JPH06509233A

JPH06509233A - ポリヒドロキシアルカノエートを生産するトランスジェニック植物

Info

Publication number: JPH06509233A
Application number: JP5502866A
Authority: JP
Inventors: サマービル，クリストファー　ローランド; ポアリエ，イブ; デニス、ダグラス　エドワード
Original assignee: ミシガン、ステート、ユニバーシティー
Priority date: 1991-07-19
Filing date: 1992-07-13
Publication date: 1994-10-20
Anticipated expiration: 2020-09-14
Also published as: NZ243626A; EP0595896A4; EP0595896B1; NL195045C; CZ10894A3; DE69233512D1; FI940242A; PL295350A1; FR2679735B1; US5650555A; HU9400145D0; WO1993002187A1; MX9204245A; PL170467B1; ITMI921750A0; FR2679735A1; ES2046142B1; PT100705A; SK6494A3; JP3696233B2

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】ポリヒドロキシアルカノエートを生産するトランスジェニック植物発明の分野本発明はある種の遺伝情報物質、すなわちタンパク質様物質をコードする遺伝子および／またはその生産を調節しまたはそれに影響を与える遺伝子を含むＤＮＡの高等植物の細胞への導入および発現、および遺伝学的に形質転換した細胞からの稔性植物の再生に関する。このような遺伝学的介入の目的は、ヒドロキシ酸の線形ポリエステルからなるポリマー性物質を合成する能力を微生物から高等植物へと移すことである。この種の物質は、通常はポリヒドロキシアルカノエートと呼ばれている。本明細書に示される具体例は、ポリヒドロキシブチレート（Ｐ　ＨＢ）の生産である。

発明の背景細菌の多くの種は、炭素貯蔵物として働くヒドロキシアシルモノマーからなるポリエステルの顆粒を蓄積する。

細菌性のポリヒドロキシアルカノエートの発生、代謝、代謝上の役割、および、産業上の用途が最近になって再検討されている（　Ａｎｄｅｒｓｏｎ、　Ａ、およびＤａｖｅｓ、　Ｅ、Ａ、、Ｍｌｃｒｏｂｆｏｆ、　Ｉ？ｅｖ、、　５４：　４５０−４７２　（１９９０）　）　、この種の最も一般的に見られる化合物は、ポリ（Ｄ　（−）　−３−ヒドロキシブチレート）である。しかしながら、幾つかの種では、３−ヒドロキシペンタノエートのような異なるヒドロキシアルカノエートのコポリマーを蓄積する（　Ｍａｌ　ｆｅｎ、　Ｌ、Ｌ、およびＲｏｈｗｅｄｄｅｒ、Ｗ、に、、Ｅｎｖｉｒｏｎ、　Ｓｃｌ。

Ｔｅｃｈｎｏｌ、、８：　５７６−５７９　（１９７４））　、少なくとも１１種類の短鎖の３−ヒドロキシ酸が、海洋堆積物がらのポリマーの成分として見出されている。Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ　ｅｕｔｒｏｐｈｕｓにおけるポリヒドロキンアルカノエートの生産を検討することにより、グルコースだけを炭素源として用いる培地で細菌を培養すると、ＰＨＢだけが蓄積されることが明らかになっている。しかしながら、グルコースとプロピオン酸とを炭素源として供給すると、細菌は３−ヒドロキシペンタノエートと３−ヒドロキシブチレートのランダムコポリマーを蓄積する（　Ｈｏｌｍｅｓ、　Ｐ、Ａ、、Ｐｈｙｓ　。

Ｔｅｃｈｎｏｌ、、　１Ｓ：　３２−３８　（ＩＨ５）　；　Ｉ（ｏｌｇｅｓ、　Ｐ、Ａ、、　Ｗｒｊｇｈｔ。

Ｌ　、　ｐ　、およびＣｏｆｆ１ｎｓ、　Ｓ、Ｈ，、欧州特許第００６９４９７号明細書、１９８３年１月および第００５２４５９号明細書、１９８５年１２月）。更に、Ａ、　ｅｕｔｒｏｐｈｕｓを様々な他の炭素源と共に供給すると、４ −ヒドロキシブチレートおよび５−ヒドロキシバレレートモノマーを含むポリエステルが産生される（Ａｎｄｅｒｓｏｎ、　Ａ、Ｊ、およびＤａｖｅｓ　。

Ａ、Ｅ、　、旧ｃｒｏｂ１ｏ１．Ｒｅｖ、、　５４：　４５０−４７２　（１９９０）の第１表）。このように、ポリマーの組成は、モノマーがらポリマーへの合成を触媒する酵素に対して代替基質を利用することができれば、ある程度まで調節されると思われる。

ＰＨＢは、細菌細胞中に直径が約０，２４〜０．５μｍの顆粒とて蓄積される。

ＰＨＢモノマーの分子量の測定値に基づいて、それぞれの顆粒は最低でも１，０００本のポリマー鎖を有するものと算定されている。これらの顆粒は、脂質およびタンパク質を顆粒重量のそれぞれ約０．５および２％含んでなる皮膜を有するものとされている（Ａｎｄｅｒｓｏｎ、　Ａ、およびＤａｖｅｓ、　Ｅ、＾、　、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、　Ｒｅｖ、。

５４：　４５０−４７２　（１９９０））。ＰＨ８合成酵素の活性は、この膜と関連しているものと考えられる。顆粒内部のＰＨＢの状態はほとんど解明されていない。最近の報告によれば、顆粒内部のポリマーは非晶質状態であることが示唆されている。任意の生物体でのＰＨＢＩＩ粒の大きさを調節するものは、知られていない。

はとんどの生物において、ＰＨＢは、３−ケトチオラーゼ（アセチル−ＣｏＡアセチルトランスフェラーゼ；ＥＣ２，３，１，９）　、アセトアセチル−ＣｏＡレダクターゼ（ヒドロキシブチリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ；ＥＣ１，１，１，３６）およびポリ（３−ヒドロキシブチレート）シンターゼによって触媒される連続して起こる三反応によって、アセチル補酵素Ａ（アセチル−ＣＯＡ）から合成される。反応経路を第１図に示す。

Ｒｈｏｄｏｓｐｉｒｉｌｌｕｗ　ｒｕｂｒｕｇでは、ＰＨＢはＬ　（＋）　−３ −ヒドロキシブチリル−ＣｏＡのクロトニル−ＣｏＡを介したＤ　（−）　−３ −ヒドロキシブチリル−ＣｏＡへの転換によって合成される。３−ケトチオラーゼは、様々なＰＨ８合成細菌から精製されており、数種の高等植物で検討が行われてきた。高等植物でのこの酵素の役割は、アセトアセチル−ＣｏＡを産生してメバロネートを生産すること並びに脂肪酸の分解にあると考えられている。

アセトアセチル−ＣｏＡレダクターゼは、多数のＰＨ８合成細菌で検出されている。＾、　ｅｕｔｒｏｐｈｕｓのような数種は、基質特異性および補助因子要件に関して異なる２種類のイソ酵素を有すると思われる。Ａ、　ｅｕｔｒｏｐｈｕｓのＮＡＤＨレダクターゼは０４〜Ｃｌ０Ｄ　（−）−およびＬ（＋）−３−ヒドロキシアセチル−ＣｏＡで活性であるが、ＮＡＤＰＨレダクターゼはＣ４およびＣ５Ｄ（−）−３−ヒドロキシアセチル−ＣｏＡのみで活性である。

この種類の酵素は、高等植物で報告されたことはない。

ＰＨＢシンターゼ活性は、成長条件によっては、ＰＨＢ蓄積細菌に可溶性酵素としても顆粒結合活性としても検出されている。いずれの形態の酵素も部分的には精製されているが、不安定であるため均質になるまで精製されてはいない。＾、　ｅｕｔｒｏｐｈｕｓのＰＨＢシンターゼはＤ（−）−鏡像異性体に特異的であり、３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡて試験したところ、Ｃ４およびＣ５基質だけで活性であり、Ｃ４およびＣ５の３−ヒドロキシ酸モノマー単位だけがこの生物によってポリマー中に取り込まれるという観察と一致している。ＰＨＢシンターゼの作用機構は未だ解明されていない。このシンターゼによる連鎖移動の役割によって、場合によっては所定の生物に特徴的な生成するポリマーの分子量が制御されると思われる。

ＰＨＢシンターゼ活性は、植物では報告例はない。

いくつかの研究者グループが、独立に＾、　ｅｕｔｒｏｐｈｕｓによるＰ）ｔＢの生合成に関与する遺伝子をＥ、　ｃｏｌｔでクローニングして発現させた（　５ｌａｔｅｒ、　Ｓ、Ｃ，ら、Ｊ、　Ｂａｃｔｅｒｌｏｌ、、　１７０：　４４３１−４４３８　（１９Ｈ）　；　５ｃｈｕｂｅｒｔ、　Ｐ。

ら、Ｊ、　Ｂａｅｔｅｒ−１ｏｆ、、　１７０：　５８３７−５８４７　（１９８８）　）。

＾、　ｅｕｔｒｏｐｈｕｓ由来の５．２　ｋｂｐのフラグメントを有するＥ、　ｃｏｉｌの組換え株は、細胞内顆粒としてＰＨＢをかなりの量蓄積することができた。５．２　ｋｂｐフラグメントのヌクレオチド配列も、２つのグループによって独立に決定された（　Ｊａｎｅｓ、　Ｂ、Ｂ、ら、Ｄａｖｅｓ、　Ｅ、Ａ、（監修）Ｎｏｖｅｌ　Ｂｉｏｄｅｇｒａｄａｂｌｅ　Ｍｉｃｒｏｂｌａｌ　ＰｏｌｙｍｅｒｓＳＫｌｕｖｅｒＡｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ、　１７５−１９０頁（１９９０年）；Ｐｅｏｐｌｅｓ、　Ｏ，Ｐ、および５１ｎｓｋｅｙ、　Ａ、Ｊ、　、Ｊ、　Ｂｌｏｌ、Ｃｈｅｓ、。

２θ４：　１５２９３−１５２９７　（１９ｇ９）　；　Ｐｅｏｐｌｅｓ、　０．Ｐ、および５ｉｎｓｋｅｙ、＾、Ｊ、　、　Ｊ、Ｂｌｏｌ、Ｃｈｅｗ、、２８４：　１５２９ｇ−１５３０３（１９８９））。遺伝学的な補完的研究に基づく証拠と共にオーブンリーディングフレームの推定されたアミノ酸配列を解析することにより、５．２　ｋｂｐフラグメントはＰＨＢの生産に必要な３種類の酵素をコードする３個の緊密に連結した遺伝子を含んでいることが明らかになった。

このクローニングした遺伝子を用いて細菌中に生合成酵素を過剰生産させることに関する特許が出願されている（　Ｐｅｏｐｌｅｓ、　０．Ｐ、および５１ｎｓｋｅｙ、　Ａ、Ｊ、　、ＷＯ８９１００２０２号明細書、１９８９年１月）。

ある種の細菌は、酵素を分泌し、ＰＨＢおよび関連したポリヒドロキシアルカノエートを分解する能力を有する（　Ａｎｄｅｒｓｏｎ、　Ａ、およびＤａｖｅｓ、　Ｅ、Ａ、により概説、Ｍｌｃｒｏｂｉｏｌ、　Ｒｅｖ、、　５４：　４５０ −４７２　（１９９０）　）　、多くの自然環境ではこれらの細菌種が広く存在するため、ＰＨＢは土壌および活性化スラッジ中で速やかに分解される。従って、ＰＨＢおよび関連したポリヒドロキシアルカノエートは、再生可能な生分解性の熱可塑性プラスチック源として興味深いものである。細菌の大規模培養によるＰＨＨの工業的生産は、１９８２年に開始された。この方法で生産されたＰＵＢは、ＩＣＩによりＢｉｏｐｏｌの商品名で発売されている。しかしながら、細菌の多量な培養物の生育および回収には費用が掛かるため、ＰＨＢは多くの種の高等植物で高水準にまで蓄積される澱粉のようなポリマー性物質と比較すると、生産には遥かに費用が掛かる。それ故、遺伝子工学によりＰＨＢを蓄積する高等植物の系統を作成するのが有利であると思われる。

図面および表の簡単な説明第１図はポリヒドロキシブチレート（Ｐ　ＨＢ）を生産するための生化学的経路を示す。Ａ、　ｅｕｔｒｏｐｈｕｓでは、ＰＨＢは３種類の酵素、すなわちアセチル−ＣｏＡをアセトアセチル−ＣｏＡに転換する３−ケトチオラーゼ、アセトアセチル−ＣｏＡをＤ　（＝）　−３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡに転換するアセトアセチル−ＣｏＡレダクターゼおよびＤ　（−）　−３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡをポリヒドロキシブチレートに転換するＰＨＢシンターゼの連続的作用により生産される。植物および動物では、アセトアセチル−ＣｏＡはメバロネートの産生の前駆体である。

第２図はＡ、　ｅｕｔｒｏｐｈｕｓ由来のＰＨＢオペロンのヌクレオチド配列を示す。この配列は、Ｊａｎｅｓ、　Ｂ、、　Ｈｏ１ｌａｒ。

Ｊ、およびＤｅｎｎｉｓ、　Ｄ、により得られた（　Ｄａｖｅｓ、　Ｅ、Ａ。

（監修）　、Ｎｏｖｅｌ　Ｂｉｏｄｅｇｒａｄａｂｌｅ　Ｐｏ１ｙｓｅｒｓｓ　ＫｌｕｗｅｒＡｃａｄｅｓｉｃ　Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ％１７５−１９０頁（１９９０年））。

ヌクレオチド８４２から２６１１までのオープンリーディングフレームはＰＨＢシンターゼ（ｐｈｂＣ遺伝子）をコードする（アミノ酸８１〜５５８９）。ヌクレオチド２６９Ｂから３８７７までのオープンリーディングフレームは、酵素３ −ケトチオラーゼ（ｐｈｂＡ遺伝子）をコードする（アミノ酸Ｔ１〜Ｔ３９３）。ヌクレオチド３９５２から４８９２までのオーブンリーディングフレームは、酵素アセトアセチル−ＣｏＡレダクターゼ（ｐｈｂＢ遺伝子）をコードする（アミノ酸Ｒ１〜Ｒ２４６）　、制限酵素Ｄｄｅｌ、ＢｓｔＢＩ　ｓ　Ｐｓｔｌ。

Ｓａｃ　ｌおよびＴｔｈｌｌｌｌに対する配列を下線を引いて示す。

これらの制限酵素を用いて、ｐｈｂ遺伝子をサブクローニングした。

第３図はプラスミドｐＵｃ−ＴＨＩＯおよびｐＢＩ−ＴＨＩＯの構築に関する段階を模式的にまとめたものである。この後者のプラスミドの目的は、Ａ、　（ｕ１ｒｏｐｈｕｓ由来の３−ケトチオラーゼ遺伝子をＣａＭＶ３５９プロモーターの転写制御下に置き、高等植物で転写されるようにすることである。最上段の図は、Ａ、　ｅｕｔｒｏｐｈｕｓＰ　ＨＢオペロンを、ＰＨＢシンターゼ、３−ケトチオラーゼおよびアセトアセチル−ＣｏＡレダクターゼをコードするオーブンリーディングフレームの近似的位置と共に示している。横矢印は転写の方向を示している。最下段の図はｐＢ１１２１由来のプラスミドの主成分である、ＮＰＴＴＩ　、すなわちカナマイシン耐性をコードするネオマイシンホスホトランスフェラーゼ１１遺伝子；　ＣａＭＶ３５Ｓ　、すなわちカリフラワーモザイクウィルス３５Ｓプロモーター；　ｐｏ＋ｙＡ、すなわちポリアデニル化配列、　ＲＢ、すなわちＴ−ＤＮＡの右境界配列；およびＬＢ、すなわちＴ−ＤＮＡの左境界配列を示す。最下段の図は縮尺通りには表わしていない。制限酵素部位に対する略号は下記の通りである：　Ｄ、　Ｄｄｅｌ　；　Ｐ、　Ｐｓｔｌ　；Ｂ、　ＢｓｔＢＩ；Ｔ、　Ｔｔｈｌｌｌｌ；ＢＨ，Ｂａｍｔ（Ｉ　；Ｓ、　５ａｃｌ　；Ｈ，Ｈｌｎｄｌｌｌ。

第４図はプラスミドｐＵＣ−８ＹＮおよびｐＢＩ−８ＹＮの構築に関する段階を模式的にまとめたものである。この後者のプラスミドの目的は、Ａ、　ｅｕｔｒｏｐｈｕｓ由来のＰＨＢシンターゼ遺伝子をＣａＭＶ３５Ｓプロモーターの転写制御下に置き、高等植物で転写されるようにすることである。図および略号は、第３図に記載している。

第５図はプラスミドｐＵｃ−ＲＥＤおよびｐＢＩ−ＲＥＤの構築に関する段階を模式的にまとめたものである。この後者のプラスミドの目的は、Ａ、　ｅｕｔｒｏｐｈｕｓ由来のアセトアセチル−ＣｏＡレダクターゼ遺伝子をＣａＭＶ１５Ｓプロモーターの転写制御下に置き、高等植物で転写されるようにすることである。最上段および最下段の図および略号は、第３図に記載されている。中段の図は、アセトアセチル−ＣｏＡレダクターゼ遺伝子領域を拡大したものである。

ＰＣＲプライマー＃１および＃２の位置および配列が示されている。ＰＣＲプライマーの３′末端における最後のヌクレオチドは第２図のヌクレオチド３９５２に対応し、レダクターゼ遺伝子に対する開始コドンの最初のヌクレオチドである。ＰＣＲ＃２の３′末端における最後のヌクレオチドは、第２図のヌクレオチド４７０８に相補的である。ＰＣＲプライマーによって作成された追加のＢａ層旧およびＫｐｎ　Ｉ制限酵素部位が示されている。

第６図は、形質転換されていないコントロールおよびトランスジェニックＡ、　ｔｈａｌｌａｎａ植物のサザンプロット分析を示す。形質転換されていないＡ、　ｔｈａｌｌａｎａ　Ｒｓｃｈｅｖ種およびトランスジェニック植物由来のゲノムＤＮＡ１ｇを制限酵素旧ｎｄ　Ｉ　１１で消化し、フラグメントをアガロースゲル電気泳動によって分離して、ナイロン膜に移した。フィルターを、遺伝子（Ａ）　ｐｈｂ＾、（Ｂ）　ｐｈｂＢおよび（Ｃ）　ｐｈｂｃ由来の３２Ｐを標識したＤＮＡフラグメントに／％イブリダイゼーションした。分析を行ったゲノムＤＮＡは、野生型Ａ、　ｔｈａｌｌａｎａ　Ｒｓｅｈｅｖ種（レーンａ）およびトランスジェニックＴ４−３Ａ　（レーンｂ）　、Ｔ３−２Ａ　（レーンｃ　）　、Ｔ４−２Ａ　（レーンｄ　）　、Ｔ４−３Ｂ　（レーンｅ　）　、ＲｅｄＢ −２Ｇ（レーンｆ　）　、ＲｅｄＢ−２Ｂ　（レーンｇ　）　、ＲｅｄＢ−２Ｅ（レーンｈ　）　、ＲｅｄＢ−２０（レーンｉ　）　、ＲｅｄＤ３Ａ　（レーンｊ　）　、　ＲｅｄＢ−２Ａ　（レーンｋ　）　、ＲｅｄＢ−２０（レーンｌ）、５１２−３Ａ　（レーンｍ）　、８８−１．−２０（レーンｎ　）　、５８− １−２Ａ（レーン０）および５８ＰＵＣ−２Ｂ　（レーンｐ）である。左側の数値は、キロ塩基対での長さである。

第７図は、形質転換していないコントロールおよびトランスジェニックＡ、　ｔｈａｌｉａｎａ植物のノザンプロット分析を示している。野生型Ａ、　ｔｈａｌｉａｎａ　Ｒｓｃｈｅｖ種由来のＲＮＡ（１０Ｐｇ）とトランスジェニック植物由来のＲＮＡ（２０Ｐｇ）との総ＲＮＡを、ホルムアルデヒド含有アガロースゲル中で電気泳動によって分離して、ナイロン膜に移した。フィルターを遺伝子（＾）　ｐｈｂ＾、（Ｂ）ｐｈｂＢオヨヒ（Ｃ）ｐｈｂｃ由来ノ３２Ｐヲ標識シタＤＮＡフラクメントにハイブリダイゼーションした。分析を行ったＲＮＡは、植物：　Ｔ３−２Ａ　（レーンａ　）　、Ｔ４−２Ａ　Ｃレーンｂ）　、Ｔ４−３Ｂ　（レーンｃ　）　、Ｔ４−３Ａ　（レーンｄ）、野生型Ａ、　ｔｈａｌｉａｎａ　（レーンｅ、ｊおよびｒ　）　、５ＩＩＰＵＣ−２８（Ｌ／　−ンｆ　）　、５Ｒ−１−２（レーンｇ　）　、５Ｌ２−３Ａ　（レーンｈ）　、５８−１ −２Ａ　（レーンｉ　）　、ＲｅｄＢ−２０（レーンｋ）、ＲｅｄＢ−２Ｅ　（レーン１　）　、ＲｅｄＢ−２Ｇ　（レーンｍ）、ＲｅｄＢ−２Ａ　（レーンｎ　）　、ＲｅｄＢ−ＩＢ　（レーン。）、ＲｅｄＢ−２Ｃ（レーンｐ）およびＲｅｄＤ−３Ａ　（レーンｑ）由来のものである。数値は、キロ塩基対での長さである。

第８図は、精製したＰＨＢおよび植物抽出物のガスクロマトグラフィ　（Ｇ　Ｃ）を表わしている。形質転換していない野生型の＾、　ｔｈａｌｉａｎａ　Ｒｓｃｈｅｖ種（Ｂ）およびトランスジェニック植物５８−１−２ＡとＲｅｄＢ−２０（Ｃ）とのＦ１ハイブリッドからの葉のクロロホルム抽出物のエステル交換したもののＧＣスペクトルを、市販のＰＨＨのエステル交換したもの（Ａ）のクロマトグラムと比較した。矢印は、エチル−ヒドロキシブチレートビークの位置を示す。

第９図は、ＰＨＢ標準品と植物抽出物がらのＰＵＢから製造したエチル−ヒドロキシブチレートのガスクロマトグラフィーマススペクトル分析を示す。（Ａ”）市販のＰＵＢのエステル交換したもののマススペクトル；　（Ｂ）エチル−ヒドロキシブチレートと同じ保持時間を有する９ｇ−１−２ＡとＲｅｄＢ−２ＣとのＦ１ハイブリッドの葉のりｏ。

ホルム抽出物からのＧＣビークのマススペクトル（第８Ｃ図に示した通り）。

第１０図は、ＰＨＢ陽性のトランスジェニック＾、　ｔｈａｌｌａｎａ植物の葉および種子の透過型電子顕微鏡写真（ＴＥＭ）を示す。トランスジェニック植物８Ｂ−１−２Ａおよび５８−１−２Ｃを、トランスジェニック植物ＲｅｄＢ−２ＤまたはＩ？ｅｄＢ−２Ａと交配した。生じるＦ１種子を土壌に播種し、２〜３週齢の植物の葉の試料をＴＥＭによって分析した。幾つかのＦ１種子を水に２４時間浸漬し、胚を種皮から切除し、子葉をＴＥＭによって分析した（電子顕微鏡写真ｆ）。（ａ）核における電子半透明（ｅｌｅｃｔｒｏｎ−Ｉｕｃｅｎｔ）　１１粒の凝集を示すＲｅｄＢ−２Ｄと５８−１−２ＡとのＦ１ハイブリッドからの２個の隣接した葉肉細胞。（ｂ）顕微鏡写真ａに示された右上方の細胞の核の高倍率写真。

（ｃ）　８粒の凝集を示すＲｅｄＢ−２Ｄと５８−１−２ＡとのＦ１ハイブリッドからの葉肉細胞の核。（ｄ）核（Ｎ）と液胞（ｖ）における電子半透明（ｅｌｅｃｔｒｏｎ−１ｕｃｅｎｔ）顆粒を示すＲｅｄＢ−２Ａと３８−１−２ＡとのＦ１ハイブリッドからの葉肉細胞。

（ｅ）細胞質における電子半透明（ｅｌｅｃｔｒｏｎ−１ｕｃｅｎｔ）顆粒を示すＲｅｄＢ−２Ａと５８−１−２ＡとのＦ１ハイブリッドからの葉肉細胞。（「）核における顆粒を示すＲｅｄＢ−２Ａと５８−１．−２ＣとのＦ１ハイブリッドからの子葉細胞。矢印は電子半透明（ｅｌｅｃｔｒｏｎ−１ｕｃｅｎｔ）顆粒の凝集を示す。棒線−顕微鏡写真ａＳｂ、ｃ、ｄおよびｆでは１μｍ０棒線−顕微鏡写真ｅでは、０．２５μｍ０発明の概要本発明は、ポリヒドロキシアルカノエートを産生ずる異種ＤＮＡを含むトランスジェニック植物性物質に関する。

本発明は、３−ケトチオラーゼ活性を示すペプチドをコードする異種ＤＮＡを含むトランスジェニック植物性物質にも関する。

本発明は、アセトアセチル−ＣｏＡレダクターゼ活性を示すペプチドをコードする異種ＤＮＡを含むトランスジェニック植物性物質にも関する。

本発明は、異種ＰＵＢシンターゼ活性を示すペプチドをコードする異種ＤＮＡを含むトランスジェニック植物性物質にも関する。

本発明は、ポリヒドロキシアルカノエートの合成に必要なタンパク質をコードする細菌ＤＮＡを植物に導入する方法であって、ＰＨＢを生産しない二種類の植物を有性生殖によって交配することを含んでなり、それぞれの植物は、ポリヒドロキシアルカノエートシンターゼによってヒドロキシアルキル−ＣｏＡの重合して、ポリヒドロキシアルカノエートをコードする植物を生産させる経路における一種類以上の異なる酵素をコードする異種ＤＮＡを含んでなる方法に関する。

従って、本発明はＰＨＢまたは関連のポリヒドロキシアルカノエートを生産し、蓄積する遺伝学的に修飾した高等植物を生産する方法を提供する。一つの態様では、ＰＨＢ産生植物は、酵素、アセトアセチル−ＣｏＡレダクターゼ（ヒドロキシブチリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ）およびポリ（３−ヒドロキシブチレート）シンターゼをコードする細菌の遺伝子をＴｉ−プラスミドを介した形質転換によって植物に安定に導入することによって得られる。細菌の遺伝子は通常は植物細胞に転写されないので、遺伝子を修飾して、植物細胞への転写を誘発するＤＮＡ配列（すなわち、「プロモーター」）によって転写制御されるようにする。遺伝子は、これらの遺伝子の非コード３′−領域に適当なりＮＡ配列を加えることによっても修飾され、植物細胞中に産生ずる転写体が適当にポリアデニル化されるようにする。

本発明の一つの態様では、ＰＨＢ産生植物は、ＰＵＢを生産しない２種類の親ラインの間で交配することによって得られる。これは、修飾したＰＨＢシンターゼ遺伝子の異所性コピーに対してホモ接合性のトランスジェニック植物ラインと、修飾したアセトアセチル−ＣｏＡレダクターゼ遺伝子の異所性コピーに対してホモ接合性のトランスジェニック植物とを交配することによって行われる。本明細書において、「異所性遺伝子」という用語は生物体に通常は存在しないが、遺伝子形質転換によってゲノムに安定に組込まれている遺伝子を表わす。異所性コピーに対してホモ接合性であるとは、二倍体止物において、いずれの相同染色体も染色体の同じ場所に組込まれた異所性遺伝子を有することを意味する。

発明の詳細な説明本発明の説明を行う前に、以後に用いられるある種の用語の定義を説明するのが有用である。

形質転換とは、何んらかの手段によってＤＮＡを安定に導入することによってレシピエンド生物の遺伝子型を変化させる方法を意味する。

トランスジェニック植物は、通常はその種には存在しないが形質転換によって導入されるＤＮＡ配列を含む植物である。

転写とは、ＤＮＡに含まれる遺伝情報に従ったＲＮＡ鎖の形成を意味する。

翻訳とは、ｍＲＮＡ分子における遺伝情報をタンパク質合成の際に特異的なアミノ酸の順序を指示する方法を意味する。

プロモーターは遺伝子物質の転写を引き起こすＤＮＡフラグメントである。本明細書においては、プロモーターは植物細胞において転写を行うＤＮＡフラグメントを表わすのに用いられる。ＣａＭＶ３５Ｓプロモーターは、多くの種の高等植物の多くの異なる組織で比較的高水準の転写を引き起こすカリフラワーモザイクウィルスからのＤＮＡフラグメントである（　Ｂｅｎｆｅｙ、　Ｐ、Ｎ、およびＣｈｕａ。

Ｎ、Ｈ，，５ｃｉｅｎｃｅ、　２５０：　９５９−９６６　（１９９０））。

ポリーＡ付加部位は、所定の酵素に特異的部位でｍＲＮＡを開裂させ、アデニル酸残基の配列をｍＲＮＡの３′末端に付加させるヌクレオチド配列である。

ｐｈｂｃＳｐｈｂ＾、ｐｈｂＢは、それぞれＰＨＢシンターゼ、３−ケトチオラーゼおよびアセトアセチル−ＣｏＡレダクターゼについてＡ、　ｅｕｔｒｏｐｈｕｓ遺伝子に与えた遺伝子記号である（　Ｐｅｏｐｌｅｓ、　０．Ｐ、および５ｌｎｓｋｅｙ、　Ａ、Ｊ、、Ｊ、　Ｂｌｏｌ、　Ｃｈｅｗ、、　２８４：　１５２９８−１５３０３　（１９８９）　）。

トランスジェニック植物の子孫を記載するのに、ＤＮＡの導入を行ってから幾世代の自家受粉を経過したかを表わす決まりを採用するのが有用である。本明細書では、最初の形質転換体を１０世代と表わす。この世代の自家受粉から生じる子孫をＴ１世代などと表わす。

２種類の別の親植物の交配の場合には、最初に交配したものから生じる子孫を、Ｆ１世代と表わす。

以下に記載する実験はＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ　ｔｈａｌｌａｎａ　（Ｌ、）Ｈｅｙｎｈｏｌｄという植物種に関するものであるが、記載される方法は一般に形質転換の方法を利用できる任意の高等植物に応用することができる。同様に、本明細書に記載される方法はＡ、　６ｕｔｒｏｐｈｕｓ由来の遺伝子の使用に関するものであるが、また、記載される方法は一般にＰＨＢを合成することができる任意の生物由来の遺伝子の使用に応用することができる。記載される方法はＰＨＢの産生に関す・るものであるが、この手順は一般にポリヒドロキシアルカノエート（ＰＨＡ）シンターゼ（ＰＨＢシンターゼを含む）の活性によって微生物中に普通に生産される任意のポリヒドロキシアルカノエートであって、適当なヒドロキシアルキル−ＣｏＡ基質が特定の植物で生産される任意のポリヒドロキシアルカノエートの生産に応用することができることは明らかである。。

形質転換した植物の子孫におけるＰＨＢの生産には、下記のように一連の段階を完結することが必要である。

（１）プロモーター融合体を含む一連の細菌性プラスミドの構築、（２）これらのプラスミドのＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕ＋５ｔｕｓｅｒａｃｔｅｎｓへのトランスファー、（３）Ａ、　ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓを用いて、これらの遺伝子の植物（すなわち、この例ではＡ、　ｔｈａｌｉａｎａ　）の細胞への導入、（４）トランスジェニック植物の再生、（５）異所性遺伝子に対してホモ接合性である植物の選択、（６）形質転換した植物での異所性遺伝子の機能を解析して、確実にそれらを発現させ、遺伝子生成物を機能的にすること、（７）交配による２種類以上の異なる異所性遺伝子を含むハイブリツド植物の産生、（８）ＰＨＢの存在に対するハイブリッド物質の分析。これらの段階を、下記の項で詳細に説明する。

転写融合体の構築高等植物で細菌遺伝子の転写を行うには、細菌性遺伝子を植物プロモーターの付加により修飾して、遺伝子が高等植物に導入されたときに転写されるようにしなければならない。また、ポリーＡ付加部位を細菌性遺伝子の３′領域に付加して、高等植物でこれらの遺伝子を適性に発現させることも普通に行われる。これらの要因は、いずれもプラスミドｐＴＺ１８Ｕ−ＰＨＢ由来ノｐｈｂＣ，ｐｈｂＡオ、及びｐｈｂＢ遺伝子を二元ＴｉプラスミドベクターｐＢ１１２１（Ｃ１ｏｎｅｔｅｃｈ　％カリフォルニア）にクローニングすることによって満足される。

プラスミドｐＴＺ１８Ｕ−ＰｔｌＢに含まれるｐｈｂＣＳｐｈｂ＾およびｐｈｂＢ遺伝子のヌクレオチド配列を第２図に示す。クローニングに用いられる関連した制限酵素部位並びに３種類の遺伝子に対するオープンリーディングフレームと思われる部分を示す。

ＣａＭＶ３５Ｓ−ｐｈｂＡ遺伝子融合体は、プラスミドｐＴＺ１８Ｏ−ＰＨＢを制限酵素ＰｓｔｌおよびＤｄｅｌで消化することによって構築した。３−ケトチオラーゼ遺伝子のコード配列を含むＩＪ　ｋｂの制限フラグメントを、アガロースゲル電気泳動によって他のＤＮＡフラグメントから分離した。ＤＮＡフラグメントをＤＥＡＥセルロース膜を用いてアガロースから回収したＣ３ｃｈＩｅｉｃｈｅｒ　＆５ｃｈｕｅｌｌ　Ｎ＾−４５ＤＥＡＥ膜）。ＤＮＡフラグメントのジグザグ末端を、精製した制限フラグメントをＴ４ＤＮＡポリメラーゼおよびデオキシヌクレオチドトリホスフェートと共にインキュベーションすることによって充填した。次に、プラントフラグメントをプラスミドｐＵｃ１Ｂ中でＳ■ａ１部位にクローニングして、プラスミドｐＵｃ−ＴＨＩＯを産生させた。１．３　ｋｂの制限フラグメントをＢａｇ旧とＳａｃ　Ｉで消化することによってｐＵｃ− ＴＨＩＯプラスミドから取り出し、ＤＥＡＥセルロース膜を用いて電気泳動によって精製し、同じ２種類の酵素で予め消化しておいたプラスミドｐＢ１１２１に連結した。

ｐＢＩ−ＴＨＩＯと呼ぶ生成したプラスミドは、ＣａＭＶ３５ＳプロモーターおよびｐＢＩ１２１のポリーＡ付加部位に対して正確な配向で＾、ｅｕｔｒｏｐｈｕｓ　３−ケトチオラーゼ遺伝子を有することが見出され、高等植物で発現するものと思われた。

ｐＢＩ−ＴＨＩＯの構築に関する段階を模式的にまとめたものを、第３図として表わす。

ＣａＭＶ３５Ｓ−ｐｈｂＣ遺伝子融合体を、プラスミドｐＴＺ１８Ｕ−ＰＨ８を制限酵素ＢｓｔＢＩおよびＴｔｈｌｌｌｌで消化することによって構築した。ＰＨＢシンターゼのコード配列を含む１．９ｋｂの制限フラグメントを、アガロースゲル電気泳動によって他のＤＮＡフラグメントから分離した。ＤＮＡフラグメントを、ＤＥＡＥセルロース膜を用いてアガロースから回収した。ＤＮＡフラグメントのジグザグ末端を、精製した制限フラグメントをＴ４ＤＮＡポリメラーゼおよびデオキシヌクレオチドトリホスフェートと共にインキュベーションすることによって充填した。次に、ブラントフラグメントをプラスミドｐＵｃ１８中でＳｍａ１部位にクローニングして、プラスミドｐＵｃ−８ＹＮを産生させた。

１．９　ｋｂの制限フラグメントをＢａｍＨＩで完全消化しＳａｃ　Ｉで部分消化することによってｐＬＩｃ−８ＹＮから取り出し、ＤＥＡＥセルロース膜を用いて電気泳動によって精製し、同じ２種類の酵素で予め消化しておいたプラスミドｐＢ１１．２１に連結した。ｐＢＩ−８ＹＮと呼ぶ生成したプラスミドは、ＣａＭ■３５ＳプロモーターおよびｐＢ＋１２１のポリーＡ付加部位に対して正確な配向で＾、　ｅｕｔｒｏｐｈｕｓＰ　ＨＢシンターゼ遺伝子を有することが見出され、高等植物で発現するものと思われた。Ｉ）Ｂｌ−８ＹＮの構築に関する段階を模式的にまとめたものを、第４図として表わす。

ＣａＭＶ３５Ｓ−ｐｈｂＢ遺伝子融合体を、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）におけるプライマーに対する一対の合成オリゴヌクレオチドを用いてプラスミドｐＴＺ１８Ｕ−ＰＨＢ由来のｐｈｂＢ遺伝子を増幅することによって構築した。オリゴヌクレオチドブライマーの配列を第５図に示すが、それらはＰＣＲプライマー＃１およびＰＣＲプライマー＃２と表わされる。オリゴヌクレオチドは、増幅したＤＮＡ配列がコード配列の５′末端近くに合成りａｓ８１部位を、配列の３ ′末端に合成Ｋｐｎ　１部位を含む様にデザインした。

ポリメラーゼ連鎖反応の７９０塩基対の生成物をアガロースゲルで分離して、精製し、Ｂａ■旧およびＫｐｎｌで制限し、同じ２種類の酵素で予め制限しておいたプラスミドｐＵｃＩ８に連結し、プラスミドｐＵｃ−ＲＥＤを産生させた。制限フラグメントをＢａ１１旧と５ａｃｌで消化してｐＵＣ−ＲＥＤから取り出し、ＤＥＡＥセルロース膜を用いて電気泳動によって精製し、同じ２種類の酵素で予め消化しておいたプラスミドｐＢＩ１２１に連結した。ｐＢＩ−ＲＥＤと呼ぶ生成したプラスミドは、ＣａＭＶ３５ＳプロモーターおよびｐＢｌ１２１のポリーＡ付加部位に対して正確な配向でＡ、　ｅｕｔｒｏｐｈｕｓアセトアセチル− ＣｏＡレダクターゼ遺伝子を有することが見出され、高等植物で発現するものと思われた。

ｐＢＩ−ＲＥＤの構築に関する段階を模式的にまとめたものを、第５図として表わす。

プラスミドｐＢＩ−８ＹＮ　５ｐＢＩ−Ｔ）１１０およびｐＢＩ−ＲＥＤを、エレクトロポレーションによって＾ｇｒＯｂａｅｔｅｒｉｕｌｔｕｍｅｆ’ａｃｌｅｎｓ　Ｃ５８ｐＧＶ３８５０株に移した。プラスミドを含むコロニーを、親のプラスミドルＢ１１２１上に存在するカナマイシン耐性遺伝子の発現について選択することによって回収した。

トランスジェニック植物の生産前項に記載の組換え二元Ｔｉプラスミドを有するＡ、　ｔｕ■ｅｌ’ａｃｉｅｎｓの培養物と共に無菌の根組織をインキュベーションすることによってＡ、　ｔｈａｌｉａｎａの細胞を形質転換した。Ａ、　ｔｈａｌｉａｎａ　Ｒｓｃｈｅｖ種の無菌の実生からの根は、Ｖａｌｖｅｋｅｎｓ、　Ｄ、らによって記載の通りに形質転換した（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、ＵＳＡ、　８５：　５５ｇＢ−５５４０（１９８８））。修飾したｐｈｂ遺伝子の一つを有するＡ、　ｔｕｓｅｒａｃｔｅｎｓの３株のそれぞれを用いて、Ａ、　ｔｈａｌｌａｎａの根の切片に感染させた。この結果、それぞれの場合に約５０カナマイシン耐性のカルス組織が回収された。これらのうち、１０〜２５％が繁殖力のある苗条を生じ、種子を産生じた。種子を産生じたそれぞれの植物を異なる番号を割り当て、それが別の形質転換を表わすようにした。

総数が１１のトランスジェニック植物と思われるものを、プラスミドｐＢＩ−ＲＥＤを有するＡ、　ｔｕｍｅｆ’ａｃｉｅｎｓで処理した組織から回収した。これらを、ＲｅｄＢ−２Ａ　、　−２Ｂ　、　−２Ｇ　。

−２Ｄ　、　−２Ｅ　、　−２Ｆ　、　−２Ｇ　、　−２Ｈ、−３Ａ　、−５Ａおよび’ＲｅｄＤ−３Ａと呼んだ。ＲｅｄＢ−２Ｆ　、−２Ｈおよび一５Ａ以外の総てのトランスジェニック植物ラインを下記の項に記載されているように詳細に分析した。

総数が５個のトランスジェニック植物と思われるものを、プラスミドｐＢＩ−Ｔ旧０を有するＡ、　ｔｕｍｅｆ’ａｃｉｅｎｓで処理した組織から回収した。これらをＴ３−２Ａ　、　Ｔ４−２Ａ　。

Ｔ４−３Ａ％Ｔ４−３８およびＴ４−３Ｃと呼んだ。Ｔ４−３Ｃ以外の総てのこれらのトランスジェニック植物ラインを、下記の項に記載されているように詳細に分析した。

総数が４個のトランスジェニック植物と思われるものを、プラスミドｐＢ］−８ＹＮを有するＡ、　ｔｕｓｅｒａｃｔｅｎｓで処理した組織から回収した。これらを３８−１−２Ａ　、　５８−１−２Ｃ。

８１２−３Ａおよび５８ＰＵＣ−２Ａと呼んだ。これら総てのトランスジェニック植物ラインを、下記の項に記載されているように詳細に分析した。

トランスジェニック植物と思われるものにおけるＴ−ＤＮＡの存在を、５０Ｐｇ／ｍｌのカナマイシンを含む寒天で固化した無機培地にトランスジェニック植物からの種子を蒔くことによって証明した。このカナマイシンの濃度では形質転換しないＡ、　ｔｈａｌｌａｎａ植物の生育が妨げられるが、ｐＢ１１２１またはｐＢ１１２１由来のプラスミド上にＮＰＴＩＩ遺伝子を有する植物は正常に生育することができる。トランスジェニック植物Ｔ４−２Ａ　、　ＲｅｄＤ−３Ａおよび５８−１−２Ａからの種子は、Ｔｈｅ　Ａｓｅｒｌｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ１Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ　、メリーランド２０８５２から入手できる。

ホモ接合性のトランスジェニック系統と思われるものの見！ホモ接合性のトランスジェニック系統を産生させるのに用いられる最低基準は、ホモ接合性植物からの総ての子孫はカナマイシン耐性と思われることであった。

ゲノム中の異なる部位においてｐＢ１１２１由来のＮＰＴＩＩ遺伝子の多重異所性コピーの存在が同様な表現型を生じさせることがあるので、この基準は、−次形質転換がただ一つの染色体位置へのＴ−ＤＮＡの挿入を伴うときに最も有用である。

ホモ接合性系統を同定するために、それぞれのトランスジェニック系統からの数種類のカナマイシン耐性Ｔ１植物を生育させて、成熟させ、再生物を単離した。

次に、カナマイシン耐性の頻度を、それぞれの系統からの約５０個の１２種子の試料で測定した。特定の植物からの１２種子が総てカナマイシン耐性であるときには、この系統は暫定的にホモ接合性と考えた。

トランスジェニック植物におけるｐｈｂ遺伝子の組込みの外見生産された各種のトランスジェニック植物におけるｐｈｂ遺伝子の適正な組込みを証明するため、トランスジェニック植物のゲノムＤＮＡを分析した。コントロールの形質転換しない植物およびプラスミドｐＢＩ−ＴＨＴＯ。

ＰＢＩ−ＲＥＤおよびｐＢｌ−８ＹＮで形質転換したＴ３トランスジェニック植物からの高分子量ＤＮＡを単離した。ＤＮＡを制限酵素旧ｎｄｌｌｌで消化し、フラグメントをアガロースゲル電気泳動によって分離し、ナイロンフィルターに移した。制限酵素旧ｎｄｌｌｌは、プラスミドｐＢＩ−ＴＨＩＯ１ｐＢｌ−１？ＥＤおよびｐＢＩ−８ＹＮ中ではＣａＭＶ３５８プロモーターの５′末端で１回だけ切断する（第３．４および５図）。

従って、ｐｈｂ遺伝子に特異的なプローブを用いて検出したフラグメントは、植物ゲノムＤＮＡを有するＴｉベクターの結合フラグメントまたはコントロールしたＴｉベクターの内部フラグメントを表わすものである。プラスミドｐＵＣ−Ｔ旧０．　ｐＣＵ−ＲＥＤおよびｐＵＣ−８ＹＮにおけるインサートをＥｅｏＲＩおよび旧ｎｄｌｌｌで処理することによって取り出し、ＤＥＡＥセルロース膜を用いてアガロースゲル電気泳動によって精製し、ランダムプライマー化により３２Ｐ−デオキシリボヌクレオチドで標識した。次に、標識したｐｈｂ遺伝子フラグメントを用いてナイロンフィルターを分析した。フィルターを／１イブリダイゼーションした後、極めて厳密な条件下で洗浄した。このフィルターハイブリダイゼーションの結果を、第６図に示す。

形質転換しないコントロール植物では３種類のｐｈｂ遺伝子は全く検出することができない（第６Ａ、Ｂおよび０図、レーンａ　）　ｏ　ｐｈｂＡ遺伝子は、プラスミドｐＢＩ−ＴＨＩＯを用いる形質転換によって産生じたトランスジエニ・ツク系統の４つに検出された（第６Ａ図、レーンｂ　−ｅ　）。

ｐｈｂＢ遺伝子は、プラスミドｐＢＩ−ＲＥＤを用いる形質転換によって産生じたトランスジェニック植物の７つに検出された（第６Ｂ図、レーンｆ−１）。最後に、ｐｈｂＣ遺伝子は、プラスミドｐＢＩ−８ＹＮを用いる形質転換によって産生じたトランスジェニック植物の３つに検出された（第６Ｃ図、レーンｍ　− ｐ　）。植物系統５１２−３Ａはカナマイシン５０μｇ／ｍｌに耐性であり、ＮＰＴ１１遺伝子が組込まれていることを示唆しているが、ｐｈｂｃ遺伝子は検出することができなかった。ＮＰＴ１１遺伝子を有するがｐｈｂｃ遺伝子は持たないＴｉベクターのフラグメントだけが、植物系統５１２−３ＡのゲノムＤＮＡに組込まれたものと思われる。

＾、　ｅｕｔｒｏｐｈｕｓ　ｐｈｂ遺伝子が各種のトランスジェニック系統で発現されるかどうかを検討するために、プラスミドｐＵｃ−ＴＨＩＯ１ｐＵｃ−ＲＥＤおよびｐＵＣ−８ＹＮに含まれるクローニングした遺伝子をフィルターハイブリダイゼーション実験におけるプローブとして用いた。総ＲＮＡを形質転換しないコントロールとＴ３トランスジェニック植物から抽出した。ＲＮＡをホルムアルデヒドを含むアガロースゲル中で電気泳動によって分離し、確立された手順によってナイロンフィルターに移した。プラスミドｐＵＣ−ＴＨＩＯ２ｐＵＣ− ＲＥＤおよびｐＵＣ−３ＹＮのインサートをＥｃｏＲＩとＨｆｎｄｌｌｌで処理することによって取り出し、ＤＥＡＥセルロース膜を用いて電気泳動によって精製し、ランダムプライマー化によって３２Ｐ−デオキシリボヌクレオチドで標識した。標識したｐｈｂ遺伝子を用いて、ナイロンフィルターを分析した。これらの実験では、３個のｐｈｂプローブのいずれも、形質転換しないコントロール植物ではＲＮＡには全くハイブリダイゼーションしないことを示していた（第７図、レーンｅＳｊおよびｒ）。対照的に、ｐＢＩづ旧Ｏを用いる形質転換によって産生じたトランスジェニック植物は、１．Ｂ　ｋｂｐのＲＮＡを有しており、これは３〜ケトチオラーゼ遺伝子に相補性であった（第７Ａ図、レーンａ　−ｄ　）。ｐＢ１１２１由来のプラスミド上に存在するＣａＭＶ３５ＳプロモーターおよびポリーＡ付加配列は、ｐｈｂ融合遺伝子から産生じたｍＲＮＡの最終的な長さに約ａｏｏ　ｂｐ寄与している。３−ケトチオラーゼｍＲＮＡの水準は、植物系統Ｔ４−３Ａでは他の植物系統と比較して低かった。同様に、ｐＢｌ−８ＹＮを用いる形質転換によって産生じたトランスジェニック系統の３つは、ＰＨＢシンターゼ遺伝子に対応する２、１　ｋｂｐのｍＲＮＡを有した（第７Ｂ図、レーンｆ１ｇおよびｉ）。トランスジェニック系統５１２−３＾は、ｐｈｂｃプローブにハイブリダイゼーションするｍＲＮＡは検出されなかった（第７Ｂ図、レーンｈ）。この結果は、サザンプロット分析の結果と一致しており、系統ＳＬ２〜３ＡのゲノムＤＮＡにはｐｈｂＣ遺伝子が組込まれていないことを示している（第６Ｃ図、レーンｍ）。最後に、プラスミドｐＢｌ−１？ＥＤを用いた形質転換によって産生された７つのトランスジェニック系統は、ｉ、、ｉ　ｋｂｐのｍＲＮＡを有し、これはアセトアセチル−ＣｏＡレダクターゼ遺伝子に相補性であった（第７Ｃ図、レーンに−ｑ）。従って、３種類のｐｈｂ遺伝子のそれぞれについて、予想された大きさの相補性ＲＮＡを発現する少なくとも３種類の独立なトランスジェニック植物が得られた。

ＲＮＡが存在することは遺伝子が転写されることを示しているが、それらの遺伝子が翻訳されまたは翻訳生成物が機能的であることについては全く情報が提供されない。これは、トランスジェニック植物の酵素活性を分析することによって検討した。

ｐＢＩ−ＴＨＩＯを用いる形質転換によって産生されたトランスジェニック植物を、５ｅｎｉｏｒ、　Ｐ、Ｊ、およびＤａｖｅｓ、　Ｅ、Ａ、、Ｂｉｏｃｈｃｖ、　Ｊ、、　１：（４：　２２５−２Ｈ（１９７３）に記載の方法を若干変更することによって、３−ケトチオラーゼ活性について分析した。Ｔ３植物からの凍結した葉の組織をトリス緩衝液中でホモゲナイズし、透明にした粗抽出物を３− ケトチオラーゼ活性について分析した。これらの実験の結果を、第１表に示す。

形質転換しないＡ、　ｔｈａｌｉａｎａ植物からの抽出物は、分析条件下では３ −ケトチオラーゼ活性は極めて低い水準であった。対照的に、ｐｈｂ＾遺伝子を転写することが見出されたそれぞれのトランスジェニック植物は、チオラーゼ活性が実質的に増加した水準にあった。これは、細菌性チオラーゼ遺伝子がトランスジェニック植物で発現するときには機能的であることを示していた。しかしながら、各種のトランスジェニック植物に検出される３−ケトチオラーゼの比活性は、プラスミドｐＴＺ１８ｕ−ＰＨＢ上にｐｈｂＡ遺伝子を有するＥ、　ｃｏｌｌから調製した抽出物と比較すると著しく低かった。

第１表：　＾、　ｔｈａｌｌａｎａ　トランスジェニック植物における３−ケトチオラーゼ活性の水準試　料　３−ケトチオラーゼ活性８野生型Ａ、　ｔｈａｌＩａｎａ　Ｏ，０１９Ｔ４−３Ａ　）ランスジェニック　０．０５７Ｔ３−２Ａ　トランスジェニック　０．４２Ｔ４−２Ａ　トランスジェニック　ｏ、４３Ｔ４−３Ｂ　トランスジェニック　０．５４８１分当たりタンパク質１ｍｇ当たり分解したアセトアセチル−ＣｏＡのマイクロモル数。値は２〜４回の測定値の平均である。

ｂ　ＰＨＢオペロンを有するプラスミドｐＴＺ１８Ｕ−ＰＨＢを含むＥ、　ｃｏｌｔ　Ｄ　Ｈ５ａ。

プラスミドｐＢＩ−１？ＥＤを用いる形質転換によって産生じたトランスジェニック植物を５ｅｎｉｏｒ、　Ｐ、Ｊ、およびＤａｖｅｓ　。

Ｅ、Ａ、　、Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｊ、、　１３４：　２２５−２３８　（１９７３）に記載の方法を若干変更することによって、アセトアセチル−Ｃ。

Ａレダクターゼ活性について分析した。Ｔ３植物からの葉をリン酸カリウム緩衝液中でホモゲナイズし、透明にした粗抽出物をアセトアセチル−ＣｏＡレダクターゼ活性について分析した。これらの実験の結果を、第２表に示す。形質転換しないＡ、　ｔｈａｌｉａｎａ植物からの抽出物は、分析条件下ではアセトアセチル−ＣｏＡレダクターゼ活性は検出不能な水準であった。対照的に、ｐｈｂＡ遺伝子を転写することが見出されたそれぞれのトランスジェニック植物では、アセトアセチル−ＣｏＡレダクターゼ活性は高水準であった。これは、細菌性アセトアセチル−ＣｏＡレダクターゼ遺伝子がトランスジェニック植物で発現するときには機能的であることを示している。更に、分析を行った７つのトランスジェニック植物の内の６つに検出されたアセトアセチル−ＣｏＡレダクターゼの比活性は、プラスミドｐＴＺ１８１１−ＰＨＢ上にｐｈｂＢ遺伝子を有するＥ、　ｃｏｌｌからの抽出物の比活性よりも著しく高かった。

第２表：　Ａ、　ｔｈａｌｌａｎａ　）ランスジェニック植物におけるアセトアセチル−ＣｏＡレダクターゼ活性野生型Ａ、　ｔｈａｌｉａｎａ　＜　０．０３ＲｅｄＢ−２Ａ　）ランスジェニック　１２．５ＲｅｄＢ−２Ｂ　トランスジェニック　１６．２ＲｅｄＢ−２Ｃトランスジェニック　９．１ＲｅｄＢ−２０）ランスジェニック　８．８ＲｅｄＢ−２Ｅ　）ランスジェニック　１．６ＲｅｄＢ−２Ｇ　）ランスジェニック　５．２セチル−ＣｏＡのマイクロモル数。値は２〜４回の測定値の平均である。

ｂ　ＰＨＢオペロンを有するプラスミドｐＴＺ１８Ｕ−ＰＨＢを含むＥ、　ｃｏｌｔ　Ｄ　Ｈ５α。

プラスミドｐＢ　Ｉ−ＲＥＤを用いる形質転換によって得られるトランスジェニック植物は、チオラーゼおよびレダクターゼ活性がない場合には、この構想の活性を測定することが技術的に困難であるため、ＰＨＢシンターゼ活性の存在については分析しなかった。

ハイブリッド植物の生産および分析高等植物は内因性の細胞質性３−ケトチオラーゼ活性を有するので、ＰＨＢを生産するのに必要なわずかな追加の酵素はアセトアセチル−ＣｏＡレダクターゼおよびＰＨＢシンターゼである。これらの２種類の遺伝子を、アセトアセチル−ＣｏＡレダクターゼ遺伝子とホモ接合性であると考えられるトランスジェニック系統とＰＨＢ遺伝子とホモ接合性であると考えられるトランスジェニック系統とを交配することによって同じ植物に導入した。

これらの交配から生じるハイブリッド種子を土壌中で２〜３週間生育させた後、ＰＨＨの存在に就いて分析を行った。

植物中でのアセトアセチル−ＣｏＡレダクターゼおよびＰＨＢシンターゼ遺伝子の存在がＰＨＢの生産および蓄積に十分であるかどうかを検討するために、クロロホルム可溶性物質の抽出物をコントロールおよびこれらの遺伝子を両方とも含むハイブリッド植物から作成した。

これらの抽出物中のＰＨＢの存在を、ガスクロマトグラフィ　（ＧＣ）によって分析した。２つの方法を用いて、ＧＣ分析用の植物抽出物を調製した。これらの方法は、ＰＨＢの高度に重合した性質（Ａ、ｅｕｔｒｏｐｈｕｓから生産されるＰＨＢについては平均で１０６ダルトン）およびそれのクロロホルムのような塩素化した炭化水素に対する選択的溶解性を利用している。簡単に言えば、第一の方法では、全部の葉をクロロホルムと水との１＝１溶液に入れ、６５℃で１６時間反転振盪する。約５０．０００ダルトンより大きな分子は植物細胞壁を通過できないので、これらの条件下では低分子量の水またはクロロホルム可溶性生成物だけが葉から抽出される。次に、高分子量のＰＨＢと思われるものを、残っている組織をホモゲナイズして細胞壁を破壊することによって葉から抽出し、これを１：１クロロホルムと水との溶液中で６５℃で１２時間再抽出する。第二の方法では、全部の葉の試料を５０％エタノール中で５５℃で２時間、１００％メタノール中で５５℃で２時間および１００％ジエチルエーテル中で２０℃で１５分間連続的に抽出する。次に、残りの組織を１００℃でクロロホルム中で４時間ホモゲナイズし、抽出した。これらの方法から得られる最終的なりロロホルム抽出物に含まれる生成物をエタノールと塩酸でエステル交換し、ガスクロマトグラフィによって分析した。エステル交換した植物生成物の保持時間を、Ａ、　ｅｕｔｒｏｐｈｕｓから精製したエステル交換した市販のＰ　ＨＢ　（Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｌｃａｌ　Ｃｏ、、　ミズーリ−）の保持時間と比較した。

トランスジェニック植物８Ｂ−１−２Ａおよび／または５８−１−２０をトランスジェニック植物ＲｅｄＢ−２Ａ　、　−２Ｃ。

−２Ｄ　、−２ＧおよびＲｅｄＤ−３Ａと交配した。生成するＦ１種子を土壌に蒔き、２〜３週齢の植物の葉の試料または全若枝を採取してＰＨＢの存在について分析した。第一の精製法を用いて得られた結果の例を、第８図に示す。アセトアセチル−ＣｏＡレダクターゼおよびＰＨＢシンターゼトランスジーンを両方とも有するＦ１植物の抽出物中に含まれる生成物は、市販のＰＨＢのエステル交換した生成物の保持時間と比較することによって測定したところ、エチル−ヒドロキシブチレートと同じ保持時間であった。この新規な生成物は、暫・定的にエチル−ヒドロキシブチレートについて同定したが、活性なアセトアセチル−ＣｏＡレダクターゼトランスジーンとＰＨＢシンターゼトランスジーンを両方とも有するＦ１ハイブリッド植物だけに検出された。同様な生成物は前記の遺伝子の一方だけを有するトランスジェニック植物または形質転換しないＡ、　ｔｈａｌｌａｎａ植物では検出されなかった。更に、この生成物は、予めホモゲナイズしなかった植物抽出物のクロロホルム抽出物では検出されなかった。これは、エチル− ヒドロキシブチレートは高分子量前駆体から誘導されることを示している。

エチル−ヒドロキシブチレートと同じ保持時間の新規な植物生成物の同定はガスクロマトグラフィーマススベクトル分析法（ＧＣ−ＭＳ）によって行った。ＧＣ −ＭＳ分析はＭＳＵ−ＮＩＨＭａｓｓ　Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ　Ｆａｃｉｌｌｔｙによって行った。第９Ａ図に、真のＰＨＢから調製したエチル−ヒドロキシブチレートのマススペクトルを示す。第９Ｂ図には、トランスジェニック植物５８−１−２ＡおよびＲｅｄＢ−２Ｃの交配から生じたＦ１ハイブリッド植物から抽出したエチル−ヒドロキシブチレートと思われるもののマススペクトルを示す。これらの結果は、エチル讃ヒドロキシブチレートと同じ保持時間で溶出する新規な植物生成物は、エチル−ヒドロキシブチレートの真正試料と同じ開裂パターンも有することを示している。この新規な生成物が予めホモゲナイズしておいた葉の組織からの抽出物中にだけ検出することができるという事実は、エチル− ヒドロキシブチレートが分子量が約５０，０００ダルトン（植物細胞壁の近似的気孔率）より大きな物質から誘導されることを示している。また、これらのデーターは、アセトアセチル−ＣｏＡレダクターゼとＰＨＢシンターゼ遺伝子を両方とも含むトランスジェニック植物がポリヒドロキシブチレートを蓄積することも示している。第３表は、ＧＣおよびＧＣ−ＭＳによって分析したＦ１植物をまとめて示している。ＧＣ分析によれば、Ｆｌ／＼イブリッドの葉に蓄積されるＰＨＢの量はＲｅｄＤ−３Ａと５ａ−ｔ−２Ｃとの間のＦ１ハイブリッド対して葉の新鮮な重量１ａ当たりＰＨＢが約５μｇからＲｅｄＢ−２０と８８−４−２Ａとの間のＦ１ハイブリッドからの葉の新鮮な重量１ａ当たりＰＨＢが約１００μｇの範囲であった。

第３表二　Ｆ１ハイブリッド植物におけるＰＨＢの産生の証拠のまとめ親トランスジェニック系統８　親トランスジェニック系統８Ｓ８−１−２Ｃ５８ −１−２ＡＳｃＴＥＭｄ（葉）ＲｅｄＢ−２Ａ　Ｇ　ＣＴＥＭ　（種子）ＴＥＭ　（葉、種子）Ｒ−Ｂ−２０Ｇ　ＣＳＴＥＭ（葉）ＲｅｄＢ−２ＣＧ　ＣＳＴＥＭ　（葉）ＲｅｄＢ−２０ＴＥＭ　（葉）トランスジェニック系統をＰＨＢシンターゼを有するトランスジェニック系統と交配した。生成するＦ１ハイブリッドをＰＨＢの産生について分析した。

５　ガスクロマトグラフィ分析によるＰＨＢの産生の証拠、０　ガスクロマトグラフィーマススペクトロメトリーによるＰＨＢの産生の証拠。

１　透過型電子顕微鏡法による電子半透明（ｅｌｅｃｔｒｏｎ−１ｕｃｅｎｔ）顆粒の検出。括弧内は、分析した植物組織を示す。

８　総での空欄は、分析を行わなかったことを示している。

ハイブリッド植物におけるＰＨＢ顆粒の目視観察ＰＨＢを蓄積する細菌の透過型電子顕微鏡法（ＴＥＭ）から、直径が０．２〜０．５μｍの電子半透明顆粒が約２ｎｓの厚みの皮膜によって囲まれていることが明らかになった（　Ｌｕｎｄｇｒｅｎ、　Ｄ、Ｇ、、Ｐｆｉｓｔｅｒ、　Ｒ，Ｍ、およびＭｅｒｒｉｃｋ。

Ｊ８Ｍ−、Ｊ、　Ｇｅｎ、旧ｃｒｏｂｉｏ１．．３４：　４４１−４４６　（１９Ｂ４））。

ＧＣ−ＭＳ分析によりＰＨＢの産生について陽性であることが示されているハイブリッド植物で同様な顆粒が検出されるかどうかを検討するため、植物組織を透過型電子顕微鏡法によって検討した。トランスジェニック植物８８−１−２Ａおよび／または８ｇ−１−２ＣをトランスジェニックなＲｅｄＢ−２Ａ　、　−２Ｃ、−２Ｄ　、−２ＧおよびＲｅｄＤ−３＾に交配した。生成するＦｌのハイブリッド種子および成熟した葉の物質を固定して、透過型電子顕微鏡法によって分析した。簡単に説明すれば、組織を３％グルグルアルデヒドと１％四酸化オスミウムで固定して、エポキシ樹脂に埋設した。８０〜９０ｎ■の切片を５％ウラニルアセテートとクエン酸鉛で染色した。

一連の実験において、Ｆ１種子を土壌に蒔き、２〜３週齢の植物の葉を採取してＴＥＭ分析を行った。葉に含まれる細胞を検査したところ、電子半透明顆粒の凝集体が含まれることが明らかになった。これらの顆粒は、ＰＨＢシンターゼ遺伝子を有するトランスジェニック体とアセトアセチル−ＣｏＡレダクターゼ遺伝子を有するトランスジェニック体との交雑によって生じる総ての分析を行ったＦ１ハイブリッド植物で検出された。幾つかの例を第１０図に示す。同様な顆粒は、ＰＨＢシンターゼまたはアセトアセチル−ＣｏＡレダクターゼ遺伝子のみを有する親のトランスジェニック系統では検出されず、形質転換していないＡ、　ｔｈａｌｉａｎａでも検出されなかった。

Ｆ１ハイブリッドの葉の組織では、顆粒は葉肉細胞に検出された（第１Ｏ図、顕微鏡写真ａ　−ｅ　）。電子半透明顆粒の凝集体は核に最も頻繁に検出されたが（第１Ｏ図、顕微鏡写真ａ−ｃ）、同様な構造はＦ１ハイブリッドの葉の組織の細胞質（第１Ｏ図、顕微鏡写真ｅ）および液胞（ｍ１０図、顕微鏡写真ｄ）でも検出された。核および細なることができた。液胞では、顆粒は一般的に大きめで、最大直径は約０．５５μｍに達した。更に倍率を上げると、核の顆粒は電子の濃い（ｅｌｅｃｔｒｏｎ−ｄｅｎｓｅ）物質によって囲まれていると思われる。

これらの顆粒の大きさおよび見掛けの構造は共に、ＰＨＢを蓄積する細菌で観察された顆粒に極めて類似している。

第二の系列の実験では、Ｆ１種子を水に２４時間浸漬し、胚を種皮から取り出し、組織を固定した。胚性子葉を分析したところ、核に電子半透明顆粒の凝集体が含まれていた（第１Ｏ図、顕微鏡写真ｆ）。顆粒の最大直径は０．１８μｍに達することができた。これらの顆粒は、ＰＨＢシンターゼ遺伝子を有するトランスジェニック系統とアセトアセチル−ＣｏＡレダクターゼ遺伝子を有するトランスジェニック系統との交配によって生成するＦ１ハイブリッドの胚の核に検出されただけであった。異所性遺伝子一方だけを有する親のトランスジェニック植物や形質転換しない野生型のＡ、ｔｈａｌｌａｎａでは、顆粒は検出されなかった。

第３図に、ＴＥＭによって分析されたＦ１植物をまとめて示す。

前記のデーターは、ＧＣ−ＭＳによるＰＨＢの検出と電子顕微鏡水準での顆粒の存在との間に正の相関があることを示している。個々の顆粒を取り巻く電子の濃い物質の大きさ、形状および存在はＰＵＢを産生ずる細菌に含まれる顆粒に極めてよく類似している。最後に、Ｇｃ−ＭＳによるＰＨＢの検出と電子半透明顆粒の存在は、アセトアセチル−ＣｏＡレダクターゼおよびＰＨＢシンターゼトランスジーンを両方とも有するハイブリッド植物だけで観察される。また、これらのデーターは、Ｆ１ハイブリッド植物で観察される顆粒がポリヒドロキシブチレートからなることを示している。

考　察これらの検討において、ＰＨ８合成に必要な酵素をコードする細菌遺伝子を高等植物に安定に導入して、遺伝子を転写させて、予想した大きさの転写体を産生ずるようにすることができることを説明してきた。更に、ｐｈｂＡおよびｐｈｂＢ遺伝子の場合には、トランスジェニック植物にこれらの遺伝子が含まれていればそれぞれ３−ケトチオラーゼまたはアセトアセチル−ＣｏＡレダクターゼ酵素活性の水準がそれぞれ増加することも示した。従って、これらの２個の遺伝子の生成物は植物で翻訳されるときには機能的であることは明らかである。ＰＨＢシンターゼ活性を直接分析することは技術的に困難であるため、トランスジェニック植物におけるＰＨＢシンターゼ活性の量は測定しなかった。

アセトアセチル−ＣｏＡレダクターゼおよびＰＨＢシンターゼを両方とも発現するＦ１トランスジェニック植物からの植物抽出物だけが、エタノールおよび塩酸でエステル交換するとエチル−ヒドロキシブチレートを産生ずる新規な高分子量のクロロホルム可溶性の化合物を生産することが示された。これらのデーターは、新規な化合物がポリヒドロキシブチレートであることを示している。また、これらのデータはトランスジェニック植物における機能性ＰＨＢシンターゼの産生の間接的な証拠である。これは、ＰＨＢシンターゼ活性についてイン・ビトロ分析を行うことができないので、重要である。更に、ＰＨＢの産生は、ＰＨＢシンターゼの基質であるＤ（−）−ヒドロキシブチリルーＣｏＡが植物で産生されることも間接的に示している。このヒドロキシアシル−ＣｏＡは、天然には植物体には見られないものである。

透過型電子顕微鏡法も、ＰＨＢがトランスジェニック植物で生産されることを立証している。アセトアセチル−ＣｏＡレダクターゼとＰＨＢシンターゼを両方とも発現するＦ１トランスジェニック植物の胚の子葉および成熟した葉を分析したところ、Ａ、ｅｕｔｒｏｐｈｕｓのようなＰＨＢを産生する細菌に見られる顆粒に極めて類似した大きさおよび構造を有する電子半透明顆粒の凝集体であった。

これらの顆粒は核に最もよく見られるが、Ｆ１ハイブリッド植物の液胞および細胞質でも検出された。

本明細書に記載の実験では、特異的なアミノ酸配列をタンパク質に加えて特異的に任意の細胞小器官にへと向けることはなかったので、Ａ、　ｅｕｔｒｏｈｐｕｓ由来のｐｈｂＡ。

ｐｈｂＢおよびｐｈｂＣ遺伝子の生成物はほとんどが細胞質で発現するものと思われる。植物細胞の細胞質は３−ケトチオラーゼを既に含んでいるので、ＰＨＢを産生ずるには、アセトアセチル−ＣｏＡレダクターゼとＰＨＢシンターゼの追加的発現が必要なだけである。顆粒が核と液胞に見出されることは、細胞質での酵素の発現と必ずしも矛盾するものではない。核層は細胞分裂の際にはばらばらになり（ｄｉｓｓｅｍｂｌｅ）　、再集合するので、細胞質で最初に産生じたＰＨＢ顆粒は核の新たに再形成する膜内部に取り込まれることができる。あるいは、ＰＨＢ顆粒が疎水性であるため、核または液胞の膜を通過することができる。

別の方法では、ＰＨＢの産生は、ＰＨ８合成に関与する酵素の細胞小器官に標的を定めた発現によって特異的な植物細胞の細胞小器官に局在化させることができた。

この場合には、標的を定めた細胞小器官が活性な３−ケトチオラーゼを発現しない場合には、ＰＨＢの産生にはアセトアセチル−ＣｏＡレダクターゼおよびＰＨＢシンターゼの外に外因性３−ケトチオラーゼ活性の発現が必要となる。

高等植物でのＰＨＢまたはＰＨＡ産生の将来的な目的は、脂質、澱粉またはテルペノイドのような主要な保存化合物から炭素を方向転換させ、ＰＨＡ合成に向けることである。この目的には、ＰＨＡ合成に関与した酵素の組織特異的発現あるいは細胞小器官特異的発現が必要となる。

油状生成物産生穀物も、同様に遺伝子工学の目標である。脂質はアセチル−ＣｏＡを用いてブラスチドで合成され、同じ前駆体はＰＨＢおよび他のＰＨＡの合成用いられる。それ故、油状穀物の遺伝子工学では、ＰＨＡ生合成酵素をブラスチドに向けることが必要になる。遺伝子操作を行ってＰＨＡを産生させることができる油状穀物の例には、アブラナ、ヒマワリ、ギネアアブラヤシがある。アブラナおよびヒマワリは北米における主要な穀物であり、異種ＤＮＡで形質転換することができる。あるいは、ＰＨＡ産生は、ギネアアブラヤシの実の中果皮に標的を向けることができる。中果皮で産生ずる脂質は樹木または胚の生存には必須のものではないので、Ｐ）Ｉ。

Ａの産生はヤシの木に悪影響を及ぼすことはない。不運なことには、形質転換技術は、ギネアアブラヤシには未だ利用できないのである。

ＰＨＡ産生は、テンサイおよび多量の澱粉を蓄積する穀物であるジャガイモの根および塊茎に標的を向けることもできる。この方法での主要な問題点は、澱粉とＰ　ＨＡは同じ前駆体を用いないので、炭素が澱粉からＰＨＡに転換する前に、炭素の代謝において多くの修飾を行う必要があることである。

ＰＩ（Ａの産生に最も直接的な方法と思われるものは、カロチノイドを蓄積するニンジン、またはステロールを蓄積するメキシコイモのような、多量のテルペノイドを蓄積する穀物を使用することである。テルペノイドはＰＨＡと同じ前駆体を用いるので（アセチル−ＣｏＡおよびアセトアセチル−Ｃｏ　Ａ　）　、炭素を転換してＰＨＡを産生させることは更に容易に行うことができる。

材料および方法ＤＮＡ組換体の構築プラスミドを有するＥ、　ｃｏｌｉ　ＤＨ５αを、カナマイシン（５０Ｐｇ　／　ｍｌ）またはアンピシリン（５０Ｐｇ／■１）を補足したＬＢブロスで生育させた。プラスミドＤＮＡの大規模製造は、５ａＩｌｂｒｏｏｋ、　Ｊ、、Ｆｒ１ｔｓｃｈ、　Ｅ、Ｐ、およびＭａｎｌａｔｉｓ、Ｔ、、Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｓ　ａ　ｌａｂｏｒａｔｏｒｙｗａｎｕａ！　、Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ（１９８９年）に記載のアルカリリーシスおよびポリエチレングリコール沈澱法によって行った。

プラスミドＤＮＡを製造業者の指示に従って制限エンドヌクレアーゼで開裂しくＮｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ　ｓ　？サチューセッツ；Ｐｒｏ＊ｅｇａ　Ｃｏｒｐ、　、ライスコンシン；　ＢｏｅｈｒｌｎｇｅｒＭａｎｎｈｅｌｓ　Ｂｉｏｃｈｅｓｉｃａｌｓ、インデアアナ；　Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ。

カリフォルニア）、アガロースゲル電気泳動によって分離し、Ｓａｍｂｒｏｏｋ、　Ｊ、、Ｆｒ１ｔｓｃｈ、　Ｅ、Ｆ、およびＭａｎｌａｔｉＳ。

Ｔ、ＳＭｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　、　ａ　１ａｂｏｒａｔｏｒｙ　ｍａｎｕａｌ、Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　）ｌａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ　（１９８９年）に記載のエチジウムプロミド染色によって可視化した。

ＤＮＡフラグメントをＤＥＡＥ膜（ＮＡ−４５ＤＥＡＥ膜、５ｃｈｌｅｉｃｈｅｒ　＆　５ｃｈｕｅ１１．　Ｉｎｃ、、ニューハンプシャー）を用いてアガロースゲルから回収した。簡単に説明すれば、ＤＮＡをＮＡ−４５のストリップで電気泳動し、膜を０．１５ＭＮａ　ＣＩ、０．ＩｓＭ　ＥＤＴＡおよび２０１１Ｍトリス−ＨＣ１（ｐＨ８）で洗浄する。ＤＮＡを、次に１．ＯＭＮ　ａ　Ｃ１。

０．１１阿ＥＤＴＡおよび２０ＩＩＭトリスーＭＣＩ　（ｐＨ８）で６５℃で１〜２時間溶出させる。

ＤＮＡを、フェノール−クロロホルム抽出およびエタノール沈澱によって更に生成する。幾つかの実験では、ＤＮＡフラグメントの四部を形成した３′末端を、Ｓａｗｂｒｏｏｋ、　Ｊ、、Ｐｒ１ｔｓｃｈ、　Ｅ、Ｐ、およびＭａｎｉａｔｌｓ、Ｔ、、Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　ｓ　ａ　１ａｂｏｒａｔｏｒｙ　ｍａｎｕａｌ　、ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ　（１９８９年）に記載のプロトコールを用いてＴ４ＤＮＡポリメラーゼでプラント末端に転換した。ＤＮＡフラグメントと粘着若しくはプラント末端との連結は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ、　Ｊ、、Ｐｒ１ｔｓｃｈ。

Ｅ、Ｐ、およびＭａｎｉａｔｌＳ、Ｔ、　、Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｌｎｇ　ａｌａｂｏｒａｔｏｒｙＩｍａｎｕａｌ　、Ｃｏ１ｄ　ｓｐｒｔｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　ｔ、ａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ　（１９８９年）に記載の５０１Ｍ　）リス−ＭＣＩ（ｐ　Ｈ７＝　６　）　、５ｍＭ　Ｍ　ｇ　ＣＩ　２．５％（ｗ　／　ｖ　）ポリエチレングリコール８０００．０，５腸ＭＡＴＰおよび５ｓＭジチオスレイトールを含む緩衝液中で１４℃で１８時間行った。連結反応の画分を、Ｈａｎａｈａｎ、　Ｄ、　、Ｊ、　Ｍｏ１．　Ｂｌｏｔ、。

１６６：　５５７−５８０　（１９８３）に記載の塩化ルビジウム法によってＥ、　ｃｏｌｉ中に移した。形質転換した細菌を、ＬＢブロスと５０Ｐｇ／■１のカナマイシンまたは５０Ｐｇ／■ｌのアンピシリンを含む寒天プレートに塗布した。組換えプラスミドを含む細菌コロニーは、ナイロン膜（Ｈｙｂｏｎｄ−Ｎ。

Ａ■ｅｒｓｈａｓ、イリノイ）をニトロセルロース膜の代わりに用いたこと以外は、Ｓａｓ＋ｂｒｏｏｋ、　Ｊ、、Ｆｒ１ｔｓｃｈ、　Ｅ、Ｐ、およびＭａｎｊａｔｉｓ、Ｔ、　ｓ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　％　ａ　ｌａｂｏｒａｔｏｒｙｍａｎｕａｌ　、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ（１９８９年）に記載の３２Ｐを標識したＤＮＡプローブとハイブリダイゼーションすることによって同定した。

放射能標識を行ったＤＮＡプローブの調製およびハイブリダイゼーションを、下記の項で説明する。プラスミドＤＮＡのスモールスケールでの調製は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ、　Ｊ、、Ｆｒ１ｔｓｃｈ、　Ｅ、Ｆ、およびＭａｎｉａｔｌｓ、Ｔ、　、ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｌｎｇ　ｓ　ａ　１ａｂｏｒａｔｏｒｙ　ｍａｎｕａｌ　ｓ　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｌｎｇ　ＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ　（１９８９年）に記載のアルカリンライシス法によって行った。

オリゴヌクレオチドはＡｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｓｓ　８８０＾ＤＮ＾合成装置で、製造業者の指示に従って合成した（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｌｏｓｙｓｔｅｓｓ、カリフォルニア）。５′末端にジメトキシトリチル基を結合させたオリゴヌクレオチドは、Ｃ１８カラムを備えたＶａｒｌａｎ　５０００　ＨＰＬＣで精製した（Ｖａｒｆａｎ　Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ　Ｇｒｏｕｐ　、テキサス）０オリゴヌクレオチドを０．１Ｍトリエチルアミンに再懸濁して、１２％アセトニトリル／８８％０．１Ｍ）リエチルアミンーアセテート（ｐＨ７）（溶媒Ａ）で予備平衡にしておいたＣ１ｓカラムに注入した。ＨＰＬＣの条件は次のように設定した。

流速０．９　ｍｌ／分；最大圧２００　ｐｓｌ　；時間０分、８８％溶媒Ａ／１２％溶媒Ｂ（アセトニトリル）；時間３分、８８％溶媒Ａ／１２％溶媒Ｂ；時間２１分、６５％溶媒Ａ／３５％溶媒Ｂ；時間２５分、６５％溶媒Ａ／３５％溶媒Ｂ０精製したオリゴヌクレオチドを８０％酢酸中で１０分間脱トリチル化し、窒素リス−ＨＣｌ　（ｐＨ７，５）および０．１　ｓＭＥ　Ｄ　Ｔ　Ａに溶解し、等容の酢酸エチルで３回抽出し、エタノールで沈澱させた。

ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）は、Ｐｅｒｋｌｎ−ＥｌｍｅｒＣｅｔｕｓ　ＤＮＡサーマル・サイクラ−（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｂｉｇｅｒ、コネチカット）を用いて行った。反応混合物は、オリゴヌクレオチド１００ピコモル、ＰＣＴプライマー＃１および＃２（第５図参照）、制限酵素ＥｃｏＲＩで線形にしたプラスミ　ドｐＴＺ１８Ｕ−ＰＨＢ２００ｎｇ　Ｓ　１２５　ｕ　Ｍ　ｄ　Ｎ　Ｔ　Ｐ　、５０　５ＭＫＣｌ　％　１０ｍＭ　ト　リ　ｘ−ＨＣ１（ｐＨ８，３）　、　２．５　ｍＷＭ　ｇ　ＣＩ　０．０１％ゼラチンおよびＴａｑポリメラーゼ（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｓｅｒｓコネチカット）２．５単位を含んだ。

ＤＮＡサーマル・サイクラ−の測定条件は次の通りであった。９４℃で３分間、９４℃で１分間、５５℃で３分間、７２℃で３分間を４０サイクル、最後に７２ ℃で７分間。ＰＣＲ生成物をアガロースゲル電気泳動およびＤＥＡＥセルロース膜で溶出することによって単離した。

トランスジェニック植物の生産トランスジェニック植物を生産するのに用いたＴｉプラスミドベクターを、最初にエレクトロポレーションによってＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｌｕｍ　ｔｕｍｅｆａｃｌｅｎｓ　Ｃ５ｇ−ｐＧＶ３８５０株に移した（　Ｚａｂｒｉｓｋｙ、　Ｐ、ら、ＥＭＢｏ、　２：　２１４８−２１５０　（１９８８）　；およびＳａｍｂｒｏｏｋ、　Ｊ、、Ｐｒ１ｔｓｃｈ、　Ｅ、Ｐ、およびＭａｎｌａｔｌｓ、Ｔ９、Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　ａ　１ａｂｏｒａｔｏｒｙ　ｍａｎｕａｌ　ＳＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ　（１９８９年））。

Ａｒａｂｉｄｏｐｓｌｓ　ｔｈａｌｉａｎａ　Ｒｓｃｈｅｖ種を、Ｅｓｔｅｌｌｅ、　Ｍ、Ａ、およびＳｏｍｅｒｖｉｌｌｅ、　Ｃ，、Ｍｏ１．　Ｇｅｎ、　ｃｅｎｅｔ、、　２０８：　２００−２０８（１９８７）および５ｃｈｅｆｅｌｂｅｉｎ、　ＪＪ、およびＳｏｍｅｒｖｉｌｌｅ。

Ｃ，Ｒ，、Ｐｌａｎｔ　Ｃｅ１１．２：　２３５−２４３　（１９９０）に記載の無機元素、０．８％寒天（Ｄｌｆｃｏ　）および１％スクロースを含む縦型ベトリ皿で無菌的に生育させた。ｌＯ〜１２日令の植物からの根を取り出して、Ｖａｌｖｅｋｅｎｓ、　Ｄ、　、Ｖａｎ　Ｍｏｎｔａｇｕ。

Ｘ、およびＶａｎ　Ｌｉｊｓｅｂｅｔｔｅｎｓ、　Ｍ、、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ。

Ｓｃｉ、　ＵＳＡ、　８５：　５５３８−５５４０　（１９Ｈ）に記載の通りに形質転換に用いた。

ＴＯおよびＴ１トランスジェニック植物からの種子を無機元素、１％スクロース、０．８％寒天（Ｄｌｆｃｏ　）および５０Ｈｇ／■１のカナマイシンを含む培地で生育させた。

１０−１４日間の生育の後、カナマイシン耐性（Ｋｍ　）のトランスジェニック植物は緑色の葉を着けたが、形質転換しないカナマイシン感受性（Ｋｍ　ｓ）の植物は黄色の葉を着けた。この段階で、Ｋｍ　植物を寒天プレートから取り出し、肥沃にした土壌に移植することができた。

ゲノムＤＮＡの抽出および制限エンドヌクレアーゼ開裂野生型とトランスジェニック植物を土壌で２〜３週間生育させ、約５ｇの葉の物質を収集し、液体窒素で冷凍した。高分子量ＤＮＡを、Ｒｏｇｅｒｓ、　Ｓ、Ｃ，およびＢｅｎｄｉｃｈ。

Ａ、Ｊ、　、Ｐｌａｎｔ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　Ｍａｎｕａｌ　ＡＯ：　１−１０＜１９８８）に記載の方法によって凍結した植物組織から抽出した。酵素器ｎ旧１１による制限エンドヌクレアーゼ開裂は、製造業者が勧める条件で行った（Ｎｅｗ　ＥｎｇｌａｎｄＢｌｏｌａｂｓ　Ｉｎｃ、、マサチューセッツ）。

アガロースゲル電気泳動によるＤＮＡ分析とナイロン膜（Ｈｙｂｏｎｄ−Ｎ、　Ａｍｅｒｓｈａ＊、イリノイ）への移行は、５ｏｕｔｈｅｒｎ、　Ｅ、Ｍ、、Ｊ、　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、、　３８：　５０３−５１７　（１９７５）およびＳａｇｂｒｏｏｋ、　Ｊ、　Ｆｒ１ｔｓｃｈ、　Ｅ、　Ｆ、およびＮａｎｆａｔｌｓ。

Ｔ１、Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　ＣＣｌ０ｎｌｎ　ａ　１ａｂｏｒａｔｏｒｙ　ｍａｎｕａｌ　、ＣｏｌｄＳｐｒｌｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ　（１９８９年）に記載の確立された方法を用いて行った。プローブとして用いられる特異的にクローニングしたＤＮＡフラグメントを適当な制限エンドヌクレアーゼでベクターから取り出し、インサートをアガロースゲル電気泳動およびＤＥＡＥセルロース膜を用いる電気溶出によってベクターから精製した。

プローブは、Ｐｅｌｎｂｅｒｇ、　Ａ、Ｐ、およびＶｏｌｇｅｌｓｔｅｌｎ、Ｓ、、Ａｎａｌ、Ｂｌｏｃｈｅｍ、、１３８：　８−１３　（１９８Ｂ）に記載の方法によってヘキサマーを用いてランダムプライマー伸張法によって３２Ｐ−デオキシリボヌクレオチドで標識した。ナイロンフィルターを標識したプローブでハイブリッドし、Ｐｏ１ｒｌｅｒ、　Ｙ、およびＪｏｌｉｃｏｅｕｒ、　Ｐ、、Ｊ、　Ｖｉｒｏｌ、、　８３：　２０８８−２０９８　（１９８９）に記載の方法にょってフィルター上に暴露した。

ＲＮＡ単離および電気泳動全ＲＮＡを、Ｐｕ１ｓｓａｎｔ、　Ｃ，およびＨｏｕｄｅｂｌｎｅ、　Ｌ、Ｍ、、ＢｌｏＴｅｃｈｎｌｑｕｅｓ、　８：　１４８−１４９　（１９９０）に記載の方法によって凍結した葉の試料から単離した。単離したＲＮＡをホルムアルデヒドを含むアガロースゲル中で電気泳動によって分離し、５ａｓｂｒｏｏｋ、　Ｊ、　Ｐｒ１ｔｓｃｈ、　Ｅ、　Ｆ、およびＭａｎｌａｔｉｓ、　Ｔ、、Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　、、　ａ　ｌａｂｏｒａｔｏｒｙｍａｎｕａｌ　、Ｃｏ１ｄ　ＳｐｒＩｎｇ　ｔｌａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ（１，９８９年）に記載の方法によ７てナイロン膜（Ｈｙｂｏｎｄ−Ｎ、＾ｍｅｒｓｈａｗ、イリノイ）に移した。ナイロンフィルターを、前項に記載の標識したプローブでバイブ凍結した葉の試料１ｇを、１００５Ｍ　トリス−ＨＣＩ（ｐ　Ｈ８，０）　、４０ｍＭＭｇ　Ｃｌ　２および５ｇ＋Ｍβ−メルカプトエタノールを含む水冷緩衝液２１中でホモゲナイズした。ホモゲネートを１０，０ＯＯＸ　ｇで２分間遠心分離して透明にし、上清を新しい試験管に移した。抽出物のタンパク質含量を、ＢＩｏＲａｄタンパク質分析キット（ＢｉｏｒａｄＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ　、カリフォルニア）を用いてＢｒａｄｆｏｒｄ法によって測定した。分析当たりに、３〜３０μｇの植物タンパク質抽出物を用いた。タンパク質抽出物は、細菌からも調製した。この場合には、細菌の静止培養物を遠心分離によってベレット化し、氷冷した分析緩衝液で１回洗浄し、同じ緩衝液２００μｌに再懸濁した。細菌懸濁液を超音波処理によって溶菌し、ホモゲネートを遠心分離によって透明にし、抽出物のタンパク質含量をＢｒａｄｆｏｒｄ法によって測定した。分析当たりに、細菌タンパク質抽出物０．２〜１ｇを用いた。

様々な抽出物の３−ケトチオラーゼ酵素の活性を、５ｅｎｉｏｒ、　Ｐ、Ｊ、およびＤａｖｅｓ、　Ｅ、Ａ、、旧ｏｃｈｅｍ、　Ｊ、、　１３４：　２２５−２３８　（１９７３）に記載の方法に従って測定した。

アセトアセチル−ＣｏＡレダクターゼ活性の測定凍結した葉の試料１ｇを、１００■ＭＫＨ２ＰＯ４（ｐＨ５−５）　、０．０２ｇ＋ＭＭ　ｇ　Ｃ１２および４．０ｍＭβ−メルカプトエタノールを含む水冷緩衝液２ｓｌ中でホモゲナイズし゛た。ホモゲネートをｔｏ、ｏｏｏｘ　ｇで２分間遠心分離することによって透明にし、上清を新しい試験管に移した。抽出物のタンパク質含量を、ＢｉｏＲａｄタンパク質測定キ・ソトを用いてＢｒａｄｆｏｒｄ法によって測定した。分析当たりに、植物タンパク質抽出物０．８〜１０μｇを用いた。細菌抽出物も、本質的に前項に記載の方法によって分析緩衝液中で調製した。アセトアセチル−ＣｏＡレダクターゼ酵素の活性は、５ｅｎｉｏｒ、　Ｐｌ、およびＤａｖｅｓ、　Ｅ、Ａ、　、Ｂｉｏｃｈｅｓ。

Ｊ、、　１３４：　２２５−２３８　（１９７３）に記載の方法に従って測定した。

ガスクロマトグラフィおよびマススペクトロメトリー分板２つの方法を用いて、ＧＣ分析用の植物抽出物を調製した。第一の方法では、新鮮なまたは凍結した植物物質（葉または全若技）　０．００５〜０．０５ｇを、クロロホルムと水の１＝１溶液１〜２ｍｌで、６５℃で１６時間、一定速度で撹拌を行いながら抽出した。次に、植物物質を水中でホモゲナイズし、クロロホルムと水の１：１溶液中で１６時間６５℃で一定速度で撹拌しながら再抽出した。

クロロホルム相を新しい試験管に移し、等容の水で１回抽出した。

クロロホルム相の最終容積を０．５■！に調整し、下記のようにエタノールとＨＣＩとでエステル交換に用いた。第二の方法では、凍結または新しい植物物質０．００５〜０．１５ｇを５０％エタノールで５５℃で２時間、１００％メタノールで５５℃で２時間および１００％ジエチルエーテルで室温で１５分間、連続的に抽出した。次に、残っている組織を水中でホモゲナイズし、乾燥して、クロロホルム０．５１でｉｏｏ℃で４時間抽出した。

第一および第二の方法によって得た最終的なりロロホルム抽出物（０，５ｍ１）を、濃ＨＣ１０，２■！および１００％エタノール１．７■！を加え、１００℃ で２時間加熱すること（こよってエステル交換した。次に、反応混合物を室温まで冷却し、りｏｏホルム相を０．９％Ｎａ　Ｃｌ　（ｗ／ｖ）　２■！で２、再抽出し、最終的な有機相を１００μｍに減少させた。標準品としては、市販のＰ　ＨＢ　（Ｓｉｇｇ＋ａ　ＣｈｅｓｉｃａＩＣｏ、、ミズーリー）を加温したクロロホルムに溶解し、１■ｇを前記のようにしてエステル交換した。

エチルエステルを含むクロロホルム相をＧＣ用バイアル瓶に移して、１μｌをプログラム可能なオートサンプラーと５Ｐ−２３３０ガラス毛細管カラムを備えたｎｅｗ＋ｅｔｔＰａｃｋａｒｄ　５８９０シリーズＪＩＧ　Ｃに注入した。キャリヤーガスとしてのヘリウムの近似的な直線速度は２０ｃｍ／秒であった。注入部の温度は２２０℃に設定し、フレームイオン化検出器部の温度は２２０℃に設定した。下記の温度勾配を用いた。６５℃で４分間、その後温度を２０℃／分の速度で１９５℃まで上昇させ、１９５℃で３．５分間。実験後の温度は２０℃／分の速度で６５℃まで低下させる。

目的のピークの同定は、ＧＣ−マススペクトロメトリーによって行った。電子衝撃マススペクトルデーターは、Ｈｅｖｌｅｔｔ　Ｐａｃｋａｒｄ　５８９０　ＧＣを連結したＪＥＯＬ　ＪＭＳ−ＡＸ５０５Ｈマススペクトロメーターで得た。

下記のパラメーターを用いた。ソース温度、２００℃；イオン化電流、■００μ Ａ；加速電圧、３　ｋｅＶ　ｏ　Ｊ　＆　Ｗ　５ｃｌｅｎｔｉｆ’ｉｃ　Ｃｏ、製カラムＤＢ−２２５をマススペクトロメーター源に直接挿入し、ヘリウムをキャリヤーとして用いた。スプリットレス・インジェクターを２６０℃に保持し、トランスファー系統を２６０℃に保持した。同じＧＣオーブン温度勾配を用いた（前節を参照）。

透過型電子顕微鏡法植物組織を０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７，２）中で３％グルタルアルデヒドで、室温で１．５〜２時間固定した。

試料を０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７，２）で４回洗浄し、リン酸緩衝液中１％０６０４中に室温で２時間固定した。

次に、組織を等綴付けした一連のエタノールで脱水し、５ｐｕｒｒｓエポキシ樹脂に埋設した。８０〜９０ｎｍの切片を切断し、銅グリッド上に置き、５％酢酸ウラニルで３０〜４５分間染色した後、Ｒｅｙｎｏｌｄｓのクエン酸鉛で３〜４分間染色した。切片を、８０ｋＶテ操作するＪＥＯＬ　１００ＣＸ　Ｉ！透過型電子顕微鏡で観察した。

他の植物本明細書に記載の発明の具体例は、植物＾ｒａｂ１ｄｏｐｓ１ｓｔｈａｌｉａｎａおよびＡｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ　ｅｕｔｒｏｐｈｕｓ由来の遺伝子を含むものであったが、しかし本発明は一般的に利用され得るものである。植物におけるポリヒドロキシブチレートおよび／またはポリヒドロキシアルカノエートの産生に関する請求の範囲は＾ｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ　ｔｈａｌｉａｎａに限定されず、Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ　ｅｕｔｒｏｐｈｕｓ由来の遺伝子の使用に特異的に連ながるものではない。下記の請求の範囲は植物細胞に異種ＤＮＡ物質を導入することによる植物におけるポリヒドロキシアルカノエートを産生させる一般的方法を記載する。このような植物には、前記の植物およびニンジン、ヒマラリ、タバコ、トマトおよびジャガイモ等があげられる。

植物の各種の系統由来の種子は、プダベスト条約に基づきｓ　ｔｈｅ　Ａｍｅｒｉｃａｎ　ＴＹ９ｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃ０１ｌｅｅＬ１０ｎｓ１２３０１バークローン・ドライブ、ロックビル、メリーランド２０８５２に寄託されている。

これらの系統にはアセトアセチル−ＣｏＡレダクターゼ遺伝子を含むＲｅｄＤ− ３Ａ（ＡＴＣＣ７５０４４）　、Ｐ　ＨＢシンターゼ遺伝子を含む８ｇ−１−２Ａ　（ＡＴＣＣ７５０４３）および３−ケトチオラーゼ遺伝子を含むＴ４−２Ａ　（ＡＴＣＣ７５０４２）がある。これらの遺伝子はそれぞれ配列番号１に示される通りである。

上記の具体的な説明は単に本発明の例示のためのものであり、本発明は、請求の範囲によってのみ制限されるものである。

付属書類（１）一般的情報（ｉ）　Ａｐｐｌｉｃａｎｃｓ：　Ｃｈｒｉｓ　Ｓｏｍｅｒｖｉｌｌｅ、　Ｙｖｅｓ　Ｐｏ１ｒｉｅｒ。

Ｄｏｕｇｌａｓ　Ｄｅｎｎｉｓ（ｉｉ）　Ｔｉｔｌｅ　ｏｆ　Ｉｎｖｅｎセｉｏｎ：　Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ　Ｐｌａｎｔ　ＭａｔｅｒｉａｌｓＰｒｏｄｕｃｉｎｇ　Ｐｏ１ｙｈｙｄｒｏｘｙａｌｋａｎｏａｔｅｓ（ｉｉｉ）　Ｎｕｍｂｅｒ　ｏｆ　５ｅｑｕｅｎｃｅｓ＝　１（ｉｖ）　Ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｅｎｃｅ　Ａｄｄｒｅｓｓ：（Ａ）　Ａｄｄｒｅｓｓｅｅ：　工ａｎ　Ｃ，ＭｃＬｅｃｘｉ（Ｂ）　５ｔｒｅｅｔ：　２１９０　Ｃｏｍｍｏｎｓ　Ｐａｒｋｗａｙ（Ｃ）　Ｃ１ｔｙ：　Ｏｋｅｍｏｓ（Ｄ）　５ｔａｔｅ：　Ｍｉｃｈｉｇａｎ（Ｅ）　Ｃｏｕｎｔｙ：　工ｎｇｈａｍ（Ｆ）　Ｚｉｐ　Ｃｏｄｅ：　４８８６４（ｖ）　Ｃｏｍｐｕｔｅｒ　Ｒｅａｄａｂｌｅ　Ｆｏｒｍ：（Ａ）　Ｍｅｄｉｕｍ　Ｔｙｐｅ：　Ｄｉｓｋｅｔｔｅ　５．２５　１ｎｃｈ、３６０　ＫｂＳｔｏｒａｇｅ（Ｂ）　Ｃｏｍｐｕｔｅｒ：よりＭ　ＡＴ（Ｃ）　Ｏｐｅｒａｔｉｎｇ　Ｓｙｓｔｅｍ：　ＭＳ−ＤＯ５（ｖｅｒｓｉｏｎ　４）（Ｄ）　Ｓｏｆｔｗａｒｅ：　Ｗｏｒｄｐｅｒｆｅｃセ　５．１（ｖｉｉｉ）Ａｔｔｏｒｎｅｙ／Ａｇｅｎセ　エｎｆｏｒｍａセｉｏｎ：＋ＡＩ　Ｎａｍｅ：　工ａｎ　Ｃ，ＭｃＬｅｏｄＣＢ）　Ｒｅｇｉｓｔｒａセｉｏｎ　Ｎｏ、＝　２０，９３１ｔｅｌ　Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ／Ｄｏｃｋｅｔ　Ｎｕｍｂｅｒ：　ＭＳｔＪ　４．１−１３１（ｉｘｌ　Ｔｅｌｅｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎ　工ｎｆｏｒｍａセｉｏｎ：（Ａ）　Ｔｅ１ｅｐｈｏｎｅ：　（５１７）　３４７−４１００（Ｂ）　Ｔｅ１ｅｆａｘ：　（５１７）　３４７−４１０３（２）配列番号１の情報（ｉ）配列の特徴（Ａ）長さ：４９８０ｂｐ（Ｂ）型　：ペプチド前駆体をコードする核酸（Ｃ）鎖　：二本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（１１）分子の型（Ａ）種類：　Ｇｅｎｏｍｉｃ　Ｄ　Ｎ　Ａ（ｉｆｆ）ハイポセテイカル＝ＮＯ（ｉｖ）　：アンチセンス二Ｎ０（ｉｖ）：起源（Ａ）：生物：　Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ　ｅｕｔｒｏｐｈｕｓ（ｖｉｉ）：直接の起源（Ａ）：ライブラリー：　Ｇｅｎｏｉｉｃ（Ｘｉ）　：配列番号１ｌ　ＣＣＣＧＧＧ　ＣＡＡＧＴＡＣＣＴＴＧ　ＣＣＧＡ　ＣＡＴ　ＣＴＡＴＧ　ＣＧ　ＣＴＧＧ　ＣＧＣＧＣｋＣＧＣＧＣＣＴＧＧＣＧＣＧ@ＣＧ　ＣＣＧＧ４９２１　ＧＣＡＧＣＧＧＣにＣＡＧＣＣＡＧＣＡＣＣＡＴＧＴｒＣＧＴＧＣＡＧＣＧＣにＧＣＣＣＴＣＧＣＧＧＧＧＧＣＧＡＧＧＣＴにＣ`Ｇ一− ばっＭ／ＺＦＩＧ、９ＢＦＩＧ、　１０ＡＦＩＧ、１０ＢＦｆＧ、１０ＣＦｉＧ、１０ＤＦＩＧ、１０ＥＦｉＧ、１０Ｆフロントページの続き（８１）指定国　ＥＰ（ＡＴ、ＢＥ、ＣＨ，ＤＥ。

ＤＫ、ＥＳ、ＦＲ，ＧＢ、ＧＲ，ＩＴ、ＬＵ、ＭＣ，ＮＬ、ＳＥ）、０Ａ（ＢＦ、ＢＪ、ＣＦ、ＣＧ、ＣＩ、ＣＭ、ＧＡ、ＧＮ、ＭＬ、ＭＲ，ＳＮ、ＴＤ、ＴＧ）、ＡＵ、ＢＢ、ＢＧ、ＢＲ，ＣＡ、Ｃ３，ＦＩ、ＨＵ、ＪＰ。

ＫＰ、ＫＲ，ＬＫ、ＭＧ、ＭＮ、ＭＷ、Ｎｏ、ＲＯ，ＲＵ、５Ｄ（７２）発明者　デニス、ダグラス　ニドワードアメリカ合衆国バージニア用、ウエイヤーズ、ケープ、ボックス、９２ニー、ルート、

Claims

【特許請求の範囲】

１．ポリヒドロキシアルカノエートを生産する異種ＤＮＡを含んでなる、好ましくはポリヒドロキシアルカノエートがポリヒドロキシプチレートである、トランスジェニック植物物質。
２．ポリヒドロキシプチレートを合成する酵素を産生するＤＮＡおよびＲＮＡのコード配列が配列番号１に示されるものである、請求の範囲第２項に記載の植物物質。
３．３−ケトチオラーゼ活性を示すペプチドをコードする異腫ＤＮＡを含んでなる、好ましくはそのＤＮＡが配列番号１の２６９６と３８７７の間のオープンリーディングフレームである、トランスジェニック植物物質。
４．アセトアセチル−ＣｏＡレダクターゼ活性をコードする異種ＤＮＡを含んでなる、好ましくはそのＤＮＡが配列番号１の３９５２と４６９２の間のオープンリーディングフレームである、トランスジェニック植物物質。
５．ＰＨＡシンターゼ活性を示すポリペプチドをコードする異種ＤＮＡを含んでなる、トランスジェニック植物物質。
６．ヒドロキシアルキル−ＣｏＡからポリヒドロキシアルカノエートを合成する一種類以上の酵素をコードする異種ＤＮＡを含んでなる、好ましくはそのＤＮＡが配列番号１の８４２と２６１１の間のオープンリーディングフレームである、トランスジェニック植物物質。
７．ヒドロキシアルキル−ＣｏＡの合成を触媒する一種類以上の酵素をコードする異種ＤＮＡを含んでなる、トランスジェニック植物物質。
８．異種ＤＮＡによってコードされた生成物からアセトアセチル−ＣｏＡを産生する一種類以上の酵素をコードする異種ＤＮＡを含んでなる、トランスジェニック植物物質。
９．種子または種子の胎芽である、請求の範囲第１〜８項のいずれか一項記載の植物物質。
１０．植物中にポリヒドロキシアルカノエートを合成するポリペプチドをコードする異種ＤＮＡを導入する方法であって、ポリヒドロキシアルカノエートを産生しない二種類の植物を有性生殖によって交配することを含んでなり、それぞれがポリヒドロキシアルカノエートシンターゼによってヒドロキシアルキル−ＣｏＡを重合してポリヒドロキシアルカノエートをコードする植物を生産させるような経路における一種類以上の異なる酵素をコードする異種ＤＮＡを含んでなるものである、好ましくはポリヒドロキシアルカノエートがポリヒドロキシプチレートである、方法。
１１．ポリヒドロキシアルカノエートが植物の細胞中の顆粒である、請求の範囲第１０項に記載の方法。
１２．３−ケトチオラーゼ遺伝子をコードするＤＮＡを含むＡＴＣＣ７５０４２として寄託された種子に含まれる遺伝子セグメント。
１３．好ましくは植物がＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ　ｔｈａｌｉａｎａである、請求の範囲第１２項に記載の遺伝子セグメントを含む植物。
１４．アセトアセチル−ＣｏＡレダクターゼ遺伝子をコードするＤＮＡを含むＡＴＣＣ　７５０４４として寄託された種子に含まれる遺伝子セグメント。
１５．好ましくは植物がＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ　ｔｈａｌｉａｎａである、請求の範囲第１４項に記載の遺伝子セグメントを含む植物。
１６．ＰＨＢシンターゼ遺伝子をコードするＤＮＡを含むＡＴＣＣ　７５０４３として寄託された種子に含まれる遺伝子セグメント。
１７．好ましくは植物がＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ　ｔｈａｌｉａｎａである、請求の範囲第１６項に記載の遺伝子セグメントを含む植物。
１８．異種ＤＮＡによってコードされた生成物から３−ヒドロキシプチリル−ＣｏＡを産生する一種類以上の酸素をコードする異種ＤＮＡを含んでなる、トランスジェニック植物物質。