ES2336641T3 - Constructos de expresion multigenicos que contienen inteinas modificadas. - Google Patents
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Abstract
Un constructo de DNA para expresión de productos de genes múltiples en una célula eucariota, comprendiendo el constructo de DNA una casete que está constituida por las características que se muestran, en la dirección 5'' a 3'', en la fórmula siguiente: (i)-(ii)-[(iii)-(iv)]n-(v) (a) en la cual: (i) es un promotor simple en el extremo 5'' de la casete, (ii) es una secuencia de DNA que codifica una proteína exteína N-terminal; (iii) es una secuencia de DNA que codifica una inteína, (iv) es una secuencia de DNA que codifica una proteína exteína C-terminal, y (v) es una región no codificante 3'' que es operativa como secuencia de terminación de la transcripción, y comprende una señal de poliadenilación, (b) en la cual n es un número entero de uno o más, y (c) en la cual (ii)-[(iii)-(iv)]n, como se muestra en la fórmula anterior codifican juntos una unidad de remodelación de inteína modificada que se expresa como una sola poliproteína precursora y que cataliza la escisión de las exteínas de la o de cada una de las inteínas, y previene la ligación de las exteínas.
Description
Constructos de expresión multigénicos que
contienen inteínas modificadas.
Esta solicitud reivindica prioridad respecto a
U.S.S.N. 60/181.739, presentada el 11 de febrero de 2000.
La manipulación genética de las cosechas de
plantas para producir rasgos de aporte acumulados, tales como
tolerancia a herbicidas y resistencia a los insectos, o productos
con valor añadido tales como polihidroxialcanoatos (PHAs), requiere
la expresión de genes extraños múltiples. La metodología de
reproducción transicional utilizada para ensamblar más de un gen en
una planta requiere ciclos repetidos de producción y cruzamiento de
líneas homocigóticas, un proceso que contribuye significativamente
al coste y tiempo para generar plantas transgénicas adecuadas para
producción en campo (Hitz, B. Current Opinion in Plant Biology,
1999, 2, 135-138). Este coste podría reducirse
drásticamente por la inserción multigénica en una planta en un solo
suceso de transformación.
Halpin et al. 1999, The Plant
Journal, 17(4), 453-459 informan
que es difícil la expresión coordinada, de nivel alto y estable de
transgenes múltiples en las plantas. Halpin et al. informan
también que en el virus de la enfermedad de la fiebre aftosa
(FMDV), una secuencia (2A) de solo 16-20 aminoácidos
parece tener la capacidad singular de mediar la escisión en su
propio término C por un nuevo tipo de reacción aparentemente
independiente de enzimas, y que esta secuencia puede mediar también
la escisión en un contexto heterólogo de proteínas dentro de una
gama de sistemas de expresión eucariotas. Halpin et al.
informan acerca de la construcción de un plásmido en el cual la
secuencia 2A está insertada entre los genes informadores
cloranfenicol-acetiltransferasa (CAT) y
\beta-glucuronidasa (GUS), manteniendo un solo
marco de lectura abierto, y la expresión de este constructo en
lisado de germen de trigo y plantas transgénicas que se dice dan
como resultado escisión eficiente de la poliproteína y expresión
coordinada de CAT y GUS activos. Halpin et al. proponen que
el autoprocesamiento de poliproteínas utilizando la secuencia 2A de
FMDV podría proporcionar un sistema para asegurar la expresión
coordinada y estable de proteínas múltiples introducidas en células
de plantas.
WO 9521249 informa que una casete para expresión
simultánea de dos o más polipéptidos heterogéneos en cantidades
equimolares puede estar basada en la proteasa de inclusión nuclear
(NIa) del potivirus del moteado del tabaco. Los autores informan
que los péptidos heterogéneos se traducen e incorporan en un
polipéptido que incluye también la proteasa que libera las
proteínas heterólogas después de la traducción por reacción
autoproteolítica.
La creación de un solo vector que contiene
casetes multigénicas, flanqueados cada uno por un promotor y una
secuencia de poliadenilación, permite un suceso de transformación
simple, pero puede conducir a la silenciación de genes si
cualquiera de las secuencias promotora o de poliadenilación son
homólogas (Matzke, M., Matzke, A. J. M., Scheid, O. M. In
Homologous Recombination y gen Silencing en Plants; Paszkowski, J.
Ed. Kluwer Academic Publishers, Países Bajos, 1994; pp
271-300). Pueden emplearse promotores múltiples
únicos, pero la coordinación de la expresión es difícil. Los
investigadores han coordinado la expresión multigénica a partir de
un solo promotor por manipulación genética de sitios de escisión de
ribozimas en constructos multigénicos de tal modo que se produce un
RNA policistrónico que puede escindirse subsiguientemente en un RNA
monocistrónico (U.S. 5519164). Se han expresado también genes
múltiples como una poliproteína en la cual las regiones codificantes
están unidas por sitios de reconocimiento de proteasas (Dasgupta,
S., Collins, G.B., Hunt, A. G. The Plant Journal, 1998, 16,
107-116). Una proteasa coexpresada libera las
enzimas individuales pero deja a menudo residuos del sitio de
escisión de la proteasa que pueden afectar a la actividad de las
enzimas.
La remodelación de proteínas, un proceso en el
cual una región interior de una proteína precursora (una inteína)
se escinde y las regiones flanqueantes de la proteína (exteínas) se
ligan para formar la proteína madura (Figura 1a), ha sido observado
en numerosas proteínas tanto de procariotas como de eucariotas
(Perler, F. B., Xu, M. Q., Paulus, H. Current Opinion in Chemical
Biology 1997, 1, 292-299; Perler, F. B. Nucleic
Acids Research 1999, 27, 346-347). La unidad
inteína contiene los componentes necesarios precisos para catalizar
la remodelación de la proteína y contiene a menudo un dominio de
endonucleasa que participa en la movilidad de la inteína (Perler,
F. B., Davis, E. O., Dean, G. E., Gimble, F. S., Jack, W. E., Neff,
N., Noren, C. J., Thorner, J., Belfort, M. Nucleic Acids Research
1994, 22, 1127-1127). Sin embargo, las proteínas
resultantes están enlazadas, no expresadas como proteínas
separadas.
Por consiguiente, es un objeto de la presente
invención proporcionar un método y medios para producir constructos
de expresión multigénicos, especialmente para expresión en plantas
de proteínas múltiples separadas.
Es un objeto adicional de la presente invención
proporcionar un método y medios para la expresión coordinada de
genes que codifican proteínas múltiples, o copias múltiples de
proteínas, especialmente proteínas implicadas en caminos
metabólicos o caminos para fabricación de nuevos productos.
Se describen métodos y constructos para
introducción de genes múltiples en eucariotas, tales como plantas,
utilizando un solo suceso de transformación.
De acuerdo con ello, en un primer aspecto de la
presente invención, se proporciona un constructo de DNA para
expresión de productos de genes múltiples en una célula eucariota,
comprendiendo el constructo de DNA una casete que está constituida
por las características que se muestran, en la dirección 5' a 3', en
la fórmula siguiente:
(i)-(ii)-[(iii)-(iv)]_{n}-(v)
- (a)
- en la cual:
- (i)
- es un promotor simple en el extremo 5' de la casete,
- (ii)
- es una secuencia de DNA que codifica una proteína exteína N-terminal;
- (iii)
- es una secuencia de DNA que codifica una inteína,
- (iv)
- es una secuencia de DNA que codifica una proteína exteína C-terminal, y
- (v)
- es una región no codificante 3' que es operativa como secuencia de terminación de la transcripción, y comprende una señal de poliadenilación,
- (b)
- en la cual n es un número entero de uno o más, y
- (c)
- en la cual (ii)-[(iii)-(iv)]_{n}, como se muestra en la fórmula anterior, codifican juntos una unidad de remodelación de inteína modificada que se expresa como una sola poliproteína precursora y que cataliza la escisión de las exteínas de la o de cada una de las inteínas, y previene la ligación de las exteínas.
\vskip1.000000\baselineskip
En una realización del primer aspecto de la
presente invención, n puede ser un número entero mayor que 1 y la
unidad de remodelación de inteína modificada codifica más de dos
proteínas exteína.
En otra realización del primer aspecto de la
presente invención, la unidad de remodelación de inteína modificada
puede comprender elementos de inteína de fuentes diferentes.
En otra realización del primer aspecto de la
presente invención, la célula puede ser una célula de levadura y el
promotor es un promotor operativo en la célula de levadura, o la
célula puede ser una célula de planta y el promotor es un promotor
operativo en una célula de planta, o la célula puede ser una célula
de mamífero y el promotor es operativo en una célula de
mamífero.
En otra realización del primer aspecto de la
presente invención, el promotor puede seleccionarse del grupo
constituido por promotores inducibles, promotores constitutivos y
promotores específicos de tejido.
En otra realización del primer aspecto de la
presente invención, las secuencias de exteína que codifican una o
más proteínas están precedidas o seguidas por una secuencia que
codifica un péptido que dirige el producto de expresión de las
secuencias de exteína a un compartimiento particular dentro de la
célula en la que se expresa el constructo.
En otra realización del primer aspecto de la
presente invención, las proteínas exteína pueden ser proteínas
diferentes.
En otra realización del primer aspecto de la
presente invención, las proteínas exteína pueden ser proteínas
iguales.
En otra realización del primer aspecto de la
presente invención, el constructo de DNA puede codificar una
glicina o alanina en el primer residuo del término N de la exteína
enlazado al término C de una inteína.
En otra realización del primer aspecto de la
presente invención, la unidad de remodelación de inteína modificada
puede comprender secuencias de exteína que codifican enzimas que
catalizan pasos diferentes en un camino metabólico.
En otra realización del primer aspecto de la
presente invención, las proteínas de exteína pueden seleccionarse
del grupo constituido por
acil-CoA-deshidrogenasas,
acil-CoA-oxidasas, catalasas,
subunidades alfa de oxidación en beta, subunidades beta de
oxidación en beta, PHA-sintasas con especificidad de
sustrato de longitud de cadena media,
beta-cetotiolasas, reductasas dependientes de NADH o
NADPH, PHA-sintasas con especificidad de longitud
de cadena corta, y PHA-sintasas que incorporan a la
vez sustratos de longitud de cadena corta y media.
En otra realización del primer aspecto de la
presente invención, las proteínas exteína pueden seleccionarse del
grupo constituido por enzimas codificadas por el locus phaG,
sintasas de longitud de cadena media,
beta-cetotiolasas, reductasas dependientes de NADH
o NADPH, y sintasas PHA que incorporan sustratos tanto de longitud
de cadena corta como de longitud de cadena media.
En otra realización del primer aspecto de la
presente invención, las proteínas exteína pueden seleccionarse del
grupo constituido por resistencia a los herbicidas, resistencia a
los insectos, y rasgos deseables de cosechas de plantas.
En otra realización del primer aspecto de la
presente invención, el constructo puede comprender una única unidad
de remodelación de inteína modificada en la cual la unidad única de
remodelación modificada está constituida por una secuencia de
inteína que tiene un extremo 5' y un extremo 3', en donde una
primera secuencia de exteína está fusionada al extremo 5' de la
secuencia de la inteína y una segunda secuencia de exteína está
fusionada al extremo 3' de la secuencia de inteína.
En un segundo aspecto de la presente invención,
se proporciona un método de expresión multigénica en células que
comprende transformar las células con el constructo del primer
aspecto de la presente invención, en donde las células son células
eucariotas, tales como células seleccionadas del grupo constituido
por células de mamífero, células de plantas y células de levadura,
y en donde, si las células son células animales, entonces el método
es un método in vitro.
En una realización del segundo aspecto de la
presente invención, la célula eucariota es una célula de levadura y
el promotor es un promotor operativo en la célula de levadura, o la
célula eucariota es una célula de planta y el promotor es un
promotor operativo en una célula de planta.
En otra realización del segundo aspecto de la
presente invención, la célula eucariota es una célula de planta, el
promotor es un promotor operativo en una célula de planta, y el
método es un método para producir polihidroxialcanoatos en plantas
en el cual las proteínas exteína se seleccionan del grupo
constituido por
acil-CoA-deshidrogenasas,
acil-CoA-oxidasas, catalasas,
subunidades alfa de oxidación beta, subunidades beta de oxidación
beta, PHA-sintasas con especificidad de sustrato de
longitud de cadena media, beta-cetotiolasas,
reductasas dependientes de NADH o NADPH,
PHA-sintasas con especificidad de longitud de cadena
corta, y PHA-sintasas que incorporan sustratos de
longitud de cadena tanto corta como media.
En otra realización del segundo aspecto de la
presente invención, la célula eucariota es una célula de planta, el
promotor es un promotor operativo en una célula de planta, y el
método es un método para producir polihidroxialcanoatos en plantas
en el cual las proteínas exteína se seleccionan del grupo
constituido por enzimas codificadas por el locus phaG, sintasas de
longitud de cadena media, beta-cetotiolasas,
reductasas dependientes de NADH o NADPH, y
PHA-sintasas que incorporan sustratos de longitud de
cadena tanto corta como media.
En otra realización del segundo aspecto de la
presente invención, la célula eucariota es una célula de planta, el
promotor es un promotor operativo en una célula de planta, y las
proteínas exteína se seleccionan del grupo constituido por
resistencia a los herbicidas, resistencia a los insectos, y rasgos
deseables de cosechas de plantas.
En un tercer aspecto de la presente invención,
se proporciona una célula eucariota que produce proteínas
recombinantes que comprenden el constructo del primer aspecto de la
presente invención.
En un cuarto aspecto de la presente invención,
se proporciona un constructo de DNA que comprende:
- a)
- un promotor simple específico de plantas en el extremo 5' del constructo,
- b)
- una primera región codificante aguas abajo del promotor específico de plantas,
- c)
- una secuencia de inteína fusionada al extremo 3' de la primera región codificante y al extremo 5' de una segunda región codificante; y
- d)
- una secuencia de terminación de la transcripción;
en donde la primera región codificante, la
secuencia de inteína y la segunda región codificante codifican
juntas una unidad de remodelación de inteína modificada que se
expresa como una poliproteína precursora simple y que cataliza la
escisión de las secuencias proteínicas codificadas por las regiones
codificantes primera y segunda de la inteína, y previene la
ligación de las secuencias de proteína codificadas por las regiones
codificantes primera y segunda.
\vskip1.000000\baselineskip
En un quinto aspecto de la presente invención,
se proporciona el uso del constructo de DNA del cuarto aspecto de
la presente invención, para causar la expresión de las regiones
codificantes primera y segunda en una célula de planta.
En un sexto aspecto de la presente invención, se
proporciona una célula de planta que comprende un constructo del
cuarto aspecto de la presente invención.
De acuerdo con ello, se describen a continuación
constructos que contienen un solo promotor 5' enlazado
operativamente a DNA que codifica una unidad de remodelación de
inteína modificada. La unidad de remodelación se expresa como una
poliproteína y está constituida por una primera proteína fusionada a
una inteína fusionada a una segunda proteína. La unidad de
remodelación se ha modificado por manipulación genética para
promover la escisión de todos los componentes no esenciales en la
poliproteína pero que previene las reacciones de ligación asociadas
normalmente con el corte u empalme de proteínas. Elementos genéticos
adicionales que codifican inteínas y proteínas adicionales pueden
estar fusionados en marco al término C de la región codificante para
la segunda proteína a fin de formar un constructo para la expresión
de más de dos proteínas. Una sola secuencia de terminación 3', tal
como una secuencia de poliadenilación cuando el constructo debe
expresarse en células eucariotas, sigue a la última región
codi-
ficante.
ficante.
Estos métodos y constructos son particularmente
útiles para creación de plantas con rasgos de aporte acumulados,
ilustrados por plantas tolerantes a glifosato que producen la toxina
BT, y/o productos de valor añadido, ilustrados por la producción de
polihidroxialcanoatos en plantas.
Las Figuras 1A, B y C son representaciones
esquemáticas que muestran la expresión multigénica utilizando
secuencias de inteína. La Figura 1A muestra la remodelación de una
poliproteína en una unidad de remodelación de inteína nativa que da
como resultado exteínas ligadas y una inteína libre. La Figura 1B
muestra la remodelación de una proteína en una unidad de
remodelación de inteínas modificada que da como resultado exteínas e
inteínas libres. La Figura 1C muestra un esquema de una casete para
expresión multigénica constituida por un promotor 5', una unidad de
remodelación de inteínas modificada, y una señal de poliadenilación.
Para constructos que expresan dos actividades enzimáticas
fusionadas a una sola inteína, n = 1. Para constructos que expresan
más de dos actividades enzimáticas y más de una inteína, n es mayor
que 1.
La Figura 2 muestra los caminos para la
producción de PHA de longitud de cadena corta y media por caminos
de oxidación en beta de ácidos grasos. Las actividades para promover
la síntesis de PHA por la degradación de ácidos grasos pueden
introducirse en la planta hospedadora por transformación de la
planta con una unidad de remodelación modificada. Proteínas que
pueden utilizarse como exteínas en las unidades de remodelación
modificadas incluyen
acil-CoA-deshidrogenasas (Reacción
1a), acil-CoA-oxidasas (Reacción
1b), catalasas (Reacción 2), subunidades alfa de oxidación beta
(Reacciones 3, 4, 5), subunidades beta de oxidación beta (Reacción
6), PHA-sintasas con especificidad de sustrato de
longitud de cadena media (Reacción 7),
beta-cetotiolasas (Reacción 8), reductasas
dependientes de NADH o NADPH (Reacción 9),
PHA-sintasas con especificidad de longitud de
cadena corta (Reacción 10), y PHA-sintasas que
incorporan sustratos de longitud de cadena tanto corta como media
(Reacción 11).
La Figura 3 es un esquema del camino para la
producción de PHA de longitud de cadena media a partir de la
biosíntesis de ácidos grasos. Las actividades para promover la
síntesis de PHA a partir de la biosíntesis de ácidos grasos pueden
introducirse en la planta hospedadora por transformación de la
planta con una unidad de remodelación modificada. Proteínas que
pueden ser utilizadas como exteínas en las unidades de remodelación
modificadas incluyen enzimas codificadas por el locus phaG (Reacción
1), sintasas de longitud de cadena media (Reacción 2),
beta-cetotiolasas (Reacción 3), reductasas
dependientes de NADH o NADPH (Reacción 4), y
PHA-sintasas que incorporan sustratos de longitud
de cadena tanto corta como media (Reacción 5).
Figura 4. Casete de expresión en plantas para
testado del procesamiento de poliproteínas en protoplastos de
Arabidopsis.
La posibilidad de inducir la escisión de un
elemento de remodelación, pero previniendo la ligación de las
exteínas permite la construcción de elementos de remodelación
artificiales para la expresión coordinada de multiproteínas en
eucariotas y procariotas (Figura 1b). El método emplea el uso de
unidades de remodelación de inteínas modificadas para crear
poliproteínas autoescindibles que contienen más de una, hasta
varias, regiones codificantes deseadas (Figura 1c). El
procesamiento de la poliproteína por el elemento de remodelación
modificado permite la producción de las unidades de proteína
maduras. El método descrito permite a la vez la expresión
coordinada de todas las proteínas codificadas por el constructo con
alteración mínima o nula de las secuencias de aminoácidos nativas
de las proteínas codificadas, o en algunos casos, proteínas con un
solo residuo N-terminal modificado. Esto se
consigue construyendo un gen que codifica una poliproteína
autoescindible. Una unidad de remodelación de inteína modificada,
constituida por la región codificante 1, una secuencia de inteína,
y la región codificante 2, promueve la escisión de la poliproteína
pero previene las ligaciones de exteína de remodelación de
proteínas mediada por inteínas normales. Esta configuración de genes
permite la inserción de genes múltiples en una célula tal como una
planta utilizando un solo suceso de transformación. Se describe el
uso de esta metodología para la inserción y expresión multigénica
que codifican caminos metabólicos para la fabricación de productos
con valor añadido, así como para la manipulación genética de plantas
a fin de expresar rasgos de aporte acumulados.
Los constructos descritos en esta memoria
incluyen un promotor, las regiones codificantes de genes múltiples
que codifican una o más proteínas, inteínas, y secuencias de
terminación de la transcripción. Los constructos pueden incluir
también secuencias que codifican secuencias de direccionamiento,
tales como secuencias que codifican secuencias de direccionamiento
de plastos, o secuencias específicas de tejidos, tales como péptidos
de direccionamiento específicos de semillas.
La selección de los promotores específicos,
secuencias de terminación de la transcripción y otras secuencias
opcionales, tales como secuencias que codifican secuencias
específicas de tejidos, estará determinada en gran parte por el
tipo de célula en el que se desea la expresión. Las células pueden
ser células bacterianas, de levadura, de mamífero o de plantas.
Se conocen y están disponibles cierto número de
de promotores para la expresión en células bacterianas, de
levaduras, de plantas o de mamíferos. Los mismos pueden ser
inducibles, constitutivos o específicos de tejido.
Los promotores y las secuencias de terminación
de la transcripción pueden añadirse al constructo cuando la unidad
de remodelación de la proteína está insertada en un vector de
transformación apropiado, muchos de los cuales están disponibles
comercialmente. Por ejemplo, existen muchas opciones disponibles de
vectores de transformación de plantas (Gene Transfer a Plants
(1995), Potrykus, I. y Spangenberg, G. compiladores, Springer Verlag
Berlin, Heidelberg, Nueva York; "Transgenic Plants: A Production
System for industrial and Pharmaceutical Proteins"
(1996), Owen, M.R.L. and Pen, J. compiladores, John Wiley & Sons
Ltd. England y Methods in Plant Molecular Biology-a
laboratory course manual (1995), Maliga, P., Klessig, D. F.,
Cashmore A, R., Gruissem, W. y Varner, J.E., compiladores, Cold
Spring Laboratory Press, Nueva York). En general, los vectores de
transformación de plantas comprenden una o más secuencias
codificantes de interés bajo el control transcripcional de
secuencias reguladoras 5' y 3', que incluyen un promotor, una señal
de terminación de la transcripción y/o de poliadenilación y un gen
marcador seleccionable o susceptible de cribado. Los requerimientos
usuales para las secuencias reguladoras 5' incluyen un promotor, un
sitio de iniciación de la transcripción, y una señal de
procesamiento de RNA.
Se conocen un gran número de promotores de
plantas y dan como resultado la expresión constitutiva, o regulada
ambiental o evolutivamente del gen de interés. Los promotores de
plantas pueden seleccionarse para controlar la expresión del
transgén en tejidos u orgánulos de plantas diferentes para todos los
cuales existen métodos conocidos por los expertos en la técnica
(Gasser y Fraley, 1989, Science 244; 1293-1299).
Promotores de plantas constitutivos adecuados incluyen el promotor
del virus 35S del mosaico de la coliflor (CaMV) y promotores CaMV
mejorados (Odell et al., 1985, Nature, 313: 810), el promotor
actina (McElroy et al., 1990, Plant Cell 2:
163-171), el promotor AdhI (Fromm et al.,
1990, Bio/Technology 8: 833-839, Kyozuka et
al., 1991, Mol. Gen. Genet. 228: 40-48),
promotores ubiquitina, el promotor del virus del mosaico de la
escrofularia, el promotor manopina-sintasa, el
promotor nopalina-sintasa y el promotor
octopina-sintasa. Sistemas promotores regulables
útiles incluyen el promotor de espinaca inducible por nitrato, los
promotores del choque térmico, la subunidad pequeña de los
promotores
ribulosa-bifosfato-carboxilasa y los
promotores inducibles químicamente (U.S. 5.364.780, U.S. 5.364.780,
y U.S. 5.777.200).
Puede ser preferible expresar los transgenes
únicamente en las semillas en desarrollo. Promotores adecuados para
este propósito incluyen el promotor del gen napin (U.S. 5.420.034;
U.S. 5.608.152), el promotor acetil-CoA carboxilasa
(U.S. 5.420.034; U.S. 5.608.152), el promotor 2S de albúmina, el
promotor de la proteína de almacenamiento de semillas, el promotor
faseolina (Slightom et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. USA
80: 1897-1901), el promotor oleosina (Plant et
al., 1994, Plant Mol. Biol. 25: 193-205; Rowley
et al., 1997, Biochim. Biophys. Acta. 1345:
1-4; U.S. 5.650.554; PCT WO 93/20216), el promotor
zeína, el promotor glutelina, el promotor
almidón-sintasa, el promotor de la enzima de
ramificación del almidón, etc.
Alternativamente, para algunos constructos puede
ser preferible expresar el transgén únicamente en la hoja. Un
promotor adecuado para este propósito podría incluir el promotor
C4PPDK precedido por el intensificador 35S (Sheen, J. EMBO, 1993,
12, 3497-3505) o cualquier otro promotor que sea
específico para expresión en la hoja.
En el extremo 3' del transcrito, puede
introducirse por manipulación genética una señal de poliadenilación.
Una señal de poliadenilación hace referencia a cualquier secuencia
que pueda dar como resultado la poliadenilación del mRNA en el
núcleo antes de la exportación del mRNA al citosol, tal como la
región 3' de nopalina-sintasa (Bevan, M., Barnes,
W. M., Chilton, M. D. Nucleic Acids Res. 1983, 11,
369-385).
El extremo 5' de la exteína, o transgén, puede
manipularse genéticamente para incluir secuencias que codifican
péptidos de direccionamiento a plastos u otros orgánulos
subcelulares enlazados en marco con el transgén. Una secuencia de
direccionamiento de cloroplastos es cualquier secuencia peptídica
que pueda direccionar una proteína a los cloroplastos o plastos,
tales como el péptido de tránsito de la subunidad pequeña de la
ribulosa-bifosfato-carboxilasa de
la alfalfa (Khoudi, et al., gen 1997, 197,
343-351). Una secuencia de direccionamiento
peroxisómico hace referencia a cualquier secuencia peptídica, sea
N-terminal, interna, o C-terminal,
que puede direccionar una proteína a los peroxisomas, tal como el
tripéptido de direccionamiento de plantas C-terminal
SKL (Banjoko, A. & Trelease, R.N. Plant Physiol. 1995, 107,
1201-1208).
El mecanismo del proceso de remodelación de
proteínas ha sido estudiado con gran detalle (Chong, et al.,
J. Biol. Chem. 1996, 271, 22159-22168; Xu,
M-Q & Perler, F. B. EMBO Journal, 1996, 15,
5146-5153) y se han encontrado aminoácidos
conservados en los puntos de remodelación de inteínas y exteínas
(Xu, et al., EMBO Journal, 1994, 13,
5517-522). Los constructos descritos en esta memoria
contienen una secuencia de inteína fusionada al término 5' del
primer gen. Las secuencias de inteína adecuadas pueden seleccionarse
de cualquiera de las proteínas conocidas que contienen elementos de
remodelación de proteínas. Una base de datos que contiene todas las
inteínas conocidas puede encontrarse en la hoja de Internet en
http://www.neb.com/neb/inteins, html (Perler, F. B. Nucleic
Acids Research, 1999, 27, 346-347). La secuencia de
inteína está fusionada en el extremo 3' al extremo 5' de un segundo
gen. Para direccionamiento de este gen a cierto orgánulo, un péptido
señal puede fusionarse a la secuencia codificante del gen. Después
del segundo gen, la secuencia inteína-gen puede
repetirse tantas veces como se desee para la expresión de proteínas
múltiples en la misma célula (Figura 1a, n > 1). Para
constructos que contienen multi-inteínas, puede ser
útil utilizar elementos de inteína de fuentes diferentes. Después
que la secuencia del último gen a expresar, debe insertarse una
secuencia de terminación de la transcripción.
En la realización preferida, está diseñada una
unidad de remodelación de inteína modificada de tal modo que la
misma puede catalizar la escisión de las exteínas de las inteínas y
prevenir a la vez la ligación de las exteínas. Se encontró que la
mutagénesis de la unión por exteínas C-terminal en
la DNA-polimerasa de la especie
GB-D de Pyrococcus produce un elemento de
remodelación alterado que induce la escisión de exteínas e inteínas
pero previene la ligación subsiguiente de las exteínas (Xu,
M-Q & Perler, F. B. EMBO Journal, 1996, 15,
5146-5153). La mutación de la serina 538 tanto a
alanina como a glicina inducía escisión pero prevenía la ligación.
La mutación de residuos equivalentes en otras unidades de
remodelación de inteínas debería evitar también la ligación de las
exteínas debido a la conservación de los aminoácidos en la unión de
la exteína C-terminal a la inteína. Una inteína
preferida que no contiene un dominio de endonucleasas es la proteína
GyrA de Mycobacterium xenopi (Telenti, et al. J.
Bacteriol. 1997, 179, 6378-6382). Otras han sido
encontradas en la naturaleza o se han creado artificialmente por
eliminación de los dominios endonucleasa de las inteínas que
contienen endonucleasas (Chong et al. J. Biol. Chem. 1997,
272, 15587-15590). En una realización preferida, la
inteína se selecciona de tal modo que la misma está constituida con
el número mínimo de aminoácidos necesarios para realizar la función
de remodelación, tales como la inteína de la proteína GyrA de
Mycobacterium xenopi (Telenti, et al. J. Bacteriol.
1997, 179, 6378-6382). En una realización
alternativa, se selecciona una inteína sin actividad de
endonucleasa, tal como la inteína de la proteína GyrA de
Mycobacterium xenopi o la inteína VMA de Saccharomyces
cerevisiae que se ha modificado para eliminar los dominios de
endonucleasa (Chong, 1997).
La modificación ulterior de la unidad de
remodelación de inteínas puede permitir que la velocidad de la
reacción de escisión se altere permitiendo que la dosificación de
la proteína sea controlada por modificación simple de la secuencia
génica de la unidad de remodelación.
En otra realización, el primer residuo de la
exteína C-terminal se manipula genéticamente de modo
que contenga una glicina o alanina, una modificación que se
demostró previene la ligación de la exteína con la
DNA-polimerasa GB-D de las especies
de Pyrococcus (Xu, M-Q & Perler, F. B.
EMBO Journal, 1996, 15, 5146-5153). En esta
realización, las exteínas preferidas del terminal C contienen
secuencias codificantes que contienen naturalmente un residuo
glicina o alanina a continuación de la metionina
N-terminal en la secuencia de aminoácidos nativa.
La fusión de la glicina o alanina de la exteína al término C de la
inteína proporcionará la secuencia de aminoácidos nativa después
del procesamiento de la poliproteína. En una realización
alternativa, se crea una glicina o alanina artificial en la exteína
C-terminal, sea por alteración de la secuencia
nativa o por adición de un residuo aminoácido adicional en el
término N de la secuencia nativa. En esta realización, la secuencia
de aminoácidos nativa de la proteína estará alterada por un solo
aminoácido después del procesamiento de la poliproteína.
La secuencia de DNA de la inteína
GB-D de DNA-polimerasa de las
especies de Pyrococcus es SEQ ID NO: 1. El punto de unión de
la exteína N-terminal es la secuencia "aac"
(nucleótidos 1-3 de SEQ ID NO: 1) y codifica un
residuo asparagina. Los sitios de remodelación en la proteína
precursora de la DNA-polimerasa GB-D
nativa siguen al nucleótido 3 y al nucleótido 1614 en SEQ ID NO: 1.
El punto de unión de la exteína C-terminal es la
secuencia "agc" (nucleótidos 1615-1617 de SEQ
ID NO: 1) y codifica un residuo serina. La mutación de la serina
exteína C-terminal a una alanina o glicina formará
un elemento de remodelación de inteína modificado que es capaz de
promover la escisión de la poliproteína, pero no ligará las unidades
exteína.
La secuencia de DNA de la inteína mínima GyrA de
Mycobacterium xenopi es SEQ ID NO: 2. El punto de unión de
la exteína N-terminal es la secuencia "tac"
(nucleótidos 1-3 de SEQ ID NO: 2) y codifica un
residuo tirosina. Los sitios de remodelación en la proteína
precursora siguen al nucleótido 3 y al nucleótido 597 de SEQ ID NO:
2. El punto de unión de la exteína C-terminal es la
secuencia "acc" (nucleótidos 598-600 de SEQ ID
NO: 2) y codifica un residuo treonina. La mutación de la treonina
exteína C-terminal a una alanina o glicina debería
formar un elemento de remodelación de inteína modificado que es
capaz de promover la escisión de la poliproteína pero no ligará las
unidades exteína.
Las exteínas codifican una o más proteínas para
su expresión. Éstas pueden ser la misma proteína, en los casos en
que es deseable aumentar la cantidad de proteína expresada.
Alternativamente, las proteínas pueden ser diferentes. Las
proteínas pueden ser enzimas, cofactores, sustratos, o tener otras
funciones biológicas. Las mismas pueden actuar independientemente o
de manera coordinada. En una realización, las secuencias de exteína
codifican enzimas que catalizan pasos diferentes en un camino
metabólico.
Una realización preferida es aquélla en la que
las secuencias exteína codifican enzimas requeridas para la
producción de biopolímeros polihidroxialcanoato, como se expone con
mayor detalle más adelante. En otra realización, las secuencias
exteína codifican subunidades diferentes de una sola enzima o
complejo multienzimático. Enzimas preferidas de dos subunidades
incluyen las PHA-sintasas de dos subunidades, tales
como la sintasa de dos subunidades codificada por phaE y phaC, de
Thiocapsa pfennigii (U.S. 6.011.144). Complejos
multienzimáticos preferidos incluyen los complejos de oxidación de
ácidos grasos.
Enzimas útiles para la producción de polímeros
incluyen las siguientes. La ACP-CoA transacilasa
hace referencia a una enzima capaz de convertir
beta-hidroxi-acil-ACPs
en
beta-hidroxi-acil-CoAs,
tal como la proteína codificada por phaG de Pseudomonas
putida (Rehm et al. J. Biol. Chem. 1998, 273,
24044-24051). La PHA-sintasa se
refiere a un gen que codifica una enzima que polimeriza unidades
monómeras de hidroxiacil-CoA para formar polímero.
Ejemplos de PHA-sintasas incluyen una sintasa con
especificidad de sustrato de cadena media, tal como phaC1 de
Pseudomonas oleovorans (WO 91/00917; Huisman, et al.
J. Biol. Chem. 1991, 266, 2191-2198) o
Pseudomonas aeruginosa (Timm, A. & Steinbuchel, A. Eur.
J. Biochem. 1992, 209, 15-30), la sintasa de
Alcaligenes eutrophus con especificidad de longitud de cadena
corta (Peoples, O. P. & Sinskey, A. J. J. Biol. Chem. 1989,
264; 15298-15303), o una sintasa de dos subunidades
tal como la sintasa de Thiocapsa pfennigii codificada por
phaE y phaC (U.S. 6.011.144). Una serie de genes de
PHA-sintasa y genes que codifican pasos adicionales
en la biosíntesis de PHA han sido descritos por Madison y Huisman
(1999, Microbiology and Molecular Biology Reviews 63:
21-53). Una subunidad alfa de oxidación en beta se
refiere a una enzima multifuncional que posee actividades de
hidratasa y deshidrogenasa en grado mínimo (Figura 2). La subunidad
puede poseer también actividades de epimerasa y
\Delta3-cis, \Delta2-trans
isomerasa. Ejemplos de subunidades alfa de oxidación en beta son
FadB de E. coli (DiRusso, C. C. J. Bacteriol. 1990, 172,
6459-6468), FaoA de Pseudomonas fragi (Sato,
S., Hayashi, et al. J. Biochem. 1992, 111,
8-15), y el marco de lectura abierto f714 de E.
coli que contiene homología con las subunidades multifuncionales
\alpha de oxidación en \beta (Acceso a Genbank # 1788682). Una
subunidad \beta de oxidación en \beta hace referencia a un
polipéptido capaz de formar un complejo enzimático multifuncional
con su subunidad asociada \alpha. La subunidad \beta posee
actividad de tiolasa (Figura 2). Ejemplos de subunidades \beta son
FadA de E. coli (DiRusso, C. C. J. Bacteriol. 1990, 172,
6459-6468), FaoB de Pseudomonas fragi (Sato,
S., Hayashi, M., Imamura, S., Ozeki, Y., Kawaguchi, A. J. Biochem.
1992, 111, 8-15), and el marco de lectura abierto
E. coli f436 que contiene homología para una subunidad
\alpha de oxidación en \beta (# de Acceso a Genbank AE000322;
gen b2342). Una reductasa hace referencia a una enzima que puede
reducir \beta-cetoacil CoAs a
R-3-OH-acil CoAs,
tal como la Reductasa dependiente de NADH de Chromatium
vinosum (Liebergesell, M., & Steinbuchel, A. Eur. J.
Biochem. 1992, 209, 135-150), la Reductasa
dependiente de NADPH de Alcaligenes eutrophus (Peoples, O. P.
& Sinskey, A. J. J. Biol. Chem. 1989, 264,
15293-15297), o la NADPH-reductasa
de Zoogloea ramigera (Peoples, O. P., Masamune, S., Walsh,
C. T., Sinskey, A. J. J. Biol. Chem. 1987, 262,
97-102; Peoples, O. P. & Sinskey, A. J. J.
Molecular Microbiology 1989, 3, 349-357). Una
beta-cetotiolasa hace referencia a una enzima que
puede catalizar la conversión de acetil CoA y una acil CoA en una
\beta-cetoacil CoA, una reacción que es reversible
(Figura 2). Un ejemplo de una tiolasa de este tipo es PhaA de
Alcaligenes eutrophus (Peoples, O. P. & Sinskey, A. J. J.
Biol. Chem. 1989, 264, 15293-15297). Una acil CoA
oxidasa hace referencia a una enzima capaz de convertir acil CoAs
saturadas en acil CoAs \Delta2-insaturadas (Figura
2). Ejemplos de acil CoA oxidasas son POX1 de Saccharomyces
cerevisiae (Dmochowska, et al. Gene, 1990, 88,
247-252) and ACX1 de Arabidopsis thaliana (#
de Acceso a Genbank AF057044). Una catalasa hace referencia a una
enzima capaz de convertir peróxido de hidrógeno en hidrógeno y
oxígeno. Ejemplos de catalasas son KatB de Pseudomonas
aeruginosa (Brown, et al., J. Bacteriol. 1995, 177,
6536-6544) y KatG de E. coli
(Triggs-Raine, B. L. & Loewen, P. C. gene 1987,
52, 121-128).
Caminos enzimáticos de pasos múltiples han sido
elaborados ahora para la biosíntesis de copolímeros PHA a partir
de metabolitos celulares normales y son particularmente adecuados
para la invención descrita en esta memoria. Caminos para
incorporación de 3-hidroxivalerato han sido
descritos por Gruys et al., en PCT WO 98/00557, que se
incorpora en esta memoria por referencia. Caminos para la
incorporación de 4-hidroxibutirato han sido
elaborados en PCT WO 98/36078 concedida a Dennis y Valentin, y PCT
WO 99/14313 concedida a Huisman et al.
En otra realización, las secuencias codificantes
de proteínas codifican proteínas que imparten a la planta
resistencia a los insectos y las plagas, como se expone con mayor
detalle más adelante. En el caso de una proteína que codifica
resistencia a los insectos, se prefiere una endotoxina de
Bacillus thuringiensis, y en el caso de un gen de
resistencia a los herbicidas, la secuencia codifícate preferida
imparte resistencia a glifosato, sulfosato o herbicidas
Liberty.
Genes marcadores seleccionables para uso en
plantas incluyen el gen de neomicin-fosfotransferasa
nptII (U.S. 5.034.322, U.S. 5.530.196), el gen de resistencia a la
higromicina (U.S. 5.668.298), y el gen bar, que codifica
resistencia a fosfinotricina (U.S. 5.276.268). EP 0 530 129 A1
describe un sistema de selección positivo que permite que las
plantas transformadas crezcan más que las líneas no transformadas
por expresión de un transgén que codifica una enzima que activa un
compuesto inactivo añadido al medio de crecimiento. La patente U.S.
No. 5.767.378 describe el uso de manosa o xilosa para la selección
positiva de plantas transgénicas. Genes marcadores susceptibles de
cribado útiles para practicar la invención incluyen el gen de
beta-glucuronidasa (Jefferson et al., 1987,
EMBO J. 6:3901-3907; U.S. 5.268.463) y el gen de la
proteína fluorescente verde modificado (Cubitt et al., 1995,
Trends Biochem Sci. 20: 448-455; Pan et al.,
1996, Plant Physiol. 112: 893-900). Algunos de
estos marcadores presentan la ventaja añadida de introducir un
rasgo, v.g. resistencia a los herbicidas, en la planta de interés,
proporcionando un valor agronómico adicional en el aspecto de
aporte.
Se han descrito usos múltiples para elementos de
remodelación de proteínas que contienen inteínas, que incluyen
purificación enzimática por afinidad y desactivación de la actividad
de proteínas (U.S. 5834237). Hasta la fecha, no existe descripción
alguna del uso de secuencias de inteína para expresión coordinada de
genes múltiples, una tarea que es particularmente útil en plantas
para la expresión multigénica a fin de intensificar los rasgos de
aporte, o para la expresión multigénica para la formación de
productos de plantas naturales o nuevos o plantas con rasgos de
aporte acumulados múltiples.
Aunque se conocen medios para la transformación
de células de todos los tipos, y los constructos descritos en esta
memoria pueden utilizarse en estos tipos diferentes de células,
únicamente se describe en detalle la transformación de células de
plantas utilizando estos constructos. Los expertos en la técnica
podrían utilizar esta información para transformar los otros tipos
de células para propósitos similares.
Especies de plantas particularmente útiles
incluyen: la familia Brassica que incluye colza, nabo, sp. carinata
y juncia, maíz, soja, algodón, girasol, palma, coco, cártamo,
cacahuete, mostazas con inclusión de Sinapis alba y lino. Tejidos
adecuados para transformación utilizando estos vectores incluyen
protoplastos, células, tejido de callo, discos de hoja, polen,
meristemos, etc. Procedimientos adecuados de transformación incluyen
transformación mediada por Agrobacterium, biolística,
microinyección, electroporación, transformación de protoplastos
medida por polietilenglicol, transformación mediada por liposomas,
transformación mediada por fibras de silicio (U.S. 5.464.765) etc.
(Gene Transfer to Plants (1995), Potrykus, I. y Spangenberg, G.
compiladores Springer-Verlag
Berlín-Heidelberg-Nueva York;
"Transgenic Plants: A Production System for Industrial and
Pharmaceutical Proteins" (1996), Owen, M.R.L. y Pen, J.
compiladores, John Wiley & Sons Ltd. England y Methods in Plant
Molecular Biology - a laboratory course manual (1995), Maliga P.,
Klessig, D.F., Cashmore, A. R., Gruissem, W. y Varner, J. E.
compiladores Cold Spring Laboratory Press, Nueva York). Brassica
napus puede transformarse como se describe por ejemplo en U.S.
5.188.958 y U.S. 5.463.174. Otras crucíferas tales como nabo,
carinata y juncia así como Sinapis alba pueden transformarse como ha
sido descrito por Moloney et al. (1989, Plant Cell Reports
8:238-242). La soja puede transformarse por varios
procedimientos publicados (U.S. 5.015.580; U.S. 5.015.944; U.S.
5.024.944; U.S. 5.322.783; U.S. 5.416.011; U.S. 5.169.770).
Cierto número de procedimientos de
transformación han sido consignados para la producción de plantas
transgénicas de maíz, que incluyen transformación de polen (U.S.
5.629.183), transformación mediada por fibras de silicona (U.S.
5.464.765), electroporación de protoplastos (U.S. 5.231.019; U.S.
5.472.869; U.S. 5.384.253), cañón de genes (U.S. 5.538.877; U.S.
5.538.880), y transformación mediada por Agrobacterium (EP 0
604 662 A1; WO 94/00977). El procedimiento mediado por
Agrobacterium es particularmente preferido dado que sucesos
de integración simples de los constructos transgénicos se obtienen
más fácilmente utilizando este procedimiento que facilita
notablemente la reproducción subsiguiente de las plantas. El algodón
puede transformarse por bombardeo con partículas (U.S. 5.004.863;
U.S. 5.159.135). El girasol puede transformarse utilizando una
combinación de bombardeo con partículas e infección por
Agrobacterium (EP 0 486 233 A2; U.S. 5030572). El lino puede
transformarse por bombardeo con partículas o transformación mediada
por Agrobacterium. Tecnologías de recombinasas que son
útiles en la práctica de la presente invención incluyen los sistemas
cre-lox, FLP/FRT y Gin. Métodos por los cuales
pueden utilizarse estas tecnologías para el propósito descrito en
esta memoria se describen por ejemplo en (U.S. 5.527.695; Dale y
Ow, 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:
10558-10562; Medberry et al., 1995, Nucleic
Acids Res. 23: 485-490).
Después de la transformación por cualquiera de
los métodos descritos anteriormente, pueden utilizarse los
procedimientos siguientes para obtener una planta transformada que
expresa los transgenes: seleccionar las células de plantas que han
sido transformadas en un medio selectivo; regenerar las células de
plantas que han sido transformadas para producir plantas
diferenciadas; seleccionar plantas transformadas que expresan el
transgén de tal modo que el nivel de polipéptido(s)
deseado(s) se obtiene en la localización deseada tisular y
celular.
La expresión de enzimas múltiples es útil para
alterar el metabolismo de las plantas a fin de aumentar, por
ejemplo, los niveles de aminoácidos nutricionales (Falco et
al., 1995, Bio/Technology 13:577), modificar el metabolismo de
la lignina, modificar las composiciones de aceite (Murphy, 1996,
TIBTECH 14:206-213), modificar la biosíntesis del
almidón, o producir polímeros de polihidroxialcanoato (PHAs, Huisman
y Madison, 1999, Microbiol and Mol. Biol. Rev.
63:21-53; y las referencias citadas en dicho
lugar).
La modificación de plantas para producir
biopolímeros PHA es un ejemplo del modo en que pueden utilizarse
estos constructos. Los biopolímeros PHA abarcan una amplia clase de
poliésteres con composiciones diferentes de monómeros y una extensa
gama de propiedades físicas (Madison y Huisman, 1999, Dudesh et
al., 2000, Prog. Polym. Sci. 25:1503-1555).
PHAs de cadena corta, de cadena media, así como copolímeros de
longitud de cadena corta y media pueden producirse en plantas por
manipulación del metabolismo natural de la planta para producir
3-hidroxiacil-CoAs, el sustrato de
la PHA-sintasa, en el orgánulo en el cual debe
acumularse el polímero. Esto requiere a menudo la expresión de dos
o más proteínas recombinantes, con una señal de direccionamiento a
los orgánulos apropiados unida. Las proteínas pueden expresarse de
modo coordinado como exteínas en una unidad de remodelación
modificada introducida en la planta por un suceso de transformación
simple. Después de la remodelación, las proteínas maduras se
liberan de la inteína.
En las bacterias, cada grupo PHA es producido
por un camino específico. En el caso de los PHAs con grupos
colgantes cortos, están implicadas tres enzimas, una
beta-cetotiolasa (Figura 2. Reacción 8), una
acetoacetil-CoA-reductasa (Figura
2, Reacción 9), y una PHA-sintasa (Figura 2,
Reacción 10). Las PHA-sintasas de longitud de cadena
corta permiten típicamente la polimerización de los monómeros de
hidroxiácidos C3-C5 que incluyen a la vez unidades
de 4-hidroxiácidos y
5-hidroxiácidos. Este camino biosintético se
encuentra en cierto número de bacterias tales como Ralstonia
eutropha, Alcaligenes latus, Zoogloea ramigera, etc
(Madison, L.L. & Huisman, G.W. Microbiology and Molecular
Biology Reviews 1999, 63, 21-53). Las actividades
para promover la síntesis de PHA de longitud de cadena corta pueden
introducirse en una planta hospedadora por un suceso de
transformación simple con una unidad de remodelación modificada en
la cual las exteínas se seleccionan de las enzimas descritas en las
reacciones 8-10 (Figura 2). En caso necesario, los
genes que codifican exteínas pueden fusionarse a una secuencia de
DNA que codifica una señal de direccionamiento de péptidos que
direcciona la proteína madura después de la remodelación a un
compartimiento particular de la célula.
PHAs con grupos colgantes de longitud de cadena
media son producidos por muchas bacterias Pseudomonas diferentes.
Las unidades monómeras de hidroxiacil-coenzima A
pueden originarse por oxidación en beta de ácidos grasos (Figura 2)
y caminos biosintéticos de ácidos grasos (Figura 3). Las unidades
monómeras se convierten luego en polímeros por
PHA-sintasas que tienen especificidades de sustrato
que favorecen las unidades monómeras C6-C14 más
largas (Figura 2, Reacción 7; Figura 3, Reacción 2; Madison, L.L.
& Huisman, G.W. Microbiology and Molecular Biology Reviews
1999, 63, 21-53). Las actividades para promover la
síntesis de PHA de longitud de cadena media a partir de caminos de
oxidación en beta de ácidos grasos pueden introducirse en una planta
hospedadora por un solo suceso de transformación con una unidad de
remodelación modificada en la cual las exteínas se seleccionan de
las enzimas descritas en las Reacciones 1-7 (Figura
2). En caso necesario, genes que codifican exteínas pueden
fusionarse a una secuencia de DNA que codifica una señal de
direccionamiento de péptidos que dirige la proteína madura después
de la remodelación a un compartimiento particular de la célula.
Un enlace enzimático entre la síntesis de PHA y
la biosíntesis de ácidos grasos ha sido comunicado tanto en
Pseudomonas putida como en Pseudomonas aeruginosa
(Reacción 1, Figura 3). El locus genético que codifica la enzima
que se cree es responsable de la desviación del carbono de la
biosíntesis de los ácidos grasos se designó phaG (Rehm, et
al. J. Biol. Chem. 1998, 273, 24044-24051; WO
98/06854; U. S. 5.750.848; Hoffmann, N., Steinbuchel, A., Rehm, B.
H. A. FEMS Microbiology Letters, 2000, 184,
253-259). Sin embargo, no se ha observado polímero
alguno después de la expresión de una sintasa de longitud de cadena
media y PhaG en E. coli (Rehm, et al. J. Biol. Chem.
1998, 273, 24044-24051), lo que sugiere que puede
ser necesaria otra enzima en los promotores de PHA no nativos tales
como E. coli y plantas. Las actividades para promover la
síntesis de PHA de longitud de cadena media a partir de caminos
para biosíntesis de ácidos grasos pueden introducirse en una planta
hospedadora por un suceso de transformación simple con una unidad de
remodelación modificada en la cual las exteínas se seleccionan de
las enzimas descritas en las Reacciones 1-2 (Figura
3). En caso necesario, los genes que codifican exteínas pueden
fusionarse a una secuencia de DNA que codifica una señal de
direccionamiento de péptidos que dirige la proteína madura después
de la remodelación a un compartimiento particular de la célula.
Copolímeros constituidos por grupos colgantes de
longitud de cadena corta y media pueden producirse también en
bacterias que poseen una PHA-sintasa con una
especificidad amplia de sustratos (Reacción 11, Figura 2; Reacción
5, Figura 3). Por ejemplo, Pseudomonas sp. A33 (Appl.
Microbiol. Biotechnol. 1995, 42, 901-909),
Pseudomonas sp. 61-3 (Kato, et al.
Appl. Microbiol. Biotechnol. 1996, 45, 363-370), y
Thiocapsa pfennigii (U.S. 6.011.144) poseen todas ellas
PHA-sintasas que, según se ha consignado, producen
copolímeros de unidades monómeras de longitud de cadena corta y
media. Actividades para promoción de la transformación de
copolímeros con grupos colgantes de longitud de cadena corta y
media pueden introducirse en una planta hospedadora por la vía de
un solo suceso de transformación con una unidad de remodelación
modificada en la cual las exteínas se seleccionan de las enzimas
descritas en las Reacciones 1-11 (Figura 2) para
rutas de degradación de ácidos grasos, y las Reacciones
1-5 (Figura 3) para rutas de biosíntesis de ácidos
grasos. Si es necesario, genes codificantes de exteínas pueden
fusionarse a una secuencia de DNA que codifica una señal de
direccionamiento de péptidos que dirige la proteína madura después
de la remodelación a un compartimiento particular de la célula.
Caminos adicionales para incorporación de
3-hidroxivalerato han sido descritos por Gruys et
al., en PCT WO 98/00557, incorporado en esta memoria por
referencia. Caminos para incorporación de
4-hidroxibutirato son elaborados en PCT WO 98/36078
a Dennis y Valentin y PCT WO 99/14313 a Huisman et al.
Antes de la producción de PHAs a partir de
plantas en escala industrial, será preciso conseguir la optimización
de la producción de polímeros en cosechas de valor agronómico.
Estudios preliminares en algunas cosechas de valor agronómico han
sido realizados, con inclusión de la producción de PHB en cultivos
en suspensión de células de maíz y en los peroxisomas de plantas de
tabaco intactas (Hahn J.J., febrero de 1998, tesis Ph. D.
Universidad de Minnesota) así como la producción de PHB en semillas
transgénicas de canola y soja (Gruys et al., PCT WO
98/00557). En estos estudios, los niveles de polímero observados
eran demasiado bajos para la producción económica del polímero. La
optimización de la producción de PHA en cosechas de valor agronómico
utilizará el cribado de enzimas múltiples, señales de
direccionamiento, y sitios de producción hasta que se obtenga una
ruta de alto rendimiento del polímero con la composición deseada.
Ésta es una labor que puede simplificarse si se pudieran insertarse
genes múltiples en un solo suceso de transformación. La creación de
constructos de expresión multigénica es útil para reducir la
complejidad de la metodología de reproducción tradicional requerida
para hacer agronómicamente útil la planta transgénica.
La producción de una planta que es tolerante al
herbicida glifosato y que produce la toxina de Bacillus
thuringiensis (BT) es ilustrativa de la utilidad de los
constructos de expresión multigénica para la creación de plantas
con rasgos de aporte acumulados. El glifosato es un herbicida que
previene la producción de aminoácidos aromáticos en las plantas por
inhibir la enzima
5-enolpiruvilshikimato-3-fosfato-sintasa
(EPSP-sintasa). La sobreexpresión de
EPSP-sintasa en una cosecha de interés permite la
aplicación de glifosato como un destructor de malezas sin destruir
la planta manipulada genéticamente (Suh, et al., J. M. Plant
Mol. Biol. 1993, 22, 195-205). La toxina BT es una
proteína que es letal para muchos insectos, proporcionando a la
planta que la produce protección contra las plagas (Barton, et
al. Plant. Physiol. 1987, 85, 1103-1109). Ambos
rasgos pueden introducirse en una planta hospedadora por un solo
suceso de transformación con una unidad de remodelación modificada
en la cual las exteínas son EPSP-sintasa y la toxina
BT.
La presente invención será mejor comprendida
haciendo referencia a los ejemplos no limitantes que siguen.
\vskip1.000000\baselineskip
Un constructo adecuado contiene los elementos
genéticos siguientes (Figura 4): un promotor activo en las hojas
tal como el promotor de plantas 35S-C4PPDK inducible
por la luz (Sheen, J. EMBO, 1993, 12, 3497-3505);
una secuencia de exteína N-terminal que codifica
beta-glucuronidasa (GUS) (Jefferson, R.A., Kavanagh,
T.A., Bevan, M.W., EMBO J. 1987, 6, 3901-3907)
fusionado en su término C al término N de una secuencia de inteína;
una secuencia de inteína de la polimerasa GB-D de
las especies de Pyrococcus (Xu, M-Q &
Perler, F.B. EMBO Journal, 1996, 15, 5146-5153) en
la cual la serina 538 ha sido mutada a alanina o glicina; una
secuencia de exteína 5'-terminal que codifica una
proteína fluorescente verde intensificada (EGFP; Clontech, Palo
Alto, CA) fusionada en su término 3' al término 5' de la secuencia
de inteína; y una señal de poliadenilación.
La producción de las proteínas GUS y EGFP
remodeladas correctamente a partir de un constructo de poliproteína
que contiene inteína modificada puede testarse utilizando el
procedimiento de expresión transitoria de protoplastos siguiente:
Se recogen dos hojas bien expandidas de plantas de
4-6 semanas de Arabidopsis thaliana y las
hojas se cortan perpendicularmente, con respecto a la longitud de la
hoja, en pequeñas tiras. Las hojas cortadas se transfieren a 20
mililitros de una solución que contiene manitol 0,4 M y MES 10 mM,
de pH 5,7, en un matraz de 250 mililitros con rama lateral. Se
cortan hojas adicionales de tal modo que el número total de hojas
procesadas es 100. Una vez cortadas todas las hojas, se retira la
solución del matraz con una pipeta y se añaden 20 mililitros de una
solución celulasa/macerozima. La solución enzimática se prepara como
sigue: 8,6 mililitros de H_{2}O, 10 mililitros de manitol 0,8 M,
y 400 microlitros de MES 0,5 M, pH 5,7, se mezclan y se calientan a
55ºC. Se añaden celulasa R-10 (0,3 g, Serva) y
macerozima R-10 (0,08 g, Serva) y la solución se
mezcla por inversión. La solución enzimática se incuba a la
temperatura ambiente durante 10-15 min. Se añaden a
la solución enzimática una parte alícuota de 400 microlitros de KCl
1M y 600 microlitros de CaCl_{2} 1M, se mezclan, y la solución
resultante se filtra en condiciones estériles a través de un filtro
de 0,2 \mum. Después de la adición de la solución enzimática, se
agita suavemente el matraz para mezclar los trozos de hoja y se
aplica el vacío de la sala durante 5 minutos. Antes de la supresión
del vacío, se agita suavemente el matraz para desprender las
burbujas de aire de los cortes de hoja. Las hojas se digieren
durante 2-3 horas a la temperatura ambiente.
Se liberan protoplastos de las hojas agitando
suavemente el matraz durante un minuto y la solución que contiene
los protoplastos se filtra a través de malla de nailon (malla de 62
micrómetros). Se transfiere el eluyente a un tubo de centrífuga
cónico de vidrio de 40 mililitros, estéril y con tapón roscado, y se
centrifuga a 115 g durante 2 min. El sobrenadante se retira con una
pipeta Pasteur y se añaden 10 mililitros de solución W5 enfriada en
hielo (la solución W5 contiene NaCl 154 mM, CaCl_{2} 125 mM, KCl 5
mM, glucosa 5 mM, y MES 1,5 mM, pH 5,7). La muestra se mezcla por
oscilación del tubo de un lado a otro hasta que se ha disuelto la
totalidad del sedimento. Se centrifuga la muestra como se ha
descrito arriba y se retira el sobrenadante con una pipeta Pasteur.
El sedimento de protoplastos se suspende de nuevo en 5 mililitros de
W5 enfriada en hielo. La muestra se incuba durante 30 minutos en
hielo a fin de que los protoplastos sean competentes para
transformación. Los protoplastos intactos se cuantifican utilizando
un hemacitómetro. Se aíslan los protoplastos por centrifugación y
se suspenden de nuevo en una solución enfriada en hielo que contiene
manitol 0,4 M, MgCl_{2} 15 mM, y MES 5 mM, pH 5,7, hasta
aproximadamente 2 x 10^{6} protoplastos/mililitro.
Muestras de DNA plasmídico (40 microgramos, 1
microgramo/microlitro de stock) para transformación se ponen en
tubos de centrífuga cónicos de vidrio de 40 mililitros. Se añade una
parte alícuota de protoplastos (800 microlitros) a un tubo
individual seguido inmediatamente por 800 microlitros de una
solución que contiene 40% de PEG 3350 (p/v), manitol 0,4 M, y
Ca(NO_{3})_{2} 100 mM. La muestra se mezcla por
inversión suave y se repite el procedimiento para cualesquiera
muestras remanentes. Todos los tubos de transformación se incuban a
la temperatura ambiente durante 30 minutos. Las muestras de
protoplastos se diluyen sucesivamente con 1,6 mililitros, 4
mililitros, 8 mililitros (sic) protoplastos pueden determinarse por
detección Western de la proteína. Se preparan muestras de
experimentos de expresión transitoria por análisis Western como
sigue. Se recogen los cloroplastos por centrifugación (115 g) y se
retira el sobrenadante. Se añade a la muestra una parte alícuota
(14 microlitros) de stock 7X de stock inhibidor de proteasas y la
muestra se lleva a un volumen final de 100 microlitros con una
solución que contiene manitol 0,5 M, MES 5 mM, pH 5,7, KCl 20 mM y
CaCl_{2} 5 mM. El stock 7X de inhibidores de proteasas se prepara
por disolución de una "Tableta de Inhibidor de Proteasas Mini
Completa" (Boehringer Mannheim) en 1,5 mililitros, manitol 0,5
mM, MES 5 mM, pH 5,7, KCl 20 mM, CaCl_{2} 5 mM. Los protoplastos
se fragmentan en un tubo de centrífuga de 1,5 mililitros utilizando
un mezclador de mortero de pelets (Kontes) durante 30 segundos. Las
proteínas solubles se separan de las proteínas insolubles por
centrifugación a la velocidad máxima en una microcentrífuga (10 min,
4ºC). La concentración de proteínas de la fracción soluble se
cuantifica utilizando el procedimiento de
tinción-aglutinación de Bradford con seroalbúmina
bovina como estándar (Bradford, M.M. Anal. Biochem. 1976, 72,
248-254). La proteína insoluble se resuspende en
100 microlitros de tampón de carga de gel 1X covalente (New England
Biolabs, Beverly, MA) y se prepara para análisis un volumen igual
al cargado para la fracción soluble. Las muestras de las fracciones
soluble e insoluble del experimento de expresión transitoria de
protoplastos, así como estándares de proteína fluorescente verde
(Clontech, Palo Alto, CA), se resuelven por SDS-PAGE
y las proteínas se transfieren a PVDF. La detección de las
proteínas de expresión transitoria puede realizarse por análisis
Western utilizando Living Colors Peptide Antibody para GFP,
Clontech, Palo Alto, CA), el anticuerpo
anti-beta-glucuronidasa para GUS
(Molecular Probes, Inc., Eugene, OR), y el sistema de detección de
proteínas quimioluminiscentes Immun-Star (BioRad,
Hercules, CA).
<110> Metabolix, Inc.
\vskip1.000000\baselineskip
<120 Constructos de Expresión Multigénicos
que Contienen Inteínas Modificadas
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> MBX 038 PCT
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<140> No asignado todavía
\vskip0.400000\baselineskip
<141>
2000-02-09
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn Ver. 2.1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1617
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Pyrococcus sp.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Característica mixta (varias
veces)
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(3)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Residuo asparagina codificado en el
punto de unión de la exteína N-terminal
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Característica mixta (varias
veces)
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1615)..(1617)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Residuo serina codificado en el
punto de unión de la exteína C-terminal
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\hskip1cm
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 600
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Mycobacterium xenopi
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Característica mixta (varias
veces)
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(3)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Residuo tirosina codificado en el
punto de unión de la exteína C-terminal
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Característica mixta (varias
veces)
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (558)..(600)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Residuo treonina codificado en el
punto de unión de la exteína C-terminal
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\hskip1cm
Claims (26)
1. Un constructo de DNA para expresión de
productos de genes múltiples en una célula eucariota, comprendiendo
el constructo de DNA una casete que está constituida por las
características que se muestran, en la dirección 5' a 3', en la
fórmula siguiente:
(i)-(ii)-[(iii)-(iv)]_{n}-(v)
- (a)
- en la cual:
- (i)
- es un promotor simple en el extremo 5' de la casete,
- (ii)
- es una secuencia de DNA que codifica una proteína exteína N-terminal;
- (iii)
- es una secuencia de DNA que codifica una inteína,
- (iv)
- es una secuencia de DNA que codifica una proteína exteína C-terminal, y
- (v)
- es una región no codificante 3' que es operativa como secuencia de terminación de la transcripción, y comprende una señal de poliadenilación,
- (b)
- en la cual n es un número entero de uno o más, y
- (c)
- en la cual (ii)-[(iii)-(iv)]_{n}, como se muestra en la fórmula anterior codifican juntos una unidad de remodelación de inteína modificada que se expresa como una sola poliproteína precursora y que cataliza la escisión de las exteínas de la o de cada una de las inteínas, y previene la ligación de las exteínas.
\vskip1.000000\baselineskip
2. El constructo de la reivindicación 1 en el
cual n es un número entero mayor que 1 y la unidad de remodelación
de inteína modificada codifica más de dos enzimas exteína.
3. El constructo de la reivindicación 2 en el
cual la unidad de remodelación de inteína modificada comprende
elementos de inteína de diferentes fuentes.
4. El constructo de la reivindicación 1 en el
cual la célula es una célula de levadura y el promotor es un
promotor operativo en la célula de levadura.
5. El constructo de la reivindicación 1 en el
cual la célula es una célula de planta y el promotor es un promotor
operativo en una célula de planta.
6. El constructo de la reivindicación 1 en el
cual la célula es una célula de mamífero y el promotor es un
promotor operativo en una célula de mamífero.
7. El constructo de la reivindicación 1 en el
cual el promotor se selecciona del grupo constituido por promotores
inducibles, promotores constitutivos y promotores específicos de
tejido.
8. El constructo de la reivindicación 1 en el
cual las secuencias de exteína que codifican una o más proteínas
están precedidas o seguidas por una secuencia que codifica un
péptido que dirige el producto de expresión de las secuencias de
exteína a un compartimiento particular dentro de la célula en la
cual se expresa el constructo.
9. El constructo de la reivindicación 1 ó 2 en
el cual las proteínas exteína son proteínas diferentes.
10. El constructo de la reivindicación 1 ó 2 en
el cual las proteínas exteína son proteínas iguales.
11. El constructo de DNA de la reivindicación 1
en el cual el constructo de DNA codifica una glicina o alanina en
el primer residuo del término N de la exteína enlazada al término C
de una inteína.
12. El constructo de DNA de cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en el cual la unidad de remodelación
de inteína modificada comprende secuencias de exteína que codifican
enzimas que catalizan pasos diferentes en un camino metabólico.
13. El constructo de la reivindicación 1 ó 5 en
el cual las proteínas exteína se seleccionan del grupo constituido
por acil-CoA-deshidrogenasas,
acil-CoA-oxidasas, catalasas,
subunidades alfa de oxidación en beta, subunidades beta de
oxidación en beta, PHA-sintasas con especificidad de
sustrato de longitud de cadena media,
beta-cetotiolasas, reductasas dependientes de NADH
o NADPH, PHA-sintasas con especificidad de longitud
de cadena corta, y PHA-sintasas que incorporan a la
vez sustratos de longitud de cadena corta y media.
14. El constructo de la reivindicación 1 ó 5 en
el cual las proteínas exteína se seleccionan del grupo constituido
por enzimas codificadas por el locus phaG, sintasas de longitud de
cadena media, beta-cetotiolasas, reductasas
dependientes de NADH o NADPH, y PHA-sintasas que
incorporan a la vez sustratos de longitud de cadena corta y
media.
15. El constructo de la reivindicación 5 en el
cual las proteínas exteína se seleccionan del grupo constituido por
resistencia a los herbicidas, resistencia a los insectos, y rasgos
deseables de plantas de cosecha.
16. Un método para expresar genes múltiples de
células que comprende transformar las células con el constructo de
una cualquiera de las reivindicaciones 1-15, en el
cual las células son células eucariotas, tales como células
seleccionadas del grupo constituido por células de mamífero, células
de planta y células de levadura, y en el cual si las células son
células animales, entonces el método es un método in
vitro.
17. Una célula eucariota que produce proteínas
recombinantes que comprenden el constructo de cualquiera de las
reivindicaciones 1-15.
18. El método de la reivindicación 16, en el
cual la célula eucariota es una célula de levadura y el promotor es
un promotor operativo en la célula de levadura.
19. El método de la reivindicación 16, en el
cual la célula eucariota es una célula de planta y el promotor es
un promotor operativo en una célula de planta.
20. El método de la reivindicación 19 para
producir hidroxialcanoatos en plantas, en el cual las proteínas
exteína se seleccionan del grupo constituido por
acil-CoA-deshidrogenasas,
acil-CoA-oxidasas, catalasas,
subunidades alfa de oxidación en beta, subunidades beta de
oxidación en beta, PHA-sintasas con especificidad de
sustrato de longitud de cadena media,
beta-cetotiolasas, reductasas dependientes de NADH o
NADPH, PHA-sintasas con especificidad de longitud
de cadena corta, y PHA-sintasas que incorporan
sustratos con longitud de cadena tanto corta como media.
21. El método de la reivindicación 19 para
producir polihidroxialcanoatos en plantas, en el cual las proteínas
exteína se seleccionan del grupo constituido por enzimas codificadas
por el locus phaG, sintasas de longitud de cadena media,
beta-cetotiolasas, reductasas dependientes de NADH o
NADPH y PHA-sintasas que incorporan a la vez
sustratos de longitud de cadena corta y media.
22. El método de la reivindicación 19, en el
cual las proteínas exteína se seleccionan del grupo constituido por
resistencia a herbicidas, resistencia a los insectos, y rasgos
deseables de plantas de cosecha.
23. El constructo de la reivindicación 1, que
comprende una sola unidad de remodelación de inteína modificada, en
el cual la unidad de remodelación modificada única está constituida
por una secuencia de inteína que tiene un extremo 5' y un extremo
3', en el cual una primera secuencia de exteína está fusionada al
extremo 5' de la secuencia de inteína, y una segunda secuencia de
exteína está fusionada al extremo 3' de la secuencia de
inteína.
24. Un constructo de DNA que comprende:
- a)
- un promotor simple específico de plantas en el extremo 5' del constructo,
- b)
- una primera región codificante aguas abajo del promotor específico de plantas,
- c)
- una secuencia de inteína fusionada al extremo 3' de la primera región codificante y al extremo 5' de una segunda región codificante; y
- d)
- una secuencia de terminación de la transcripción;
en donde la primera región codificante, la
secuencia de inteína y la segunda región codificante codifican
juntas una unidad de remodelación de inteína modificada que se
expresa como una poliproteína precursora simple y que cataliza la
escisión de las secuencias proteínicas codificadas por las regiones
codificantes primera y segunda de la inteína, y previene la
ligación de las secuencias de proteína codificadas por las regiones
codificantes primera y segunda.
\vskip1.000000\baselineskip
25. Uso del constructo de DNA de la
reivindicación 24 para causar la expresión de las regiones
codificantes primera y segunda en una célula de planta.
26. Una célula de planta que comprende un
constructo como se define por la reivindicación 24.
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