CZ10894A3 - Transgenic plants producing polyhydroxyalkanoates - Google Patents
Transgenic plants producing polyhydroxyalkanoates Download PDFInfo
- Publication number
- CZ10894A3 CZ10894A3 CS94108A CS1089492A CZ10894A3 CZ 10894 A3 CZ10894 A3 CZ 10894A3 CS 94108 A CS94108 A CS 94108A CS 1089492 A CS1089492 A CS 1089492A CZ 10894 A3 CZ10894 A3 CZ 10894A3
- Authority
- CZ
- Czechia
- Prior art keywords
- dna
- plant material
- phb
- plant
- transgenic plant
- Prior art date
Links
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 title claims abstract description 128
- 239000005014 poly(hydroxyalkanoate) Substances 0.000 title claims abstract description 39
- 229920000903 polyhydroxyalkanoate Polymers 0.000 title claims abstract description 39
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 59
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims abstract description 37
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims abstract description 32
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims abstract description 32
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 claims description 233
- 229920000331 Polyhydroxybutyrate Polymers 0.000 claims description 100
- 239000005015 poly(hydroxybutyrate) Substances 0.000 claims description 98
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 72
- 239000000463 material Substances 0.000 claims description 54
- 239000008187 granular material Substances 0.000 claims description 47
- 108091000039 acetoacetyl-CoA reductase Proteins 0.000 claims description 41
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 38
- 108010078304 poly-beta-hydroxybutyrate polymerase Proteins 0.000 claims description 38
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 35
- 241000252867 Cupriavidus metallidurans Species 0.000 claims description 29
- 108010003902 Acetyl-CoA C-acyltransferase Proteins 0.000 claims description 28
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 claims description 24
- 102000004672 Acetyl-CoA C-acyltransferase Human genes 0.000 claims description 23
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 12
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 claims description 11
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 claims description 11
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 claims description 10
- OJFDKHTZOUZBOS-CITAKDKDSA-N acetoacetyl-CoA Chemical compound O[C@@H]1[C@H](OP(O)(O)=O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OCC(C)(C)[C@@H](O)C(=O)NCCC(=O)NCCSC(=O)CC(=O)C)O[C@H]1N1C2=NC=NC(N)=C2N=C1 OJFDKHTZOUZBOS-CITAKDKDSA-N 0.000 claims description 9
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 8
- 241000219195 Arabidopsis thaliana Species 0.000 claims description 7
- 230000001568 sexual effect Effects 0.000 claims description 6
- QHHKKMYHDBRONY-RMNRSTNRSA-N 3-hydroxybutanoyl-CoA Chemical compound O[C@@H]1[C@H](OP(O)(O)=O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OCC(C)(C)[C@@H](O)C(=O)NCCC(=O)NCCSC(=O)CC(O)C)O[C@H]1N1C2=NC=NC(N)=C2N=C1 QHHKKMYHDBRONY-RMNRSTNRSA-N 0.000 claims description 5
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims description 5
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims description 4
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 3
- 108010010718 poly(3-hydroxyalkanoic acid) synthase Proteins 0.000 claims description 3
- 230000004720 fertilization Effects 0.000 claims description 2
- 230000037361 pathway Effects 0.000 claims description 2
- 229920001791 ((R)-3-Hydroxybutanoyl)(n-2) Polymers 0.000 claims 1
- 230000000379 polymerizing effect Effects 0.000 claims 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 abstract description 9
- ZSLZBFCDCINBPY-ZSJPKINUSA-N acetyl-CoA Chemical compound O[C@@H]1[C@H](OP(O)(O)=O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OCC(C)(C)[C@@H](O)C(=O)NCCC(=O)NCCSC(=O)C)O[C@H]1N1C2=NC=NC(N)=C2N=C1 ZSLZBFCDCINBPY-ZSJPKINUSA-N 0.000 abstract description 8
- WHBMMWSBFZVSSR-GSVOUGTGSA-N (R)-3-hydroxybutyric acid Chemical compound C[C@@H](O)CC(O)=O WHBMMWSBFZVSSR-GSVOUGTGSA-N 0.000 abstract description 2
- 244000005700 microbiome Species 0.000 abstract description 2
- 239000002207 metabolite Substances 0.000 abstract 1
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 abstract 1
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 57
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 35
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 28
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 24
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 22
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 22
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 21
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 21
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 19
- 238000004817 gas chromatography Methods 0.000 description 19
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 17
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 16
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 16
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 16
- 239000000047 product Substances 0.000 description 16
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 15
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 15
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 15
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 15
- 238000003917 TEM image Methods 0.000 description 13
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 13
- LXVSANCQXSSLPA-UHFFFAOYSA-M 2-ethyl-2-hydroxybutanoate Chemical compound CCC(O)(CC)C([O-])=O LXVSANCQXSSLPA-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 12
- 101150048611 phaC gene Proteins 0.000 description 12
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 12
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 12
- 239000004677 Nylon Substances 0.000 description 11
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 11
- 229920001778 nylon Polymers 0.000 description 11
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 10
- 241000894007 species Species 0.000 description 10
- GUBGYTABKSRVRQ-WFVLMXAXSA-N DEAE-cellulose Chemical compound OC1C(O)C(O)C(CO)O[C@H]1O[C@@H]1C(CO)OC(O)C(O)C1O GUBGYTABKSRVRQ-WFVLMXAXSA-N 0.000 description 9
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N Formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 9
- 239000013615 primer Substances 0.000 description 9
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 9
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 101100243777 Dictyostelium discoideum phbB gene Proteins 0.000 description 8
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 8
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 8
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 8
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 8
- 210000004940 nucleus Anatomy 0.000 description 8
- 101150110984 phaB gene Proteins 0.000 description 8
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 8
- 241000589155 Agrobacterium tumefaciens Species 0.000 description 7
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 101100243766 Dictyostelium discoideum phbA gene Proteins 0.000 description 7
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 7
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 7
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 7
- 101150046540 phaA gene Proteins 0.000 description 7
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 7
- 230000008569 process Effects 0.000 description 7
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 7
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 7
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 7
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 108700003860 Bacterial Genes Proteins 0.000 description 6
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N Diethyl ether Chemical compound CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 6
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 6
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 6
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 6
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 6
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 6
- 239000000419 plant extract Substances 0.000 description 6
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 6
- 210000003934 vacuole Anatomy 0.000 description 6
- 108090000854 Oxidoreductases Proteins 0.000 description 5
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 5
- 108700019146 Transgenes Proteins 0.000 description 5
- 238000005054 agglomeration Methods 0.000 description 5
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 description 5
- 125000004432 carbon atom Chemical group C* 0.000 description 5
- 239000002026 chloroform extract Substances 0.000 description 5
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 5
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 5
- 239000011777 magnesium Substances 0.000 description 5
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 description 5
- 238000001819 mass spectrum Methods 0.000 description 5
- 210000000473 mesophyll cell Anatomy 0.000 description 5
- 238000001000 micrograph Methods 0.000 description 5
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 5
- 239000002689 soil Substances 0.000 description 5
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 5
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 5
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 5
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 5
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 5
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 5
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 4
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 4
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 4
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 4
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 4
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 4
- 238000002290 gas chromatography-mass spectrometry Methods 0.000 description 4
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 4
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 4
- 210000003463 organelle Anatomy 0.000 description 4
- 230000022532 regulation of transcription, DNA-dependent Effects 0.000 description 4
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 4
- 238000004627 transmission electron microscopy Methods 0.000 description 4
- BFSVOASYOCHEOV-UHFFFAOYSA-N 2-diethylaminoethanol Chemical compound CCN(CC)CCO BFSVOASYOCHEOV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000701489 Cauliflower mosaic virus Species 0.000 description 3
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 3
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 3
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N Ethyl acetate Chemical compound CCOC(C)=O XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 235000003222 Helianthus annuus Nutrition 0.000 description 3
- 102000004316 Oxidoreductases Human genes 0.000 description 3
- 108060008225 Thiolase Proteins 0.000 description 3
- ZMANZCXQSJIPKH-UHFFFAOYSA-N Triethylamine Chemical compound CCN(CC)CC ZMANZCXQSJIPKH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229940100228 acetyl coenzyme a Drugs 0.000 description 3
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 3
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 3
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 3
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 3
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 3
- 239000005547 deoxyribonucleotide Substances 0.000 description 3
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 3
- 239000007789 gas Substances 0.000 description 3
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 3
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 3
- 210000001161 mammalian embryo Anatomy 0.000 description 3
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 3
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 3
- 229930027945 nicotinamide-adenine dinucleotide Natural products 0.000 description 3
- 239000003921 oil Substances 0.000 description 3
- 235000019198 oils Nutrition 0.000 description 3
- 101150044547 phbA gene Proteins 0.000 description 3
- 101150101386 phbB gene Proteins 0.000 description 3
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 3
- 229920000728 polyester Polymers 0.000 description 3
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 3
- 150000003505 terpenes Chemical class 0.000 description 3
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 3
- QHHKKMYHDBRONY-WZZMXTMRSA-N (R)-3-hydroxybutanoyl-CoA Chemical compound O[C@@H]1[C@H](OP(O)(O)=O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OCC(C)(C)[C@@H](O)C(=O)NCCC(=O)NCCSC(=O)C[C@H](O)C)O[C@H]1N1C2=NC=NC(N)=C2N=C1 QHHKKMYHDBRONY-WZZMXTMRSA-N 0.000 description 2
- KJTLQQUUPVSXIM-ZCFIWIBFSA-N (R)-mevalonic acid Chemical compound OCC[C@](O)(C)CC(O)=O KJTLQQUUPVSXIM-ZCFIWIBFSA-N 0.000 description 2
- JNLCUVJKTXKKSG-UHFFFAOYSA-N 2-hydroxypropane-1,2,3-tricarboxylic acid;lead Chemical compound [Pb].OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O JNLCUVJKTXKKSG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- WHBMMWSBFZVSSR-UHFFFAOYSA-M 3-hydroxybutyrate Chemical compound CC(O)CC([O-])=O WHBMMWSBFZVSSR-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- REKYPYSUBKSCAT-UHFFFAOYSA-N 3-hydroxypentanoic acid Chemical compound CCC(O)CC(O)=O REKYPYSUBKSCAT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000005345 Acetyl-CoA C-acetyltransferase Human genes 0.000 description 2
- 108010006229 Acetyl-CoA C-acetyltransferase Proteins 0.000 description 2
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 2
- 238000009010 Bradford assay Methods 0.000 description 2
- KJTLQQUUPVSXIM-UHFFFAOYSA-N DL-mevalonic acid Natural products OCCC(O)(C)CC(O)=O KJTLQQUUPVSXIM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000003298 DNA probe Substances 0.000 description 2
- 244000000626 Daucus carota Species 0.000 description 2
- 235000002767 Daucus carota Nutrition 0.000 description 2
- 101710088194 Dehydrogenase Proteins 0.000 description 2
- 240000003133 Elaeis guineensis Species 0.000 description 2
- 235000001950 Elaeis guineensis Nutrition 0.000 description 2
- 241000620209 Escherichia coli DH5[alpha] Species 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 2
- SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N Glutaraldehyde Chemical compound O=CCCCC=O SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 244000020551 Helianthus annuus Species 0.000 description 2
- 239000006137 Luria-Bertani broth Substances 0.000 description 2
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L Magnesium chloride Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- ACFIXJIJDZMPPO-NNYOXOHSSA-N NADPH Chemical compound C1=CCC(C(=O)N)=CN1[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OC[C@@H]2[C@H]([C@@H](OP(O)(O)=O)[C@@H](O2)N2C3=NC=NC(N)=C3N=C2)O)O1 ACFIXJIJDZMPPO-NNYOXOHSSA-N 0.000 description 2
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010064851 Plant Proteins Proteins 0.000 description 2
- WHBMMWSBFZVSSR-UHFFFAOYSA-N R3HBA Natural products CC(O)CC(O)=O WHBMMWSBFZVSSR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 244000061456 Solanum tuberosum Species 0.000 description 2
- 235000002595 Solanum tuberosum Nutrition 0.000 description 2
- 238000002105 Southern blotting Methods 0.000 description 2
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 2
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 2
- 102000002932 Thiolase Human genes 0.000 description 2
- COQLPRJCUIATTQ-UHFFFAOYSA-N Uranyl acetate Chemical compound O.O.O=[U]=O.CC(O)=O.CC(O)=O COQLPRJCUIATTQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000009471 action Effects 0.000 description 2
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 2
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 2
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 2
- 239000012131 assay buffer Substances 0.000 description 2
- 230000001851 biosynthetic effect Effects 0.000 description 2
- 210000002421 cell wall Anatomy 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 2
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 2
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 2
- 230000010154 cross-pollination Effects 0.000 description 2
- 239000000287 crude extract Substances 0.000 description 2
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 2
- XBDQKXXYIPTUBI-UHFFFAOYSA-N dimethylselenoniopropionate Natural products CCC(O)=O XBDQKXXYIPTUBI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000003822 epoxy resin Substances 0.000 description 2
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 2
- 239000000835 fiber Substances 0.000 description 2
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 2
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 2
- 239000001307 helium Substances 0.000 description 2
- 229910052734 helium Inorganic materials 0.000 description 2
- SWQJXJOGLNCZEY-UHFFFAOYSA-N helium atom Chemical compound [He] SWQJXJOGLNCZEY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 2
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 2
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 2
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 2
- 239000002366 mineral element Substances 0.000 description 2
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 2
- 210000000633 nuclear envelope Anatomy 0.000 description 2
- 235000021118 plant-derived protein Nutrition 0.000 description 2
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 2
- 210000002706 plastid Anatomy 0.000 description 2
- 229920000647 polyepoxide Polymers 0.000 description 2
- 235000012015 potatoes Nutrition 0.000 description 2
- 238000002731 protein assay Methods 0.000 description 2
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 2
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 description 2
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 description 2
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 2
- FGDZQCVHDSGLHJ-UHFFFAOYSA-M rubidium chloride Chemical compound [Cl-].[Rb+] FGDZQCVHDSGLHJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 230000010153 self-pollination Effects 0.000 description 2
- 238000000527 sonication Methods 0.000 description 2
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 2
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 2
- 238000005809 transesterification reaction Methods 0.000 description 2
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 2
- 239000001226 triphosphate Substances 0.000 description 2
- 235000011178 triphosphate Nutrition 0.000 description 2
- 125000002264 triphosphate group Chemical class [H]OP(=O)(O[H])OP(=O)(O[H])OP(=O)(O[H])O* 0.000 description 2
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000040650 (ribonucleotides)n+m Human genes 0.000 description 1
- IUPHTVOTTBREAV-UHFFFAOYSA-N 3-hydroxybutanoic acid;3-hydroxypentanoic acid Chemical compound CC(O)CC(O)=O.CCC(O)CC(O)=O IUPHTVOTTBREAV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- SJZRECIVHVDYJC-UHFFFAOYSA-M 4-hydroxybutyrate Chemical compound OCCCC([O-])=O SJZRECIVHVDYJC-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- BAMBWCGEVIAQBF-CITAKDKDSA-N 4-hydroxybutyryl-CoA Chemical compound O[C@@H]1[C@H](OP(O)(O)=O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OCC(C)(C)[C@@H](O)C(=O)NCCC(=O)NCCSC(=O)CCCO)O[C@H]1N1C2=NC=NC(N)=C2N=C1 BAMBWCGEVIAQBF-CITAKDKDSA-N 0.000 description 1
- PHOJOSOUIAQEDH-UHFFFAOYSA-N 5-hydroxypentanoic acid Chemical compound OCCCCC(O)=O PHOJOSOUIAQEDH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HBAQYPYDRFILMT-UHFFFAOYSA-N 8-[3-(1-cyclopropylpyrazol-4-yl)-1H-pyrazolo[4,3-d]pyrimidin-5-yl]-3-methyl-3,8-diazabicyclo[3.2.1]octan-2-one Chemical class C1(CC1)N1N=CC(=C1)C1=NNC2=C1N=C(N=C2)N1C2C(N(CC1CC2)C)=O HBAQYPYDRFILMT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QTXZASLUYMRUAN-QLQASOTGSA-N Acetyl coenzyme A (Acetyl-CoA) Chemical compound O[C@@H]1[C@H](OP(O)(O)=O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OCC(C)(C)[C@@H](O)C(=O)NCCC(=O)NCCSC(=O)C)O[C@H]1N1C2=NC=NC(N)=C2N=C1.O[C@@H]1[C@H](OP(O)(O)=O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OCC(C)(C)[C@@H](O)C(=O)NCCC(=O)NCCSC(=O)C)O[C@H]1N1C2=NC=NC(N)=C2N=C1 QTXZASLUYMRUAN-QLQASOTGSA-N 0.000 description 1
- 241001133760 Acoelorraphe Species 0.000 description 1
- 241000589158 Agrobacterium Species 0.000 description 1
- 101150076489 B gene Proteins 0.000 description 1
- 108020000946 Bacterial DNA Proteins 0.000 description 1
- 108010077805 Bacterial Proteins Proteins 0.000 description 1
- 241000219310 Beta vulgaris subsp. vulgaris Species 0.000 description 1
- 229920013642 Biopol™ Polymers 0.000 description 1
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 1
- 108020004394 Complementary RNA Proteins 0.000 description 1
- RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N Copper Chemical compound [Cu] RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000003155 DNA primer Substances 0.000 description 1
- 240000005717 Dioscorea alata Species 0.000 description 1
- 235000002723 Dioscorea alata Nutrition 0.000 description 1
- 102100040004 Gamma-glutamylcyclotransferase Human genes 0.000 description 1
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 1
- 241000208818 Helianthus Species 0.000 description 1
- YXASFUBDSDAXQD-UWVGGRQHSA-N His-Met-Gly Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CNC=N1)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)NCC(O)=O YXASFUBDSDAXQD-UWVGGRQHSA-N 0.000 description 1
- 101000886680 Homo sapiens Gamma-glutamylcyclotransferase Proteins 0.000 description 1
- 206010020649 Hyperkeratosis Diseases 0.000 description 1
- 108010044467 Isoenzymes Proteins 0.000 description 1
- 108010025815 Kanamycin Kinase Proteins 0.000 description 1
- 235000007688 Lycopersicon esculentum Nutrition 0.000 description 1
- SPSSJSICDYYTQN-HJGDQZAQSA-N Met-Thr-Gln Chemical compound CSCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCC(N)=O SPSSJSICDYYTQN-HJGDQZAQSA-N 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 244000061176 Nicotiana tabacum Species 0.000 description 1
- 235000002637 Nicotiana tabacum Nutrition 0.000 description 1
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 1
- 238000000636 Northern blotting Methods 0.000 description 1
- 235000019482 Palm oil Nutrition 0.000 description 1
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 1
- 239000004353 Polyethylene glycol 8000 Substances 0.000 description 1
- 208000037534 Progressive hemifacial atrophy Diseases 0.000 description 1
- 238000002123 RNA extraction Methods 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- 241000190984 Rhodospirillum rubrum Species 0.000 description 1
- 240000003768 Solanum lycopersicum Species 0.000 description 1
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 1
- 229930182558 Sterol Natural products 0.000 description 1
- 235000021536 Sugar beet Nutrition 0.000 description 1
- 108010006785 Taq Polymerase Proteins 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- UDMBCSSLTHHNCD-KQYNXXCUSA-N adenosine 5'-monophosphate Chemical group C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(O)=O)[C@@H](O)[C@H]1O UDMBCSSLTHHNCD-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 1
- 230000008238 biochemical pathway Effects 0.000 description 1
- 229920002988 biodegradable polymer Polymers 0.000 description 1
- 239000004621 biodegradable polymer Substances 0.000 description 1
- 230000006860 carbon metabolism Effects 0.000 description 1
- 235000021466 carotenoid Nutrition 0.000 description 1
- 150000001747 carotenoids Chemical class 0.000 description 1
- 239000012159 carrier gas Substances 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 230000032823 cell division Effects 0.000 description 1
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 1
- 150000008280 chlorinated hydrocarbons Chemical class 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 230000002759 chromosomal effect Effects 0.000 description 1
- 239000003184 complementary RNA Substances 0.000 description 1
- 239000000470 constituent Substances 0.000 description 1
- 229920001577 copolymer Polymers 0.000 description 1
- 229910052802 copper Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010949 copper Substances 0.000 description 1
- KFWWCMJSYSSPSK-PAXLJYGASA-N crotonoyl-CoA Chemical compound O[C@@H]1[C@H](OP(O)(O)=O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OCC(C)(C)[C@@H](O)C(=O)NCCC(=O)NCCSC(=O)/C=C/C)O[C@H]1N1C2=NC=NC(N)=C2N=C1 KFWWCMJSYSSPSK-PAXLJYGASA-N 0.000 description 1
- 230000001086 cytosolic effect Effects 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 235000014113 dietary fatty acids Nutrition 0.000 description 1
- -1 dimethoxytrityl group Chemical group 0.000 description 1
- 235000021186 dishes Nutrition 0.000 description 1
- VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N dithiothreitol Chemical compound SC[C@@H](O)[C@H](O)CS VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N 0.000 description 1
- 235000013399 edible fruits Nutrition 0.000 description 1
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 1
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 1
- 210000002257 embryonic structure Anatomy 0.000 description 1
- 238000012869 ethanol precipitation Methods 0.000 description 1
- ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N ethidium bromide Chemical compound [Br-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CC)=C1C1=CC=CC=C1 ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960005542 ethidium bromide Drugs 0.000 description 1
- 125000004494 ethyl ester group Chemical group 0.000 description 1
- 125000001495 ethyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 description 1
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 description 1
- 239000000194 fatty acid Substances 0.000 description 1
- 229930195729 fatty acid Natural products 0.000 description 1
- 150000004665 fatty acids Chemical class 0.000 description 1
- 238000013467 fragmentation Methods 0.000 description 1
- 238000006062 fragmentation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 1
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 1
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 1
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 1
- 238000007429 general method Methods 0.000 description 1
- 238000003167 genetic complementation Methods 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 230000009931 harmful effect Effects 0.000 description 1
- 238000003306 harvesting Methods 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 150000001261 hydroxy acids Chemical class 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 238000009776 industrial production Methods 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 150000002605 large molecules Chemical class 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000010534 mechanism of action Effects 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 1
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 description 1
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 1
- 239000007003 mineral medium Substances 0.000 description 1
- 229910000402 monopotassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019796 monopotassium phosphate Nutrition 0.000 description 1
- BOPGDPNILDQYTO-NNYOXOHSSA-N nicotinamide-adenine dinucleotide Chemical compound C1=CCC(C(=O)N)=CN1[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OC[C@@H]2[C@H]([C@@H](O)[C@@H](O2)N2C3=NC=NC(N)=C3N=C2)O)O1 BOPGDPNILDQYTO-NNYOXOHSSA-N 0.000 description 1
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 239000012074 organic phase Substances 0.000 description 1
- 229910000489 osmium tetroxide Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000012285 osmium tetroxide Substances 0.000 description 1
- 238000012261 overproduction Methods 0.000 description 1
- 239000002540 palm oil Substances 0.000 description 1
- 238000012017 passive hemagglutination assay Methods 0.000 description 1
- PJNZPQUBCPKICU-UHFFFAOYSA-N phosphoric acid;potassium Chemical compound [K].OP(O)(O)=O PJNZPQUBCPKICU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000010152 pollination Effects 0.000 description 1
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 1
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 1
- 229940085678 polyethylene glycol 8000 Drugs 0.000 description 1
- 235000019446 polyethylene glycol 8000 Nutrition 0.000 description 1
- 238000006116 polymerization reaction Methods 0.000 description 1
- 239000008057 potassium phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 235000019260 propionic acid Nutrition 0.000 description 1
- 238000001243 protein synthesis Methods 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- IUVKMZGDUIUOCP-BTNSXGMBSA-N quinbolone Chemical compound O([C@H]1CC[C@H]2[C@H]3[C@@H]([C@]4(C=CC(=O)C=C4CC3)C)CC[C@@]21C)C1=CCCC1 IUVKMZGDUIUOCP-BTNSXGMBSA-N 0.000 description 1
- 229920005604 random copolymer Polymers 0.000 description 1
- 230000001850 reproductive effect Effects 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- 229940102127 rubidium chloride Drugs 0.000 description 1
- 239000013049 sediment Substances 0.000 description 1
- 239000010802 sludge Substances 0.000 description 1
- 239000002195 soluble material Substances 0.000 description 1
- 238000009331 sowing Methods 0.000 description 1
- 230000003595 spectral effect Effects 0.000 description 1
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 150000003432 sterols Chemical class 0.000 description 1
- 235000003702 sterols Nutrition 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 1
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 1
- 229920001169 thermoplastic Polymers 0.000 description 1
- 239000004416 thermosoftening plastic Substances 0.000 description 1
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 1
- 238000011426 transformation method Methods 0.000 description 1
- AVBGNFCMKJOFIN-UHFFFAOYSA-N triethylammonium acetate Chemical compound CC(O)=O.CCN(CC)CC AVBGNFCMKJOFIN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000011179 visual inspection Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
- C12N9/0006—Oxidoreductases (1.) acting on CH-OH groups as donors (1.1)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
- C12N15/8242—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits
- C12N15/8243—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits involving biosynthetic or metabolic pathways, i.e. metabolic engineering, e.g. nicotine, caffeine
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/10—Transferases (2.)
- C12N9/1025—Acyltransferases (2.3)
- C12N9/1029—Acyltransferases (2.3) transferring groups other than amino-acyl groups (2.3.1)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
- C12P7/62—Carboxylic acid esters
- C12P7/625—Polyesters of hydroxy carboxylic acids
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Nutrition Science (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
- Polyesters Or Polycarbonates (AREA)
- Biological Depolymerization Polymers (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Compounds Of Unknown Constitution (AREA)
- Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)
Description
Transgenní rostlinný materiál produkující polyhydroxyalkanoáty
Oblast techniky
Tento vynález se týká transgenních rostlinných materiále, které produkují poly-beta-D-hydroxybutyráty (PHB) a podobné polyhydroxyalkanoáty (PHA). Tento vynález se tedy týká zavedení a exprese genetického informačního materiálu, tj. DNA, která obsahuje geny kódující proteinové materiály a/nebo geny regulující nebo jinak ovlivňující jejich produkci, do buněk vyšších rostlin a regeneraci úrodných rostlin z geneticky transformovaných buněk. Účelem této genetické intervervence je přenos schopnosti syntetizovat polymerní materiály sestavené z lineárních polyesterů hydroxykyselin z mikrobiálních organismů na vyšší rostliny. Tato skupina materiálů se obecně označuje jako polyhydroxyalkanoáty. Specifickým zde uvedeným příkladem je produkce polyhydroxybutyrátu (PHB).
Dosavadní stav techniky
Mnoho druhů bakterií shromažďuje granule polyesterů sestavené z hydroxyacylmonomerů, které slouží jako zásoba uhlíku. Výskyt, metabolismus, metabolická úloha a průmyslové využití bakteriálních polyhydroxyalkanoátů bylo nedávno souhrnně dokumentováno Andersonem a spol. [Anderson A., Dawes E.A.: Microbiol. Rev. 54, 450 až 472 (1990).]. Nejobvykleji se vyskytující sloučeninou této skupiny je póly (D(-)-3-hydroxybytyrát) . Některé druhy však akumulují kopolymery jiných hydroxyalkanoátů, jako je například 3-hydroxypentanoát [Wallen J.L., Rohwedder W.: Environ Sci. Technol. 8, 576 až 579 (1974).}. Jako složky polymerů z mořských sedimentů bylo nalezeno alespoň 11 3-hydroxykyselin s krátkým řetězcem. Studie produkce polyhydroxyalkanoátů v Alcaligenes eutrophus ukázaly, že jestliže se bakterie kultivují v mediu, které má jako zdroj uhlíku pouze glukosu, akumuluje se pouze PHB. Avšak jestliže se jako zdroj uhlíku používá jak glukosa tak kyselina propionová, bakterie akumulují náhodné kopolymery 3-hydroxypentanoátu a 3-hydroxybutyrátu [Holmes P.A.: Phys. Technol. 16. 32 až 36 (1985), Holmes P.A., Wright L.F., Collins S.H.: evropské patenty 0 069 497 (leden 1983) a 0 052 459 (prosinec 1985).]. A dále, jestliže se A. eutrophus dodávají různé jiné zdroje uhlíku, produkují se polyestery, které obsahují 4-hydroxybutyrát a 5-hydroxyvalerát [Tabulka I v citaci Anderson A.J., Dawes A.E.: Microbiol. Rev. 54. 450 až 472 (1990).]. Je tedy zřejmé, že složení polymeru je do jistého stupně regulováno dostupností alternativních substrátů pro enzymy, které katalýzují syntézu polymeru z monomerů.
PHB se akumuluje v bakteriálních buňkách jako granule s průměrem přibližně 0,24 až 0,5 Mm. Na základě měření molekulové hmoty PHB monomerů bylo zjištěno, že každá granule obsahuje minimálně 1000 polymerních řetězců. Bylo navrženo, že granule mají membránový potah složený z lipidů a proteinů, které představují přibližně 0,5 a 2 % hmotnosti granule [Anderson A., Dawes E.A.: Microbiol. Rev. 54, 450 až 475 (1990).]. Předpokládá se, že aktivita PHB synthasového enzymu souvisí s touto membránou. Stav PHB uvnitř této granule je v podstatě nejistý. Nedávný důkaz navrhuje, že polymer uvnitř granulí je v amorfním stavu. Není známo, co reguluje velikost PHB granulí v jakémkoliv organismu.
Ve většině organismů se PHB syntetizuje z acetylkoenzymu A (acetyl-CoA) řadou tří reakcí katalyžovaných 3-ketothiolasou (acetyl-CoA acetyltransferasa; EC 2.3.1.9) , acetoacetyl-CoA reduktasou (hydroxybutyryl-CoA dehydrogenasa; EC 1.1.1.3 6) a póly (3-hydroxubutyrát) synthasou. Cesta je uvedena na obrázku 1. V Rhodospirillum rubrum se PHB syntetizuje konversí L(+)-3-hydroxybutyryl-CoA na krotonyl-CoA a D(-)-3-hydroxybutyryl-CoA. 3-Ketothiolasa byla vyčištěna z různých PHB-syntetizujících bakterií a byla studována na několika druzích vyšších rostlin. Předpokládá se, že úloha enzymů ve vyšších rostlinách je při produkci acetoacetyl-CoA pro produkci mevalonátu a také při degradaci mastných kyselin. Acetoacetyl-CoA reduktasa byla detegována u četných PHB-syntetizujících bakterií. Zdá se, že něk3 teré druhy, včetně A. eutrophus. mají dva isoenzymy, které se liší pokud jde o substrátovou specifičnost a kofaktorové požadavky. NADH reduktasa A. eutrophus je aktivní u D(-)- a L(+)-3-hydroxyacyl-CoA se 4 až 10 atomy uhlíku, zatímco NADPH reduktasa je aktivní pouze u D(-)-3-hydroxyacyl-CoA se 4 až 5 atomy uhlíku. Enzym tohoto druhu nebyl nikdy popsán u vyšších rostlin. PHB synthasová aktivita byla detegována v PHB-akumulujících bakteriích jako jak rozpustný enzym tak jako aktivita vázaná na granule, podle podmínek růstu. Obě formy enzymu byly částečně vyčištěny, ale nebyly ještě vyčištěny do homogenity vzhledem ke své nestabilitě. PHB synthasa A. eutrophus je specifická pro D(-)-enantiomery a při testování s 3-hydroxyacyl-CoA bylo ukázáno, že je aktivní pouze se substráty se 4 a 5 atomy uhlíku, což souhlasí s pozorováním že do polymeru jsou tímto organismem inkorporovány pouze 3-hydroxykyselinové monomery se 4 a 5 atomy uhlíku. Mechanismus působení PHB synthasy zůstává nejasný. Předpokládá se, že role přenosu řetězců hraná synthasou musí být nějakým způsobem regulována molekulovou hmotou produkovaného polymeru, která je charakteristická pro daný organismus. PHB synthasová aktivita nebyla nikdy popsána u žádné rostliny.
Několik skupin vědců nezávisle na sobě klonovalo a expresí v E. coli získalo geny, které jsou obsaženy v biosyntéze PHB mikroorganismem A. eutrophus [Slater S.C. a spol.: J. Bacteriol. 170. 4431 až 4436 (1988), Schubert F. a spol.: J. Bacteriol. 170. 5837 až 5847 (1988) . ]. Rekombinantní kmeny E. coli nesoucí fragment o 5200 párech nukleotidů z A. eutrophus byly schopny akumulovat podstatná množství PHB jako intracelulární granule. Dvěma skupinami byly rovněž stanoveny sekvence nukleotidů fragmentu o 5200 párech nukleotidů [Janes B.B. a spol. v Novel Biodegradable Microbial Polymers, Dawes E.A. (red.), Kluwer Academie Publishers, str. 175 až 198 (1990), Peoples O.P. a Sinskey A. J. : J. Biol. Chem. 264. 15293 až 15303 (1989).]. Analýza odvozených sekvencí aminokyselin otevřených čtecích fragmentů ve spojení s důkazem založeným na genetických komplementačních studiích odhalily, že fragment o velikosti
5200 pára nukleotidů obsahoval tři úzce související geny kódující tři enzymy požadované pro produkci PHB. Byl podán patent, který se týká použití klonovaných genů pro nadprodukci biosyntetických enzymů v bakteriích [Peoples O.P. a Sinskey A.J.: mezinárodní patent Světového úřadu WO 89/00202 z ledna 1989.].
Některé druhy bakterií mají schopnost vylučovat enzymy a degradovat PHB a podobné polyhydroxyalkanoáty [přehledný článek: Anderson A. a Dawes E.A.: Microbiol. Rev. 54, 450 až 472 (1990) .]. Protože tyto bakteriální druhy převládají v mnoha typech přirozeného prostředí, PHB se v zemi a aktivovaných kalech rychle rozkládá. PHB a podobné polyhydroxyalkanoáty jsou tedy zajímavé jako obnovitelné zdroje biodegradovatelných termoplastických látek. Průmyslová produkce PHB kultivací bakterií ve velkém měřítku začala v roce 1982. PHB produkovaný tímto způsobem je dodáván na trh UCI plc pod obchodním označením Biopol. Avšak vzhledem k cenám souvisejícím s růstem a sklízením velkých kultur bakterií je výroba PHB mnohem dražší než výroba takových polymerních materiálů, jako je například škrob, který se v mnoha druzích vyšších rostlin akumuluje ve vysokých množstvích. Může být tedy výhodné vyvinout způsobem genetického inženýrství linie vyšších rostlin, které akumulují PHB.
V následující části budou stručně popsány obrázky a tabulky .
Obrázek 1 ukazuje biochemickou cestu výroby polyhydroxybutyrátu (PHB) . V A. eutrophus se pHB produkuje postupným působením tří enzymů, 3-ketothiolasy, která převádí acetyl-CoA na acetoacetyl-CoA, acetoacetyl-CoA reduktasy, která převádí acetoacetyl-CoA na D(-)-3-hydroxybutyryl-CoA, a PHB synthasy, která převádí D(-) -3-hydroxybutyryl-CoA na polyhydroxybutyrát. Acetoacetyl-CoA je u rostlin a živočichů prekursorem produkce mevalonátu.
Obrázek 2 ukazuje sekvenci nukleotidů PHB operonu z A. eu5 trophus. Tato sekvence byla získána od Janese B., Hollara J. a Dennise D., Novel Biodegradable Polymers, Dawes E.A. (red.), Kluwer Academie Publishers, 175 až 190 (1990). Otevřená čtecí oblast od nukleotidu 842 do 2611 kóduje PHB synthasu (phbC gen) (aminokyseliny S1 až S589). Otevřená čtecí fáze od nukleotidu 2696 do 3877 kóduje enzym 3-ketothiolasu (phb A gen) (aminokyselina TI až T393) . Otevřená čtecí fáze od nukleotidu 3952 do 4692 kóduje enzym acetoacetyl-CoA reduktasu (phb B gen) (aminokyselina R1 až R246). Sekvence restrikčních enzymů Ddel, BstBI, Pstl, Sací a Tthllll jsou podtrženy. Tyto restrikční enzymy byly použity pro subklonování genů phb.
Obrázek 3 ukazuje schematický souhrn stupňů, které jsou obsaženy v konstrukci plasmidů pUC-THIO a pBI-THIO. Účelem druhého plasmidu je umístit gen 3-ketothiolasy z A. eutrophus pod transkripční kontrolu promotoru CaMV 35S tak, aby byl transkribován ve vyšších rostlinách. Horní diagram představuje A. eutrophus PHB operon s přibližným umístěním otevřené čtecí fáze kódující PHB synthasu, 3-ketothiolasu a acetoacetyl-CoA reduktasu. Horizontální šipky ukazují směr transkripce. Dolní diagram označuje hlavní složky plasmidů odvozených od pBI121: NPT II, gen neomycin-fosfotransferasy II kódující resistenci na kanamycin, CAMV 35S, 35S promotor viru květákové mosaiky, póly A, polyadenylační sekvenci, RB, pravou hraniční sekvenci T-DNA, a LB, levou hraniční sekvenci T-DNA. Dolní diagram není nakreslen v měřítku. Zkratky míst restrikčních enzymů: D pro Ddel, P pro Pstl, B pro BstBI, T pro Tthllll, BH pro BamHI, S pro Sací a H pro HindlII.
Obrázek 4 je schematickým souhrnem stupňů konstrukce plasmidu pUC-SYN a pBI-SYN. Účelem druhého z plasmidů je umístit gen PHB synthasy z A. eutrophus pod transkripční kontrolu promotoru CaMV 35S tak, aby byl transkribován ve vyšších rostlinách. Diagramy a zkratky jsou popsány na obrázku 3.
Obrázek 5 je schematickým souhrnem stupňů konstrukce plasmidů pUC-RED a pBI-RED. Účelem druhého z plasmidů je umístit gen acetoacetyl-CoA reduktasy z A. eutrophus pod transkripční kontrolu promotoru CaMV 35S tak, aby docházelo k jeho expresi ve vyšších rostlinách. Horní a spodní diagramy a zkratky jsou popsány na obrázku 3. Střední diagram je zvětšením oblasti genu acetoacetyl-CoA reduktasy. Jsou onačena umístění a sekvence PCR primeru č. 1 a č. 2. Poslední nukleotid na 3' konci PCR primeru č. 1 odpovídá nukleotidu 3952 na obrázku 2 a je prvním nukleotidem iniciačního kodonu genu reduktasy. Poslední nukleotid na 3' konci PCR primeru č. 2 je doplňkový k nukleotidu 4708 na obrázku 2. Jsou označena další místa pro restrikční enzymy BamHI a KpnI vytvořená PCR primery.
Obrázek 6 ukazuje Southernovu blotovou analýzu netransformované kontroly a transgenních A. thaliana rostlin. Jeden gram genomové DNA z netransformované A. thaliana druh Rschew a z transgenních rostlin se rozštěpí působením restrikčního enzymu HindlII. Fragmenty se oddělí elektroforesou na agarosovém gelu a přenesou se na nylonové membrány. Filtry se hybridizují s 32P-označenými DNA fragmenty z genů (A) phbA, (B) phbB a (C) phbC. Byly analyzovány tyto genomové DNA: divokého typu A. thaliana druh Rschew (pás a) a transgenní T4-3A (pás B) , T3-2A (pás c) , T4-2A (pás d) , T4-3B (pás e) , RedB-2G (pás f) , RedB-2B (pás g) , RedB-2E (pás h) , RedB-2C (pás i), RedD-3A (pás j), RedB-2A (pás k) , RedB-2D (pás 1) , S12-3A (pás m) , S8-1-2C (pás n) , S8-1-2A (pás o) a S8PUC-2B (pás p) . Čísla na levé straně jsou délky v tisících párech nukleotidů (pn) .
Obrázek 7 ukazuje Northernovu blotovou analýzu netransformované kontroly a transgenních A. thaliana rostlin. Celková RNA z divokého typu A. thaliana druh Rschew (10 gg) a z transgenních rostlin (20 gg) se rozdělí elektroforesou na agarosových gelech obsahujících formaldehyd a přenese se na nylonové membrány. Filtry se hybridizují s 32P-označenými DNA fragmenty z genů (A) phbA, (B) phbC a (C) phbB. Z rostlin byly analyzovány tyto RNA: T3-2A (pás a) , T4-2A (pás b) , T1-3B (pás c) , T4-3A (pás d) , divoký typ A. thaliana (pásy e, jar), S8PUC-2B (pás
f) , S8-1-2C (pás g) , S12-3A (pás h) , S8-1-2A (pás i) , RedB-2D (pás k) , RedB-2E (pás 1) , RedB-2G (pás m) , RedB-2A (pás n) ,
RedB-2B (pás o) , RedB-2C (pás p) a RedD-3A (pás q) . Čísla znamenají délky v tisících párech nukleotidů (pn) .
Obrázek 8 ukazuje plynovou chromatografii (GC) vyčištěných PHB a rostlinných extraktů. GC spektra transesterifikovaného chloroformového extraktu listů netr as formovaného divokého typu . A. thaliana druh Rschew (B) a F1 hybridu transgennich rostlin
S8-1-2A a RedB-2C (C) byla srovnána s chromatogramem transeste- rif ikovaného komerčního PHB (A) . Šipky označují místa ethyl-hydroxybutyrátového maxima.
Obrázek 9 ukazuje analýzu plynovou chromatograf i í a hmotovou spektrometrií ethyl-hydroxubutyrátu připraveného z PHB standardu a PHB z rostlinných extraktů. (A) : hmotové spektrum transesterifikovaného komerčního PHB, (B) : hmotové spektrum GC maxima z chloroformového extraktu listů hybridu F1 (hybrid S8-1-2A s RedB-2C) s retenčním časem identickým s retenčním časem ethyl-hydroxybutyrátu (jak je to uvedeno na obrázku 8C) .
Obrázek 10 ukazuje transmisní elektronové mikrofotografie (TEM) listu a semene PHB-positivních transgennich A. thaliana rostlin. Transgenní rostliny S8-1-2A a S8-1-2C byly zkříženě opyleny s transgenními rostlinami RedB-2D a RedB-2A. Výsledná semena F1 byla vyseta do půdy a vzorky listů rostlinek starých 2 až 3 týdny byly analyzovány TEM (mikrofotografie a až e) .
• Některá semena F1 byla také nechána nabobtnat ve vodě (24 hodin) , embryo bylo vyříznuto z potahu semene a kotyledony byly analyzovány TEM (mikrofotografie F) . (a): Dvě přilehlé listové mesofylní buňky z RedB-2D X S8-1-2A F1 hybridu vykazující aglomerace svítících (vlivem elektronů) granulí v jádře, (b) : Větší zvětšení pravé horní buňky z mikrofotografie a. (c): Jádro listové mesofylní buňky z RedB-2D X S8-1-2A F1 hybridu vykazující aglomeraci granulí, (d) : Listová mesofylní buňka z RedB-2A X S8-1-2A F1 hybridu vykazující svítící granule v jádře (N) a vakuole (V) . (e) : Listová mesofylní buňka z RedB-2A X S8-1-2A F1 hybridu vykazující svítící granule v cytoplasmě. (f) : Kotyledo8 nové buňky z RedB-2A X S8-1-2C F1 hybridního semene vykazující granule v jádře. Šipky ukazují aglomerace svítících granulí, čárka znamená 1 Mm pro mikrofotografie a, b, c, d a f. čárka znamená 0,25 μια pro mikrofotograf ie e.
Podstata vynálezu
Tento vynález se týká transgenního rostlinného materiálu, který se vyznačuje tím, že obsahuje cizí DNA, která vede k produkci polyhydroxyalkanoátu.
Tento vynález se dále týká transgenního rostlinného materiálu, který obsahuje cizí DNA kódující peptid, který vykazuje 3-ketothiolasovou aktivitu.
Tento vynález se týká také transgenního rostlinného materiálu, který obsahuje cizí DNA kódující peptid, který vykazuje acetoacetyl-CoA reduktasovou aktivitu.
Tento vynález se týká také transgenního rostlinného materiálu, který obsahuje cizí DNA kódující polypeptid, který inhibuje PHB synthasovou aktivitu.
Tento vynález se týká způsobu zavedení bakteriální DNA kódující proteiny, které jsou potřeba pro syntézu polyhydroxyalkanoátu, do rostliny, vyznačující se tím, že zahrnuje pohlavní spojení sexuálním oplodněním dvou rostlin, které neprodukují PHB, při čemž každá obsahuje cizí DNA kódující jeden nebo více různých enzymů na cestě vedoucí k polymeraci hydroxyalkyl-CoA na polyhydroxyalkanoátovou synthasu za vzniku rostliny, která kóduje polyhydroxyalkanoát.
Podle tohoto vynálezu se tedy získává způsob přípravy geneticky modifikovaných vyšších rostlin, které produkují a akumulují PHB nebo podobné polyhydroxyalkanoáty. V jednom uspořádání se rostliny produkující PHB získávají stabilním zaváděním bakteriálních genů, které kódují enzymy acetoacetyl-CoA reduk9 tasy (hydroxybutyryl-CoA dehydrogenasa) a póly(3-hydroxybutyrát) synthasy do rostlin transformací zprostředkovanou Ti-plasmidem. Jelikož bakteriální geny nejsou v rostlinných buňkách normálně transkribovány, jsou tyto geny modifikovány tak, že jsou pod transkripční kontrolou DNA sekvence (tj. promotoru) , která indukuje transkripci v rostlinných buňkách. Tyto geny jsou modifikovány také přidáním příslušné DNA sekvence k nekódující 3' -oblasti genů tak, že transkripty produkované v rostlinných buňkách jsou příslušně polyadenylované.
V jednom uspořádání podle vynálezu se PHB-produkující rostliny získávají sexuálním zkřížením dvou rodičovských linií, které neprodukují PHB. Toho se dosáhne zkříženým opylením transgenní rostlinné linie homozygotní pro ektopické kopie genu modifikované PHB synthasy transgenní rostlinnou linií homozygotní pro ektopické kopie modifikovaného genu acetoacetyl-CoA reduktasy. V této souvislosti se pojem ektopické geny týká genů, které nejsou normálně přítomny v organismu, ale které jsou stabilně integrovány do genomu genetickou transformací. Být homozygotní pro ektopické kopie znamená, že v diploidním organismu mají oba homologní chromosomy ektopický gen integrován ve stejném místě chromosomu.
Před vysvětlením vynálezu je užitečné vysvětlit definice některých pojmů, které jsou zde dále používány.
Transformace znamená proces, kterým se mění genotyp organismu příjemce stabilním zavedením DNA jakýmikoliv způsoby.
Transgenní rostlina znamená rostlinu, která obsahuje DNA sekvence, které normálně nejsou přítomny v tomto druhu, ale které byly do něj zavedeny transformací.
Transkripce znamená tvorbu RNA řetězce podle genetické informace obsažené v DNA.
Translace znamená proces, při němž genetická informace v molekule mRNA řídí pořadí specifických aminokyselin během syntézy proteinu.
Promotor znamená DNA fragment, který způsobuje transkripci genetického materiálu. Pro zde popsané účely se promotor používá pro označení DNA fragmentů, které dovolují transkripci do buněk rostlin. CaMV 35S-promotor je DNA fragment viru květákové mosaiky, který způsobuje relativně vysoké hladiny transkripce v mnoha různých tkáních mnoha druhů vyšších rostlin [Benfey P.N. a Chu N.H.: Science 250, 959 až 966 (1990).].
Poly-A adiční místo znamená nukleotidovou sekvenci, která způsožuje, že jisté enzymy štěpí mRNA ve specifickém místě a přidávají sekvence skupin kyseliny adenylové na 3'-konec mRNA.
phbC, phbA a phbB jsou symboly genů A. eutrophus pro PHB synthasu, 3-ketothiolasu a acetoacetyl-CoA reduktasu [Peoples O.P. a Sinskey A.J.: J. Biol. Chem. 264. 15298 až 15303 (1989).].
Při popisu potomstva transgenních rostlin je užitečné přijmout konvenci, která označuje, jak mnoho generací samo-opylení uplynulo od zavedení DNA. V tomto spisu se původní transformant označuje TO generace. Potomstvo, které pochází od samoopylení této generace je označeno TI generace atd.
V případě zkříženého opylení dvou různých rodičovských rostlin se výsledné potomstvo původního zkříženého opylení označuje jako F1 generace.
I když se pokusy, které jsou zde dále diskutovány, týkají rostlin druhu Arabidopsis thaliana (L.) Heynhold, popsaný postup je obecně aplikovatelný na jakoukoliv vyšší rostlinu, pro kterou je dostupný způsob transformace. Podobně, i když se zde popsaný postup týká použití genů z A. eutrophus. zde popsaný postup je obecně aplikovatelný na použití genů z jakéhokoliv organismus, který je schopen syntézy PHB. Je také jasné, že i když se zde popsaný postup týká produkce PHB, tento postup je obecně aplikovatelný na produkci jakéhokoliv polyhydroxyalkanoátu, který se normálně produkuje v mikroorganismech účinkem polyhydroxyalkanoátové (PHA) synthasy (která zahrnuje PHB synthasu) a pro který se v odpovídající rostlině produkuje příslušný hydroxyalkyl-CoA substrát.
Příklady provedeni vynálezu
Návrh experimentu
Produkce PHB v potomcích transformovaných rostlin vyžaduje kompletaci řady následujících stupňů: 1) konstrukce řady bakteriálních plasmidů obsahujících promotorové fůze, 2) přenos těchto plasmidů do Agrobacterium tumefaciens. 3) použití A. tumefaciens pro zavedení genů do buněk rostlin (tj. v tomto případě A. thaliana) , 4) regenerace transgenních rostlin, 5) výběr rostlin, které jsou homozygotní pro ektopické geny, 6) analýza funkce ektopických genů v transformovaných rostlinách, aby se zajistilo, že se získají expresí a že genové produkty jsou funkční, 7) produkce hybridních rostlin obsahujících dva nebo více různých ektopických genů sexuálním zkřížením, 8) analýza hybridního materiálu na přítomnost PHB. Tyto stupně jsou popsány podrobněji v následujících částech.
Konstrukce trankripčních fúzí
Aby se získala transkripce bakteriálních genů ve vyšších rostlinách, musí se bakteriální geny modifikovat přidáním rostlinného promotoru tak, aby se po zavedení do vyšších rostlin transkribovaly (přepisovaly) . Dále je obvyklou praxí, že se polyA adiční místo přidá do 3' oblasti bakteriálních genů, aby se získala příslušná exprese genů ve vyšších rostlinách. Oba tyto požadavky byly uspokojeny klonováním genů phbC, phbA a phbB z plasmidů pTZ18U-PHB do binárního Ti plasmidového vektoru pBI121 (Clonotech, Ka., USA). Nukleotidová sekvence genů phbC, phbA a phbB, která je obsažena v plasmidů pTZ18U-PHB, je uve12 děna na obrázku 2. Jsou onačena místa pro příslušné restrikční enzymy použitá pro klonování a také odvozená otevřená čtecí oblast pro tyto tři geny.
CaMV 35S-phbA genová fůze byla zkonstruována tak, že se plasmid pTZ18U-PHB rozštěpí působením restrikčních enzymů Pstl a Ddel. Restrikční fragment o 1300 nukleotidech, který obsahuje sekvenci kódující gen 3-ketothiolasy, se oddělí od dalších DNA fragmentů elektroforesou na agarosovém gelu. DNA fragment se z agarosy isoluje DEAE celulosovou membránou (Schleicher & Schuell NA-45 DEAE membrána). Přečnívající konce DNA fragmentu se doplní inkubací vyčištěného restrikčního fragmentu s T4 DNA polymerasou a deoxynukleotid-trifosfáty. Zarovnaný fragment se pak klonuje do místa Smál v plasmidu pUC18 za vzniku plasmidu pUC-THIO. Restrikční fragment o 1300 nukleotidech se vyštípne z plasmidu pUC-THIO štěpením působením BamHI a Sací, vyčistí se elektroforesou s použitím DEAE celulosové membrány a liguje se do plasmidu pBI121, který byl předem rozštěpen stejnými dvěma enzymy. Bylo zjištěno, že výsledný plasmid, označený pBI-THIO, má A. eutrophus 3-ketothiolasový gen se správnou orientací vzhledem k CaMV 35S promotoru a poly-A adičnímu místu pBI121, takže je možné očekávat, že bude docházet k expresi ve vyšších rostlinách. Schematický souhrn stupňů, které jsou obsaženy při konstruování pBI-THIO, je uveden na obrázku 3.
CaMV 35S-pbhC genová fůze se zkonstruuje tak, že se plasmid pTZ18U-PHB rozštěpí působením restrikčních enzymů BstBI a Tthllll. Restrikční fragment o 1900 nukleotidech, který obsahuje sekvenci kódující gen PHB synthasy, se oddělí od dalších DNA fragmentů elektroforesou na agarosovém gelu. DNA fragment se z agarosy isoluje DEAE celulosovou membránou. Přečnívající konce DNA fragmentu se doplní inkubací vyčištěného restrikčního fragmentu s T4 DNA polymerasou a deoxynukleotid-trifosfáty. Zarovnaný fragment se pak klonuje do místa Smál v plasmidu pUC18 za vzniku plasmidu pUC-THIO. Restrikční fragment o 1900 nukleotidech se vyštípne z plasmidu pUC-SYN úplným štěpením působením BamHI a částečným štěpením působením Sací, vyčistí se elektro13 foresou s použitím DEAE celulosové membrány a liguje se do plasmidu pBI121, který byl předem rozštěpen stejnými dvěma enzymy. Bylo zjištěno, že výsledný plasmid, označený pBI-SYN, má' A. eutrophus PHB synthasový gen se správnou orientací vzhledem k CaMV 35S promotoru a poly-A adičnímu místu pBI121, takže je možné očekávat, že bude docházet k expresi ve vyšších rostlinách. Schematický souhrn stupňů, které jsou obsaženy při konstruování pBI-SYN, je uveden na obrázku 4.
CaMV 35S-pbhB genová fúze se zkonstruuje tak, že se použije pár syntetických oligonukleotidů pro primery v polymerasové řetězové reakci (PCR), aby se amplifikoval gen phbB z plasmidu pTZ18U-PHB. Sekvence oligonukleotidových primerú je uvedena na obrázku 5, kde jsou označeny PCR primer č. 1 a PCR primer č. 2. Oligonukleotidy byly navrženy takovým způsobem, aby amplifikovaná DNA sekvence obsahovala syntetické BamHI místo blízko 5'-konce kódující sekvence a syntetické místo KpnI na 3'-konci sekvence. Produkt polymerasové řetězové reakce o 790 párech nukleotidů se oddělí, vyčistí od agarosového gelu, rozštěpí se působením BamHI a KpnI a ligu je se do plasmidu pUC18, který byl předem rozštěpen působením stejných dvou enzymů. Získá se tak plasmid pUC-RED. Restrikční fragment se vyštípne z pUC-RED štěpením působením BamHI a Sací, vyčistí se elektroforesou s použitím DEAE celulosové membrány a liguje se do plasmidu pBI121, který byl předem rozštěpen stejnými dvěma enzymy. Bylo zjištěno, že výsledný plasmid, označený pBI-RED, má A. eutrophus acetoacetyl-CoA reduktasový gen se správnou orientací vzhledem k CaMV 35S promotoru a poly-A adičnímu místu pBI121, takže je možné očekávat, že bude docházet k expresi ve vyšších rostlinách. Schematický souhrn stupňů, které jsou obsaženy při konstruování pBI-RED, je uveden na obrázku 5.
Plasmidy pBI-SYN, pBI-THIO a pBI-RED byly elektroporací přeneseny do Aqrobacterium tumefaciens kmene C58 pGV3850. Plasmid, který obsahuje kolonie, se isoluje selekcí na expresi genu resistence na kanamycin, který je přítomen na rodičovském plasmidu pBI121.
Produkce transgenních rostlin
Buňky A. thaliana byly transformovány inkubací sterilní kořenové tkáně s kulturami A. tumefaciens. které nesou rekombinantní binární Ti plasmidy popsané v předcházející části. Kořeny ze sterilních sazeniček thaliana druh Rschew se transformují tak, jak je to popsáno Valvekensem D a spol. : Proč. Nati. Acad. Sci. USA 85, 5536 až 5540 (1988). Pro infikování kousků kořene A. thaliana se použije každý ze tří kmenů A. tumefaciens nesoucí jeden z modifiovaných phb genů. To vede v každém případě k isolaci přibližně 50 tkáňových kalusů resistentních na kanamycin. Z nich 10 až 25 % poskytlo plodné výhonky, které poskytly semena. Každá rostlina, která poskytla semena, byla označena jiným číslem, aby se tak označilo, že představuje rozdílnou transformační událost.
Celkem bylo z tkání zpracovaných s A. tumefaciens. nesoucích plasmid pBI-RED, isolováno 11 domnělých transgenních rostlin. Tyto rostliny byly označeny Redb-2A, -2B, -2C, -2D, -2E, -2F, -2G, -2H, -3A, -5A a RedD-3A. Všechny tyto transgenní rostlinné linie, s výjimkou RedB-2F, -2H a -5A, byly podrobně analyzovány tak, jak je to popsáno v následujících částech.
Z tkání zpracovaných s A. tumefaciens. které nesou plasmid pBI-THIO, bylo isolováno 5 domnělých transgenních rostlin. Tyto rostliny byly označeny T3-2A, T4-2A, T4-3A, T4-3B a T4-3C. Všechny tyto transgenní rostlinné linie, s výjimkou T4-3C, byly podrobně analyzovány, jak je to popsáno v následujících částech.
Z tkání zpracovaných s A. tumefaciens. které nesou plasmid pBI-SYN, byly isolovány 4 domnělé transgenní rostliny. Tyto rostliny byly označeny S8-1-2A, S8-1-2C, S12-3A a S8PUC-2A. Všechny tyto transgenní rostlinné linie byly podrobně analyzovány, jak je to popsáno v následujících částech.
Přítomnost T-DNA v domnělých transgenních rostlinách byla potvrzena vysetím semene z transgenních rostlin na agarem zpevněné minerální prostředí, které obsahuje 50 gg/ml kanamycinu. Tato koncentrace kanamycinu brání růstu netransformovaných rostlin A. thaliana, ale umožňuje normální růst rostlinám, které obsahují gen NPTII nesený na plasmidech odvozených od pBI121 nebo na plasmidu pBI121. Semena z transgenních rostlin T4-2A, RedD-3A a S8-1-2A jsou dostupná z Americké sbírky typů kultur, Rockville, Md. 20850, USA.
Isolace domnělých homozygotních transgenních linií
Minimální kriterium, které se používá při produkci homozygotních transgenních linií, je to, že se očekává, že všichni potomci z homozygotní rostliny budou resistentní na kanamycin. Jelikož přítomnost násobných ektopických kopií genu NPTII z pBI121 v různých místech genomu může způsobit podobný fenotyp, toto kriterium je nejužitečnější, jestliže primární transformace zahrnuje inserci T-DNA pouze do jediného chromosomálního místa.
Aby se identifikovaly domnělé homozygotní linie, nechá se několik TI rostlin resistentních na kanamycin z každé transgenní linie růst do zralosti v reprodukční isolaci. Ve vzorcích přibližně 50 T2 semen z každé linie se pak stanoví frekvence resistence na kanamycin. Jestliže jsou všechna T2 semena z příslušné rostliny resistentní na kanamycin, tato linie se prozatímně považuje za homozygotní.
Analýza integrace genů phb do transgenních rostlin
Aby se ověřila příslušná integrace phb genů do různých připravených transgenních rostlinných linií, analyzuje se genomová DNA transgenních rostlin. Z kontrolních netransformovaných rostlin a z T3 transgenních rostlin transformovaných plasmidy pBI-THIO, pBI-RED a pBI-SYN se isoluje DNA o vysoké molekulové hmotě. Tyto DNA se rozštěpí retrikčními enzymy HindlII, fragmenty se rozdělí elektroforesou na agarosovém gelu a přene16 sou se na nylonový filtr. Restrikční enzym HindlII štěpí pouze jednou na 57 konci CaMV 35S promotor v plasmidech pBI-THIO, pBI-RED a PBI-SYN (obrázky 3, 4 a 5) . Fragmenty, které se detegují sondami specifickými na phb gen, by měly tedy představovat fragmenty spojení Ti vektorů s rostlinnou genomovou DNA nebo vnitřní fragmenty Ti vektorů. Inserty v plasmidech pUC-THIO, pCU-RED a pUC-SYN byly vyštěpeny zpracováním s EcoRI a HindlII, vyčištěny elektroforesou na agarosovém gelu pomocí DEAE celulosové membrány a označeny 32P-deoxyribonukleotidy náhodnou aktivací. Označené phb genové fragmenty se pak použijí pro sondování nylonových filtrů. Filtry se hybridizují a následně se promyjí za přísně řízených podmínek. Výsledek těchto hybridizací na filtru je uveden na obrázku 6. Žádný ze tří phb genů nemůže být detegován v transformovaných kontrolních rostlinách (obrázky 6A, 6B a 6C, pás a). phbA gen byl detegován ve čtyřech transgenních liniích připravených transformací s plasmidem pBI-THIO (obrázek 6A, pásy b až e). phbB gen byl detegován v sedmi transgenních rostlinách připravených transformací s plasmidem pBI-RED (obrázek 6B, pásy f až 1) . A konečně, phbC gen byl detegován ve třech transgenních rostlinách připravených transformací s plasmidem pBI-SYN (obrázek 6C, pásy m až p). I když rostlinná linie S12-3A byla resistentní na 50 Mg/ml kanamycinu, což předpokládá integraci NPTII genu, nemohl být detegován žádný phbC gen. Je pravděpodobné, že do genomové DNA rostlinné linie S12-3A byl integrován pouze fragment Ti vektoru nesoucí NPTII gen a nikoliv phbC gen.
Analýza exprese phb genů v transgenních rostlinách
Aby se zjistilo, jestli dochází k expresi A. eutrophus phb genů v různých transgenních liniích, jako sondy v pokusech hybridizace na filtru se použijí klonované geny přítomné v plasmidech pUC-THIO, pUC-RED a pUC-SYN. Z netransformovaných kontrolních a z T3 trangenních rostlin se extrahuje celková RNA. RNA se rozdělí elektroforesou na agarosových gelech obsahujících formaldehyd a známými postupy se přenese na nylonové filtry. Inserty plasmidů pUC-THIO, pUC-RED a pUC-SYN se vyštěpí zpracováním s EcoRI a HindlII, vyčistí se elektroforesou pomocí DEAE celulosové membrány a označí se 32P-deoxyribonukleotidy náhodnou aktivací. Označené phb geny se použijí pro sondování nylonových filtrů. Tyto pokusy ukázaly, že žádná ze tří phb sond nehybridizuje žádnou RNA v netransformované kontrolní rostlině (obrázek 7, pásy e, jar). Naopak, transgenní rostliny připravené transformací s pBI-THIO měly RNA o velikosti 1600 párů nukleotidů (pn), která byla komplementární ke genu 3-ketothiolasy (obrázek 7A, pásy a až d) . CaMV 35S promotor a poly-A adiční sekvence přítomné na plasmidech odvozených od pBI121 přispívají přibližně 300 páry nukleotidů k celkové délce mRNA připravených z phb fúzovaných genů. Množství 3-ketothiolasové mRNA bylo u rostlinné linie T4-3A nízké vzhledem k jiným rostlinným liniím. A podobně, tři z transgenních linií připravených transformací s pBI-SYN měly mRNA o velikosti 2100 párů nukleotidů, což odpovídá genu PHB synthasy (obrázek 7B, pásy f, g a i) . Transgenní linie S12-3A neměla žádnou detegovatelnou mRNA hybridizující se sondou phbC (obrázek 7B, pás h). Tento výsledek je v souladu se Southernovou blotovou analýzou, která neukazuje žádnou integraci phbC genu do genomové DNA linie S12-3A (obrázek 6C, pás m) . A konečně, sedm transgenních linií připravených transformací s plasmidem pBI-RED mělo mRNA o velikosti 1100 párů nukleotidů, která byla komplementární ke genu acetoacetyl-CoA reduktasy (obrázek 7C, pásy k až q) . Pro každý ze tří phb genů byly tedy získány alespoň tři nezávislé transgenní rostliny, které expresí poskytují komplementární RNA s očekávanou velikostí.
I když přítomnost RNA ukazuje, že geny jsou transkribovány, neposkytuje žádnou informaci o tom, že jsou přeloženy nebo že translační produkt je funkční. Tato funkčnost byla zkoumána testováním transgenních rostlin na enzymovou aktivitu.
Transgenní rostliny připravené transformací s pBI-THIO byly analyzovány na 3-ketothiolasovou aktivitu analýzou popsanou Seniorem P.J. a Dawesem E.A.: Biochem. J. 134. 225 až 238 (1973) s menšími modifikacemi. Zmrazená tkáň listů z T3 rostlin se homogenizuje v Tris pufru. Vyčeřené surové extrakty se analyzují na 3-ketothiolasovou aktivitu. Výsledky těchto pokusů jsou uvedeny v tabulce 1. Extrakty z netransformovaných A. thaliana rostlin měly za podmínek testu velmi nízkou úroveň 3-ketothiolasové aktivity. Naproti tomu každá z transgenních rostlin, o níž bylo zjištěno, že transkribuje phbA gen, měla podstatně zvýšenou úroveň thiolasové aktivity. To naznačuje, že bakteriální thiolasový gen je funkční, jestliže dochází k jeho expresi v transgenních rostlinách. Avšak specifická 3-ketothiolasová aktivita detegovaná v různých transgenních rostlinách byla podstatně nižší ve srovnání s extrakty připravenými z E. coli nesoucí phbA gen na plasmidu pTZ18U-PHB.
Tabulka 1
Úrovně 3-ketothiolasové aktivity v A. thaliana transgenních rostlinách
| vzorek | 3-ketothiolasová aktivita3 |
| DH5alfa/PHBb | 9,5 |
| divoký tvo A. thaliana | 0,019 |
| T4-3A transgenní | 0,057 |
| T3-2A transgenní | 0,42 |
| T4-2A transgenní | 0,43 |
| T4-3B transgenní | 0,54 |
a Mikromoly acetoacetyl-CoA degradovaného za minutu na miligram proteinu. Hodnoty jsou průměrem ze dvou až čtyř měření.
b E. coli DH5alfa obsahující plasmid pTZ18U-PHB nesoucí PHB operon.
Transgenní rostliny připravené transformací s plasmidem pBI-RED byly analyzovány na acetoacetyl-CoA reduktasovou aktivitu analýzou popsanou Seniorem P.J. a Dawesem E.A.: Biochem. J. 134. 225 až 238 (1973) s menšími modifikacemi. Listy z T3 rostlin se homogenizují v pufru fosforečnanu draselného. Vyče19 řené surové extrakty se analyzují na acetoacetyl-CoA reduktasovou aktivitu. Výsledky těchto pokusů jsou uvedeny v tabulce 2. Extrakty z netransformovaných A. thaliana rostlin měly za podmínek testu nedetegovatelnou úroveň acetoacetyl-CoA reduktasové aktivity. Naproti tomu každá z transgenních rostlin, o níž bylo zjištěno, že transkribuje phbB gen, měla vysokou úroveň acetoacetyl-CoA reduktasové aktivity. To naznačuje, že bakteriální acetoacetyl-CoA reduktasový gen je funkční, jestliže dochází k jeho expresi v transgenních rostlinách. Navíc, specifická aktivita acetoacetyl-CoA reduktasy detegovaná v šesti ze sedmi analyzoaných transgenních rostlin byla podstatně vyšší než v extraktech z E. co li nesoucí phbB geny na plasmidu pTZ18U-PHB.
Tabulka 2
Úrovně acetoacetyl-CoA reduktasové aktivity v A. thaliana transgenních rostlinách
| vzorek | acetoacetyl-CoA reduktasové aktivitaa |
| DH5alfa/PHBb | 1,4 |
| divoký tvo A. thaliana | méně než 0,003 |
| RedB-2A transgenní | 12,5 |
| RedB-2B transgenní | 16,2 |
| RedB-2C transgenní | 9,1 |
| RedB-2D transgenní | 8,8 |
| RedB-2E transgenní | 1,6 |
| RedB-2G transgenní | 5,2 |
| RedD-3A transgenní | 2,3 |
a Mikromoly NADPH zredukované za minutu na miligram proteinu. Hodnoty jsou průměrem dvou až čtyř měření.
b E. coli DH5alfa obsahující plasmid pTZ18U-PHB nesoucí PHB operon.
Transgenní rostliny získané transformací plasmidem pBI-SYN nebyly analyzovány na přítomnost PHB synthasové aktivity vzhle20 dera k technickým obtížím měření aktivity tohoto enzymu v nepřítomnosti thiolasové a reduktasové aktivity.
Příprava a analýza hybridních rostlin
Jelikož vyšší rostliny obsahují endogenní cytoplasmovou 3-ketothiolasovou aktivitu, pro přípravu PHB jsou potřebné jenom acetoacetyl-CoA reduktasa a PHB synthasa. Tyto dva geny se zavedou do stejné rostliny zkříženým opylením transgenní linie, která byla posouzena jako homozygotní pro gen acetoacetyl-CoA reduktasy, transgenní linií, která byla posouzena jako homozygotní pro gen PHB synthasy. Hybridní semena, která pocházejí z tohoto zkřížení, byla před testováním na přítomnost PHB nechána růst v zemi dva až tři týdny.
Pro stanovení toho, jestli přítomnost genů acetoacetyl-CoA reduktasy a PHB synthasy v rostlinách je dostatečná pro přípravu a akumulaci PHB, se z kontrolních rostlin a z hybridních rostlin obsahujících oba tyto geny připraví extrakty materiálu, který je rozpustný v chloroforomu. Přítomnost PHB v těchto extraktech byla analyzována plynovou chromatograf ií (GC). Pro přípravu rostlinných extraktů pro GC analýzu byly použity dva způsoby. Tyto způsoby využívají jak vysoce polymerní povahy PHB (průměrná molekulová hmotn. PHB připraveného z A· eutrophus je 106) tak selektivní rozpustnosti v chlorovaných uhlovodících, jako je například chloroform. Ve stručnosti - podle způsobu č. 1 se celé listy umístí do roztoku chloroformu s vodou v poměru 1:1a třepou se s převracením 16 hodin při 65 °C. Jelikož molekuly o molekulové hmotn. větší než přibližně 50 000 nemohou projít stěnou rostlinné buňky, extrahují se z listů za těchto podmínek pouze nízkomolekulární produkty rozpustné ve vodě nebo v chloroformu. Domnělý PHB s vysokou molekulovou hmotn. se pak z listů extrahuje tak, že se zbývající tkáň zhomogenizuje, aby se rozbily buněčné stěny a homogenát se extrahuje roztokem chloroformu s vodou v poměru 1:1 12 hodin při 65 ’C. Podle způsobu č. 2 se vzorky celých listů postupně extrahují 2 hodiny při 55 *C 50% ethanolem, 2 hodiny při 55 °C 100% methanolem a minut při 20 °C 100% diethyletherem. Zbývající tkáň se pak homogenizuje a extrahuje chloroformem 4 hodiny při 100 °C. Produkty, které byly přítomny v konečném chlorofomovém extraktu z obou těchto způsobů, se transesterifikují ethanolem a kyselinou chlorovodíkovou a analyzují se plynovou chromatografií. Retenční doba transesterifikovaných rostlinných produktů byla srovnána s transesterifikovaným komerčním PHB vyčištěným z A. eutroohus (Sigma Chemical Co., Mo.).
Transgenní rostliny S8-1-2A a/nebo S8-1-2C byly zkříženě opyleny transgenními rostlinami RedB-2A, -2C, -2D, -2G a RedD-3A. Výsledná F1 semena byla vyseta do půdy. Vzorky listů nebo celé výhonky rostlin starých 2 až 3 týdny se seberou a analyzují se na přítomnost PHB. Příklady výsledků získaných způsobem čištění č. 1 jsou uvedeny na obrázku 8. Produkt přítomný v extraktech F1 rostlin, které mají transgeny jak acetoacetyl-CoA reduktasy tak PHB synthasy, má retenční čas identický s ethyl-hydroxybu týrá tem, jak to bylo stanoveno srováním s retenčním časem transesterifikovaného produktu komerčního PHB. Tento nový produkt, prozatímně identifikovaný jako ethyl-hydroxybutyrát, byl detegován pouze v F1 hybridních rostlinách, které mají jak aktivní acetoacetyl-CoA reduktasový transgen tak PHB synthasový transgen. Podobný produkt nemohl být detegován v transgenních rostlinách, které mají pouze jeden ze shora uvedených genů nebo v netransformovaných A. thaliana rostlinách. A dále, tento produkt nemohl být detegován v chloroformových extraktech rostlinných tkáni, které nebyly předem zhomogenizovány. To ukazuje, že ethyl-hydroxybutyrát je odvozen od prekursoru s vysokou molekulovou hmotou.
Identita nového rostlinného produktu, který má retenční dobu identickou s ethyl-hydroxybutyrátem, byla analyzována plynovou chromatografií ve spojitosti s hmotovou spektrometrií (GC-MS). GC-MS analýza byla prováděna na hmotovém spektrometru MSU-NIH. Na obrázku 9A je hmotové spektrum ethyl-hydroxybutyrátu připraveného z autentického PHB. Na obrázku 9B je hmotové spektrum domnělého ethyl-hydroxybutyrátu extrahovaného z F1 hybridních rostlin, které pocházely ze zkřížení transgenních rostlin S8-1-2A a RedB-2C. Tyto. výsledky ukazují, že nový rostlinný produkt, který se eluuje stejným retečním časem jako ethyl-hydroxybutyrát, má také stejnou fragmentaci v hmotovém spektru jako autentický vzorek ethyl-hydroxybutyrátu. Skutečnost, že tento nový produkt může být detegován pouze v extraktech z tkáně listů, které byly předem homogenizovány, ukazuje, že ethyl-hydroxybutyrát je odvozen od materiálu, který má molekulovou hmotn. vyšší než přibližně 50 000 (přibližná poréznost stěn rostlinné buňky). Souhrnně tato data ukazují, že transgenní rostliny obsahující gen jak acetoacetyl-CoA reduktasy tak PHB synthasy akumulují polyhydroxybutyrát. Tabulka 3 ukazuje souhrn F1 rostlin, které byly analyzovány GC a GC-MS. Na základě GC analýzy lze říci, že množství PHB akumulovaného v listech F1 hybridů se pohybuje v množství od přibližně 5 ng PHB na gram čerstvé hmotnosti listů pro F1 hybridy mezi RedD-3A a S8-1-2C do přibližně 100 μg PHB na gram čerstvé hmotnosti listů pro F1 hybrid mezi RedB-2C a S8-1-2A.
Tabulka 3
Souhrn důkazu produkce PHB v F1 hybridních rostlinách
| rodičovská transgenní liniea | rodičovská transgenní linie3 | |
| S8-1-2C | S8-1-2A | |
| RedD-3A | GCb MSC | TEMd list) |
| RedB-2A | TEM (semeno) | GC TEM (list, semeno) |
| RedB-2G | GC MS TEM (list) | |
| RedB-2C | TEM (list) | GC MS |
| RedB-2D | TEM (list) |
a Transgenní linie nesoucí transgen acetoacetyl-CoA reduktasy byly zkříženy opylením transgenními liniemi nesoucími PHB synthasu. Výsledné F1 hybridy byly analyzovány na produkci PHB.
b Důkaz produkce PHB analýzou plynovou chromatograií. c Důkaz produkce PBH plynovou chromatografií s hmotovou spektroskopií.
d Detekce zářících granulí transmisní elektronovou mikroskopií. V závorkách je označena rostlinná tkáň, která byla analyzována.
e Všechna prázdná místa znamenají, že analýza nebyla prováděna.
Vizuální inspekce PHB granulí v hybridních rostlinách
Transmisní elektronová mikroskopie (TEM) bakterií, které akumulují PHB, odkryla svítící granule o průměru 0,2 až 0,5 Mm obklopené membránových potahem o tloušťce asi 2 nm [Lundgren D.G., Pfister R.M. a Merrick J.M.: J. Gen. Microbiol. 34, 441 až 446 (1964).]. Pro stanovení toho, jestli se mohou podobné granule detegovat v hybridních rostlinách, u nichž bylo GC-MS analýzou ukázáno, že jsou positivní na produkci PHB, se rostlinné tkáně zkoumají transmisní elektronovou mikroskopií. Transgenní rostliny S8-1-2A a/nebo S8-1-2C se zkříženě opylí transgenními RedB-2A, -2C, -2D, -2G a RedD-3A. Výsledná F1 hybridní semena a zralý listový materiál se upevní pro analýzu transmisním elektronovým mikroskopem. Stručně řečeno - tkáně se upevní v 3% glutaraldehydu a 1% oxidu osmičelém a zapustí se do epoxidové pryskyřice, části o velikosti 80 až 90 nm se vybarví 5% octanem uranylu a citranem olova.
V jedné řadě pokusů se F1 semena vysejí do půdy. Listy z rostlinek starých dva až tři týdny se odeberou pro TEM analýzu. Zkoumání buněk v listech odhalilo přítomnost aglomerací svítících granulí. Tyto granule byly detegovány ve všech analyzovaných F1 hybridních rostlinách, které pocházely ze zkřížení transgenního materiálu, který má gen PHB synthasy, a transgenního materiálu, který má gen acetoacetyl-CoA reduktasy. Příklady jsou uvedeny na obrázku 10. Podobné granule nebyly nikdy detegovány v rodičovských transgenních liniích, které mají pouze gen PHB synthasy nebo pouze gen acetoacetyl-CoA reduktasy, ani nebyly detegovány v netransformovaných A. thaliana. V tkáni listů F1 hybridu byly granule detegovány v mezofylních buňkách (obrázek 10, mikrofotografie a až e) . Aglomerát svítících granulí byl detegován nejčastěji v jádru (obrázek 10, mikrofotograf ie a až c) , ale podobné struktury byly detegovány také v cytoplasmě (obrázek 10, mikrofotografie e) a vakuole (obrázek 10, mikrofotograf ie d) tkáně listů F1 hybridu. V jádře a v cytoplasmě mohou jednotlivé granule dosáhnout maximálního rozměru přibližně 0,18 μπι. Ve vakuolách byly granule obvykle větší, maximálně dosahovaly průměru přibližně 0,55 μτα. Při větším zvětšení se zdá, že jaderné granule jsou obklopeny elektronově hustým materiálem. Jak velikost tak zdánlivá struktura těchto granulí je velice podobná granulím v bakteriích, které akumulují PHB.
V druhé sérii pokusů se F1 semena nechají bobtnat ve vodě 24 hodin, potom se embryo vyřízne z povrchu semene a tkáň se fixuje. Analýza embyonálních kotyledonů odhalila přítomnost aglomerace zářících granulí v jádře (obrázek 10, mikrofotografie f) . Tyto granule mohly mít maximální průměr až 0,18 μπι. Tyto granule mohly být detegovány pouze v jádře F1 hybridních embryí, které pocházely ze zkřížení transgenního materiálu, který má gen PHB synthasy, a transgenního materiálu, který má gen acetoaceyl-CoA reduktasy. Žádné granule nebyly detegovány ani v rodičovských transgenních rostlinnách, které mají pouze jeden z ektopických genů, ani v netransformovaném divokém typu A. thaliana. Tabulka 3 ukazuje souhrnně F1 rostliny, které byly analyzovány TEM.
Shora popsaná data vykazují positivní korelaci mezi detekcí PHB kombinací GC-MS a přítomností granulí studií elektronovým mikroskopem. Velikost, tvar a přítomnost elektronově hustého materiálu obklopují cícho jednotlivé granule velice připomíná granule, které jsou přítomny v bakterii produkující PHB. A konečně, jak detekce PHB systémem GC-MS tak přítomnost svítících granulí je při TEM pozorována pouze u hybridních rostlin, které mají transgeny jak acetoacetyl-CoA reduktasy tak PHB synthasy. Souhrnně tato data ukazují, že granule pozorované v F1 hybridních rostlinách jsou složena z polyhydroxybutyrátu.
Diskuse
V těchto studiích bylo ukázáno, že bakteriální geny kódující enzymy, které jsou potřebné pro PHB syntézu, mohou být stabilně zavedeny do vyšších rostlin takovým způsobem, že dochází k transkripci těchto genů a k produkci transkriptů o očekávané velikosti. Dále bylo ukázáno, že v případě genů phbA a phbB přítomnost těchto genů v transgenních rostlinách umožňuje zvýšení hladiny enzymové 3-ketothiolasové nebo acetoacetyl-CoA reduktasové aktivity. Je tedy zřejmé, že tyto dva genové produkty jsou funkční, jestliže jsou překládány v rostlině. Vzhledem k technickým obtížím souvisejícím s testováním PHB synthasové aktivity přímo, nebylo stanovováno množství PHB synthasové aktivity v transgenních rostlinách.
Bylo ukázáno, že pouze rostlinné extrakty z F1 transgenních rostlin, které expresí poskytují jak acetoacetyl-CoA reduktasu tak PHB synthasu, produkují novou sloučeninu s vysokou molekulovou hmotou, která je rozpustná v chloroformu a která, po transesterif ikaci ethanolem a kyselinou chlorovodíkovou, poskytuje ethyl-hydroxybutyrát. Tato data ukazují, že novou sloučeninou je polyhydroxybutyrát. Navíc jsou tato data nepřímým důkazem produkce funkční PBH synthasy v transgenních rostlinách. To je důležité, protože nelze provádět in vitro testování PHB synthasové aktivity. A dále, produkce PHB také nepřímo ukazuje na to, že v rostlinách je produkován D(-)-hydroxybutyryl-CoA, substrát pro PHB synthasu. Tento hydroxyacyl-CoA se v rostlinách přirozeně nevyskytuje.
Transmisní elektronová mikrospopie dále prokázala opodstatněnost tvrzení, že PHB je produkován v transgenních rostlinách. Analýza embryonálních kotyledonů a zralých listů F1 transgenních rostlin, které expresí poskytují jak acetoacetyl-CoA reduktasu tak PHB synthasu, odhalila aglomeráty svítících granulí, které mají tvar a strukturu velmi podobnou granulím, které se nalézají v bakteriích produkujících PHB, jako je například A. eutrophus. Tyto granule byly nejčastěji nalezeny v jádře, byly však detegovány také ve vakuole a cytoplasmě F1 hybridních rostlin.
V pokusech popsaných v této práci dochází k expresi produktů genů phbA, phbB a phbC z A. eutrophus nej pravděpodobně ji v cytoplasmě, protože k proteinům nebyly přidány žádné specifické aminokyselinové sekvence, které by je specificky směrovaly do organel. Protože cytoplasma rostlinných buněk již obsahuje 3-ketothiolasu, je pro produkci PHB potřeba pouze další exprese acetoacetyl-CoA reduktasy a PHB synthasy. Skutečnost, že granule se nacházejí v jádře a vakuolách, není nutně v rozporu s expresí těchto enzymů v cytoplasmě. Jelikož během dělení buněk dochází k demontáži a opětovnému sestavení jaderných membrán, PHB granule, které se původně produkují v cytoplasmě, se mohou zachytit uvnitř nově se tvořících membrán jádra. Díky své hydrofobnosti mohou PHB granule procházet také membránami jader a vakuoly.
Podle jiného přístupu by mohla být produkce PHB lokalizována ve specifické organele rostlinné buňky cílenou expresí enzymů, kterých je potřeba při syntéze PHB, do organely. V tomto případě, jestliže cílová organela neposkytuje expresí aktivní 3-ketothiolasu, může být pro produkci PHB potřeba exprese exogenní 3-keto-thiolasové aktivity vedle acetoacetyl-CoA reduktasy a PHB synthasy.
Dlouhodobým cílem produkce PHB nebo PHA ve vyšších rostlinách je odvést skladování uhlíku ve formě hlavních zásobních sloučenin, jako je například tuk, škrob nebo terpenoidy, směrem k syntéze PHA. Tento cíl vyžaduje tkáňově specifickou expresi a také potenciálně organelově specifickou expresi enzymů, které jsou potřeba při syntéze PHA.
Pravděpodobnými cíly genetického inženýrství jsou plodiny produkující olej. Lipidy jsou syntetizovány v plastidech pomocí acetyl-CoA, stejného prekursoru používaného v syntéze PHB a dalších PHA. Genetické inženýrství olejnatých plodin tedy bude vyžadovat zacílení PBA biosyntetických enzymů do plastidu. Příkladem olejnatých plodin, které by se mohly v tomto směru využít pro produkci PHA, je řepka, slunečnice a olejová palma. Řepka a slunečnice jsou hlavními plodinami v Severní Amaerice. Obě tyto plodiny se mohou transformovat cizí DNA. PHA produkce může být také směrována do mezokarpu plodů palmy olejové. Protože lipidy, které se zde produkují, nejsou podstatné pro přežití stromu nebo zárodku, produkce PHA by neměla mít žádné škodlivé účinky na palmové stromy. Naneštěstí dosud nejsou dostupný žádné transformační techniky pro palmu olejovou.
PHA produkce by mohla být nasměrována také do kořenů a hlíz cukrovky a brambor, plodin, které akumulují velká množství škrobu. Hlavním problémem tohoto přístupu je to, že jelikož škrob a PHA nepoužívají stejné prekursory, bylo by potřeba, před tím, než by došlo k přesunu uhlíku od škrobu do PHA, potenciálně násobných modifikací v metabolismu uhlíku.
Možným nejpřímějším přístupem k PHA produkci by bylo použití plodin akumulujících velká množství terpenoidů, jako je například mrkev, která akumuluje karotenoidy, nebo mexický jam (hlíza rostliny Dioscorea alata), který akumuluje steroly. Jelikož terpenoidy používají stejné prekursory jako PHA (acetyl-CoA a acetoacetyl-CoA), přesun uhlíku na produkci PHA by se mohl dosáhnout snáze.
Materiály a metody
Konstrukce DNA rekombinantů
E. coli kmen DH5alfa nesoucí plasmidy se kultivuje v živné půdě LB doplněné o kanamycin (50 Mg/ml) nebo ampicilin (50 Mg/ml). Přípravy plasmidové DNA ve velkém měřítku se provádějí alkalickou lyží a postupem srážení polyethylenglykolem jak to popsali Sambrook J., Fritsch E.F. a Maniatis T.: Molecular Cloning, a labarotarory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989). Plasmidová DNA se rozštěpí restrikčními endonukleasami podle doporučení výrobců (New England Biolabs, Mass.; Promega Corp., Wi.; Boehringer Mannheim Biochemicals, In.; Stratagene, Ka.) , oddělí se elektroforesou na agarosovém gelu a zviditelní se vybarvením ethidiumbromidem jak to popsali Sambrook J., Fritsch E.F. a Maniatis T.: Molecular Cloning, a labarota29 rory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989). DNA fragmenty se isolují na agarosovém gelu DEAE membránami (NA-45 DEAE membrána, Schleicher & Schuell, lne., Nh.). Ve stručnosti - DNA se elektroforesuje na proužku NA-45. Membrána se promyje v 0,15M NaCl, O,lmM EDTA a 20mM Tris-HCl (pH 8). DNA se pak eluuje 1,OM NaCl, 0,lmM EDTA a 20mM Tris-HCl (pH 8) 1 až dvě hodiny při 65 °C. DNA se dále vyčistí extrakcí fenolem s chloroformem a vysrážením ethanolem. V některých příkladech se přečnívající 3' -konce DNA fragmentů převedou na zarovnané konce T4 DNA polymerasou podle postupu, který popisují Sambrook J., Fritsch E.F. a Maniatis T.: Molecular Cloning, a labarotarory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989). Ligace DNA fragmentů s kohezivnlmi nebo zarovnanými konci se provádí při 14 °C po dobu 16 hodin v pufru, který obsahuje 50 mM Tris-HCl (pH 7,6) , 5mM MgCl2, 5% (hmotnostní procenta k objemovým) polyethylenglykolu 8000, 0,5mM ATP a 5mM dithiothreitol, jak to popsali Sambrook J., Fritsch E.F. a Maniatis T.: Molecular Cloning, a labarotarory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989). část ligační reakce se přenese do E. coli způsobem s chloridem rubidia, jak to popsal Hanahan D.: J. Mol. Biol. 166. 557 až 580 (1983) . Transformované bakterie se vysejí na agarové desky, které obsahují živnou půdu LB a buď 50 /xg/ml kanamycinu nebo 50 Mg/ml ampicilinu. Bakteriální kolonie obsahující rekombinantní plasmidy se identifikují hybridizací s 32P-značenými DNA sondami, jak to popsali Sambrook J., Fritsch E.F. a Maniatis T.: Molecular Cloning, a labarotarory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989) s tím, že místo nitrocelulosových membrán se používají nylonové membrány (Hybond-N, Amersham, II.). Příprava radioaktivně označených DNA sond a hybridizace jsou popsány v následující části. Příprava plasmidové DNA v malém měřítku se provádí způsobem alkalické lýze, jak to popsali Sambrook J., Fritsch E.F. a Maniatis T. : Molecular Cloning, a labarotarory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989).
Oligonukleotidy byly syntetizovány na DNA syntetizátoru Applied Biosystems 380A DNA synthesizer podle pokynů výrobce (Applied Biosystems, Ka.). Oligonukleotidy s dimethoxytritylovou skupinou napojenou na 5' konce se vyčistí na přístroji Varian 5000 HPLC s kolonou C18 column (Varian Instrument Group, Tx.). Oligonukleotidy se resuspendují v O,1M triethylaminu. Injekcí se nanesou na C18 kolonu předekvilibrovanou směsí 12 % acetonitrilu s 88 % O,1M triethylamin-acetátu (pH 7) (rozpouštědlo A). HPLC program byl nastaven následujícím způsobem: průtok: 0,9 ml/min, maximální tlak: 1,4 MPa, čas 0 minut: 88 % rozpouštědla A s 12 % rozpouštědla B (acetonitril), čas 3 minuty: 88 % rozpouštědla A s 12 % rozpouštědla B, čas 21 minut: 65 % rozpouštědla A s 35 % rozpouštědla B, čas 25 minut: 65 % rozpouštědla A s 35 % rozpouštědla B. Vyčištěné oligonukleotidy byly detritylovány v 80% kyselině octové po dobu 10 minut a vysušeny pod dusíkem. Oligonukleotidy byly rozpuštěny v lOmM Tris-HCl (pH 7,5) a 0,lmM EDTA, extrahovány třikrát stejnými objemy ethylacetátu a vysráženy ethanolem.
Polymerasová řetězová reakce (PCR) byla prováděna na přístroji Perkin-Elmer Cetus DNA Thermal Cycler (Perkin-Elmer, Kt.). Reakční směs obsahovala 100 pmolů oligonukleotidů, PCT primer č. 1 a č.2 (viz obrázek 5), 200 ng plasmidu pTZ18U-PHB linearizovaného restrikčním enzymem EcoRI, 125 μΜ dNTP, 50 mM KC1, 10 mM Tris-HCl (pH 8,3), 2,5 mM MgCl2, 0,01 % želatiny a 2,5 jednotek Taq polymerasy (Perkin-Elmer, Kt.). Program přístroje byl nastaven následovně: 3 minuty při 94 °C, 40 cyklů sekvence 1 min při 94 ’C - 3 min při 55 ‘c - 3 min při 72 ’c a konečně 7 min při 72 °C. PCR produkt se isoluje elektroforesou na agarosovém gelu a elucí DEAE celulosovou membránou.
Produkce transgenních rostlin
Ti plasmidové vektory používané pro přípravu transgenních rostlin se nejdříve elektroporací přenesou do Agrobacterium tu-: mefaciens kmene C58-pGV3850 (Zabrinsky P. a spol.: EMBO 2, 2143 až 2150 (1983) a Sambrook J., Fritsch E.F. a Maniatis T.: Molecular cloning, a laboratory manual, Cold Spring Harbor Labora31 tory Press (1989).]. Arabidopsis thaliana druh Rschew se pěstuje asepticky na vertikálních Petriho miskách, které obsahují minerální prvky, 0,8 % agaru (Difco) a 1 % sacharosy, jak to popsali Estelle M.A. a Sommerville C.: Mol. Gen. Genet. 206. 200 až 206 (1987) a Schiefelbein J.W. a Sommerville C.R.: Plant Cell 2, 235 až 243 (1980). Kořeny z rostlinek starých 10 až 12 dnů se uříznou a použijí se pro transformaci jak to popsali Valvekens D., Van Montagu, M. a Van Lijsebettens M.: Proč. Nati. Acad. Sci. USA 85, 5536 až 5540 (1988).
Semena z TO a TI transgenních rostlin se vysejí na media obsahující minerální prvky, 1 % sacharosy, 0,8 % agaru (Difco) a 50 Mg/ml kanamycinu. Po 10 až 14 dnech růstu transgenní rostliny resistentní na kanamycin (Kmr) měly zelené listy, zatímco netransformované na kanamycin citlivé (Kms) rostliny měly žluté listy. V tomto stupni se Kmr rostliny mohou odstranit z agarových desek a přenést do úrodné půdy.
Extrakce a štěpení genomové DNA restrikční endonukleasou
Divoké a transgenní rostliny byly nechány růst v půdě po dobu 2 až 3 týdnů. Bylo sebráno asi 5 g materiálu listů a tento materiál byl zmrazen v kapalném dusíku. Vysokomolekulární DNA se ze zmrazené tkáně listů extrahuje postupem, který popsali Rogers S.C. a Bendich A.J.: Plant Molecular Biology Manual A6, 1 až 10 (1988). Štěpení restrikční endonukleasou, enzymem HindlII, se provádí za podmínek doporučených výrobcem (New England Biolabs lne., Mass.).
Elektroforesa na agarosovém gelu a postup hybridizace
DNA analýza elektroforesou na agarosovém gelu a přenos na nylonové membrány (Hybond-N, Amersham, II.) se provádí známými postupy, které popsali Southern E.M.: J. Mol. Biol. 38, 503 až 517 (1975) a Sambrook J., Fritsch E.F. a Maniatis T. : Molecular cloning, a laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1988) . Specifické klonované DNA fragmenty, které se pou32 žijí jako sondy, se vyštěpí z vektoru příslušnými restrikčními endonukleasami, inserty se vyčistí od vektoru elektroforesou na agarosovém gelu a elektroelucí pomocí DEAE celulosových membrán. Sondy se označí 32P-deoxyribonukleotidy způsobem prodloužení náhodným primerem pomocí hexamerů podle postupu, který popsali Feinberg A.P. a Volgelstein B.: Anal. Biochem. 136. 6 až 13 (1983) . Nylonové filtry se hybridizují značenými sondami a exponují se na film, jak popsali Poirier Y. a Jolicoeur P.: J. virol. 63, 2088 až 2098 (1989).
Isolace RNA a elektroforesa
Celková RNA se isoluje ze vzorků zmrazených listů podle postupu, který popsali Puissant C. a Houdebine L.M.: BioTechniques 8, 148 až 149 (1990). Isolovaná RNA se rozdělí elektroforesou na agarosovém gelu obsahujícím formaldehyd a přenese se na nylonové membrány (Hybond-N, Amersham, II.) postupy, které Sambrook J., Fritsch E.F. a Maniatis T.: Molecular cloning, a laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989). Nylonové filtry se hybridizují značenými sondami jak je to popsáno v předcházející části.
Test 3-ketothiolasové aktivity
Jeden gram vzorků zmrazených listů se zhomogenizuje ve 2 ml ledem ochlazeného pufru, který obsahuje lOOmM Tris-HCl (pH 8,0) , 40mM MgCl2 a 5mM beta-merkaptoethanol. Homogenát se vyčeří odstřeďováním při 10000 x g dvě minuty a super na tant se přenese do čerstvé zkumavky. Obsah proteinu v extraktu se změří Bradfordovým testem s pomocí BioRad soupravy pro testování proteinů (BioRad Laboratories, Ka.). Na analýzu se používá mezi 3 až 30 μ% extraktů rostlinného proteinu. Proteinové extrakty byly připraveny také z bakterií. V tomto případě se stacionární kultury bakterií peletují odstřeďováním, promyjí se jednou ledem ochlazeným testovacím pufrem a resuspendují se ve 200 μΐ stejného pufru. Bakteriální suspenze se lyžuje sonikací (působením ultrazvuku), homogenát se vyčeří odstřeďováním a obsah proteinu v extraktu se stanoví Bradfordovým testem. Pro analýzu se používá mezi 0,2 až 1 μg bakteriálního proteinového extraktu. Aktivita 3-ketothiolasového enzymu v různých extraktech se testuje podle postupu, který popsali Senior P.J. a Dawes E.A.: Biochem. J. 134. 225 až 238 (1973).
Test acetoacetyl-CoA reduktasové aktivity
Jeden gram vzorků zmrazených listů se zhomogenizuje ve 2 ml ledem ochlazeného pufru, který obsahuje lOOmM dihydrogenfosforečnan draselný (pH 5,5), 0,02mM chlorid horečnatý a 4,0mM β-merkaptoethanol. Homogenát se vyčeří odstřeďováním při 10000 x g po dobu dvou minut a supernatant se přenese do čerstvé zkumavky. Obsah proteinu v extraktu se změří Bradfordovým testem s pomocí BioRad soupravy pro testování proteinů. Na analýzu se používá mezi 0,8 a 10 μg extraktů rostlinného proteinu. Bakteriální extrakty se připraví také v testovaném pufru v podstatě tak, jak je to popsáno v předcházející části. Aktivita acetoacetyl-CoA reduktasového enzymu se testuje způsobem, který popsali Senior P.J. a Dawes E.A.: Biochem. J. 134. 225 až 238 (1973) .
Analýza plynovou chromátografií a hmotovou spektroskopií
Pro přípravu rostlinných extraktů pro GC analýzu byly použity dva způsoby. Podle prvního způsobu se mezi 0,005 a 0,05 g čerstvého nebo zmrazeného rostlinného materiálu (listy nebo celé výhonky) extrahuje 1 až 2 μΐ roztoku chloroformu s vodou v poměru 1:1 při 65 °C 16 hodin za konstantního třepání. Rostlinný materiál se pak zhomogenizuje ve vodě a reextrahuje se roztokem chloroformu s vodou v poměru 1:1 při 65 °C 16 hodin za konstantního třepání. Chloroformová fáze se přenese do nové zkumavky a extrahuje se jednou stejným objemem vody. Konečný objem chloroformové fáze se upraví na 0,5 ml a použije se pro transesterifikaci ethanolem a kyselinou chlorovodíkovou jak níže popsáno. Podle způsobu č. 2 se mezi 0,005 a 0,15 g zmrazeného nebo čerstvého rostlinného materiálu postupně extrahuje
50% ethanolem při 55 °C dvě hodiny, 100% methanolem při 55 °C dvě hodiny a 100% diethyletherem 15 minut za teploty místnosti. Zbývající tkáň se zhomogenizuje ve vodě, vysuší a extrahuje se 0,5 ml chloroformu 4 hodiny při 100 °C.
Konečné chloroformové extrakty (0,5 ml) získané podle způsobu č. 1 a č. 2 se transesterifikují přidáním 0,2 ml koncentrované HC1 a 1,7 ml 100% ethanolu zahříváním na 100 °C po dobu dvou hodin. Reakční směs se pak ochladí na teplotu místnosti, chloroforomvá fáze se dvakrát extrahuje 2 ml 0,9% chloridu sodného (hmotnostní díly k objemovým dílům) a výsledná organická fáze se zmenší na 100 μΐ. Jako standardní vzorek se použije komerční PHB (Sigma Chemical Co., Mo.), který se rozpustí v teplém chloroformu a 1 mg se transesterif ku je jak shora uvedeno.
Chloroformová fáze, která obsahuje ethylestery, se přenese do GC baňky pro injektování 1 μΐ do plynového chromatografu Hewlett Packard 5890 series II, který je opatřen programovatelným zásobníkem se skleněnou kapilární kolonou SP-2330 (Supelco, Pa.). Jako nosný plyn se používá helium s přibližně lineární rychlostí 20 cm/s. Teplota v místě injekčního otvoru byla nastavena na 220 °C, teplota v místě plamenného ionizačního detektoru byla nastavena na 220 °C. Používá se následující teplotní profil: 4 minuty při 65 °C, potom se teplota zvyšuje rychlostí 20 °C za minutu až na 195 °C, 3,5 minuty zůstane na 195 °C a potom teplota opět klesá rychlostí 20 °C/minutu na 65 °C.
Identita maxim, o které se jedná, byla stanovena GC-hmotovou spektrometrií. El (electron impact) hmotová spektrální data byla získána na hmotovém spektrometru JEOL JMS-AX505H ve spojení s plynovým chromatografem Hewlett Packard 5890. Používají se následující parametry: zdroj teploty: 200 °C, ionizační proud: 100 μΑ, urychlující napětí: 3 keV. Kolona DB-225 (J & W Scientific Co.) byla vložena přímo do zdroje hmotového spektrometru. Jako nosič bylo použito helium. Injektor (bez dělení potřebného množství) byl udržován na 260 °C a přenosná linie na 260 °C. Používá se stejný teplotní profil GC pece (viz před35 cházející odstavec).
Transmisní elektronová mikroskopie
Rostlinné tkáně se fixují 3% glutaraldehydem v O,1M fosforečnanovém pufru (pH 7,2) 1,5 až 2 hodiny za teploty místnosti. Vzorky se promyjí čtyřikrát O,1M fosforečnanovým pufrem (pH 7,2) a fixují se 1% 0s04 ve fosforečnanovém pufru dvě hodiny za teploty místnosti. Tkáně se pak dehydratují ethanolem a upevní se v epoxidové pryskyřici Spurrs. Nařežou se části 80 až 90 nm, které se umístí na měděnou mřížku a vybarvují se 5% octanem uranylu 30 až 45 minut a následně Reynoldsovým citranem olovičitým 3 až 4 minuty. Tyto části se pak prohlížejí transmisním elektronovým mikroskopem JEOL 100CXII, který pracuje při 80 kv.
Jiné rostliny
I když jsou v tomto vynálezu jako specifické rostliny popsány Arabidopsis thaliana a geny z Alcaligenes eutrophus. tento vynález má obenou platnost. Nároky týkající se produkce polyhydroxybutyrátu a/nebo polyhydroxyalkanoátu v rostlinách nejsou omezeny na Arabidopsis thaliana nebo nesouvisejí specificky s používáním genů z Alcaligenes eutrophus. Nároky popsané níže popisují obecný způsob produkce polyhydroxyalkanoátu v rostlinách zavedením cizího DNA materiálu do buněk rostlin. Mezi takové rostliny patří shora diskutované rostliny a například mrkev, slunečnice, tabák, rajské jablko a brambory.
Semena těchto různých linií rostlin jsou uložena podle Budapešťské dohody (Budapešť treaty) v Americké sbírce typů kultur (American Type Culture Collection), 12301 Raklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, USA. Mezi tyto linie patří RedD-3A (ATCC 75044) obsahující gen acetoacetyl-CoA reduktasy, S8-1-2A (ATCC 75043) obsahující gen PHB synthasy a T4-2A (ATCC 75042) obsahující gen 3-ketothioalsy. Tyto geny jsou uvedeny v sekvenci id. č. 1.
Následující specifický popis je pouze ilustrací tohoto vynálezu. Je to myšleno tak, že tento vynález je omezen pouze připojenými nároky.
Příloha I (1) Obecné informace:
(i) Žadatelé: Chris Somerville, Yves Poirier, Douglas Dennis (ii) Název vynálezu: Transgenní rostlinný materiál produkující polyhydroxyalkanoáty (iii) Počet sekvencí: 1 (iv) Korespondenční adresa:
(A) adresát: lan C. McLeod (B) ulice: 2190 Commons Parkway (C) město: Okemos (D) stát: Michigan (E) oblast: Ingham (F) poštovní směrovací číslo: 48864 (v) Počítačová forma:
(A) typ media: disketa 5,25', 360 kb (B) počítač: IBM AT (C) operační systém: MS-DOS (verse 4) (D) software: Wordperfect 5.1 (viii) Informace o patentovém zástupci:
(A) jméno: lan Mc Load (B) registrační č.: 20 931 (C) číslo dokumentu (odkaz): MSU 4.1-131 (ix) Telekomunikační informace:
(A) telefon: (517) 347-4100 (B) telefax: (517) 347-4103 (2) Informace o sekvenci id. č. 1 (i) Vlastnosti sekvence:
(A) délka: 4980 párů nukleotidů (B) typ: nukleová kyselina s kódovanými peptidy (C) typ vlákna: dvojvláknová (D) topologie: lineární (ii) Typ molekuly:
(A) popis: genomová DNA (iii) Hypotetické č.
(iv) Proti smyslu vlákna: ne (vi) Původní zdroj:
(A) organismus: Alcaliqenes eutrophus (vii) Bezprostřední zdroj:
(A) knihovna: genomová (ix) popis sekvence: sekvence id. č. 1.:
CCCGGGCAAGTACCTTGCCGACATCTATGCGCTGGCGCGCACGCGCCTGGCGCGCGCCGG
CTGTACCGAGGTCTACGGCGGCG ACGCCTGCACCGTGGCCG ACGCCGGTCGCTTCTACTC
121 CTATCGGCGCGATGGCGTGACCGGCCGCATGGCCAGCCTGGTCTGGCTGGCGGACTG AGC
181 CCGCCGCTGCCTCACTCGTCCTTGCCCCTGGCCGCCTGCGCGCGCTCGGCTTCAGCCTTG
241 CGTCGGCGGCGGCCGGGCGTGCCCATGATGTAGAGCACCACGCCACCGGCGCCATGCCAT
301 ACATCAGGAAGGTGGCAACGCCTGCCACCACGTTGTGCTCGGTGATCGCCATCATCAGCG
61 CCACGTAGAGCCAGCCAATGGCCACGATGTACATCAAAAATTCATCCTTCTCGCCTATGC
21 TCTGGGGCCTCGGCAGATGCGAGCGCTGCATACCGTCCGGTAGGTCGGGAAGCGTGCAGT
81 GCCGAGGCGGATTCCCGCATTGACAGCGCGTGCGTTGCAAGGCAACAATGGACTCAAATG
541 TCTCGGAATCGCTGACGATTCCCAGGTTTCTCCGGCAAGCATAGCGCATGGCGTCTCCAT
601 GCGAGAATGTCGCGCTTGCCGGATAAAAGGGGAGCCGCTATCGGAATGGACGCAAGCCAC
661 GGCCGCAGCAGGTGCGGTCGAGGGCTTCCAGCCAGTTCCAGGGCAGATGTGCCGGCAGAC
721 CCTCCCGCTTTGGGGGAGGCGCAAGCCGGGTCCATTCGGATAGCATCTCCCCATGCAAAG,
781 TGCCGGCCAGGGCAATGCCCGGAGCCGGTTCGAATAGTGACGGCAGAGAGACAATCAAAT
841 CATGGCGACCGGCAAAGGCGCGGCAGCTTCCACGCAGGAAGGCAAGTCCCAACCATTCAA S1 MetAlaThrGlyLysGlyAlaAlaAlaSerThrGlnGluGlyLysSerGlnProPheLy
901 GGTCACGCCGGGGCCATTCGATCCAGCCACATGGCTGGAATGGTCCCGCCAGTGGCAGGG S21 sValThrProGlyProPheAspProAlaThrTrpLeuGluTrpSerArgGlnTrpGlnGl
961 CACTGAAGGCAACGGCCACGCGGCCGCGTCCGGCATTCCGGGCCTGGATGCGCTGGCAGG S41 yThrGluGlyAsnGlyHisAlaAlaAlaSerGlylleProGlyLeuAspAlaLeuAlaGl
1021 CGTCAAGATCGCGCCGGCGCAGCTGGGTGATATCCAGCAGCGCTACATGAAGGACTTCTC
S61 yValLysIleAlaProAlaGlnLeuGlyAspIleGlnGlnArgTyrMetLysAspPheSe
1081 AGCGCTGTGGCAGGCCATGGCCGAGGGCAAGGCCGAGGCCACCGGTCCGCTGCACGACCG S81 rAlaLeuTrpGlnAlaMetAlaGluGlyLysAlaGluAlaThrGlyProLeuHisAspAr
1141 GCGCTTCGCCGGCGACGCATGGCGCACCAACCTCCCATATCGCTTCGCTGCCGCGTTCTA S101 gArgPheAlaGlyAspAlaTrpArgThrAsnLeuProTyrArgPheAlaAlaAlaPheTy
1201 CCTGCTCAATGCGCGCGCCTTGACCGAGCTGGCCGATGCCGTCGAGGCCGATGCCAAGAC S121 rLeuLeuAsnAlaArgAlaLeuThrGluLeuAlaAspAlaValGluAlaAspAlaLysTh
61 CCGCCAGCGCATCCGCTTCGCGATCTCGCAATGGGTCGATGCGATGTCGCCCGCCAACTT S141 rArgGlnArglleArgPheAlalleSerGlnTrpValAspAlaMetSerProAlaAsnPh
21 CCTTGCCACCAATCCCGAGGCGCAGCGCCTGCTGATCGAGTCGGGCGGCGAATCGCTGCG S161 eLeuAlaThrAsnProGluAlaGlnArgLeuLeuIleGluSerGlyGlyGluSerLeuAr
81 TGCCGGCGTGCGCAACATGATGGAAGACCTGACACGCGGCAAGATCTCGCAGACCGACGA S181 gAlaGlyValArgAsnMetMetGluAspLeuThrArgGlyLysIleSerGlnThrAspGl
41 GAGCGCGTTTGAGGTCGGCCGCAATGTCGCGGTGACCG AAGGCGCCGTGGTCTTCGAG AA S201 uSerAlaPheGluValGlyArgAsnValAlaValThrGluGlyAlaValValPheGluAs
1501 CGAGTACTTCCAGCTGTTGCAGTACAAGCCGCTGACCGACAAGGTGCACGCGCGCCCGCT S221 nGluTyrPheGlnLeuLeuGlnTyrLysProLeuThrAspLysValHisAlaArgProLe
1561 GCTG ATGGTGCCGCCGTGCATCAACAAGTACTACATCCTGGACCTGCAGCCGGAGAGCTC S2 41 uLeuMetValProProCysIleAsnLysTyrTyrlleLeuAspLeuGlnProGluSerSe
1621 GCTGGTGCGCCATGTGGTGGAGCAGGGACATACGGTGTTTCTGGTGTCGTGGCGCAATCC S261 rLeuValArgHisValValGluGlnGlyHisThrValPheLeuValSerTrpArgAsnPr
1681 GGACGCCAGCATGGCCGGCAGCACCTGGGACGACTACATCGAGCACGCGGCCATCCGCGC S281 oAspAlaSerMetAlaGlySerThrTrpAspAspTyrlleGluHisAlaAlalleArgAl
174 1 CATCGAAGTCGCGCGCGACATCAGCGGCCAGGACAAGATCAACGTGCTCGGCTTCTGCGT S301 alleGluValAlaArgAspIleSerGlyGlnAspLysIleAsnValLeuGlyPheCysVa
1801 GGGCGGCACCATTGTCTCGACCGCGCTGGCGGTGCTCGCCCCGCGCGGCG AGCACCCGGC S321 lGlyGlyThrlleValSerThrAlaLeuAlaValLeuAlaAlaArgGlyGluHisProAl
1861 CGCC AGCGTCACGCTGCTGACCACGCTGCTGGACTTTGCCGACACGGGCATCCTCGACGT
S341 aAlaSerValThrLeuLeuThrThrLeuLeuAspPheAlaAspThrGlylleLeuAspVa
1921 CTTTGTCGACGAGGGCCATGTGCAGTTGCGCGAGGCCACGCTGGGCGGCGGCGCCGGCGC S361 lPheValAspGluGlyHisValGlnLeuArgGluAlaThrLeuGlyGlyGlyAlaGlyAl
1981 GCCGTGCGCGCTGCTGCGCGGCCTTGAGCTGGCCAATACCTTCTCGTTCTTGCGCCCGAA S381 aProCysAlaLeuLeuArgGlyLeuGluLeuAlaAsnThrPheSerPheLeuArgProAs
2041 CGACCTGGTGTGGAACTACGTGGTCGACAACTACCTGAAGGGCAACACGCCGGTGCCGTT S4 01 nAspLeuValTrpAsnTyrValValAspAsnTyrLeuLysGlyAsnThrProValProPh
2101 CG ACCTGCTGTTCTGGAACGGCGACGCCACCAACCTGCCGGGGCCGTGGTACTGCTGGTA S4 21 eAspLeuLeuPheTrpAsnGlyAspAlaThrAsnLeuProGlyProTrpTyrCysTrpTy
2161 CCTGCGCCACACCTACCTGCAGAACGAGCTCAAGGTACCGGGCAAGCTGACCGTGTGCGG S441 rLeuArgHisThrTyrLeuGlnAsnGluLeuLysValProGlyLysLeuThrValCysGl
2221 CGTGCCGGTGGACCTGGCCAGCATCGACGTGCCGACCTATATCTACGGCTCGCGCGAAG A S4 61 yValProValAspLeuAlaSerlleAspValProThrTyrlleTyrGlySerArgGluAs
2281 CCATATCGTGCCGTGGACCGCGGCCTATGCCTCGACCGCGCTGCTGGCG AACAAGCTGCG S481 pHisIleValProTrpThrAlaAlaTyrAlaSerThrAlaLeuLeuAlaAsnLysLeuAr
2341 CTTCGTGCTGGGTGCGTCGGGCCATATCGCCGGTGTGATCAACCCGCCGGCCAAGAACAA S501 gPheValLeuGlyAlaSerGlyHisIleAlaGlyValIleAsnProProAlaLysAsnLy
01 GCGCAGCCACTGGACTAACGATGCGCTGCCGGAGTCGCCGCAGCAATGGCTGGCCGGCGC S521 sArgSerHisTrpThrAsnAspAlaLeuProGluSerProGlnGlnTrpLeuAlaGlyAl
61 CATCGAGCATCACGGCAGCTGGTGGCCGGACTGGACCGCATGGCTGGCCGGGCAGGCCGG S541 alleGluHisHisGlySerTrpTrpProAspTrpThrAlaTrpLeuAlaGlyGlnAlaGl
2521 CGCGAAACGCGCCGCGCCCGCCAACTATGGCAATGCGCGCTATCGCGCAATCGAACCCGC S561 yAlaLysArgAlaAlaProAlaAsnTyrGlyAsnAlaArgTyrArgAlalleGluProAl
2581 GCCTGGGCGATACGTCAAAGCCAAGGCATGACGCTTGCATGAGTGCCGGCGŤGCGTCATG S581 aProGlyArgTyrValLysAlaLysAla*
2641 CACGGCGCCGGCAGGCCTGCAGGTTCCCTCCCGTTTCCATTGAAAGGACTACACAATGAC ti MetTh
2701 TGACGTTGTCATCGTATCCGCCGCCCGCACCGCGGTCGGCAAGTTTGGCGGCTCGCTGGC T3 rAspValVallleValSerAlaAlaArgThrAlaValGIyLysPheGlyGlySerLeuAl
2761 CAAGATCCCGGCACCGGAACTGGGTGCCGTGGTCATCAAGGCCGCGCTGGAGCGCGCCGG T23 aLysIleProAlaProGluLeuGlyAlaValValIleLysAlaAlaLeuGluArgAlaGl
2821 CGTCAAGCCGGAGCAGGTGAGCGAAGTCATCATGGGCCAGGTGCTGACCGCCGGTTCGGG T4 3 yValLysProGluGlnValSerGluValIleMetGlyGlnValLeuThrAlaGlySerGl
2881 CCAGAACCCCGCACGCCAGGCCGCGATCAAGGCCGGCCTCGGCGCGATGGTGCCGGCCAT T63 yGlnAsnProAlaArgGlnAlaAlalleLysAlaGlyLeuGlyAlaMetValProAlaMe
2941 GACCATCAACAAGGTGTGCGGCTCGGGCCTG AAGGCCGTGATGCTGGCCGCCAACGCGAT T83 tThrlleAsnLysValCysGlySerGlyLeuLysAlaValMetLeuAlaAlaAsnAlall
3001 CATGGCGGGCGACGCCGAGATCGTGGTGGCCGGCGGCCAGGAAAACATGAGCGCCGCCCC T103 eMetAlaGlyAspAlaGluIleValValAlaGlyGlyGlnGluAsnMetSerAlaAlaPr
061 GCACGTGCTGCCGGGCTCGCGCGATGGTTTCCGCATGGGCGATGCCAAGCTGGTCGACAC T123 oHisValLeuProGlySerArgAspGlyPheArgMetGlyAspAlaLysLeuValAspTh
3121 CATGATCGTCG ACGGCCTGTGGG ACGTGTACAACCAGTACCACATGGGCATCACCGCCG A T143 rMetlleValAspGlyLeuTrpAspValTyrAsnGlnTyrHisMetGlylleThrAlaGl
3181 GAACGTGGCCAAGGAATACGGCATCACACGCGAGGCGCAGGATGAGTTCGCCGTCGGCTC T163 uAsnValAlaLysGluTyrGlylleThrArgGluAlaGlnAspGluPheAlaValGlySe
3241 GCAGAACAAGGCCGAAGCCGCGCAGAAGGCCGGCAAGTTTGACGAAGAGATCGTCCCGGT T183 rGlnAsnLysAlaGluAlaAlaGlnLysAlaGlyLysPheAspGluGluIleValProVa
3301 GCTGATCCCGCAGCGCAAGGGCGACCCGGTGGCCTTCAAGACCGACGAGTTCGTGCGCCA T203 lLeuIleProGlnArgLysGlyAspProValAlaPheLysThrAspGluPheValArgGl
3361 GGGCGCCACGCTGGACAGCATGTCCGGCCTCAAGCCCGCCTTCGACAAGGCCGGCACGGT T223 nGlyAlaThrLeuAspSerMetSerGlyLeuLysProAlaPheAspLysAlaGlyThrVa
21 GACCGCGGCCAACGCCTCGGGCCTGAACGACGGCGCCGCCGCGGTGGTGGTGATGTCGGC T24 3 IThrAlaAlaAsnAlaSerGiyLeuAsnAspGlyAlaAlaAlaValValValMetSerAl
3481 GGCCAAGGCCAAGGAACTGGGCCTGACCCCGCTGGCCACGATCAAGAGCTATGCCAACGC T263 aAlaLysAlaLysGluLeuGlyLeuThrProLeuAlaThrlleLysSerTyrAlaAsnAl
541 CGGTGTCGATCCCAAGGTGATGGGCATGGGCCCGGTGCCGGCCTCCAAGCGCGCCCTGTC
T28 3 aGlyValAspProLysValMetGlyMetGlyProValProAlaSerLysArgAlaLeuSe
601 GCGCGCCGAGTGGACCCCGCAAGACCTGGACCTGATGGAGATCAACGAGGCCTTTGCCGC T303 rArgAlaGluTrpThrProGinAspLeuAspLeuMetGlulleAsnGluAlaPheAlaAl
661 GCAGGCGCTGGCGGTGCACCAGCAGATGGGCTGGGACACCTCCAAGGTCAATGTGAACGG T3 23 aGlnAlaLeuAlaValHisGlnGlnMetGlyTrpAspThrSerLysValAsnValAsnGl
3721 CGGCGCCATCGCCATCGGCCACCCGATCGGCGCGTCGGGCTGCCGTATCCTGGTGACGCT T34 3 yGlyAlalleAlalleGlyHisProIleGlyAlaSerGlyCysArglleLeuValThrLe
3781 GCTGCACGAGATGAAGCGCCGTGACGCGAAGAAGGGCCTGGCCTCGCTGTGCATCGGCGG T3 63 uLeuHisGluMetLysArgArgAspAlaLysLysGlyLeuAlaSerLeuCysIleGlyGl
3841 CGGCATGGGCGTGGCGCTGGCAGTCGAGCGCAAATAAGGAAGGGGTTTTCCGGGGCCGCG T383 yGlyMetGlyValAlaLeuAlaValGluArgLys*
3901 CGCGGTTGGCGCGGACCCGGCGACGATAACGAAGCCAATCAAGGAGTGGACATGACTCAG R1 MetThrGln
3961 CGCATTGCGTATGTGACCGGCGGCATGGGTGGTATCGGAACCGCCATTTGCCAGCGGCTG R4 ArglleAlaTyrValThrGlyGlyMetGlyGlylleGlyThrAlalleCysGlnArgLeu
021 GCCAAGGATGGCTTTCGTGTGGTGGCCGGTTGCGGCCCCAACTCGCCGCGCCGCGAAAAG R24 AlaLysAspGlyPheArgValValAlaGlyCysGlyProAsnSerProArgArgGluLys
081 TGGCTGGAGCAGCAGAAGGCCCTGGGCTTCGATTTCATTGCCTCGGAAGGCAATGTGGCT R4 4 TrpLeuGluGlnGlnLysAlaLeuGlyPheAspPhelleAlaSerGluGlyAsnValAla
4141 GACTGGGACTCGACCAAGACCGCATTCGACAAGGTCAAGTCCGAGGTCGGCGAGGTTGAT R64 AspTrpAspSerThrLysThrAlaPheAspLysValLysSerGluValGlyGluValAsp
201 GTGCTGATCAACAACGCCGGTATCACCCGCGACGTGGTGTTCCGCAAGATGACCCGCGCC R84 ValLeulleAsnAsnAlaGlylleThrArgAspValValPheArgLysMetThrArgAla
261 GACTGGGATGCGGTGATCGACACCAACCTGACCTCGCTGTTCAACGTCACCAAGCAGGTG R104 AspTrpAspAlaValIleAspThrAsnLeuThrSerLeuPheAsnValThrLysGlnVal
321 ATCGACGGCATGGCCG ACCGTGGCTGGGGCCGCATCGTCAACATCTCGTCGGTGAACGGG R12 4 IleAspGlyMetAlaAspArgGlyTrpGlyArglleValAsnlleSerSerValAsnGly
3 81 CAGAAGGGCCAGTTCGGCCAGACCAACTACTCCACCGCCAAGGCCGGCCTGCATGGCTTC R14 4 GlnLysGlyGlnPheGlyGlnThrAsnTyrSerThrAlaLysAlaGlyLeuHisGlyPhe
4 41 ACCATGGCACTGGCGCAGGAAGTGGCGACCAAGGGCGTGACCGTCAACACGGTCTCTCCG R164 ThrMetAlaLeuAlaGlnGluValAlaThrLysGlyValThrValAsnThrValSerPro
501 GGCTATATCGCCACCGACATGGTCAAGGCGATCCGCCAGGACGTGCTCGACAAGATCGTC R184 GlyTyrlleAlaThrAspMetValLysAlalleArgGlnAspValLeuAspLysIleVal
561 GCGACGATCCCGGTCAAGCGCCTGGGCCTGCCGGAAGAGATCGCCTCGATCTGCGCCTGG R204 AlaThrlleProValLysArgLeuGlyLeuProGluGlulleAlaSerlleCysAlaTrp
621 TTGTCGTCGGAGGAGTCCGGTTTCTCGACCGGCGCCGACTTCTCGCTCAACGGCGGCCTG R22 4 LeuSerSerGluGluSerGlyPheSerThrGlyAlaAspPheSerLeuAsnGlyGlyLeu
681 CATATGGGCTGACCTGCCGGCCTGGTTCAACCAGTCGGCAGCCGGCGCTGGCGCCCGCGT R244 HisMetGly*
4741 ATTGCGGTGCAGCCAGCGCGGCGČACAAGGCGGCGGGCGTTTCGTTTCGCCGCCCGTTTC
801 GCGGCAAGGCCCGCGAATCGTTTCTGCCCGCGCGGCNTTCCTCGCTrTTTGCGCCAATTC
861 ACCGGGTTTTCCTTTAAGCCCCGTCGCTTTTCTTAGTGCCTTGTTGGGCATAGAATCAGG
4921 GCAGCGGCGCAGCCAGCACCATGTTCGTGCAGCGCGGCCCTCGCGGGGGCGAGGCTGCAG
Claims (36)
1. Transgenní rostlinný materiál, vyznačuj ící se tím , že obsahuje cizí DNA kódující bakteriální polypeptid, který je vybrán ze skupiny sestávající z 3-ketothiolasy, acetoacetyl-CoA reduktasy, PHB synthasy a jejich směsí, která v rostlině vede k produkci polyhydroxyalkanoátu ve formě granule.
2. Transgenní rostlinný materiál podle nároku 1, vyznačující se tím , že polyhydroxyalkanoát z namená polyhydroxybutyrát.
3. Transgenní rostlinný materiál podle nároku 2, vyznačující se tím , že sekvence kódující DNA a RNA pro produkci enzymu vedoucího k syntéze polyhydroxybutyrátu jsou uvedeny v sekvenci id. č. 1.
4. Transgenní rostlinný materiál, vyznačuj ící se tím , že obsahuje cizí DNA z bakterie, která má DNA sekvenci homologní s DNA z Alcaliqenas eutroohus a kódující peptid, který má 3-ketothiolasovou aktivitu.
5. Transgenní rostlinný materiál podle nároku 4, vyznačující se tím , že DNA znamená otevřenou čtecí oblast mezi 2696 a 3877 sekvence id. č. 1.
6. Transgenní rostlinný materiál, vyznačuj ící se tím , že obsahuje cizí DNA z bakterie, která má DNA sekvenci homologní s DNA z Alcaliqenes eutroohus a kódující acetoacetyl-CoA reduktasovou aktivitu.
7. Transgenní rostlinný materiál podle nároku 6, vyznačující se tím , že DNA znamená otevřenou čtecí oblast mezi 3952 a 4692 sekvence id. č. 1.
8. Transgenní rostlinný materiál, vyznačuj ící se tím , že obsahuje cizí DNA z bakterie, která má DNA sekvenci homologní s DNA z Alcaligenes eutrophus a kódující popypeptid, který má PHA synthasovou aktivitu.
9. Transgenní rostlinný materiál, vyznačuj ící se tím , že obsahuje cizí DNA z bakterie, která má DNA sekvenci homologní s DNA z Alcaligenes eutrophus a kódující jeden nebo více enzymů vedoucích v rostlině k syntéze polyhydroxyalkanoátu z hydroxyacyl-CoA ve formě granule.
10. Transgenní rostlinný materiál podle nároku 9, vyznačující se tím , že DNA znamená otevřenou čtecí oblast mezi 842 a 2611 sekvence id. č. 1.
11. Transgenní rostlinný materiál, vyznačuj ící se tím , že obsahuje cizí DNA z bakterie, která má DNA sekvenci homologní s DNA z Alcaligenes eutrophus a kódující jeden nebo více enzymů, které katalýzují syntézu hydroxyacyl-CoA.
12. Transgenní rostlinný materiál, vyznačuj ící se tím , že obsahuje cizí DNA z bakterie, která má DNA sekvenci homologní s DNA z Alcaligenes eutrophus a kódující jeden nebo více enzymů vedoucích k produkci acetoacetyl-CoA z produktů kódovaných cizí DNA.
13. Transgenní rostlinný materiál podle nároku 1, vyznačující se tím , že existuje jako semeno nebo jako klíční rostlina.
14. Transgenní rostlinný materiál podle nároku 2, vyznačující se tím , že existuje jako semeno nebo jako klíční rostlina.
15. Transgenní rostlinný materiál podle nároku 3, vyznačující se tím , že existuje jako semeno nebo jako klíční rostlina.
16. Transgenní rostlinný materiál podle nároku 4, vyznačující se tím , že existuje jako semeno nebo jako klíční rostlina.
17. Transgenní rostlinný materiál podle nároku 5, vyznačující se tím , že existuje jako semeno nebo jako klíční rostlina.
18. Transgenní rostlinný materiál podle nároku 6, vyznačující se tím , že existuje jako semeno nebo jako klíční rostlina.
19. Transgenní rostlinný materiál podle nároku 7, vyznačující se tím , že existuje jako semeno nebo jako klíční rostlina.
20. Transgenní rostlinný materiál podle nároku 8, vyznačující se tím , že existuje jako semeno nebo jako klíční rostlina.
21. Transgenní rostlinný materiál podle nároku 10, vyznačující se tím , že existuje jako semeno nebo jako klíční rostlina.
22. Transgenní rostlinný materiál podle nároku 11, vyznačující se tím , že existuje jako semeno nebo jako klíční rostlina.
23. Transgenní rostlinný materiál podle nároku 12, vyznačující se tím , že existuje jako semeno nebo jako klíční rostlina.
24. Způsob zavedení cizí DNA kódující polypeptidy vedoucí k syntéze polyhydroxyalkanoátu do rostliny, vyznačující se tím , že zahrnuje pohlavní spojení sexuálním oplodněním dvou rostlin, které neprodukují PHB, při čemž každá obsahuje cizí DNA z bakterie kódující jeden nebo více různých enzymů na cestě vedoucí k polymeraci hydroxyacyl-CoA polyhydroxyalkanoátovou synthasou za vzniku rostliny, která syntetizuje polyhydroxyalkanoát jako granule.
25. Způsob podle nároku 24, vyznačující se tím , že polyhydroxyalkanoát znamená polyhydroxybutyrát.
26. Způsob podle nároku 24, vyznačující se tím , že polyhydroxyalkanoát je v granulích v buňkách rostliny.
27. Segment genu tak, jak je obsažen v semenu uloženém pod
ATCC 75042, vyznačující se tím , že obsahuje DNA, která kóduje 3-ketothiolasový gen.
28. Rostlina, vyznačující se tím , že obsahuje segment genu podle nároku 27.
29. Rostlina podle nároku 28, kterou je Arabidopsis thaliana.
30. Segment genu tak, jak je obsažen v semenu uloženém pod ATCC 75044, vyznačující se tím , že obsahuje DNA z Alcaligenes eutrophus. která kóduje gen acetoacetyl-CoA reduktasy.
31. Rostlina, vyznačující se tím , že obsahuje segment genu podle nároku 30.
32. Rostlina podle nároku 31, kterou je Arabidopsis thaliana.
33. Segment genu tak, jak je obsažen v semenu uloženém pod ATCC 75043, vyznačující se tím , že obsahuje DNA z Alcaligenes eutrophus. která kóduje gen PHB synthasy.
34. Rostlina, vyznačující se tím , že obsahuje segment genu podle nároku 33.
35. Rostlina podle nároku 34, kterou je Arabidopsis thaliana.
36. Transgenní rostlinný materiál, vyznačuj ící se tím , že obsahuje cizí DNA z bakterie, která má DNA sekvenci homologní s DNA z Alcaligenes eutrophus a kódující jeden nebo více enzymů vedoucích k produkci 3-hydroxybutyryl-CoA z produktů kódovaných cizí DNA.
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US73224391A | 1991-07-19 | 1991-07-19 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CZ10894A3 true CZ10894A3 (en) | 1994-12-15 |
Family
ID=24942760
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CS94108A CZ10894A3 (en) | 1991-07-19 | 1992-07-13 | Transgenic plants producing polyhydroxyalkanoates |
Country Status (22)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5650555A (cs) |
| EP (1) | EP0595896B1 (cs) |
| JP (1) | JP3696233B2 (cs) |
| AT (1) | ATE295891T1 (cs) |
| AU (1) | AU671953B2 (cs) |
| BE (1) | BE1006851A5 (cs) |
| BR (1) | BR9206297A (cs) |
| CA (1) | CA2113412C (cs) |
| CZ (1) | CZ10894A3 (cs) |
| DE (1) | DE69233512T2 (cs) |
| ES (1) | ES2046142B1 (cs) |
| FI (1) | FI120353B (cs) |
| FR (1) | FR2679735A1 (cs) |
| HU (1) | HUT66825A (cs) |
| IT (1) | IT1255348B (cs) |
| MX (1) | MX9204245A (cs) |
| NL (1) | NL195045C (cs) |
| NZ (1) | NZ243626A (cs) |
| PL (1) | PL170467B1 (cs) |
| PT (1) | PT100705B (cs) |
| SK (1) | SK6494A3 (cs) |
| WO (1) | WO1993002187A1 (cs) |
Families Citing this family (60)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5245023A (en) | 1987-06-29 | 1993-09-14 | Massachusetts Institute Of Technology | Method for producing novel polyester biopolymers |
| GB9108756D0 (en) * | 1991-04-24 | 1991-06-12 | Ici Plc | Production of polyalkanoate in plants |
| CA2113412C (en) * | 1991-07-19 | 2000-01-25 | Christopher R. Somerville | Transgenic plants producing polyhydroxyalkanoates |
| US5610041A (en) * | 1991-07-19 | 1997-03-11 | Board Of Trustees Operating Michigan State University | Processes for producing polyhydroxybutyrate and related polyhydroxyalkanoates in the plastids of higher plants |
| AU5676394A (en) * | 1992-11-20 | 1994-06-22 | Agracetus, Inc. | Transgenic cotton plants producing heterologous bioplastic |
| US5942597A (en) * | 1995-08-21 | 1999-08-24 | The Procter & Gamble Company | Solvent extraction of polyhydroxyalkanoates from biomass |
| US6083729A (en) * | 1995-10-26 | 2000-07-04 | Metabolix, Inc. | Methods for isolating polyhydroxyalkanoates from plants |
| US5849894A (en) * | 1995-11-29 | 1998-12-15 | Monsanto Company | Rhodospirillum rubrum poly-β-hydroxyalkanoate synthase |
| EP0870053A4 (en) | 1995-12-19 | 2002-09-11 | Univ Minnesota | METABOLIC PROCESS FOR THE MANUFACTURE OF POLYHYDROXYALCANOATE MONOMER SYNTHASES |
| US5821299A (en) * | 1996-02-16 | 1998-10-13 | The Proctor & Gamble Company | Solvent extraction of polyhydroxy-alkanoates from biomass facilitated by the use of marginal nonsolvent |
| JP3062459B2 (ja) * | 1996-08-14 | 2000-07-10 | 理化学研究所 | ポリエステル重合酵素遺伝子及びポリエステルの製造方法 |
| US6143561A (en) * | 1997-06-30 | 2000-11-07 | The Curators Of The University Of Missouri | DNA encoding plastid pyruvate dehydrogenase and branched chain oxoacid dehydrogenase components |
| ATE323152T1 (de) | 1997-09-19 | 2006-04-15 | Metabolix Inc | Biologische systeme zur herstellung von polyhydroxyalkanoate polymeren die 4-hydroxysäure enthalten |
| EP1044278A1 (en) * | 1998-01-05 | 2000-10-18 | Monsanto Company | Biosynthesis of medium chain length polyhydroxyalkanoates |
| CA2317314C (en) | 1998-01-07 | 2003-12-30 | Metabolix, Inc. | Animal nutrition compositions |
| US6586658B1 (en) | 1998-03-06 | 2003-07-01 | Metabolix, Inc. | Modification of fatty acid metabolism in plants |
| US6103956A (en) * | 1998-03-31 | 2000-08-15 | Regents Of The University Of Minnesota | Polyhydroxyalkanoate synthesis in plants |
| US6143952A (en) * | 1998-03-31 | 2000-11-07 | Regents Of The University Of Minnesota | Modified pseudomonas oleovorans phaC1 nucleic acids encoding bispecific polyhydroxyalkanoate polymerase |
| DE69942060D1 (de) | 1998-04-08 | 2010-04-08 | Metabolix Inc | Verfahren für die trennung und reinigung von biopolymeren |
| JP2000189170A (ja) * | 1998-05-08 | 2000-07-11 | Daicel Chem Ind Ltd | 光学活性４―ハロ―３―ヒドロキシ酪酸エステルの製造方法 |
| EP1100928B1 (en) * | 1998-07-30 | 2006-02-01 | Metabolix, Inc. | Bifunctional enzymes for biopolymer production |
| DE19834608A1 (de) | 1998-07-31 | 2000-02-03 | Basf Ag | Kristallmodifikation der Liponsäure |
| DE69938105T2 (de) | 1998-08-04 | 2009-01-29 | Metabolix, Inc., Cambridge | Herstellung von polyhydroxyalkanoaten aus polyolen |
| US6160199A (en) * | 1998-12-21 | 2000-12-12 | The Procter & Gamble Company | Absorbent articles comprising biodegradable PHA copolymers |
| US6174990B1 (en) | 1998-12-21 | 2001-01-16 | The Procter & Gamble Company | Films comprising biodegradable PHA copolymers |
| US6077931A (en) * | 1998-12-21 | 2000-06-20 | The Procter & Gamble Company | Biodegradable PHA copolymers |
| WO2000052183A1 (en) * | 1999-03-05 | 2000-09-08 | Monsanto Technology Llc | Multigene expression vectors for the biosynthesis of products via multienzyme biological pathways |
| US6492134B1 (en) | 1999-03-15 | 2002-12-10 | UNIVERSITé LAVAL | Method for producing polyhydroxyalkanoates in recombinant organisms |
| US6451564B1 (en) * | 1999-07-02 | 2002-09-17 | Massachusetts Institute Of Technology | Methods for producing L-isoleucine |
| US6475734B1 (en) * | 1999-09-29 | 2002-11-05 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Polyhydroxyalkanoate synthase genes |
| US20020169297A1 (en) | 2000-10-20 | 2002-11-14 | Susheng Gan | Genetic insulator for preventing influence by another gene promoter |
| US6806401B2 (en) * | 2000-12-27 | 2004-10-19 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | OAR polynucleotides, polypeptides and their use in PHA production in plants |
| US6822142B2 (en) | 2001-01-05 | 2004-11-23 | Monsanto Company | Transgenic plants containing altered levels of steroid compounds |
| AU2002251830A1 (en) * | 2001-01-26 | 2002-08-06 | Colorado State University Research Foundation | Analysis of gene expression and biological function using optical imaging |
| DE10254165A1 (de) | 2002-11-20 | 2004-06-03 | Icon Genetics Ag | Verfahren zur Kontrolle eines zellulären Prozesses in einem multizellulären Organismus |
| US7581543B2 (en) | 2004-04-14 | 2009-09-01 | Philip Morris Usa Inc. | Reduction of phenolic compound precursors in tobacco |
| TW200613560A (en) * | 2004-06-29 | 2006-05-01 | Procter & Gamble | Solvent extraction of polyhydroxyalkanoates from biomass |
| US20060057691A1 (en) * | 2004-09-15 | 2006-03-16 | Karunakaran Narasimhan | Process for the extraction of polyhydroxyalkanoates from biomass |
| JP2009509530A (ja) * | 2005-09-27 | 2009-03-12 | ヘルムート アダム レフム，ベルン | ポリマー粒子およびその使用 |
| AU2008229076B2 (en) | 2007-03-16 | 2014-05-15 | Genomatica, Inc. | Compositions and methods for the biosynthesis of 1,4-butanediol and its precursors |
| US7947483B2 (en) | 2007-08-10 | 2011-05-24 | Genomatica, Inc. | Methods and organisms for the growth-coupled production of 1,4-butanediol |
| WO2009145840A2 (en) * | 2008-04-04 | 2009-12-03 | Massachusetts Institute Of Technology | Cellular production of hydroxyvalerates from levulinate |
| EP3514242A3 (en) * | 2008-09-10 | 2019-08-28 | Genomatica, Inc. | Microrganisms for the production of 1,4-butanediol |
| MY149457A (en) * | 2008-12-29 | 2013-08-30 | Eyal Res | Integrated methods for processing palm fruit bunches |
| CN102459138A (zh) * | 2009-06-04 | 2012-05-16 | 基因组股份公司 | 分离发酵液成分的方法 |
| VN29801A1 (cs) | 2009-06-04 | 2012-05-25 | ||
| CN102762735B (zh) * | 2009-10-13 | 2016-08-03 | 基因组股份公司 | 生产1,4-丁二醇、4-羟基丁醛、4-羟基丁酰-coa、腐胺和相关化合物的微生物及其相关方法 |
| WO2011066076A1 (en) | 2009-11-25 | 2011-06-03 | Genomatica, Inc. | Microorganisms and methods for the coproduction of 1,4-butanediol and gamma-butyrolactone |
| WO2011100601A1 (en) | 2010-02-11 | 2011-08-18 | Metabolix, Inc. | Process for gamma-butyrolactone production |
| US8048661B2 (en) | 2010-02-23 | 2011-11-01 | Genomatica, Inc. | Microbial organisms comprising exogenous nucleic acids encoding reductive TCA pathway enzymes |
| US8637286B2 (en) | 2010-02-23 | 2014-01-28 | Genomatica, Inc. | Methods for increasing product yields |
| EP2625179A2 (en) * | 2010-10-08 | 2013-08-14 | Cadila Healthcare Limited | Process for preparing an intermediate of sitagliptin via enzymatic conversion |
| CN104685058B (zh) | 2012-06-04 | 2020-07-07 | 基因组股份公司 | 制造4-羟基丁酸酯、1，4-丁二醇和相关化合物的微生物和方法 |
| CN110023372A (zh) | 2016-10-18 | 2019-07-16 | 梅雷迪安生物塑料有限公司 | 用于聚羟基脂肪酸酯的晶体成核剂 |
| US11584110B2 (en) | 2020-07-30 | 2023-02-21 | Pepsico, Inc. | Multi-layered packaging films |
| AU2021347979A1 (en) | 2020-09-24 | 2023-06-08 | Danimer Ipco, Llc | Biodegradable containers and resin therefor |
| KR20230093264A (ko) | 2020-09-24 | 2023-06-27 | 메레디언, 인크. | 생분해성 라벨 및 이를 위한 수지 |
| US20220089863A1 (en) | 2020-09-24 | 2022-03-24 | Meredian Bioplastics, Inc. | Pre-forms for making biodegradable containers and resin therefor |
| US20220089862A1 (en) | 2020-09-24 | 2022-03-24 | Meredian Bioplastics, Inc. | Biodegradable container closure and resin therefor |
| CA3230745A1 (en) | 2021-09-22 | 2023-03-30 | Laurent HENRIQUEL | Method for manufacturing a pha container |
Family Cites Families (10)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5245023A (en) * | 1987-06-29 | 1993-09-14 | Massachusetts Institute Of Technology | Method for producing novel polyester biopolymers |
| US5229279A (en) * | 1987-06-29 | 1993-07-20 | Massachusetts Institute Of Technology | Method for producing novel polyester biopolymers |
| US5250430A (en) * | 1987-06-29 | 1993-10-05 | Massachusetts Institute Of Technology | Polyhydroxyalkanoate polymerase |
| AT397771B (de) * | 1988-07-25 | 1994-06-27 | Tyrolia Freizeitgeraete | Vorrichtung zur montage von skibindungen |
| ES2125222T3 (es) * | 1989-07-10 | 1999-03-01 | Massachusetts Inst Technology | Procedimiento de produccion de biopolimeros a base de poliesteres. |
| GB9108756D0 (en) * | 1991-04-24 | 1991-06-12 | Ici Plc | Production of polyalkanoate in plants |
| GB9115245D0 (en) * | 1991-07-16 | 1991-08-28 | Ici Plc | Production of polyalkanoate |
| CA2113412C (en) * | 1991-07-19 | 2000-01-25 | Christopher R. Somerville | Transgenic plants producing polyhydroxyalkanoates |
| GB9223332D0 (en) * | 1992-11-06 | 1992-12-23 | Ici Plc | Production of polyhydroxyalkanoate in plants |
| GB9306490D0 (en) * | 1993-03-29 | 1993-05-19 | Zeneca Ltd | Plant gene specifying acetyl,coenzyme a carboxylase and transformed plants containing same |
-
1992
- 1992-07-13 CA CA002113412A patent/CA2113412C/en not_active Expired - Lifetime
- 1992-07-13 HU HU9400145A patent/HUT66825A/hu unknown
- 1992-07-13 EP EP92915635A patent/EP0595896B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1992-07-13 BR BR9206297A patent/BR9206297A/pt not_active IP Right Cessation
- 1992-07-13 CZ CS94108A patent/CZ10894A3/cs unknown
- 1992-07-13 SK SK64-94A patent/SK6494A3/sk unknown
- 1992-07-13 AU AU23238/92A patent/AU671953B2/en not_active Expired
- 1992-07-13 DE DE69233512T patent/DE69233512T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1992-07-13 JP JP50286693A patent/JP3696233B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 1992-07-13 AT AT92915635T patent/ATE295891T1/de active
- 1992-07-13 WO PCT/US1992/005786 patent/WO1993002187A1/en active IP Right Grant
- 1992-07-17 ES ES09201500A patent/ES2046142B1/es not_active Expired - Fee Related
- 1992-07-17 IT ITMI921750A patent/IT1255348B/it active IP Right Grant
- 1992-07-17 NL NL9201288A patent/NL195045C/nl not_active IP Right Cessation
- 1992-07-17 PT PT100705A patent/PT100705B/pt not_active IP Right Cessation
- 1992-07-20 NZ NZ243626A patent/NZ243626A/en unknown
- 1992-07-20 PL PL92295350A patent/PL170467B1/pl unknown
- 1992-07-20 BE BE9200673A patent/BE1006851A5/fr not_active IP Right Cessation
- 1992-07-20 MX MX9204245A patent/MX9204245A/es unknown
- 1992-07-20 FR FR9208949A patent/FR2679735A1/fr active Granted
-
1994
- 1994-01-18 FI FI940242A patent/FI120353B/fi not_active IP Right Cessation
-
1995
- 1995-06-07 US US08/472,358 patent/US5650555A/en not_active Expired - Lifetime
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CZ10894A3 (en) | Transgenic plants producing polyhydroxyalkanoates | |
| Kriegshauser et al. | Function of the HYDROXYCINNAMOYL-CoA: SHIKIMATE HYDROXYCINNAMOYL TRANSFERASE is evolutionarily conserved in embryophytes | |
| US5602321A (en) | Transgenic cotton plants producing heterologous polyhydroxy(e) butyrate bioplastic | |
| Malik et al. | Production of high levels of poly‐3‐hydroxybutyrate in plastids of C amelina sativa seeds | |
| Poirier et al. | Perspectives on the production of polyhydroxyalkanoates in plants | |
| WO1994012014A9 (en) | Transgenic cotton plants producing heterologous bioplastic | |
| US20140148622A1 (en) | Engineering Plants to Produce Farnesene and Other Terpenoids | |
| EP0719342A1 (en) | Processes for producing polyhydroxybutyrate and related polyhydroxyalkanoates in the plastids of higher plants | |
| US20100011462A1 (en) | Flavin monooxygenases and transcription factors involved in glucosinolate biosynthesis | |
| US20080213871A1 (en) | Altering regulation of maize lignin biosynthesis enzymes via RNAi technology | |
| US20020066123A1 (en) | Fatty acid elongases | |
| EP0973905B1 (en) | Plant pyruvate dehydrogenase kinase gene | |
| EP1076095B1 (en) | Methods for transformation of plants, transformed plants and processes for preparation of polyesters | |
| US5859342A (en) | Antisense nucleotide sequences affecting fatty acid catabolism in plants | |
| MXPA00008674A (es) | Modificacion de metabolismo de acidos grasos en plantas. | |
| Rose et al. | Function of the HYDROXYCINNAMOYL-CoA: SHIKIMATE HYDROXYCINNAMOYL TRANSFERASE is evolutionarily conserved in embryophytes | |
| US10351868B2 (en) | Engineering cyclopropane fatty acid accumulation in plants | |
| WO2023196865A2 (en) | Methods and compositions for producing plants having high vegetative fatty acids | |
| Rathnayaka et al. | Down-Regulation of CELLULOSE SYNTHASE Expression in Arabidopsis Seeds as a Possible Means of Increasing Seed Oil and Protein Content, and Reducing Fibre Content | |
| Kriegshauser et al. | HYDROXYCINNAMOYL-CoA: SHIKIMATE HYDROXYCINNAMOYL TRANSFERASE is evolutionarily conserved in embryophytes |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PD00 | Pending as of 2000-06-30 in czech republic |