SK6494A3 - Transgenic plants material producing polyhydroxyalkanoates - Google Patents

Transgenic plants material producing polyhydroxyalkanoates Download PDF

Info

Publication number
SK6494A3
SK6494A3 SK64-94A SK6494A SK6494A3 SK 6494 A3 SK6494 A3 SK 6494A3 SK 6494 A SK6494 A SK 6494A SK 6494 A3 SK6494 A3 SK 6494A3
Authority
SK
Slovakia
Prior art keywords
phb
plant
transgenic
dna
plants
Prior art date
Application number
SK64-94A
Other languages
English (en)
Inventor
Christopher R Sommerville
Yves Poirier
Douglas E Dennis
Original Assignee
Univ Michigan State
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=24942760&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=SK6494(A3) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Univ Michigan State filed Critical Univ Michigan State
Publication of SK6494A3 publication Critical patent/SK6494A3/sk

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0006—Oxidoreductases (1.) acting on CH-OH groups as donors (1.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8242—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits
    • C12N15/8243—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits involving biosynthetic or metabolic pathways, i.e. metabolic engineering, e.g. nicotine, caffeine
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/1025—Acyltransferases (2.3)
    • C12N9/1029—Acyltransferases (2.3) transferring groups other than amino-acyl groups (2.3.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/62—Carboxylic acid esters
    • C12P7/625—Polyesters of hydroxy carboxylic acids

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Nutrition Science (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
  • Polyesters Or Polycarbonates (AREA)
  • Biological Depolymerization Polymers (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Compounds Of Unknown Constitution (AREA)
  • Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)

Description

Oblasť techniky
Tento vynález sa týka transgénnych rastlinných materiálov, ktoré produkujú poly-beta-D-hydroxybutyráty (PHB) a podobné polyhydroxyalkanoáty (PHA). Tento vynález sa teda týka zavedenia a expresie genetického informačného materiálu, tj. DNA, ktorá obsahuje gény kódujúce proteínové materiály a/lebo gény regulujúce lebo inak ovlivňujúce ich produkciu, do buniek vyšších rastlín a regeneráciu úrodných rastlín z geneticky transformovaných buniek. Účelom tejto genetickej intervervencie je prenos schopnosti syntetizovať polymérne materiály zostavené z lineárnych polyesterov hydroxykyselín z mikrobiálnych organizmov na vyššie rastliny. Táto skupina materiálov sa obecne označuje ako polyhydroxyalkanoáty. Špecifickým tu uvedeným príkladom je produkcia polyhydroxybutyrátu (PHB).
Doterajší stav techniky
Mnoho druhov baktérií zhromažďuje granule polyesterov zostavené z hydroxyacylmonomérov, ktoré slúžia ako zásoba uhlíku. Výskyt, metabolizmus, metabolická úloha a priemyslové využitie bakteriálnych polyhydroxyalkanoátov bolo nedávno súhrnne dokumentované Andersonom a spol. [Anderson A., Dawes E.A.: Microbiol. Rev. 54, 450 až 472 (1990).]. Nejobvyklejšie sa vyskytujúcou zlúčeninou tejto skupiny je poly(D(-)-3-hydroxybytyrát). Niektoré druhy však akumulujú kopolyméry iných hydroxyalkanoátov, ako je napríklad 3-hydroxypentanoát [Wallen J.L., Rohwedder W. : Environ Sci. Technol. 8., 576 až 579 ( 1974).}. Ako zložky polymérov z morských sedimentov bolo nájdených aspoň 11 3-hydroxykyselín s krátkym reťazcom. Štúdie produkcie polyhydroxyalkanoátov v Alcaliqenes eutrophus ukázali, že ak sa baktérie kultivujú v médiu, ktoré má ako zdroj uhlíku len glukózu, akumuluje sa len PHB. Avšak ak sa ako zdroj uhlíku používá ako glukóza tak kyselina propionová, baktérie j·.;· akumulujú náhodné kopolyméry 3-hydroxypentanoátu a 3-hydroxybutyrátu [Holmes P.A.: Phys. Technol. 16, 32 až 36 (1985), Holmes P.A., Wright L.F., Collins S.H.: európske patenty 0 069 497 (január 1983) a 0 052 459 (december 1985).]. A ďalej, ak sa A. eutrophus dodávajú rôzne iné zdroje uhlíku, produkujú sa polyestery, ktoré obsahujú 4-hydroxybutyrát a 5-hydroxyvalerát [Tabulka I v citácii Anderson A.J., Dawes A.E.: Microbiol. Rev. 54, 450 až 472 (1990).]. Je teda zrejmé, že zloženie polyméru je do istého stupňa regulované dostupnosťou alternatívnych substrátov pre enzýmy, ktoré katalyzujú syntézu polyméru z monomérov.
PHB sa akumuluje v bakteriálnych bunkách ako granule s priemerom približne 0,24 až 0,5 μιη. Na základe meraní molekulovej hmoty PHB monomérov bolo zistené, že každá granula obsahuje minimálne 1000 polymérnych reťazcov. Bolo navrhnuté, že granule majú membránový poťah zložený z lipidov a proteínov, ktoré predstavujú približne 0,5 a 2 % hmotnosti granule [Anderson A., Dawes E.A.: Microbiol. Rev. 54 , 450 až 475 (1990).]. Predpokladá sa, že aktivita PHB syntázového enzýmu súvisí s touto membránou. Stav PHB vnútri tejto granule je v podstate neistý. Nedávny dôkaz navrhuje, že polymér vnútri granulí je v amorfnom stave. Nie je známe, čo reguluje veťkosť PHB granulí v akomkoívek organizme.
Vo väčšine organizmov sa PHB syntetizuje z acetylkoenzýmu A (acetyl-CoA) radom troch reakcii katalyzovaných 3-ketotiolázou (acetyl-CoA acetyltransferáza; EC 2.3.1.9), acetoacetyl-CoA reduktázou (hydroxybutyryl-CoA dehydrogenáza; EC 1.1.1.36) a poly(3-hydroxubutyrát)syntézou. Cesta je uvedená na obrázku 1. V Rhodospirillum rubrum sa PHB syntetizuje konverziou L(+)-3-hydroxybutyryl-CoA na krotonyl-CoA a D(-)-3-hydroxybutyryl-CoA. 3-Ketotioláza bola vyčistená z rôznych PHB-syntetizujúcich baktérií a bola študovaná na niekolkých druhoch vyšších rastlín. Predpokladá sa, že úloha enzýmov vo vyšších rastlinách je pri produkcii acetoacetyl-CoA pre produkciu mevalonátu a tiež pri degradácii mastných kyselín. Acetoacetyl-CoA reduktáza bola detegovaná u početných PHB-syntetizujúcich baktérií. Zdá sa, že niektoré druhy, vrátane A. eutrophus, majú dva izoenzýmy, ktoré sa líšia pokiaí ide o substrátovú špecifičnost a kofaktorové požiadavky. NADH reduktáza A. eutrophus je aktívna u D(-)- a L(+)-3-hydroxyacyl-CoA so 4 až 10 atómami uhlíku, zataíčo NADPH reduktáza je aktívna len u D(-)-3-hydroxyacyl-CoA so 4 až 5 atómami uhlíku. Enzým tohoto druhu nebol nikdy popísaný u vyšších rostlín. PHB syntázová aktivita bola detegovaná v PHB-akumulujúcich baktériách či už ako rozpustný enzým lebo ako aktivita viazaná na granule, podlá podmienok rastu. Obe formy enzýmu boli čiastočne vyčistené, ale neboli ešte vyčistené do homogenity vzhladom ku svojej nestabilite. PHB syntéza A. eutrophus je špecifická pre D(-)-enantioméry a pri testování s 3-hydroxyacyl-CoA bolo ukázané, že je aktívna len so substrátmi so 4 a 5 atómami uhlíku, čo súhlasí s pozorovaním že do polyméru sú týmto organizmom inkorporované len 3-hydroxykyselinové monoméry so 4 a 5 atómami uhlíku. Mechanizmus pôsobenia PHB syntézy zostává nejasný. Predpokladá sa, že úloha prenosu retazcov hraná syntázou musí byt nejakým spôsobom regulovaná molekulovou hmotou produkovaného polyméru, ktorá je charakteristická pre daný organizmus. PHB syntázová aktivita nebola nikdy popísaná u žiadnej rastliny.
Niekolko skupín vedcov nezávisle na sebe klonovalo a expresiou v E. coli získalo gény, ktoré sú obsiahnuté v biosyntéze PHB mikroorganizmom A. eutrophus [Slater
S.C. a spol.: J. Bacteriol. 170, 4431 až 4436 (1988),
Schubert F. a spol.: J. Bacteriol. 170, 5837 až 5847 (1988).]. Rekombinantné kmene E. coli nesúce fragment s 5200 pármi nukleotidov z A. eutrophus boli schopné akumulovat podstatné množstvá granule. Dvomi skupinami boli nukleotidov fragmentu s 5200
PHB ako intracelulárne tiež stanovené sekvencie pármi nukleotidov [Janes
B.B. a spol. v Novel Biodegradable Microbial Polymers, Dawes
E.A. (red.), Kluwer Academic Publishers, str. 175 až 198 (1990), Peoples O.P. a Sinskey A.J.: J. Biol. Chem. 264,
15293 až 15303 (1989).]. Analýza odvodených sekvencí aminokyselín otvorených čítacích fragmentov vo spojení s dôkazom založeným na genetických komplementačných štúdiách odhalili, že fragment s veľkosťou 5200 párov nukleotidov obsahoval tri úzko súvisiace gény kódujúce tri enzýmy požadované pre produkciu PHB. Byl podaný patent, ktorý sa týka použitia klónovaných génov na nadprodukciu biosyntetických enzýmov v baktériách [Peoples O.P. a Sinskey A.J.: medzinárodný patent Svetového úradu WO 89/00202 z januára 1989.].
Niektoré druhy baktérií a degradovať PHB a podobné článok: Anderson A. a Dawes E.A.: Microbiol. 472 (1990).]. Pretože tieto v mnohých typoch prirodzeného a aktivovaných kaloch rýchlo polyhydroxyalkanoáty sú teda zdroje biodegradovatelných Priemyslová produkcia PHB meradle začala je dodávaný na Avšak vzhľadom veľkých kultúr výroba takých škrob, ktorý sa vo vysokých množstvách, spôsobom genetického ktoré akumulujú PHB.
v roku 1982.
majú schopnosť vylučovať enzýmy polyhydroxyalkanoáty
Rev.
[prehľadný 54, 450 až prevládajú sa v zemi a podobné obnovitelné látok, kultiváciou baktérií vo veľkom produkovaný týmto spôsobom i označením Biopol. rastom a zberom moc drahšia ako ako je napríklad l rastlín akumuluje výhodné vyvinúť vyšších rastlín, bakteriálne druhy prostredia, PHB rozkladá. PHB zaujímavé ako termoplastických
PHB pod obchodným súvisiacim s je výroba PHB o trh UCI plc k cenám baktérií polymérnych materiálov, v mnohých druhoch vyšších
Môže byť teda inženierstva línie
V následujúcej časti a tabuľky.
budú stručne popísané obrázky
Obrázok 1 polyhydroxybutyrátu ( postupným pôsobením prevádza acetyl-CoA reduktázy, ktorá ukazuj e PHB) .
troch biochemickú
A. eutrophus enzýmov, na acetoacetyl-CoA, prevádza
D(-)-3-hydroxybutyryl-CoA, a PHB cestu výroby sa pHB produkuje 3-ketotiolázy, ktorá acetoacetyl-CoA acetoacetyl-CoA na syntézy, ktorá prevádza
D( -)-3-hydroxybutyryl-CoA na
Acetoacetyl-CoA je u rastlín a produkcie mevalonátu.
polyhydroxybutyrát. živočíchov prekurzorom
Obrázok 2 ukazuje sekvenciu nukleotidov PHB operónu z A. eutrophus. Táto sekvencia bola získaná od Janesa B., Hollara J. a Dennisa D., Novel Biodegradable Polymers, Dawes
E.A. (red.), Kluwer Academic Publishers, 175 až 190 (1990).
Otvorená čítacia oblasť od nukleotidu 842 do 2611 kóduje PHB syntázu (phbc gen) (aminokyseliny SI až S589). Otvorená čítacia fáza od nukleotidu 2696 do 3877 kóduje enzým 3-ketotiolázu (phb A gen) (aminokyselina TI až T393). Otvorená čítacia fáza od nukleotidu 3952 do 4692 kóduje enzým acetoacetyl-CoA reduktázu (phb B gen) (aminokyselina
R1 až R246). Sekvencie reštrikčných enzýmov Ddel, BstBI, PstI, Sací a Tthllll sú podčiarknuté. Tieto reštrikčné enzýmy boli použité pre subklónovanie génov phb.
Obrázok 3 ukazuje schématický súhrn stupňov, ktoré sú obsiahnuté v konštrukcii plazmidov pUC-THIO a pBI-THIO. Účelom druhého plazmidu je umiestniť, gén 3-ketotiolázy z A. eutrophus pod transkripčnú kontrolu promótoru CaMV 35S tak, aby bol transkribovaný vo vyšších rastlinách. Horný diagram predstavuje A. eutrophus PHB operón s približným umiestnením otvorenej čítacej fáze kódujúcej PHB syntázu, 3-ketotiolázu a acetoacetyl-CoA reduktázu. Horizontálne šipky ukazujú smer transkripcie. Dolný diagram označuje hlavné zložky plazmidov odvodených od pBI121: NPT II, gén neomycín-fosfotransferázy II kódujúci rezistenciu na kanamycín, CAMV 35S, 35S promótor vírusu karfiolovej mozaiky, poly A, polyadenylačnú sekvenciu, RB, pravú hraničnú sekvenciu T-DNA, a LB, lavú hraničnú sekvenciu T-DNA. Dolný diagram nie je nakreslený v merítku. Skratky miest reštrikčných enzýmov: D pre Ddel, P pre PstI, B pre BstBI, T pre Tthllll, BH pre BamHI, S pre Sací a H pre HindlII.
Obrázok 4 je schématický súhrn stupňov konštrukcie plazmidu pUC-SYN a pBI-SYN. Účelom druhého z plazmidov je umiestniť gén PHB syntázy z A. eutrophus pod transkripčnú
kontrolu promótoru CaMV 35S tak, aby bol transkribovaný vo vyšších rastlinách. Diagramy a skratky sú popísané na obrázku 3.
Obrázok 5 je schématický súhrn stupňov konštrukcie plazmidov pUC-RED a pBI-RED. Účelom druhého z plazmidov je umiestnil: gén acetoacetyl-CoA reduktázy z A. eutrophus pod transkripčnú kontrolu promótoru CaMV 35S tak, aby dochádzalo k jeho expresii vo vyšších rastlinách. Horné a spodné diagramy a skratky sú popísané na obrázku 3. Stredný diagram je zväčšením oblasti génu acetoacetyl-CoA reduktázy. Sú označené umiestnenia a sekvencie PCR primeru č. 1 a č. 2. Posledný nukleotid na 3' konci PCR primeru č. 1 zodpovedá nukleotidu 3952 na obrázku 2 a je prvým nukleotidom iniciačného kodónu génu reduktázy. Posledný nukleotid na 3' konci PCR primeru č. 2 je doplnkový k nukleotidu 4708 na obrázku 2. Sú označené d’aíšie miesta pre reštrikčné enzýmy BamHI a KpnI vytvorené PCR primermi.
Obrázok 6 ukazuje Southernovu blotovú analýzu netransformovanéj kontroly a transgénnych A. thaliana rastlín. Jeden gram genómovej DŇA z netransformovanej A. thaliana druh Rschew a z transgénnych rastlín sa rozštepí pôsobením reštrikčného enzýmu HindlII. Fragmenty sa oddelia elektroforézou na agarózovom géle a prenesú sa na nylonové membrány. Filtre sa hybridizujú s 32P-označenými DNA fragmentárni z génov (A) phbA, (B) phbB a (C) phbC. Boli analyzované tieto genómové DNA: divokého typu A. thaliana druh Rschew (pás a) a transgénny T4-3A (pás B), T3-2A (pás c), T4-2A (pás d), T4-3B (pás e), RedB-2G (pás f), RedB-2B (pás g), RedB-2E (pás h), RedB-2C (pás i), RedD-3A (pás j), RedB-2A (pás k), RedB-2D (pás 1), S12-3A (pás m), S8-1-2C (pás n), S8-1-2A (pás o) a S8PUC-2B (pás p). Čísla na lavej strane sú dĺžky v tisícoch párov nukleotidov (pn).
Obrázok 7 ukazuje Northernovu blotovú analýzu netransformovanej kontroly a transgénnych A. thaliana rastlín. Celková RNA z divokého typu A. thaliana druh Rschew (10 pg) a z transgénnych rastlín (20 pg) sa rozdelí elektroforézou na agarózových géloch obsahujúcich formaldehyd a prenesie sa na nylonové membrány. Filtre sa hybridizujú s 32P-označenými DNA fragmentárni z génov (A) phbA, (B) phbC a (C) phbB. Z rastlín boli analyzované tieto RNA: T3-2A (pás a), T4-2A (pás b), T1-3B (pás c), T4-3A (pás
d), divoký typ A. thaliana (pásy e, jar), S8PUC-2B (pás f), S8-1-2C (pás g), S12-3A (pás h), S8-1-2A (pás i), RedB-2D (pás k), RedB-2E (pás 1), RedB-2G (pás m), RedB-2A (pás n), RedB-2B (pás o), RedB-2C (pás p) a RedD-3A (pás q). Čísla znamenajú dĺžky v tisícoch párov nukleotidov (pn).
Obrázok 8 ukazuje plynovú chromatografiu (GC) vyčistených PHB a rastlinných extraktov. GC spektrá transesterifikovaného chloroformového extraktu listov netrasformovaného divokého typu A. thaliana druh Rschew (B) a F1 hybridu transgénnych rastlín S8-1-2A a RedB-2C (C) boli porovnané s chromatogramom transesterifikovaného komerčného PHB (A). Šípky označujú miesta etyl-hydroxybutyrátového maxima.
Obrázok 9 ukazuje analýzu plynovou chromatografiou a hmotovou spektrometriou etyl-hydroxubutyrátu pripraveného z PHB štandartu a PHB z rastlinných extraktov. (A): hmotové spektrum transesterifikovaného komerčného PHB, (B): hmotové spektrum GC maxima z chloroformového extraktu listov hybridu F1 (hybrid S8-1-2A s RedB-2C) s retenčným časom identickým s retenčným časom etyl-hydroxybutyrátu (ako je to uvedené na obrázku 8C).
Obrázok 10 ukazuje transmisné elektrónové mikrofotografie (TEM) listu a semena PHB-pozitívnych transgénnych A. thaliana rastlín. Transgénne rastliny
S8-1-2A a S8-1-2C boli skrížené opylením s transgénnymi rastlinami
RedB-2D a RedB-2A.
Výsledné semená F1 boli vysiate do pôdy a vzorky listov rastliniek starých 2 až 3 týždne boli analyzované TEM (mikrofotografie a až e).
Niektoré semená F1 boli tiež nechané nabotnať vo vode (24 hodín), embryo bolo vyrezané z potahu semena a kotyledony boli analyzované TEM (mikrofotografia F), (a): Dve prilahlé listové mezofylné bunky z RedB-2D X S8-1-2A F1 hybridu vykazujúce aglomerácie svietiacich (vlivom elektrónov) granulí v jadre, (b): Väčšie zväčšenie pravej hornej bunky z mikrofotografie a. (c): Jadro listovej mezofylnej bunky z RedB-2D X S8-1-2A F1 hybridu vykazujúce aglomeráciu granulí. (d): Listová mezofylná bunka z RedB-2A X S8-1-2A F1 hybridu vykazujúca svietiace granule v jadre (N) a vakuole (V). (e): Listová mezofylná bunka z RedB-2A X S8-1-2A F1 hybridu vykazujúca svietiace granule v cytoplazme. (f): Kotyledonové bunky z RedB-2A X S8-1-2C F1 hybridného semena vykazujúce granule v jadre. Šipky ukazujú aglomerácie svietiacich granulí. Čiarka znamená 1 μη pre mikrofotografie a, b, c, d a f. čiarka znamená 0,25 μιη pre mikrofotografiu e.
Podstata vynálezu
Tento vynález sa týka transgénneho rastlinného materiálu, ktorý sa vyznačuje tým, že obsahuje cudziu DNA, ktorá vedie k produkcii polyhydroxyalkanoátu.
Tento vynález sa ďalej týka transgénneho rastlinného materiálu, ktorý obsahuje cudziu DNA kódujúcu peptid, ktorý vykazuje 3-ketotiolázovú aktivitu.
Tento vynález sa týka tiež transgénneho rastlinného materiálu, ktorý obsahuje cudziu DNA kódujúcu peptid, ktorý vykazuje acetoacetyl-CoA reduktázovú aktivitu.
Tento vynález sa týka tiež transgénneho rastlinného materiálu, ktorý obsahuje cudziu DNA kódujúcu polypeptid, ktorý inhibuje PHB syntázovú aktivitu.
Tento vynález sa týka spôsobu zavedenia bakteriálnej DNA kódujúcej proteíny, ktoré sú potrebné na syntézu polyhydroxyalkanoátu, do rastliny, vyznačujúci sa tým, že zahrnuje pohlavné spojenie sexuálnym oplodnením dvoch rastlín, ktoré neprodukujú PHB, pričom každá obsahuje cudziu DNA kódujúcu jeden lebo viac rôznych enzýmov na ceste vedúcej k polymérácii polyhydroxyalkanoátovú syntézu za kóduje polyhydroxyalkanoát.
hydroxyalkyl-CoA na vzniku rastliny, ktorá
Podľa tohoto vynálezu sa teda získáva spôsob prípravy geneticky modifikovaných vyšších rastlín, ktoré produkujú a akumulujú PHB lebo podobné polyhydroxyalkanoáty. V jednom usporiadaní sa rastliny produkujúce PHB získavajú stabilným zavádzaním bakteriálnych génov, ktoré kódujú enzýmy acetoacetyl-CoA reduktázy (hydroxybutyryl-CoA dehydrogenáza) a poly(3-hydroxybutyrát)syntázy do rastlín transformáciou sprostredkovanou Ti-plazmidom. Pretože bakteriálne gény nie sú v rastlinných bunkách normálne transkribované, sú tieto gény modifikované tak, že sú pod transkripčnou kontrolou DNA transkripciu modifikované k nekodujúcej produkované promótoru), bunkách. príslušnej génov tak, bunkách sekvencie (tj.
v rastlinných pridaním -oblasti i rastlinných tiež v
polyadenylované.
ktorá indukuje Tieto gény sú
DNA sekvencie že transkripty sú príslušne
V jednom usporiadaní podlá vynálezu sa PHB-produkujúce rastliny ziskávajú sexuálnym skrížením dvoch rodičovských línií, ktoré neprodukujú PHB. Toto sa dosiahne skríženým opylením transgénnej rastlinnej línie homozygótnej pre ektopické kópie génu modifikovanej PHB syntázy transgénne rastlinnou líniou homozygótnou pre ektopické kópie modifikovaného génu acetoacetyl-CoA reduktázy. V tejto súvislosti sa pojem ektopické gény týka génov, ktoré nie sú normálne prítomné v organizme, ale ktoré sú stabilne integrované do genómu genetickou transformáciou. Byt homozygótný pre ektopické kópie znamená, že v diploidnom organizme majú obidva homológne chromozómy ektopický gén integrováný v rovnakom mieste chromozómu.
Pred vysvetlením vynálezu je užitočné vysvetlit definície niektorých pojmov, ktoré sú tu ďalej používané.
Transformácia znamená proces, ktorým sa mení genotyp organizmu príjemcu stabilným zavedením DNA akýmikoľvek spôsobmi.
Transgénna rastlina znamená rastlinu, ktorá obsahuje DNA sekvencie, ktoré normálne nie sú prítomné v tomto druhu, ale které boli do nej zavedené transformáciou.
Transkripcia znamená tvorbu RNA reťazca podľa genetickej informácie obsiahnutej v DNA.
Translácia znamená proces, pri ktorom genetická informácia v molekule mRNA riadi poradie špecifických aminokyselín behom syntézy proteínu.
Promótor znamená DNA fragment, ktorý spôsobuje transkripciu genetického materiálu. Pre tu popísané účele sa promótor používa pre označenie DNA fragmentov, ktoré dovolujú transkripciu do buniek rastlín. CaMV 35S-promótor je DNA fragment vírusu karfiólovej mozaiky, ktorý spôsobuje relatívne vysoké hladiny transkripcie v mnohých rôznych tkanivách mnohých druhov vyšších rastlín [Benfey P.N. a Chu
N. H.: Science 250, 959 až 966 (1990).].
Poly-A adičné miesto znamená nukleotidovú sekvenciu, ktorá spôsobuje, že isté enzýmy štepia mRNA vo špecifickom mieste a pridávajú sekvencie skupín kyseliny adenylovej na 3'-koniec mRNA.
phbC, phbA a phbB sú symboly génov A. eutrophus pre PHB syntázu, 3-ketotiolázu a acetoacetyl-CoA reduktázu [Peoples
O. P. a Sinskey A.J.: J. Biol. Chem. 264, 15298 až 15303 (1989) . ] .
Pri popise potomstva transgénnych rastlín je užitočné prijmúť konvenciu, ktorá označuje, ako mnoho generací samoopylenia uplynulo od zavedenia DNA. V tomto spise sa pôvodný transformant označuje TO generácia. Potomstvo, ktoré pochádza od samoopylenia tejto generácie je označené TI generácia atd’.
J.l.t•Jtú'ú.tl·^. ^>wvľLuA.4í UA>2/•.'.~^· ·. ·>’> :<,. »' h,.
V prípade skríženého opylenia dvoch rôznych rodičovských rastlín sa výsledné potomstvo pôvodného skríženého opylenia označuje ako F1 generácia.
Aj ked' sa pokusy, ktoré sú tu ďalej diskutované, týkajú rastlín druhu Arabidopsis thaliana (L.) Heynhold, popísaný postup je obecne aplikovateľný na akúkoľvek vyššiu rastlinu, pre ktorú je dostupný spôsob transformácie. Podobne, aj keď sa tu popísaný postup týka použitia génov z A. eutrophus, tu popísaný postup je obecne aplikovateľný na použitie génov z akéhokoľvek organizmu, ktorý je schopný syntézy PHB. Je tiež jasné, že aj keď sa tu popísaný postup týka produkcie PHB, tento postup je obecne aplikovateľný na produkciu akéhokoľvek polyhydroxyalkanoátu, ktorý sa normálne produkuje v mikroorganizmoch účinkom polyhydroxyalkanoátovej (PHA) syntázy (ktorá zahrnuje PHB syntázu) a pre ktorý sa v odpovedajúcej rastline produkuje príslušný hydroxyalkyl-CoA substrát.
Príklady prevedenia vynálezu
Návrh experimentu
Produkcia PHB v potomkoch transformovaných rastlín vyžaduje kompletáciu radu následujúcich stupňov:
1) konštrukciu radu bakteriálnych plazmidov obsahujúcich promótorové fúzie, 2) prenos týchto plazmidov do
Agrobacterium tumefaciens, 3) použitie A. tumefaciens na zavedenie génov do buniek rastlín (tj. v tomto prípade A. thaliana), 4) regeneráciu transgénnych rastlín, 5) výber rastlín, ktoré sú homozygótne pre ektopické gény, 6) analýzu funkcie ektopických génov v transformovaných rastlinách, aby sa zaistilo, že sa získajú expresie a že génové produkty sú funkčné, 7) produkciu hybridných rastlín obsahujúcich dva lebo viac rôznych ektopických génov sexuálnym skrížením, 8) analýzu hybridného materiálu na prítomnosť PHB. Tieto stupne sú popísané podrobnejšie v následujúcich častiach.
Konštrukcia trankripčných fúzií
Aby sa získala transkripcia bakteriálnych génov vo vyšších rastlinách, musia sa bakteriálne gény modifikoval pridaním rastlinného promótoru tak, aby sa po zavedení do vyšších rastlín transkribovali (prepisovali). Ďalej je obvyklá prax, že sa polyA adičné miesto pridá do 3' oblasti bakteriálnych génov, aby se získala príslušná expresia génov vo vyšších rastlinách. Obidve tieto požiadavky boli uspokojené klónovaním génov phbC, phbA a phbB z plazmidu pTZ18U-PHB do binárneho Ti plazmidového vektoru pBI121 (Clonotech, Ka. , USA). Nukleotidová sekvencia génov phbC, phbA a phbB, ktorá je obsiahnutá v plazmide pTZ18U-PHB, je uvedená na obrázku 2. Sú onačené miesta pre príslušné reštrikčné enzýmy použité pre klónovanie a tiež odvodená otvorená čítacia oblasť pre tieto tri gény.
CaMV 35S-phbA génová fúzia bola skonštruovaná tak, že se plazmid pTZ18U-PHB rozštepí pôsobením reštrikčných enzýmov PstI a Ddel. Reštrikčný fragment s 1300 nukleotidmi, ktorý obsahuje sekvenciu kódujúcu gén 3-ketotiolázy, sa oddelí od agarózovom celulózovou membrána). inkubáciou polymérazou fragment sa vzniku plazmidu nukleotidmi sa pôsobením BamHI a DEAE celulózovej predom rozštepený rovnakými dvomi enzýmami. Bolo že výsledný plazmid, označený pBI-THIO, má A.
3-ketotiolázový gén so k CaMV 3 5S promótoru a pBI121, takže je možné očakávať, ďalších
DNA fragmentov elektroforézou na izoluje DEAE NA-45 DEAE fragment sa z (Schleicher & konce DNA agarózy
Schuell fragmentu fragmentu se doplnia s T4 DNA géle. DNA membránou
Prečnievajúce vyčisteného reštrikčného dezoxynukleotid-trifosfátmi. klonuje do miesta Smal pUC-THIO. Reštrikčný vystepí z plazmidu
Sací, vyčistí sa elektroforézou s membrány a liguje sa do plazmidu potom v plazmide fragment pUC-THIO
Zarovnaný pUC18 za s 1300 štepením použitím pBI121, ktorý bol zistené, eutrophus vzhladom pBI-THIO, správnou orientáciou poly-A adičnému miestu že bude dochádzať k expresii vo vyšších rastlinách. Schematický súhrn stupňov, ktoré sú obsiahnuté pri konštruovaní pBI-THIO, je uvedený na obrázku 3.
CaMV 35S-pbhC génová fúzia sa skonštruuje tak, že sa plazmid pTZ18U-PHB rozštep! pôsobením reštrikčných enzýmov BstBI a Tthllll. Reštrikčný fragment s 1900 nukleotidmi, ktorý obsahuje sekvencie kódujúce gén PHB syntázy, sa oddelí od ďalších DNA fragmentov elektroforézou na agarózovom géle.
DNA fragment sa z agarózy izoluje DEAE Prečnievajúce konce DNA fragmentu vyčisteného reštrikčného fragmentu dezoxynukleotid-trifosfátmi. klonuje do miesta Smal v plazmidu pUC-THIO. Reštrikčný fragment sa vyšepí z plazmidu pUC-SYN úplným membránou.
inkubáciou polymerázou fragment sa vzniku nukleotidmi potom plazmidu celulózovou sa doplnia s T4 DNA
Zarovnaný pUC18 za s 1900 štepením pôsobením BamHI a čiastočným štepením pôsobením Sací, vyčistí sa elektroforézou s použitím DEAE celulózovej membrány a liguje sa do plazmidu pBI121, ktorý bol predom rozštepený rovnakými dvomi enzýmami. Bolo zistené, že výsledný plazmid, označený pBI-SYN, má A. eutrophus PHB syntázový gén so správnou orientáciou vzhladom k CaMV 35S promótoru a poly-A adičnému miestu pBI121, takže je možné očekávať, že bude dochádzať k expresii vo vyšších rastlinách. Schematický súhrn stupňov, ktoré sú obsiahnuté pri konštruování pBI-SYN, je uvedený na obrázku 4.
CaMV 35S-pbhB génová fúzia sa skonštruuje tak, že sa použije pár syntetických oligonukleotidov pre primery v polymerázovej reťazovej reakci (PCR), aby sa amplifikoval gén phbB z plazmidu pTZ18U-PHB. Sekvencia oligonukleotidových primerov je uvedená na obrázku 5, kde sú označené PCR primer č. 1 a PCR primer č. 2. Oligonukleotidy boli navrhnuté takým spôsobom, aby amplifikovaná DNA sekvencia obsahovala syntetické BamHI miesto blízko 5'-konca kódujúcej sekvencie a syntetické miesto KpnI na 3’-konci sekvencie. Produkt polymerázovej reťazovej reakcie s 790 pármi nukleotidov sa oddelí, vyčistí od agarózového gélu, rozštep! sa pôsobením BamHI a KpnI a liguje sa do plazmidu pUC18, ktorý bol predom rozštepený pôsobením rovnakých dvoch enzýmov. Získá sa tak plazmid pUC-RED.
Reštrikčný fragment sa vyštepí z pUC-RED štepením pôsobením BamHI a Sací, vyčistí sa elektroforézou s použitím DEAE celulózovej membrány a liguje sa do plazmidu pBI121, ktorý bol predom rozštepený rovnakými dvomi enzýmami. Bolo zistené, že výsledný plazmid, označený pBI-RED, má A. eutrophus acetoacetyl-CoA reduktázový gén so správnou orientáciou vzhľadom k CaMV 35S promótoru a poľy-A adičnému miestu pBI121, takže je možné očakávať, že bude dochádzať k expresii vo vyšších rastlinách. Schematický súhrn stupňov, ktoré sú obsiahnuté pri konštruování pBI-RED, je uvedený na obrázku 5.
Plazmidy pBI-SYN, pBI-THIO a pBI-RED boli elektroporáciou prenesené do Agrobacterium tumeŕaciens kmeňa C58 pGV3850. Kolónie, ktoré obsahujú plazmid, sa izolujú selekciou na expresiu génu rezistencie na kanamycín, ktorý je prítomný na rodičovskom plazmide pBI121.
Produkcia transgénnych rastlín
Bunky A. thaliana boli transformované inkubáciou sterilnej koreňovej tkáne s kultúrami A. tumefaciens, ktoré nesú rekombinantné binárne Ti plazmidy popísané v predchádajúcej časti. Korene zo sterilných sádzaničiek A. thaliana druh Rschew sa transformujú tak, ako je to popísané Valvekensom D a spol.: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 5536 až 5540 (1988). Na infikovanie kúskov koreňa A. thaliana sa použije každý z troch kmeňov A. tumefaciens nesúci jeden z modifiovaných phb génov. To vedie v každom prípade k izolácii približne 50 tkáňových kalusov rezistentných na kanamycín. Z nich 10 až 25 % poskytlo plodné výhonky, ktoré poskytli semená. Každá rastlina, ktorá poskytla semená, bola označená iným číslom, aby sa tak označilo, že predstavuje rozdielnu transformačnú udalosť.
Celkom bolo z tkaní spracovaných s A. tumefaciens, nesúcich plazmid pBI-RED, izolovaných 11 domnelých transgénnych rastlín. Tieto rastliny boli označené Redb-2A, -2B, -2C, -2D, -2E, -2F, -2G, -2H, -3A, -5A a RedD-3A. Všetky tieto transgénne rastlinné línie, s výnimkou RedB-2F,
-2Η a -5A, boli podrobne analyzované tak, ako je to popísané v následujúcich častiach.
Z tkaní spracovaných s A. tumefaciens, ktoré nesú plazmid pBI-THIO, bolo rastlín. Tieto rastliny T4-3B a T4-3C. Všetky s výnimkou T4-3C, boli popísané v následujúcich izolovaných 5 domnelých transgénnych boli označené T3-2A, T4-2A, T4-3A, tieto transgénne rastlinné línie, analyzované, podrobne častiach.
ako je to
Z tkání spracovaných s A. plazmid pBI-SYN, boli izolované tumefaciens, domnelé ktoré nesú transgénne rastliny. Tieto rastliny boli S12-3A a S8PUC-2A. Všetky tieto boli podrobne analyzované, označené S8-1-2A, S8-1-2C, transgénne rastlinné línie ako je to popísané v následujúcich častiach.
Prítomnosť T-DNA v domnelých transgénnych rastlinách bola potvrdená vysiatím semena z transgénnych rastlín na agarom spevnené minerálne médium, ktoré obsahuje 50 μg/ml kanamycínu. Táto koncentrácia kanamycínu bráni rastu netransformovaných rastlín A. thaliana, ale umožňuje normálny rast rastlinám, ktoré obsahujú gén NPTII nesený na plazmidoch odvodených od pBI121 lebo na plazmidu pBI121. Semená z transgénnych rastlín T4-2A, RedD-3A a S8-1-2A sú dostupné z Americkej zbierky typov kultur, Rockville, Md. 20850, USA.
Izolácia domnelých homozygótnych transgénnych línií
Minimálne kritérium, ktoré sa používá pri produkci homozygótnych transgénnych línií, je to, že sa očakáva, že všetci potomkovia z homozygótnej rastliny budú rezistentní na kanamycín. Pretože prítomnosť násobných ektopických kópií génu NPTII z pBI121 v rôznych miestach genómu môže spôsobiť podobný fenotyp, toto kritérium je nejužitočnejšie, ak primárna transformácia zahrnuje inzerciu T-DNA len do jediného chromozomálneho miesta.
Aby s.a identifikovali domnelé homozygótne línie, ponechá sa niekolko TI rastlín rezistentných na kanamycín z každej transgénnej línie rásť do zrälosti v reprodukčnej izolácii. Vo vzorkách približne 50 T2 semien z každej línie sa potom stanoví frekvencia rezistencie na kanamycín. Keď sú všetky T2 semená z príslušnej rastliny rezistentné na kanamycín, táto línia sa predbežne považuje za homozygótnu.
Analýza integrácie génov phb do transgénnych rastlín
Aby sa overila príslušná integrácia phb génov do rôznych pripravených transgénnych rastlinných línií, analyzuje sa genómová DNA transgénnych rastlín. Z kontrolných netransformovaných rastlín a z T3 transgénnych rastlín transformovaných plazmidmi pBI-THIO, pBI-RED a pBI-SYN sa izoluje DNA s vysokou molekulovou hmotou. Tieto DNA sa rozštepia retrikčními enzýmy HindlII, fragmenty sa rozdelia elektroforézou na agarózovom géle a prenesú sa na nylonový filter. Reštrikčný enzým HindlII štepí len raz na 5' konci CaMV 35S promótor v plazmidoch pBI-THIO, pBI-RED a PBI-SYN (obrázky 3, 4 a 5). Fragmenty, ktoré sa detegujú sondami špecifickými na phb gén, by mali teda predstavovať fragmenty spojenia Ti vektorov s rastlinnou genómovou DNA lebo vnútorné fragmenty Ti vektorov. Inzerty v plazmidoch pUC-THIO, pCU-RED a pUC-SYN boli vyštepené spracovaním s EcoRI a HindlII, vyčistené elektroforézou na agarózovom géle pomocou DEAE celulózovej membrány a označené 32P-deoxyribonukleotidmi náhodnou aktiváciou. Označené phb génové fragmenty sa potom použijú na sondovanie nylonových filtrov. Filtre sa hybridizujú a následne sa premyjú za prísne riadených podmienok. Výsledok týchto hybridizácií na filtre je uvedený na obrázku 6. Žiadny z troch phb génov nemôže býť detegovaný v transformovaných kontrolných rastlinách (obrázky 6A, 6B a 6C, pás a). phbA gén bol detegovaný vo štyroch transgénnych líniách pripravených transformáciou s plazmidem pBI-THIO (obrázok 6A, pásy b až
e). phbB gén bol detegovaný v siedmych transgénnych rastlinách pripravených transformáciou s plazmidom pBI-RED (obrázok 6B, pásy f až 1). A konečne, phbc gén bol detegovaný vo troch transgénnych rastlinách pripravených transformáciou s plazmidom pBI-SYN (obrázok 6C, pásy m až p). I keď rastlinná línia S12-3A bola rezistentná na 50 μg/ml kanamycínu, čo predpokladá integráciu NPTII génu, nemohol byt detegováný žiadny phbC gén. Je pravdepodobné, že do genómovej DNA rastlinnej línie S12-3A bol integrováný len fragment Ti vektoru nesúci NPTII gén a nie phbC gén.
Analýza expresie phb génov v transgénnych rastlinách
Aby sa zistilo, či dochádza k expresii A. eutrophus phb génov v rôznych transgénnych líniách, ako sondy v pokusoch hybridizácie na filtre sa použijú klónované gény prítomné v plazmidoch pUC-THIO, pUC-RED a pUC-SYN. Z netransformovaných kontrolných a z T3 transgénnych rastlín sa extrahuje celková RNA. RNA sa rozdelí elektroforézou na agarózových géloch obsahujúcich formaldehyd a známymi postupmi sa prenesie na nylonové filtre. Inzerty plazmidov pUC-THIO, pUC-RED a pUC-SYN sa vyštepia spracovaním s EcoRI a HindlII, vyčistia sa elektroforézou pomocou DEAE celulózovej membrány a označia sa 32P-dezoxyribonukleotidmi náhodnou aktiváciou. Označené phb gény sa použijú na sondovanie nylonových filtrov.
Tieto pokusy ukázali, že žiadna z troch phb sond nehybridizuje žiadnu RNA v netransformovanej kontrolnej rastline (obrázok 7, pásy e, ja r). Naopak, transgénne rastliny pripravené transformáciou s pBI-THIO mali RNA s veľkosťou 1600 párov nukleotidov (pn) , ktorá bola komplementárna ku génu
3-ketotiolázy (obrázok 7A, pásy a až d). CaMV 35S promótor a poly-A adičné sekvencie prítomné na plazmidoch odvodených od pBI121 prispievajú približne 300 pármi nukleotidov k celkové dĺžke mRNA pripravených z phb fúzovaných génov. Množstvo 3-ketotiolázovej mRNA bolo u rastlinnej línie T4-3A nízke vzhľadom k iným rastlinným líniám. A podobne, tri z transgénnych línií pripravených transformáciou s pBI-SYN mali mRNA s veľkosťou 2100 párov nukleotidov, čo zodpovedá génu PHB syntázy (obrázok 7B, pásy f, g a i). Transgénna línia S12-3A nemala žiadnu detegovateľnú mRNA hybridizujúci so sondou phbC (obrázok 7B, pás h). Tento výsledok je v súlade so Southernovou blotovou analýzou, ktorá neukazuje žiadnu integráciu phbC génu do genómovej DNA línie S12-3A (obrázok 6C, pás m). A konečne, sedem transgénnych línií pripravených transformáciou s plazmidom pBI-RED malo mRNA s veľkosťou 1100 párov nukleotidov, ktorá bola komplementárna ku génu acetoacetyl-CoA reduktázy (obrázok 7C, pásy k až q). Pre každý z troch phb génov boli teda získané aspoň tri nezávislé transgénne rastliny, ktoré expresiou poskytujú komplementárnu RNA s očakávanou veľkosťou.
I keď prítomnosť RNA ukazuje, že gény sú transkribované, neposkytuje žiadnu informáciu o tom, že sú preložené lebo že translačný produkt je funkčný. Táto funkčnosť bola skúmaná testovaním transgénnych rastlín na enzýmovú aktivitu.
Transgénne rastliny pripravené transformáciou s pBI-THIO boli analyzované na 3-ketotiolázovú aktivitu analýzou popísanou Seniorom P.J. a Dawesom E.A.: Biochem. J. 134, 225 až 238 (1973) s menšími modifikáciami. Zmrazená tkáň listov z T3 rastlín sa homogenizuje v Tris pufre. Vyčírené surové extrakty sa analyzujú na 3-ketotiolázovú aktivitu. Výsledky týchto pokusov sú uvedené v tabuľke 1. Extrakty z netransformovaných A. thaliana rastlín mali za podmienok testu velmi nízku úroveň 3-ketotiolázove j aktivity. Naproti tomu každá z transgénnych rastlín, o ktorej bolo zistené, že transkribuje phbA gén, mala podstatne zvýšenú úroveň tiolázovej aktivity. To naznačuje, že bakteriálny tiolázový gén je funkčný, ak dochádza k jeho expresii v transgénnych rastlinách. Avšak špecifická 3-ketotiolázová aktivita detegovaná v rôznych transgénnych rastlinách bola podstatne nižšia v porovnaní s extraktmi pripravenými z E. coli nesúcimi phbA gén na plazmide pTZ18U-PHB.
Tabuľka 1
Úrovne 3-ketotiolázovej aktivity v A. thaliana transgénnych rastlinách
vzorka 3-ketotiolázová aktivitaa
DH5alfa/PHBb 9,5
divoký tvo A. thaliana 0,019
T4-3A transgénna 0,057
T3-2A transgénna 0,42
T4-2A transgénna 0,43
T4-3B transgénna 0,54
a Mikromoly acetoacetyl-CoA degradovaného za minútu na miligram proteínu. Hodnoty sú priemerom zo dvoch až štyroch meraní.
b E. coli DH5alfa obsahujúce plazmid pTZ18U-PHB nesúci PHB operón.
Transgénne rastliny pripravené transformáciou s plazmidom pBI-RED boli analyzované na acetoacetyl-CoA reduktázovú aktivitu analýzou popísanou Seniorom P.J. a Dawesom E.A.: Biochem. J. 134, 225 až 238 (1973) s menšími modifikáciami. Listy z T3 rastlín sa homogenizujú v pufre fosforečnanu draselného. Vyčírené surové extrakty sa analyzujú na acetoacetyl-CoA reduktázovú aktivitu. Výsledky týchto pokusov sú uvedené v tabuľke 2. Extrakty z netransformovaných A. thaliana rastlín mali za podmienok testu nedetegovateľnú úroveň acetoacetyl-CoA reduktázovej aktivity. Naproti tomu každá z transgénnych rastlín, o ktorej bolo zistené, že transkribuje phbB gen, mala vysokú úroveň acetoacetyl-CoA reduktázovej aktivity. To naznačuje, že bakteriálny acetoacetyl-CoA reduktázový gén je funkčný, ak dochádza k jeho expresii v transgénnych rastlinách. Navyše, špecifická aktivita acetoacetyl-CoA reduktázy detegovaná v šiesticc zo siedmych analyzovaných transgénnych rastlín bola podstatne vyššia ako v extraktoch z E. coli nesúcich phbB gény na plazmide pTZ18U-PHB.
Tabuľka 2
Úrovne acetoacetyl-CoA reduktázovej aktivity v A. thaliana transgénnych rastlinách
vzorka acetoacetyl-CoA reduktázová aktivitaa
DH5alfa/PHBb 1,4
divoký typ A. thaliana menej ako 0,003
RedB-2A transgénna 12,5
RedB-2B transgénna 16,2
RedB-2C transgénna 9,1
RedB-2D transgénna 8,8
RedB-2E transgénna 1,6
RedB-2G transgénna 5,2
RedD-3A transgénna 2,3
a Mikromoly NADPH zredukované za minútu na miligram proteinu. Hodnoty sú priemerom dvoch až štyroch meraní.
b E· coli DH5alfa obsahujúce plazmid pTZ18U-PHB nesúci PHB operón.
Transgénne rastliny získané transformáciou plazmidom pBI-SYN neboli analyzované na prítomnosť: PHB syntázovej aktivity vzhľadom k technickým ťažkostiam merania aktivity tohoto enzýmu v neprítomnosti tiolázovej a reduktázovej aktivity.
Príprava a analýza hybridných rastlín
Pretože vyššie rastliny obsahujú endogennú cytoplazmovú 3-ketotiolázovú aktivitu, pre prípravu PHB sú potrebné len acetoacetyl-CoA reduktáza a PHB syntáza. Tieto dva gény sa zavedú do rovnakej rastliny skríženým opylením transgénnej línie, ktorá bola posúdená ako homozygótna pre gén acetoacetyl-CoA reduktázy, transgénnej línie, ktorá bola posúdená ako homozygotná pre gén PHB syntázy. Hybridné semená, ktoré pochádzajú z tohoto skríženia, boli pred testováním na prítomnosť PHB ponechané tri týždne.
rásť v zemi prítomnosť syntázy v či
Na stanovenie toho, acetoacetyl-CoA reduktázy a PHB dostatočná pre prípravu a akumuláciu PHB, sa rastlín a z hybridných rastlín gény pripravia extrakty v chloroforome. Prítomnosť analyzovaná plynovou rastlinných extraktov spôsoby. Tieto spôsoby
PHB (priemerná molekulová eutrophus je 106) tak uhľovodíkoch, ako - podlá spôsobu č.
chloroformu s vodou 16 hodín pri 65 C. väčšou ako približne bunky, extrahuj ú nízkomolekulárne produkty v chloroforme. Domnelý PHB s vysokou potom z listov extrahuje tak, že zhomogenizuje, aby sa rozbili bunečné extrahuje roztokom chloroformu s vodou pri 65 postupne pri 55 dietyléterom. Zostávajúca a extrahuje chloroformom ktoré boli prítomné v z oboch týchto spôsobov, a kyselinou chromatograf iou. rastlinných produktov bola komerčným PHB vyčisteným z Mo. ).
dva až obsahujúcich materiálu, ktorý PHB v týchto (GC) . boli génov rastlinách je z kontrolných obidva tieto je rozpustný extraktoch bola chromatografiou (GC). Pre prípravu pre GC analýzu boli použité dva využívajú jak vysoko polymérnu povahu hmotn. PHB pripraveného z A. selektívnu rozpustnost v chlórovaných napríklad chloroform. Vo stručnosti sa celé listy umiestnia do roztoku pomeru 1:1 a trepú sa s prevracaním Pretože molekuly s molekulovou hmotn.
000 nemôžu prejsť stenou rastlinnej sa z listov za týchto podmienok len rozpustné vo vode lebo molekulovou hmotn. sa sa zostávajúca tkáň steny a homogenát sa v pomere 1:1 12 hodín č. 2 sa vzorky celých listov °C 50% etanolom, 2 hodiny a 15 minút pri 20 °C 100% tkáň sa potom homogenizuje hodiny pri 100 ’C.
konečnom chlorofomovom transesterifikujú a analyzujú sa doba transesterifikovaných je °C. Podlá spôsobu extrahujú 2 hodiny pri 55 °C 100% metanolom sa
Produkty, extrakte etanolom plynovou chlorovodíkovou
Retenčná porovnaná s transesterifikovaným A. eutrophus (Sigma Chemical Co.,
Transgénne rastliny S8-1-2A a/lebo S8-1-2C boli skrížené opylené transgénnymi rastlinami RedB-2A, -2C, -2D, -2G a RedD-3A. Výsledné F1 semená boli vysiate do pôdy. Vzorky listov lebo celé výhonky rastlín starých 2 až 3 týždne sa zoberú a analyzujú sa na prítomnost PHB. Príklady výsledkov získaných spôsobom čistenia č. 1 sú uvedené na obrázku 8. Produkt prítomný v extraktoch F1 rastlín, ktoré majú transgény jak acetoacetyl-CoA reduktázy tak PHB syntázy, má retenčný čas identický s etyl-hydroxybutyrátom, ako to bolo stanovené porovnaním s retenčným časom transesterifikovaného produktu komerčného PHB. Tento nový produkt, predbežne identifikovaný ako etyl-hydroxybutyrát, bol detegovaný len v F1 hybridných rastlinách, ktoré majú jak aktívny acetoacetyl-CoA reduktázový transgén tak PHB syntázový transgén. Podobný produkt nemohol byt detegovaný v transgénnych rastlinách, ktoré majú len jeden zo zhora uvedených génov lebo v netransformovaných A. thaliana rastlinách. A ďalej, tento produkt nemohol byt detegovaný v chloroformových extraktoch rastlinných tkaní, ktoré neboli predom zhomogenizované. To ukazuje, že etyl-hydroxybutyrát je odvodený od prekurzoru s vysokou molekulovou hmotou.
Identita nového rastlinného produktu, ktorý má retenčnú dobu identickú s etyl-hydroxybutyrátom, bola analyzovaná plynovou chromátografiou vo spojení s hmotovou spektrometriou (GC-MS). GC-MS analýza bola prevádzaná na hmotovom spektrometre MSU-NIH. Na obrázku 9A je hmotové spektrum etyl-hydroxybutyrátu pripraveného z autentického PHB. Na obrázku 9B je hmotové spektrum domnelého etyl-hydroxybutyrátu extrahovaného z F1 hybridných rastlín, ktoré pochádazali zo skríženia transgénnych rastlín S8-1-2A á RedB-2C. Tieto výsledky ukazujú, že nový rastlinný produkt, ktorý sa eluuje rovnakým retečným časom ako etyl-hydroxybutyrát, má tiež rovnakú fragmentáciu v hmotovom spektre ako autentická vzorka etyl-hydroxybutyrátu. Skutočnost, že tento nový produkt môže byt detegovaný len v extraktoch z tkáne listov, ktoré boli predom homogenizované, ukazuje, že etyl-hydroxybutyrát je odvodený od materiálu, ktorý má molekulovú hmotn. vyššiu ako približne 50 000 (približná poréznost stien rastlinnej bunky). Súhrnne tieto dáta ukazujú, že transgénne rastliny obsahujúce gén ako acetoacetyl-CoA reduktázy tak PHB syntézy akumulujú polyhydroxybutyrát. Tabuľka 3 ukazuje súhrn F1 rastlín, ktoré boli analyzované GC a GC-MS. Na základe GC analýzy sa dá povedať, že množstvo PHB akumulovaného v listoch F1 hybridov sa pohybuje v množstve od približne 5 μg PHB na gram čerstvej hmotnosti listov pre F1 hybridy medzi RedD-3A a S8-1-2C do približne 100 μg PHB na gram čerstvej hmotnosti listov pre F1 hybrid medzi RedB-2C a S8-1-2A.
Tabulka 3
Súhrn dôkazu produkcie PHB v F1 hybridných rastlinách
rodičovská transgénna línia rodičovská transgénna línia
S8-1-2C S8-1-2A
RedD-3A GCb MSC TEM0 list)
RedB-2A GC
TEM (semeno) TEM (list,
semeno)
RedB-2G GC MS TEM (list)
RedB-2C GC
MS
TEM (list)
RedB-2D TEM (list)
a Transgénne línie nesúce transgén acetoacetyl-CoA reduktázy boli skrížené opylením transgénnymi líniami nesúcimi PHB syntázu. Výsledné F1 hybridy boli analyzované na produkciu PHB.
b Dôkaz produkcie PHB analýzou plynovou chromatografiou.
c Dôkaz produkcie PBH plynovou chromatografiou s hmotovou spektroskopiou.
Detekcia žiariacich granulí transmisnou elektrónovou mikroskopiou. V zátvorkách je označená rastlinná tkáň, ktorá bola analyzovaná.
e Všetky prázdne miesta znamenajú, že analýza nebola prevádzaná
Vizuálna inšpekcia PHB granuli v hybridných rastlinách
Transmisná elektrónová mikroskopia (TEM) baktérií, ktoré akumulujú PHB, odkryla svietiace granule s priemerom 0,2 až 0,5 μιη obklopené membránovým poťahom s hrúbkou asi 2 nm [Lundgren D.G. , Pfister R.M. a Merrick J.M.: J. Gen. Microbiol. 34 , 441 až 446 (1964).]. Na stanovenie toho, či sa dajú podobné granule detegovať v hybridných rastlinách, pre ktoré bolo GC-MS analýzou ukázané, že sú pozitívne na produkci PHB, sa rostlinné tkáne skúmajú transmisnou elektrónovou mikroskopiou. Transgénne rastliny S8-1-2A a/lebo S8-1-2C sa skrížené opylia transgénnymi RedB-2A, -2C, -2D, -2G a RedD-3A. Výsledné F1 hybridní semena a zrälý listový materiál sa spevní pre analýzu transmisným elektrónovým mikroskopem. Stručne rečeno - tkáne sa spevnia v 3% glutaraldehyde a 1% oxide osmičelom a zapustí sa do epoxidovej pryskyrice. Časti s velkosťou 80 až 90 nm sa vyfarbia 5% octanom uranylu a citranom olova.
V jednom rade pokusov sa rastlinek starých dva Skoumanie buniek svietiacich vo všetkých ktoré ktorý
Listy z
TEM analýzu, aglomerácií detegované rastlinách, materiálu, materiálu, ktorý má sú uvedené detegované v
F1 semená vysejú do pôdy, až tri týždne sa odoberú na v listoch odhalilo prítomnosť granuli. Tieto analyzovaných F1 pochádzali zo skríženia má gén PHB syntázy, a gén acetoacetyl-CoA reduktázy. Príklady na obrázku 10. Podobné granule neboli nikdy rodičovských transgénnych líniách, ktoré majú granule boli hybridných transgénneho transgénneho len gen PHB syntázy lebo len gén acetoacetyl-CoA reduktázy, ani neboli detegované v netransformovaných A. thaliana. V tkáni listov F1 hybridu boli granule detegované v mezofilných bunkách (obrázok 10, mikrofotografie a až e). Aglomerát svietiacich granuli bol detegovaný nejčastejšie v jadre (obrázok 10, mikrofotografie a až c), ale podobné štruktúry boli detegované tiež v cytoplazme (obrázok 10, mikrofotografie e) a vakuole (obrázok 10, mikrofotografie d) tkáne listov F1 hybridu. V jadre a v cytoplazme môžu jednotlivé granule dosiahnuť maximálny rozmeru približne
0,18 μιη. Ve vakuolách boli granule obvykle väčšie, maximálne dosahovali priemer približne 0,55 μη. Pri väčšom zväčšení sa zdá, že jaderné granule sú obklopené elektrónovo hustým materiálom. Jak veľkosť tak zdanlivá štruktúra týchto granulí je velice podobná granuliam v baktériách, ktoré akumulujú PHB.
V druhej sérii pokusov sa F1 semena nechajú bobtnať vo vode 24 hodín, potom sa embryo vyrežie z povrchu semena a tkáň se fixuje. Analýza embyonálnych kotyledonov odhalila prítomnosť aglomerácie žiariacich granulí v jadre (obrázok 10, mikrofotografie f). Tieto granule mohli mať maximálny priemer až 0,18 μπι. Tieto granule mohli byť detegované len v jadre F1 hybridných embryí, ktoré pochádzali zo skríženia transgénneho materiálu, ktorý má gén PHB syntézy, a transgénneho materiálu, ktorý má gén acetoaceyl-CoA ŕeduktázy. Žiadne granule neboli detegované ani v rodičovských transgénnych rastlinnách, ktoré majú len jeden z ektopických génov, ani v netransformovanom divokom type A. thaliana. Tabuľka 3 ukazuje súhrnne F1 rastliny, ktoré boli analyzované TEM.
Zhora popísané dáta vykazujú pozitívnu koreláciu medzi detekciou PHB kombináciou GC-MS a prítomnosťou granulí štúdiou elektrónovým mikroskopom. Veľkosť, tvar a prítomnosť elektrónovo hustého materiálu obklopujúcecho jednotlivé granule velice pripomína granule, ktoré sú prítomné v baktérii produkujúcej PHB. A konečne, jak detekcia PHB systémom GC-MS tak prítomnosť svietiacich granulí je pri TEM pozorovaná len u hybridných rastlín, ktoré majú transgény jak acetoacetyl-CoA ŕeduktázy tak PHB syntézy. Súhrnne tieto dáta ukazujú, že granule pozorované v F1 hybridných rastlinách sú zložené z polyhydroxybutyrátu.
Diskúzia
V týchto štúdiách bolo ukázané, že bakteriálne gény kódujúce enzýmy, ktoré sú potrebné pre PHB syntézu, môžu byť stabilne zavedené do vyšších rastlín takým spôsobom, že dochádza k transkripcii týchto génov a k produkcii transkriptov s očakávanou veľkosťou. Ďalej bolo ukázané, že v prípade génov phbA a phbB prítomnosť týchto génov v transgénnych rastlinách umožňuje zvýšenie hladiny enzýmovej 3-ketotiolázovej lebo acetoacetyl-CoA reduktázovej aktivity. Je teda zrejmé, že tieto dva génové produkty sú funkčné, ak sú prekládané v rastline. Vzhľadom k technickým ťažkostiam súvisejúcim s testovaním PHB syntázovej aktivity priamo, nebolo stanovované množstvo PHB syntázovej aktivity v transgénnych rastlinách.
Bolo ukázané, že len rastlinné extrakty z F1 transgénnych rastlín, ktoré expresiou poskytujú jak acetoacetyl-CoA reduktázu tak PHB syntázu, produkujú novú zlúčeninu s vysokou molekulovou hmotou, ktorá je rozpustná v chloroforme a ktorá, po transesterifikácii etanolom a kyselinou chlorovodíkovou, poskytuje etyl-hydroxybutyrát. Tieto dáta ukazujú, že novou zlúčeninou je polyhydroxybutyrát. Navyše sú tieto dáta nepriamym dôkazom produkcie funkčnej PBH syntázy v transgénnych rastlinách. To je dôležité, pretože sa nedá prevádzať in vitro testovanie PHB syntázovej aktivity. A ďalej, produkcia PHB tiež nepriamo ukazuje na to, že v rastlinách je produkovaný D(-)-hydroxybutyryl-CoA, substrát pre PHB syntázu. Tento hydroxyacyl-CoA sa v rastlinách prirodzene nevyskytuje.
Transmisná elektrónová mikroskopia ďalej preukázala opodstatnenosť tvrdenia, že PHB je produkovaný v transgénnych rastlinách. Analýza embryonálnych kotyledonov a zrälých listov F1 transgénnych rastlín, ktoré expresiou poskytujú jak acetoacetyl-CoA reduktázu tak PHB syntázu, odhalila aglomeráty svietiacich granulí, ktoré majú tvar a štruktúru veľmi podobnú granuliam, ktoré sa nachádzajú v baktériách produkujúcich PHB, ako je napríklad A. eutrophus. Tieto granule boli nejčastejšie nájdené v jadre, boli však detegované tiež vo vakuole a cytoplazme F1 hybridných rastlín.
V pokusoch popísaných v tejto práci dochádza k expresii produktov génov phbA, phbB a phbC z A. eutrophus nejpravdepodobnejšie v cytoplazme, pretože k proteínom neboli pridané žiadne špecifické aminokyselinové sekvencie, ktoré by ich špecificky smerovali do organel. Pretože cytoplazma rastlinných buniek už obsahuje 3-ketotiolázu, je pre produkciu PHB potreba len ďalšia expresia acetoacetyl-CoA reduktázy a PHB syntézy. Skutočnosť, že granule sa nachádzajú v jadre a vakuolách, nie je nutne v rozpore s expresiou týchto enzýmov v cytoplazme. Pretože behom delenia buniek dochádza k demontáži a opätovnému zostaveniu jaderných membrán, PHB granule, ktoré sa pôvodne produkujú v cytoplazme, sa môžu zachytiť vnútri novo sa tvoriacich membrán jadra. Vďaka svojej hydrofóbnosti môžu PHB granule prochádzať tiež membránami jadier a vakuoly.
Podľa iného prístupu by mohla byť produkcia PHB lokalizovaná vo špecifickej organele rastlinnej bunky cielenou expresiou enzýmov, ktoré sú potrebné pri syntéze PHB, do organely. V tomto prípade, ak cieľová organela neposkytuje expresiou aktívnu 3-ketotiolázu, môže byť pre produkci PHB potrebná expresia exogénnej 3-keto-tiolázovej aktivity vedia acetoacetyl-CoA reduktázy a PHB syntézy.
Dlhodobým cielom produkcie PHB lebo PHA vo vyšších rastlinách je odviesť skladovanie uhlíku vo forme hlavných zásobných zlúčenín, ako je napríklad tuk, škrob lebo terpenoidy, smerem k syntéze PHA. Tento ciei vyžaduje tkáňovo špecifickú expresiu a tiež potenciálne organelovo špecifickú expresiu enzýmov, ktoré sú potrebné pri syntéze PHA.
Pravdepodobnými cieľmi genetického inženierstva sú plodiny produkujúce olej.
Lipidy sú syntetizované v plastidoch používaného inženierstvo pomocou acetyl-CoA, rovnakého prekurzoru v syntéze PHB a olejnatých plodín zacielenie PBA biosyntetických ďaiších PHA.
teda bude enzýmov
Genetické vyžadovať do plastidu.
Príkladom olejnatých plodín, ktoré by sa mohli v tomto smere využiť na produkciu PHA, je repka, slnečnica a olejová palma. Repka a slnečnica sú hlavnými plodinami v Severnej Amerike. Obe tieto plodiny sa môžu transformovať cudziou DNA. PHA produkcia môže byť tiež smerovaná do mezokarpu plodov palmy olejovej. Pretože lipidy, ktoré sa tu produkuj í, nie sú podstatné pre prežitie stromu lebo zárodku, produkcia PHA by nemala mať žiadne škodlivé účinky na palmové stromy. Nanešťastie doteraz nie sú dostupné žiadne transformačné techniky pre palmu olejovú.
PHA produkcia by mohla byť nasmerovaná tiež do koreňov a hlúz cukrovky a zemiakov, plodín, ktoré akumulujú veľké množstvá škrobu. Hlavným problémom tohoto prístupu je to, že ked’že škrob a PHA nepoužívajú rovnaké prekurzory, bolo by potreba, pred tím, než by došlo k presunu uhlíku od škrobu do PHA, potenciálne násobných modifikací v metabolismu uhlíku.
Možným nejpriamejším prístupom k PHA produkcii by bolo použitie plodín akumulujúcich veľké množstvá terpenoídov, ako je napríklad mrkva, ktorá akumuluje karotenoídy, lebo mexický jam (hluza rastliny Dioscorea alata), ktorý akumuluje steroly. Pretože terpenoídy používajú rovnaké prekurzory ako PHA (acetyl-CoA a acetoacetyl-CoA), presun uhlíku na produkciu PHA by se mohol dosiahnuť ľahšie.
Materiály a metódy
Konštrukcia DNA rekombinantov
E. coli kmeň DHóalfa nesúci plazmidy sa kultivuje v živnej pôde LB doplnenej o kanamycín (50 μ9/ιη1) lebo ampicilín (50 μ9/πι1). Prípravy plazmidovej DNA vo veľkom meradle sa prevádzajú alkalickou lýzou a postupom zrážania polyetylénglykolom ako to popísali Sambrook J., Fritsch E.F. a Maniatis T.: Molecular Cloning, a labarotarory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989). Plasmidová DNA sa rozštep! reštrikčnými endonukleázami podľa doporučenia výrobcov (New England Biolabs, Mass.; Promega Corp., Wi.; Boehringer Mannheim Biochemicals, In.;
Stratagene, Ka.), oddelí sa elektroforézou na agarózovom géle a zviditeľní sa vyfarbením etídiumbromidom ako to popísali Sambrook J., Fritsch E.F. a Maniatis T.: Molecular
Cloning,
Laboratory agarózovom Schleicher a labarotarory
Press (1989). DNA géle DEAE membránami & Schuell, Inc., Nh.).
manual, Cold fragmenty (NA-45
Vo stručnosti
Spring Harbor sa izolujú na DEAE membrána,
DNA sa elektroforézuje na prúžku NA-45. Membrána sa premyje v 0,15M NaCl, 0,lmM EDTA a 20mM Tris-HCl (pH 8). DNA sa potom eluuje l,0M NaCl, 0,lmM EDTA a 20mM Tris-HCl (pH 8) 1 až dve hodiny pri 65 ’C. DNA sa ďalej vyčistí extrakciou fenolom s chloroformom a vyzrážaním etanolom. V niektorých príkladoch sa prečnievajúce 3' -konce DNA fragmentov prevedú na zarovnané konce T4 DNA polymerázou podľa postupu, ktorý popisujú Sambrook J., Fritsch E.F. a Maniatis T.: Molecular Cloning, a labarotarory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989). Ligácie DNA fragmentov s kohezivnými lebo zarovnanými koncami sa prevádzajú pri 14 ’C po dobu 16 hodín v pufre, ktorý obsahuje 50 mM Tris-HCl (pH 7,6), 5mM MgC12, 5% (hmotnostné procenta k objemovým) polyetylénglykolu 8000, 0,5mM ATP a 5mM ditiotreitol, ako to popísali Sambrook J., Fritsch E.F.
a Maniatis T.: Molecular Cloning, a labarotarory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989). Časť ligačnej reakcie sa prenesie do E. coli spôsobom s chloridom rubidia, ako to popísal Hanahan D.: J. Mol. Biol. 166, 557 až 580 (1983). Transformované baktérie sa vysejú na agarové dosky, ktoré obsahujú živnú pôdu LB a buď 50 μg/ml kanamycínu lebo 50 μg/ml ampicilínu. Bakteriálne kolónie obsahujúce rekombinantné plazmidy sa identifikujú hybridizáciou s 32P-značenými DNA sondami, ako to popísali Sambrook J., Fritsch E.F. a Maniatis T.: Molecular Cloning, a labarotarory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989) s tým, že miesto nitrocelulózových membrán sa používajú nylonové membrány (Hybond-N, Amersham, II.). Príprava rádioaktívne označených DNA sond a hybridizácie sú popísané v následujúcej časti. Príprava plazmidovej DNA v malom meradle sa prevádza spôsobom alkalickej lýzy, ako to popísali Sambrook J., Fritsch E.F. a Maniatis T.: Molecular
Cloning, a labarotarory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989).
Oligonukleotidy boli syntetizované na DNA syntetizátore
Applied Biosystems výrobcu (Applied s dimetoxytritylovou
380A DNA synthesizer podlá pokynov Biosystems, Ka. ) . Oligonukleotidy skupinou napojenou na 5' konce sa vyčistia na prístroji Varian 5000 HPLC s kolonou C18 column (Varian Inštrument Group, Tx.). Oligonukleotidy sa resuspendujú v O,1M trietylamínu. Injekciou sa nanesú na
C18 kolonu predekvilibrovanú zmesou 12 % acetonitrilu s 88 % 0,IM trietylamin-acetátu (pH 7) (rozpúšťadlo A). HPLC program bol nastavený následujúcim spôsobom: prietok: 0,9 ml/min, maximálny tlak: 1,4 MPa, čas 0 minút: 88 % rozpúšťadla A s 12 % rozpúšťadla B (acetonitril) , čas 3 minúty: 88 % rozpúšťadla A s 12 % rozpúšťadla B, čas 21 minút: 65 % rozpúšťadla A s 35 % rozpúšťadla B, čas 25 minút: 65 % rozpúšťadla A s 35 % rozpúšťadla B. Vyčistené oligonukleotidy boli detritylované v 80% kyseline octovej po dobu 10 minút a vysušené pod dusíkom. Oligonukleotidy boli rozpustené v 10mM Tris-HCl (pH 7,5) a 0, lmM EDTA, extrahováné tri razy rovnakými objemami etylacetátu a vyzrážené etanolom.
Polymerázová reťazová reakcia (PCR) bola prevádzaná na prístroji Perkin-Elmer Cetus DNA Thermal Cycler (Perkin-Elmer, Kt.). Reakčná zmes obsahovala 100 pmolov oligonukleotidov, PCT primer č. 1 a č.2 (vid’ obrázok 5), 200 ng plazmidu pTZ18U-PHB linearizovaného reštrikčným enzýmom EcoRI, 125 μΜ dNTP, 50 mM KC1, 10 mM Tris-HCl (pH 8,3), 2,5 mM MgC12, 0,01 % želatíny a 2,5 jednotiek Taq polymerázy (Perkin-Elmer, Kt.). Program prístroja bol nastavený následovne: 3 minutý pri 94 ’C, 40 cyklov sekvencie 1 min pri 94 ’C - 3 min pri 55 ’C - 3 min pri 72 C a konečne 7 min pri 72 ’C. PCR produkt sa izoluje elektroforézou na agarózovom géle a elúciou DEAE celulózovou membránou.
Produkcia transgénnych rastlín
Ti plazmidové vektory používané na prípravu transgénnych rastlín sa nejskôr elektroporaciou prenesú do Aqrobacterium tumefaciens kmeňa C58-pGV3850 (Zabrinsky P. a spol.: EMBO 2, 2143 až 2150 (1983) a Sambrook J., Fritsch E.F. a Maniatis T.: Molecular cloning, a laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989).]. Arabidopsis thaliana druh Rschew sa pestuje aseptický na vertikálnych Petriho miskách, ktoré obsahujú minerálne prvky, 0,8 % agaru (Difco) a 1 % sacharózy, ako to popísali Estelle M.A. a Sommerville C.: Mol. Gen. Genet. 206, 200 až 206 (1987) a Schiefelbein J.W. a Sommerville C.R.: Plánt Celí 2., 235 až 243 (1980). Korene z rastlinek starých 10 až 12 dní sa odrežú a použijú sa na transformáciu ako to popísali Valvekens D., Van Montagu, M. a Van Lijsebettens M.: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 5536 až 5540 (1988).
Semená z TO a TI transgénnych rastlín sa vysejú na média obsahujúce minerálni prvky, 1 % sacharózy, 0,8 % agaru (Difco) a 50 μg/ml kanamycínu. Po 10 až 14 dňoch rastu transgénne rastliny rezistentné na kanamycín (Kmr) mali zelené listy, zatialčo netransformované na kanamycín citlivé (Kms) rastliny mali žlté listy. V tomto stupni sa Kmr rastliny môžu odstrániť z agarových dosiek a preniesť do úrodnej pôdy.
Extrakcia a štepenie genómovej DNA reštrikčnou endonukleázou
Divoké a transgénne rastliny boli ponechané rásť v pôde po dobu 2 až 3 týždňov. Bolo zobrané asi 5 g materiálu listov a tento materiál bol zmrazený v kapalnom dusíku. Vysokomolekulárna DNA sa zo zmrazenej tkáne listov extrahuje postupom, ktorý popísali Rogers S.C. a Bendich A.J.: Plánt Molecular Biology Manual A6, 1 až 10 (1988). Štepenie reštrikčnou endonukleázou, enzýmom HindlII, sa prevádza za podmienok doporučených výrobcom (New England Biolabs Inc. , Mass. ) .
Elektroforéza na agarózovom géle a postup hybridizácie
DNA analýza elektroforézou na agarózovom géle a prenos na nylonové membrány (Hybond-N, Amersham, II.) sa prevádza známymi postupmi, ktoré popísali Southern E.M.: J. Mol. Biol. 38, 503 až 517 (1975) a Sambrook J., Fritsch E.F. a Maniatis T.: Molecular cloning, a laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1988). Špecifické klónované DNA fragmenty, ktoré sa použijú ako sondy, sa vyštepia z vektoru príslušnými reštrikčnými endonukleázami, inserty sa vyčistia od vektoru elektroforézou na agarózovom géle a elektroelúciou pomocou DEAE celulózových membrán. Sondy sa označia 32P-dezoxyribonukleotidmi spôsobom predĺženia náhodným primerom pomocou hexamérov podlá postupu, ktorý popísali Feinberg A.P. a Volgelstein B.: Anál. Biochem. 136, 6 až 13 (1983). Nylonové filtre sa hybridizujú značenými sondami a exponujú sa na film, ako popísali Poirier Y. a Jolicoeur P.: J. Virol. 63., 2088 až 2098 (1989).
Izolácia RNA a elektroforéza
Celková RNA sa izoluje zo vzoriek zmrazených listov podlá postupu, ktorý popísali Puissant C. a Houdebine L.M.: BioTechniques 8, 148 až 149 (1990). Izolovaná RNA sa rozdelí elektroforézou na agarózovom géle obsahujúcom formaldehyd a prenesie sa na nylonové membrány (Hybond-N, Amersham, II.) postupy, které Sambrook J., Fritsch E.F. a Maniatis T.: Molecular cloning, a laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989). Nylonové filtre sa hybridizujú značenými sondami ako je to popísané v predchádzajúcej časti.
Test 3-ketotiolázovej aktivity
Jeden gram vzoriek zmrazených listov sa zhomogenizuje vo 2 ml ladom ochladeného pufru, ktorý obsahuje lOOmM Tris-HCl (pH 8,0), 40mM MgC12 a 5mM beta-merkaptoetanol. Homogenát sa vyčerí odstreďovaním pri 10000 x g dve minutý a supernatant sa prenesie do čerstvej skúmavky. Obsah proteínu v extrakte sa zmeria Bradfordovej testom s pomocou BioRad súpravy pre testovanie proteinov (BioRad Laboratories, Ka.). Na analýzu sa používa medzi 3 až 30 extraktov rastlinného proteínu. Proteínové extrakty boli pripravené tiež z baktérií. V tomto prípade sa stacionárne kultúry baktérií peletujú odstreďováním, premyjí sa raz ľadom ochladeným testovacím pufrom a resuspendujú sa v 200 μΐ rovnakého pufru. Bakteriálna suspenzia sa lýzuje sonikáciou (pôsobením ultrazvuku), homogenát sa vyčerí odstred'ováním a obsah proteínu v extrakte sa stanoví * Bradfordovej testem. Na analýzu sa použivá medzi 0,2 až 1 μg bakteriálneho proteínového extraktu. Aktivita • 3-ketotiolázového enzýmu v rôznych extraktoch sa testuje podľa postupu, ktorý popísali Senior P.J. a Dawes E.A.: Biochem. J. 134, 225 až 238 (1973).
Test acetoacetyl-CoA reduktázové aktivity
Jeden gram vzoriek zmrazených listov sa zhomogenizuje vo 2 ml ľadom ochladeného pufru, ktorý obsahuje lOOmM dihydrogenfosforečnan draselný (pH 5,5), 0,02mM chlorid horečnatý a 4,OmM -merkaptoetanol. Homogenát sa vyčerí odstredováním pri 10000 x g počas dvoch minút a supernatant sa prenesie do čerstvej skúmavky. Obsah proteínu v extraktu sa zmeria Bradfordovej testom s pomoci BioRad súpravy na testovanie proteinov. Na analýzu sa používa medzi 0,8 a 10 μg extraktov rastlinného proteínu. Bakteriálne extrakty sa pripravia tiež v testovacom pufre v podstate tak, ako je to popísané v predchádzajúcej časti. Aktivita acetoacetyl-CoA reduktázového enzýmu sa testuje spôsobom, ktorý popísali
Senior P. J. a Dawes E.A.: Biochem. J. 134, 225 až 238
(1973 ) .
Analýza plynovou chromatografiou a hmotovou spektroskopiou
Na prípravu rastlinných extraktov pre GC analýzu boli
použité dva spôsoby. Podľa prvného spôsobu sa medzi 0,005 a 0,05 g čerstvého lebo zmrazeného rastlinného materiálu (listy lebo celé výhonky) extrahuje 1 až 2 μΐ roztoku
chloroformu s vodou v pomeru 1:1 pri 65 °C 16 hodín za konštantného trepania. Rastlinný materiál sa potom zhomogenizuje vo vode a reextrahuje sa roztokom chloroformu s vodou v pomeru 1:1 pri 65 ’C 16 hodín za konštantného trepania. Chloroformová fáza sa prenesie do novej skúmavky a extrahuje sa jeden raz rovnakým objemom vody. Konečný objem chloroformovej fáze sa upraví na 0,5 ml a použije sa na transesterifikáciu etanolom a kyselinou chlorovodíkovou ako je nižšie popísané. Podlá spôsobu č. 2 sa medzi 0,005 a 0,15 g zmrazeného lebo čerstvého rastlinného materiálu postupne extrahuje 50% etanolom pri 55 °C dve hodiny, 100% metanolom pri 55 °C dve hodiny a 100% dietyleterom 15 minút pri teplote miestnosti. Zostávajúca tkáň sa zhomogenizuje vo vode, vysuší a extrahuje sa 0,5 ml chloroformu 4 hodiny pri 100 °C.
Konečné chloroformové extrakty (0,5 ml) získané podlá spôsobu č. 1 a č. 2 sa transesterifikujú pridaním 0,2 ml koncentrovanej HC1 a 1,7 ml 100% etanolu a zahrievaním na 100 °C počas dvoch hodín. Reakčná zmes sa potom ochladí na teplotu miestnosti, chloroforomvá fáza sa dva razy extrahuje 2 ml 0,9% chloridu sodného (hmotnostné diely k objemovým dielom) a výsledná organická fáza sa zmenší na 100 μΐ. Ako štandartná vzorka sa použije komerčný PHB (Sigma Chemical Co., Mo.), ktorý sa rozpustí v teplom chloroforme a 1 mg sa transesterifkuje ako je zhora uvedené.
Chloroformová fáza, ktorá obsahuje etylestery, sa prenesie do GC banky na injektovanie 1 μ! do plynového chromatografu Hewlett Packard 5890 šerieš II, ktorý je opatrený programovateľným zásobníkom so sklenenou kapilárnou kolónou SP-2330 (Supelco, Pa.). Ako nosný plyn sa používa hélium s približne lineárnou rýchlosťou 20 cm/s. Teplota v mieste inekčného otvoru bola nastavená na 220 °C, teplota v mieste plameňového jonizačného detektoru bola nastavená na 220 ’C. Používá sa následujúci teplotný profil: 4 minutý pri 65 °C, potom sa teplota zvyšuje rýchlosťou 20 ’C za minútu až na 195 ’C, 3,5 minúty zostane na 195 °C a potom teplota opäť klesá rýchlosťou 20 °C/minútu na 65 C.
Identita maxím, o ktoré sa jedná, bola stanovená GC-hmotovou spektrometriou. EI (electron impact) hmotové spektrálne dáta boli získané na hmotovom spektrometre JEOL JMS-AX505H vo spojení s plynovým chromatografom Hewlett Packard 5890. Používajú sa následujúce parametre: zdroj teploty: 200 ’C, jonizačný prúd: 100 μΑ, urýchľujúce napätie: 3 keV. Kolóna DB-225 (J & W Scientific Co.) bola vložená priamo do zdroja hmotového spektrometra. Ako nosič bolo použité hélium. Injektor (bez delenia potrebného množstva) bol udržovaný na 260 ’C a prenosná línia na 260 °C. Používá sa rovnaký teplotný profil GC pece (viď predchádzajúci odstavec).
Transmisná elektrónová mikroskopia
Rastlinné tkáne sa fixujú 3% glutaraldehydom v 0,lM fosforečnanovom pufre (pH 7,2) 1,5 až 2 hodiny pri teplote miestnosti. Vzorky sa premyjú štyrikrát 0,lM fosforečnanovým pufrom (pH 7,2) a fixujú sa 1% OsO4 vo fosforečnanovém pufre dve hodiny pri teplote miestnosti. Tkáne sa potom dehydratujú etanolom a upevnia sa v epoxidovej pryskyrici Spurrs. Narežú sa časti 80 až 90 nm, ktoré sa umiestnia na medenú mriežku a vyfarbujú sa 5% octanom uranylu 30 až 45 minút a následne Reynoldsovým citranom olovičitým 3 až 4 minúty. Tieto časti sa potom prezerajú transmisným elektrónovým mikroskopom JEOL 100CXII, ktorý pracuje pri 80 kV.
Iné rastliny
Aj keď sú v tomto vynáleze ako špecifické rastliny popísané Arabidopsis thaliana a gény z· Alcaliqenes eutrophus, tento vynález má obecnú platnosť. Nároky týkajúce sa produkcie polyhydroxybutyrátu a/lebo polyhydroxyalkanoátu v rastlinách nie sú obmedzené na Arabidopsis thaliana lebo nesúvisia špecificky s používáním génov z Alcaliqenes eutrophus. Nároky popísané nižšie popisujú obecný spôsob produkcie polyhydroxyalkanoátu v rastlinách zavedením cudzieho DNA materiálu do buniek rastlín. Mezi také rastliny patria zhora diskutované rastliny a napríklad mrkva, slnečnica, tabak, rajčiny a zemiaky.
Semená týchto rôznych línií rastlín sú uložené podľa Budapeštianskej dohody (Budapest treaty) v Americkej zbierke typov kultúr (Američan Type Culture Collection), 12301 Raklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, USA. Medzi tieto línie patrí RedD-3A (ATCC 75044) obsahujúci gén acetoacetyl-CoA reduktázy, S8-1-2A (ATCC 75043) obsahujúci gén PHB syntázy a T4-2A (ATCC 75042) obsahujúci gén 3-ketotiolázy. Tieto gény sú uvedené v sekvencii id. č. 1.
Následujúci špecifický popis je len ilustráciou tohoto vynálezu. Je to myslené tak, že tento vynález je obmedzený len pripojenými nárokmi.
Príloha I (1) Obecné informácie:
(i) Žiadatelia: Chris Somerville, Yves Poirier, Douglas
Dennis (ii) Názov vynálezu: Transgénny rastlinný materiál produkujúci polyhydroxyalkanoáty (iii) Počet sekvencii: 1 (iv) Korešpondenčná adresa:
(A) adresát: Ian C. McLeod (B) ulica: 2190 Commons Parkway (C) mesto: Okemos (D) štát: Michigan (E) oblasť: Ingham (F) poštové smerovacie číslo: 48864 (v) Počítačová forma:
(A) typ média: disketa 5,25' , 360 kb
(B) počítač: IBM AT
(C) operačný systém: MS-DOS (verše 4)
(D) software: Wordperfect 5. 1
(viii) Informácia o patentovom zástupcovi:
(A) meno: Ian Mc Load (B) registračné č.: 20 931 (C) číslo dokumentu (odkaz): MSU 4.1-131 (ix) Telekomunikačné informácie:
(A) telefón: (517) 347-4100 (B) telefax: (517) 347-4103 (2) Informácie o sekvencii id. č. 1 (i) Vlastnosti sekvencie:
(A) dĺžka: 4980 párovtnukleotidov (B) typ: nukleová kyselina s kóodovanými peptidmiy (C) typ vlákna: dvojvláknová (D) topólógia: lineárna (ii) Typ molekuly:
(A) popis: genómová DNA (iii) Hypotetické č.
(iv) Proti zmyslu vlákna: nie (vi) Pôvodný zdroj:
(A) organ i zmus: Alcaligenes eutrophus (vii) Bezprostredný zdroj:
(A) knižnica: genómová

Claims (17)

  1. PATENTOVÉ NÁROKY
    1. Transgénny rastlinný materiál, vyznačuj úci sa t ý m , že obsahuje cudziu DNA, ktorá vedíé k produkcii polyhydroxyalkanoátu, s výhodou takú, že polyhydroxyalkanoát je polyhydroxybutyrát.
  2. 2. Transgénny rastlinný materiál podľa nároku 2, vyznačujúci sa t ým, že sekvencie, ktoré kódujú DNA a RNA pre produkciu enzýmov vedúcich k syntéze polyhydroxybutyrátu sú uvedené v sekvencii id.. č. 1.
  3. 3. Transgénny rastlinný materiál, vyznačujúci sa tým, že obsahuje cudziu DNA kódujúcu peptid, ktorý vykazuje 3-ketotiolázovú aktivitu, s výhodou taký, že DNA znamená otvorenú čítaciu oblasť medzi 2696 a 3877 sekvence id. č. 1.
  4. 4. Transgénny rastlinný materiál, vyznačujúci sa tým , že obsahuje cudziu DNA, ktorá kóduje acetoacetyl-CoA reduktázovú aktivitu, s výhodou taký, že DNA znamená otvorenú čítaciu oblasť medzi 3952 a 4692 sekvence id. č. 1.
  5. 5. Transgénny vyznačujúci sa ktorá kóduje polypeptid, aktivitu.
    rastlinný materiál, tým , že obsahuje cudziu DNA, ktorý inhibuje PHA syntázovú
    Transgénny rastlinný materiál, vyznačujúci sa tým , že obsahuje cudziu DNA, ktorá kóduje jeden alebo viac enzýmov vedúcich k syntéze polyhydroxyalkanoátu z hydroxyalkyl-CoA, s výhodou taký, že DNA znamená otvorenú čítaciu oblasť medzi 842 a 2611 sekvencie id. č. 1.
  6. 7. Transgénny vyznačujúci sa ktorá kóduje jeden alebo rastlinný materiál, tým , že obsahuje cudziu DNA, viac enzýmov, ktoré katalyzujú syntézu hydroxyalkyl-CoA.
  7. 8. Transgénny rastlinný materiál, vyznačujúci sa tým , že obsahuje cudziu DNA, ktorá kóduje jedenalebo viac enzýmov vedúcich k produkcii acetoacetyl-CoA z produktov kódovaných touto cudziou DNA.
  8. 9. Rastlinný materiál podlá nároku 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7alebo 8,vyz načujúc i sa tým, že existuje ako semeno alebo ako klúčna rastlina.
  9. 10. Spôsob zavedenia cudzej DNA kódujúcej polypeptidy vedúce k syntéze polyhydroxyalkanoátu do rastliny, _ ν' vyznačujúci sa tým, že zahrnuje pohlavne spojenie sexuálnym oplodnením dvoch rastlín, ktoré neprodukujú polyhydroxyalkanoát, pri - čom každá obsahuje cudziu DNA kódujúcu jeden lebo viac rôznych enzýmov na ceste vedúcej k polymerácii hydroxyalkyl-CoA polyhydroxyalkanoátovou syntézou za vzniku rastliny, ktorá kóduje polyhydroxyalkanoát, s výhodou tak, že polyhydroxyalkanoát znamená polyhydroxybutyrát.
  10. 11. Spôsob podlá nároku 10, vyznačujúci sa tým , že polyhydroxyalkanoát je v granuliach v bunkách rastliny.
  11. 12. Segment génu tak, ako je obsiahnutý v semene uloženom pod ATCC 75042, vyznačujúci sa tým, že obsahuje DNA kódujúcu 3-ketotiolázový gén.
    'íi*
  12. 13. Rastlina, vyznačujúca sa tým , že obsahuje segment génu podľa nároku 12, pri- čom touto rastlinou je s výhodou Arabidopsis thaliana.
  13. 14. Segment génu tak, ako je obsiahnutý v semene uloženom pod ATCC 75044, vyznačujúci sa tým, že obsahuje DNA kódujúci gén acetoacetyl-CoA reduktázy.
  14. 15. Rastlina, vyznačujúca sa tým , že obsahuje segment génu podlá nároku 14, pri - čom touto rastlinou je s výhodou Arabidopsis thaliana.
  15. 16. Segment génu tak, ako je obsiahnutý v semene uloženom pod ATCC 75043, vyznačujúci sa tým , že obsahuje DNA kódujúcu gén PHB-syntázy.
  16. 17. Rastlina, vyznačujúca sa tým , že obsahuje segment génu podlá nároku 16, pri - čom touto rastlinou je s výhodou Arabidopsis thaliana.
  17. 18. Transgénny rastlinný materiál, vyznačujúci sa t ý m , že obsahuje cudziu DNA, ktorá kóduje jeden lebo viac enzýmov vedúcich k produkcii 3-hydroxybutyryl-CoA z produktov kódovaných cudziou DNA.
SK64-94A 1991-07-19 1992-07-13 Transgenic plants material producing polyhydroxyalkanoates SK6494A3 (en)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US73224391A 1991-07-19 1991-07-19
PCT/US1992/005786 WO1993002187A1 (en) 1991-07-19 1992-07-13 Transgenic plants producing polyhydroxyalkanoates

Publications (1)

Publication Number Publication Date
SK6494A3 true SK6494A3 (en) 1994-10-05

Family

ID=24942760

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
SK64-94A SK6494A3 (en) 1991-07-19 1992-07-13 Transgenic plants material producing polyhydroxyalkanoates

Country Status (22)

Country Link
US (1) US5650555A (sk)
EP (1) EP0595896B1 (sk)
JP (1) JP3696233B2 (sk)
AT (1) ATE295891T1 (sk)
AU (1) AU671953B2 (sk)
BE (1) BE1006851A5 (sk)
BR (1) BR9206297A (sk)
CA (1) CA2113412C (sk)
CZ (1) CZ10894A3 (sk)
DE (1) DE69233512T2 (sk)
ES (1) ES2046142B1 (sk)
FI (1) FI120353B (sk)
FR (1) FR2679735A1 (sk)
HU (1) HUT66825A (sk)
IT (1) IT1255348B (sk)
MX (1) MX9204245A (sk)
NL (1) NL195045C (sk)
NZ (1) NZ243626A (sk)
PL (1) PL170467B1 (sk)
PT (1) PT100705B (sk)
SK (1) SK6494A3 (sk)
WO (1) WO1993002187A1 (sk)

Families Citing this family (60)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5245023A (en) 1987-06-29 1993-09-14 Massachusetts Institute Of Technology Method for producing novel polyester biopolymers
GB9108756D0 (en) 1991-04-24 1991-06-12 Ici Plc Production of polyalkanoate in plants
US5610041A (en) * 1991-07-19 1997-03-11 Board Of Trustees Operating Michigan State University Processes for producing polyhydroxybutyrate and related polyhydroxyalkanoates in the plastids of higher plants
CA2113412C (en) * 1991-07-19 2000-01-25 Christopher R. Somerville Transgenic plants producing polyhydroxyalkanoates
WO1994012014A1 (en) * 1992-11-20 1994-06-09 Agracetus, Inc. Transgenic cotton plants producing heterologous bioplastic
US5942597A (en) * 1995-08-21 1999-08-24 The Procter & Gamble Company Solvent extraction of polyhydroxyalkanoates from biomass
US6083729A (en) * 1995-10-26 2000-07-04 Metabolix, Inc. Methods for isolating polyhydroxyalkanoates from plants
US5849894A (en) * 1995-11-29 1998-12-15 Monsanto Company Rhodospirillum rubrum poly-β-hydroxyalkanoate synthase
US6600029B1 (en) 1995-12-19 2003-07-29 Regents Of The University Of Minnesota Metabolic engineering of polyhydroxyalkanoate monomer synthases
US5821299A (en) * 1996-02-16 1998-10-13 The Proctor & Gamble Company Solvent extraction of polyhydroxy-alkanoates from biomass facilitated by the use of marginal nonsolvent
JP3062459B2 (ja) * 1996-08-14 2000-07-10 理化学研究所 ポリエステル重合酵素遺伝子及びポリエステルの製造方法
AU8473198A (en) 1997-06-30 1999-01-19 Curators Of The University Of Missouri, The Use of dna encoding plastid pyruvate dehydrogenase and branched chain oxoa cid dehydrogenase components to enhance polyhydroxyalkanoate biosynthesis in p lants
US6316262B1 (en) * 1997-09-19 2001-11-13 Metabolix, Inc. Biological systems for manufacture of polyhydroxyalkanoate polymers containing 4-hydroxyacids
EP1044278A1 (en) * 1998-01-05 2000-10-18 Monsanto Company Biosynthesis of medium chain length polyhydroxyalkanoates
DE69903792T2 (de) 1998-01-07 2003-08-14 Metabolix Inc Tierfutterzusammensetzungen
US6586658B1 (en) 1998-03-06 2003-07-01 Metabolix, Inc. Modification of fatty acid metabolism in plants
US6143952A (en) * 1998-03-31 2000-11-07 Regents Of The University Of Minnesota Modified pseudomonas oleovorans phaC1 nucleic acids encoding bispecific polyhydroxyalkanoate polymerase
US6103956A (en) * 1998-03-31 2000-08-15 Regents Of The University Of Minnesota Polyhydroxyalkanoate synthesis in plants
MXPA00009754A (es) 1998-04-08 2002-05-08 Metabolix Inc Metodos para la separacion y purificacion de biopolimeros.
JP2000189170A (ja) * 1998-05-08 2000-07-11 Daicel Chem Ind Ltd 光学活性４―ハロ―３―ヒドロキシ酪酸エステルの製造方法
DE69929700T2 (de) * 1998-07-30 2006-08-31 Metabolix, Inc., Cambridge Bifunktionelle enzyme zur biopolymerherstellung
DE19834608A1 (de) 1998-07-31 2000-02-03 Basf Ag Kristallmodifikation der Liponsäure
ATE385521T1 (de) 1998-08-04 2008-02-15 Metabolix Inc Herstellung von polyhydroxyalkanoaten aus polyolen
US6174990B1 (en) 1998-12-21 2001-01-16 The Procter & Gamble Company Films comprising biodegradable PHA copolymers
US6077931A (en) * 1998-12-21 2000-06-20 The Procter & Gamble Company Biodegradable PHA copolymers
US6160199A (en) * 1998-12-21 2000-12-12 The Procter & Gamble Company Absorbent articles comprising biodegradable PHA copolymers
US6448473B1 (en) * 1999-03-05 2002-09-10 Monsanto Technology Llc Multigene expression vectors for the biosynthesis of products via multienzyme biological pathways
CA2365276C (en) 1999-03-15 2009-08-25 Universite Laval Method for producing polyhydroxyalkanoates in recombinant organisms
US6451564B1 (en) * 1999-07-02 2002-09-17 Massachusetts Institute Of Technology Methods for producing L-isoleucine
US6475734B1 (en) * 1999-09-29 2002-11-05 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Polyhydroxyalkanoate synthase genes
US20020169297A1 (en) 2000-10-20 2002-11-14 Susheng Gan Genetic insulator for preventing influence by another gene promoter
US6806401B2 (en) * 2000-12-27 2004-10-19 Pioneer Hi-Bred International, Inc. OAR polynucleotides, polypeptides and their use in PHA production in plants
US6822142B2 (en) 2001-01-05 2004-11-23 Monsanto Company Transgenic plants containing altered levels of steroid compounds
EP1366349A4 (en) * 2001-01-26 2005-02-09 Univ Colorado State Res Found ANALYSIS OF GENE EXPRESSION AND BIOLOGICAL FUNCTION BY OPTICAL ILLUSTRATION
DE10254165A1 (de) 2002-11-20 2004-06-03 Icon Genetics Ag Verfahren zur Kontrolle eines zellulären Prozesses in einem multizellulären Organismus
US7581543B2 (en) 2004-04-14 2009-09-01 Philip Morris Usa Inc. Reduction of phenolic compound precursors in tobacco
TW200613560A (en) * 2004-06-29 2006-05-01 Procter & Gamble Solvent extraction of polyhydroxyalkanoates from biomass
US20060057691A1 (en) * 2004-09-15 2006-03-16 Karunakaran Narasimhan Process for the extraction of polyhydroxyalkanoates from biomass
AU2006295515A1 (en) * 2005-09-27 2007-04-05 Polybatics Limited Polymer particles and uses thereof
EP2821494B1 (en) 2007-03-16 2017-03-08 Genomatica, Inc. Compositions and methods for the biosynthesis of 1,4-butanediol and its precursors
US7947483B2 (en) 2007-08-10 2011-05-24 Genomatica, Inc. Methods and organisms for the growth-coupled production of 1,4-butanediol
WO2009145840A2 (en) * 2008-04-04 2009-12-03 Massachusetts Institute Of Technology Cellular production of hydroxyvalerates from levulinate
WO2010030711A2 (en) 2008-09-10 2010-03-18 Genomatica, Inc. Microorganisms for the production of 1,4-butanediol
MY149457A (en) * 2008-12-29 2013-08-30 Eyal Res Integrated methods for processing palm fruit bunches
VN29235A1 (sk) * 2009-06-04 2012-03-26
EP3392340B1 (en) 2009-06-04 2022-01-05 Genomatica, Inc. Microorganisms for the production of 1,4-butanediol and related methods
CA2777459A1 (en) * 2009-10-13 2011-04-21 Genomatica, Inc. Microorganisms for the production of 1,4-butanediol, 4-hydroxybutanal, 4-hydroxybutyryl-coa, putrescine and related compounds, and methods related thereto
US8530210B2 (en) 2009-11-25 2013-09-10 Genomatica, Inc. Microorganisms and methods for the coproduction 1,4-butanediol and gamma-butyrolactone
CA2788811A1 (en) 2010-02-11 2011-08-18 Metabolix, Inc. Process for gamma-butyrolactone production
US8637286B2 (en) 2010-02-23 2014-01-28 Genomatica, Inc. Methods for increasing product yields
US8048661B2 (en) 2010-02-23 2011-11-01 Genomatica, Inc. Microbial organisms comprising exogenous nucleic acids encoding reductive TCA pathway enzymes
WO2012046254A2 (en) * 2010-10-08 2012-04-12 Cadila Healthcare Limited Process for preparing an intermediate of sitagliptin via enzymatic conversion
US11932845B2 (en) 2012-06-04 2024-03-19 Genomatica, Inc. Microorganisms and methods for production of 4-hydroxybutyrate, 1,4-butanediol and related compounds
MY197555A (en) 2016-10-18 2023-06-23 Meredian Bioplastics Inc Crystal nucleating agents for polyhydroxyalkanoates
US11584110B2 (en) 2020-07-30 2023-02-21 Pepsico, Inc. Multi-layered packaging films
JP2023543002A (ja) 2020-09-24 2023-10-12 メレディアン・インコーポレーテッド 生分解性ラベル及びそのための樹脂
EP4217170A1 (en) 2020-09-24 2023-08-02 Meredian, Inc. Pre-forms for making biodegradable containers and resin therefor
CA3193674A1 (en) 2020-09-24 2022-03-31 Adam Johnson Biodegradable container closure and resin therefor
KR20230095077A (ko) 2020-09-24 2023-06-28 메레디언, 인크. 생분해성 용기 및 이를 위한 수지
CA3230745A1 (en) 2021-09-22 2023-03-30 Laurent HENRIQUEL Method for manufacturing a pha container

Family Cites Families (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5229279A (en) * 1987-06-29 1993-07-20 Massachusetts Institute Of Technology Method for producing novel polyester biopolymers
US5250430A (en) * 1987-06-29 1993-10-05 Massachusetts Institute Of Technology Polyhydroxyalkanoate polymerase
US5245023A (en) * 1987-06-29 1993-09-14 Massachusetts Institute Of Technology Method for producing novel polyester biopolymers
AT397771B (de) * 1988-07-25 1994-06-27 Tyrolia Freizeitgeraete Vorrichtung zur montage von skibindungen
EP0482077B1 (en) * 1989-07-10 1998-10-21 Massachusetts Institute Of Technology Method for producing polyester biopolymers
GB9108756D0 (en) * 1991-04-24 1991-06-12 Ici Plc Production of polyalkanoate in plants
GB9115245D0 (en) * 1991-07-16 1991-08-28 Ici Plc Production of polyalkanoate
CA2113412C (en) * 1991-07-19 2000-01-25 Christopher R. Somerville Transgenic plants producing polyhydroxyalkanoates
GB9223332D0 (en) * 1992-11-06 1992-12-23 Ici Plc Production of polyhydroxyalkanoate in plants
GB9306490D0 (en) * 1993-03-29 1993-05-19 Zeneca Ltd Plant gene specifying acetyl,coenzyme a carboxylase and transformed plants containing same

Also Published As

Publication number Publication date
NZ243626A (en) 1995-03-28
EP0595896A4 (en) 1994-08-24
EP0595896B1 (en) 2005-05-18
NL195045C (nl) 2003-06-27
CZ10894A3 (en) 1994-12-15
DE69233512D1 (de) 2005-06-23
FI940242A (fi) 1994-03-11
PL295350A1 (en) 1993-04-05
FR2679735B1 (sk) 1995-05-05
US5650555A (en) 1997-07-22
HU9400145D0 (en) 1994-05-30
WO1993002187A1 (en) 1993-02-04
MX9204245A (es) 1993-02-01
PL170467B1 (pl) 1996-12-31
ITMI921750A0 (it) 1992-07-17
FR2679735A1 (fr) 1993-02-05
ES2046142B1 (es) 1994-10-01
PT100705A (pt) 1993-10-29
JP3696233B2 (ja) 2005-09-14
CA2113412A1 (en) 1993-02-04
HUT66825A (en) 1995-01-30
FI120353B (fi) 2009-09-30
AU671953B2 (en) 1996-09-19
EP0595896A1 (en) 1994-05-11
BE1006851A5 (fr) 1995-01-10
DE69233512T2 (de) 2005-10-13
ES2046142A1 (es) 1994-01-16
ATE295891T1 (de) 2005-06-15
CA2113412C (en) 2000-01-25
JPH06509233A (ja) 1994-10-20
IT1255348B (it) 1995-10-31
ITMI921750A1 (it) 1994-01-17
NL9201288A (nl) 1993-02-16
AU2323892A (en) 1993-02-23
BR9206297A (pt) 1995-10-17
PT100705B (pt) 1999-06-30
FI940242A0 (fi) 1994-01-18

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CA2113412C (en) Transgenic plants producing polyhydroxyalkanoates
US5602321A (en) Transgenic cotton plants producing heterologous polyhydroxy(e) butyrate bioplastic
Kriegshauser et al. Function of the HYDROXYCINNAMOYL-CoA: SHIKIMATE HYDROXYCINNAMOYL TRANSFERASE is evolutionarily conserved in embryophytes
EP0719342B1 (en) Processes for producing polyhydroxybutyrate and related polyhydroxyalkanoates in the plastids of higher plants
Malik et al. Production of high levels of poly‐3‐hydroxybutyrate in plastids of C amelina sativa seeds
WO1994012014A9 (en) Transgenic cotton plants producing heterologous bioplastic
US20140148622A1 (en) Engineering Plants to Produce Farnesene and Other Terpenoids
US20080213871A1 (en) Altering regulation of maize lignin biosynthesis enzymes via RNAi technology
EP1076095B1 (en) Methods for transformation of plants, transformed plants and processes for preparation of polyesters
MXPA00008674A (es) Modificacion de metabolismo de acidos grasos en plantas.
WO2011010485A1 (ja) エイコサノイド生産方法、並びにゼニゴケ由来のエイコサノイド生合成系遺伝子及びその利用
Seki et al. The “all-in-one” rol-type binary vectors as a tool for functional genomic studies using hairy roots
US10351868B2 (en) Engineering cyclopropane fatty acid accumulation in plants
WO2023196865A2 (en) Methods and compositions for producing plants having high vegetative fatty acids
CN115044608A (zh) 忽地笑LaOMT1及其编码基因在植物耐受盐胁迫中的应用
Kriegshauser et al. HYDROXYCINNAMOYL-CoA: SHIKIMATE HYDROXYCINNAMOYL TRANSFERASE is evolutionarily conserved in embryophytes
JP2001046074A (ja) ポリエステルの製造方法