JPH05500751A - 新規なポリエステルバイオポリマー - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 新規なポリエステルバイオポリマー Ｉ豆些互１ Ｎａｔｉｏｎａｌ　＋ｎ５ｔｔｔｕｔｅ　ｏｆ　）ｌｅａｌｔｈ、海軍研究機関 、および国立科学基金からの助成金の規定により、米国政府は本発明に権利を有 する。

細菌による合成は、これまで長い間、多くのより複雑なバイオポリマーを産生ず る手段でしかなかった。最近になってようやく、これらのバイオポリマーの合成 経路が確かめられた。これら経路に関係する様々な酵素および補助因子の単離に 多くの努力が払われた。これらの発現の調節は主として経験上のものであった。

即ち、栄養分濃度や酸素のようなその他の因子のレベルを変化させて、ポリマー の産生および組成が測定された。

これらの複雑なバイオポリマーの産生を制御し、それを特定の様式に改変するた め、これらの合成に必要な化学反応工程を調べる以下の系を設計することが必要 である；これらの化学反応工程に寄与するタンパク質を単離し、特徴付けること ；これらのタンパク質をフードする遺伝子を単離し、配列決定し、クローニング すること：およびこれらの遺伝子の発現割合および発現１ノベルを調節するメカ ニズノ・を同定し、特徴付け、利用すること。

商業上有用な複雑なバイオポリマーであるポリヒドロキシブチレートは、多数の 細菌が産生ずる細胞間保持物質である。

ポリ−β−ヒドロキシブチレート（ＰＩ（Ｂ）はＤ（−）−３−ヒドロキシブチ レートの重合したエステルであり、１９２５年にＢａｃｉｌｌｕｓ　ｍｅｇａｔ ｅｒｉｕｍで最初に発見された。この独特のポリエステルは、その化学的性質お よび物理的性質の両者のために、さらに進んだ研究の対象として注目されるバイ オポリマーになった。

ＰＨＢは生分解性／熱可型性材料として、ある種の抗生物質の有機合成のための キラル中心として、およびドラッグデリバリ−と骨の置換のためのマトリックス としての用途を含む、様々な応用か可能である。このポリマーはインビボの体内 で、ヒト血液の正常な構成成分であるヒドロキシブチレートに分解される。

Ｃ２生合成中間体のアセチルＣｏＡからの疎水性結晶性ＰＩ（８粒子の酵素的合 成は、多数の細菌で研究されてきた。アセチルＣ。

ＡからＰＨＢへの変換には、βケトチオラーゼ、アセトアセチルＣｏＡレタクタ ーゼおよびＰＨＢポリメラーゼの３つの酵素が関与する。

チオラーゼは炭素−炭素結合の合成および開裂を触媒する遍在性酵素であり、従 って細胞内代謝において中心的役割を占める。テルペノイド、ステロイド、マク ロライドおよび他の生合成経路と、脂肪酸の分解とには、異なるチオラーゼ酵素 が関与する。Ｚ、　ｒａｍｉｇｅｒａでは、２つのアセチルＣｏＡ基が縮合して アセトアセチルＣｏＡを形成するのをβケトチオラーゼが触媒する。次にアセト アセチルＣｏＡはＮＡＤＰ特異的レダクターゼで還元されて、ＰＨＢポリメラー ゼの基質であるＤ（−）−β−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡが形成される。

βケトチオラーゼ（アセチル−ＣｏＡ−ＣｏＡ−Ｃ−アセチルトランスフェラー ゼ、Ｅ、Ｃ，２，３，１，９）は、Ａ、　ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉｉ（Ｓｅｎｉ ｏｒおよびＤａｗｅｓ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｊ、、　１３４．２２５−２３８（ １９７３））、　Ａ、　ｅｕｔｒｏｐｈｕｓ（ＯｅｄｉｎｇおよびＳｃｈｌｅｇ ｅｌ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ　Ｊ、、１３４．　２３９−２４８（１９７３））、　 Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ　ｐａｓｔｅｕｒｉａｎｕｍ（ＢｅｒｎｔおよびＳｃｈ ｌｅｇｅｌ、　ＡｒＣｈｌＭｉＣｍｉｇｅｒａのアセトアセチル−ＣｏＡレダク ターゼ遺伝子のクローニングおよび発現は米国特許出願第０６７、６９５号に記 載されている。

次にこの遺伝子は、Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ　ｅｕｔｒｏｐｈｕｓおよびＮｏｃ ａｒｄｉａを含む他の細菌種からレダクターゼ遺伝子を単離するための７・イブ リダイズ用プローブとして用いられた。

Ｚ、　ｒａｍｉｇｅｒａでＰＨＢ生合成に関与するレダクターゼはヒドロキシブ チリル−ＣｏＡのＤ（−）異性体に立体特異的であり、補助因子としてもっばら ＮＡＤＰ（Ｈ）を利用する。最もよく特徴付けられたアセトアセチルＣｏＡレダ クターゼは、５ａｉｔｏら、　Ａｒｃｈ、　Ｍｉｃｒｏｂｏｌｌａｎｄ、１９８ ３）により記載されたＺｏｏｇｌｏｅａ由来のものである。

このＮＡＤＰ特異的な分子量９２．０００の酵素はＦｕｋｕｉら、　Ｂｉｏｃｈ ｉｍ肛匹追１工穎ｔａ　９１７．３６５−３７１（１９８７）により、少量では あるが均一にまで精製された。米国特許出願第０６７、６９５号に記載されたよ うに、Ｚ、　ｒａｍｉｇｅｒａ由来のβケトチオラーゼ酵素は今日ではクローニ ングされ、発現され、その精製物は均一にまで精製されている。クローニングさ れた遺伝子は、ＡｌｃａｌｉｇｅｎｅｓｅｕｔｒｏｐｈｕｓおよびＮｏｃａｒｄ ｉａを含む他の細菌種から相当するβケトチオラーゼを同定および単離するのに 用いられた。

Ｚ、ｒａｍｉｇｅｒａのＰＨＢポリメラーゼはＤ−β−ヒドロキシブチリルＣｏ Ａに対して立体特異的である。Ａ、　ｅｕｔｒｏｐｈｕｓは他の基質、例えばＤ −β−ヒドロキシバレリルＣｏＡを使用し得る。Ａ、　ｅｕｔｒｏｐｈＵＳの培 地にプロピオネートを添加すると、Ｃ５とＣ４ユニットのＰＨＢ／ＨＶコポリマ ーへの取り込みが起こるからである。ＧｒｉｅｂｅｌおよびＭｅｒｒｉｃｋ、　 Ｊ、　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、、　１０８．７８２−７８９（１９７１）はＢ、　 ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍの天然のＰ）１８粒子からＰＨＢポリメラーゼを分離した が、その過程で酵素活性はすべて消失した。彼らは２つのタンパク質分画の１つ へＰＨ８粒子を添加することによってのみ、活性を再構築し得た。より最近、Ｆ ｕｋｕｉら、　Ａｒｃｈ、　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、、１１０．　１４９−１５６ （１９７５）およびＴｏｍｉｔａら（１９８３）はＺ、　ｒａｍｉｇｅｒａにこ の酵素を発見し、粒子に結合しないＰＨＢポリメラーゼに部分精製した。クロー ニングし、発現させ、新規なポリマーの合成にその産生物を用いる方法は米国特 許出願第０６７、６９５号にｇ己載されている。

Ａ、　ｅｕｔｒｏｐｈｕｓおよびＰ、　ｏｌｅｏｖａｒａｎｓを含む細菌により 産生されるポリヒドロキンアルカノエート（ＰＨＡ）貯蔵ポリマーの全範囲か見 いだされている。ＰＨＡポリマーは、側鎖の長さに変異を有する（ＣＨ３〜ＣＨ ８ＨＩ７）βヒドロキシアルカノエートのＤ−異性体のへテロポマーである。例 えば、Ａ、　ｅｕｔｒｏｐｈｕｓは５−クロロペンタン酸の存在下で生育させる と、３−ヒドロキシブチレート、３−ヒドロキシバレレートおよび５−ヒドロキ シバレレートをポリマーに取り込む。

このポリマーは古典的な発酵法で非常に高収量か得られること、および１０．０ ００よりも大きい分子量のＰＨＡおよびＰＨＢは多くの応用に有用であるという 事実から、新規なＰＨＢ様バイオポリマーを開発して応用分野を改善、または新 たに作り出すことか望まれている。

ＰＨＢ以外のポリ−β−ヒドロキシアルカノエートの、Ａ、　ｅｕｔｒｏｐｈｕ ｓおよびＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｏｌｅｏｖａｒａｎｓの単一培養による産生 は、ｄｅｓｍｅｔら、　Ｊ、　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、、　１５４．８７０−８７ ８　（１９８３）により報告されている。両方の細菌で、ポリマーは制御された 発酵により産生じた。Ａ、　ｅｕｔｒｏｐｈｕｓはグルコースとプロピオネート 下で生育させるとＰＨＢ−Ｐ）ｔＶのヘテロポリマーを産生じ、ＰＨＶ含有量は 約３０％に達する。Ｐ、　ｏｌｅｏｖａｒａｎｓはオクタン下で生育させるとポ リ−β−ヒドロキシオクタノエートを産生ずる。Ｎｏｃａｒｄｉａはｎ−ブタン 下で生育させるとＰＨＢ−ＰＨ−２〜ブテノエートのコポリマーを産生ずること が報告されている。選択された基質を用いる制御発酵により得られる３−ヒドロ キシブチレートポリマーの最終組成の決定もまた、Ｈｏｌｍｅｓらの米国特許第 ４．４７７、６５４号に記載されている。

基質特異性に関して異なる様々な酵素の利用を可能にし、これらの酵素をコード する遺伝子を他の宿主、特に植物で発現させる方法により、現在利用可能な石油 由来のプラスチックス、特にポリプロピレンの経済的な生体分解性代替物を提供 することが可能となる。

従って、本発明の目的は、複合バイオポリマー、特にＰＨＢ。

ＰＨＡおよび類似ポリマーの合成方法に用いられる酵素をさらに提供することで ある。

本発明の目的はさらに、これらのポリマー合成タンパク［をコードする他の遺伝 子を単離し、配列決定し、クローニングすること、およびこれらの遺伝子の発現 速度と発現レベルを調節する手段である。

本発明の他の目的は、ポリヒドロキシブチレートおよびポリヒドロキシアルカノ エートを合成するタンパク質をコードする遺伝子から発現する、精製されたタン パク質を提供することである。

本発明の目的はさらに、これらのタンパク質および調節配列を用いて、ポリエス テル骨格を有する新規なバイオポリマーを創製する方法を提供することである。

さらに本発明の目的は一１細菌および植物細胞を製造に用い、生体分解性ポリヒ ドロキシアルカノエートおよび新規な関連ポリマーの経済的な供給源を提供する ことである。

１豆旦！亙 ポリヒドロキンブチレート＜ＰＨＢ）およびポリヒドロキシアルカノニー）　（ ＰＨＡ）ポリエステル合成の遺伝子および酵素を、原核細胞および真核細胞、特 に植物で分子レベルで操作することにより、バイオポリマー合成を制御し改変す る方法。

ＰＨＢおよびＰＨＡポリマーの産生に関与する遺伝子の単離、特徴付け、および 発現が例示されている。Ｚｏｏｇｌｏｅａ　ｒａｍｉｇｅｒａ株１−１６−Ｍ、 Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ　ｅｕｔｒｏｐｈｕｓ、　Ｎｏｃａｒｄｉａ　ｓａｌｍ ｏｎｉｃｏｌｏｒ。

およびＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｏｌｅｏｖａｒａｎｓ由来のＰＨ８およびＰＨ Ａ合成経路の酵素（β−ケトチオラーゼ、アセトアセチル−ＣｏＡ’Ｊタクター ゼおよびＰＨＢポリメラーゼあるい、はＰＩ（Ａポリメラーゼ）をコードする遺 伝子が、ＰＨＢを産生じない生物であるＥ、　ｃｏｌ　ｉで確認または単離され 、発現された。

細菌細胞を用いた好ましい実施態様では、窒素またはリン酸制限条件下でＰＨＢ を乾燥細胞重量の７０％から８０％まで蓄積する能力のあるＡ、　ｅｕｔｒｏｐ ｈｕｓにより産生される。他の実施例では、ＰＨＢ、　ＰＩ（Ａおよび新規ポリ マーの発現および合成のために、遺伝子が植物細胞に導入される。ポリマーの特 定の改変には、ポリマー鎖の長さの変化、およびポリマーに異なるモノマーを組 み入れて物理的性質の異なるコポリマーを製造することが含まれる。

・　の　な３日 図１はＺｏｏｇｌｏｅａ　ｒａｍｉｇｅｒａ由来のチオラーゼの遺伝子配列であ る。転写開始部位（太い矢印）の上流（−１００から−９５、および−１２２か ら−１１６）で、Ｅ、　ｃｏｌｉ−１０−および−３５”コンセンサス領域と相 同な位置にある配列を下線で示す。おそらくリポソーム結合部位と考えられる部 位を下線で示す（−１１から−８）。

図２はクローンｐＵＣＤＢＫ　１のチオラーゼ遺伝子の下流にある、アセトアセ チルＣｏＡレダクターゼをコードするＺ、　ｒａｍｉｇｅｒａ　ＤＮＡの２．３ ｋｂの完全なヌクレオチド配列である。初めの坦１部位から次の担１部位まで伸 びる２０９４ｂｐの配列が示されている。

ヌクレオチド３７のＡＴＧからヌクレオチド７６０のＴＧＡ終止コドンまで伸び るアセトアセチルＣｏＡレダクターゼ構造遺伝子の翻訳産物も示す。四角で囲ん だアミノ酸残基２位から６位は、精製タンパク質のエドマン分解で得られる配列 と同一である。可能なリポソーム結合部位を下線で示し、可能なターミネータ− は矢印で示す。Σ１，１および石１の制限酵素部位が示されている。

図３はプラスミドｐＡｅＴ３にクローニングされたＡ、　ｅｕｔｒｏｐｈｕｓＤ ＮＡの、相当する２ｋｂ断片のヌクレオチド配列を示す。それぞれヌクレオチド ４０〜１２１９および１２９６〜２０３４に伸びるＡ、ｅｕｔｒ。

ｐｈｕｓチオラーゼとアセトアセチルＣｏＡリダクターゼ遺伝子との転写産物を 示す。過剰産生ベクターｐＡＴおよびｐＡＲの構築に用いた制限エンドヌクレア ーゼ開裂部位を示す。Ｐｓｔｌ＝Ｐｓｔｌ；　Ａｖａ＝２およびＤｄｅ＝Ｄｄｅ １゜ 図４はＡｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ　ｅｕｔｒｏｐｈｕｓ　Ｈ２ＳのＰＨＢボリメラ ーセ（ｌ１Ｃ）遺伝子座のヌクレオチド配列である。オープンリーディングフレ ーム８４２位から２６０８位の転写産物で、推定するＰＨ８ポリメラーゼのアミ ノ酸配列を示す。■Ａ遺伝子の最初の７２個のヌクレオチドの転写産物も示す。

ヘアピン構造を形成可能な配列（２６６０位）を矢印で示す。

図５はＰ、　ｏｌｅｏｖａｒａｎｓ　ＰＨＡポリメラーゼ遺伝子の可能なコーデ ィング領域、オーブンリーディングフレーム０ＲＦＩ、ＯＲＦ２、および０ＲＦ ３を示す。０ＲＦＩは開始コドンＡＴＧのヌクレオチド５５４に始まって終止コ ドンＴＧＡのヌクレオチド２２３１に終わり、アミノ酸５５９個からなるＭｒ＝ ６２．３００ダルトンのポリペプチドをコードする。０ＲＦ２は開始コドンＡＴ Ｇのヌクレオチド２２９７に始まってＴＡＡのヌクレオチド３１４６に終わり、 アミノ酸２８３個からなるＭｒ＝３１．４００ダルトンのタンパク質をコードす る。０ＲＦ３はＡＴＧのヌクレオチド３２１７に始まってＴＧＡのヌクレオチド ４９４８に終わり、アミノ酸５５７個からなるＭｒ＝６４．４００ダルトンのタ ンパク質をコードする。

図６はＰ、　ｏｌｅｏｖａｒａｎｓ　巴Ｃ遺伝子を含有する６ｋｂ断片の完全な ヌクレオチド配列分析である。

ｌ肘見１ｉ〜免説」弓。

以下の方法は、βケトチオラーゼ、アセトアセチルＣｏＡレダクターセ、ＰＨＢ ポリメラーゼ、およびＰＨＡポリメラーゼをコードする遺伝子とそれらの発現産 物とを単離し、その発現を調節する配列を同定し、特徴付け、ぞしてポリマー産 生に対する培養条件および使用基質の影響を調へるために用いられた。

ＰＨ８およびＰＨＡ様バイオポリマーを製造する系を構築する技法もまた開示さ れている。これらの酵素を細菌または植物細胞で組み合わせ、適当な酸素および 温度の制御培養条件下に適当な基質を用いることにより、様々なポリマーを作成 できる。

これらの発現を調節する酵素またはヌクレオチド配列もまた、発現量を変え、ま たは基質特異性を変光で得られるポリマーをさらに変化させるために改変するこ とが可能である。その効果は、完全細胞を用いては通常利用できなかった基質が 、単離された酵素を用いることにより製造可能であることである。

方法、遺伝子、およびこれらの発現産物およびポリマー合成は以下の実施例に詳 細が記載されているが、それに限定さＰ＋ｉＢ生合成経路の遺伝学的研究のため に、まず初めにＺｏｏｇｌｏｅａ　ｒａｍｉｇｅｒａ株１−１６Ｍ（ＡＴＣＣ１ ９６２３）を用いた。Ｚ、　ｒａｍｉｇｅｒａ　ＤＮＡは２００ｍ１の対数増殖 期中期の培養物から、以下のように精製した。細胞を遠心して集め、２０ｍＭの Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、　ｐＨ８，２で洗浄し、１０ｍｊのＴｒｉｓ−ＨＣＩに再懸 濁した。次に１０ｍ１の２４％ｗ／ｖポリエチし・ングリコール８０００および ２ｍｌの２５ｍｇ／＋ｎｌリゾチームを加え、次に３７℃で３０分インキュベー トシて、細胞をスフェロプラストにした。スフェロプラストを遠心して集め、５ ｍｌのＴＥ緩衝液（１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８，０，１ｍＭのＥ　Ｄ ＴＡ　）に再懸濁し、３００μｌの１０％ｗ／ｖ　ＳＤＳを添加し、５５°Ｃで １０分間インキュベート・し７て細胞を溶解した。１０ｍ１のＴＥをさらに添加 し、細胞溶解物をＲＮＡ５ｅ（５０Ｍｇ／ｍｌ）およびプロティナーゼＫ　（３ ０Ｍｇ／ｍｌ）と共に３７℃で１時間インキュベートした。次にＤＮＡをＣｓＣ １密度勾配遠心により精製した。

Ｅ、　ｃｏｌｉ株はＬＢ　（Ｌｕｒｉａ　Ｂｅｒｔａｎｉ）培地（ＮａＣＩ、１ ０ｇ／ｌ：　トリプトン、１０ｇ／１．　イースト抽出物、ｌｏｇ／ｌ）または ２ＸＴＹ培地（ＮａＣＩ、５ｇ／ｌ　Ｉ−＋）ブトン、１５　ｇ／　１　：　イ ースト抽出物、ｌｏｇ／ｌ）ｉ：生育させた。組換えプラスミドを含有するＥ、 　ｃｏｌｉによる、ＰＨＢまたはＰＨＡの産生には（ＮＨ４）２ｓＯ４濃度を０ ．０４％に減少させ変更した最小培地を用いた。

Ａ、　ｅｕｔｒｏｐｈｕｓ株はトリブチカーゼソイブロス（ＴＳＢ、　ＢＢＬ　 Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ　ｓｙｓｔｅｍｓ、　Ｃｏｃｋｅｙｓｖｉｌｌｅ、　 Ｍｄ）または０．３９ｇ／ｌ　ＭｇＳＯ４；　０．４５ｇ／Ｉ　Ｋ２Ｓ０ａ＋　 １２ｍ１１．Ｉｍ　Ｈ３Ｐ０Ａ：　１５ｍｇ／Ｉ　ＦｅＳＯ４７Ｈ２０；２４ｍ １痕跡元素（２０ｍｇ／ｌ　ＣｕＳＯ４５Ｈ２０；　１００ｍｇ／Ｉ　Ｚｎ５Ｏ ａ６Ｈ２０；　ｌｏｏｍｇ／］　ＭｎＳＯ４４Ｈ２０；　２．６ｇ／ｌ　ＣａＣ ｌ２２Ｈ２０）を含有する限定最小培地に生育させた。ｐＨはＮａＯＨで６．８ に調整し、培地はオートクレーブで滅菌した。窒素源としてＮＨ４Ｃｌを最終濃 度０．１％または０．０１％になるように添加し、フルクトースを最終濃度０． ５〜１％（Ｖ／Ｖ）になるように添加した。

プラスミドＤＩＪＡの調製は、Ｉｓｈ−ＨｏｒｏｗｉｃｚおよびＢｕｒｋｅ、Ｎ ｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、、　９．　２９８９−２９９８　（１９８ １）の記載に従いＢｉｒｎｂｏｉｍおよびＤｏｌｙのＮｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄ ｓ　Ｒｅｓ、、　７．　１５１３−１５２３　（１９７９＞の方法で行った。λ ＤＮＡはＭａｎｉａｔｉｓら、Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃ１ｏｎｉｎ　二Ａ−Ｌ　 ｂｏｒａｔｏｒ　Ｍａｎｕａｌ、（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌ ａｂｏｒａｔｏｒｙ、　ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ、　ＮＹ　１９８ ２ンに記載の標準的方法で調製した。

ＤＮＡ配列はＭ１３ｍｐ１ｇおよびＭ１３ｍｐ１９クローニングベクターを（Ｙ ａｎｉｓｃｈ−Ｐｅｒｒｏｎら、Ｇｅｎｅ　３３．１．０３−１０９（１９８５ ））用いてＳａｎｇｅｒら。

Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　７４．５４６３−５ ４６７　（１９７７）のジデオ牛ン鎖終結法により分析した。α−［３５Ｓ］− ｄＡＴＰおよびＤＮＡポリメラーゼ１のフレノウ断片はＡｍｅｒｓｈａｍから購 入した。配列データはＶＡＸシステムでコンパイルし分析した。

ランダムなＺ、　ｒａｍｉｇｅｒａクロモソームＤＮＡ断片の組換えライブラリ ーを、ＹｏｕｎｇおよびＤａｖｉｓ、５ｃｉｅｎｃｅ、２２２．　７７８−７８ ２　（１９８３）の記載に従いλｇｔ１１発現ベクターに構築した。Ｚ、　ｒａ ｍｉｇｅｒａ　ＤＮＡはＡｎｄｅｒｓｏｎ、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ、９． 　３０１５−３０２６　（１９８１）の教示に従いまずＥｃｏＲＩメチラーゼを 用いてメチル化し、次にＭｇ２“の存在下にＤＮＡ５ｅ　１で部分消化した。部 分消化したＤＮＡ断片の末端をタレノウポリメラーゼで修復し、ＥｃｏＲＩリン カ−を添加し、過剰量のＥｃｏＲｌでＤＮＡを完全に消化した。２−８ｋｂの断 片を１．５％アガロースゲルでサイズ選別し、電気溶出により精製し、ＥｃｏＲ Ｉ消化されたホスファターゼ処理λｇｔｌｌのＤＮＡニライゲートした。ライゲ ーションは２μｇのλｇｔｌｌ　ＤＮＡおよび１μｇの断片化クロモソームＤＮ Ａを用い全ｊｌｌＯＪ、ｔｌで、４℃で１８時間行った。完全なライゲーション 反応物はインビトロでＭａｎ　１ａｔｉｓら（１９８２）の記載に従い、Ｅ、　 ｃｏｌｉ株Ｂｌ（Ｂ２１５８８およびＢＨＢ２６９０、ＨｏｈｎおよびＭｕｒｒ ａｙ、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、、　ＵＳＡ、７４゜３ ２５９−３２６３　＜１９７７）から調製したλ抽出物を用いてパッケージした 。パッケージしたファージはＥ、　ｃｏｌｉ　Ｙ２Ｏ２Ｓを用いてプレートにま き増幅させた。

λｇｔ１１発現ライブラリーのスクリーニングは、ウサギ抗チオラーゼ抗体を用 いてＹｏｕｎｇおよびＤａｖｉｓ、　５ｃｉｅｎｃｅ、　２２２．７７８−７８ ２　（１９８３）に記載の変法により行った。

制限エンドヌクレアーゼ、Ｔ４　ＤＮＡリガーゼおよびＤＮＡポリメラーゼ１は Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓから入手し、製造業者の指示した条件 下で用いた。子牛腸アルカリホスファターゼはＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎ ｈｅｉｍ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎから購入した０　プラスミドの精製、Ｅ、　 ｃｏｌｉの形質転換等を含む全ての慣例的ＤＮＡ操作は、Ｍａｎｉａｔｉｓら（ １９８２）の記載した方法で行った。クロモソームＤＩＪＡはＡ、　ｅｕｔｒｏ ｐｈｕｓ株から精製し、ＴＳＢ中で後期対数相まで生育させた。制限酵素消化Ｄ ＮＡ試料のアガロースゲルからニトロセルロースフィルターへの転写、３２ｐ標 ｍＤＮＡプローブを用いたプレハイブリダイゼーションおよびハイブリダイゼー ションはＰｅｏｐｌｅｓら、　Ｊ、　Ｂｉｏｌ　Ｃｈｅｍ、、　２６２．９７− １０２　（１９８７）に記載されている。制限酵素分析のためのＡ、　ｅｕｔｒ ｏｐｈｕｓの組換え株からの迅速なプラスミドの単離は、Ｂｉｒｎｂｏｉｍおよ びＤｏｌｙ、　ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｌｄｓＲｅｓ、　７．１５１３−１５２３　 （１９７９）のアルカリ抽出法で行った。

Ｌ」那二狙胞しソ目Ｌ１云這 広宿主プラスミドｐＬＡＦＲ３またはｐＬＡＦＲ３の組換え誘導体のＡ。

ｅｕｔｒｏｐｈｕｓへの接合移入は、Ｅａｓｓｏｎら、　Ｊ、　Ｂａｃｔｅｒｉ ｏｌ、、　１６９゜４５１８−４５２４　（１９８７）に記載の方法により行っ た。但しこの場合、受容細胞Ａ、　ｅｕｔｒｏｐｈｕｓはソニケートせず、また 接合移入体は窒素源として０．０１％ＮＨ４Ｃｌ、炭素源として１％（ｗ／ｖ） フルクトース、および１０μｇ／ｍｌテトラサイクリンを含有するＡ、　ｅｕｔ ｒｏｐｈｕｓ無機塩寒天プレートで選択した。

Ｔｎ５変異誘発のために、自然ストレプトマイシン耐性株のＡｅｕｔｒｏｐｈｕ ｓ　１１５９９　（１５９９Ｓｌンを用いた。唯一のドナーとしてＥ、　ｃｏｌ ｉ　ＭＭ２９４Ａ　（ｐＲＫ６０２）を用いて、上記の様にｐＲＫ６０２　（Ｔ ｎ５）の移入を行った。Ｔｎ５を含有するＡ、　ｅｕｔｒｏｐｈｕｓ株はストレ プトマイシン（ＳＯＯμｇ／ｍｌ）およびカナマイシン〈１００μｇ／ｍｌ）上 での生育によって選択した。

Ｚ、　ｒａｍｉ　ｅｒａチオラーゼ　伝　の６定チオラーゼ抗血清は精製された チオラーゼタンパク質ヲ用いて標準方法により、Ｎｅｗ　Ｚｅａｌａｎｄ白色ウ サギの雌を用いて調製した。抗体力価はＡｃｔａ　Ｐａｔｈｏｌ、　Ｍｉｃｒｏ ｂｉｏｌ、　５ｃａｎｄ、　２６．５０７−５１５（１９４９）のオフタロ二− 二重拡散アッセイで評価した。

精製抗体は血清から、Ｂｉｇｈｅｅら、　Ｍｏ１．１ｍｍｕｎｏ１．２０．１３ ５３−１３５７　（１９８３）に従いプロティンＡアガロースのクロマトグラフ ィーで調製した。約４Ｘ１０’個の組換えファージをＥ、　ｃｏｌｉ　Ｙ１０９ ０に吸着させて１５ｃｍのＬＢアガープレートにまき、４２°Ｃで３時間インキ ュベートした。次にプレートを、予め１０ｍＭ　ＩＰＴＧで飽和させたニトロセ ルロースフィルター（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ　＆　５ｃｈｕ１１、　ＢＡ８５） の上に載せ、３７°Ｃでさらに４時間インキュベートした。

フィルターを取り除き、ＴＢＳＴ（５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、　ｐＨ７，９ ，１５０ｍＭ　ＮａＣ１，０，０５％Ｔｗｅｅｎ−２０）で１０分間洗浄し、２ ０％ｖ／ｖ牛脂児血清を添加したＴＢＳＴ中で３０分間インキュベートして、Ｔ ＢＳＴですすいだ。第一抗体は精製した抗チオラーゼ抗体（１０μｍ）を添加し たＴＢＳＴの１０ｍｌ中でこのフィルターを、室温で１時間インキュベートする ことにより結合させた。次にフィルターを、ＴＢＳＴを各５分間ずつ３回替えて 洗浄した。結合した第一抗体はビオチン−アビジン　ホースラディツシュペルオ キシダーゼ検出系（Ｃ１ｏｎｔｅｃｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）およびポー スラディッシ′−６ルオキシダーゼ発色剤（Ｂｉｏ−Ｒａｄ　Ｌａｂｏｒａｔｏ ｒｉｅｓ、　Ｒｉｃｈｍｏｎｄ、　ＶＡ）を用いて検出した。

タンパク質はドデシル硫酸ナトリウムゲル電気泳動により、Ｌａｅ＋＋ｖ＋ｌｉ 、　Ｎａｔｕｒｅ　２２２．６８０−６８５　（１９７０）の方法で分離し、Ｂ ｕｒｎｅｔｔｉ、　Ａｎａｌ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　１１２．１９５−２０３　 （１９８１）の記載に準じてニドセルロースフィルター（５ｃｈｌｅｉｃｈｅｒ および５ｃｈｕｅｌｌ　ＢＡ８５）に電気泳動により移した。３０Ｖで一晩移し た後、フィルターをＴＢＳ　（ツイン２０を含有しないＴＢＳＴ）ですすぎ、５ ％ウシ血清アルブミンを添加したＴＢＳ中でインキュベートした。次に、抗チオ ラーゼ血清と反応するタンパク質を、フィルターを１００ｍ１の１％ゼラチン入 りＴＢＳに２ｍｌの抗チオラーゼ血清を添加したものと共に１−２時間インキュ ベートすることにより検出した。結合した第一抗体は、ヤギ抗ウサギＩｇＧのホ ースラディツシュペルオキシダーゼ複合体およびホースラディツシュペルオキシ ダーゼ発色試薬（Ｂｉｏ−Ｒａｄ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、　Ｒｉｃｈｍｏ ｎｄ、　ＣＡ）を用いて検出した。

アガロースゲルから分離したＤＮＡ断片を用い、５ｏｕｔｈｅｒｎ、　Ｊ、　Ｍ ｏ１．　Ｂｉｏｌ、、　９８．５０３−５１７　（＋９７５＞の開発した方法に 基づくＳ＋ｎ１ｔｈおよびＳｕｍｍｅｒｓ、　Ａｎａｌ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、１ ０９．　１２３−１２９　（１９８０）のサンドイッチプロット法によりＤ’Ｎ Ａプロットを調製した。フィルターは、Ｒｉｇｂｙら、Ｊ、　Ｍｏｔ、Ｂｉｏｌ 、、１１３．　２３７−２５１（１９７７）の二ノクトランスレーンヨン法によ り［α−３２Ｐ］ｄＡＴＰで高比活性（０，１−１ｘ　ｌｏ８ｃｐｍ＃ｚ　ｇＤ ＮＡ）にラベルしたＤＮＡプローブとハイブリダイズさせた。プレハイブリダイ ゼーションおよびハイブリダイゼーションは、プールされたポリテン（ｐｏｌｙ ｔｈｅｎｅ）バッグ中で６５℃にて行った。プレハイブリダイゼーション／ハイ ブリダイ上−’／　−ｒ　ン液は５　ｘ　５ＳＣＰ　（ｌ　ｘ　５ＳＣＰはＱ、 ＩＳＭ　ＮａＣ１，０，１５Ｍクエン酸ナトリウム、１０ｍＭ　Ｎａ２ＨＰＯ４ 、ＩＱｍＭ　ＮａＨ２ＰＯ４を含有）、５×デンハー液、０．１％（ｗ／ｖ）Ｓ ＤＳ、　１０ｍＭ　ＥＤＴＡおよび１００μｇ／ｍｌ超音波処理変性サケＤＮＡ を含有した。フィルターを８〜１８時間プレハイダリダイズさせ、フィルター当 り１１０７ｃｐのラベル化ＤＮＡプローブを用いて１６〜１８時間ハイブリダイ ズさせた。

溶原性λｇｔｌ１組換えクローンはＹｏｕｎｇおよびＤａｖｉｓ、　５ｃｉｅｎ ｃｅ　２２２．７７８−７８２　（１９８３）に記載のようにＥ、　ｃｏｌｉ　 Ｙ１０８９で調製した。λファージにコードされるタンパク質の調製および分析 のために、溶源菌をＬＢ　（１００ｍｌ）で３０℃にて、０．５０Ｄ６．、に達 するまで生育させた。プロファージは４５℃で２０分間インキュベートして誘導 し、ＩＰＴＧを５ｍＭになるように添加して、誘導された溶源菌を３７℃で１時 間インキュベートした。細胞を集め、アッセイ緩衝液（０，ＬＭ　Ｔｒｉｓ−） １ｃＩ、　ｐＨ７，５，５ｍＭβメルカプトエタノール、５％（Ｖ／Ｖ）グリセ ロール）に再懸濁し、超音波処理により溶菌させ、遠心により細胞残渣をベレッ ト化して、細胞抽出物を一２０°Ｃで貯蔵した。細菌溶解物のタンパク質濃度は 、Ｍ、　Ｍ、　Ｂｒａｄｆｏｒｄ、　Ａｎａｌ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　７２．２ ４８−２５４　（１９７６）の方法により標準としてウシ血清アルブミンを用い てアッセイした。

チオラーゼ酵素のアッセイはＮｉｓｈＮ１５ｈｉら、　Ａｒｃｈ、　Ｍｉｃｒｏ ｂｉｏｌ＝　１１６．２１−２７　（１９７８）の記載に従い行った。

ＤＮＡ断片はＭベクターｍｐｌＯおよびｍｐＨにクローン化し、Ｓａｎｇｅｒら 、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、１０．　１４１−１５８　（１９Ｈ） 、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　７４．５４６３−５ ４６７　（１９７７）のジデオキシ鎖終結法により配列決定した。Ｍ１３配列決 定用プライマーおよび池の試薬はＡｍｅｒｓｈａｍ　Ｃｏｒｐ　から購入した。

Ｇ／Ｃに富む領域はＭｌｌｌｓおよびＫｒａｍｅｒ、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、 　Ａｃａｄ、　Ｓｅｔ、　ＵＳＡ　７６、２２３２−２２３５　（１９７９）に 記載のように、ｄＧＴＰの代わりにｄｌＴＰを用いて再ｉ　配列決定した。コン ピューターを用いた配列解析はＮｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、１０．１ ４１（５８（１９８４）の５ｔａｄｅｎプログラムを用いて行った。

精製された目的のＤＮＡ　１μｇから、約２Ｘ　１０５個の組換え体が得られ、 これをＥ、　ｃｏｌｉ　Ｙ２Ｏ２Ｓで増幅させた。合計１０５個の増幅ファージ を、精製したウサギ抗チオラーゼ抗体を用いてスクリーニングした。最初のスク リーニングで１０個の潜在的陽性クローンが確認された（ＬＤＢＫＩ−ＬＤＢＫ ＩＯ）。制限酵素分解による分析により、ＬＤＢＫ２−１０のクローンは同一で あることが示された。クローンＬＤＢＫＩおよびＬＤＢＫ　２を以下の研究のた めに選択した。ＬＤＢＫＩは３．６ｋｂおよび０．７５ｋｂの２個の肚旦ＲＩ断 片を含む挿入物を有する。ＬＤＢＫ２は１．６５ｋｂおよび１．０８ｋｂの３個 の社旦Ｒ１断片を含む挿入物を有する。

ＬＤＢＫＩおよびＬＤＢＫ２の挿入配列にコードされるタンパク質は、チオラー ゼ酵素活性およびウサギ抗チオラーゼ血清との交叉反応について分析した。ＬＤ ＢＫｌおよびＬＤＢＫ２ファージＤＮＡを含む溶原性株Ｅ、　ｃｏｌｉＹ１０８ ９を調製した。各クローンからいくつかの溶源菌が得られ、その内の２つ、Ｙ１ ０８９／ＬＤＢＫＩおよびＹ１０８９／ＬＤＢＫ２を以下の研究に用いた。λｇ ｔ１１ベクターであるＢＮＮ９７／λｇｔｌｌの溶源菌をコントロールとして用 いた。チオラーゼ酵素アッセイの結果は、Ｙ１０８９／ＬＤＢＫＩ由来のタンパ ク質はチオラーゼ活性をかなり含有していることを明確に示した。さらに、チオ ラーゼ活性はＩＰＴＧ添加により、５倍より多くまでも誘導可能である。このこ とはチオラーゼをコードする配列の発現はλｇ、ｔｌ　Ｌベクターに含まれるヱ プロモーターの転写制御下に置かれていることを示す。Ｙ１０８９／ＬＤＢＫ２ もＢＮＮ９７／λｇｔｌｌも、そのタンパク質溶菌物は、［ＰＴＧで誘導した場 合でさえも、有意なチオラーゼ活性を示さない。

ウサギ抗チオラーゼ抗体に対し最初に陽性反応を生じたタンパク質のサイズは、 ウェスタンプロット実験により調べた。

タンパク質溶菌物はＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動で分離し、ニトロセ ルロースフィルターに写し、ウサギ抗チオラーゼ血清でスクリーニングした。結 果は、Ｙ１０８９／ＬＤＢＫＩのＩＰＴＧ誘導およびＩＰＴＧ非誘導溶菌物の両 者に、免疫反応陽性の４０゜０００ダルトンタンパク質が示された。

ＬＤＢＫＩ挿入物の制限酵素地図を作成した。完全なチオラーゼ遺伝子領域を含 有する大きな３．６ｋｂ　ＥｃｏＲ＋断片は、操作を容易とするためプラスミド ベクターｐｔｌｃ３にサブクローンした。得られたサブクローンの一つであるｐ ＵｃＤＫＢｌの制限酵素分析から、ＬＤＢＫｌのこの断片の制限地図を確立した 。ｐＵｃＤＢＫｌのＤＮＡは３２ｐで高比活性にラベル化し、Ｚ、　ｒａ１１ｉ ｇｅｒａクロモソームＤＮＡをｐＵＣＤＢＫＩの制限酵素地図に用いたのと同じ 酵素で消化したものを含むニトロセルロースフィルターにハイブリダイズさせた 。

サザンハイプリダイゼーシ目ン実験により、５．４ｋｂゲノム断片はｐＵｃＤＢ Ｋｌからの１．４５ｋｂ坦Ｉル並Ｒ１断片および１．０５ｋｂ鎧ユＩ断片の両方 にハイブリダイズすることが確認された。サザンハイブリダイゼーション実験に 基づき、クローン化されたｐＵＣＤＢＫＩ挿入物はＺ、　ｒａｍｉｇｅｒａゲノ ムに唯１つだけ示される。

ｐＵＣＤＢＫ　１挿入物のＤＩＪＡ配列分析は、Ｍ１３／サンガージデオキシ鎖 終結法を用いて行った。遺伝子をコードする領域を位置付けるため、６個のリー ディングフレームの全てについて、各々のＤＮＡ配列をアミノ酸配列のＮＨ２末 端との相同性についてスキャンした。これらの手法を用いることにより、１．４ ５ｋｂ　Ｅｃ。

Ｒ１／５ａｉｌ断片内の遺伝子コーディング領域を同定した。遺伝子のプラス鎖 の完全ヌクレオチド配列を図１に示す。ＥｃｏＲ１部位から２９０ｂｐ下流には 、ＤＮＡ配列をＮＨ２末端アミノ酸配列と比較して帰属されたチオラーゼ構造遺 伝子の開始点がある。このＮＨ２末端配列は、−８９位からヌクレオチド１１７ ４位の終止コドン（ＴＡＧ）まで伸びる単一の長いオープンリーディングフレー ム内にある。セリンに始まり２５残基伸びる部分は実験的に決定したＮＨ２末端 配列であり、これはＤＮＡ配列の解読による２位から２６位の残基と同一である 。次に、ＤＮＡ配列を解読して残余の残基２７位から３９１位（ヌクレオチド７ ９位から１１７３位）までのアミノ酸配列を推定した。このようにして、ヌクレ オチド１位から１１７４位（上記リーディングフレーム内）のＤＮＡ配列はアミ ノ酸３９１個の算出分子１１４０．５９８のポリペプチドをフードする。この値 はＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動で決定した分子ｆｉ　４２．０００と 非常によく一致する。

他の２つの証拠から、この翻訳産物はチオラーゼの正しいアミノ酸配列であるこ とが確認される。まず、活性部位ペプチドと推定されるアミノ酸配列（ＮＯ３− Ｇｌｙ−Ｍｅｔ−Ａｓｎ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−３ｅｒ−Ｇｌｙ− ＣＯＯＨ）を検索すると８４位−９２位残基に存在した。

さらに、翻訳産物から推定されるアミノ酸組成は実験的に得られたものと非常に より一致している。１．４６ｋｂ　ＥｃｏＲｌ−Ｓａｉｌ断片のＧ／Ｃ含有量は ６６．２％と高い。分けて考えると、５−フランキング２９０ｂｐのＧ／Ｃ含有 量は５７，４％であり、構造遺伝子領域では６８．４％である。アミノ酸配列か ら、Ｚ、　ｒａｍｉｇｅｒａチオラーゼが５個のシスティン残基を有することが 確認される。Ｚ、　ｒａｍｉｇｅｒａ活性部位のシスティンは残基Ｃｙｓ−８９ である。他の分子内または分子間ジスルフィド結合に関与するシスティンはＣｙ ｓ−１２５、Ｃｙｓ−３２３、Ｃｙｓ−３７７およびＣｙｓ−３８７である。Ｎ Ｈ２末端配列の分析は、１位がセリンであることを示した。

ＡＴＧ開始フドンから７ヌクレオチド上流にはＥ、　ｃｏｌ　ｉ配列との相同性 から確認される、可能なリポソーム結合部位５−ＣＴＧＡＧＧＡ−３°がある。

ある種の細菌の遺伝子で翻訳開始可能な、２つのＧＴＧを含む他の開始コドンが 、さらに上流に存在する。５−フランキング領域を、Ｅ、　ｃｏｌｉプロモータ ーエレメントの”−１０”および”−３５”との相同性について調べることによ り残基−１２２位から一１１６位に可能な“−３５”領域が、また−１００位か ら一９５位に対応する”−１０”領域である５−ＴＡＴＡＡＴ−３°が確認され た。ポリ（Ｔ）トラクトもまた一２５５位から一２６６位に存在する。Ｎ−ホル ミルメチオニン残基の除去のみがチオラーゼの翻訳後プロセシングであることが 明かである。なぜなら、他の開始コドンであるＡＴＣまたはＧＴＧはフレームか らはずれているか、または構造遺伝子の開始前にインフレームの終止コドンがあ るからである。

ｐＵＣＤＢＫ　１の１．５Ｋｂ　５ａｉｌ−ＥｃｏＲＩ断片は完全なＺ、　ｒａ ｍｉｇｅｒａのチオラーゼ構造遺伝子に加えて２８３ｂｐの５゛−フランキング ＤＮＡを含んでいる。このＤＮＡ断片がｔａｃプロモーターのベクターｐＫＫ　 ２２３−３　（またはその誘導体）内に挿入された一連のプラスミド構築物を作 成した。ｐＺＴ３の作成のために、ｐＵｃＫＢＫｌをＳａｌ　＋で開裂させ、タ レノウポリメラーゼで平滑末端にし、ヒュＲ１リンカ−を付加する。ＥｃｏＲｌ で消化した後、１．５Ｋｂ断片をアガロースゲルから精製して、ｐＫＫ２２３− ３のＥｃｏＲ１部位に挿入した。ｔａｃプロモーターに対して正しい方向に挿入 された遺伝子を有する組換えクローンは、制限酵素分析の後Ｅ、ｃｏｌｉ　ＪＭ １０５を形質転換することにより確認した。

次に、チオラーゼ遺伝子の５′末端に隣接する２８３ｂｐの配列が欠失した一連 のクローンを構築した。ｐ［ＩｃＤＢＫＩ　ＤＮＡをＥｃｏＲｌで内の断ハをア ガロースゲルから精製して、ｐＫＫ２２３−３のＥｃｏＲ１部位にライゲートし た。目的のクローンを制限酵素地図により同定し、５−欠失の程度をＤＮＡ配列 決定により測定した。これらの一連のクローン、ｐＺＴ３．１−ｐＺ７３．５の 内、最も欠失の長いクローンは残った５°−フランキングＤＮＡが８４ｂｐであ った。従って続＜　Ｂａ１３１欠界を以下のように行った：　ｐＺＴ３．５　Ｄ ＮＡをＥｃｏＲｌで完全に消化し、Ｂａ１３１ヌクレアーゼで処理した；タレノ ウポリメラーゼで末端を修復して、ＥｃｏＲ１’Ｊンカーを付加し、社旦Ｒ１お よびＢａｍ旧で完全に消化した後、チオラーゼのＮＨ２末端領域に相当する断片 をアガロースゲルから溶出して、Ｂａｍ旧−ＥｃｏＲ１？ｍ化したＭ１３ｍｐ　 １１　ＤＮＡにライゲートし、Ｅ、　ｃｏｌｉ　ＪＭＩＯＩ上にプレートした； ５０個の形質転換体から一本鎖ＤＮＡを調製し、５゛−欠失の程度をＴ−トラッ キングで分析した；目的のクローンからインビトロで二本鎖ＤＮＡを調製し、Ｅ ｃｏＲｌ−Ｂａｍ　ｌ挿入物を制限酵素消化およびアガロースゲルからの溶出に より回収した。

完全なチオラーゼ遺伝子を再構築するために、ｐＫＫ２２３−３から工プロモー ター上流の抛旧部位を欠失させた誘導体ベクター（ｐＫＫ２２６）に、ｐＺＴ３ ．５からの２９０ｂｐのＢａｍＨｌ−肛匝ＩＩＩ断片をライゲートした：このＣ 末端ベクターを次に、目的のＢａ１３１が欠失したＮＨ２末端を再構築するため に用いた；クローンｐＺＴ３゜５．１およびｐＺＴ３．５．２を以下の研究に用 いた。

チオラーゼのＡＴＧ翻訳開始コドンに隣接した２８３ｂｐのＤＮＡの配列欠失の 効果は、プラスミドｐＺＴ３．１−ｐＺＴ３．５．２の産生ずるチオラーゼ活性 レベルを分析することにより測定した。各プラスミドを含むＥ、ｃｏｌｉ　ＪＭ １０５培養物の１００ｍ１ｆ−ＩＰＴＧと共に１５時間、インフレームし、チオ ラーゼレベルをアッセイした。これらの結果のうち最も注目すべきことは、クロ ーンｐＺＴ３．３−ｐＺＴ３゜５．２を用いて得られるチオラーゼの発現レベル は非常に高く、ｐＺＴ３．５で最大の１７８０／ｍｇが得られたことである。こ れは完全な２８３ｂｐの５゛フランキングＤＩＪＡを含むプラスミドｐＺＴ３に 比較して、５．９倍の増加を示している。このデータは、−８４（＋）Ｚｒ２． ５）（！ニー１６８（ｐＺＴ３．２）との間に位置するチオラーゼ５°フランキ ング配列が、チオラーゼ遺伝子のエプロモーターがらの発現を強く阻害すること を示す。これらの配列の位置は−８４（ｐＺＴ３．５）および−１２４（ｐＺＴ ３．４＞の間に限定し得る。なぜならば、この領域を欠失させると、ニー誘起の チオラーゼ発現が最大レベルとなるためである。さらに−３７（ｐＺＴ３．５． １）まで、および−２６（ｐＺＴ３．５゜２）までの欠失は、チオラーゼの発現 レベルを増加せず、実際僅かに減少が観察された。この一連のクローンの誘導の タイムコースはｐＺＴ３と同じ牛ネティソクスに従い、欠失によってそれとわか るほど影響されないことは注目に値する。

チオラーゼプロモーターが領域−８４（＋）Ｚｒ２．５）がら−１２４（ｐＺ７ ３．４）に存在するか否かを決定するために、Ｂｅｒｋおよび５ｈａｒｐ。

Ｃｅ１ｌ　１２．７２１−７３２　（１９７７）の方法に従いＺ、　ｒａｍｉｇ ｅｒａ　ＲＮＡについてＳ１ヌクレオチド保護実験を行った。全ＲＮＡを１００ ｍ１の対数増殖期中期の培養物から、Ｈｉｎｎｅｎｂｕｓｃｈら、　Ｊ、　Ｂｉ ｏｌ、　Ｃｈｅｍ。

２５８、５２３８−５２４７　（１９８３）の熱フェノール、／ガラスピーズ抽 出法により単離した。５−３２ｐラベル化ＤＮＡプローブは以下のように調製し た＝１０μｇのプラスミドｐＺＴ３．１　ＤＮＡをＡｖａｌで完全に消化し、続 いてＣＩＰで処理した；ｍＩ制限酵素断片の５°末端を、［γ−３２ＰＩ−ＡＴ Ｐおよびポリヌクレオチドキナーゼでラベル化した；　ＥｃｏＲ１？）１化の後 、ＤＮＡを８％アクリルアミドゲルで分離して、３２　ｐ−ｙベル化した２８０ ｂｐのプローブ断片を溶出し、エタノール沈澱により回収した。プローブ（１０ ，ＯＯＯｃｐｍ）および１１Ｍｇ　ＲＮＡをプールし、凍結乾燥し、１１０Ａｔ ハイブリダイゼーシヨン緩衝液（４０ｍＭ　ＰＩＰＥＳ、　１）Ｈ６，４；　１ ｍＭ　ＥＤＴＡ、　ｐＨ８，ｏ：　０．４Ｍ　ＮａＣ１：　８０％（Ｖ／Ｖ）ホ ルムアミド）に再懸濁して、９０℃で１０分間変性させ、５５℃で一晩アニール させた。２０００単位の３１ヌクレアーゼを含有する２３５μｌの水冷Ｓ１ヌク レアーゼ緩衝液（０，２５Ｍ　ＮａＣ１：　３０ｉ＋Ｍ　Ｎａ０Ａｃ：　１ｍＭ 　ＺｎＳＯ４；　２００μｇ一本鎖子牛胸腺ＤＮＡ）を添加した後、３７°Ｃて ３０分間インキュベートした。反応混合物をフェノール−クロロホルムで１回抽 出し、０．２Ｍ　Ｎａ０Ａｃおよび１０ＭｇイーストｔＲＮＡキャリアーの存在 下でエタノール沈澱を行った。

得られた断片を６％（Ｗ／Ｖ）アクリルアミド、７Ｍ尿素のＤＮＡ配列決定ゲル で分析した。サイズ標準としてマキサムギルバートのＧおよびＣ配列決定反応を 、５０．ＯＯＯｃｐｍの５−３２Ｐ−ラベル化プローブＤＮＡで行った。結果は 、保護された断片を明確に示し、そしてＲＮＡ開始部位が、−８６位または一８ ７位のＣまたはＴ残基に位置することを明かに示した。コントロールは、Ｚ、　 ｒａｍｉｇｅｒａ　ＲＮＡの非存在下でプローブは完全に分解されることを示し 、このことはチオラーゼのプロモーター領域が約１ｏｂｐ（−９６）および３５ ｂｐ（−１２１）上流に存在することを実証する。チオラーゼの５°非翻訳領域 の長さはａａｂｐである。

誘導実験の結果から、チオラーゼ遺伝子がＥ、　ｃｏｌｉにおいて可溶性で触媒 活性な形態で高レベルで発現し得ることを明確に示した。Ｓｌヌクレアーゼの実 験で、Ｚ、ｒａｍｉｇｅｒａのチオラーゼ遺伝子の転写開始部位をヌクレオチド −８６／−８７位に位置付けできた。

チオラーゼプロモーターの′−３５”領域が認識され、ＲＮＡポリメラーゼを結 合することが示されているけれども、転写開始速度を決定するのは”−１０−領 域である。例えばｐＺＴ３の場合、ベクターおよび挿入プロモーターの両方にＲ ＮＡポリメラーゼ分子が同時に結合することにより、土プロモーターから速やか に転写が開始される結果となり、次にこの１プロモーターが２ｏｏｇｌｏｅａプ ロモーターに結合したポリメラーゼ分子の存在により阻害されるのであるろう。

２つのプロモーターが接近している程、ポリメラーゼの両者への同時の結合チャ ンスは少なくなり、同時に阻害が低くなる。従って、これにより、酵素の発現速 度を制御する１つの手段が提示される。

Ｚ、　ｒａｍｉ　ｅｒａレダクターゼ　伝子の確認チオラーゼ遺伝子のプロモー ター領域を確認し、チオラーゼＴＡＧ終止コドンの下流に、可能なターミネータ −配列が存在しないことを確認した後、クローンｐＵｃＤＢＫ１に存在する残余 の２　ｋｂのＺｏｏｇｌｏｅａ　ＤＮＡを配列決定して、レダクターゼ遺伝子に ついて調べた。完全なｐＵｃＤＢＫ１挿入またはその断片を含有する一連の発現 プラスミド（ｐＺＴｌ　〜ｐＺＴ３＞を、Ｅ、　ｃｏｌｔ　ｔａｃプロモーター ベクターｐＫＫ２２３．３中に構築した。各プラスミドはｔａｃプロモーターに 対して発現のために正しい方向に位置するチオラーゼ遺伝子を有する。エプロモ ーターはチオラーゼの発現を指令するのではなく、オペロン様タイプの機構の２ ．３ｋｂ下流に位置する任意の遺伝子の発現を指令すると予想するのが理にかな っている。りｏ　−７ｐＺＴｌは、ｐＵｃＤＢＫｌの完全な３．８ｋｂＥｃｏＲ Ｉ　Ｚ、　ｒａｍｉｇｅｒａ　ＤＮＡ挿入を、ベクターｐＫＫ２２３−３のＥｃ ｏＲ１部位に挿入することにより構築した。続いて、ｐＺＴ２をｐＺＴｌがら、 ８５０ｂｐ　Ｓｍａｌ断片を欠失させる直接的な方法で派生させた。ｐＺＴ３は チオラーゼプロモーターの確認についての記載のようにして構築する。一連のエ プロモーター誘導実験は、各々の組換えり０−　ンｐＺＴ１、ｐＺＴ２およびｐ ＺＴ３テ行った。ヘク９−ｐＫＫ２２３−３をコントロールとして用いた。

各々のプラスミドを含有するＥ、　ｃｏｌｉ細胞を生育させ、イソプロピル−β −Ｄ−ガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を最終濃度２ｍＭとなるように添加する ことにより誘導させた。１５時間誘導を行った後、１０ｍ１の培地を収穫し、超 音波で溶菌させた。次に各クローンから細胞溶解物を、酵素アッセイおよび５Ｄ Ｓ−ＰＡＧＥの両者で分析した。どちらの細胞溶解物がらもＰＨＢポリメラーゼ 活性は検出されなかった。３つの組換えプラスミドｐＺＴ１、ｐＺＴ２およびｐ ＺＴ３の各々は、チオラーゼ活性を相当なレベルで示した。さらに、ｐＺＴｌお よびｐＺＴ２からの細胞溶解物は、ＮＡＤＰＨを補助因子とするＡｃＡｃ−Ｃｏ Ａレダクターゼ活性を比較的高レベルで有する。ＮＡＤＰＨを補助因子として用 いる場合は、どの細胞溶解物にもレダクターゼ活性が検出されない。コントロー ルのｐＫＫ２２３−３はチオラーゼ活性もレダクターゼ活性も有さない。ｐＺＴ ｌおよびｐＺＴ２の細胞溶解物は実際に、正しいレダクターゼを含有するという ことを確認するために、この細胞溶解物もまたＤ（−）β−ヒドロキシブチリル −ＣｏＡの酸化についてアッセイした。どちらの場合にも、ＮＡＤＰを電子受容 体として用いて酵素活性が観察された。

上記細胞溶解物の各々は５ＤＳ−ＰＡＧＥでも分析した。結果は、ｐ　ＺＴＩ、 ｐＺＴｌおよびｐＺＴ３の細胞溶解物タンパク質中に４２．０００ダルトン付近 のチオラーゼタンパク質が存在することを示す。

このタンパク質はコントロールであるｐＫＫ２２３−３の細胞溶解物には存在し ない。ｐＺＴｌおよびｐＺＴｌの細胞溶解物は、ｐＺＴ３またはコントロールに は存在しない小さな２５．０００ダルトンタンパク質も宵し、このタンパク質は ＡｃＡｃＣｏＡレダクターゼに相当する。結果は、ＡｃＡｃ−ＣｏＡレダクター ゼ遺伝子はチオラーゼ遺伝子の下流に位置することを示す。この酵素の完全な構 造遺伝子はｐＵｃＤＢＫｌのチオラーゼの３゛末端と下流の最初のＳｍａ１部位 との開に位置するにちがいない。

レダクターゼ　伝　の転　４始部位の確認と過剰発現ｐＵｃＤＢＫ１の最初の鎧 」１部位の２．３ｋｂ下流に位置する、２３３９ｂｐの完全ヌクレオチド配列を 図２に示す。チオラーゼ遺伝子のコドン使用情報を標準として用いて配列データ のコンピューター分析を行い、３つのオーブンリーディングフレームを同定した 。ｐＺＴｌおよびｐＺＴｌの誘導された細胞溶解物中に存在する２５．０００ダ ルトンのバンドを、次に調製用５ＤＳ−ＰＡＧＥにかけて電気溶出し、Ｎ末端タ ンパク質配列のデータを得た。このデータを用いて対応する遺伝子の転写開始部 位を確立した。実験で決定したＮ末端の５個のアミノ酸は、最初のオーブンリー ディングフレームのＤＮＡ配列から推定される２位〜６位の残基と一致する。こ のリーディングフレームの翻訳により、分子１１２５．０００のポリペプチドが 推定される。ヌクレオチド３７位のＡＴＧに始まりＴＧＡ終止コドンヌクレオチ ドに終わる最初のオーブンリーディングフレームの翻訳産物を図２に示す。これ はアセトアセチルＣｏＡレダクターゼタンパク質の推定される一次アミノ酸配列 である。

クローンｐＺＴ１およびｐＺＴｌのアセトアセチルＣｏＡレダクターゼ遺伝子は ｌ：、ｃｏｌｉで、納得できるほど高レベルで発現可能である。しかし、両方の 場合共、止プロモーターからのレダクターゼ遺伝子の発現は、チオラーゼ構造遺 伝子および５°フランキング配列の存在のために至適ではない。より単純なアセ トアセチル−ＣｏＡレダクターゼ過剰産生ベクターとしてｐＺＲ１４を構築した 。ｐＵｃＤＢＫＩ　ＤＮＡをＳａｌ　＋と計＋ａｌとで完全に消化し、ジ吐Ｉ末 端をＤＮＡポリメラーゼのフレノウ断片で修復した。ＥｃｏＲＩリンカ−を付加 しＥｃｏＲＩで消化した後、断片をアガロースゲル電気泳動で分離した。アセト アセチルＣｏＡレダクターゼ構造遺伝子に、５゛末端の３６ｂｐフランキングお よび３°末端の２６６ｂｐフランキングを加えたものに相当する１、０５ｋｂ断 片を精製し、ｐＫＫ２２３−３のＥｃｏＲ１部位にライゲートした。次に、この ｐＺＲ１４が、レダクターゼ遺伝子が正しい方間に入った正しい制限酵素地図を 有することを確認した。ｐＺＲ１４の誘導実験をｐＺＴｌ、ｐＺＴｌおよびｐＺ Ｔ３についての記載と同様にして行った。アセトアセチルＣｏＡレダクターゼが 発現した。

Ａ、　ｅｕｔｒｏ　ｈｕｓでのチオラーゼおよびレダクターゼ°伝　の確認 Ｚｏｏｇｌｏｅａから最初の２つのＰＨＢ遺伝子を単離した方法を適用腰Ｚｏｏ ｇ　１ｏｅａチオラーゼ遺伝子領域を相同な配列の位置を決めるハイブリダイゼ ーション用プローブとして用いて、他のＰＨＢ産生種であるＡｌｃａｌｉｇｅｎ ｅｓ　ｅｕｔｒｏｐｈｕｓから遺伝子を同定し、単離し、特徴付けた。

次に、ｐＵＣ８にクローン化された（クローンｐＡｅＴ３）Ａ、　ｅｕｔｒｏｐ ｈｕｓ　ＤＮＡの２ｋｂ　Ｐｓｔｌ断片の配列を分析して、Ａ、　ｅｕｔｒｏｐ ｈｕｓ　Ｈ１６ゲノム中の対応するチオラーゼ遺伝子領域を同定した。ｐＡｅＴ ３の下流の配列もまた、ＺｏｏｇｌｏｅａクローンｐＵｃＤＢＫ１のＮＡＤＰ− 関与レダクターゼ遺伝子領域と相同である。Ａ　１ｃａｌ　ｉｇｅｎｅｓチオラ ーゼおよびレダクターゼ遺伝子の配列を図３に示す。

チオラーゼおよびレダクターゼ遺伝子をｐＡｅＴ３がらｐＫＫ２２３゜３にクロ ーニングすることにより、各々の酵素の発現が得られる。Ｚｏｏｇ　１ｏｅａと Ａ、　ｅｕｔｒｏｐｈｕｓとでチオラーゼタンパク質配列を比較することにより 、２つのタンパク質が活性部位Ｃｙｓ−８９を含め６３％について相同であるこ とが確立された。

Ａ、　ｅｕｔｒｏｐｈｕｓおよびＺｏｏｇｌｏｅａチオラーゼ遺伝子領域は両方 とも５ＮｏｃａｒｄｉａおよびＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｏｌｅｏｖａｒａｎｓ 　ＤＮＡを相同な遺伝子についてスクリーニングするための、ハイブリダイゼー ション用プローブとして用いた。チオラーゼ、レダクターゼおよび他の合成酵素 の遺伝子を、相同な配列を有する上記以外の他の種から、同定する手法は当業者 に周知である。

Ｚ、ｒａｍｌｅｒａのＰＨＢポリメラーゼ”伝　の確認Ｚ、　ｒａｍｉｇｅｒａ 由来のＰ）ＩＢポリメラーゼは、Ｄ（−）−ヒドロキシルブチル−ＣｏＡを利用 し、これらを鋳型に依存しないヘッドトゥーテイル縮合反応によるオキジエステ ル結合で重合し、直鎖状のポリマーを得る。これらのポリマーは、最大で１０． ０００個のモノマーユニットを含み得、Ｉ　Ｘ　１０６以上の分子量となり得る 。このポリマーは迅速に不溶性となり、細胞中で独立した顆粒として蓄積される 。

広域宿主プラスミドｐＲＫ２９０の誘導体を基にした接合移入システムは、Ｄｉ ｔｔａらの、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ　７７、　７３４ ７−７３５１　（１９８０）に記載され、Ｚ、ｒａｍｉｇｅｒａおよびＡ、　ｅ ｕｔｒｏｐｈｕｓについてＰＩ（Ｂポリメラーゼ遺伝子を単離するために、ＰＨ ８陰性変異体の単離、特徴付けおよび補完性に関連して、トランスポゾン変異誘 発および相補性分析が使坩し得る。Ｓｃｈｌｅｇｅｌらの、Ａｒｃｈ、Ｍｉｃｒ ｏｂｉｏｌ、　７１．２８３−２９４　（１９７０）に記載されている様に、ス ダンブランク染色がＰＨＢ陰性変異体の検出に用いられる。生育させ、収穫し、 そしてＰＨＢを放出させるために細胞を溶解することにより、変異体の補完性を スクリーニングし、次いでこれを精製し、その存在および分子量分布を測定し得 る。溶解液中のチオラーゼ、リダクターゼおよびＰＨＢポリメラーゼの活性もま た試験される。　゛ Ａ、ｅｕｔｒｏ　ｈｕｓのＰＨＢポリメラーゼ・　の確Ｊこれらの技術はまた、 Ａ、ｅｕｔｒｏｐｈｕｓ　Ｈ２Ｓのポリ（β）−ヒドロキシブチレート−陰性変 異体の補完性を用いて、Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓｅｕｔｒｏｐｈｕｓ　Ｈ２Ｓ中 にＰＩ（Ｂポリメラーゼ遺伝子（１痩Ｃ）を、クローニング、配列決定、および 発現させることにも応用される。

ＰＨＢの生合成経路の３つの酵素をコードしている遺伝子は、吐ｂ　Ｃ−出Ａ− 出Ｂと統合されていることが結果から示された。Ｅ、ｃｏｌｉ中で３つ全ての遺 伝子を発現させたところ、この細菌では顕著なレベル（乾燥細胞の５０％）の、 Ｐｌ（Ｂ産生があった。ｐ−ｊ、ｂ、Ｃは、典型的な膜タンパク質とは異なる親 水性の特性の、Ｍｒ・６３゜９００のポリペプチドをコードしており、このこと は、ＰＨＢの生合成には恐らく膜種合体が含まれないことを示している。

Ａ、ｅｕｔｒｏｐｈｕｓ　Ｈ２Ｓの誘導体（１１５９９Ｓｌ、表１〉のＰＨＢ− 陰性変異体の構築、特徴付けおよび相補性のための方針を、ＰＨＢポリメラーゼ をコードする遺伝子（複数の遺伝子の場合も）の確認および単離に用いた。トラ ンスポゾン変異誘発を用いたことにより、全ての興味ある株へのＴｎ５挿大のク ロモソーム中での位置決めにＤ）ＪＡハイブリダイゼーション分析の使用が可能 となった。窒素を制限した最少寒天プレートで生育させた時の、不透明なコロニ ー（ｏｐａｑｕｅ　ｃｏｌｏｎｙ）表現型により、３２個の潜在的なＰＨＢ陰性 変異体が確認された。３つのクラスに属するだけなのに、Ｔｎ５のＤＮＡプロー ブを用いたＤＮＡハイブリダイゼーションで３２もの変異体が見つかったのは、 これがＰＨ８−欠損株を濃縮するために用いられる方法であるため、驚くことで はない。

次に、各クラスからの代表、即ち、Ｐ）ＩＢ　Ｓ２、ＰＨＢ　３３およびＰＨＢ ：１９を分析するためにさらに詳細なりＮＡハイブソダイゼーンヨン実験を行っ た。これらの実験により、ＰＨＢ　＄２およびＰＨ８３３株の場合不透明な表現 型を引き起こすＴｎ５挿入はクロモソーム中、図３に示した様に、出Ａ−出Ｂ遺 伝子からそれぞれ約１．２ｋｂおよび１．５ｋｂ上流に位置していると結論され る。ＰＩ（Ｂ　８１９株の場合、Ｔｎ５挿入はＡ、　ｅｕｔｒｏｐｈｕｓクロモ ソームの他の場所に位置している。

Ｉｃの、単離および特徴付けに用いた実験方法および実験材料は以下の通りであ る。この実験方法および実験材料は、ｍＡおよび匡Ｂ遺伝子の単離に関して記述 したものと類似である。

細菌株およびプラスミドは表１に示しである。培地および培養条件は上述の通り である。

（以下余白） 表よ：細菌株とプラスミド 株　関連する特質　参照 ＤＨ５α　プラスミドの宿主　ＢＲＬ Ａ、ｅｕｔｒｏ　ｈｕｓ Ｈ２Ｓ　野生株　ＡＴＣＣ１７６９９ １１５９９ＮＣＩＢ　１１５９９ ＤＮＡの操作方法は上述したのと類似である。制限エンドヌクレアーゼのＴ４　 ＤＮＡリガーゼおよびＤＮＡポリメラーゼ１は、ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏ ｌａｂｓから入手し製造者の指示に従い使用した。

ランの腸のアルカリフォスファターゼは、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅ ｉｍ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎから購入した。常法のＤＮＡ操作方法は、グラス ミドの精製、Ｅ、ｃｏｌｉの形質転換、その他を含め全て、Ｍａｎ　１ａｔｉｓ らの記載した方法を用いて行った。クロモソームＤＮＡは前述した様に、ＴＢＳ 中で対数増殖期後期まで生育させたＡ、　ｅｕｔｒ。

ｐｈｕｓ株から精製した。アガロースゲルがらニトロセロロースフィルターへの 制限酵素消化されたＤＮＡ試料の転写、ブリハイブリダイゼーションおよび３２ ｐ−標識ＤＮＡプローブとのハイブリダイゼーションは前述した通りである。制 限酵素分析用の、Ａ、ｅｕｔｒｏｐｈｕｓのリコンビナント株からのプラスミド の迅速な単離は、アルカリ抽出法で行った。

Ａ、ｅｕｔｒｏ　ｈｕｓ、中への　合 Ａ、　ｅｕｔｒｏｐｈｕｓ中への、広域宿主プラスミドｐＬＡＦＲ３あるいはｐ ＬＡＦＲ３のりコンビナンド誘導体の接合移入は、前述したのと同じ方法を用い て行った。しがしこの場合、受容細胞であるＡ。

並立」立■細胞は超音波処理せず、そして接合移入体（Ｔｒａｎｓｃｏｎｊｕｇ ａｎｔｓ）は、０．０１％のＮＨａＣｌを窒素源、１％（ｗ／ｖ）のフルクトー スを炭素源として１０μｇ／ｍ　１のテトラサイクリンを含んだＡ、ｅ旦匹■旦 奔機質寒天プレート上で選択した。

Ｔｎ５変異誘発用には、１１５９９（１５９９Ｓｌ）のＪ、ｅｕｔｒｏ　ｈｕｓ ストレプトマイシン自然耐性株を用いた。ｐＲＫ６０２（Ｔｎ５）の移入は、上 述の様にＥ、ｃｏｌｉのＭＭ２９４Ａ　（ｐＲＫ６０２）を唯一のドナーとして 用いて行った。Ｔｎ５を含んだＡ、　ｅｕ　ｔｒｏｐｈｕｓ株は、ストレプトマ イシン（５００μｇ／ｍｌ）およびカナマイシン（１ｏｏ　ｕ　ｇ／ｍｌ）上で 生育させることにより選択した。

刷七恣叩゛　体の　幅および確認 Ａ、　ｅｕｔｒｏｐｈｕｓのＰＨＢ−欠損株を確認するための増幅およびスクリ ーニングの方法は、ＳｃｈｌｅｇｅｌおよびＯｅｄｉｎｇの、Ｒａｄｉａｔｉｏ ｎａｎｄ　Ｒａｄｉｏｉｓｏｔｏ　ｅｓ　ｆｏｒ　Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ　Ｍｉ ｃｒｏｏｒ　ａｎｉｓｍｓ、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　Ａｔｏｍｉｃ　Ｅｎ ｅｒｇｙ　Ａｇｅｎｃｙ、　Ｖｉｅｎｎａ、　２２３−２３１　（１９７１）に 記載されているものを使用した。約１０５個のＫａｎ’接合移入体（Ｔｎ５挿入 変異体）のプールを、０．０１％のＮＨ４Ｃｌ、　１％のフルクトースおよび１ ００μｇ／ｍ　１のカナマイシンを含んだ１０　ｍｌの無機質培地に接種し、そ して３０’Ｃで１８時間培養口た。この培養物を次に１００　ｍｌの同じ培地に 接種し、３０℃で３０時間培養した。ＰＨＢ−欠損変異株を増幅するために、こ の培養物がら１ｏ９の細胞を含んだ一部を、密度平衡遠心分離によりショ糖の段 階グラジェントで分画し、そして０．０１％のＮＨ４Ｃｌ、１％のフルクトース および１００μｇ／ｍｌのカナマイシンを含んだ無機塩寒天プレート上に蒔いた 。３０℃で４から５日間生育させた後、不透明な（ＰＨＢ−欠損）および白（Ｐ ＨＢ−含有）のコロニーが容易に区別できた。不透明なおよび白の両方のコロニ ーにより産生されたＰＨＢのレベルを定量することにより、不透明なコロニーは Ｐ）ＩＢ−欠損テ、白コロニーはＰＩ（Ｂを含有することが確認された。

又２二り亘旦旦丘 β−ケトチオラーゼ、ＮＡＤＰ）Ｉ−関与のアセトアセチル−ＣｏＡリダクター ゼおよびＰＨ８−ポリメラーゼのアッセイを行うために、１００　ｍｌのＡ、　 ｅｕｔｒｏｐｈｕｓ株の培養物を３０’Ｃで４０時間ＴＢＳ中で生育させた。Ｔ ｎ５変異体株用には１ｏｏμｇ／ｍｌの濃度のカナマイシンを加え、そしてｐＬ ＡＦＲ３あるいはその誘導体を含んだ採用には１０μｇ／ｍｌのテトラサイクリ ンを加えた。遠心分離で細胞を回収し、２　ｍｌの細胞溶解バッファー（ｌｏｍ ＭのＴｒｉｓ　ＨＣＩ、ｐｕａ、。

；　５　ｍＭ（７）　７３−）　ルカプトｘ　９　／　−ル；　５　ｍＭノＥＤ ＴＡＳＯ，０２ｍＭノフェニルーメチルースルフォニルーフルオライド；１ｏ％ ｖ／ｖのグリセリン）に再懸濁し、そして超音波処理で細胞溶解した。細胞溶解 液の一部を遠心分離して細胞残渣デブリスを除去し、β−ケトチオラーゼおよび アセトアセチル−ＣｏＡレダクターゼのアッセイ用とした。β−ケトチオラーゼ 活性は、ＤａｖｉｓらのＬＢｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、２６２．８２−８９　（１９ ｇ？）に記載された様に、ＮＡＤＰ）Ｉを補助因子として、アセトアセチル−Ｃ ｏＡのアセトアセチル−ＣｏＡのチオリシスの速度の測定により決定された。Ｐ ＨＢポリメラーゼアッセイは粗細胞溶解液を用いて行い、そして、Ｆｕｋｕｉら のＡｒｃｈ、　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、　１１０．１４９−１５６　（１９７６） に記載された様に、Ｄ−’Ｈ−ヒドロキシブチルーＣｏＡ　（約２μＣｉ／μｍ ｏｌの放射比活性）の取り込みレベルを測定した。タンパク質濃度は、Ｂｒａｄ ｆｏｒｄのＡｎａｌ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　７２．２４８−２５４　（１９７６ ）の方法により、Ｂｉｏｒａｄのアッセイ溶液および標準物としてウシ血清アル ブミンを用いて決定された。Ｅ、ｃｏｌｉのｍａｘｉ−ｃｅｌｌ標識実験は、５ ａｎｃａｒらのＪ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、　１３７．６９２−６９３　（１９７ ９）に記載された様に行った。

ＰＨＢの　１および 異なった株のＰＨ８レベルを調べるために、粗細胞溶解液の１００μｍを５％の 次亜塩素酸ナトリウム１．２ｍｌで３７°Ｃにて１時間処理した。不溶のＰＨＢ を次に、１ｏ分間微量遠心管で遠心分離し回収し、１　ｍｌのＨ２Ｏ，１ｍｌの アセトン、１ｍｌのエタノールで連続して洗浄し、減圧下で乾燥した。次にＰＨ ８濃度は、ＬａｗおよびＳ　１ｅｐｅｃｋｙのＪ、　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、　８ ２．３３−３６　（１９６１）に記載されている様に分光光度計で標準曲線を用 いて定量し、ｍｇ　ＰＨＢ／ｍｇタンパク質で表した。

プラスミドの　築および目　性　析 プラスミドｐＬＡ２９、ｐＬＡ４０、ｐＬＡ４１およびｐ［、Ａ４２は、ｐＡｅ Ｔ２９の制限酵素断片を広域宿主ベクター１）ＬＡＦＲ３に挿入するクローニン グで構築し、ＰＨＢ−陰性のＡ、　ｅｕｔｒｏｐｈｕｓ株を相補性分析した。

ｐＬＡＦＲ３はｐＬＡＦＲｌの誘導体で、ＦｒｉｅｄｍａｎのＧｅｎｅ　１８． 　２８９−２９６　（１９８２）に記載され、ＥｃｏＲ１部位へ挿入されたｐＵ ｃｌｌｌポリリンカークローニング部位を有する。ｐＡｅＴ９の異なった断片を ｐＬＡＦＲ３へクローニングした。ｐＬＡ２９は、ｐＡｅＴ２９がらの１５　ｋ ｂのＥｃｏＲ１部位挿入体全体をｐＬＡＦＲ３のＥｃｏＲｉ部位へつなげること で構築した。

ｐＬＡ４０、ｐＬＡ４１およびｐＬＡ４２を構築するため、先ずｐＵｃ１８へ対 応する断片をクローニングし、プラスミドｐＡｅＴ４０．　ｐＡｅＴ４Ｌおよび ｐＡｅＴ４２を生成した。次にこの断片をＢａｍ旧およびＥｃｏＲｌによる消化 でｐＵｃ１８から切り出し、アガロースゲル電気泳動で精製し、そして醜ユ旧／ Ｈ４ｎｄｌｌｌで消化したｐＬＡＦＲ３につなげた。ｐＡｅＴ４０を構築するた め、ｐＡｅＴ２９のＤＮＡを匙至１で完全に消化しＤＮＡポリメラーゼのフレノ ウ断片を用いて結合性末端を埋めた。アガロースゲル上で断片を分画した後、目 的の７　ｋｂ断片を電気溶出で精製し、ｐＵｃ１８の油１部位につなげ、そして 次にＥ、ｃｏｌｉのＤＨ５α細胞を形質転換した後に制限酵素分析によりリコン ビナントプラスミドｐＡｅＴ４０を確認した。進匡１部位の一つがこの酵素の構 造遺伝子の中にあるために、この構築によりアセトアセチル−ＣｏＡリダクター ゼ活性は除去される。ｐＡｅＴ４１の構ｉ＋ｔ、Ｓｍａｌ／Ｅｃ旦Ｒ１消化され たｐＡｅＴ２９のＤＮＡをアガロースゲルで分画し、そして５　ｋｂの逅１ル匹 Ｒ１断片を精製し、と旦１／ＥｃｏＲ１消化したｐＵｃ１８につなぎ、正しいプ ラスミドを得た。β−ケトチオラーゼおよびアセトアセチル−ＣｏＡレダクター ゼの構造遺伝子を有する２、３ｋｂの匡１断片の欠損は、ｐＡｅＴ４１のＤＮＡ を匡１により部分消化し、そして再びつなぐことにより行い、ｐＡｅＴ４２を構 築した。

Ｔｎ５挿入物のハイブリダイゼーションによるマツピング１０５個のＡ、ｅｕｔ ｒｏｐｈｕｓ　１１５９９　ＳｌのＴｎ５挿入変異体のライブラリーを構築し、 そして３２個の潜在的にＰＨＢ−陰性のコロニーを、前述の様に窒素制限最少プ レート上での不透明なコロニー表現型で確認した。これらはさらに５ｏｕｔｈｅ ｒｎ　ＤＮＡハイブリダイゼーション分析により特徴付けられた。ＤＮＡハイブ リダイゼーション実験は、制限酵素消化された各株からのクロモソームＤＮＡを 、それぞれＴｎ５　ＤＮＡプローブ（プラスミドｐＲＫ６０２）と、でＡ、ｅｕ ｔｒｏ　ｈｕｓの出Ａ−■Ｂ遺伝子座（図３）を含んだ２つのプラスミドｐＡｅ Ｔ１０およびｐＡｅＴ２９とを用いて分析して行った。

３２個の「不透明な」株は、たった三つの明確な変異体タイプの雑多なコピーを 表している。これらの三つの明確な変異体タイプは、株ＰＨＢ　＃２、ＰＨＢ　 ２３およびＰＨＢ　８１９で表される。株ＰＨＢ　＃２およびＰＨＢ　Ｈでは、 トランスポソンＴｎ５はそれぞれ２．３ｋｂおよび０．６ｋｂのクロモソームの Ｐｓｔｌ断片に挿入された。これらのクロモソームのＰｓｔｌ断片の両方は、ｐ ＡｅＴ２９にクローニングされた１５　ｋｂのＡ、　ｅｕｔｒｏｐｈｕｓのＤＮ Ａ上に位置付されたが、２にＴｎ５を挿入したが、ｐＡｅＴ２９プラスミド上に はなかった。

さらに詳細なりＮＡハイブリダイゼーション実験を、ＰＨＢ　＃２およびＰＨＢ 　＃３からのクロモソームＤＮＡに対して行い、これらの変異体のそれぞれでの Ｔｎ５ｎ５挿入の位！＆めをした。これらの株のそれぞれ、および野生株Ｈ１６ およびＰＨＢ　＃１９からのクロモソームＤ）ＪＡをむユ１、釦１１および凪１ １で１肖化し、ニトロセルローズフィルターの両面へ転写し、そしてＴｎ５　Ｄ ＮＡ　（ｐＲＫ６０．２）プローブおよびｐＡｅＴ２９　ＤＮＡプローブとハイ ブリダイゼーションさせて、ＰＩ（Ｂ　３２およびＰＨＢ　３３株中でのＴｎ５ 挿入の位置をマツピングした。

野生株Ｈ１６および、各変異株ＰＨＢ　、＄２、ＰＨＢ　＃３およびＰＨＢ　３ １９の生化学分析の結果を表２に示した。各株の定常相の培養物を１００　ｍｌ を回収し、細胞溶解し、そしてＰＨ８含量およびβ−ケトチオラーゼ、ＮＡＤＰ −特異的アセトアセチルーＣｏＡリダクターゼおよびＰＨＢポリメラーゼ活性に 関してアッセイした。これらの生育条件下では、野生株８．１６は有意なレベル のＰＨＢ、（１，３ｍｇ　ＰＨ８７ｍｇタンパク質、表２）を産生じ、三つの酵 素活性全てが高いレベルであった。変異株ＰＨ８３２およびＰＨＢ　＃３は、Ｐ ＨＢを実質的に産生ぜず、そしてＰＨ８３１９株は野生株のレベルのたった５％ しか産生じなかった（表２）。ＰＨＢポリメラーゼ活性はこれら三つの変異株全 てで検出されなかったが、しかしＰＨ８３１９株の細胞溶解液中にＰＨＢが存在 していることは、酵素活性がアッセイの検出レベルよりも恐ら（低いが、酵素が 存在していることを示している。三つの変異体全てのβ−ケトチオラーゼ活性は 、野生株Ｈ１６の４５％（ＰＨＢ　＃２）から３８％（ＰＨ８３１９）のオーダ ーに減少していた。同様に、ＮＡＤＰ−特異的アセトアセチルーＣｏＡリダクタ ーゼ活性は、野生株の５０％付近であった。ＰＨＢ−ポリメラーゼ遺伝子はｍＡ −ｍＢから上流に位置し、後者の遺伝子の発現はＰＨＢ’＃２およびＰＨＢ　９ ３株の場合上流に挿入されたＴｎ５に影響されろことがこれらのデータから結論 される。

Ａ、　ｅｕｔ＋図迫■を挿入したｐＡｅＴ：＋９の断片を含んだ一連のプラスミ ドを、広域宿主ベクターｐＬＡＦＲ３中で構築して、ＰＨＢ−陰性変異体の相補 性分析を行った。

各リコンビナントプラスミドｐＬＡ２９、ｐＬＡ４０、ｐＬＡ４１およびｐＬＡ ４２は、連結により各Ａ、　ｅｕｔｒｏｐｈｕｓ株に導入され、そして得ら“れ た連結体は、白（ＰＩ（Ｂプラス）の表現型の復活に関して窒素制限プレート上 で分析された。プラスミドｐＬＡ２９、ｐＬＡ４０ＳｐＬＡ’４１およびｐＬＡ ４２は、それぞれＰＨＢ　＃２およびＰＨＢ　＃３株のクロモソーム中にＴｎ５ が挿入された出Ａ−ｐ２Ｊ３Ｂから上流の領域を含み、これらの二つの株のそれ ぞれの変異を相補し、白いコロニーの表現型を復活している。４つのりコンビナ ンドプラスミド全てはまた、変異株ＰＨＢ　＄１９に対して野生株コロニーの表 現型を復活した。この株の場合、Ｔｎ５ｎ５挿入各プラスミドに含まれているＡ 、　ｅｕｔｒｏｐｈｕｓのクロモソーム領域の外側に位置した。ベクターｐＬＡ ＦＲ３を用いた対照実験では、三つの変異株のそれぞれに導入すると不透明なコ ロニー表現型が得られた。

各相補株の生化学分析は、変異株の特徴付けに関して記述したように行い、そし てこれらの結果もまた表２に示しである。各変異株にｐＬＡ２９を導入すると、 ＰＨＢポリメラーゼ活性およびＰＨＢ生合成が復活した（表２）。さらに、約３ から５倍のレベルのβ−ケトチオラーゼおよびＮＡＤＰ−特異的アセトアセチル ーＣｏＡリダクターゼ活性が観察された。プラスミドｐＬＡ４０およびｐＬＡ４ １はまた、ＰＨＢ−ポリメラーゼおよびＰＩ（Ｂ産生をＰＨＢ　＃２（表２）、 ＰＨＢ　＃３およびＰＨＢ　＃１９に復活させたが、ｐＬＡ４０の場合には、ｄ Ｂ遺伝子はこのプラスミドの構築中に破壊された。最後に、プラスミドｐＬＡ４ ２は、三つの変異株全てにＰＩ（Ｂポリメラーゼ活性およびＰＨ８産生を復活し たが、出Ａ−ＩＢ遺伝子は欠損していた。このプラスミドを含んだ株の場合、β −ケトチオラーゼおよびＮＡＤＰ−特異的アセトアセチルーＣｏＡリダクターゼ 活性は、野生株と同じレベルで残っていた（表２）。

表主：変異および補完されたＡ、ｅｕｔｒｏｐｈｕｓ　Ｈ２Ｓ株の生化学的分析 株　ＰＨ８’　チオラーゼ′２　リダクターゼ゛２　ネ°リメラーセ゛３（Ｘ　 １０３） Ｈ２Ｓ　１．３　８．９　１．０　３．９ＰＨＢ＃２　＜０．０１　４．０　０ ．５　ＮＤＰＨＢ＃３　＜０．０１　３．４　０．５　ＮＤＴｎ５３１９　０． ６．　３．２　：　０．４　ＮＤＨ１６／ｐＬＡ２９　１．０　２８．７　’　 ９．２　５．３ＰＨＢ＃２／ｐＬＡ２９　ｔ、ｓ　２７．５　３．５”　、’３ ．８ＰＨＢ＃３／ｐＬＡ２９　０．９　２４゜８　４．４　０．７ＰＨＢ＃１９ ／ｐＬＡ２９　１．８　２６．７　４．９　、　１．０ＰＨＢ：２／ｐＬＡ４０ 　０．９　２０．４　０，４５　０．６ＰＨＢ３２／ｐＬＡ４１　１８．　Ｏ３ ，７０，９ＰＨＢ＃２／ｐＬＡ４２　Ｌ、２　２．０　０．３　４．３ＰＨＢ＃ ３／ｐＬＡ４２　０．９　５．５　０．５　０．６ＰＨＢＳ１９　ＬＡ４２　１ ．２　５．５　０．４　０．６’、　ｍｇ／ｍｇタンパク質 ２、ユニンツ／ｍｇタンパク質 ３、ｃｐｍ／ｍｉｎ／ｍｇタンパク質 ＮＤ：検出可能な活性無し 示した結果は２あるいはそれ以上の実験の平均である。

上述の様に、プラスミドｐＡｅＴ２９上に位置するｌ止Ａ−ｍＢは、Ａ、　ｅｕ ｔｒｏｐｈｕｓプロモーターの制御下でＥ、ｃｏｌｉ中で発現した。ＰＨＢ　＃ ２およびＰＨＢ　３３株での、凶１Ｃ遺伝子が凪Ａ−Ｊ±Ｂから上流に確認され たことと、チオラーゼおよびリダクターゼ活性の減少の観察とから、これら三つ の遺伝千金ては耐山ｃから上流に位置する単一のプロモーターから発現されてい ることが示された。このことから、プラスミドｐＡｅＴ４１およびｐＡｅＴ４２ を含んだＥ、ｃｏｌｉ株の培養物を、細胞が静止期相に達するまで窒素制限条件 下で生育させ、その時点で細胞を回収し、分析した。

ｐＵｃ１８を含んだＥ、　ｃｏｌｉを対照として用いた。β−ケトチオラーゼ、 アセトアセチル−ＣｏＡリダクターゼ、ＰＩ（ＢポリメラーゼおよびＰ）［Ｂ濃 度のアッセイの結果は表３に示されており、ｐＡｅＴ４１を含んだＥ、ｃｏｌｉ の細胞溶解液は、各酵素活性およびＰＨＢ産生が顕著なレベルであることを示し ている。

上述のＥ、ｃｏｌｉ株のＭａｘｉ−ｃｅｌ１分析を、プラスミドｐＡｅＴ４１お よびｐＡｅＴ４２にフードされたポリペプチドの分子量の決定に用いた。このプ ラスミドは、ｐＵＣ８ベクターの１ａｃＺプロモーターからのＡ、　ｅｕ　ｔｒ ｏｐｈｕｓの白Ａ−ｍＢ遺伝子を発現していたので、プラスミドｐＡｅＴ１０も この分析に含められた。プラスミドｐＡｅＴ１０およびｐＡｅＴ４１を含んだ試 料中で、付加的なタンパク質バンドがそれぞれＭｒ　４０，０００およびＭｒ　 ２６，０００に存在した。これらのプラスミドの両方は、β−ケトチオラーゼ（ Ｍｒ　４１，０００）およびＮＡＤＰ−特異的アセトアセチルーＣｏＡレタクタ ーゼ（Ｍｒ　２６，０００＞をコードする川Ａ　−出Ｂ遺伝子を発現している。

これら２つのタンパク質ノイツれも、匡Ａ−ＩＢ遺伝子を含まないプラスミドｐ ＡｅＴ４２を含んだ細胞の抽出液中には存在しなかった。ベクター　ｐＵＣ８を 用いた対照実験では、Ｍｒ　４１，０００あるいはＭｒ　２６，０００にはシグ ナルを与えなかった。プラスミドｐＡｅＴ４１およびｐＡｅＴ４２の両者は、Ｅ 、　ｃｏｌｉ中でＰＨＢポリメラーゼ遺伝子（川ｃ）を発現し、そしてこれらの プラスミドを含んだ細胞の抽出物を含んだ試料中には、Ｍ、　５８，０００のシ グナルが明瞭に現れた。さらに、このタンパク質は、ｍＣ遺伝子を含まないプラ スミドｐＡｅＴ１０を含んだ細胞からの抽出液を含んだ、試料中には存在せず、 そしてｐＵＣ８を含んだ細胞の対照試料にも存在しない。Ｍｒ　３０゜０００付 近の付加的なバンドは、全ての試料中に存在し、そしてｐＵＣ８を含んだ細胞抽 出液の対照実験でもまた見いだされ、それ故これはベクターのタンパク質であろ うと思われる。これらのデータからＥ、　ｃｏｌ　ｉで発現されているｍＣ遺伝 子は約Ｍ、　５８、０００のポリペプチドをコードしていると考えられる。

表１：　Ｅ、　ｃｏ　ｌ　ｉ中の出Ｃ−Ａ　−Ｈの発現確認のためのりコンビナ ンドＥ、　ｃｏｌ　ｉの生化学的分析 チオラーゼ゛　リタ゛クターセ゛　本°リメラーセ’　ＰＨ８プラスミド ーへ　ｍ　ンへ°り ｐＵｃ１８　０．　５　ＮＤ　ＮＤ　Ｏ．　０１５ｐＡｅＴ４１　５９．０　２ ．５　２．４ｘｌＯ’　２．９７７ＡｅＴ４２　０．９　ＮＤ　０．０２Ｘ１０ ’　０．０１１ＮＤ：検出可能な活性無し 示した結果は２あるいはそれ以上の実験の平均である。

ｈｂｃのヌクレオチド配夕１ノ プラスミドｐＡｅＴ４２中にクローニングされたＡ．　ｅｕｔｒｏｐｈｕｓクロ モノームＤＮＡの２　ｋｂのＳｍａｌ−Ｐｓｔｌ断片は、１山ｃおよび恐らく調 節配列の完全な構造遺伝子を含んでいる。この断片は、上述のンデオキシ配列決 定方法を用いて、ＤＮＡ鎖の両方から何回も配列決定された。単一の長いオーブ ンリーディングフレームは、ヌクレオチド８２０からヌクレオチド２６０８のＴ ＧＡ停止コドンまで延びている。潜在的な翻訳開始コドンは、位置８４２（ＡＴ Ｇ）、１０６７（ＡＴＧ）および１０９７（ＡＴＧ）に存在する。これらの潜在 的な開始部位から翻訳すると、それぞれＭｒ　６３，９４０、Ｍｒ　５５，５１ ３およびＭｒ　５４，４８３のタンパク質が生成される。位置８４２のＡＴＧか らの翻訳生成物と、位置１０６７のＡＴＧからの翻訳生成物および以下に記述す るＰ．　ｏｌｅｏｖａｒａｎｓのＰＨＡポリメラーゼ遺伝子の生成物との間のア ミノ酸配列に顕著に相同性があることは、恐らく最初のＡＴＧ（位置８４２）が 正しいごとを示している。図４は、針巳１部位から下流に位置する山Ａ遺伝子の 最初の３０のヌクレオチドまでの、この領域の全部のヌクレオチド配列を表して いる。

位置８４２のＡＴＧから位置２６０９のＴＧＡまての、このオーブンリーディン グフレームの翻訳生成物もまた示しである。プラスミドｐＡｅＴ４　２のｍＣ遺 伝子にコードされたＰＨＢポリメラーゼは、Ｍ。

・６３，　９４０の５８９アミノ酸のポリペプチドである。ｍＡ遺伝子産生物の Ｎ−末端の１０個のアミノ酸もまた図４に示されている。

図４に示されたヌクレオチド配列の付加的な特徴には、虱１部位から上流で始ま り、位置７６のＴＧＡ停止コドンで終わる、オーブンリーディングフレームのＣ −末端が含まれる。凪ＣのＴＧＡ停止コドン（位ｆｆｉ２６０９）から８５　ｂ ｐ上下流位置にｍΔ構造遺伝子のＡＴＧ開始コドン（位置２９６９）がある。こ れらのデータから、Ａ．　ｅｕｔ　ｒｏｐｈｕｓのＰＨＢ生合成経路の三つの酵 素は、図４に示した様にｐｊ３４Ｃ　１皿Ａ−ｐｊ３４Ｂとして統合された三つ の遺伝子にコードされていることは明白である。

Ｅ．ｃｏｌｉ中でｌＣのみを発現させると、ＰＨＢあるいは顕著なレベルのＰ） ＩＢポリメラーゼ活性のいづれも産生されない（プラスミドｐＡｅＴ４２）。Ｅ ．ｃｏｌｉはＡ．　ｅｕｔｒｏｐｈｕｓの匡Ａ−　１１Ｂ遺伝子が存在しないと 、ＰＨＢポリメラーゼを基質としてＤ−　（−）−ヒドロキシルブチリル−Ｃｏ Ａを合成できない様である。ｐＡｅＴ４２の挿入体は吐ｂｃ用のプロモーターお よび構造遺伝子を含んでいるので（プラスミドｐＬＡ４２はＰＨＢ−陰性変異株 の全て相補する、表２）、Ｅ．　ｃ。

１１中では使用できる基質がない場合に、ＰＨＢポリメラーゼは活性がないか分 解されると考えられる。

Ｐ）ＩＢポリメラーゼをフードする、プラスミドｐＬＡ４２中にＡ．　ｅｕｔｒ ｏｐｈｕｓクロモソームＤＮＡを挿入した核酸配列は、Ｍｒ　６３，９４０の単 一のポリペプチド（図４）を予測させる。ＰＨ８ポリメラーゼは以前には精製お よび特徴付されていないが、Ｅ．ｃｏｌｉのｍａｘｉ−ｃｅｌｌ実験の結果はこ のペプチドがＭｒ　＝　５８，０００であることを示し、遺伝子配列から予想さ れるのと良く一致している。

何年もの間、（Ｄ）〜βーヒドロキシブチリルーＣｏＡの重合は、膜に結合した ポリメラーゼが関与し、サイトプラズムの水性の環境と疎水性の結晶性ＰＩ（Ｂ 顆粒どの間に一種のバリアーを形成する、と提唱されていた。ＰＨＢポリメラー ゼポリペプチドの親水性の性質は、典型的な膜貫通構造を示唆しない。さらに、 Ｍｅｔｈｙｌｏｌ）ａｃｔｅｒｉｕｓの天然のＰＨＢ顆粒のＮＭＲによる研究で は、高度に結晶性で固体の状態とは逆で、これらの顆粒は流動性の状態であるこ とが示された。これらのデータを合わせると、ＰＨＨの生合成には複雑な膜に結 合した重合系を全く必要と巳ないという考えに保証を与える。文献で提案された ＰＩ（Ｂポリメラーゼ用の機構には二つの部分的反応が含まれる。最初のアシル −３−酵素中間体の形成の次に、第二の反応でプライマー受容体への転移が起こ る。ＰＨＢポリメラーゼの予測される一次構造には５つのシスティン残基Ｃｙｓ ２４ａ、Ｃ３’５３１９、Ｃｙｓ３８２、Ｃｙｓａ３ｓおよびＣｙｓａｓ９があ る。

Ｐ、ｏｌｅｏｖａｒａｎｓ　ＰＨＡポリメラーゼ・伝　の確認Ｐｓｅｕｄｏｍｏ ｎａｓ　ｏｌｅｏｖａｒａｎｓ中でのポリヒドロ牛ンアルカノエ−）　（ＰＨＡ ）ポリエステルの生合成に関与する遺伝子もまた以下の様に単離された。

１９８３年にｄｅ　ＳｍｅｔらはＪ、　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、１５４゜８７０− ８７８で、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｏｌｅｏｖａｒａｎｓ　ＴＦ４−ＩＬ（Ａ ＴＣＣ２９３４７）により産生されるポリマーであるポリーＢ−ヒドロキシオク タノエートを確認した。

引き続きの研究で、Ｐ、　ｏｌｅｏｖａｒａｎｓは、使用する炭素源に依存して 一連のＰＨＡバイオポリマーを産生じ得ることが示された。

炭素源は、例えば、ｎ−アルカンおよび１−アルケン（Ｌａｇｅｖｅｅｎ　ラ、 Ａ　１．　Ｅｎｖｉｒｏｎ、　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、　５４．２９２４−２９３ ２　（１９８８弼、あるいは脂肪酸（Ｂｒａｎｄｌら、Ａ　、　Ｅｎｖｉｒｏｎ 、　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、　５４．１９７７−１９８２　（１９８ｇ）である。

この経路は、アルカン／アルケンの脂肪酸への変換を含む様であり、次にこの脂 肪酸がＢ−酸化経路に入り、Ｂ−ヒドロ牛／アセチル−ＣｏＡのＤ異性体の形成 が起こり、ＰＨＡポリメラーゼによりポリマー中に取り込まれる。１）チオラー ゼ／リダクターゼ酵素を宵さない、あるいは２）ＰＨＡポリメラーゼはＢ−ヒド ロキシルブチレートを基質として使用できないことから、Ｐ、　ｏｌｅｏｖａｒ ａｎｓは、Ｂ−ヒドロキシルブチレートノ取り込みを示していないｏ　Ｐ、ｏｌ ｅｏｖａｒａｎｓのＰＨＡポリメラーゼに使用される広い範囲の基質により、こ の酵素をコードする遺伝子は、ポリエステルのパイオポリマー工学において特別 の興味をもたれている。

Ｌユ紅玉ｎの８−ケトチオラーゼ遺伝子をＤＮＡハイブリダイゼーションプロー ブとして用い、シ堕遅立工匹のＢ−ケトチオラーゼおよびＮＡＤＰ−特異的アセ トアセチルーＣｏＡリダクターゼを単離するために用いたアプローチを、上述の 通り行い、Ｐ、ｏｌｅｏｖａ＝のＰＨＡポリメラーゼ遺伝子を単離した。Ｐ、　 ｏｌｅｏｖａｒａｎｓクロモソームＤＮＡのサザンＤＮＡハイブリダイゼーショ ンにより、Ｌ牡旦」五ｕのＰＨＢポリメラーゼ遺伝子（Ｉｃ）に高い相同性を示 す６　ｋｂのＥｃｏＲ１制限酵素断片が確認された。この６　ｋｂのＥｃｏＲ１ 制限酵素断片は、Ｅ、ｃｏｌｉプラスミドベクターであるｐＵｃ１８中に標準的 な方法でクローニングされ、プラスミドｐＰＯ２３を得た。

Ａ、ｅｕｔｒｏ　ｈｕｓのＩｃ遺伝子にハイブリダイゼーションする領域は、図 ５に示した様に位置づけされた。完全な６　ｋｂの断片のヌクレオチド配列分析 により、三つの潜在的なタンパク質コード領域（図５に示されたオーブンリーデ ィングフレーム０ＲＦ１．０ＲＦ２および０ＲＦ３）が確認された。ＯＲＦ　ｌ は、ヌクレオチド５４４のＡＴＧ開始コドンから始まりヌクレオチド２２３１の ＴＧＡ停止コドンで終わる（図６）。このオーブンリーディングフレームは、［ シあコ止ｕの出Ｃ遺伝子とハイブリダイゼーションするｐＰ０２３挿入領域に含 まれている。

０ＲＦＩは、Ｍ、＝　６２，３００ダルトンの５５９アミノ酸のポリペプチドを コードしている。０ＲＦＩを翻訳して推定したタンパク質の配列と、［朋遍四± 肛のＰｉ（Ｂポリメラーゼとを、プログラムＡＬＩＧＮを用いて比較し、二つの タンパク質の間に５２％の同一性のあることが判明した。０ＲＦ３は、位ｆｆｉ 　２２９７のＡＴＧから始まり、位置３１４６のＴＡＡで終わり、モしてＭ、　 ＝　６４，４００ダルトンの５７７アミノ酸のタンパク質をコードしている。０ ＲＦＩおよび０ＲＦ３の推定されたポリペプチド産生物は、」Ｃ遺伝子産物と４ ０％および４２％の絶対同一性かあった。単離され試験し得た全てのＰＨＡ陰性 株は０ＲＦＩで相補され、この遺伝子が通常に発現されるＰＨＡポリメラーゼを コードしていることが確認された。０ＲＦ３はまた、ＰＩ（Ａポリメラーゼをコ ードしていると信じられている。しかし、遺伝子発現試験は０ＲＦ３が通常は発 現されないことを示している。

０ＲＦ２は、位置３２１７のＡＴＧから始まり位置４９４８のＴＧＡで終わり、 そしてＭ、　＝　３１，４００ダルトンの２８３アミノ酸のタンパク質をコード している。この遺伝子は、ＰＨＡデポリメラーゼをコードしていると信じられて いる。

ＰＨＢＳＰＨＡおよび類似ポリマーの合ｊ以上により、Ｌ胚」コ斑■のＰＨＢ生 合成遺伝子をＥ、　ｃｏｌ　ｉへ導入することにより、新しいＰｈＢ産生株を構 築することが可能で、乾燥細胞重量の５０％までのＰＨＢの蓄積が得られること が確立された。新しいあるいは改良されたポリエステル産生株の構築が、多くの システムで、Ａ、　ｅｕ旦」五巨からのＰ）ＩＢ生合成遺伝子、あるいはＰ、　 ｏｌｅｏｖａｒａｎｓからのＰＨＡポリメラーゼ遺伝子および０ＲＦ２および０ ＲＦ３のいづれかにより現在可能となった。Ａ、　ｅｕｔｒ。

蝕■のＢ−ケトチオラーゼおよびＰ、ｏｌｅｏｖａｒａｎｓ中のＮＡＤＰ−特異 的アセトアセチルーＣｏＡリダクターゼ遺伝子を、広域宿主発現ベクターｐＮＭ １８５　（Ｍｅｒｍｏｄら、Ｊ、　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、　１６７、４４７−４ ５４　（１９８６）、あるいはｐＥＲＤ２０／ｐＥＲＤ２１　（Ｒａｍｏｓら、 ＦＥＢＳ　ＬＥＴＴＥＲＳ　２２５．２４１−２４６　（１９８６）の中で、■ がプロモーターの制御下で発現する７３−２８２　（１９８３））による。これ らと同じベクターが、［肛且匹ｌのＰＨＢポリメラーゼ遺伝子あるいはプラスミ ドｐＰＯ２３にクローニングされた三つのＰ、　ｏｌｅｏｖａｒａｎｓ遺伝子の 発現に使用し得る（図５）。

二つのプラスミドｐＬＡＰ１およびｐＬＡＰ２が構築され、これらはＰ、　ｏｌ ｅｏｖａｒａｎｓのＰＨＡポリメラーゼ遺伝子および０ＲＦ２（ｐＬＡＰｌ）あ るいはＰＨＡポリメラーゼ遺伝子および０ＲＦ２プラス０ＲＦ３（ｐＬＡＰ２） ヲＡｅｕｔｒＯｈｕｓの戯Ｃボロモーターの制御下で発現するはずである（図４ ）。

これらのプラスミドを構築するため、１山ｃプロモーターを含んだプラスミドｐ ＡｅＴ４２中のＡ、　ｅｕμ立±Ｕ挿入体の最初の８１０ヌクレオチドを含んだ 、　８１０　ｂｐのＳｍａ　１−ＢｓｔＢ　１制限酵素断片をＥ、ｃｏｌｉベク ターｐＵｃ１９中の唯一の漁１部位につなげ、プラスミドｐＡｅＴＢ１を得た。

シュ１消化したｐＰＯ２３のＤＮＡの端から１７０ｏｖａｒａｎｓのＰＨＡポリ メラーゼ遺伝子プロモーターを除去し、そして引続き」１で消化することにより ＰＨＡポリメラーゼ構造遺伝子プラス０ＲＦ２を回収し、そしてこの断片をＳｍ ａｌ／Ｃ１ａｌ消化したｐＢＬＳＫ＋ベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、　Ｌａ 　Ｊｏｌｌａ、　ＣＡ　９２０３７）にクローニングした。ｐＰＯＢｌｏの挿入 は、ＰＨＡポリメラーゼ構造遺伝子のＡＴＧ開始コドン（ヌクレオチド５３５、 図６）からすぐ上流の１９ｂｐを含むことで、完全なＰＨＡポリメラーゼ構造遺 伝子および０ＲＦ２であることを確認した。構造遺伝子と０ＲＦ２は次に、２． ６ｋｂのＢａｍＨｌ−Ｘｈｏｌ断片上に回収され得、そしてＢａｍｔ（１／５ａ ｉｌ消化したｐＡｅＴＢｌにつなげ、プラスミドｐＡｅＰ１を得た。坦山Ｃプロ モーター〜ＰＨＡポリメラーゼ構造遺伝子−０ＲＦ２構築物を含んだｐＡｅＰｌ の完全な挿入体を、次に３，４のに吐１−■匝１１１断片に切り取り、そして広 域宿主ベクターｐＬＡＦＲ３のポリリンカー領域にクローニングし、「弦旦」± ｕ株中にとりこんだ。ｐＡｅＰ２を構築するために、ｐＰＯＢｌｏからの２．６ ｋｂのｈ■１−臘ユ１断片と、０ＲＦ３を含んだｐＰＯ２３から）２．５　ｋｂ ノｃｌａｌ−匹１断片とを、ＢａｍＨ１／５ａｌｔ消化したｐＡｅＴＢｌとつな げ、ｐＡｅＰ２を得た。もう一度、Ｖ山Ｃ−ＰＨＡポリメラーゼ−０ＲＦ２−Ｏ ＲＦ３構築物を、５．９　ｋｂの江」１−ニＩＩＩ断片として切り取り、そして ｐＬＡＲＦ３のポリリンカーＲ域へクローニングし、ｐＬＡＰ２を得た。ｐＬＡ Ｐｌは、紅玉」二点ｕ中のＰＨＡポリメラーゼおよび０ＲＦ２の両方を発現する はずであり、モしてｐＬＡＰ２はそれに加えて０ＲＦ３を発現するはっである。

もしこれらの遺伝子が発現されないなら、Ｂ−ケトチオラーゼおよびＮＡＤＰ− 特異的アセトアセチルーＣｏＡリダクターセ遺伝子用に上述した、広い宿主領域 を有する発現ベクターに挿入し得る。

ＰＨＢポリメラーゼおよびＰＨＡポリメラーゼ遺伝子は、細菌および植物システ ム中では、ＰＨＡポリマーの産生の役に立たないことを証明しなければならない 。しかし、クローニングされ特徴付けられた遺伝子は、さらに二つのポリメラー ゼの融合による構築あるいは化学的変異誘発ζこより改変し得る。機能的なポリ メラーゼ酵素は次に、表現型による外観あるいは増大した密度によりポリマーの 蓄積が検出できる適切な生物体中で選択できる。これは、酵素の特異性を変える 、新規のポリメラーゼを創製するだめの直線的なアプローチである。

ｏ　１ｅｏｖａｒａｎｓで示した様に、一連の生物体からのポリマー遺伝子およ び遺伝子産生物の単離および特徴付けの後、遺伝子産生物の発現を制御する手段 が確立し得る。≧岨匝二のチオラーゼ遺伝子の過剰生産は、Ｌ二ｒ山ｔｅｒａの 転写開始部位およびプロモーターを定義するために使用する実験で示された。過 剰産生は酵素を均一まで精製することを可能にし、そして分析および基質特異性 の比較のための試薬に用い得る量を与える。加えて、精製された酵素は、ｉｎ　 ｖｉｔｒｏのポリマー合成用の立体特異的基質の合成に使用し得る。さらに、ポ リマーの過剰生産に対応する転写調節機構か一連の環境条件下で解明されたなら 、既知のポリマーおよび新規のポリマーの酵素的合成用のｉｎ　ｖｉｔｒｏシス テムが開発され、新しい物質が提供される。この新しい物質は、次にこのポリマ ーの最適の利用がなされる様に、化学組成、分子量およびレオロジー特性に関し て分析される。

Ｅ、ｃｏＬｉ中でのし二ｙ山ｐチオラーゼの過剰生産システムは、合成された上 プロモーターを用いて構築され、一連のチオラーゼ発現プラスミドを生成し、Ｅ 、ｃｏＬｉ細胞中に導入された最適の構築体が総可溶性細胞タンパク質の約２０ −３０％のチオラーゼを与える。この方法は試薬に用い得る量のチオラーゼを与 え、平均１５０　ｍｇの純粋なチオラーゼが１Ｌの培養物から得られる。

Ｌ坦扛し■およびＡ、　ｅｕｔｒｏ　ｈｕｓの遺伝子調節が起こると予想される 本質的に二つの条件がある；栄養制限条件下で炭素が不足した細胞に引続いて炭 素源を与え、次いで栄養制限条件下で生育した細胞が大量のＰＨＢを蓄積させ、 そして栄養制限条件を取り去ると、ＰＨＢの分解が起こる。

ポリマーの生合成遺伝子の転写調節は、以下の様に決定される。種々の条件下で 生育した培養物を、酵素アッセイ（チオラーゼ、リダクターゼおよびシンセター ゼ）およびＲＮＡ精製の両方ために回収する。ＲＮＡ試料をクローニングされた 遺伝子をプローブとして、一連のノーザンＩ＼イブリダイゼーション実験で分析 する。有用なＲＮＡハイブリダイゼーションの方法論には、ＲＮＡのグリオキシ ル化（ＭｃＭａｓｔｅｒおよびＣａｒｍｉｃｈａｅｌのＰｒｏｃ、Ｎａｔｌ、　 Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　７４．４８３５　（１９７７））；ホルムアル デヒＳｃｉ、　ｔｌｓＡ　１６．４７４３　（１９７７））；ニトロセルローズ あるいはナイロンフィルターへの移動（ＴｈｏｍａｓのＰｒｏｃ、Ｎａｔｌ、　 Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ。

旦７７、５２［）１　（１９８０））；およびニックトランスレーションにより ３２ｐで標識したＤＮＡプローブとのハイブリダイゼーシヨン（Ｒｉｇｂｙらの Ｊ、　Ｍａｌ、　Ｂｉｏｌ、　１１３．２３７　（１９７７））が含まれる。Ｄ ＮＡプローブは、クローンｐＨｃＤＢＫ１（Ｚ、　ｒａｍｉｇｅｒａ）　；およ びｐＡｅＴ３　（Ａ、　ｅｕｔエアーから調製した。これらの実験の結果の一つ として、遺伝子のオペロンの統合およびｍＲＮＡの長さの確定ができた。

それぞれの生合成酵素のレベルを操作し、そしてポリマー合成におけるその効果 をモニターした。速度制限酵素（あるいは複数の場合も有り得る）を過剰産生ず ることで経路の流量を増大させるためには、生合成経路中の速度制限酵素（ある いは複数の場合も有り得る）を確認することが必要である；各酵素の過剰生産の 効果は、異なるモノマーユニットの取り込み、即ちブチレートで生育させたしム コ」±巨により産生されたコポリマー中のＰＨＢ：ＰＲＹの比率に影響する；そ して一つの種からの遺伝子を他の種の中で発現させ、例えば、包ユニＵの遺伝子 をＡ、ｅｕｌ旦±■で、およびその逆に、および他の生物体からの他の単離およ び特徴付けられた不均一な遺伝子を、例えば複数の宿主生物体中でポリマー生合 成遺伝子を過剰生産させるためには、これらの細菌中で機能する広域宿主発現ベ クターを使用しなければならない。一つの例として、遺伝子投与量による酵素の 過剰生産を行った。例えば、プロモーター領域を含んだ完全なｐＵｃＤＢＫ１挿 入体は、ベクターｐｓＵＰ１０４（Ａ。

Ｐｏｂｌｅｒｍ集のＭｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｂ ａｃｔｅｒｉａ−Ｐｌａｎｔ　１ｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ、（Ｓｐｒｉｎｇ−Ｖｅ ｒｌａｇ、　ＮＹ　１９８３）中にＳｉｍｏｎらが記載）へクローニングし得、 そしてＬ坦肚■ユｌ−１６−Ｍを形質転換するのに使用し得る。各酵素の過剰生 産の度合は酵素アッセイでモニターされ得る。同様のアプローチが、いかなる数 の他の遺伝子にも行い得る；例えば、チオラーゼ；チオラーゼおよびリダクター ゼ；　リダクターゼ：　リダクターゼおよびシンセターゼ、その他。第二に、遺 伝子は、高効率のプロモーター、即ちｔａｃ（ＧｉｌｌらのＪ、　Ｂａｃｔ、　 １６７、６１１−６１５　（１９８６）およびｔｏｌ　（ＭｅｒｍｏｄらのＪ、 　Ｂａｃｔ、　１６７．４４７−４５４　（１９８６）の転写調節下に置き得る 。この場合構築物は、対応した遺伝子を欠損した変異体へ連節される。ポリマー の生合成遺伝子あるいは目的の遺伝子の発現は、次に過剰生産のレベルを酵素ア ッセイを用いてモニターし定量することで、厳密に調節し得る。各構築物を試験 するので、ポリマー合成の効果、即ち合成の速度およびレベルをルーチン的にモ ニターすることができる。

７８られる基　あるいは酵素の特６性を・・えることによるポリ二二艷炙二玖亥 異なった細菌によって産生されたＰＨＢあるいはＰｉ（Ａの分子量を決定する因 子は、種々の細菌により産生されたポリマーの分子量分布を分析することで解明 できる。多くのＰＨＢ−生産微生物が、Ｄ（−）−ヒドロキシルブチレート以外 のモノマーをポリマー鎖に組み込む能力にはほとんど疑問はない。Ｌ匹■並鳳Σ により産生されたＰＨＢ−ＰＨ’／コポリマーの場合、プロピオネートが先ずプ ロピオニル−ＣｏＡに変換され、次にこれがβ−ケトチオラーゼの基質として働 （と提案されている。過剰生産システムから得られる高い収量の純粋な酵素が、 三つのＰＨＢ−生合成酵素のそれぞれが利用し得る代わりの基質の範囲を決定す るた５に必要であり、そして得られる基質が厳格に制御し得るｉｎ　ＶｉｔｒＯ システム中で、種々のタイプのＰＨＢ一様の新ポリマーが合成され得る。

チオラーゼおよびリダクターゼ酵素は、ＰＨＢおよびＰＨＢ一様のポリマーの生 合成の本質的な部分であるが、生成される新しいタイプのポリマーを最終的に決 定するのはＰＨＢポリメラーゼである。このことは、その多くは細胞中に入らず 、そのため発酵工程によるＰＨＢへの取り込みを試験できない基質についても、 全部の範囲の基質を試験することが、酵素を用いたｉｎ　ｖｉｔｒｏシステムの 開発により、容易となった。

一つ以上のりダクターゼ酵素の過剰産生および精製により、酵素の反応速度およ び特異性を比較する手段が提供された。

ｚｏｏｇｌｏｅａのリダクターゼは、ＮＡＤＰ−特異的であると報告されている が、Ａ、　ｅｕｔｒｏｐｈｕｓの酵素は明かにＮＡＤあるいはＮＡＤＰのいづれ かを使用する。この酵素の立体特異性は、この酵素をＰＨＢポリメラーゼの研究 用のＤ−基質の合成用の有用な試薬として得る。アセトアセチル誘導体の内試験 されるものは、ＣｏＡのオキソエステルおよびオキソバンテテインピヴアロエー ト（ＯＰＰ）およびそのメチレン誘導体である。このメチレンアナログのオキソ エステルではなくケトンがＺｏｏｇｌｏｅａのチオラーゼにより分解される。

種々のより長い鎖のアルキル誘導体が、特にＣ５からＣＢの直鎖の３−オキソチ オールエステル、オキソエステルおよびメチレンケトン、もまたＰＨＢポリメラ ーゼの基質として有用であり得、Ｂ、　ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ中のＣｓ−Ｃｓ− β−ヒドロキシアルカノエートが存在すれば、オレフィン、アルコールおよびエ ポキシドも基質として有用であり得る。

Ｚ、　ｒａｍｉｇｅｒａの粗抽出物中の、Ｌ−ヒドロキシルブチリルＣｏＡでは なくＤ−β−ヒドロキシルブチリルＣｏＡはＰＨＢポリメラーゼの基質である。

他のＤ−ヒドロキシルアシルＣｏＡ種も代わりの基質あるいはＤ−β−ヒドロキ シバレリルＣｏＡ　（ＨＶ−ＣｏＡ）の様な共基質として利用できると予測され ている。［２−３Ｈ］ＨＢ−ＣｏＡおよびβ−［３−”　Ｃ］−ＨＶ−ＣｏＡは 、それぞれ酵素的あるいは化学的合成により簡単に調製でき、そして基質として 使用し得、そして沈澱したあるいはゲル濾過で分離したポリマー中の３Ｈおよび ＩＡＣ含量あるいは比率をモニターし得る。ブロックコポリマー領域、例えば（ ＨＢ）５Ｔ１１１（Ｈ’／）　＋５８２（ＨＢ）ｓａａ・は、例えば、ＨＢ−Ｏ ＸＯ−ＣＯＡおよび）ｔＶ−Ｓ−ＣｏＡモノマーの様な基質の比率および延長期 での脱離基を慎重に制御することで構築し得ると予測できる。

分岐したβ−ヒドロキシアンルＣｏＡ　’Ｒを含んだ付加的な他の基質も試験し 得る。この様な化合物は通常細胞中へ輸送されないので、全細胞中では試験は行 えない。他の基質は、正常な［”Ｃ］−ＰＨＢ形成の阻害に関して、先ず可溶性 の［”　Ｃ］−）ＩＢＣｏＡを不溶性のポリマーに取り込ませることで、次いで 共重合の共基質として、そして最後にホモポリマー化で、試験され得る。代わり の基質は、ＨＢ−ＣｏＡ・に対するに７、ＶｌｌａＸｓ　および、キャリプレー トされたゲル濾過実験で決定されるポリマーサイズで試験される。

連続してＰ）ＩＢを　生する　法 ＰＨＢは、栄養制限条件下、通常は窒素制限条件（例えば、０゜１％窒素、種に 依存する）で生育させると、細菌中で産生され貯蔵され、酸素、リン酸あるいは 他の非−炭素栄養源を制限してもまたＰＨ８合成および貯蔵は誘起される。例え ば、窒素固定細菌Ａｚｏｔｏｂａｃｔｅｒ　ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉｊは、酸素 制限下、グルコース／アンモニウム塩で生育すると、乾燥細胞重量の７０％まで をＰＨＢとして蓄積する。利用可能な酸素を増大させるとＰＨ８合成が減少し、 そして二つの生合成酵素のレベルの減少を伴う。酵素レベルの減少は遺伝子レベ ルで働いている調節機構（あるいは複数の場合も有り得る）を反映する。Ａｌｃ ａｌｉｇｅｎｅｓ　ｅｕｔｒｏｐｈｕｓの生育の窒素制限は、乾燥細胞重量の８ ０％までのＰＨＢ収量を与える。同様に、１ａ１０１）ａｃｔｅｒｉｕｍおよび Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｓｐ、も窒素制限下でＰ）ＩＢ産生を増大させる。

非制限条件下では、通常はＰＩ（Ｂを産生ずる生物体中のＰＨＢは、分解酵素に より迅速に分解する。制限条件下の生育で蓄積されたＰＨＢは非制限条件下では 分解されないので、この分解酵素が不活性な様にあるいは欠失している様に、こ れらの生物体を変異することができる。これらの細菌を生育させるために、ＰＦ ＩＢは培地中に排出されても良い。あるいは、Ｐｉ（Ｂを代謝（生合成および分 解）しない必須酵素を生物体へ導入し、その生物体に制限条件下で大量のＰＨＢ を蓄積させ、そして条件が非制限に変化しまたときに、生物体が培地中へＰＨＢ 放出するようにし得る。

制限および非制限条件をくりかえすことで、最大量のＰＨＢを蓄積することがで き（ポリマー含量の関数として増殖する細菌の吸光度に基づき）、細菌の複製を 促進する非制限条件へ変化させることで、蓄積されたポリマーを培地中へ放出さ せる。

細菌を破壊することなくポリマーを含んだ培地を連続除去することで、生物体は 通常の発酵システムで培養できる。

植物中での発現、および、ＰＨＢおよびＰＨＡポリマーの産生上述の様に細菌発 現システムを用いて、チオラーゼ、リダクターゼ、および／あるいはＰＨＢ用の ポリメラーゼ、あるいはＰＩ（Ａをコードしている遺伝子は、種々の種の植物中 で発現され得、所望するポリマー性の産生物を産生ずる。この様なシステムの利 点は、石油に基づくプラスティックへの依存の減少、および種々の土壌の上で生 育可能な植物用の経済的に有用な作物の創製、等で即座に明白となる。

植物の遺伝子工学用の第一に要求されることは、外来ＤＮＡを植物組織へ運搬す るシステムである。現時点で最も一般的なベクターは、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉ ｕｍ　ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓの腫瘍誘起（Ｔ１）プラスミドであり、感染によ りＤＩＪＡを運搬する。カリフラワーモザイクウィルスあるいはＧｅｍ１ｎｉウ イルスベクターを基にしたベクターの様な、植物ＤＮＡウィルスもまたベクター として使用し得る。植物細胞へ直接遺伝子を転移する多くの方法があり、プロト プラストによる化学的に刺激されたＤＮＡの取り込み、エレクトロポーレーショ ン、無処理の植物細胞のエレクトロインジェクション、リボン・・−ムを介した プロト・プラストの形質転換、および植物への直接注入によるＤＮＡ形質転換、 が含まれる。化学的に刺激した取り込みは、プロトプラストをドナーおよびキャ リアーＤＮＡを１３％（Ｗ／Ｖ）のポリエチレングリコールの存在下で４０　ｍ ＭのＣａＣ１２中でインキュベートすることが必要である。ボスト−インキュベ ーションを行い、ＣａＣｌ２濃度を徐々に上昇させると共にＰＥＧ濃度を徐々に 低くする。エレクトロボーレーションは、高い電圧の電気パルスを用い、細胞膜 を可逆的に透過性とし、ＤＮＡを含む大きな分子の取り込みを容易にする。電気 注入および直接注入は、最初にプロトプラストの形成を行う必要がないという利 点を有する。これらの方法は、当業者には既知である。例えば、Ｃ，Ｐ、　Ｌｉ ｃｈｔｅｎｓｔｅｉｎおよびＳ、Ｌ、Ｆｕｌｌｅｒによる総説、”Ｖｅｃｔｏｒ ｓ　ｆｏｒ　ｔｈｅ　ｇｅｎｅｔｉｃ　ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ　ｏｆ　ｐｌａ ｎｔｓ＋、　Ｇｅｎｅｔｊｃ　Ｅｎ　１ｎｅｅｒｉｎ　Ｐ、　Ｗ、　Ｊ、　Ｒｉ ｇｂｙ編果ｖｏ１．６．１０４−１７１　（Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ　Ｌ ｔｄ、　１９８７）を参照。

遺伝子は、サイトプラズム、ミトコンドリア、あるいはクロロプラストへ、直接 あるいはターゲツティング用配列のいづれかを用いて、導入し得る。ベクターお よびターゲツティング用配列および植物用のプロモーターは、当業者に既知であ り、そしてＰｈａｒｍａｃｉａ−ＩＪＢ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、　８０ ０　ＣｅｎｔｅｎｎｉａＩ　Ａｙｅ、、　Ｐｉｓｃａｔａｖａｙ、　ＮＪ　０８ ８５４−９９３２およびＳｔｒａｇｅｎｅ、　Ｌａ　Ｊ。

１１ａ、　ＣＡから市販されている。

有用な炭素基質を産生ずる全てのタイプの植物は、ポリマー産生のために改良し 得る。植物中でのポリマーの産生に関して用いる場合、用語「ポリマー」は、Ｐ ）ＩＢ、　ＰＨＡ、および開示したポリメラーゼを使用して脂肪酸から合成され る炭素を基にした新規のポリマーを含む。もしも植物が適切な脂肪酸を形成しな い場合、チオラーゼおよびリダクターゼ遺伝子を一つあるいはそれ以上のポリメ ラーゼと共に植物に導入し得る。Ａ、　ｅｕｔｒｏｐｈｕｓのポリメラーゼは、 Ｃ４および０５基質を重合する。Ｐ、ｏｌｅｏｖａｒａｎｓのポリメラーゼは、 Ｃ６からＣ１８の脂肪酸の様に、より長い基質に働き、短い鎖の脂肪酸には働か ない。好ましくは変異誘発により、グリセリンエステルおよび脂肪酸分解経路を ブロックして植物が適切な基質を形成する様に改変し得る。

遺伝子は、全てのタイプの植物へ導入し得る。広く生育され、これらの遺伝的シ ステムは良く特徴付けられているために、トウモロフン、小麦および米の様な、 穀物植物が好ましい。他の有用な農耕用の植物には、タバコおよび高脂肪種子植 物、特に荒れ地あるいは無機塩を含んだ土壌で生育するこれらの変種が含まれる 。

これらの遺伝子は、また、植物細胞培養／ステムへも導入でき、これらの多くは 当業者に既知である。種々の穀物および他の農耕用の作物の培養は、Ｄ、　Ａ、 　Ｅｖａｎｓ、　Ｗ、　Ｒ，５ｈａｒｐおよびＰ、　Ｖ、　Ａｍｍ１ｒａｔｏｉ ｉｉ集のＨａｎｄｂｏｏｋ　ｏｆ　Ｐｌａｎｔ　Ｃｅ１ｌ　Ｃｕ１ｔｕｒｅｖｏ ｌ、４　（Ｍａｃｍｉｌｌａｎ　ＰｕｂｌｉｓｈｉｎｇＣｏ、　ＮＹ　１９８６ ）に詳細に記載されている。多くの遺伝子研究が行われた植物システムの特別な 例は、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ　ｔｈａｌｉａｎａである。細菌中での産生に関 して記述したように、細胞培養中でのポリマー産生は、クローニングされた遺伝 子の導入のみならず、基質および条件の変化により操作できる。

本発明の、炭素−炭素骨格を有するポリヒドロキシブチレートおよびポリヒドロ キシブチレート一様のポリマーを、上述の詳細な記述に従ったりコンビナンド技 術を用いて作る方法、および得られるポリマー、の改変および変更は当業者には 明白である。この様な変更および改変は添付した請求項の範囲内にあるものと見 なされる。

、＝＝　ミ　；ＥＭ＠：：ｕ　ニニ＝！暑＝！二至＝Ｆ／６　政′、３　（、、 ｒ）、、、／）ＦＩＧＵＲＥ５ ＦＩＧＵＲＥ　６　ｊｐａｇｅ　Ｉ） ＦＩＧＩＩＲＥ　６　（ｐａｇｅ　２１ＦＩＧＵＲＥ　６　（ｐａｇｅ　３） ｍｗ　Ｔｃ　為 ＾１，１−〇□ｈ−”ａＬｙＡＬａｕ＾ａａｐ＋ｃｄ、−一−ｒｈ＋ｘｕｐ＋ａ ＾ニーＣ１ｙしｅｕ４λυＶａ上ｃｙｍｃｌｙＴｈｔＰｒｏ撃撃≠拷■香[ＩＪ ｃｌａＬｙｍｖａＷλｕＬ−ｕ＾−＄ｆＰ平成４年１月１０日 ＰＣＴ／ＵＳ９０１０３８５１ 、発明の名称 新規なポリエステルバイオポリマー ３、特許出願人 住所　アメリカ合衆国　マサチューセッツ　０２１３９゜ケンブリッジ、マサチ ューセノツ　アベニュー　７７名称　マサチューセッツ　インスティテユート　 オブ住所　〒５４０　大阪府大阪市中央区域見−下目２、特許請求の範囲 １、宿主中でポリエステルバイオポリマーを構築する方法であって、 βケトチオラーゼおよびアセトアセチルＣｏＡレダクターゼを含む、ポリヒドロ キノアルカノエートの合成に必要な酵素をコードする遺伝子の発現のために、宿 主を選択する工程、該宿主に、単離されたボ１ノヒドロキシアルカノエートポリ メラーゼをコードする構造遺伝子を該遺伝子の発現の調節配列と組み合わせて導 入する工程、および発現した該酵素にポリヒドロキノアルカノエートを合成する ために適当な基質を提供する工程、 を包含する、方法。

２、前記ポリヒドロキシアルカノエートがポリヒドロキンブチレートである、請 求項１に記載の方法。

３、酵素をそれらの基質特異性に基づいて選択する工程をさらに包含する、請求 項１に記載の方法。

４、酵素をコードする遺伝子を改変することにより酵素の基質特異性を変化させ る工程をさらに包含する、請求項１に記載の方法。

５、特定のインデューサーに反応して、ポリマーの合成に必要な酵素をコードす る遺伝子の発現を制御する、調節配列を発現ヘクターに提供する工程をさらに包 含する、請求項１に記載の方法。

６、ポリマー合成の特定のインデューサーが温度変化および特定の基質からなる 群から選択される、請求項５に記載の方法。

７、前記遺伝子がＺｏｏｑｌｏｅａ、　Ａｚｏｔｏｂａｃｔｅｒ、　Ａｌｃａｌ ｉｇｅｎｅｓ。

Ｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｎｏｃａｒｄｉａ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ、Ｈａｌｏｂａ ｃｔｅｒｉｕｍ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ、　ＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓおよびＲ ｈｏｄｏｓｐｉｒｉｌｌｉｕｍからなる群から選択される細菌に由来する、請求 項１に記載の方法。

８、ポリマー合成に必要な酵素の少なくとも１つが欠損した細菌宿主中で前記遺 伝子を発現させる工程をさらに包含する、請求項１に記載の方法。

９、前記遺伝子を植物宿主中で発現させる工程をさらに包含する、請求項１に記 載の方法。

１０、前記遺伝子が、ヒドロキシアシルＣｏＡ基質のＤ異性体に立体特異的な酵 素を特徴とする請求項１に記載の方法。

１１、　請求項１に記載の方法で製造される／＜イオポリマー。

１２、ＮａＣ１、クエン酸ナトリウム、リン酸ナトリウム溶液中で約１６から１ ８時間、６５°Ｃにて、ポリヒドロキシアルカノエートボリメラーセをコードす る遺伝子とノ・イブリダイズする、単離されたＤＮＡ配列。

Ｈ，Ｚｏｏｑｌｏｅａ、　Ａｚｏｔｏｂａｃｔｅｒ、　Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ 、　Ｂａｃｉｌｌｕｓ、　Ｎ。

ｃａｒｄｉａ、　Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ、　Ｈａｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、　 Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ、　ＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓおよびＲｈｏｄｏｓｐｉｒ ｉ　ｌｌｉｕｍからなる群から選択される細菌に見いだされる酵素を特徴とする 請求項１２に記載の配列。

１４、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｏｌｅｏｖａｒａｎｓに見いだされる酵素を特 徴とする請求項１２に記載の配列。

１５、図６に示された配列を有する、請求項１４に記載の配列。

１６１図６に示すヌクレオチド５５４位から２２３１位のオーブンリーディング フレーム１およびヌクレオチド３２１７位から３１４６位のオーブンリーディン グフレーム３、または標準的条件下でこれらにハイブリダイズする配列を有する 、請求項１４に記載の配列。

１７、単離された構造遺伝子から発現される、ポリヒドロキシアルカノエートポ リメラーゼ。

１８、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｏｌｅｏｖａｒａｎｓに見いだされる遺伝子が コードする、請求項１７に記載のポリヒドロキシアルカノエートポリメラーゼ。

１９、ポリエステル骨格を有するバイオポリマーを合成する系であって、 βケトチオラーゼおよびアセトアセチルＣｏＡレダクターゼを含むポリヒドロキ ノアルカノエートの合成に必要な酵素をフードする遺伝子、および単離されたポ リヒドロキシアルカノエートポリメラーゼをコードする構造遺伝子、とを遺伝子 を宿主中で発現させるための調節配列と組み合わせて、該酵素群かポリヒドロキ ノアルカノエートを合成するための適切な基質を含んだ栄養培地中で、発現させ るための宿主を包含する、系。

２０、前記宿主か細菌および植物からなる群から選択される、請求項１９に記載 の系。

２１、前記基質か、アセトアセチル誘導体、オレフィン、エステル、アルコール 、ジオール、エボ牛ンド、Ｄ−ヒドロキシブチリルＣｏＡＳＤ−βヒドロキシバ レリルＣＯＡ％　分枝βヒドロキシアシルＣｏＡＳＤ−３−ヒドロキシブチリル ＣｏＡのアシルＣｏＡモノマー類似体、ア／ルチオエステルＣｏＡ、およびこれ らの組合せからなる群から選択される、請求項１９に記載の系。

国際調査報告 国際調査報告 ＵＳ　９００３８５１ ＳＡ　３８８８７

Claims (27)

【特許請求の範囲】
1. １．宿主中でポリエステルバイオポリマーを構築する方法であって、 ポリヒドロキシアルカノエートの合成に必要な酵素をコードする遺伝子の発現の ために、宿主を選択する工程、該宿主に、βケトチオラーゼ、アセトアセチルＣ ｏＡレダクターゼ、ポリヒドロキシブチレートポリメラーゼ、およびポリヒドロ キシアルカノエートポリメラーゼからなる群から選択される酵素をコードする単 離された構造遺伝子群を、該遺伝子群を宿主中で発現させる調節配列と組み合わ せて導入する工程、 導入された遺伝子群にコードされる酵素を発現させる工程、および 発現した該酵素群にポリヒドロキシアルカノエートを合成するために、適当な基 質を提供する工程、を包含する、方法。
2. ２．前記ポリヒドロキシアルカノエートがポリヒドロキシブチレートである、請 求項１に記載の方法。
3. ３．酵素をそれらの基質特異性に基づいて選択する工程をさらに包含する、請求 項１に記載の方法。
4. ４．酵素をコードする遺伝子を改変することにより酵素の基質特異性を変化させ る工程をさらに包含する、請求項１に記載の方法。
5. ５．特定のインデューサーに反応して、ポリマーの合成に必要な酵素をコードす る遺伝子の発現を制御する、調節配列を発現ベクターに提供する工程をさらに包 含する、請求項１に記載の方法。
6. ６．前記インデューサーが温度変化および特定の基質からなる群から選択される 、請求項５に記載の方法。
7. ７．前記遺伝子がＺｏｏｇｌｏｅａ，Ａｚｏｔｏｂａｃｔｅｒ，Ａｌｃａｌｉｇ ｅｎｅｓ，Ｂａｃｉｌ１ｕｓ，Ｎｏｃａｒｄｉａ，Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ，Ｈ ａｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ，Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ，Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ およびＲｈｏｄｏｓｐｉｒｉｌｌｉｕｍからなる群から選択される細菌に由来す る、請求項１に記載の方法。
8. ８．ポリマー合成に必要な酵素の少なくとも１つが欠損した細菌宿主中で前記遺 伝子を発現させる工程をさらに包含する、請求項１に記載の方法。
9. ９．前記遺伝子を植物宿主中で発現させる工程をさらに包含する、請求項１に記 載の方法。
10. １０．前記遺伝子が、ヒドロキシアシルＣｏＡ基質のＤ異性体に立体特異的な酵 素をコードする、請求項１に記載の方法。
11. １１．請求項１に記載の方法で製造されるバイオポリマー。
12. １２．ＮａＣｌ、クエン酸ナトリウム、リン酸ナトリウム溶液中で約１６から１ ８時間、６５℃にて、ポリヒドロキシブチレートポリメラーゼをコードする遺伝 子とハイブリダイズする、単離されたＤＭ配列。
13. １３．Ｚｏｏｇｌｏｅａ，Ａｚｏｔｏｂａｃｔｅｒ，Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ， Ｂａｃｉｌｌｕｓ，Ｎｏｃａｒｄｉａ，Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ，Ｈａｌｏｂａ ｃｔｅｒｉｕｍ，Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ，ＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓおよびＲｈ ｏｄｏｓｐｉｒｉｌｌｉｕｍからなる群から選択される細菌に発現される酵素を コードする、請求項１２に記載の配列。
14. １４．図４に示す請求項１３に記載の配列。
15. １５．標準条件下でポリヒドロキシアルカノエートポリメラーゼをコードする遺 伝子とハイブリダイズする、単離されたＤＮＡ配列。
16. １６．Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｏｌｅｏｖａｒａｎｓに見いだされる酵素をコ ードする、請求項１５に記載の配列。
17. １７．図６に示された配列を有する、請求項１６に記載の配列。
18. １８．図６に示すヌクレオチド５５４位から２２３１位のオープンリーディング フレーム１およびヌクレオチド３２１７位から４９４８位のオープンリーディン グフレーム３を有する、請求項１６に記載の配列。
19. １９．図６に示すヌクレオチド２２９７位から３１４６位のオープンリーディン グフレーム２の配列、または標準的条件下でこれらにハイブリダイズする配列を 有する、単離されたＤＮＡ配列。
20. ２０．単離された構造遺伝子から発現される、ポリヒドロキシブチレートポリメ ラーゼ。
21. ２１．Ｚｏｏｇｌｏｅａ　ｒａｍｉｇｅｒａおよびＡｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ　ｅ ｕｔｒｏｐｈｕｓからなる群から選択される細菌に見いだされる遺伝子がコード する、請求項２０に記載のポリヒドロキシブチレートポリメラーゼ。
22. ２２．単離された構造遺伝子から発現される、ポリヒドロキシアルカノエートポ リメラーゼ。
23. ２３．Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｏｌｅｏｖａｒａｎｓに見いだされる遺伝子に コードされる、請求項２２に記載のポリヒドロキシアルカノエートポリメラーゼ 。
24. ２４．図６のヌクレオチド２２９７位から３１４６位のオープンリーディングフ レーム２から発現されるタンパク質。
25. ２５．ポリエステル骨格を有するバイオポリマーを合成する系であって、 ポリヒドロキシアルカノエートの合成に必要な酵素群をコードする遺伝子群の発 現のための宿主、該遺伝子群の該宿主中での発現のための調節配列と組み合わさ れた、βケトチオラーゼ、アセトアセチルＣｏＡレダクターゼ、ポリヒドロキシ ブチレートポリメラーゼ、およびポリヒドロキシアルカノエートポリメラーゼか らなる群から選択される酵素群をコードする、単離された構造遺伝子、および該 酵素群がポリヒドロキシアルカノエートを合成するための基質、 を包含する、系。
26. ２６．前記宿主が細菌および植物からなる群から選択される、請求項２５に記載 の系。
27. ２７．前記基質が、アセトアセチル誘導体、オレフィン、エステル、アルコール 、ジオール、エポキシド、Ｄ−ヒドロキシブチリルＣｏＡ、Ｄ−βヒドロキシバ レリルＣｏＡ、分枝βヒドロキシアシルＣｏＡ、Ｄ−３−ヒドロキシブテリルＣ ｏＡのモノマーアシルＣｏＡアナログ、アシルチオエステルＣｏＡ、およびこれ らの組合せからなる群から選択される、請求項２５に記載の系。