PL170467B1 - Sposób wytwarzania polihydroksyalkanonianów PL - Google Patents
Sposób wytwarzania polihydroksyalkanonianów PLInfo
- Publication number
- PL170467B1 PL170467B1 PL92295350A PL29535092A PL170467B1 PL 170467 B1 PL170467 B1 PL 170467B1 PL 92295350 A PL92295350 A PL 92295350A PL 29535092 A PL29535092 A PL 29535092A PL 170467 B1 PL170467 B1 PL 170467B1
- Authority
- PL
- Poland
- Prior art keywords
- phb
- plants
- polyhydroxyalkanoate
- dna
- synthase
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 35
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 title description 181
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 title 2
- 229920000331 Polyhydroxybutyrate Polymers 0.000 claims abstract description 99
- 239000005015 poly(hydroxybutyrate) Substances 0.000 claims abstract description 99
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 claims abstract description 85
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims abstract description 47
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims abstract description 40
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims abstract description 40
- 108091000039 acetoacetyl-CoA reductase Proteins 0.000 claims abstract description 37
- 229920000903 polyhydroxyalkanoate Polymers 0.000 claims abstract description 37
- 239000005014 poly(hydroxyalkanoate) Substances 0.000 claims abstract description 36
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims abstract description 34
- 108010010718 poly(3-hydroxyalkanoic acid) synthase Proteins 0.000 claims abstract description 18
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims abstract description 17
- 239000000463 material Substances 0.000 claims abstract description 17
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims abstract description 16
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 claims abstract description 9
- 230000037361 pathway Effects 0.000 claims abstract description 7
- 230000001568 sexual effect Effects 0.000 claims abstract description 5
- 238000000605 extraction Methods 0.000 claims abstract description 4
- 238000006116 polymerization reaction Methods 0.000 claims abstract description 4
- 230000004720 fertilization Effects 0.000 claims abstract description 3
- 239000008187 granular material Substances 0.000 claims description 46
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 34
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 4
- 230000001850 reproductive effect Effects 0.000 claims description 3
- 230000003533 narcotic effect Effects 0.000 claims 1
- 230000014639 sexual reproduction Effects 0.000 abstract 1
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 68
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 60
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 37
- 108010078304 poly-beta-hydroxybutyrate polymerase Proteins 0.000 description 37
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 24
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 24
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 22
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 21
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 20
- 238000004627 transmission electron microscopy Methods 0.000 description 18
- 241000252867 Cupriavidus metallidurans Species 0.000 description 16
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 16
- 239000000047 product Substances 0.000 description 16
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 16
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 14
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 14
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 14
- 238000004817 gas chromatography Methods 0.000 description 14
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 14
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 14
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 14
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 14
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 14
- LXVSANCQXSSLPA-UHFFFAOYSA-M 2-ethyl-2-hydroxybutanoate Chemical group CCC(O)(CC)C([O-])=O LXVSANCQXSSLPA-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 13
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 12
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 12
- 210000004940 nucleus Anatomy 0.000 description 12
- 101150048611 phaC gene Proteins 0.000 description 12
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 12
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 12
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 12
- 239000004677 Nylon Substances 0.000 description 11
- 108090000854 Oxidoreductases Proteins 0.000 description 11
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 11
- 238000002290 gas chromatography-mass spectrometry Methods 0.000 description 11
- 238000001000 micrograph Methods 0.000 description 11
- 229920001778 nylon Polymers 0.000 description 11
- 239000013615 primer Substances 0.000 description 11
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 10
- GUBGYTABKSRVRQ-WFVLMXAXSA-N DEAE-cellulose Chemical compound OC1C(O)C(O)C(CO)O[C@H]1O[C@@H]1C(CO)OC(O)C(O)C1O GUBGYTABKSRVRQ-WFVLMXAXSA-N 0.000 description 9
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N Formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 102000004316 Oxidoreductases Human genes 0.000 description 9
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 9
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 9
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 9
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 9
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 101100243777 Dictyostelium discoideum phbB gene Proteins 0.000 description 8
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 8
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- OJFDKHTZOUZBOS-CITAKDKDSA-N acetoacetyl-CoA Chemical compound O[C@@H]1[C@H](OP(O)(O)=O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OCC(C)(C)[C@@H](O)C(=O)NCCC(=O)NCCSC(=O)CC(=O)C)O[C@H]1N1C2=NC=NC(N)=C2N=C1 OJFDKHTZOUZBOS-CITAKDKDSA-N 0.000 description 8
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 8
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 8
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 8
- 101150110984 phaB gene Proteins 0.000 description 8
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 8
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 8
- 241000894007 species Species 0.000 description 8
- 241000589155 Agrobacterium tumefaciens Species 0.000 description 7
- 101100243766 Dictyostelium discoideum phbA gene Proteins 0.000 description 7
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 7
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 7
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 7
- 101150046540 phaA gene Proteins 0.000 description 7
- 239000002689 soil Substances 0.000 description 7
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N Diethyl ether Chemical compound CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L Magnesium chloride Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 6
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 108060008225 Thiolase Proteins 0.000 description 6
- ZSLZBFCDCINBPY-ZSJPKINUSA-N acetyl-CoA Chemical compound O[C@@H]1[C@H](OP(O)(O)=O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OCC(C)(C)[C@@H](O)C(=O)NCCC(=O)NCCSC(=O)C)O[C@H]1N1C2=NC=NC(N)=C2N=C1 ZSLZBFCDCINBPY-ZSJPKINUSA-N 0.000 description 6
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 6
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 6
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 6
- 210000003934 vacuole Anatomy 0.000 description 6
- 102000004672 Acetyl-CoA C-acyltransferase Human genes 0.000 description 5
- 108010003902 Acetyl-CoA C-acyltransferase Proteins 0.000 description 5
- 108700003860 Bacterial Genes Proteins 0.000 description 5
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 5
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 5
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 5
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 5
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 5
- 102000002932 Thiolase Human genes 0.000 description 5
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 5
- 239000002026 chloroform extract Substances 0.000 description 5
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 5
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 5
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 5
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 5
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 5
- 210000000473 mesophyll cell Anatomy 0.000 description 5
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 5
- 210000003463 organelle Anatomy 0.000 description 5
- 239000000419 plant extract Substances 0.000 description 5
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 5
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 5
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 5
- -1 (+) - 3-hydroxybutyryl Chemical group 0.000 description 4
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 4
- 241000219195 Arabidopsis thaliana Species 0.000 description 4
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 4
- 108700019146 Transgenes Proteins 0.000 description 4
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 4
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 4
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 4
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 4
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 4
- 210000002257 embryonic structure Anatomy 0.000 description 4
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 4
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 4
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 4
- 229920000728 polyester Polymers 0.000 description 4
- 230000022532 regulation of transcription, DNA-dependent Effects 0.000 description 4
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 4
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 4
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 4
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 4
- BFSVOASYOCHEOV-UHFFFAOYSA-N 2-diethylaminoethanol Chemical compound CCN(CC)CCO BFSVOASYOCHEOV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000009010 Bradford assay Methods 0.000 description 3
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 3
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000620209 Escherichia coli DH5[alpha] Species 0.000 description 3
- XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N Ethyl acetate Chemical compound CCOC(C)=O XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 244000020551 Helianthus annuus Species 0.000 description 3
- 235000003222 Helianthus annuus Nutrition 0.000 description 3
- 229940100228 acetyl coenzyme a Drugs 0.000 description 3
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 3
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 3
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 3
- 125000004432 carbon atom Chemical group C* 0.000 description 3
- 210000002421 cell wall Anatomy 0.000 description 3
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 3
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 3
- 230000010154 cross-pollination Effects 0.000 description 3
- 239000005547 deoxyribonucleotide Substances 0.000 description 3
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 3
- 239000007789 gas Substances 0.000 description 3
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 3
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 3
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 description 3
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 description 3
- 238000001819 mass spectrum Methods 0.000 description 3
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 3
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 3
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 3
- 101150101386 phbB gene Proteins 0.000 description 3
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 3
- 150000003505 terpenes Chemical class 0.000 description 3
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 3
- 229920001791 ((R)-3-Hydroxybutanoyl)(n-2) Polymers 0.000 description 2
- QHHKKMYHDBRONY-WZZMXTMRSA-N (R)-3-hydroxybutanoyl-CoA Chemical compound O[C@@H]1[C@H](OP(O)(O)=O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OCC(C)(C)[C@@H](O)C(=O)NCCC(=O)NCCSC(=O)C[C@H](O)C)O[C@H]1N1C2=NC=NC(N)=C2N=C1 QHHKKMYHDBRONY-WZZMXTMRSA-N 0.000 description 2
- KJTLQQUUPVSXIM-ZCFIWIBFSA-N (R)-mevalonic acid Chemical compound OCC[C@](O)(C)CC(O)=O KJTLQQUUPVSXIM-ZCFIWIBFSA-N 0.000 description 2
- 102000005345 Acetyl-CoA C-acetyltransferase Human genes 0.000 description 2
- 108010006229 Acetyl-CoA C-acetyltransferase Proteins 0.000 description 2
- 240000002791 Brassica napus Species 0.000 description 2
- KJTLQQUUPVSXIM-UHFFFAOYSA-N DL-mevalonic acid Natural products OCCC(O)(C)CC(O)=O KJTLQQUUPVSXIM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000003298 DNA probe Substances 0.000 description 2
- 244000000626 Daucus carota Species 0.000 description 2
- 235000002767 Daucus carota Nutrition 0.000 description 2
- 101710088194 Dehydrogenase Proteins 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 2
- SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N Glutaraldehyde Chemical compound O=CCCCC=O SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000006137 Luria-Bertani broth Substances 0.000 description 2
- BAVYZALUXZFZLV-UHFFFAOYSA-N Methylamine Chemical compound NC BAVYZALUXZFZLV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- OAICVXFJPJFONN-OUBTZVSYSA-N Phosphorus-32 Chemical compound [32P] OAICVXFJPJFONN-OUBTZVSYSA-N 0.000 description 2
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 2
- WHBMMWSBFZVSSR-UHFFFAOYSA-N R3HBA Natural products CC(O)CC(O)=O WHBMMWSBFZVSSR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 244000061456 Solanum tuberosum Species 0.000 description 2
- 235000002595 Solanum tuberosum Nutrition 0.000 description 2
- 238000002105 Southern blotting Methods 0.000 description 2
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 2
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 2
- COQLPRJCUIATTQ-UHFFFAOYSA-N Uranyl acetate Chemical compound O.O.O=[U]=O.CC(O)=O.CC(O)=O COQLPRJCUIATTQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- XJLXINKUBYWONI-DQQFMEOOSA-N [[(2r,3r,4r,5r)-5-(6-aminopurin-9-yl)-3-hydroxy-4-phosphonooxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl] [(2s,3r,4s,5s)-5-(3-carbamoylpyridin-1-ium-1-yl)-3,4-dihydroxyoxolan-2-yl]methyl phosphate Chemical compound NC(=O)C1=CC=C[N+]([C@@H]2[C@H]([C@@H](O)[C@H](COP([O-])(=O)OP(O)(=O)OC[C@@H]3[C@H]([C@@H](OP(O)(O)=O)[C@@H](O3)N3C4=NC=NC(N)=C4N=C3)O)O2)O)=C1 XJLXINKUBYWONI-DQQFMEOOSA-N 0.000 description 2
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 2
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 2
- 239000012131 assay buffer Substances 0.000 description 2
- HOQPTLCRWVZIQZ-UHFFFAOYSA-H bis[[2-(5-hydroxy-4,7-dioxo-1,3,2$l^{2}-dioxaplumbepan-5-yl)acetyl]oxy]lead Chemical compound [Pb+2].[Pb+2].[Pb+2].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O.[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O HOQPTLCRWVZIQZ-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 2
- 230000006860 carbon metabolism Effects 0.000 description 2
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 2
- XBDQKXXYIPTUBI-UHFFFAOYSA-N dimethylselenoniopropionate Natural products CCC(O)=O XBDQKXXYIPTUBI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 2
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 2
- 239000003822 epoxy resin Substances 0.000 description 2
- 238000011049 filling Methods 0.000 description 2
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 2
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 2
- 239000001307 helium Substances 0.000 description 2
- 229910052734 helium Inorganic materials 0.000 description 2
- SWQJXJOGLNCZEY-UHFFFAOYSA-N helium atom Chemical compound [He] SWQJXJOGLNCZEY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 2
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 2
- 229910052500 inorganic mineral Inorganic materials 0.000 description 2
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 2
- 210000001161 mammalian embryo Anatomy 0.000 description 2
- 210000004779 membrane envelope Anatomy 0.000 description 2
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 2
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 2
- 239000011707 mineral Substances 0.000 description 2
- 229930027945 nicotinamide-adenine dinucleotide Natural products 0.000 description 2
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 2
- 210000000633 nuclear envelope Anatomy 0.000 description 2
- 229910000489 osmium tetroxide Inorganic materials 0.000 description 2
- 101150044547 phbA gene Proteins 0.000 description 2
- 229920000070 poly-3-hydroxybutyrate Polymers 0.000 description 2
- 229920000647 polyepoxide Polymers 0.000 description 2
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 2
- 238000002731 protein assay Methods 0.000 description 2
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 2
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 description 2
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 description 2
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 2
- FGDZQCVHDSGLHJ-UHFFFAOYSA-M rubidium chloride Chemical compound [Cl-].[Rb+] FGDZQCVHDSGLHJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 2
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 2
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 2
- 239000001226 triphosphate Substances 0.000 description 2
- 235000011178 triphosphate Nutrition 0.000 description 2
- 125000002264 triphosphate group Chemical class [H]OP(=O)(O[H])OP(=O)(O[H])OP(=O)(O[H])O* 0.000 description 2
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000040650 (ribonucleotides)n+m Human genes 0.000 description 1
- IUPHTVOTTBREAV-UHFFFAOYSA-N 3-hydroxybutanoic acid;3-hydroxypentanoic acid Chemical compound CC(O)CC(O)=O.CCC(O)CC(O)=O IUPHTVOTTBREAV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QHHKKMYHDBRONY-RMNRSTNRSA-N 3-hydroxybutanoyl-CoA Chemical compound O[C@@H]1[C@H](OP(O)(O)=O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OCC(C)(C)[C@@H](O)C(=O)NCCC(=O)NCCSC(=O)CC(O)C)O[C@H]1N1C2=NC=NC(N)=C2N=C1 QHHKKMYHDBRONY-RMNRSTNRSA-N 0.000 description 1
- WHBMMWSBFZVSSR-UHFFFAOYSA-M 3-hydroxybutyrate Chemical compound CC(O)CC([O-])=O WHBMMWSBFZVSSR-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- REKYPYSUBKSCAT-UHFFFAOYSA-N 3-hydroxypentanoic acid Chemical compound CCC(O)CC(O)=O REKYPYSUBKSCAT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- SJZRECIVHVDYJC-UHFFFAOYSA-M 4-hydroxybutyrate Chemical compound OCCCC([O-])=O SJZRECIVHVDYJC-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- PHOJOSOUIAQEDH-UHFFFAOYSA-N 5-hydroxypentanoic acid Chemical compound OCCCCC(O)=O PHOJOSOUIAQEDH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HBAQYPYDRFILMT-UHFFFAOYSA-N 8-[3-(1-cyclopropylpyrazol-4-yl)-1H-pyrazolo[4,3-d]pyrimidin-5-yl]-3-methyl-3,8-diazabicyclo[3.2.1]octan-2-one Chemical class C1(CC1)N1N=CC(=C1)C1=NNC2=C1N=C(N=C2)N1C2C(N(CC1CC2)C)=O HBAQYPYDRFILMT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QTXZASLUYMRUAN-QLQASOTGSA-N Acetyl coenzyme A (Acetyl-CoA) Chemical compound O[C@@H]1[C@H](OP(O)(O)=O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OCC(C)(C)[C@@H](O)C(=O)NCCC(=O)NCCSC(=O)C)O[C@H]1N1C2=NC=NC(N)=C2N=C1.O[C@@H]1[C@H](OP(O)(O)=O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OCC(C)(C)[C@@H](O)C(=O)NCCC(=O)NCCSC(=O)C)O[C@H]1N1C2=NC=NC(N)=C2N=C1 QTXZASLUYMRUAN-QLQASOTGSA-N 0.000 description 1
- 241001133760 Acoelorraphe Species 0.000 description 1
- 241000588986 Alcaligenes Species 0.000 description 1
- 101150076489 B gene Proteins 0.000 description 1
- 241000219310 Beta vulgaris subsp. vulgaris Species 0.000 description 1
- 229920013642 Biopol™ Polymers 0.000 description 1
- 235000006008 Brassica napus var napus Nutrition 0.000 description 1
- 235000011299 Brassica oleracea var botrytis Nutrition 0.000 description 1
- 240000003259 Brassica oleracea var. botrytis Species 0.000 description 1
- 235000004977 Brassica sinapistrum Nutrition 0.000 description 1
- 241000701489 Cauliflower mosaic virus Species 0.000 description 1
- 108020004394 Complementary RNA Proteins 0.000 description 1
- RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N Copper Chemical compound [Cu] RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000003155 DNA primer Substances 0.000 description 1
- 108010082495 Dietary Plant Proteins Proteins 0.000 description 1
- 244000169962 Dioscorea macrostachya Species 0.000 description 1
- 235000004868 Dioscorea macrostachya Nutrition 0.000 description 1
- 230000005526 G1 to G0 transition Effects 0.000 description 1
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 1
- 206010020649 Hyperkeratosis Diseases 0.000 description 1
- 108010044467 Isoenzymes Proteins 0.000 description 1
- 239000007836 KH2PO4 Substances 0.000 description 1
- 108010025815 Kanamycin Kinase Proteins 0.000 description 1
- 235000007688 Lycopersicon esculentum Nutrition 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 240000001140 Mimosa pudica Species 0.000 description 1
- 235000016462 Mimosa pudica Nutrition 0.000 description 1
- 244000061176 Nicotiana tabacum Species 0.000 description 1
- 235000002637 Nicotiana tabacum Nutrition 0.000 description 1
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 1
- 238000000636 Northern blotting Methods 0.000 description 1
- OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N Phosphorus Chemical compound [P] OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010064851 Plant Proteins Proteins 0.000 description 1
- 208000037534 Progressive hemifacial atrophy Diseases 0.000 description 1
- 238000002123 RNA extraction Methods 0.000 description 1
- 241000190984 Rhodospirillum rubrum Species 0.000 description 1
- 240000003768 Solanum lycopersicum Species 0.000 description 1
- 108010039811 Starch synthase Proteins 0.000 description 1
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 1
- 229930182558 Sterol Natural products 0.000 description 1
- 235000021536 Sugar beet Nutrition 0.000 description 1
- 108010006785 Taq Polymerase Proteins 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 1
- DDQAGDLHARKUFX-UHFFFAOYSA-N acetic acid;methanamine Chemical compound [NH3+]C.CC([O-])=O DDQAGDLHARKUFX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- UDMBCSSLTHHNCD-KQYNXXCUSA-N adenosine 5'-monophosphate Chemical group C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(O)=O)[C@@H](O)[C@H]1O UDMBCSSLTHHNCD-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 1
- 125000004429 atom Chemical group 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 1
- 230000008238 biochemical pathway Effects 0.000 description 1
- 229920002988 biodegradable polymer Polymers 0.000 description 1
- 239000004621 biodegradable polymer Substances 0.000 description 1
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 1
- 230000001851 biosynthetic effect Effects 0.000 description 1
- 230000006696 biosynthetic metabolic pathway Effects 0.000 description 1
- 235000021466 carotenoid Nutrition 0.000 description 1
- 150000001747 carotenoids Chemical class 0.000 description 1
- 239000012159 carrier gas Substances 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 230000032823 cell division Effects 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 1
- 150000008280 chlorinated hydrocarbons Chemical class 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 239000003245 coal Substances 0.000 description 1
- 239000003184 complementary RNA Substances 0.000 description 1
- 229920001577 copolymer Polymers 0.000 description 1
- 229910052802 copper Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010949 copper Substances 0.000 description 1
- KFWWCMJSYSSPSK-PAXLJYGASA-N crotonoyl-CoA Chemical compound O[C@@H]1[C@H](OP(O)(O)=O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OCC(C)(C)[C@@H](O)C(=O)NCCC(=O)NCCSC(=O)/C=C/C)O[C@H]1N1C2=NC=NC(N)=C2N=C1 KFWWCMJSYSSPSK-PAXLJYGASA-N 0.000 description 1
- 230000001086 cytosolic effect Effects 0.000 description 1
- 238000000354 decomposition reaction Methods 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000001627 detrimental effect Effects 0.000 description 1
- 235000014113 dietary fatty acids Nutrition 0.000 description 1
- 235000021186 dishes Nutrition 0.000 description 1
- VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N dithiothreitol Chemical compound SC[C@@H](O)[C@H](O)CS VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N 0.000 description 1
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 1
- 238000012869 ethanol precipitation Methods 0.000 description 1
- ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N ethidium bromide Chemical compound [Br-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CC)=C1C1=CC=CC=C1 ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960005542 ethidium bromide Drugs 0.000 description 1
- 125000004494 ethyl ester group Chemical group 0.000 description 1
- 229930195729 fatty acid Natural products 0.000 description 1
- 239000000194 fatty acid Substances 0.000 description 1
- 150000004665 fatty acids Chemical class 0.000 description 1
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 1
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 1
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 1
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 1
- 238000012239 gene modification Methods 0.000 description 1
- 238000003167 genetic complementation Methods 0.000 description 1
- 230000005017 genetic modification Effects 0.000 description 1
- 235000013617 genetically modified food Nutrition 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 238000003306 harvesting Methods 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 150000001261 hydroxy acids Chemical class 0.000 description 1
- 125000002768 hydroxyalkyl group Chemical group 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 238000009776 industrial production Methods 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 230000004807 localization Effects 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 230000010534 mechanism of action Effects 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 1
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 description 1
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 1
- 239000007003 mineral medium Substances 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 229910000402 monopotassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019796 monopotassium phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 1
- 239000012074 organic phase Substances 0.000 description 1
- 239000012285 osmium tetroxide Substances 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 238000012017 passive hemagglutination assay Methods 0.000 description 1
- 238000002205 phenol-chloroform extraction Methods 0.000 description 1
- 229910052698 phosphorus Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011574 phosphorus Substances 0.000 description 1
- 230000008635 plant growth Effects 0.000 description 1
- 235000021118 plant-derived protein Nutrition 0.000 description 1
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 1
- 210000002706 plastid Anatomy 0.000 description 1
- 238000007747 plating Methods 0.000 description 1
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 1
- GNSKLFRGEWLPPA-UHFFFAOYSA-M potassium dihydrogen phosphate Chemical compound [K+].OP(O)([O-])=O GNSKLFRGEWLPPA-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000008057 potassium phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 235000012015 potatoes Nutrition 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 235000019260 propionic acid Nutrition 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- IUVKMZGDUIUOCP-BTNSXGMBSA-N quinbolone Chemical compound O([C@H]1CC[C@H]2[C@H]3[C@@H]([C@]4(C=CC(=O)C=C4CC3)C)CC[C@@]21C)C1=CCCC1 IUVKMZGDUIUOCP-BTNSXGMBSA-N 0.000 description 1
- 229920005604 random copolymer Polymers 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 230000001172 regenerating effect Effects 0.000 description 1
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 1
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 1
- 229940102127 rubidium chloride Drugs 0.000 description 1
- 239000013049 sediment Substances 0.000 description 1
- 230000010153 self-pollination Effects 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 239000010802 sludge Substances 0.000 description 1
- 239000002195 soluble material Substances 0.000 description 1
- 238000000527 sonication Methods 0.000 description 1
- 230000003595 spectral effect Effects 0.000 description 1
- 238000004611 spectroscopical analysis Methods 0.000 description 1
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 235000003702 sterols Nutrition 0.000 description 1
- 150000003432 sterols Chemical class 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 229920001169 thermoplastic Polymers 0.000 description 1
- 239000004416 thermosoftening plastic Substances 0.000 description 1
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 1
- 238000005809 transesterification reaction Methods 0.000 description 1
- 238000011426 transformation method Methods 0.000 description 1
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000000007 visual effect Effects 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
- C12N9/0006—Oxidoreductases (1.) acting on CH-OH groups as donors (1.1)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
- C12N15/8242—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits
- C12N15/8243—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits involving biosynthetic or metabolic pathways, i.e. metabolic engineering, e.g. nicotine, caffeine
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/10—Transferases (2.)
- C12N9/1025—Acyltransferases (2.3)
- C12N9/1029—Acyltransferases (2.3) transferring groups other than amino-acyl groups (2.3.1)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
- C12P7/62—Carboxylic acid esters
- C12P7/625—Polyesters of hydroxy carboxylic acids
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Nutrition Science (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
- Polyesters Or Polycarbonates (AREA)
- Biological Depolymerization Polymers (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Compounds Of Unknown Constitution (AREA)
- Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)
Abstract
1 . Sposób wytwarzania polihydroksyalkanonianów, znamienny tym, ze a) otrzymuje sie rosline transgeniczna przez wprowadzenie pierwszej sekwencji DNA kodujacej enzym o aktywnosci katalitycznej ketotiolazy, drugiej sekwencji DNA kodujacej enzym o aktywnosci katalitycznej reduktazy acetoacetylo-CoA i trzeciej sekwencji DNA kodujacej enzym o aktywnosci katalitycznej syntazy polihydroksyalkanonianu, wsród których co najmniej druga i trzecia sekwencja DNA sa ektopowe, a ekspresja sekwencji DNA prowadzi do otrzymania polihydroksyalkanonianu, albo parzy sie przez zaplodnienie plciowe dwie rosliny, które nie produkuja polihydroksyalkanonianu, przy czym kazda z nich zawiera obce DNA kodujace jeden lub kilka róznych enzymów na szlaku prowadzacym ku polimeryzacji hydroksyalkilo- CoA przez syntaze polihydroksyalkanonianu, tak aby progeny wynikajace z rozmnazania plciowego byly zdolne do produkowania polihydroksyalkanonianu, korzystnie polihydro ksymaslanu, a nastepnie b) material pochodzacy z roslin produkujacych polihydroksyalka nonian poddaje sie ekstrakcji i odzyskuje sie polihydroksyalkanonian. PL
Description
Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania polihydroksyalkanonianów, czyli liniowych poliestrów kwasów hydroksyalkanowych. Sposób według wynalazku opiera się na wprowadzeniu i ekspresji pewnego genetycznego materiału informacyjnego, to jest DNA zawierającego geny kodujące białka i/lub geny regulujące, lub w inny sposób wpływające na ich wytwarzanie, do komórek wyższych roślin oraz regenerację ze stransformowanych komórek płodnych roślin. Celem tej interwencji genetycznej jest przeniesienie z mikroorganizmów do roślin wyższych zdolności do syntetyzowania materiałów polimerycznych składających się z liniowych poliestrów hydroksykwasów. Tę klasę materiałów określa się ogólnie jako polihydroksyalkanoniany. Szczegółowym przykładem tu przedstawionym jest wytwarzanie polihydroksymaślanu (PHB).
Wiele gatunków bakterii akumuluje granule poliestrów składających się z monomerów hydroksyacylowych, które służą jako rezerwy węgla. Ostatnio dokonano przeglądu występowania, metabolizmu, roli metabolicznej i zastosowań przemysłowych bakteryjnych polihydroksyalkanonianów (Anderson, A. i Dawes, E. A., Microbiol. Rev. 54: 450-472 /1990/). Najczęściej stwierdzanym związkiem tej klasy jest poli(D--)-3-hydroksymaślan). Niektóre gatunki akumulują jednakże kopolimery różnych hydroksyalkanonianów, takich jak 3-hydroksypentanian (Wallen, L. L. i Rohwedder, W. K., Environ Sei. Technol. 8:576-579 /1974/). Stwierdzono, że składnikami polimerów osadów morskich jest przynajmniej 11 krótkołańcuchowych 3-hydroksykwasów. Badania wytwarzania pohhydroksyalkanonianów' w Alcaligenes entrophus wykazały, że jeżeli bakterie hoduje się w podłożu z glikozą jako jedynym źródłem węgla, akumulacji ulega tylko PHB. Jednakże, gdy jako źródła węgla dostarcza się zarówno glikozę, jak i kwas propionowy, bakterie akumulują przypadkowe kopolimery 3-hydroksyperttmianu i 3-hydroksymaślanu (Holmes, P. A., Phys. Technol. 16:32-36 (1985); Holmes, P. A., Wright, L. F. i Collins, S. H., europejskie opisy patentowe o numerach 0 069 497, styczeń 1983 i 0 052 459, grudzień 1985). Ponadto, gdy A. eutropus umieszcza się w podłożach zawierających różne inne źródła węgla, wytwarzane są poliestry zawierające monomery 4-hy droksymaślanu i 5-hydroksywalerianianu (Tablica I w Anderson, A. J. i Dawes, A. E., Microbiol. Rev. 54:450-472
170 467 /1990/). Okazało się zatem, że skład polimeru regulowany jest w pewnym stopniu dostępnością alternatywnych substratów dla enzymów katalizujących syntazę polimeru z monomerów.
PHB akumuluje się w komórkach bakteryjnych w postaci granul o średnicy w przybliżeniu 0,24 do 0,5 [im Na podstawie pomiarów masy cząsteczkowej monomerów PHb, oszacowano, że każda granula zawiera minimum 1 000 łańcuchów polimerów. Wysunięto hipotezę, że granule posiadaj ą otoczkę błonową złożoną z lipidów i białek, stanowiących w przybliżeniu odpowiednio 0,5 i 2% masy granul (Anderson, A. i Dawes, E. A., Microbiol. Rev. 54:450-472 /1990/). Sądzi się, że aktywność enzymu syntazy PHB jest związana z tą błoną. Stan w jakim PBH występuje w granuli pozostaje sprawą niepewną. Ostatnie dowody sugerują, że polimer w granuli występuje w stanie amorficznym. Niewiadomo, co reguluje wielkość granuli PHB w konkretnym organiźmie.
W większości organizmów PHB syntetyzowany jest z acetylokoenzymu A (acetylo-CoA) w następstwie trzech reakcji katalizowanych przez 3-ketotiolazę (acetylotransferazę acetyloCoA; EC 2.3.1.9), reduktazę acetoacetylo-CoA (dehydrogenazę hydroksybutyrylo-CoA; EC 11.1.36) i syntazę poli(3-hydroksymaślanową). Szlak syntazy przedstawiono na figurze 1. W Rhodospirillum rubrum PHB jest syntetyzowany przez przekształcenie L(+)-3-hy ciroksy butyrylo-CoA w krotonylo-CoA, a następnie w D(-)-3-hydroksybutyrylo-CoA. 3-Ket:ottolazę oczyszczono z różnych bakterii syntetyzujących i badano u kilku gatunków roślin wyższych. Sądzi się, że rola enzymu u roślin wyższych polega na tworzeniu acetoacetylo-CoA do wytwarzania mewalonianu, jak również, że bierze on udział w degradacji kwasów tłuszczowych. Reduktazę acetoacetylo-CoA wykryto w licznych bakteriach syntetyzujących PHB. Kilka gatunków, włącznie z A. eutrophus, wydaje się mieć dwa izoenzymy różniące się pod względem specyficzności substratowej i wymaganych kofaktorów. Reduktaza NADH A. eutrophus aktywna jest wobec D(-)- i L(+)-hydroksyacylo-CoA o 4 do 10 atomach węgla, podczas gdy reduktaza NADPH wykazuje aktywność tylko wobec D(-)-hydroksyacylo-CoA o 4 i 5 atomach węgla. Nigdy nie donoszono o enzymie tego rodzaju u roślin wyższych. Aktywność syntazy PHB wykryto w bakteriach akumulujących PHB w postaci zarówno enzymu rozpuszczalnego, jak i aktywności związanej z granulami, w zależności od warunków wzrostu. Obie formy enzymu częściowo oczyszczono, ale jak dotąd, z powodu niestabilności, nie do stanu homogennego. Syntaza PHB jest specyficzna wobec enancjomerów D(-) i, testując ją z 3d^yyrroksyacylo-CoA, wykazano że jest aktywna tylko wobec substratów o 4 i 5 atomach węgla, co zgodne jest z obserwacją, że organizm ten włącza do polimeru tylko jednostki monomerów 3-hydroksy kwasów o 4 i 5 atomach węgla. Mechanizm działania synta/y PHB pozostaje niejasny. Przypuszcza się, że odgrywana przez syntazę rola przenoszenia łańcuchów musi w pewien sposób kontrolować masę cząsteczkową tworzonego polimeru, która jest charakterystyczna dla danego organizmu. Nigdy nie donoszono o aktywności syntazy PHB u jakiejkolwiek rośliny.
Kilka grup badaczy niezależnie sklonowało i uzyskało ekspresję w E. coli genów zaangażowanych w biosyntezie PHB przez A. eutrophus (Slater, S C., i in., J. Bacteriol. 170:4431-4436 (1988); Schubert, P., i in., J. Bacteriol. 170: 5837-5847 /1988/). Zrekombinowane szczepy E. coli przenoszące fragment o długości 5,2 kbp z A. eutropus zdolne były do akumulowania znaczących ilości PHB w postaci granul. Sekwencję nukleotydową fragmentu o długości 5,2 kbp także niezależnie określiły dwie grupy (Janes, B. B., i in., w: Dawes, E. A. (red.) Hovel Biodegradable Microbial Polymers, Kluwer Academic Publishers, str. 175-190 (1990): Peoples, O. P. i Sinskey, A. J., J. Biol. Chem. 264: 15293-15297 (1989): Peoples, O. P. i Sinskey, A. J., J. Biol. Chem. 264: 15298-15303 /1989/). Analiza przewidywanej sekwencji aminokwasowej otwartej ramki odczytu, łącznie z dowodami opartymi na badaniach komplementacji genetycznej, ujawniła, że fragment o długości 5,2 kbp zawierał trzy ściśle związane geny, kodujące trzy enzymy wymagane do wytwarzania PHB. Złożono opis patentowy dotyczący stosowania sklonowanych genów do zwiększonego wytwarzania enzymów' biosyntetycznych w bakteriach (Peoples, O. P. i Shinskey, A. J., międzynarodowy opis patentowy numer WO 89/00202, styczeń 1989).
Pewne gatunki bakterii posiadają zdolność wydzielania enzymów oraz degradowania PHB i zbliżonych polihddroksyalkanonianów (przegląd w Anderson, A. i Dawes, E. A., Microbiol.
Rev. 54: 450-472 /1990/). Z powodu rozpowszechnienia tych gatunków bakteryjnych w wielu środowiskach naturalnych, PHB w glebie i osadach czynnych ulega szybkiej degradacji. A zatem, PHB i zbliżone polihydroksyalkanoniany są przedmiotem zainteresowaniajako odnawialne źródła termoplastów ulegających degradacji biologicznej. Przemysłowe wytwarzanie PHB z hodowli bakteryjnych na dużą skalę rozpoczęto w 1982 r. PHB wytwarzany w ten sposób sprzedawany jest przez ICI plc pod nazwą handlową Biopol. Jednakże, z powodu kosztów związanych z hodowaniem i zbieraniem dużych hodowli bakterii, wytwarzanie PHB jest znacznie bardziej kosztowne niż takich materiałów polimerycznych, jak skrobia, która akumuluje się w dużych ilościach w wielu gatunkach roślin wyższych. Dlatego też, korzystne może być opracowanie, na drodze inżynierii genetycznej, linii roślin wyższych, które akumulują PHB. Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania polihydroksyalkanonianu, polegający na tym, że a) otrzymuje się roślinę transgeniczną przez wprowadzenie pierwszej sekwencji DNA kodującej enzym o aktywności katalitycznej ketotiolazy, drugiej st^e^-weincji DNA kodującej enzym o aktywności katalitycznej reduktazy acetoacetylo-CoA i trzeciej sekwencji DNA kodującej enzym o aktywności katalitycznej syntazy polihydroksyalkanonianu, wśród których co najmniej druga i trzecia sekwencja DNA są ektopowe, a ekspresja sekwencji DNA prowadzi do otrzymania polihydroksyalkanonianu, albo parzy się przez zapłodnienie płciowe dwie rośliny, które nie produkują polihydroksyalkanonianu, przy czym każda z nich zawiera obce DNA kodujące jeden lub kilka różnych enzymów na szlaku prowadzącym ku polimeryzacji hydroksyalkilo-CaO przez syntazę polihydroksyalkanonianu, tak aby progeny wynikające z rozmnażania płciowego były zdolne do produkowania polihydroksyalkanonianu, korzystnie polihydroksymaślanu, a następnie b) materiał pochodzący z roślin produkujących polihydroksyalkanonian poddaje się ekstrakcji i odzyskuje się polihydroksyalkanonian.
Korzystnie ekstrakcji poddaje się polihydroksyalkanonian występujący w komórkach roślinnych w postaci granulek.
Figura 1 przedstawia biochemiczny szlak wytwarzania polihydroksymaślanu (PHB). W. A. eutropus PHB wytwarzany jest dzięki kolejnemu działaniu trzech enzymów: 3-ketotiolazy, przekształcającej acetylo-CoA w acetoacetylo-CoA; reduktazy acetoacetylo-CoA, przekształcającej acetoacetylo-CoA w 'D(-)-3-hydroksybutyryIo-CoA; syntazy PHB, przekształcającej D(-)-3-hhdrolk>ybutyiyło-CoA w polihydroksymaślan. U roślin i zwierząt acetoacetylo-CoA jest prekursorem syntazy mewalonianu.
Figura 2 przedstawia sekwancję nukleotydową operonu PHB A. eutrophus. Sekwencję otrzymano od Janes, B., Hollar, J. i Dennis, D., w: Dawes, E. A. (red.) Novel Biodegradable Polymers, Kluwer Academic Publishers, 175-190 (1990). Otwarta ramka odczytu od nukleotydu 842 do 2611 koduje syntazę PHB (gen phbC) (aminokwasy Si do S589). Otwarta ramka odczytu od nukleotydu 2696 do 3877 koduje enzym --ketotiolazę (gen phb A) (aminokwasy T1do T393). Otwarta ramka odczytu od nukleotydu 3952 do 4692 koduje enzym reduktazę acetoacetylo-CoA (gen phb B) (aminokwasy R1 do R246). Podkreślono miejsca rozpoznawane przez enzymy restrykcyjne Ddel, BstBI, PstI, SacI i Tth111I. Enzymy te stosowano podczas subklonowania genów phb.
Figura 3 przedstawia schematyczne podsumowanie etapów konstruowania plazmidów pUC-THIO i pBI-THIO. Celem tego ostatniego plazmidu jest umieszczenie genu 3-ł<(^ti^tii^tlazy A. euthropus pod transkrypcyjną kontrolą promotora 35S CaMV, tak że będzie on ulegał ekspresji w roślinach wyższych. Górny diagram przedstawia operon PHB A. eutropus o odpowiedniej lokalizacji otwartych ramek odczytu kodujących syntazę PHB, 3-ketotiolazę i reduktazę acetoacetylo-CoA. Strzałki poziome wskazują kierunek transkrypcji. Dolny diagram przedstawia główne składniki pochodzących od pBI121: NPT II, gen fosfotransferazy neomycyny II kodujący oporność na kanamycynę; CaMV 35S, promotor 35S wirusa mozaiki kalafiora, poły A, sekwencja poliadenylacji; Rb, prawa sekwencja graniczna T-DNA; LB, lewa sekwencja granicznaT-DNA. Dolny diagram narysowano bez uwzględnienia skali. Skróty miejsc enzymów restrykcyjnych: D, DdeI; PstI; B, BstBI; T, Tth111I; BH, BamHI; SacI; H, HindIII.
Figura 4 przedstawia schematyczne podsumowanie etapów konstruowania plazmidów pUC-SYN i pBI-SYN. Celem tego ostatniego plazmidu jest umieszczenie genu syntazy PHB A.
170 467 euthropus pod transkrypcyjną kontrolą promotora 35S CaMV, tak że będzie on ulegał ekspresji w roślinach wyższych. Diagramy i skróty opisano w opisie figury 3.
Figura 5 przedstawia schematyczne podsumowanie etapów konstruowania plazmidów pUC-RED i pBI-RED. Celem tego ostatniego plazmidu jest umieszczenie genu reduktazy acetoacetylo-CoA A. euthropus pod transkrypcyjną kontrolną promotora 35S CaMV, tak że będzie on ulegał ekspresji w roślinach wyższych. Diagramy górny i dolny oraz skróty opisano w opisie figury 3. Wskazano lokalizację i sekwencję starterów do PCR numer 1 i numer 2. Ostatni nukleotyd na końcu 3' startera PCR numer 1 odpowiada nukleotydowi 3952 na figurze 2 i jest pierwszym nukleotydem kodonu startu genu reduktazy. Ostatni nukleotyd na końcu 3' startera PRC numer 2 jest komplementarny do nukleotydu 4708 na figurze 2. Wskazano dodatkowe miejsca enzymów restrykcyjnych utworzone przez startery PCR.
Figura 6 przedstawia biot Southerna niestransformowanych roślin kontrolnych i stransformowanych roślin A. thaliana. Jeden g genomowego DNA niestransformowanych A. thaliana rasy Rschew i roślin transgenicznych strawiono enzymem ινουνί'χνρη'ηι HindIII, fragmenty rozdzielono przez elektroforezę w żelu agarozowym i przeniesiono na membranę nylonową. Sączki hybrydyzowano ze znakowanymi izotopem fosforu ‘ ‘P fragmentami DNA genów (A) phbA, (B) phbB i (C) phbC. Analizowanymi genomowymi DNA są: A. thaliana rasy Rschew typu dzikiego (ścieżka a) i rośliny transgeniczne T4-3A (ścieżka b), T3-2A (ścieżka c), T4-2A (ścieżka d), T4-3B (ścieżka e), RedB-2G (ścieżka f), RedB-2B (ścieżka g), RedB-2E (ścieżka h), RedB-2C (ścieżka i), RedD-3A (ścieżka j), RedD-2A (ścieżka k), RedB-2D (ścieżka l). S12-3A (ścieżkam), S8-1-2C (ścieżkan), SS-L-Atseieżkao) i S8PUB-2B (ściezkap). Liczby po lewej stronie są długościami w tysiącach par zasad.
Figura 7 przedstawia biot typu Northern mestranslormowanych roślin kontrolnych i transgenicznych roślin A. thaliana. Całkowity RNA A. thaliana rasy Rschew typu dzikiego (10 fig) i r^oślin transgenicznych (20 pg) rozdzielono przez elektroforezę w żelu agarozowym zawierającym formaldehyd i przeniesiono na membranę nylonową. Sączki hybrydyzowano ze znakowanymi izotopem fosforu 32P fragmentami DNA genów (A) phbA, (B) phbC i (C) phbB. Analizowane RNA pochodzą z roślin: T3-2A (ścieżka a) T4-2A (ścieżka b), T4-3B (ścieżka c). T4-3A (ścieżka d), A. thaliana typu dzikiego (ścieżki e, j, r), S8PUC-2B (ścieżka f), S8-1-2C (ścieżka g), S12-3A (ścieżka h), S8-1-2A (ścieżka i), RedB-2D (ścieżka k), RedB-2E (ścieżka 1), RedB-2G (ścieżka m), RedB-2A (ścieżka n), RedB-2B (ścieżka o), RedB-2C (ścieżka p) i RedD-3A. Liczby są długością w tysiącach par zasad.
Figura 8 przedstawia chromatografię gazową (GC) oczyszczonego PHB i ekstraktów roślinnych. Widma GC transesttyfikowanych ekstraktów chloroformowych liści niestransformowanych i oślin A. thaliana rasy Rschew typu dzikiego (B) i hybryd F1 roślin transgenicznych S8-1-2A i RedB-2C (C). Porównano z chromatogramem trassestrγflkowanego PHB dostępnego w handlu (A). Strzałki wskazują położenie piku etylohydroksymaślanu.
Figura 9 przedstawia analizę poprzez chromatografię gazową-spektrometrię masową etylohydroksymaślanu przygotowanego ze standardu PHB i PHB z ekstraktów roślinnych (A). Widmo masowe transestrγfkowane'go PHB dostępnego w handlu: (B) widmo masowe piku GC z ekstraktu chloroformowego liści hybrydy F1 pomiędzy S8-1-2A a RedB-2C, posiadającego identyczny czas retencji jak etylohydroksymaślan (jak przedstawiono na figurze 8C).
Figura 10 przedstawia mikrografy z transmisyjnej mikroskopu elektronowej (TEM) liści i nasśon PHB-dodatnich trranssgeic/.nych roślln A. thallana. Transgeniczne rośhny S8-1 --A i S8-1-2C zapylono krzyżowo transgenicznymi roślinami RedB-2D i RedB-2A. Otrzymane nasiona pokolenia F1 zasiano w glebie i próbki liści 2-3-2yygdniowych roślin analizowano przez TEM (mikrografy a do e). Część nasion pokolenia F1 moczono także w wodzie w ciągu 24 godzin, z łupiny nasiennej wycięto zarodki i liścienie analizowano przez TEM (mikrograf f). (a) Dwie przylegające komórki mezofilu z hybrydy pokolenia F1 RedB-2D X S8-1-2A z widocznymi skupiskami przezroczystych dla elektronów granul w jądrze, (b) Większe powiększenie jądra górnej prawej komórki przedstawionej na mikrografie a. (c) Jądro komórki mezofilu liścia hybrydy pokolenia F1 RedB-2D X S8-1-2A z widocznymi skupiskami granul, (d) Komórka mezofilu liścia hybrydy pokolenia F1 RedB-2A X S8-1-2A z widocznymi skupiskami przezro6 czystych dla elektronów granul w jądrze (N) i wakuoli (V). (e) Komórka mezofilu liścia hybrydy pokolenia FI RedB-2A X S8-1-2A z widocznymi skupiskami przezroczystych dla elektronów granul w cytoplaźmie. (f) Komórki liścienia z nasion hybrydy pokolenia F1 RedB-2A X S8-1-2C z widocznymi granulami w jądrze. Strzałka wskazuje skupiska granul przezroczystych dla elektronów. Pasek = 1 gm dla mikrografów a, b, c, d i f. Pasek = 0,25 gm dla mikrografu e.
Zmodyfikowane genetycznie rośliny wyższe, wytwarzają i akumulują PHB lub zbliżone polihydroksyalkaniany. Rośliny wytwarzające PHB otrzymuje się przez trwałe wprowadzenie do roślin bakteryjnych genów kodujących enzymy reduktazę acetoacetylo-CoA (dehydrogenazę hydroksybutyrylo-CoA) i syntazę poli(3-hydroksymaślanową) poprzez transformację za pośrednictwem plazmidu Ti. Ponieważ geny bakteryjne nie ulegają normalnej transkrypcji w komórkach roślinnych, geny modyfikuje się, tak że pozostają pod transkrypcyjną kontrolą sekwencji DNA (tj. promotora) indukującej transkrypcję w komórkach roślinnych. Geny modyfikuje się także przez dołączenie odpowiedniej s^^w^^cji DNA do niekodującego, 3'-końcowego regionu genów, tak że transkrypty wytwarzane w komórkach roślinnych są odpowiednio poliadenylowane.
Rośliny wytwarzające PHB otrzymuje się przez krzyżówki płciowe linii rodzicielskich, które nie wytwarzają PHB. Przeprowadza się to przez zapylenie krzyżowe transgenicznej linii roślinnej homozygotycznej pod względem ektopowych kopii zmodyfikowanego genu syntazy PHB z transgeniczną linią roślinną homozygotyczną pod względem ektopowych kopii zmodyfikowanego genu reduktazy acetoacetylo-CoA. W tym kontekście, termin geny ektopowe dotyczy genów, które normalnie nie występują w organizmie, ale ulegały trwałej integracji z genomem na drodze transformacji genetycznej. Określenie homozygotyczną pod względem ektopowych kopii oznacza, że oba homologiczne chromosomy organizmu diploidlanego mają zintegrowany gen ektopowy w tej samej pozycji chromosomu.
Przed przedstawieniem wynalazku, pomocne jest przedłożenie definicji pewnych terminów wykorzystywanych tu dalej.
Transformacja oznacza proces zmieniania genotypu organizmu biorcy przez trwałe wprowadzenie DNA dowolnymi sposobami.
Roślina transgenicz.na jest rośliną zawierającą sekwencje DNA, które normalnie nie występują u gatunku, ale zostały wprowadzone przez transformację.
Transkrypcja oznacza tworzenie łańcucha RNA według informacji genetycznej zawartej w DNA.
Translacja oznacza proces dzięki któremu informacja genetyczna w cząsteczce mRNA kieruje kolejnością specyficznych aminokwasów podczas syntazy białka.
Promotor jest fragmentem DNA, który powoduje transkrypcję materiału genetycznego. Dla opisanych tu celów, promotorem określa się fragmenty DNA, które umożliwiają transkrypcję w komórkach roślinnych. Promotor 35S CaMV jest fragmentem DNA wirusa mozaiki kalafiora, który powoduje stosunkowo wysoki poziom transkrypcji w wielu różnych tkankach wielu gatunków wyższych roślin (Benfey, P. N. i Chua, N. H., Science 250: 959-966 /1990/).
Miejsce dołączania poli-A jest sekwencją nukleotydową, która powoduje rozszczepianie mRNA w specyficznym miejscu przez pewne enzymy i dołączenie sekwencji reszt kwasu adenylowego do końca 3' mRNA.
phbC, phbA i phbB są symbolami genów nadanymi odpowiednio genom syntazy PHB, 3-ketottolazy i reduktazy acetoacetylo-CoA A. eutrophus (Peoples, O. P. i Sinskey, A. J., J. Biol. Chem. 264: 15298-15303 /1989/).
Przy opisie potomstwa roślin transgenicznych, użyteczne jest przyjęcie konwencji, która wskazuje, jak wiele pokoleń powstających w wyniku samozapylenia przeminęło od wprowadzenia DNA. W niniejszym opisie, nazwaliśmy oryginalny transformant pokoleniem TO. Potomstwo powstałe w wyniku samozapylenia tego pokolenia określa się pokoleniem T1, itd.
W przypadku zapylenia krzyżowego pomiędzy dwiema różnymi roślinami rodzicielskimi, potomostwo powstałe w wyniku pierwszego zapylenia krzyżowego określa się pokoleniem F1.
Chociaż doświadczenia omawiane dalej dotyczą gatunku rośliny Arabidopsis thaliana (L.) Heynhold. opisany sposób można ogólnie zastosować wobec każdej wyższej rośliny, dla której
170 467 dostępna jest metoda transformacji. Podobnie, chociaż opisany tu sposób dotyczy stosowania genów A. eutrophus, to można go ogólnie rzecz biorąc stosować wykorzystując geny każdego organizmu zdolnego do syntazy PHB. Oczywiste jest także, że chociaż opisany sposób dotyczy wytwarzania PHB, to można go ogólnie rzecz biorąc stosować do wytwarzania wszystkich polihydroksyalkanonianów, które normalnie wytwarzają mikroorganizmy dzięki aktywności syntazy polihydroksyalkanonianowej (PHA) (która obejmuje syntazy PHB), i dla których w konkretnej roślinie wytwarzany jest odpowiedni hydroksyalkilo-CoA jako substrat.
Plan doświadczalny
Wytwarzanie PHB w potomstwie stransformowanych roślin wymaga wykonania następujących etapów: (1) konstruowanie serii plazmidów bakteryjnych zawierających fuzje promotora, (2) przeniesienie tych plazmidów do Agrobacterium tumefaciens, (3) zastosowanie A. tumefaciens do wprowadzenia genów do komórek rośliny (tj. A. thaliana w tym przykładzie), (4) regeneracja roślin transgenicznych. (5) selekcja roślin homozygotycznych pod kątem genów ektopowych, (6) analiza działania genów ektopowych w stransformowanych roślinach dla upewnienia się, że ulegają one ekspresji, i że produkty genów są funkcjonalne, (7) wytwarzanie roślin hybrydowych, zawierających dwa lub więcej różnych genów ektopowych przez krzyżówki płciowe, (8) analiza materiału hybrydowego pod kątem obecności PHB. Etapy te szczegółowo opisano w poniższych działach.
Konstruowanie fuzji transkrypcyjnych
W celu uzyskania transkrypcji genów bakteryjnych w roślinach wyższych, geny bakteryjne muszą zostać zmodyfikowane przez dołączenie promotora roślinnego, tak aby ulegały transkrypcji po wprowadzeniu do roślin wyższych. Ponadto powszechnie stosuje się dołączanie miejsca dołączania poli-A do 3'-końcowego regionu genów bakteryjnych w celu uzyskania właściwej ekspresji genów w roślinach wyższych. Oba te wymogi można spełnić przez sklonowanie genów phbC, phbA i phbB z plazmidu pTZ18U-PHB do binarnego wektora opartego na plazmidzie Ti - pTZ18U (Clonetech, CA). Sekwencję nukleotydową genów phbC, phbA i phbB zawartych w plazmidzie pTZ18U-PHB przedstawiono na figurze 2. Wskazano zastosowane do klonowania stosowne miejsca enzymów' restrykcyjnych, jak również przewidywaną otwartą ramkę odczytu trzech genów.
Fuzję genów 35S CaMV-phbA skonstruowano przez strawienie plazmidu pTZ18U-PHB enzymami restrykcyjnymi Pstl i Ddel. Fragment restrykcyjny o długości 1,3 kb, zawierający sekwencję kodującą genu 3-ketottolazy, oddzielono od innych fragmentów DNA przez elektroforezę w żelu agarozowym. Fragment DNA odzyskano z żelu stosując membranę DEAE-celulozy (membrana DEAE NA-45 Schleicher & Schuell). Lepkie końce fragmentu DNA wypełniono przez inkubację oczyszczonego fragmentu restrykcyjnego z polimerazą DNA T4 i trifosforanami deoksynukleotydów. Fragment z tępymi końcami ^klonowano następnie w miejscu Smal plazmidu pUC18, tworząc plazmid puC-THlO. Fragment restrykcyjny o długości 1,3 kb wycięto z plazmidu pUC-THlO przez strawienie restir/ktrozami BamHI i SacI, oczyszczono przez elektroforezę stosując membranę celulozy DEAE i połączono z plazmidem pBI121, który uprzednio strawiono tymi samymi dwoma enzymami. Stwierdzono, że otrzymany plazmid, oznaczony pBI-THIO, zawiera gen 3-ket.t'OI<tlazy A. eutrophus we właściwej orientacji w stosunku do promotora 35S CaMV i miejsca dołączania poli-A plazmidu pBl-121, tak że można oczekiwać jego ekspresji w rośl^ch wyższych. Schematyczne podsumowanie etapów konstruowania pBI-THIO przedstawiono na figurze 3.
Fuzję genów 35S CaMV-phbC skonstruowano przez strawienie plazmidu pTZ18U-PHB enzymami restrykcyjnymi BstBI i Tth111I. Fragment restrykcyjny o długości 1,9 kb, zawierający sekwencję kodującą genu syntazy PHB, oddzielono od innych fragmentów DNA przez elektroforezę w żelu agarozowym. Fragment DNA odzyskano z żelu stosując membranę DEAE-celulozy. Lepkie końce fragmentu DNA wypełniono przez inkubację oczyszczonego fragmentu resttr^d^cc^gnego z polimerazą DNA T4 i trifosforanami deoksynukleotydów. Fragment z tępymi końcami sklonowano następnie w miejscu SmaI plazmidu pUC18, tworząc plazmid pUCSYN. Fragment restrykcyjny o długości 1,9 kb wycięto z pUB-SYN przez całkowite strawienie re.st^ty^l^t^i^^^^^imi BamHI i częściowe SacI, oczyszczono przez elektroforezę ^^^osi^ijąc membranę celulozy DEAE i połączono z plazmidem pBI121, który uprzednio strawiono tymi samymi
170 446 dwoma enzymami. Stwierdzono, że otrzymany plazmid, oznaczony pBI-SYN, zawiera gen syntazy PHB A. eutrophus we właściwej orientacji w stosunku do promotora 35S CaMV i miejsca dołączania poli-A plazmidu pBI-121, tak że można oczekiwać jego ekspresji w roślinach wyższych. Schematyczne podsumowanie etapów konstruowania pBI-SYN przedstawiono na figurze 4.
Fuzję genów 35S CaMV-phbB skonstruowano stosując parę syntetycznych oligonukleotydów jako startery łańcuchowej reakcji polimerazy (PCR) do powielenia genu phbB z plazmidu pTZ18U-PHB. Sekwencję starterów oligonukleotydowych przedstawiono na figurze 5, gdzie oznaczono je jako starter PCR numer 1 i starter PCR nr 2. Oligonukleotydy zaprojektowano w taki sposób, że powielana sekwencja DNA zawierała syntetyczne miejsce BamHI blisko końca 5' sekwencji kodującej i syntetyczne miejsce KpnI przy końcu 3 sekwencji. Produkt reakcji łańcuchowej polimerazy o długości 790 par zasad rozdzielono i oczyszczono z żelu agarozowego, strawiono enzymami resttykcyjnymi BamHI i KpnI i połączono z plazmidem pUC18, który uprzednio strawiono tymi samymi dwoma enzymami, tworząc plazmid pUC-RED. Fragment restrykcyjny wycięto z pUC-RED przez strawienie restryktazami BamHI i SacI, oczyszczono przez elektroforezę stosując membranę celulozy DEAE i połączono z plazmidem pBI121, który uprzednio strawiono tymi samymi dwoma enzymami. Stwierdzono, że otrzymany plazmid, oznaczony pBI-RED, posiada gen reduktazy acetoacetylo-CoA A. eutrophus we właściwej orientacji w stosunku do promotora 35S CaMV i miejsca dołączania poli-A plazmidu pBI-121, tak że można oczekiwać jego ekspresji w roślinach wyższych. Schematyczne podsumowanie etapów konstruowania pBI-RED przedstawiono na figurze 5.
Plazmidy pBI-SYN, pBI-THIO i pBI-RED przeniesiono do szczepu C58 pGV3850 Agrobacterium tumefaciens przez elektroporację. Kolonie zawierające plazmidy odnaleziono przez selekcję na ekspresję genu oporności wobec kanamycyny, obecnego w macierzystym plazmidzie pBI121.
Wytwarzanie roślin transgenicznych
Komórki A, thaliana transformowano przez inkubację jałowej tkanki korzeni z hodowlami A. tumafaciens przenoszącym zrekombinowane binarne plazmidy Ti opisane w uprzednim dziale. Korzenie jałowych rozsad A. thaliana rasy Rschew transformowano jak opisali Valvekens, D. i in., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 5536-5540 (1988). Każdy z trzech szczepów A. tumafaciens przenoszącychjeden ze zmodyfikowanych genów phb zastosowano do infekowania kawałków korzeni A. thaliana. W wyniku tego otrzymano w każdym przypadku w przybliżeniu 50 tkanek kalusa opornych na kanamycynę. Spośród nich 10-25% dało wzrost płodnych pędów, które wytwarzały nasiona. Każdej wytwarzającej nasiona roślinie przydzielono inny numer aby wskazać, że reprezentuje ona przypadek odrębnej transformacji.
Z tkanek traktowanych A. tumefaciens niosącym plazmid pBI-RED otrzymano całkowitą liczbę 11 roślin przypuszczalnie transgenicznych. Oznaczono je RedB-2A, -2B, -2C, -2D, -2E, -2F, -2G, -2H, -3A, -5A o Red-3A. Wszystkie te linie roślin transgenicznych, z wyjątkiem RedB-2F, -2H i -5A, analizowano szczegółowo jak opisano w poniższych działach.
Z tkanek traktowanych A. tumefaciens niosącym plazmid pBI-THIO otrzymano całkowitą liczbę 5 roślin przypuszczalnie transgenicznych. Oznaczono je T3-2A, T4-2A, T4-3A, T4-3B i T4-3C. Wszystkie te linie roślin transgenicznych, z wyjątkiem T4-3C, analizowano szczegółowo jak opisano w poniższych działach.
Z tkanek traktowanych A. tumefaciens niosącym plazmid pBI-SYN otrzymano całkowitą liczbę 4 roślin przypuszczalnie transgenicznych. Oznaczono je S8-1-2A, S8-1-2C, S12-3A i S8PUC-2A. Wszystkie te linie roślin transgenicznych analizowano szczegółowo jak opisano w poniższych działach.
Obecność T-DNA w roślinach przypuszczalnie transgenicznych zweryfikowano przez wysianie nasion roślin transgenicznych na zestalonym agarem podłożu mineralnym zawierającym 50 gg/ml kanamycyny. To stężenie kanamycyny zapobiega wzrostowi niestransformowanych roślin A. thaliana, ale umożliwia normalny wzrost roślin zawierających gen NPTII przenoszony przez pBI121 lub plazmidy od niego pochodzące. Nasiona roślin transgenicznych T4-2A, RedD-3A i S8-1-2A dostępne są w The American Type Culture Collection, Rockville, MD 20852.
170 467
Izolowanie przypuszczalnie homozygotycznych linii transgenicznych
Minimalnym kryterium zastosowanym przy wytwarzaniu homozygotycznych linii transgenicznych było to, iż oczekiwano, że całe potomstwo rośliny homozygotycznej będzie oporne nakanamycynę. Ponieważ obecność wielu ektopowych kopii genu NPTII z plazmidu pBI121 w różnych położeniach genomu może powodować podobny fenotyp, kryterium to jest najbardziej użyteczne gdy pierwotna transformacja polega na wstawieniu T-DNA w jednej pozycji chromosomu.
W celu zidentyfikowania przypuszczalnych linii homozygotycznych, kilka opornych na kanamycynę roślin pokolenia T1 z każdej linii hodowano do osiągnięcia dojrzałości, stosując izolację reprodukcyjną. Następnie w próbkach około 50 nasion T2 z każdej linii określono częstość oporności na kanamycynę. Jeśli wszystkie z nasion T2 jednej rośliny były oporne na kanamycynę, linię tymczasowo uważano za homozygotyczną.
Analiza integracji genów phb w roślinach transgenicznych
W celu zweryfikowania właściwej integracji genów phb w różnych wytworzonych liniach roślin transgenicznych, analizowano DNA genomowy roślin transgenicznych. Wyizolowano DNA o wysokiej masie cząsteczkowej z kontrolnych roślin niestransformowanych i z roślin transgenicznych T3, stransformowanych plazmidami pBI-THIO, pBI-RED i pBI-SYN. DNA strawiono enzymem restrykcyjnym HindIII, fragmenty rozdzielono przez elektroforezę w żelu agarozowym i przeniesiono na sączek nylonowy. Enzym restrykcyjny trawi plazmidy pBI-THIO, pBI-RED i pBI-SYN tylko w jednym miejscu przy końcu 5' promotora 35S CaMV (figury 3, 4 i 5). Fragmenty wykryte z zastosowaniem sond specyficznych wobec genów phb powinny dlatego odpowiadać fragmentom połączenia wektorów T1 z genomowym DNA roślin lub wewnętrznym fragmentom wektorów T1. Wstawki w plazmidach pBI-THIO, pBI-RED i pBI-SYN wycięto przez działanie enzymami resttrykcyynymi EcoRI i HindIII, oczyszczono przez elektroforezę w żelu agarozowym stosując membranę DEAE-celulozy i znakowano ‘r-deoksyrybonukleotydami stosując losowe startery. Znakowane fragmenty genów phb zastosowano następnie do sondowania sączków nylonowych. Sączki hybrydyzowano i następnie przemywano w surowych warunkach. Wyniki tych hybrydyzacji sączków przedstawiono na figurze 6. Żadnego z trzech genów phb nie można było wykryć w niestransformowanych roślinach kontrolnych (figury 6A, B i C, ścieżka a). Gen phbA wykryto w czterech z linii transgenicznych wytworzonych przez transformację plazmidem pBI-THIO (figura 6A, ścieżki b do e). Gen phbB wykryto w siedmiu z roślin transgenicznych wytworzonych przez transformację plazmidem pBI-RED (figura 6B, ścieżki f do 1). Wreszcie, gen phbC wykryto w trzech z roślin transgenicznych wytworzonych przez transformację plazmidem pBI-SYN (figura 6C, ścieżki m do p). Chociaż linia roślinna S12-3A była oporna na 50 (Ig kanamycyny, sugerując integrację genu NPTII, nie można było wykryć genu phbC. Prawdopodobnie w genomowym DNA linii roślinnej S12-3A zintegrowany został tylko fragment wektora T1 zawierający gen NPTII, ale nie gen phbC.
Analiza ekspresji genów phb w roślinach transgenicznych
W celu określenia, czy geny phb A. eutrophus ulegały ekspresji w różnych liniach transgenicznych, sklonowane geny obecne w plazmidach pUC-THlO, pUC-RED i pUC-SYN zastosowano jako sondy w doświadczeniach hybrydyzacji sączków. Z niestransformowanych roślin kontrolnych i roślin transgenicznych pokolenia T3 wyekstrahowano całkowite RNA. RNA rozdzielono przez elektroforezę na zawierającym formaldehyd żelu agarozowym i przeniesiono na sączki nylonowe stosując ustalone procedury. Wstawki plazmidów pUC-THIO, pUC-RED i pUC-SYN wycięto przez działanie enzymami res^tjjfki^c^ynymi EcoRI i HindIII, oczyszczono przez elektroforezę stosując membranę DEAE-celulozy i znakowano ’ r-deoksyrybonukleotydami stosując losowe startery. Znakowane geny phb zastosowano następnie do sondowania sączków nylonowych. Doświadczenia te wykazały, że żadna z trzech sond phb nie hybrydyzowała z żadnym RNA z niest^ans^^r^i^owanych roślin kontrolnych (figura 7, ścieżki e, j i r). W przeciwieństwie, rośliny transgeniczne wytworzone przez transformację pbI-THIO miały RNA o długości 1,6 kbp, który był komplementarny do genu 3-ketottolazy (figura 7A, ścieżki a do d). Obecne w plazmidach pochodzących od pBI121 sekwencje promotora 35S CaMV i miejsca dołączania poli-A wnoszą udział w przybliżeniu 300 bp do końcowej długości
170 467 mRNA wytwarzanych z fuzji genów phb. Poziom mRNA 3-ketotiolazy w linii roślinnej T4-3A był niski w stosunku do innych linii roślinnych. Podobnie, trzy z transgenicznych linii wytworzonych przez transformację plazmidem pBI-SYN posiadały mRNA o długości 2,1 kbp odpowiadający genowi syntazy PHB (figura 7B, ście^żki f, g i i). Linia transgeniczna S12-3A nie posiadała wykrywalnego mRNA hybrydyzującego z sondą phbC (figura 7B, ścieżka h). Wyniki te zgodne są z analizą biotów Southema wykazującą brak integracji genu phbC z genomowym DNA linii S12-3A (figura 6C, ścieżka m). Wreszcie, siedem linii tra^genicznych, wytworzonych przez transformację plazmidem pBI-RED, posiadało mRNA o długości 1,1 kbp, który był komplementarny z genem, reduktazy acetoacetylo-CoA (figura 7C, ś<cie:żki k do q). A zatem, dla każdego z trzech genów phb otrzymano co najmniej trzy niezależne rośliny, w których ulegał ekspresji komplementarny RNA o oczekiwanej wielkości.
Chociaż obecność RNA wskazuje, że geny ulegają transkrypcji, nie dostarcza to żadnej informacji, że zachodzi translacja, lub produkty translacji są funkcjonalne. Badano to oznaczając aktywność enzymatyczną w roślinach transgenicznych.
Rośliny transgeniczne wytworzone przez transformację pBI-TIHO oceniano pod względem aktywności 3-ketottolazy stosując z niewielkimi modyfikacjami oznaczenie opisane przez Seniora, P. J. i Dawes, E. A. Biochem. J. 134: 225-238 (1973). Zamrożone tkanki liści z trzech roślin T3 homogenizowano w buforze Tris i sklarowane ekstrakty oznaczano pod kątem aktywności 3-ketottolazy. Wyniki tych doświadczeń przedstawiono w tabeli 1. Ekstrakty z niestransformowanych roślin A thaliana miały w warunkach oznaczenia bardzo niskie poziomy aktywności 3-ketotiolazd. W przeciwieństwie, każda z roślin transgenicznych u których stwierdzono transkrypcję genu pbhA. miała zasadniczo podwyższony poziom aktywności tiolazy. Wskazuje to na to, że bakteryjny gen tiolazy jest funkcjonalny, gdy ulega ekspresji w roślinach transgenicznych. Jednakże, aktywność właściwa 3-ΕοΙοΕοΕ^ wykrywana w różnych roślinach transgeniczndch była znacząco niższa w porównaniu z ekstraktami przygotowanymi z E. coli zawierającej gen phbA w plazmidzie pTZ18U-PHB.
Tabela 1
Poziomy aktywności 3-ketottolazd w roślinach transgt^nicznych A. thaliana
| Próbka | Aktywność 3-kctottolazya |
| DH5alfa/PHBb | 9,5 |
| A. thaliana typu dzikiego | 0,019 |
| linia transgeniczna T4-3A | 0,057 |
| linia transgeniczna T3-2A | 0,42 |
| linia transgeniczna T4-2A | 0,43 |
| linia transgeniczna T4-3B | 0,54 |
a Mikromole acetoacetylo-CoA zdegradowane na minutę na miligram białka. Wartości są średnimi z dwóch do czterech pomiarów.
b E. coli DH5alfa zawierająca plazmid pTZ18U-PHB obejmujący operon PHB.
W roślinach transgeniczndch wytworzonych przez transformację plazmidem pBI-RED oznaczano aktywność reduktazy acetoacetydo-CoA stiosując z niewielkimi modyfikacjami oznaczenie opisane przez Seniora, P. J. i Dawesa, E. A., Biochem. J 134: 225-238 (1973). Liście roślin T3 homogenizowano w potasowym buforze fosforanowym i w sklarowanych ekstraktach oznaczano aktywność reduktazy acetoacetydo-CoA. Wyniki tych doświadczeń przedstawiono w tabeli 2. Ekstrakty z niestransfΌrmowanycy roślin A. thaliana miały w warunkach oznaczenia niewykrywalne poziomy aktywności reduktazy acetoacetylo-CoA. W przeciwieństwie, każda z roślin transgenicznych, u których stwierdzono transkrypcję genu phbB, miała wysoki poziom aktywności reduktazy acetoacetylo-CoA. Wskazuje to, że bakteryjny gen reduktazy acetoacetylo-CaA jest funkcjonalny, gdy ulega ekspresji w roślinach transg^^^cznych. Co więcej, aktywność właściwa reduktazy acetoacetylo-CoA wykryta w sześciu z siedmiu analizowanych roślin transgenicznych była znacząco wyższa niż w ekstraktach E. coli zawierającej geny phbB w plazmidzie pTZ18U-PHB.
170 467
Tabela 2
Poziomy aktywności reduktazy acetoacetylo-CoA w roślinach transgenicznych A. thaliana
| Próbka | Aktywność reduktazy acetoacetylo-CoAa |
| DH5alf^HBb | 1,4 |
| A. thaliana typu dzikiego | <0,03 |
| linia transgeniczna RedB-2A | 12,5 |
| linia transgeniczna RedB-2B | 16,2 |
| linia transgeniczna RedB-2C | 9,1 |
| linia transgeniczna RedB-2D | 8,8 |
| linia transgeniezna RedB-2E | 1,6 |
| linia transgeniczna RedD-2G | 5,2 |
| linia iransgenlezna RedD-3A | 2,3 |
a Mikromole NADPH zredukowane na minutę na miligram białka. Wartości są średnimi z dwóch do czterech pomiarów.
b E. coli DH5alfa zawierająca plazmid pTZ18U-PHB niosący operon PHB.
W roślinach tr^^sg^i^^cznych otrzymanych przez transformację plazmidem pBI-SYN nie oznaczano obecności aktywności syntazy pBh z powodu technicznych trudności mierzenia aktywności tego enzymu w nieobecności aktywności tiolazy i reduktazy.
Wytwarzanie i analiza roślin hybrydowych
Ponieważ rośliny wyższe zawierają endogenną aktywność cytoplazmatycznej 3-ketottolazy, jedynymi dodatkowymi enzymami wymaganymi do wytwarzania PHB są reduktaza acetoacetylo-CoA i syntaza PHB. Te dwa geny wprowadzono do tej samej rośliny przez zapylenie krzyżowe linii transgenicznej, którą uważa się za homozygotyczną pod względem genu reduktazy acetoacetylo-CoA z linią transgeniczną, którą uważa się za homozygotyczną pod względem genu syntazy PHB. Hybrydowe nasiona otrzymane z tych krzyżówek hodowano przed oznaczaniem obecności PHB w glebie przez dwa do trzech tygodni.
W celu określenia, czy obecność w roślinach genów reduktazy acetoacetylo-CoA i syntazy PHB była wystarczająca do wytwarzania i akumulacji PHB, z roślin kontrolnych i hybrydowych, zawierających oba te geny, przygotowano ekstrakty materiału rozpuszczalnego w chloroformie. Obecność PHB w tych ekstraktach analizowano przez chromatografię gazową (GC). Do przygotowania ekstraktów roślinnych do analizy GC stosowano dwie metody. Metody te wykorzystują zarówno wysoki stopień spolimeryzowania PHB (średnio 106 Daltonów dla PHB wytwarzanego z A. eutrophus) i jego selektywną rozpuszczalność w chlorowanych węglowodorach, takich jak chloroform. Krótko, w metodzie numer 1 całe liście roślin umieszcza się w roztworze chloroformu i wody w stosunku 1:1 i wytrząsano przez odwracanie w ciągu 16 godzin w temperaturze 65°C. Ponieważ cząsteczki większe niż około 50 000 Daltonów nie mogą przejść przez ścianę komórek roślinnych, w tych warunkach ekstrakcji z liści ulegajątylko rozpuszczalne w wodzie lub chloroformie produkty o niskich masach cząsteczkowych. Przypuszczalny PHB o wysokiej masie cząsteczkowej ekstrahuje się następnie z liści przez homogenizację pozostałej tkaaiki w celu zniszczenia ściany komórkowej i ponownie ekstraiuje roztworem chloroformu i wody w stosunku 1:1 w ciągu 12 godzin w temperaturze 65°C. W metodzie numer 2 próbki całych liści kolejno ekstrahuje się w ciągu 2 godzin w temperaturze 55OC 50% etanolem, w ciągu 2 godzin w temperaturze 55°C 1100% metanolem i w ciągu 15 minut w temperaturze 20°C 1100% eterem dietylowym. Pozostałą tkankę homogenizuje się następnie i ekstrahuje chloroformem w temperaturze 100°C w ciągu 4 godzin. Produkty obecne w ostatecznym ekstrakcie chloroformowym otrzymanym w wyniku obu tych metod transestryfikowano etanolem i kwasem solnym i analizowano przez chromatografię gazową. Czasy retencji trantestryTikowanych produktów roślinnych porównano z transestryTikowanym PHB dostępnym w handlu, oczyszczonym z A. eutrophus (Sigma Chemical Co., MO).
Rośliny transgeniczne S8-1-2A i/lub S8-1-2C zapylono krzyżowo roślinami transgenicznymi RedB-2A, -2C, -2D, -2G i RedD-3A. Powstałe nasiona F1 wysiewano w glebie i próbki liści lub całe pędy 2-3 tygodniowych roślin zbierano i analizowano pod kątem obecności PHB.
Przykład wyników otrzymanych przy użyciu metody oczyszczania numer 1 przedstawiono na figurze 8. Produkt obecny w ekstraktach roślin F1 posiadających zarówno przeniesiony gen reduktazy acetoacetylo-CoA, jak i syntazy PHB miał czas retencji identyczny z etylohydroksymaślanem, jak określono przez porównanie z czasem ret^^ncji transe slryfikowanego produktu PHB dostępnego w handlu. Ten nowy produkt, tymczasowo zidentyfikowany jako etylohydroksymaślan, wykryto tylko w roślinach hybrydowych F1 posiadających zarówno aktywny przeniesiony gen reduktazy acetoacetylo-CoA, jak i syntazy PHB. Podobnego produktu nie można było wykryć w roślinach transgenicznych posiadających tylkojeden z wymienionych genów lub w niestransformowanych roślinach A. thaliana. Ponadto, produktu tego nie można było wykryć w ekstraktach chloroformowych tkanek roślinnych, których uprzednio nie homogenizowano. Wskazuje to na to, że etylohydroksymaślan pochodzi z prekursora o wysokiej masie cząsteczkowej.
Tożsamość nowego produktu roślinnego, posiadającego czas re^<^^<^ji identyczny jak etylohydroksymaślan, analizowano przez chromatografię gazową-spektrometrię masową (GCMS). Analizę GC-MS przeprowadzono stosując MSU-NIH Mas Spectrometry Facility. Figura 9A przedstawia widma spektrometrii masowej etylohydroksymaślanu przygotowanego z autentycznego PHB. Figura 9B przedstawia widmo masowe przypuszczalnego etylohydroksymaślanu wyekstrahowanego z roślin hybrydowych F1, które powstały w wyniku krzyżówki pomiędzy roślinami transgenicznymi S8-1-2A I RedB-2C. Wyniki wskazują, że nowy produkt roślinny, ulegający elucji z takim samym czasem retencji jak etylohydroksymaślan, ma także taki sam wzór rozkładu jak autentyczna próbka etylohydroksymaślanu. Fakt, że ten nowy produkt można wykryć tylko w ekstraktach z tkanki liści, którą uprzednio homogenizowano, wskazuje, że etylohydroksymaślan pochodzi z materiału o masie cząsteczkowej wyższej niż około 50 000 Daltonów (przybliżona porowatość ścian komórek roślinnych). Razem, dane te wskazują, że rośliny transgeniczne zawierające geny zarówno reduktazy acetoacetylo-CoA i syntazy PHB, akumulują polihydroksymaślan. Tabela 3 przedstawia podsumowanie danych dotyczących roślin F1, które analizowano przez GC i GC-MS. W oparciu o analizę GC, ilość PHB akumulowanego w liściach hybryd F1 pozostawała w zakresie 5 gg PHB na gram świeżej masy liści dla hybryd F1 pomiędzy RedD-3A i S8-1-2C, do około 100 gg PHB na gram świeżej masy liści dla hybryd F1 pomiędzy RedB-2C i S8-1-2A.
Tabela 3
Podsumowanie dowodów na wytwarzanie PHB w roślinach hybryd F1
| Rodzicielska linia transgeniczna3 | Rodzicielska linia transgeniczna3 | |
| S8-1-2C | S8-1-2A | |
| RedD-3A | GCb | |
| MSC | TEM1* (liść) | |
| RedB-2A | GC | |
| TEM (nasiono) | TEM (liść nasiono) | |
| RedB-2G | GC MS TEM (liść) | |
| RedB-2C | TEM (liść) | GC MS |
| RedB-2D | TEM (liść) |
a Linie transgenńczne zawierające przeniesiony gen reduktazy acetoacetylo-CoA zapylano krzyżowo liniami transgemcznymi zawierającymi syntazę PHB Powstałe hybrydy F1 analizowano pod kątem wytwarzania PHB. b Dowody na wytwarzanie PHB z analizy przez chromatografię gazową.
c Dowody na wytwarzanie PHB z chromatografii gazowej-spektrometrii masowej.
d Wykrywanie przezroczystych dla elektronów granul przez transmisyjną mikroskopię elektronową.
W nawiasach podano analizowaną tkankę roślinną.
e Wszystkie puste miejsca wskazują, że analizy nie przeprowadzono.
170 467
Badanie wzrokowe granul PHB w roślinach hybrydowych.
Transmisyjna mikroskopia elektronowa (TEMI) bakterii akumulujących PHB ujawniła przezroczyste dla elektronów granule o średnicy 0,2 do 0,5 gm otoczone otoczką błonową o grubości około 2 nm (Lundgren, D. G., Pfister, R. M i Merrick, J. M., J. Gen. Microbiol. 34: 441-446 /1964/). W celu stwierdzenia, czy podobne granule można wykryć w roślinach hybrydowych, które, jak wykazano przez analizę GC-MS, są dodatnie pod względem wytwarzania PHB, tkanki roślinne badano przez transmisyjną mikroskopię elektronową. Rośliny transgeniczne S8-1-2A i/lub S8-1-2C zapylono krzyżowo roślinami transgemcznymi RedB-2A, -2C, -2D, -2G i RedD-3A. Powstałe nasiona hybrydy F1 i materiał z dojrzałych liści utrwalono do analizy przez transmisyjną mikroskopię elektronową. Krótko, tkanki utrwalono w 3% glutaraldehydzie i 1% czterotlenku osmu i zatopiono w żywicy epoksydowej. Skrawki o grubości 80-90 nm barwiono 5% octanem uranylu i cytrynianem ołowiu.
W jednej serii doświadczeń, nasiona F1 wysiewano w glebie i z 2-3--yyodniowych roślin zebrano liście do analizy przez TEM. Badanie komórek obecnych w liściach ujawniło obecność skupisk przezroczystych dla elektronów granul. Granule te wykryto we wszystkich analizowanych hybrydach roślin F1 powstałych w wyniku krzyżówek pomiędzy roślinami transgenicznymi posiadającymi gen syntazy PHB a roślinami posiadającymi gen reduktazy acetoacetylo-CoA. Przykłady przedstawiono na figurze 10. Podobnych granul nigdy nie wykryto ani w rodzicielskich liniach transgenicznych posiadających tylko gen syntazy PHB lub reduktazy acetoacetylo-CoA, ani w niestransformowanym A. thaliana. W tkankach liści hybryd F1 granule wykryto w komórkach mezofilu (figura 10, mikrografy a do e). Skupiska przezroczystych dla elektronów granul najczęściej wykrywano w jądrze (figura 10, mikrografy a do c), ale podobne struktury wykryto także w cytoplaźmie (figura 10, mikrograf e) i wakuoli (figura 10, mikrograf d) tkanek liści hybryd F1. W jądrze i cytoplaźmie pojedyncze granule mogą osiągać maksymalną wielkość około 0,18 gm. W wakuolach granule są na ogół większe, osiągając maksymalną średnicę około 0,55 gm. Przy większych powiększeniach okazało się, że granule jądrowe są otoczone materiałem elektronowo gęstym. Zarówno wielkość, jak i widoczna struktura tych granul są bardzo podobne do granul obserwowanych u bakterii akumulujących PHB.
W drugiej serii doświadczeń nasiona F1 moczono w wodzie w ciągu 24 godzin, zarodki wycięto z łupiny nasiennej i tkanki utrwalono. Analiza liścieni zarodków ujawniła obecność skupisk przezroczystych dla elektronów granul w jądrze (figura 10, mikrograf f). Granule mogą osiągać maksymalną średnicę 0,18 gm. Granule te można wykryć tylko w jądrze zarodków hybryd F1 powstałych w wyniku krzyżówek pomiędzy roślinami transgenicznymi posiadającymi gen syntazy PHB a roślinami transgenicznymi posiadającymi gen reduktazy acetoacetyloCoA. Żadnych granul nie można było wykryć ani w rodzicielskich roślinach transgenicznych, ani w posiadających tylko jeden z ektopowych genów, ani w mestransformowanym A. thaliana typu dzikiego. Tabela 3 przedstawia podsumowanie danych na temat roślin F1, które analizowano przez TEM.
Dane opisane powyżej pokazują dodatnią korelację pomiędzy wykrywaniem PHB przez GC-MS a obecnośi^ią granul na poziomie mikroskopu elektronowego. Wielkość, kształt i obecność materiału elektronowo gęstego, otaczającego pojedyncze granule, bardzo blisko przypominają granule obecne w bakteriach wytwarzających PHB. Wreszcie, zarówno wykrywanie PHB przez GC-MS, jak i obecność przezroczystych dla elektronów granul, obserwuje się tylko w roślinach hybrydowych, posiadających przeniesione geny zarówno reduktazy acetoacetylo-CoA, jak i syntazy PHB. Razem, dane te wskazują, że granule obserwowane w roślinach hybrydowych F1 są złożone z polihydroksymaślanu.
Dyskusja
W badaniach tych wykazano, że geny bakteryjne kodujące enzymy wymagane do syntezy PHB można trwale wprowadzić do wyższych roślin w taki sposób, że geny ulegają transkrypcji i wytwarzają transkrypty o oczekiwanej wielkości. Wykazano dalej, że, w przypadku genów phbA i phbB, ich obecność w roślinach transgenicznych powoduje wzrost poziomu aktywności enzymatycznej odpowiednio 3-ketottotazy i reduktazy acetoacetylo-CoA. A zatem, jest jasne, że produkty tych dwóch genów są funkcjonalne, gdy ulegają translacji w roślinach. Z powodu trudności technicznych związanych z bezpośrednim oznaczaniem aktywności syntazy PHB, nie oznaczano aktywności syntazy PHB w roślinach transgenicznych.
Wykazano, że tylko ekstrakty roślinne z roślin transgenicznych F1, w których ulega ekspresji zarówno reduktaza acetoacetylo-CoA, jak i syntaza PHB, zawierają nowy, rozpuszczalny w chloroformie związek o wysokiej masie cząsteczkowej, który po transestryfikacji etanolem i kwasem solnym, daje etylohydroksymaślan. Dane te wskazują, że nowym związkiem jest polihydroksymaślan. Ponadto, dane te stanowią pośredni dowód na wytwarzanie funkcjonalnej syntazy PHB w roślinach transgenicznych. Jest to ważne, ponieważ oznaczanie in vitro aktywności syntazy PHB nie mogło być wykonane. Ponadto, wytwarzanie PHB wskazuje także pośrednio na wytwarzanie w roślinach D(-)-hydroksybutyrylo-CoA, substratu syntazy pHb. Ten hydroksyacylo-CoA nie występuje naturalnie w roślinach.
Transmisyjna mikroskopia elektronowa dalej udowadnia twierdzenie, że PHB wytwarzany jest w roślinach transgenicznych. Analiza liścieni zarodków i dojrzałych liści roślin transgenicznych F1, w których zachodzi zarówno ekspresja reduktazy acetoacetylo-CoA, jak i syntazy PHB, ujawniła skupiska przezroczystych dla elektronów granul posiadających wielkość i strukturę bardzo podobne do granul stwierdzanych w bakteriach wytwarzających PHB, takich jak A. eutrophus. Granule te stwierdza się najczęściej w jądrze, ale wykrywano je także w wakuoli i cytoplaźmie roślin hybrydowych F1.
W doświadczeniach opisanych w tej pracy, produkty genów phbA, phbB i phbC A. eutrophus najprawdopodobniej ulegają ekspresji w cytoplaźmie, ponieważ do białek nie dołączono żadnych specyficznej s^ł^’we^ncji kierującej je specyficznie do jakiejkolwiek organelli. Ponieważ cytoplazma komórek roślinnych już zawiera 3^^ett^ttidazę, do wytwarzania PHB wymagana jest tylko dodatkowa ekspresja reduktazy acetoacetylo-CoA i syntazy PHB. Fakt, że granule stwierdza się w jądrze i wakuolach niekoniecznie jest sprzeczny z ekspresją enzymów w cytoplaźmie. Ponieważ błona jądrowa ulega rozpadowi i ponownemu tworzeniu podczas podziału komórki, granule PHB wytworzone początkowo w cytoplaźmie mogłyby ulegać schwytaniu przez odtwarzaną na nowo błonę jądrową. Alternatywnie, na skutek swojej hydrofobowości, granule PHB mogłoby przechodzić przez błony jądra i wakuoli.
W alternatywnym podejściu, wytwarzanie PHB mogłoby zachodzić w specyficznych organellach komórek roślinnych dzięki docelowej ekspresji enzymów zaangażowanych w syntazie PHB w organellum. W tym przypadku, jeśli w docelowym organellum nie zachodzi ekspresja aktywnej 3-ketottolazy, do wytwarzania PHB wymagana będzie, poza ekspresją reduktazy acetoacetylo-CoA i syntazy PHB, ekspresja egzogennej aktywności B-^ieet^itt^olazy.
Długoterminowym celem wytwarzania PHB lub PHA w roślinach wyższych jest ukierunkowanie metabolizmu węgla nie na szlaki biosyntezy głównych związków zapasowych, takich jak lipidy, skrobia łub terpenoidy, lecz na szlak syntazy PHB. Cel ten wymagał będzie ekspresji specyficznej tkankowo, jak również potencjalnie specyficznej wobec organelli ekspresji enzymów zaangażowanych w syntazie PHA.
Rośliny oleiste stanowią odpowiedni cel dla inżynierii genetycznej. Lipidy syntetyzowane są w plastydach z udziałem acetylo-CoA, tego samego prekursora, który wykorzystywany jest w syntazie PHB i innych PHA. Dlatego też, modyfikacje genetyczne roślin oleistych wymagać będą kierowania enzymów biosyntazy PHA do pastydów. Przykładami roślin oleistych, które mogłyby być przekształcane technikami inżynierii genetycznej, tak aby wytwarzały PHA, są rzepak, słonecznik i olejowiec gwinejski. Głównymi roślinami uprawnymi w Ameryce Północnej są rzepak i słonecznik i można je transformować obcym DNA. Alternatywnie, wytwarzanie PHA można skierować do mezokarpu owoców olejowca gwinejskiego. Ponieważ lipidy wytwarzane w mezokarpie nie mają zasadniczego znaczenia dla przeżycia drzewa lub zarodka, wytwarzanie PHA nie powinno mieć szkodliwych wpływów na drzewa palmowe. Niestety, dotąd brak jest dostępnych technik transformacji olejowca gwinejskiego.
Wytwarzanie PHA można także umiejscawiać w korzeniach i bulwach buraków cukrowych i ziemniaków, roślinach uprawnych które rakumulują duże ilości skrobi. Główny problem występujący przy tym podejściu polega na tym, że ponieważ, przy syntazie skrobi i PHA nie są
170 467 wykorzystywane te same prekursory, zanim metabolizm węglowy zostanie skierowany na szlak syntazy pHa, a nie skrobi, wymaganych będzie wiele jego potencjalnych modyfikacji.
Być może najbardziej bezpośrednim podejściem do wytwarzania PHA byłoby wykorzystanie, roślin uprawnych akumulujących duże ilości terpenoidów, takich jak marchew akumulująca karotenoidy, lub pochrzyn meksykański akumulujący sterole. Ponieważ przy syntazie terpenoidów' wykorzystywane są te same prekursory co przy syntazie PHA (acetylo-CoA i acetoacetylo-CoA), skierowanie metabolizmu węgla na szlak syntazy PHA możnaby łatwiej osiągnąć.
MATERIAŁY I METODY
Konstruowanie rekombinantów' DNA
Zawierający plazmidy szczep DH5alfa E. coli hodowano w podłożu bulionowym LB wzbogaconym o kanamycynę (50 μg/ml) lub ampicylinę (50 gg/ml). Preparatykę DNA plazmidowego na dużą skalę przeprowadzono przez lizę zasadową i procedurę wytrącania glikolem polietylenowym, jak opisali Sambrook, J., Fritsch, E. F. i Maniatis T., Molecular Cloning, a laboratory manuał, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989). Plazmidowy DNA trawiono endonukleazami restrykcyjnymi zgodnie z zaleceniami producentów (New England Biolabs, Mass; Promego Corp., WI; Boehringer Mannheim Biochemicals, IN; Stratagene, CA), rozdzielano przez elektroforezę w żelu agarozowym i uwidaczniano przez barwienie bromkiem etydyny, jak opisali Sambrook, J., Fritsch, E. F. i Maniatis, T., Molecular cloning, a laboratory manuał, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989). Fragmenty DNA odzyskiwano z żelu stosując membrany DEAE (membrana DEAE Na-45, Schleicher i Schuell, Inc., NH). Krótko, DNA przenosi się elektroforetycznie na skrawek NA-45 i membranę przemywa się 0,15 M NaCl, 0,1 mM EDTA i 20 mM Tris-HCl (pH 8). DNA eluuje się następnie 1,0 M NaCl, 0,1 mM EDTA i 20 mM Tris-HCl (pH 8) w temperaturze 65°C w ciągu 1 do 2 godzin. DNA oczyszcza się dalej przez ekstrakcję fenolem-chloroformem i wytrącanie etanolem. W niektórych doświadczeniach lepkie końce 3' fragmentów DNA przekształcano w tępe końce polimerazą DNA T4, stosując protokół opisany w Sambrook, J., Fritsch, E. F. i Maniatis, T., Molecular cloning, a laboratory manuał, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989). Ligowanie fragmentów DNA o lepkich lub tępych końcach przeprowadzano w temperaturze 140C w ciągu 16 godzin, w buforze zawierającym 50 mM Tris-HCl (pH 7,6), 5 mM MgCl2, 5% (w/v) glikol polietylenowy 8000, 0,5 mM ATP i 5 mM ditiotreitol, jak opisali Sambrook, J., Fritsch, EF. i Maniatis, T., Molecular cloning, a laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989). Frakcję po reakcji ligowania przenoszono do E. coli metodą z wykorzystaniem chlorku rubidu, jak opisał Hanahan,
D. , J. Mol. Biol. 166: 557-580 (1983). Stransformowane bakterie wysiewano na płytki zawierające, zestalone agarem, podłoże bulionowe LB i albo 50 gg/ml kanamycyny, albo 50 gg/ml ampicyliny. Kolonie bakteryjne zawierające zrekombinowane plazmidy identyfikowano przez hybrydyzację z sondami dNa znakowanego izotopem fosforu 32P jak opisali Sambrook, J„ Fritsch, E. F. i Maniatis, T., Molecular cloning, a laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989), z tym wyjątkiem, że zamiast membran nitrocelulozowych zastosowano membrany nylonowe (Hybond-N, Amersham, EL). Przygotowywanie znakowanych radioaktywnie sond DNA i hybrydyzację opisano w poniższym dziale. Przygotowywanie plazmidowego DNA na małą skalę przeprowadzono metodą lizy zasadowej, jak opisali Sambrook, J., Fritsch,
E. F. i Maniatis, T., Molecular cloning, a laboratory manuał, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989).
Oligonukleotydy zsyntetyzowano stosując syntezator DNA Applied Biosystems 380A zgodnie z instrukcjami producenta (Applied Biosystems, CA). Oligonukleotydy z przyłączoną do końca 5' grupą dimetoksytritylową oczyszczono na HpLc Varian 5000 wyposażonej w kolumnę Cis (Varian Instrument Group, TX). Oligonukleotydy zawieszono ponownie w 0,1 M metyloaminie i wstrzyknięto na kolumnę Cis zrównoważoną 12% acetonitrylem/88% 0,1 M octanu metyloaminy (pH 7) (rozpuszczalnik A). Program HPLC ustawiono następująco: szybkość przepływu 0,9 ml/minutę; ciśnienie maksymalne 13 795 hPa; czas 0 minuta, 88% rozpuszczalnika A/12% rozpuszczalnika B (acetonitryl); czas 3 minuta, 88% rozpuszczalnika A/12% rozpuszczalnika B; czas 21 minuta, 65% rozpuszczalnika A/35% rozpuszczalnika B; czas 25
170 467 minuta, 65% rozpuszczalnika A/35% rozpuszczalnika B. Oczyszczone oligonukleotydy denitrylowano w 80% kwasie octowym w ciągu 10 minut i suszono w atmosferze azotu. Oligonukleotydy rozpuszczono w 10 mM Tris-HCl (pH 7,5) i 0,1 mM EDTA, trzy razy ekstrahowano równymi objętościami octanu etylu i wytrącono etanolem.
Reakcję łańcuchową polimerazy przeprowadzono stosując cyklizator termiczny DNA Perkin Elmer Cetus (Perkin-Elmer, CT). Mieszanina reakcyjna zawierała 100 pmoli oligonukleotydów, startera PCR numer 1 i numer 2 (patrz fig. 5), 200 ng plazmidu pTZ18U-PHB przeprowadzonego w postać liniową enzymem resttykcyynym EcoRI, 125 μΜ dNTP, 50 mM KC1, 10 mM Tris-HCl (pH 8,3), 2,5 mM MgCl2,0,01 % żelatynę i 2,5 jednostki polimerazy Taq (Perkin-Elmer, CT). Program cyklizatora termicznego DNA był następujący: 3 minuty w temperaturze 94°C, 40 cykli o kolejności 1 minuta w temperaturze 94°C - 3 minuty w temperaturze 55°C - 3 minuty w temperaturze 72°C i ostatecznie 7 minut w temperaturze 72°C. Produkt PCR wyizolowano przez elektroforezę w żelu agarozowym i elucję z zastosowaniem membrany DEAE-celulozy.
Wytwarzanie roślin transgenicznych.
Wektory plazmidowe Tl zastosowane do wytworzenia roślin transg^t^iicznych najpierw przenoszono przez elektroporację do szczepu ce8-pGV3850 Agrobacterium tumefaciens (Zabrisky, P. i in., EmBO 2: 2143-2150 (1983) i Sambrook, J., Fritsch, E. P. i Maniatis, T. Molecular cloning, a laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press /1989/). Arabidopsis thaliana rasy Rschew hodowano na szalkach Pet.riego zawierających sole mineralne, 0,8% agar (Difco) i 1% sacharozę jak opisali Estelle, M. A. i Somerville, C., Mol. Gen. Genet. 206:200-206 (1987) oraz Schiefelbein, J. W. i Somerville, C. R. Plant Celi 2: 235-243. Wycinano korzenie 10- do 12-dniowych roślin i stosowano do transformacji, jak opisali Valvekens, D., Van Montagu, M. i Van Lljjebettenj, M. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 5536-5.540 (1988).
Nasiona roślin transgenicznych TO i Tl hodowano na podłożach zawierających sole mineralne, 1 % sacharozę, 0,8% agar (Difco) i 50 μg/ml kanamycyny. Po 10 do 14 dniach wzrostu oporne na kanamycynę (W) rośliny transgeniczne miały zielone liście, podczas gdy rośliny niestransforomowane, wrażliwe na kanamycynę (Kms) miały liście żółte. Na tym etapie rośliny W można było usunąć z agaru i przesadzić do nawożonej gleby.
Ekstrakcja i trawienie endonukleazami restrykcyynymi genomowego DNA
Rośliny transgeniczne i typu dzikiego hodowano w glebie w ciągu 2 do 3 tygodni i zbierano oraz zamrażano w ciekłym azocie około 5 g materiału z liści. Z zamrożonych tkanek roślinnych ekstrahowano DNA o wysokiej masie cząsteczkowej jak opisali Rogers, S. C. i Bendich, A. J., Plant Molecular Biology Manual A6: 1-10 (1988). Trawienie restrykcyjne enzymem HindIII prowadzono w warunkach zalecanych przez producenta (New England Biolabs Inc., Mass).
Elektroforeza w żelu agarozowym i procedura hybrydyzacji
Analizę DNA przez elektroforezę w żelu agarozowym i przeniesienie na membrany nylonowe (Hybond-N, Amersham, I1) przeprowadzono stosując ustalone procedury opisane w Southern, E. M., J. Mol. Biol. 38: 503-517 (1975) oraz Sambrook, J., Fritsch, E. F. i Maniatis, T., Mlolecula' cloning, a laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989). Specyficzne sklonowane fragmenty DNA, przeznaczone do stosowania jako sondy, wycinano z wektora odpowiednią endonukleazą restrykcyjną, wstawki oczyszczano z wektora przez elektroforezę w żelu agarozowym i elektroelucję z zastosowaniem membran DEAE-celulozy. Sondy znakowano ^P-deoksyrybonukleotydami metodą wydłużania losowych starterów, stosując heksamery, jak opisali Feinberg, A. P. i Volgelstein, B., Anal. Biochem. 136:6-13 (1983). Sączki nylonowe hybrydyzowano ze znakowanymi sondami i naświetlano film, jak opisali Poirier, Y. i Jolicoeur, P., J. Virol. 63: 2088-2098 (1989).
Izolowanie RNA i elektroforeza
Z zamrożonych próbek liści wyizolowano całkowity RNA jak opisali Puissant, C. i Houdebine, L. M., BioTechniques 8: 148-149 (1990). Wyizolowany RNA rozdzielano przez elektroforezę w zawierającym formaldehyd żelu agarozowym i przenoszono na membrany nylonowe (Hybond-N, Amersham, I1, jak opisali Sambrook, J., Fritsch, E. F. i Maniatis, T.,
170 467
Molecular cloning, a laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989). Sączki nylonowe hybrydyzowano ze znakowanymi sondami jak opisano w uprzednich działach.
Oznaczanie aktywności 3-ketottolazy
Próbki jednego grama zamrożonych liści homogenizowano w 2 ml schłodzonego lodem buforu zawierającego 100 mM Tris-HCl (pH 8,0), 40 mM MgClę i 5 mM beta-merkaptoetanol. Homogenat klarowano przez wirowanie przy 10000 x g w ciągu 2 minut i supernatant przenoszono do nowej probówki. Zawartość białka w ekstrakcie mierzono przez oznaczenie Bradford, stosując zestaw do oznaczania białka BioRad (BioRad Laboratories, CA). W oznaczeniu stosowano pomiędzy 3 a 30 gg ekstraktów białek roślinnych. Ekstrakty białkowe przygotowywano także z bakterii. W tym przypadku, hodowle bakterii w fazie stacjonarnej osadzano przez wirowanie, jeden raz przemywano schłodzonym lodem buforem do oznaczenia i ponownie zawieszano w 200 gl tego samego buforu. Zawiesinę bakteryjną lizowano przez sonifikację, homogenat klarowano przez wirowanie i określano zawartość białka w ekstrakcie stosując oznaczenie Bradford. W oznaczeniu stosowano pomiędzy 0,2 a 1 gg ekstraktów białek ekstraktu bakteryjnego. Aktywność enzymu 3-ketotioIazJy w różnych ekstraktach oznaczano według procedury Seniora, P. J. i Dawesa, E. A., Biochem. J. 134: 225-238 (1973).
Oznaczanie aktywności acetoacetylo-CoA
Próbki jednego grama zamrożonych liści homogenizowano w 2 ml schłodzonego lodem buforu zawierającego 100 mM KH2PO4 (pH 5,5), 0,02 mM MgCb i 4,0 mM beta-merkaptoetanolu. Homogenat klarowano przez wirowanie przy 10000 x g w ciągu 2 minut i supernatant przenoszono do nowej probówki. Zawartość białka w ekstrakcie mierzono przez oznaczenie Bradford, stosując zestaw do oznaczania białka BioRad. W oznaczeniu stosowano pomiędzy 0,8 a 10 gg ekstraktu białek roślinnych. Ekstrakty bakteryjne także przygotowywano w buforze do oznaczania, zasadniczo jak opisano w poprzednim dziale. Aktywność enzymu reduktazy acetoacetylo-CoA oznaczano według procedury Seniora, P. J. i Dawesa, E. A., Biochem. J. 134: 225-238 (1973).
Analiza przez chromatografię gazową i spektroskopię masową
Do przygotowania ekstraktów roślinnych do analizy GC stosowano dwie metody. W metodzie numer 1, od 0,005 do 0,05 g świeżego lub zamrożonego materiału roślinnego (liści lub całych pędów) ekstrahowano przy ciągłym mieszaniu w temperaturze 65°C w ciągu 16 godzin 1 do 2 ml roztworu chloroformu i wody w stosunku 1:1. Następnie materiał roślinny homogenizowano w wodzie i ponownie ekstrahowano przy ciągłym mieszaniu roztworem chloroformu i wody w stosunku 1:1 w ciągu 16 godzin, w temperaturze 65°C. Fazę chloroformową przenoszono do nowej probówki i jeden raz ekstrahowano równą objętością wody. Końcową objętość fazy chloroformowej doprowadzano do 0,5 i stosowano do transesttrfkacji etanolem i HCl, jak opisano poniżej. W metodzie numer 2, od 0,005 do 0,15 g zamrożonego lub świeżego materiału roślinnego kolejno ekstrahowano 50% etanolem w temperaturze 55°C w ciągu 2 godzin, 100% metanolem w temperaturze 55°C w ciągu 2 godzin i 1θ0% eterem dietylowym w ciągu 15 minut w temperaturze pokojowej. PozostUą tkankę homogenizowano następnie w wodzie, suszono i ekstrahowano 0,5 ml chloroformu w ciągu 4 godzin w temperaturze 100°C.
Wreszcie, ekstrakty chloroformowe (0,5 ml), otrzymane metodami numer 1 i numer 2 transesttyfikowano przez dodanie 0,2 ml stężonego HCl i 1,7 ml 100% etanolu i ogrzewano w temperaturze 100°C w ciągu 2 godzin. Mieszaninę reakcyjną schładzano następnie do temperatury pokojowej, fazę chloroformową ekstrahowano dwukrotnie 2 ml 0,9% NaCl (w/v) i objętość końcową fazy organicznej obniżano do 100 gl. Jako standard, dostępny w handlu PHB (Sigma Chemical Co., MO) rozpuszczano w ciepłym chloroformie i 1 mg transestryfikowano jak opisano powyżej.
Fazę chloroformową, zawierającą estry etylowe przenoszono do komory nastrzykowej o objętości 1 gl chromatogramu gazowego Hewlett Packard 5890 serii H, wyposażonego w programowalny automat do pobierania próbek i szklaną kolumnę kapilarną SP-230 (Supleco, PA). Przybliżona liniowa prędkość * wynosiła 20 cm/sekundę, z helem jako gazem nośnym. Temperaturę otworu iniekcyjnego i wyjścia płomieniowego detektora jonizacyjnego nastawiono
170 467 na220°C. Stosowano następujący profil temperaturowy: 4 minuty w temperaturze 65°C,^po których następował wzrost temperatury z szybkością 20°C/minutę do temperatury 195 C, 3,5 minuty w temperaturze 195°C, po rozdziale szybkość obniżania temperatury 20°C/minutę do 65°C.
Identyczność pików będących przedmiotem zainteresowania ustalano przez GC-spektrometrię masową. Dane widm masowych po zderzeniach z ' elektronami otrzymano stosując spektrometr masowy JEOL JMS-AX505H sprzężony z chromatografem gazowym Hewlett Packard 5890. Stosowano następujące parametry: temperatura źródła jonów, 200°C; prąd jonizacji, 100 μΛ; napięcie przyspieszające, 3 keV. Kolumnę DB-225 J & W Scientific Co. bezpośrednio wprowadzano do źródła jonów spektrometru masowego, a jako nośnik zastosowano hel. Iniektor bezszczelinowd i linię przesyłania utrzymywano w temperaturze 260°C. Stosowano taki sam profil temperaturowy źródła ciepła GC (patrz poprzedni akapit).
Transmisyjna mikroskopia elektronowa
Tkanki roślinne utrwalano 3% glutaraldehydem w 0,1 M buforze fosforanowym (pH 7,2) w ciągu 1,5-2 godzin w temperaturze pokojowej. Próbki przemywano cztery razy 0,1 M buforem fosforanowym (pH 7,2) i w ciągu 2 godzin utrwalano 1 % OsOą w buforze fosforanowym w temperaturze pokojowej. Tkanki odwadniano następnie w seriach stopniowo wzrastających stężeń etanolu i zatapiano w żywicy epoksydowej Spurrs. Cięto skrawki o grubości 80-90 nm, umieszczano na miedzianej siatce i barwiono 5% octanem uranylu w ciągu 30 do 45 minut, a następnie cytrynianem ołowiu według Reynoldsa w ciągu 3 do 4 minut. Skrawki oglądano w transmisyjnym mikroskopie elektronowym JEOL 100CXII działającym przy 80 kW.
inne rośliny
Chociaż opisany tu specyficzny przykład wykonania dotyczy rośliny Arabidopsis thaliana i genów Alcaligenes eutrophus, wynalazek jest ogólnie użyteczny. Zastrzeżenia odnoszące się wytwarzania polihydroksymaślanu i/lub polihydrok^^alka^^nianu w roślinach nie są organiczone do Arabidopsis thaliana, lub związane specyficznie ze stosowaniem genów Alcaligenes eutrophus. Przedstawione poniżej zastrzeżenia opisują sposób wytwarzania polihydroksdalkanonianu w roślinach poprzez wprowadzanie obcego DNA do komórek roślinnych. Rośliny takie obejmują na przykład rośliny dyskutowane uprzednio oraz marchew, słonecznik, tytoń, pomidor i ziemniak.
Nasiona różnych linii zdeponowano na warunkach Porozumienia Budapesztańskiego w American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852. Linie te obejmują RedD-3A (ATCC 75044) zawierającą gen reduktazy acetoacetylo-CoA; S8-1-2A (ATCC 75043) zawierającą gen syntazy PHB oraz T4-2A (ATCC 75042) zawierającą gen 3-1k^e^t^t^ti^^azy. Każdy z genów przedstawiono w sekwencji przedstawionej na fig. 2.
170 467 jMewolonian ^CH
CHS-CoA
3-ketotiolaza o«»»CH3 ''CHi'0 S-CoA
NAD(P)H-sg
NAD(P)^, reduktaza acetoacetylo-CoA
PH 0 pu Γ
CHC ΧΗ2 ^S-CoA syntaza PHB o
II .Cch3 o
I J II «CH-- -ł-cK n
ch3
CH
FIGURA 1
CCCGGGCAAGTACCTTGCCGACATCTATGCGCTGGCGCGCACGCGCCTGGCGCGCGCCGG
CTGTACCGAGGTCTACGGCGGCGACGCCTGCACCGTGGCCGACGCCGGTCGCTTCTACTC Ddel
121 CTATCGGCGCGATGGCGTGACCGGCCGCATGGCCAGCCTGGTCTGGCTGGCGGACTGAGC
181 CCGCCGCTGCCTCACTCGTCCTTGCCCCTGGCCGCCTGCGCGCGCTCGGCTTCAGCCTTG
241 CGTCGGCGGCGGCCGGGCGTGCCCATGATGTAGAGCACCACGCCACCGGCGCCATGCCAT
01 ACATCAGGAAGGTGGCAACGCCTGCCACCACGTTGTGCTCGGTGATCGCCATCATCAGCG
61 CCACGTAGAGCCAGCCAATGGCCACGATGTACATCAAAAATTCATCCTTCTCGCCTATGC
21 TCTGGGGCCTCGGCAGATGCGAGCGCTGCATACCGTCCGGTAGGTCGGGAAGCGTGCAGT
481 GCCGAGGCGGATTCCCGCATTGACAGCGCGTGCGTTGCAAGGCAACAATGGACTCAAATG
541 TCTCGGAATCGCTGACGATTCCCAGGTTTCTCCGGCAAGCATAGCGCATGGCGTCTCCAT
601 GCGAGAATGTCGCGCTTGCCGGATAAAAGGGGAGCCGCTATCGGAATGGACGCAAGCCAC
661 GGCCGCAGCAGGTGCGGTCGAGGGCTTCCAGCCAGTTCCAGGGCAGATGTGCCGGCAGAC
21 CCTCCCGCTTTGGGGGAGGCGCAAGCCGGGTCCATTCGGATAGCATCTCCCCATGCAAAG
FIG. 2A
BstB 1
81 TGCCGGCCAGGGCAATGCCCGGAGCCGGTTCGAATAGTGACGGCAGAGAGACAATCAAAT
841 CATGGCGACCGGCAAAGGCGCGGCAGCTTCCACGCAGGAAGGCAAGTCCCAACCATTCAA SI HATGKGAAASTQEGKSQPFK
01 GGTCACGCCGGGGCCATTCGATCCAGCCACATGGCTGGAATGGTCCCGCCAGTGGCAGGG S21 VTPGPFDPATWLEWSRQWQG
961 CACTGAAGGCAACGGCCACGCGGCCGCGTCCGGCATTCCGGGCCTGGATGCGCTGGCAGG S41 TEGNGHAAASGIPGLDALAG
Ddel
1021 CGTCAAGATCGCGCCGGCGCAGCTGGGTGATATCCAGCAGCGCTACATGAAGGACTTęTC S61 VKIAPAQLGDIQQRYMKDFS
1081 ĄGCGCTGTGGCAGGCCATGGCCGAGGGCAAGGCCGAGGCCACCGGTCCGCTGCACGACCG S81 ALWQAMAEGKAEATGPLHDR
114 1 GCGCTTCGCCGGCGACGCATGGCGCACCAACCTCCCATATCGCTTCGCTGCCGCGTTCTA S101 RFAGDAWRTNLPYRFAAAFY
01 CCTGCTCAATGCGCGCGCCTTGACCGAGCTGGCCGATGCCGTCGAGGCCGATGCCAAGAC S121 LLNARALTELADAVEADAKT
FIG. 2B
170 467
1261 CCGCCAGCGCATCCGCTTCGCGATCTCGCAATGGGTCGATGCGATGTCGCCCGCCAACTT S141 RQRIRFAISQWVDAMSPANF
1321 CCTTGCCACCAATCCCGAGGCGCAGCGCCTGCTGATCGAGTCGGGCGGCGAATCGCTGCG S161 LATNPEAQRLLIESGGESLR
81 TGCCGGCGTGCGCAACATGATGGAAGACCTGACACGCGGCAAGATCTCGCAGACCGACGA S181 AGVRNMMEDLTRGKISQTDE
1441 GAGCGCGTTTGAGGTCGGCCGCAATGTCGCGGTGACCGAAGGCGCCGTGGTCTTCGAGAA 3201 SAFEVGRNVAVTEGAVVFEN
1501 CGAGTACTTCCAGCTGTTGCAGTACAAGCCGCTGACCGACAAGGTGCACGCGCGCCCGCT S221 eyfqllqykpltdkvharpl
Pstl
61 GCTGATGGTGCCGCCGTGCATCAACAAGTACTACATCCTGGACCTGęAGCCGGAGAGCTC S241 LMVPPCINKYYILDLQPESS
1621 GCTGGTGCGCCATGTGGTGGAGCAGGGACATACGGTGTTTCTGGTGTCGTGGCGCAATCC S261 LVRHVVEQGHTVFLVSWRNP
1681 GGACGCCAGCATGGCCGGCAGCACCTGGGACGACTACATCGAGCACGCGGCCATCCGCGC S281 DASMAGSTWDDYIEHAAIRA
F IG. 2C
41 CATCGAAGTCGCGCGCGACATCAGCGGCCAGGACAAGATCAACGTGCTCGGCTTCTGCGT S301 IEVARDISGQDKINVLGFCV
1801 GGGCGGCACCATTGTCTCGACCGCGCTGGCGGTGCTGGCCGCGCGCGCCGAGCACCCGGC S321 GGTIVSTALAVLAARGEHPA
1861 CGCCAGCGTCACGCTGCTGACCACGCTGCTGGACTTTGCCGACACGGGCATCCTCGACGT S341 ASVTLLTTLLDFADTGILDV
1921 CTTTGTCGACGAGGGCCATGTGCAGTTGCGCGAGGCCACGCTGGGCGGCGGCGCCGGCGC S361 FVDEGHVQLREATLGGGAGA
1981 GCCGTGCGCGCTGCTGCGCGGCCTTGAGCTGGCCAATACCTTCTCGTTCTTGCGCCCGAA S3 81PCALLRGLELANTFSFLRPN
2041 CGACCTGGTGTGGAACTACGTGGTCGACAACTACCTGAAGGGCAACACGCCGGTGCCGTT S401 dlvwnyvvdnylkgntpvpf
2101 CGACCTGCTGTTCTGGAACGGCGACGCCACCAACCTGCCGGGGCCGTGGTACTGCTGGTA S421 DLLFWNGDATNLPGPWYCWY
Pstl
2161 CCTGCGCCACACCTACCTGCAGAACGAGCTCAAGGTACCGGGCAAGCTGACCGTGTGCGG S441 LRHTYLQNELKVPGKLTVCG
FIG. 2D
170 467
221 CGTGCCGGTGGACCTGGCCAGCATCGACGTGCCGACCTATATCTACGGCTCGCGCGAAGA S461 VPVDLASIDVPTYIYGSRED
281 CCATATCGTGCCGTGGACCGCGGCCTATGCCTCGACCGCGCTGCTGGCGAACAAGCTGCG S481 HIVPWTAAYASTALLANKLR
341 CTTCGTGCTGGGTGCGTCGGGCCATATCGCCGGTGTG ATCAACCCGCCGGCCAAGAACAA S501 FVLGASGHIAGVINPPAKKK
01 GCGCAGCCACTGGACTAACG ATGCGCTGCCGG AGTCGCCGCAGCAATGGCTGGCCGGCGC S521 RSHWTNDALPESPQQWLAGA
4 61 CATCGAGCATCACGGCAGCTGGTGGCCGG ACTGGACCGCATGGCTGGCCGGGCAGGCCGG S541 IEHHGSWWPDWTAWLAGQAG
2521 CGCGAAACGCGCCGCGCCCGCCAACTATGGCAATGCGCGCTATCGCGCAATCGAACCCGC S561 AKRAAPANYGNARYRAIEPA
581 GCCTGGGCGATACGTCAAAGCCAAGGCATGACGCTTGCATGAGTGCCGGCGTGCGTCATG S581 PGRYVKAKA*
Pstl
6 4 1 CACGGCGCCGGCAGGCCTGęĄGGTTCCCTCCCGTTTCCATTGAAAGGACTACACAATGAC jy Μ T
FIG. 2E
Tth11 1 I
7 01 TGACGTTGTCATCGTATCCGCCGCCCGCACCGCGGTCGGCAAGTTTGGCGGCTCGCTGGC T3 DVVIVSAARTAVGKFGGSLA
7 61 CAAG ATCCCGGCACCGG AACTGGGTGCCGTGGTCATCAAGGCCGCGCTGGAGCGCGCCGG T23 KI PAPELGAVVIKAALERAG
8 21 CGTCAAGCCGGAGCAGGTGAGCGAAGTCATCATGGGCCAGGTGCTGACCGCCGGTTCGGG T4 3 VKPEQVSEVIMGQVLTAGSG
81 CCAGAACCCCGCACGCCAGGCCGCGATCAAGGCCGGCCTCGGCGCG ATGGTGCCGGCCAT T63 QNPARQAAIKAGLGAMVPAM
941 GACCATCAACAAGGTGTGCGGCTCGGGCCTGAAGGCCGTG ATGCTGGCCGCCAACGCG AT
T8 3 TINKVCGSGLKAVMLAANAI
001 CATGGCGGGCGACGCCGAGATCGTGGTGGCCGGCGGCCAGGAAAACATGAGCGCCGCCCC T103 MAG DAEIVVAGGQENMSAAP
061 GCACGTGCTGCCGGGCTCGCGCGATGGTTTCCGCATGGGCGATGCCAAGCTGGTCGACAC T123 HVLPGSRDGFRMGDAKLVDT
3121 CATGATCGTCGACGGCCTGTGGGACGTGTACAACCAGTACCACATGGGCATCACCGCCGA T143 mivdglwdvynqyhmgitae
FIG. 2F
170 467
318 1 GAACGTGGCCAAGGAATACGGCATCACACGCGAGGCGCAGGATGAGTTCGCCGTCGGCTC T163 NVAKEYGITREAQDEFAVGS
2 4 1 GCAGAACAAGGCCGAAGCCGCGCAGAAGGCCGGCAAGTTTGACGAAGAGATCGTCCCGGT T183 QNKAEAAQKAGKFDEEIVPV
3 01 GCTGATCCCGCAGCGCAAGGGCGACCCGGTGGCCTTCAAGACCGACGAGTTCGTGCGCCA T203 LIPQRKGDPVAFKTDEFVRQ
3 61 GGGCGCCACGCTGGACAGCATGTCCGGCCTCAAGCCCGCCTTCGACAAGGCCGGCACGGT T223 GAT LDSMSGLKPAFDKAGTV
4 21 GACCGCGGCCAACGCCTCGGGCCTGAACGACGGCGCCGCCGCGGTGGTGGTGATGTCGGC T243 TAANASGLNDGAAAVVVMSA
4 81 GGCCAAGGCCAAGGAACTGGGCCTGACCCCGCTGGCCACGATCAAGAGCTATGCCAACGC T263 AKAKELGLTPLATIKSYANA
54 1 CGGTGTCG ATCCCAAGGTGATGGGCATGGGCCCGGTGCCGGCCTCCAAGCGCGCCCTGTC T283 GVDPKVMGHGPVPASKRALS
601 GCGCGCCGAGTGGACCCCGCAAGACCTGGACCTGATGGAGATCAACGAGGCCTTTGCCGC T303 RAEWTPQDLDLMEINEAFAA
FIG. 2G
661 GCAGGCGCTGGCGGTGCACCAGCAGATGGGCTGGGACACCTCCAAGGTCAATGTGAACGG T323 QALAVHQQMGWDTSKVHVNG
7 21 CGGCGCCATCGCCATCGGCCACCCGATCGGCGCGTCGGGCTGCCGTATCCTGGTGACGCT T343 GAIAIGHPIGASGCRILVTL
7 81 GCTGCACGAGATGAAGCGCCGTGACGCGAAGAAGGGCCTGGCCTCGCTGTGCATCGGCGG T363 LHEMKRRDAKKGLASLCIGG
8 4 1 CGGCATGGGCGTGGCGCTGGCAGTCGAGCGCAAATAAGGAAGGGGTTTTCCGGGGCCGCG T383 GMGVALAVERK*
Ddel
9 01 CGCGGTTGGCGCGGACCCGGCGACGATAACGAAGCCAATCAAGGAGTGG ACATG ACTCAG
RI Μ T Q
3961 CGCATTGCGTATGTGACCGGCGGCATGGGTGGTATCGGAACCGCCATTTGCCAGCGGCTG R4 RIAYVTGGMGGIGTAICQRL
021 GCCAAGGATGGCTTTCGTGTGGTGGCCGGTTGCGGCCCCAACTCGCCGCGCCGCGAAAAG R24 AKDGFRVVAGCGPNSPRREK
081 TGGCTGG AGCAGCAGAAGGCCCTGGGCTTCGATTTCATTGCCTCGG AAGGCAATGTGGCT R4 4WLEQQKALGFDFIASEGNVA
FIG. 2H
170 467
Tthfł 1 I
4141 GACTGGGACTCGACCAAGACCGCATTCGACAAGGTCAAGTCCGAGGTCGGCGAGGTTGAT R64 D W D S T K T A F D K V K S E V G E V O
201 GTGCTGATCAACAACGCCGGTATCACCCGCGACGTGGTGTTCCGCAAGATGACCCGCGCC R84 V L I N N A G I T R D V V F R K Μ T R A
2 61 GACTGGGATGCGGTGATCGACACCAACCTGACCTCGCTGTTCAACGTCACCAAGCAGGTG R104 DWDAVIDTNLTSLFNVTKQV
3 21 ATCGACGGCATGGCCGACCGTGGCTGGGGCCGCATCGTCAACATCTCGTCGGTGAACGGG R124 IDGMADRGWGRIVNISSVNG
381 CAGAAGGGCCAGTTCGGCCAGACCAACTACTCCACCGCCAAGGCCGGCCTGCATGGCTTC R144 QKGQFGQTNYSTAKAGLHGF
441 ACCATGGCACTGGCGCAGGAAGTGGCGACCAAGGGCGTG ACCGTCAACACGGTCTCTCCG R164 TMALAQEVATKGVTVNTVSP
Tth1111
501 GGCTATATCGCCACCGACATGGTCAAGGCGATCCGCCAGGACGTGCTCGACAAGATCGTC R184 GYIATDMVKAIRQDVLDKIV
561 GCGACGATCCCGGTCAAGCGCCTGGGCCTGCCGG AAGAGATCGCCTCG ATCTGCGCCTGG R204 ATI PVKRLGLPEEIASICAW
FIG. 2I
6 21 TTGTCGTCGGAGGAGTCCGGTTTCTCGACCGGCGCCGACTTCTCGCTCAACGGCGGCCTG R224 LSSEESGFSTGADFSLNGGL
681 CATATGGGCTGACCTGCCGGCCTGGTTCAACCAGTCGGCAGCCGGCGCTGGCGCCCGCGT R244 Η H G *
74 1 ATTGCGGTGCAGCCAGCGCGGCGCACAAGGCGGCGGGCGTTTCGTTTCGCCGCCCGTTTC
8 01 GCGGCAAGGCCCGCGAATCGTTTCTGCCCGCGCGGCNTTCCTCGCTTTTTGCGCCAATTC Ddel
8 61 ACCGGGTTTTCCTTTAAGCCCCGTCGCTTTTCTTAGTGCCTTGTTGGGCATAGAATCAGG
Pstl
921 GCAGCGGCGCAGCCAGCACCATGTTCGTGCAGCGCGGCCCTCGCGGGGGCGAGGCTGCAG
FIG. 2J
170 467
Plazmid pTZ18U-PHB
| Syntaza | Tiolaza | Reduktaza | |
| ΓΊ I I i | I I |
Ί π i i Ί τί r
D S D PS PB PT DT T
500bp Fragment Pst I-Ddel o długości 1,3kbp
I
Wypełnianie lepkich końców (polimeraza DNA T£) ł
Klonowanie w miejscu Smal wektora pUC18 —^plazmid pUC-THIO
I
Wycięcie fragmentu Barn HI-SacI
I
Klonowanie w wektorze pB1121
Plazmid PBI-THIO
FIGURA 3
170 467
Plazmid pTZ18U~PHB —C=» g=>
| Syntaza | Tiolaza | Reduktaza | |
| I I Γ 1 1 | 1 1 |
Ί Π I I Ί ΤΊ Γ
D S D PS PB PT D T T _ l
500bp Fragment Bst BI-Tthlll I o długości 1,9 kbp
I
Wypełnianie lepkich końców (polimerazą DNA T4) l
Klonowanie w miejscu Smal wektora pUCl8 —=- plazmid pUC-SYN i
Częściowe trawienie BamHI i SacI
Klonowanie w wektorze pB1121
I
Plazmid PBI-SYN
FIGURA 4
170 467
Plazmid pTZ18U~PHB
-—-c=> c=» &
| Syntaza | Tiolaza | Reduktaza | |
| I | I 1 1 | Ί | 1 1 |
ΓΠ 1 I Ί Π Γ
D E D PS PS PT D Τ T
500bc /
5'
BamH1 .
TTGGATCCAATCAAGGAGTGGAGA Starter numer 1PCR |— ----------Reduktaza--· ...........
Starter numer 2PCR 3'ghggtcagccgtcggcgccatggtt 5‘
Kgn1
Fragment PCR o długości 790bp i
Klonowanie w miejscach BamHLiKpnI wektora pUC 18 —plazmid pUC-RED l
Wycięcie BamHI-SacI t
Klonowanie w wektorze pBI 121
Plazmid PBI-RED
FIGURA 5
170 467
FIG.6A
FIG.6B
FIG.6C
946644232023946644 232023 946644 23 20fghijklmnop o b c d e fghijklmnop
FIG 7A f Q h i 1 klmnopg
FIG.7B
FIG.7C
170 467
σ
Cza $,/mi nuty/
170 467
Względna ilość Względna ilość
FIG.9A
FIG.9B
170 467
FIG. 10Α
FIG. 100
FIG.10B
170 467
FIG. DE
Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 90 egz. Cena 6,00 zł
Claims (2)
- Zastrzeżenia patentowe1. Sposób wytwarzania pobhydroksyalkanonianów, znamienny tym, że a) otrzymuje się roślinę transgeniczną przez wprowadzenie pierwszej sekwencji DNA kodującej enzym o aktywności katalitycznej ketotiolazy, drugiej sekwencji DNA kodującej enzym o aktywności katalitycznej reduktazy acetoacetylo-CoA i trzeciej sekwencji DNA kodującej enzym o aktywności katalitycznej syntazy polihydroksyalkanonianu, wśród których co najmniej druga i trzecia sekwencja DNA są ektopowe, a ekspresja sekwencji DNA prowadzi do otrzymania polihydroksyalkanonianu, albo parzy się przez zapłodnienie płciowe dwie rośliny, które nie produkują polihydroksyalkanonianu, przy czym każda z nich zawiera obce DNA kodujące jeden lub kilka różnych enzymów na szlaku prowadzącym ku polimeryzacji hydroksyalldlo-CoA przez syntazę polihydroksyalkanonianu, tak aby progeny wynikające z rozmnażania płciowego były zdolne do produkowania polihydroksyalkanonianu, korzystnie polihydroksymaślanu, a następnie b) materiał pochodzący z roślin produkujących polihydroksyalkanonian poddaje się ekstrakcji i odzyskuje się polihydroksyalkanonian.
- 2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że ekstrakcji poddaje się pohhydroksyalkanonian występujący w komórkach roślinnych w postaci granulek.
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US73224391A | 1991-07-19 | 1991-07-19 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| PL295350A1 PL295350A1 (en) | 1993-04-05 |
| PL170467B1 true PL170467B1 (pl) | 1996-12-31 |
Family
ID=24942760
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| PL92295350A PL170467B1 (pl) | 1991-07-19 | 1992-07-20 | Sposób wytwarzania polihydroksyalkanonianów PL |
Country Status (22)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5650555A (pl) |
| EP (1) | EP0595896B1 (pl) |
| JP (1) | JP3696233B2 (pl) |
| AT (1) | ATE295891T1 (pl) |
| AU (1) | AU671953B2 (pl) |
| BE (1) | BE1006851A5 (pl) |
| BR (1) | BR9206297A (pl) |
| CA (1) | CA2113412C (pl) |
| CZ (1) | CZ10894A3 (pl) |
| DE (1) | DE69233512T2 (pl) |
| ES (1) | ES2046142B1 (pl) |
| FI (1) | FI120353B (pl) |
| FR (1) | FR2679735A1 (pl) |
| HU (1) | HUT66825A (pl) |
| IT (1) | IT1255348B (pl) |
| MX (1) | MX9204245A (pl) |
| NL (1) | NL195045C (pl) |
| NZ (1) | NZ243626A (pl) |
| PL (1) | PL170467B1 (pl) |
| PT (1) | PT100705B (pl) |
| SK (1) | SK6494A3 (pl) |
| WO (1) | WO1993002187A1 (pl) |
Families Citing this family (62)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5245023A (en) | 1987-06-29 | 1993-09-14 | Massachusetts Institute Of Technology | Method for producing novel polyester biopolymers |
| GB9108756D0 (en) | 1991-04-24 | 1991-06-12 | Ici Plc | Production of polyalkanoate in plants |
| ATE295891T1 (de) * | 1991-07-19 | 2005-06-15 | Univ Michigan State | Transgene pflanzen die polyhydroxyalkanoate produzieren |
| US5610041A (en) * | 1991-07-19 | 1997-03-11 | Board Of Trustees Operating Michigan State University | Processes for producing polyhydroxybutyrate and related polyhydroxyalkanoates in the plastids of higher plants |
| AU5676394A (en) * | 1992-11-20 | 1994-06-22 | Agracetus, Inc. | Transgenic cotton plants producing heterologous bioplastic |
| US5942597A (en) * | 1995-08-21 | 1999-08-24 | The Procter & Gamble Company | Solvent extraction of polyhydroxyalkanoates from biomass |
| US6083729A (en) * | 1995-10-26 | 2000-07-04 | Metabolix, Inc. | Methods for isolating polyhydroxyalkanoates from plants |
| US5849894A (en) * | 1995-11-29 | 1998-12-15 | Monsanto Company | Rhodospirillum rubrum poly-β-hydroxyalkanoate synthase |
| WO1997022711A1 (en) | 1995-12-19 | 1997-06-26 | Regents Of The University Of Minnesota | Metabolic engineering of polyhydroxyalkanoate monomer synthases |
| US5821299A (en) * | 1996-02-16 | 1998-10-13 | The Proctor & Gamble Company | Solvent extraction of polyhydroxy-alkanoates from biomass facilitated by the use of marginal nonsolvent |
| JP3062459B2 (ja) * | 1996-08-14 | 2000-07-10 | 理化学研究所 | ポリエステル重合酵素遺伝子及びポリエステルの製造方法 |
| WO1999000505A1 (en) | 1997-06-30 | 1999-01-07 | The Curators Of The University Of Missouri | Use of dna encoding plastid pyruvate dehydrogenase and branched chain oxoacid dehydrogenase components to enhance polyhydroxyalkanoate biosynthesis in plants |
| AU725516B2 (en) * | 1997-09-19 | 2000-10-12 | Metabolix, Inc. | Biological systems for manufacture of polyhydroxyalkanoate polymers containing 4-hydroxyacids |
| AU5907198A (en) * | 1998-01-05 | 1999-07-26 | Monsanto Company | Biosynthesis of medium chain length polyhydroxyalkanoates |
| CA2317314C (en) | 1998-01-07 | 2003-12-30 | Metabolix, Inc. | Animal nutrition compositions |
| US6586658B1 (en) | 1998-03-06 | 2003-07-01 | Metabolix, Inc. | Modification of fatty acid metabolism in plants |
| US6143952A (en) * | 1998-03-31 | 2000-11-07 | Regents Of The University Of Minnesota | Modified pseudomonas oleovorans phaC1 nucleic acids encoding bispecific polyhydroxyalkanoate polymerase |
| US6103956A (en) * | 1998-03-31 | 2000-08-15 | Regents Of The University Of Minnesota | Polyhydroxyalkanoate synthesis in plants |
| JP2002510747A (ja) | 1998-04-08 | 2002-04-09 | メタボリックス，インコーポレイテッド | バイオポリマーの分離および精製のための方法 |
| JP2000189170A (ja) * | 1998-05-08 | 2000-07-11 | Daicel Chem Ind Ltd | 光学活性４―ハロ―３―ヒドロキシ酪酸エステルの製造方法 |
| EP1100928B1 (en) * | 1998-07-30 | 2006-02-01 | Metabolix, Inc. | Bifunctional enzymes for biopolymer production |
| DE19834608A1 (de) | 1998-07-31 | 2000-02-03 | Basf Ag | Kristallmodifikation der Liponsäure |
| MXPA01001111A (es) | 1998-08-04 | 2002-04-24 | Metabolix Inc | Produccion de polihidroxialcanoato a partir de polioles. |
| US6077931A (en) * | 1998-12-21 | 2000-06-20 | The Procter & Gamble Company | Biodegradable PHA copolymers |
| US6160199A (en) * | 1998-12-21 | 2000-12-12 | The Procter & Gamble Company | Absorbent articles comprising biodegradable PHA copolymers |
| US6174990B1 (en) | 1998-12-21 | 2001-01-16 | The Procter & Gamble Company | Films comprising biodegradable PHA copolymers |
| WO2000052183A1 (en) * | 1999-03-05 | 2000-09-08 | Monsanto Technology Llc | Multigene expression vectors for the biosynthesis of products via multienzyme biological pathways |
| ES2243235T3 (es) | 1999-03-15 | 2005-12-01 | Universite Laval | Metodo para la produccion de polihidroxialcanoatos en organismos recombinantes. |
| US6451564B1 (en) | 1999-07-02 | 2002-09-17 | Massachusetts Institute Of Technology | Methods for producing L-isoleucine |
| US6475734B1 (en) * | 1999-09-29 | 2002-11-05 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Polyhydroxyalkanoate synthase genes |
| US20020169297A1 (en) | 2000-10-20 | 2002-11-14 | Susheng Gan | Genetic insulator for preventing influence by another gene promoter |
| US6806401B2 (en) * | 2000-12-27 | 2004-10-19 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | OAR polynucleotides, polypeptides and their use in PHA production in plants |
| US6822142B2 (en) | 2001-01-05 | 2004-11-23 | Monsanto Company | Transgenic plants containing altered levels of steroid compounds |
| AU2002251830A1 (en) * | 2001-01-26 | 2002-08-06 | Colorado State University Research Foundation | Analysis of gene expression and biological function using optical imaging |
| DE10254165A1 (de) | 2002-11-20 | 2004-06-03 | Icon Genetics Ag | Verfahren zur Kontrolle eines zellulären Prozesses in einem multizellulären Organismus |
| US7581543B2 (en) | 2004-04-14 | 2009-09-01 | Philip Morris Usa Inc. | Reduction of phenolic compound precursors in tobacco |
| TW200613560A (en) * | 2004-06-29 | 2006-05-01 | Procter & Gamble | Solvent extraction of polyhydroxyalkanoates from biomass |
| US20060057691A1 (en) * | 2004-09-15 | 2006-03-16 | Karunakaran Narasimhan | Process for the extraction of polyhydroxyalkanoates from biomass |
| JP2009509530A (ja) * | 2005-09-27 | 2009-03-12 | ヘルムート アダム レフム，ベルン | ポリマー粒子およびその使用 |
| EP3214179B1 (en) | 2007-03-16 | 2021-03-03 | Genomatica, Inc. | Compositions and methods for the biosynthesis of 1,4-butanediol and its precursors |
| US7947483B2 (en) | 2007-08-10 | 2011-05-24 | Genomatica, Inc. | Methods and organisms for the growth-coupled production of 1,4-butanediol |
| WO2009145840A2 (en) * | 2008-04-04 | 2009-12-03 | Massachusetts Institute Of Technology | Cellular production of hydroxyvalerates from levulinate |
| EP3514242A3 (en) | 2008-09-10 | 2019-08-28 | Genomatica, Inc. | Microrganisms for the production of 1,4-butanediol |
| MY149457A (en) * | 2008-12-29 | 2013-08-30 | Eyal Res | Integrated methods for processing palm fruit bunches |
| WO2010141920A2 (en) | 2009-06-04 | 2010-12-09 | Genomatica, Inc. | Microorganisms for the production of 1,4-butanediol and related methods |
| EP3199511B1 (en) * | 2009-06-04 | 2020-01-29 | Genomatica, Inc. | Process of separating components of a fermentation broth |
| CN105441374A (zh) * | 2009-10-13 | 2016-03-30 | 基因组股份公司 | 生产1,4-丁二醇、4-羟基丁醛、4-羟基丁酰-coa、腐胺和相关化合物的微生物及其相关方法 |
| US8530210B2 (en) | 2009-11-25 | 2013-09-10 | Genomatica, Inc. | Microorganisms and methods for the coproduction 1,4-butanediol and gamma-butyrolactone |
| CA2788596A1 (en) | 2010-02-11 | 2011-08-18 | Metabolix, Inc. | Process for producing a monomer component from a genetically modified polyhydroxyalkanoate biomass |
| US8445244B2 (en) | 2010-02-23 | 2013-05-21 | Genomatica, Inc. | Methods for increasing product yields |
| US8048661B2 (en) | 2010-02-23 | 2011-11-01 | Genomatica, Inc. | Microbial organisms comprising exogenous nucleic acids encoding reductive TCA pathway enzymes |
| EP2625179A2 (en) * | 2010-10-08 | 2013-08-14 | Cadila Healthcare Limited | Process for preparing an intermediate of sitagliptin via enzymatic conversion |
| CN104685058B (zh) | 2012-06-04 | 2020-07-07 | 基因组股份公司 | 制造4-羟基丁酸酯、1，4-丁二醇和相关化合物的微生物和方法 |
| EP3529296A1 (en) | 2016-10-18 | 2019-08-28 | Meredian Bioplastics, Inc. | Crystal nucleating agents for polyhydroxyalkanoates |
| CA3190297A1 (en) | 2020-07-30 | 2022-02-03 | Meredian, Inc. | Biobased material for consumer goods packaging |
| US11584110B2 (en) | 2020-07-30 | 2023-02-21 | Pepsico, Inc. | Multi-layered packaging films |
| AU2021347979A1 (en) | 2020-09-24 | 2023-06-08 | Danimer Ipco, Llc | Biodegradable containers and resin therefor |
| AU2021349252A1 (en) | 2020-09-24 | 2023-06-08 | Danimer Ipco, Llc | Biodegradable container closure and resin therefor |
| AU2021347248A1 (en) | 2020-09-24 | 2023-06-08 | Danimer Ipco, Llc | Pre-forms for making biodegradable containers and resin therefor |
| CA3193672A1 (en) | 2020-09-24 | 2022-03-31 | Satyabrata Samanta | Biodegradable labels and resin therefor |
| CA3230745A1 (en) | 2021-09-22 | 2023-03-30 | Laurent HENRIQUEL | Method for manufacturing a pha container |
| WO2024163714A1 (en) | 2023-02-03 | 2024-08-08 | Danimer Ipco, Llc | Biodegradable test kit |
Family Cites Families (10)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5229279A (en) * | 1987-06-29 | 1993-07-20 | Massachusetts Institute Of Technology | Method for producing novel polyester biopolymers |
| US5250430A (en) * | 1987-06-29 | 1993-10-05 | Massachusetts Institute Of Technology | Polyhydroxyalkanoate polymerase |
| US5245023A (en) * | 1987-06-29 | 1993-09-14 | Massachusetts Institute Of Technology | Method for producing novel polyester biopolymers |
| AT397771B (de) * | 1988-07-25 | 1994-06-27 | Tyrolia Freizeitgeraete | Vorrichtung zur montage von skibindungen |
| JPH05500751A (ja) * | 1989-07-10 | 1993-02-18 | マサチューセッツ インスティテュート オブ テクノロジー | 新規なポリエステルバイオポリマー |
| GB9108756D0 (en) * | 1991-04-24 | 1991-06-12 | Ici Plc | Production of polyalkanoate in plants |
| GB9115245D0 (en) * | 1991-07-16 | 1991-08-28 | Ici Plc | Production of polyalkanoate |
| ATE295891T1 (de) * | 1991-07-19 | 2005-06-15 | Univ Michigan State | Transgene pflanzen die polyhydroxyalkanoate produzieren |
| GB9223332D0 (en) * | 1992-11-06 | 1992-12-23 | Ici Plc | Production of polyhydroxyalkanoate in plants |
| GB9306490D0 (en) * | 1993-03-29 | 1993-05-19 | Zeneca Ltd | Plant gene specifying acetyl,coenzyme a carboxylase and transformed plants containing same |
-
1992
- 1992-07-13 AT AT92915635T patent/ATE295891T1/de active
- 1992-07-13 AU AU23238/92A patent/AU671953B2/en not_active Expired
- 1992-07-13 SK SK64-94A patent/SK6494A3/sk unknown
- 1992-07-13 CZ CS94108A patent/CZ10894A3/cs unknown
- 1992-07-13 WO PCT/US1992/005786 patent/WO1993002187A1/en active IP Right Grant
- 1992-07-13 HU HU9400145A patent/HUT66825A/hu unknown
- 1992-07-13 BR BR9206297A patent/BR9206297A/pt not_active IP Right Cessation
- 1992-07-13 DE DE69233512T patent/DE69233512T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1992-07-13 EP EP92915635A patent/EP0595896B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1992-07-13 JP JP50286693A patent/JP3696233B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 1992-07-13 CA CA002113412A patent/CA2113412C/en not_active Expired - Lifetime
- 1992-07-17 ES ES09201500A patent/ES2046142B1/es not_active Expired - Fee Related
- 1992-07-17 PT PT100705A patent/PT100705B/pt not_active IP Right Cessation
- 1992-07-17 IT ITMI921750A patent/IT1255348B/it active IP Right Grant
- 1992-07-17 NL NL9201288A patent/NL195045C/nl not_active IP Right Cessation
- 1992-07-20 MX MX9204245A patent/MX9204245A/es unknown
- 1992-07-20 BE BE9200673A patent/BE1006851A5/fr not_active IP Right Cessation
- 1992-07-20 PL PL92295350A patent/PL170467B1/pl unknown
- 1992-07-20 FR FR9208949A patent/FR2679735A1/fr active Granted
- 1992-07-20 NZ NZ243626A patent/NZ243626A/en unknown
-
1994
- 1994-01-18 FI FI940242A patent/FI120353B/fi not_active IP Right Cessation
-
1995
- 1995-06-07 US US08/472,358 patent/US5650555A/en not_active Expired - Lifetime
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| PL170467B1 (pl) | Sposób wytwarzania polihydroksyalkanonianów PL | |
| US6495740B1 (en) | Manipulation of cellulose and/or β-1,4-Glucan | |
| Kriegshauser et al. | Function of the HYDROXYCINNAMOYL-CoA: SHIKIMATE HYDROXYCINNAMOYL TRANSFERASE is evolutionarily conserved in embryophytes | |
| Malik et al. | Production of high levels of poly‐3‐hydroxybutyrate in plastids of C amelina sativa seeds | |
| EP0719342A1 (en) | Processes for producing polyhydroxybutyrate and related polyhydroxyalkanoates in the plastids of higher plants | |
| WO1998046776A9 (en) | Plant fatty acid synthases and use in improved methods for production of medium-chain fatty acids | |
| AU5676394A (en) | Transgenic cotton plants producing heterologous bioplastic | |
| JPH11506323A (ja) | 酵母ｓｌｃ遺伝子を用いての植物脂質及び種子油の変更 | |
| CN101048507B (zh) | 一种增大种子大小的方法 | |
| US20020066123A1 (en) | Fatty acid elongases | |
| US5859342A (en) | Antisense nucleotide sequences affecting fatty acid catabolism in plants | |
| MXPA00008674A (es) | Modificacion de metabolismo de acidos grasos en plantas. | |
| US7214859B2 (en) | Brassica pyruvate dehydrogenase kinase gene | |
| Rose et al. | Function of the HYDROXYCINNAMOYL-CoA: SHIKIMATE HYDROXYCINNAMOYL TRANSFERASE is evolutionarily conserved in embryophytes | |
| AU720423B2 (en) | Manipulation of cellulose and/or beta-1,4-glucan | |
| WO2023196865A2 (en) | Methods and compositions for producing plants having high vegetative fatty acids | |
| Ye et al. | Construction of plant seed-specific expression vectors pSCB and pSCAB and the obtainment of transgenic Brassica napus H165 expressing poly-3-hydroxybutyrate synthetic genes | |
| Rathnayaka et al. | Down-Regulation of CELLULOSE SYNTHASE Expression in Arabidopsis Seeds as a Possible Means of Increasing Seed Oil and Protein Content, and Reducing Fibre Content | |
| US20050125858A1 (en) | Oil biosynthesis | |
| Kriegshauser et al. | HYDROXYCINNAMOYL-CoA: SHIKIMATE HYDROXYCINNAMOYL TRANSFERASE is evolutionarily conserved in embryophytes | |
| EP1624066A2 (en) | Plant fatty acid synthases and use in improved methods for production of medium-chain fatty acids | |
| PL198868B1 (pl) | Sposób wytwarzania lnu o podwyższonym poziomie polihydroksymaślanu |