-N, Amersham, IL) à la place de membranes en nitrocellulose. La préparation des sondes d'ADN radiomarquées et leur hybridation sont décrites ci-après. Une préparation d'un ADN de plasmide à l'échelle du laboratoire a été faite par la méthode de la lyse alcaline comme décrit par Sambrook, J., Fritsch, E.F. et Maniatis, T., Molecular Cloning, a laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989).

Des oligonucléotides ont été synthétisés sur un synthétiseur d'ADN Applied Biosystems 380A selon les instructions du constructeur (Applied Biosystems, CA). Les oligonucléotides comportant un groupe diméthoxytrityle fixé aux extrémités 5' ont été purifiés sur un chromatographe HPLC Varian 5000 équipé d'une colonne C18 (Varian Instrument Group, TX).

Les oligonucléotides ont été remis en suspension dans de la triéthylamine 0,1 M et injectés sur une colonne C18 prééquilibrée avec un mélange de 12 % d'acétonitrile et de 88 % d'acétate de triéthylamine 0,1 M à pH 7 (solvant A). Le pro gramme du chromatographe HPLC a été défini comme suit débit 0,9 ml/min ; pression maximale 200 psi (1400 kPa) temps O min, 88 t solvant A/12 t solvant B (acétonitrile) temps 3 min, 88 * solvant A/12 t solvant B ; temps 21 min, 65 % solvant A/35 % solvant B ; temps 25 min, 65 % solvant
A/35 % solvant B. Les oligonucléotides purifiés ont été détritylés dans de l'acide acétique à 80 % pendant 10 minutes et séchés sous azote.Les oligonucléotides ont été dissous dans Tris-HCl 10 mM pH 7,5 et EDTA 0,1 mM, extraits à trois reprises avec des volumes égaux d'acétate d'éthyle et précipités à 1'méthanol.

La réaction en chaîne de polymérase (PCR) a été effectuée à l'aide d'un cycleur thermique d'ADN Perkin-Elmer
Cetus (Perkin-Elmer, CT). Le mélange réactionnel contenant 100 pmoles d'oligonucléotides, les amorces PCR N" 1 et N" 2 (voir Figure 5), 200 ng du plasmide pTZ18U-PHB linéarisé avec l'enzyme de restriction EcoRI, dNTP 125 uM, KCl 50 mM,
Tris-HCl 10 mM pH 8,3, MgCl2 2,5 mM, 0,01 % de gélatine et 2,5 unités de Taq-polymérase (Perkin-Elmer, CT).Le programme du cycleur thermique d'ADN a été le suivant : 3 min à 94"C, 40 cycles de la séquence pendant 1 minute à 94"C - 3 minutes à 55"C - 3 minutes à 72"C et finalement 7 minutes à 72"C. Le produit de la réaction PCR a été isolé par électrophorèse sur gel d'agarose et une élution à l'aide d'une membrane en DEAE-cellulose.

Production de plants transgéniques
Les vecteurs du plasmide Ti utilisés pour produire des plants transgéniques ont été d'abord transférés dans Agrobacterium tumefaciens, souche C58-pGV3850 par électroporation (Zabrisky, P. et al., EMBO 2:2143-2150 (1983) ; et
Sambrook, J., Fritsch, E.F. et Maniatis, T., Molecular Cloning, a laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory
Press (1989)). On a cultivé en culture aseptique Arabidopsis thaliana race Rschew sur des boites de Pétri verticales contenant des éléments minéraux, 0,8 % de gélose (Difco) et 1 t de saccharose comme décrit par Estelle, M.A. et Somerville,
C., Mol. Gen. Genet. 206:200-206 (1987) et Schiefelbein,
J.W. et Somerville, C.R., Plant Cell 2:235-243 (1990).Des racines provenant de plants de 10 à 12 jours ont été excisées et utilisées pour la transformation comme décrit par
Valvekens, D., Van Montagu, M. et Van Ligjsebettens, M.,
Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85:5536-5540 (1988).

Des semences provenant de plants transgéniques TO et T1 ont été cultivées sur des milieux contenant des éléments minéraux, 1 t de saccharose, 0,8 * de gélose (Difco) et 50 ,ug/ml de kanamycine. Au bout de 10 à 14 jours de croissance, les plants transgéniques résistant à la kanamycine (Kmr) avaient des feuilles vertes, tandis que les plants non transformés sensibles à la kanamycine (KmS) avaient des feuilles jaunes. A ce stade, les plants Kmr ont pu être enlevés des plaques de gélose et transplantés dans un sol fertilisé.

Extraction, et clivage par une endonucléase de restriction, de 1'ADN génomique
Des plants de type sauvage et des plants transgéniques ont été cultivés dans le sol pendant 2 à 3 semaines, et environ 5 g d'un matériel foliaire ont été recueillis et congelés dans de l'azote liquide. De l'ADN à masse moléculaire élevée a été extrait des tissus végétaux congelés, comme décrit par Rogers S.C. et Bendich, A.J., Plant
Molecular Biology Manual A6:1-10 (1988). Le clivage par une endonucléase de restriction, utilisant l'enzyme Hindîli, a été réalisé dans les conditions recommandées par le fabricant (New England Biolabs Inc., Mass.).

Electrophorèse sur gel d'agarose et hybridation
L'analyse de 1'ADN par électrophorèse sur gel d'agarose et son transfert sur des membranes de Nylon (Hybond-N, Amersham, Il) ont été effectués à l'aide de techniques connues décrites par Southern, E.M., J. Mol. Biol. 38:503-517 (1975) et Sambrook, J., Fritsch, E.F. et Maniatis, T., Molecular
Cloning, a laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory
Press (1989). Des fragments d'ADN clonés spécifiques, destinés à être utilisés comme sondes, ont été excisés du vecteur à l'aide d'endonucléases de restriction appropriées, les produits d'insertion ont été purifiés du vecteur par électrophorèse sur gel d'agarose et électroélution à l'aide de membranes en DEAE-cellulose.Les sondes ont été marquées par des 32P-désoxyribonucléotides, par la méthode de l'extension d'amorce statistique faisant appel à des hexamères, comme décrit par Feinberg, A.P; et Volgelstein, B., Anal. Biochem.

136:6-13 (1983). Les filtres de Nylon ont été hybridés avec des sondes marquées et exposés sur un film, comme décrit par
Poirier, Y. et Jolicoeur, P., J. Virol., 63:2088-2098(1989).

Isolement et électrophorèse de l'ARN
L'ARN total a été isolé d'échantillons foliaires congelés comme décrit par PUissant, C. et Houdebine, L.M., Bio
Techniques 8:148-149 (1990). L'ARN isolé a été séparé par électrophorèse sur gel d'agarose contenant du formaldéhyde et transféré sur des membranes en Nylon (Hybond-N, Amersham, Il), comme décrit par Sambrook, J., Fritsch, E.F. et Maniatis, T., Molecular Cloning, a laboratory manual, Cold Spring
Harbor Laboratory Press (1989). Les filtres en Nylon ont été hybridés avec des sondes marquées, comme décrit plus haut.

Dosage de l'activité de 3-cétothiolase
On a homogénéisé 1 g d'échantillons foliaires congelés dans 2 ml d'un tampon refroidi par de la glace contenant
Tris-HCl 100 mM à pH 8,0, MgCl2 40 mM et beta-mercaptoéthanol 5 mM. L'homogénéisat a été clarifié par centrifugation à 10 000 g pendant 2 minutes, et le surnageant a été transféré dans un tube frais. La teneur de l'extrait en protéines a été mesurée par la technique de Bradford, qui utilise le coffret de dosage des protéines BioRad (BioRad Laboratories,
CA). On a utilisé par dosage de 3 à 30 pg d'extraits de protéines végétales. Les extraits protéiques ont eux aussi été préparés à partir de bactéries. Dans ce cas, des cultures stationnaires de bactéries ont été centrifugées, on les a prélevées dans le culot, lavées une fois avec un tampon de dosage refroidi par de la glace et remises en suspens ion dans 200 p1 du même tampon. La suspension bactérienne a été lysée par sonication, lthomogénéisat a été clarifié par centrifugation, et la teneur de l'extrait en protéines a été déterminée par la méthode de Bradford. On a utilisé par dosage de 0,2 à 1 pg d'extrait protéique bactérien. L'activité de l'enzyme 3-cétothiolase dans les différents extraits a été déterminée par la technique de Senior, P.J. et Dawes,
E.A., Biochem. J. 134:225-238 (1973).

Détermination de l'activité d'acétoacétyl-CoA-réductase
On a homogénéisé 1 g d'échantillons foliaires congelés dans 2 ml d'un tampon refroidi par de la glace et contenant
KH2P04 100 mM à pH 5,5, MgCl2 0,02 mM et bêta-mercaptoéthanol 4,0 mM. L'homogénéisat a été clarifié par centrifugation à 10 000 g pendant 2 minutes, et le surnageant a été transvasé dans un tube frais. La teneur de l'extrait en protéines a été mesurée par la méthode de Bradford à l'aide d'un coffret de dosage des protéines BioRad. On a utilisé par dosage de 0,8 à 10 pg d'extrait de protéines végétales. On a aussi préparé des extraits bactériens dans le tampon d'analyse, essentiellement comme décrit plus haut. L'activité de l'enzyme acétoacétyl-CoA-réductase a été déterminée par la technique de Senior, P.J. et Dawes, E.A., Biochem. J. 134:225238 (1973).

Analyse par chromatographie en phase gazeuse et spectrométrie de masse
On a utilisé deux méthodes pour préparer des extraits végétaux pour analyse par CPG. Dans la méthode N" 1, on a extrait de 0,005 à 0,05 g d'un matériel végétal frais ou congelé (feuilles ou pousses complètes) dans 1 à 2 ml d'une solution 1:1 de chloroforme et d'eau à 65"C pendant 16 heures sous agitation constante. Le matériel végétal a été ensuite homogénéisé dans de l'eau et réextrait dans une solution 1:1 de chloroforme et d'eau pendant 16 heures à 65"C sous agitation constante.La phase chloroforme a été transvasée dans un nouveau tube et extraite une fois avec un volume égal d'eau. Le volume final de la phase chloroforme a été ajusté à 0,5 ml et utilisé pour une transesterification à méthanol et au HC1 comme décrit ci-après. Dans la méthode N" 2, on a extrait successivement 0,005 à 0,15 g d'un matériel végétal congelé ou frais dans de l'méthanol à 50 t à 55"C pendant 2 heures, du méthanol à 100 t à 55"C pendant 2 heures et du diéthyléther à 100 % pendant 15 minutes à la température ambiante.Le tissu restant a été ensuite homogénéisé dans de l'eau, séché et extrait dans 0,5 ml de chloroforme pendant 4 heures à 100 C.

Les extraits dans le chloroforme (0,5 ml) finalement obtenus par les méthodes N" 1 et 2 ont été transesterifié par addition de 0,2 ml de HCl concentré et de 1,7 ml d'éthanol à 100 , et chauffage à 100 C pendant 2 heures. Le mélange réactionnel a été ensuite refroidi à la température ambiante, la phase chloroforme a été extraite à deux reprises avec 2 ml de NaCl à 0,9 % (p/v), et la phase organique finale a été réduite à 100 pl. En tant qu'étalon, on a dissous du PHB du commerce (Sigma Chemical Co., MO) dans du chloroforme chaud, et on en a transesterifié 1 mg comme décrit ci-dessus.

La phase chloroforme contenant les esters éthyliques a été transférée dans un flacon CPG pour injection de 1 p1 dans un chromatographe CPG Hewlett Packard 5890 série II équipé d'un autoéchantillonneur programmable et d'une colonne capillaire en verre SP-2330 (Supelco, PA). La vitesse linéaire approximative était de 20 cm/s, avec de l'hélium servant de gaz porteur.La température au niveau de la chambre d'injection a été ajustée à 220 C, et celle de la chambre du détecteur par ionisation de flamme à 220 C. On a utilisé le profil de température suivant : 4 minutes à 65"C, puis augmentation de la température à raison de 20 C/minute jusqu'à 195"C, 3,5 minutes à 195"C, puis diminution de la température à raison de 20 C/minute jusqu'à 65"C.

L'identité des pics intéressants a été établie par CPGspectrométrie de masse. Les résultats d'une spectrométrie de masse par impact d'électrons ont été obtenus sur un spectromètre de masse JEOL JMS-AX505H couplé à un CPG Hewlett Packard 5890. On a utilisé les paramètres suivants : température de la source 200"C ; courant d'ionisation 100 pA ; tension d'accélération 3 keV. Une colonne DB-225 de J & W
Scientific Co. a été directement insérée dans la source du spectromètre de masse, et on a utilisé de l'hélium comme gaz porteur. L'injecteur, sans diviseur, a été maintenu à 260"C, et la ligne de transfert à 260 C. On a utilisé le même profil de température du four du chromatographe CPG (voir paragraphe précédent).

Microscopie électronique par transmission
Des tissus végétaux ont été fixés avec du glutaraldéhyde à 3 % dans un tampon phosphate 0,1 M à pH 7,2 pendant 1,5-2 heures à la température ambiante. Les échantillons ont été lavés quatre fois dans un tampon phosphate 0,1 M à pH 7,2 et fixés dans de l'Os04 à 1 % dans un tampon phosphate pendant 2 heures à la température ambiante. Les tissus ont été ensuite déshydratés dans une série progressive à l'éthanol, et incorporés dans une résine époxyde Spurrs. On a préparé des coupes de 80-90 nm, on les a placées sur une grille de cuivre et on les a colorées dans de l'acétate d'uranyle à 5 % pendant 30 à 45 minutes, avant coloration dans du citrate de plomb Reynolds pendant 3 à 4 minutes. Les coupes ont été observées au microscope électronique par transmission JEOL lOOCXII travaillant à 80 kV.

Autres plants
Bien que l'exemple spécifique de l'invention, décrit ci-dessus, mette en jeu le plant Arabidopsis thaliana et les gènes provenant d'Alcaligenes eutrophusr l'invention présente une utilité générale. Les revendications concernant la production du polyhydroxybutyrate et/ou d'un polyhydroxyalcanoate chez les végétaux n'est pas limitée à Arabidopsis thaliana, ou ne sont pas liées d'une manière spécifique à l'utilisation de gènes provenant d'alcaligenes eutrophus.

Les revendications données ci-après décrivent un procédé général de production d'un polyhydroxyalcanoate chez les végétaux par introduction d'un matériel d'ADN étranger dans les cellules végétales. Ces végétaux comprennent les végétaux mentionnés ci-dessus et par exemple la carotte, le tournesol, le tabac, la tomate et la pomme de terre.

Les semences provenant de différentes lignées végétales ont été déposées au titre du Traité de Budapest auprès de l'American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive,
Rockville, Maryland 20852. Ces lignées comprennent RedD-3A (ATCC 75044) contenant le gène de l'acétoacétyl-CoAreductase ; S8-1-2A (ATCC 75043) contenant le gène de la
PHB-synthase et T4-2A (ATCC 75042) contenant le gène de la 3-cétothiolase. Les gènes sont tous présentés dans la séquence N" 1.

La description spécifique ci-dessus n'est donnée qu'à titre d'illustration de la présente invention, et il est prévu que la présente invention ne soit limitée que par les revendications ci-après.

ANNEXE 1 (1) RENSEIGNEMENT D'ORDRE GENERAL (i) Demandeurs : Chris Somerville, Yves Poirier, Dou
glas Dennis (ii) Titre de l'invention : Matériels Végétaux Transgé
niques Produisant des Polyhydroxyalcanoates (iii) Nombre de séquences : 1 (iv) Adresse postale (A) Destinataire : Ian C. McLeod (B) Adresse : 2190 Commons Parkway (C) Ville : Okemos (D) Etat : Michigan (E) Comté : Ingham (F) Code postal : 48864 (v) Forme lisible par un ordinateur (A) Type de support : Disquette 5,25 pouces, mémoire
360 kO (B) Ordinateur : IBM AT (C) Système d'exploitation : MS-DOS (version 4) (D) Logiciel : Wordperfect 5.1 (viii) Renseignements sur l'agent/le mandataire (A) Nom : Ian C. McLeod (B) Homologation N" : 20 931 (C) Numéro de référence/dossier : MSU 4.1-131 (ix) Renseignements relatifs aux télécommunications (A) Téléphone : (517) 347-4100 (B) Téléfax : (517) 347-4103 (2) Renseignements pour la séquence N" 1 (i) Caractéristiques de la séquence (A) Longueur : 4980 paires de base (B) Type:peptides précurseurs codés d'acides nucléiques (C) Nombre de brins : deux (D) Topologie : linéaire (ii) Type de molécule (A) Description : ADN génomique (iii) Eléments hypothétiques : aucun (iv) Non sens : aucun (vi) Source originale (A) Organisme : Alcaligenes eutrophus (vii) Source immédiate (A) Bibliothèque : génomique (xi) Description de la séquence : séquence N" 1 (voir
Figure 2).

Claims (18)

Revendications

1. Matériel végétal transgénique contenant un ADN étranger conduisant à la production d'un polyhydroxyalcanoate, daoeis lequel le polyhydroxyalcanoate est préférentiellement un polyhydroxybutyrate.

2. Matériel végétal selon la revendication 1, caractérisé en ce que la séquence de l'ADN et la séquence de l'ARN permettant la production des enzymes conduisant à la synthèse du polyhydroxybutyrate ressortent de la séquence N" 1.

3. Matériel végétal transgénique contenant un ADN étranger codant un peptide qui présente une activité de 3cétothiolase, dans lequel l'ADN est préfrentiellement un cadre de lecture ouvert compris entre 2696 et 3877 de la sequence N" 1.

4. Matériel végétal transgénique contenant un ADN étranger codant l'activité d'acétoacétyl-CoA-réductase, caractérisé de préférence en ce que l'ADN est un cadre de lecture ouvert compris entre 3952 et 4692 de la séquence N" 1.

5. Matériel végétal transgénique contenant un ADN étranger codant un polypeptide, caractérisé en ce que ce polypeptide présente une activité de PHA-synthase.

6. Matériel végétal transgénique contenant un ADN étranger codant une ou plusieurs enzymes conduisant à la synthèse d'un polyhydroxyalcanoate à partir d'hydroxyalkyl

CoA, caractérisé de préférence en ce que l'ADN est un cadre de lecture ouvert entre 842 et 2611 de la séquence N" 1.

7. Matériel végétal transgénique contenant un ADN étranger codant une ou plusieurs enzymes, caractérisé en ce que ces enzymes catalysent la synthèse de I'hydroxyalkyl-

CoA.

8. Matériel végétal transgénique contenant un ADN étranger codant une ou plusieurs enzymes, caractérisé en ce que ces enzymes conduisent à la production d'acétoacétyl-CoA à partir de produits codés par 1'ADN étranger.

9. Matériel végétal selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, caractérisé en ce qu'il se présente sous la forme d'une semence ou du propagule de la semence.

10. Procédé pour introduire un ADN étranger codant des polypeptides qui conduisent à la synthèse d'un polyhydroxyalcanoate dans un végétal, caractérisé en ce qu'il comprend

- l'introduction dans deux plants d'ADN étrangers codant une ou plusieurs enzymes différentes intervenant dans un processus réactionnel conduisant à une polymérisation de 1 'hydroxyalkyl-CoA par la polyhydroxyalcanoate-synthase,

- l'appariement par fertilisation sexuée des deux plants ne produisant pas de polyhydroxyalcanolate, pour produire le végétal codant le polyhydroxyalcanoate, de préférence le polyhydroxybutyrate.

11. Procédé selon la revendication 10, caractérisé en ce que le polyhydroxyalcanoate se trouve dans les granules des cellules du végétal.

12. Segment génétique, caractérisé en ce qu'il est contenu dans une semence déposée sous la désignation ATCC 75042, et contenant un ADN codant le gène de la 3cétothiolase.

13.Végétal contenant le segment génétique selon la revendication 12, caractérisé de préférence en ce que le végétal est Arabidopsis thaliana.

14. Segment génétique caractérisé en ce qu'il est contenu dans une semence déposée sous la désignation ATCC 75044 et contenant un ADN codant le gène de l'acetoacetyl-CoA- réductase.

15. Végétal contenant le segment génétique selon la revendication 14, caractérisé de préférence en ce que le végétal est Arabidopsis thaliana.

16. Segment génétique, caractérisé en ce qu'il est contenu dans une semence déposée sous la désignation ATCC 75043 et contenant un ADN codant le gène de la PHB-synthase.

17. Végétal contenant le segment génétique selon la revendication 16, caractérisé de préférence en ce que le végétal est ArabidoPsis thaliana.

18.Matériel végétal transgénique,caractérisé en ce qu'il contient un ADN étranger codant une ou plusieurs enzymes conduisant à la production de 3-hydroxybutyryl-CoA à partir de produits codés par l'ADN étranger.