JPH11332588A - 新規なポリエステルバイオポリマー - Google Patents

新規なポリエステルバイオポリマー

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JPH11332588A
JPH11332588A JP10363334A JP36333498A JPH11332588A JP H11332588 A JPH11332588 A JP H11332588A JP 10363334 A JP10363334 A JP 10363334A JP 36333498 A JP36333498 A JP 36333498A JP H11332588 A JPH11332588 A JP H11332588A
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Abstract

(57)【要約】 【課題】 新規生分解性プラスチックの経済的な供給源
を提供する。 【解決手段】 生物中でポリエステルバイオポリマーを
構築する方法であって、ポリヒドロキシブチレートの合
成に必要な酵素をコードする遺伝子の発現のために生物
を選択する工程、この生物に、ポリヒドロキシブチレー
トポリメラーゼをコードする単離された構造遺伝子を、
生物中の上記遺伝子の発現の調節配列と組み合わせて導
入する工程、および発現した酵素がポリヒドロキシブチ
レートを合成するために適切な基質を提供する工程を包
含する。

Description

【発明の詳細な説明】
【0001】
【発明の属する分野】本発明は、トランスジェニック生
物、特にトランスジェニック植物における生分解性プラ
スチックの製造方法、および新規なポリエステルバイオ
ポリマーに関する。National institu
te of health、海軍研究機関、および国立
科学基金からの助成金の規定により、米国政府は本発明
に権利を有する。
【0002】
【従来の技術】細菌による合成は、これまで長い間、多
くのより複雑なバイオポリマーを産生する手段でしかな
かった。最近になってようやく、これらのバイオポリマ
ーの合成経路が確かめられた。これら経路に関係する様
々な酵素および補助因子の単離に多くの努力が払われ
た。これらの発現の調節は主として経験上のものであっ
た。即ち、栄養分濃度や酸素のようなその他の因子のレ
ベルを変化させて、ポリマーの産生および組成が測定さ
れた。
【0003】これらの複雑なバイオポリマーの産生を制
御し、それを特定の様式に改変するため、これらの合成
に必要な化学反応工程を調べる以下の系を設計すること
が必要である;これらの化学反応工程に寄与するタンパ
ク質を単離し、特徴付けること;これらのタンパク質を
コードする遺伝子を単離し、配列決定し、クローニング
すること;およびこれらの遺伝子の発現割合および発現
レベルを調節するメカニズムを同定し、特徴付け、利用
すること。
【0004】商業上有用な複雑なバイオポリマーである
ポリヒドロキシブチレートは、多数の細菌が産生する細
胞間保持物質である。ポリ−β−ヒドロキシブチレート
(PHB)はD(−)−3−ヒドロキシブチレートの重
合したエステルであり、1925年にBacillus
megateriumで最初に発見された。この独特
のポリエステルは、その化学的性質および物理的性質の
両者のために、さらに進んだ研究の対象として注目され
るバイオポリマーになった。PHBは生分解性/熱可塑
性材料として、ある種の抗生物質の有機合成のためのキ
ラル中心として、およびドラッグデリバリーと骨の置換
のためのマトリックスとしての用途を含む、様々な応用
が可能である。このポリマーはインビボの体内で、ヒト
血液の正常な構成成分であるヒドロキシブチレートに分
解される。
【0005】C2生合成中間体のアセチルCoAからの
疎水性結晶性PHB粒子の酵素的合成は、多数の細菌で
研究されてきた。アセチルCoAからPHBへの変換に
は、βケトチオラーゼ、アセトアセチルCoAレダクタ
ーゼおよびPHBポリメラーゼの3つの酵素が関与す
る。
【0006】チオラーゼは炭素−炭素結合の合成および
開裂を触媒する遍在性酵素であり、従って細胞内代謝に
おいて中心的役割を占める。テルペノイド、ステロイ
ド、マクロライドおよび他の生合成経路と、脂肪酸の分
解とには、異なるチオラーゼ酵素が関与する。Z.ra
migeraでは、2つのアセチルCoA基が縮合して
アセトアセチルCoAを形成するのをβケトチオラーゼ
が触媒する。次にアセトアセチルCoAはNADP特異
的レダクターゼで還元されて、PHBポリメラーゼの基
質であるD(−)−β−ヒドロキシブチリル−CoAが
形成される。
【0007】βケトチオラーゼ(アセチル−CoA−C
oA−C−アセチルトランスフェラーゼ、E.C.2.
3.1.9)は、A.beijerinckii(Se
niorおよびDawes、Biochem.J.、1
34、225−238(1973))、A.eutro
phus(OedingおよびSchlegel、Bi
ochem J.、134、239−248(197
3))、Clostridium pasteuria
num(BerntおよびSchlegel、Arc
h.Microbiol.、103、21−30(19
75))およびZ.ramigera(Nishimu
raら、Arch.Microbiol.、116、2
1−27(1978))で研究された。Z.ramig
eraのアセトアセチル−CoAレダクターゼ遺伝子の
クローニングおよび発現は米国特許出願第067,69
5号に記載されている。次にこの遺伝子は、Alcal
igenes eutrophusおよびNocard
iaを含む他の細菌種からレダクターゼ遺伝子を単離す
るためのハイブリダイズ用プローブとして用いられた。
【0008】Z.ramigeraでPHB生合成に関
与するレダクターゼはヒドロキシブチリル−CoAのD
(−)異性体に立体特異的であり、補助因子としてもっ
ぱらNADP(H)を利用する。最もよく特徴付けられ
たアセトアセチルCoAレダクターゼは、Saito
ら、Arch. Microbiol.、114、21
1−217(1977)およびTomitaら、Bio
chemistry of Metabo1ic Pr
ocesses、353、D.Lennonら編(El
sevier、Holland、1983)により記載
されたZoogloea由来のものである。このNAD
P特異的な分子量92,000の酵素はFukuiら、
Biochim.Biophys.Acta 917、
365−371(1987)により、少量ではあるが均
一にまで精製された。米国特許出願第067,695号
に記載されたように、Z.ramigera由来のβケ
トチオラーゼ酵素は今日ではクローニングされ、発現さ
れ、その精製物は均一にまで精製されている。クローニ
ングされた遺伝子は、Alca1igenes eut
rophusおよびNocardiaを含む他の細菌種
から相当するβケトチオラーゼを同定および単離するの
に用いられた。
【0009】Z.ramigeraのPHBポリメラー
ゼはD−β−ヒドロキシブチリルCoAに対して立体特
異的である。A.eutrophusは他の基質、例え
ばD−β−ヒドロキシバレリルCoAを使用し得る。
A.eutrophusの培地にプロピオネートを添加
すると、C5とC4ユニットのPHB/HVコポリマーへ
の取り込みが起こるからである。Griebelおよび
Merrick、J.Bacteriol.、108、
782−789(1971)はB. megateri
umの天然のPHB粒子からPHBポリメラーゼを分離
したが、その過程で酵素活性はすべて消失した。彼らは
2つのタンパク質分画の1つへPHB粒子を添加するこ
とによってのみ、活性を再構築し得た。より最近、Fu
kuiら、Arch.Microbiol.、110、
149−156(1976)およびTomitaら(1
983)はZ.ramigeraにこの酵素を発見し、
粒子に結合しないPHBポリメラーゼに部分精製した。
クローニングし、発現させ、新規なポリマーの合成にそ
の産生物を用いる方法は米国特許出願第067,695
号に記載されている。
【0010】A.eutrophusおよびP.ole
ovaransを含む細菌により産生されるポリヒドロ
キシアルカノエート(PHA)貯蔵ポリマーの全範囲が
見いだされている。PHAポリマーは、側鎖の長さに変
異を有する(CH3〜CH8 17)βヒドロキシアルカノ
エートのD−異性体のヘテロポマーである。例えば、
A.eutrophusは5−クロロペンタン酸の存在
下で生育させると、3−ヒドロキシブチレート、3−ヒ
ドロキシバレレートおよび5−ヒドロキシバレレートを
ポリマーに取り込む。
【0011】このポリマーは古典的な発酵法で非常に高
収量が得られること、および10,000よりも大きい
分子量のPHAおよびPHBは多くの応用に有用である
という事実から、新規なPHB様バイオポリマーを開発
して応用分野を改善、または新たに作り出すこと望まれ
ている。
【0012】PHB以外のポリ−β−ヒドロキシアルカ
ノエートの、A.eutrophusおよびPseud
omonas oleovaransの単一培養による
産生は、deSmetら、J.Bacteriol.、
154、870−878(1983)により報告されて
いる。両方の細菌で、ポリマーは制御された発酵により
産生した。A.eutrophusはグルコースとプロ
ピオネート下で生育させるとPHB−PHVのヘテロポ
リマーを産生し、PHV含有量は約30%に達する。
P.oleovaransはオクタン下で生育させると
ポリ−β−ヒドロキシオクタノエートを産生する。No
cardiaはn−ブタン下で生育させるとPHB−P
H−2−ブテノエートのコポリマーを産生することが報
告されている。選択された基質を用いる制御発酵により
得られる3−ヒドロキシブチレートポリマーの最終組成
の決定もまた、Holmesらの米国特許第4,47
7,654号に記載されている。
【0013】
【発明が解決しようとする課題】基質特異性に関して異
なる様々な酵素の利用を可能にし、これらの酵素をコー
ドする遺伝子を他の宿主、特に植物で発現させる方法に
より、現在利用可能な石油由来のプラスチックス、特に
ポリプロピレンの経済的な生体分解性代替物を提供する
ことが可能となる。
【0014】従って、本発明の目的は、複合バイオポリ
マー、特にPHB、PHAおよび類似ポリマーの合成方
法に用いられる酵素をさらに提供することである。
【0015】本発明の目的はさらに、これらのポリマー
合成タンパク質をコードする他の遺伝子を単離し、配列
決定し、クローニングすること、およびこれらの遺伝子
の発現速度と発現レベルを調節する手段である。
【0016】本発明の他の目的は、ポリヒドロキシブチ
レートおよびポリヒドロキシアルカノエートを合成する
タンパク質をコードする遺伝子から発現する、精製され
たタンパク質を提供することである。
【0017】本発明の目的はさらに、これらのタンパク
質および調節配列を用いて、ポリエステル骨格を有する
新規なバイオポリマーを創製する方法を提供することで
ある。
【0018】さらに本発明の目的は、細菌および植物細
胞を製造に用い、生体分解性ポリヒドロキシアルカノエ
ートおよび新規な関連ポリマーの経済的な供給源を提供
することである。
【0019】
【課題を解決するための手段】本発明は、生物中でポリ
エステルバイオポリマーを構築する方法に関し、この方
法は、ポリヒドロキシブチレートの合成に必要な酵素を
コードする遺伝子の発現のために、生物を選択する工
程、この生物に、ポリヒドロキシブチレートポリメラー
ゼをコードする単離された構造遺伝子を上記生物中の上
記遺伝子の発現の調節配列と組み合わせて導入する工
程、および発現した上記酵素がポリヒドロキシブチレー
トを合成するために適切な基質を提供する工程を包含
し:ここで、上記単離された構造遺伝子は、
【0020】
【化2】
【0021】のヌクレオチド配列を有する遺伝子、およ
び、このヌクレオチド配列とハイブリダイズし、かつポ
リヒドロキシブチレートポリメラーゼ活性を有するポリ
ペプチドをコードする遺伝子からなる群から選択され、
このハイブリダイゼーションは、5×SSCP(1×S
SCPは、0.15M NaCl、0.15Mクエン酸
ナトリウム、10mM NaH2PO4、および10nM
Na2HPO4を含む)、5×デンハート液、0.1%
(w/v)SDS、10mM EDTAおよび100μ
g/ml超音波処理変性サケDNAを含む溶液中で約1
6から18時間の期間、65℃の温度で実施される。
【0022】本発明の方法は、上記酵素をそれらの基質
特異性に基づいて選択する工程をさらに包含し得る。
【0023】本発明の方法は、上記酵素をコードする遺
伝子を改変することによりこの酵素の基質特異性を変化
させる工程をさらに包含し得る。
【0024】本発明の方法は、特定のインデューサーに
反応して、ポリマーの合成に必要な酵素をコードする遺
伝子の発現を制御する調節配列を発現ベクターに提供す
る工程をさらに包含し得る。上記ポリマー合成の特定の
インデューサーは、温度変化および特定の基質からなる
群から選択され得る。
【0025】上記遺伝子は、Zoogloea、Azo
tobacter、Alcaligenes、Baci
llus、Nocardia、Clostridiu
m、Halobacterium、Escherich
ia、PsuedomonasおよびPhodospi
rilliumからなる群から選択される細菌に由来し
得る。
【0026】本発明の方法は、ポリマー合成に必要な酵
素の少なくとも1つが欠損した細菌生物中で前記遺伝子
を発現させる工程をさらに包含し得る。
【0027】本発明の方法は、上記遺伝子を植物中で発
現させる工程をさらに包含し得る。
【0028】上記遺伝子は、ヒドロキシアシルCoA基
質のD異性体に立体特異的な酵素をコードし得る。
【0029】本発明は、1つの局面で、ポリヒドロキシ
ブチレートまたはそのコポリマーを合成するための生物
に関し、この生物は、ポリヒドロキシブチレートの合成
に必要な酵素をコードする遺伝子、および適切な基質と
反応してポリヒドロキシブチレートまたはそのコポリマ
ーを合成し得るこの生物中の、ポリヒドロキシブチレー
トポリメラーゼをコードする単離された構造遺伝子の発
現のための調節配列と組み合わせて上記遺伝子を発現す
る。
【0030】好ましくは、上記生物は、細菌または植物
である。
【0031】好ましくは、上記基質は、アセトアセチル
誘導体、オレフィン、エステル、アルコール、ジオー
ル、エポキシド、D−ヒドロキシブチリルCoA、D−
βヒドロキシバレリルCoA、分岐βヒドロキシアシル
CoA、D−3−ヒドロキシブチリルCoAのアシルC
oAモノマー類似体、4−ヒドロキシブチルCoA、ア
シルチオエステルCoA、3ヒドロキシ−4−ペンテノ
イル−CoAおよびこれらの組み合わせからなる群から
選択され得る。
【0032】上記生物は、ポリヒドロキシブチレートポ
リメラーゼタンパク質を発現し得る。
【0033】上記生物は、上記ポリヒドロキシブチレー
トポリメラーゼ遺伝子が、Agrobacterium
tumefaciensプラスミドおよび植物DNA
ウイルスからなる群から選択されるベクターを用いて導
入された、植物であり得る。
【0034】上記生物は、上記ポリヒドロキシブチレー
トポリメラーゼ遺伝子が、細胞質、ミトコンドリア、ま
たはクロロプラスト中に導入された、植物であり得る。
【0035】本発明は、ポリヒドロキシブチレート(P
HB)およびポリヒドロキシアルカノエート(PHA)
ポリエステル合成の遺伝子および酵素を、原核細胞およ
び真核細胞、特に植物で分子レベルで操作することによ
り、バイオポリマー合成を制御し改変する方法に関す
る。
【0036】PHBおよびPHAポリマーの産生に関与
する遺伝子の単離、特徴付け、および発現が例示されて
いる。Zoogloea ramigera株I−16
−M、Alcaligenes eutrophus、
Nocardia salmonicolor、および
Pseudomonas oleovarans由来の
PHBおよびPHA合成経路の酵素(β−ケトチオラー
ゼ、アセトアセチル−CoAリダクターゼおよびPHB
ポリメラーゼあるいはPHAポリメラーゼ)をコードす
る遺伝子が、PHBを産生しない生物であるE.co1
iで確認または単離され、発現された。
【0037】細菌細胞を用いた好ましい実施態様では、
窒素またはリン酸制限条件下でPHBを乾燥細胞重量の
70%から80%まで蓄積する能力のあるA.eutr
ophusにより産生される。他の実施例では、PH
B、PHAおよび新規ポリマーの発現および合成のため
に、遺伝子が植物細胞に導入される。ポリマーの特定の
改変には、ポリマー鎮の長さの変化、およびポリマーに
異なるモノマーを組み入れて物理的性質の異なるコポリ
マーを製造することが含まれる。
【0038】
【発明の実施の形態】以下の方法は、βケトチオラー
ゼ、アセトアセチルCoAレダクターゼ、PHBポリメ
ラーゼ、およびPHAポリメラーゼをコードする遺伝子
とそれらの発現産物とを単離し、その発現を調節する配
列を同定し特徴付け、そしてポリマー産生に対する培養
条件および使用基質の影響を調べるために用いられた。
PHBおよびPHA様バイオポリマーを製造する系を構
築する技法もまた開示されている。これらの酵素を細菌
または植物細胞で組み合わせ、適当な酸素および温度の
制御培養条件下に適当な基質を用いることにより、様々
なポリマーを作成できる。これらの発現を調節する酵素
またはヌクレオチド配列もまた、発現量を変え、または
基質特異性を変えて得られるポリマーをさらに変化させ
るために改変することが可能である。その効果は、完全
細胞を用いては通常利用できなかった基質が、単離され
た酵素を用いることにより製造可能であることである。
【0039】方法、遺伝子、およびこれらの発現産物お
よびポリマー合成は以下の実施例に詳細が記載されてい
るが、それに限定されない。
【0040】
【実施例】培地および培養条件 PHB生合成経路の遺伝学的研究のために、まず初めに
Zoogloea ramigera株I−16M(A
TCC19623)を用いた。Z.ramigeraD
NAは200mlの対数増殖期中期の培養物から、以下
のように精製した。細胞を遠心して集め、20mMのT
ris−HC1、PH8.2で洗浄し、10mlのTr
is−HC1に再懸濁した。次に10mlの24% w
/vポリエチレングリコール8000および2mlの2
5mg/mlリゾチームを加え、次に37℃で30分イ
ンキュベートして、細胞をスフェロプラストにした。ス
フェロプラストを遠心して集め、5mlのTE緩衝液
(10mMのTris−HC1、pH8.0.1mMの
EDTA)に再懸濁し、300μ1の10% w/vS
DSを添加し、55℃で10分間インキュベートして細
胞を溶解した。10mlのTEをさらに添加し、細胞溶
解物をRNAse(50μg/ml)およびプロテイナ
ーゼK(30μg/ml)と共に37℃で1時間インキ
ュベートした。次にDNAをCsC1密度勾配遠心によ
り精製した。
【0041】E.co1i株はLB(Luria Be
rtani)培地(NaC1、10g/l;トリプト
ン、10g/1;イースト抽出物、10g/1)または
2XTY培地(NaCl、5g/1;トリプトン、16
g/1:イースト抽出物、10g/1)に生育させた。
組換えプラスミドを含有するE.co1iによる、PH
BまたはPHAの産生には(NH42SO4濃度を0.
04%に減少させ変更した最小培地を用いた。
【0042】A.eutrophus株はトリプチカー
ゼソイブロス(TSB、BBL Microbiolo
gy systems、 Cockeysvi11e、
Md)または0.39g/1 MgSO4:0.45
g/1 K2SO4;12ml1.1m H3PO4;15
mg/1 FeSO4 7H2O;24ml痕跡元素(2
0mg/1 CuSO45H2O; 100mg/1 Z
nSO46H2O;100mg/1 MnSO44H2O;
2.6g/1 CaCl22H2O)を含有する限定最
小培地に生育させた。pHはNaOHで6.8に調整
し、培地はオートクレーブで滅菌した。窒素源としてN
4Clを最終濃度0.1%または0.01%になるよ
うに添加し、フルクトースを最終濃度0.5〜1%(W
/V)になるように添加した。
【0043】プラスミドDNAの調製は、Ish−Ho
rowiczおよびBurke、Nucleic Ac
ids Res.、9.2989−2998(198
1)の記載に従いBirnboimおよびDolyのN
ucleic Acids Res.、7.1513−
1523(1979)の方法で行った。λ DNAはM
aniatisら、Mo1ecular Clonin
g : A Laboratory Manual.
(Co1d Spring Harbor Labor
atory、Cold Spring Harbor、
NY 1982)に記載の標準的方法で調製した。DN
A配列はM13mp18およびM13mp19クローニ
ングベクターを(Yanisch−Perronら、G
ene33、103−109(1985))用いてSa
ngerら、Proc.Natl.Acad.Sci.
USA 74、5463−5467(1977)のジデ
オキシ鎖終結法により分析した。α−[35S]−dAT
PおよびDNAポリメラーゼ1のクレノウ断片はAme
rshamから購入した。配列データはVAXシステム
でコンパイルし分析した。
【0044】ランダムなZ.ramigeraクロモソ
ームDNA断片の組換えライブラリーを、Youngお
よびDavis、Science、222、778−7
82(1983)の記載に従いλgt11発現ベクター
に構築した。Z.ramigera DNAはAnde
rson、 Nucleic Acids、9、301
5−3026(1981)の教示に従いまずEcoRI
メチラーゼを用いてメチル化し、次にMg2+の存在下に
DNAse 1で部分消化した。部分消化したDNA断
片の末端をクレノウポリメラーゼで修復し、EcoRI
リンカーを添加し、過剰量のEcoRIでDNAを完全
に消化した。2−8 kbの断片を1.5%アガロース
ゲルでサイズ選別し、電気溶出により精製し、EcoR
I消化されたホスファターゼ処理λgt11のDNAに
ライゲートした。ライゲーションは2μgのλgt11
DNAおよび1μgの断片化クロモソームDNAを用
い全量10μlで、4℃で18時間行った。完全なライ
ゲーション反応物はインビトロでManiatisら
(1982)の記載に従い、E.co1i株BHB26
88およびBHB2690、HohnおよびMurra
y、Proc.Natl.Acad.Sci.、 US
A、74、3259−3263(1977)から調製し
たλ抽出物を用いてパッケージした。パッケージしたフ
ァージはE.co1i Y1088を用いてプレートに
まき増幅させた。
【0045】λgt11発現ライブラリーのスクリーニ
ングは、ウサギ抗チオラーゼ抗体を用いてYoungお
よびDavis、Science、222、778−7
82(1983)に記載の変法により行った。
【0046】制限エンドヌクレアーゼ、T4 DNAリ
ガーゼおよびDNAポリメラーゼ1はNew Engl
and Biolabsから入手し、製造業者の指示し
た条件下で用いた。子牛腸アルカリホスファターゼはB
oehringer Mannheim Corpor
ationから購入した。プラスミドの精製、E.co
1iの形質転換等を含む全ての慣例的DNA操作は、M
aniatisら(1982)の記載した方法で行っ
た。クロモソームDNAはA.eutrophus株か
ら精製し、TSB中で後期対数相まで生育させた。制限
酵素消化DNA試料のアガロースゲルからニトロセルロ
ースフィルターへの転写、32P標識DNAプローブを用
いたプレハイブリダイゼーションおよびハイブリダイゼ
ーションはPeoplesら、J.Biol.Che
m.、 262、97−102(1987)に記載され
ている。制限酵素分析のためのA.eutrophus
の組換え株からの迅速なプラスミドの単離は、Birn
boimおよびDoly、Nucleic Acids
Res.7.1513−1523(1979)のアル
カリ抽出法で行った。A.eutrophusへの接合伝達 広宿主プラスミドpLAFR3またはpLAFR3の組
換え誘導体のA.eutrophusへの接合移入は、
Eassonら、J.Bacteriol.、169、
4518−4524(1987)に記載の方法により行
った。但しこの場合、受容細胞A.eutrophus
はソニケートせず、また接合移入体は窒素源として0.
01% NH4Cl、炭素源として1%(w/v)フル
クトース、および10μg/mlテトラサイクリンを含
有するA.eutrophus無機塩寒天プレートで選
択した。
【0047】Tn5変異誘発のために、自然ストレプト
マイシン耐性株のA. eutrophus 1159
9(1599 S1)を用いた。唯一のドナーとして
E.co1i MM294A(pRK602)を用い
て、上記の様にpRK602(Tn5)の移入を行っ
た。Tn5を含有するA.eutrophus株はスト
レプトマイシン(500μg/ml)およびカナマイシ
ン(100μg/ml)上での生育によって選択した。Z.ramieraチオラーゼ遺伝子の同定 チオラーゼ抗血清は精製されたチオラーゼタンパク質を
用いて標準方法により、New Zealand白色ウ
サギの雌を用いて調製した。抗体力価はActa Pa
thol.Microbio1.Scand.26、5
07−515(1949)のオクタロニー二重拡散アッ
セイで評価した。精製抗体は血清から、Bighee
ら、Mol.Immunol.20、1353−135
7(1983)に従いプロテインAアガロースのクロマ
トグラフィーで調製した。約4×104個の組換えファ
ージをE.co1i Y1090に吸着させて15cmの
LBアガープレートにまき、42℃で3時間インキュベ
ートした。次にプレートを、予め10mM IPTGで
飽和させたニトロセルロースフィルター(Schlei
cher & Schull、BA85)の上に載せ、
37℃でさらに4時間インキュベートした。フィルター
を取り除き、TBST(50mM Tris−HCl、
PH7.9、150mM NaCl、0.05% Tw
een−20)で10分間洗浄し、20% v/v牛胎
児血清を添加したTBST中で30分間インキュベート
して、TBSTですすいだ。第一抗体は精製した抗チオ
ラーゼ抗体(10μl)を添加したTBSTの10ml
中でこのフィルターを、室温で1時間インキュベートす
ることにより結合させた。次にフィルターを、TBST
を各5分間ずつ3回替えて洗浄した。結合した第一抗体
はビオチン−アビシン ホースラディッシュペルオキシ
ダーゼ検出系(Clontech Laborator
ies)およびホースラディッシュペルオキシダーゼ発
色剤(Bio−Rad Laboratories、
Richmond、VA)を用いて検出した。
【0048】タンパク質はドデシル硫酸ナトリウムゲル
電気泳動により、Laemmli、Nature 22
2、680−685(1970)の方法で分離し、Bu
rnetti、Ana1.Biochem.112、1
95−203(1981)の記載に準じてニトセルロー
スフィルター(SchleicherおよびSchue
ll BA85)に電気泳動により移した。30Vで一
晩移した後、フィルターをTBS(ツイン20を含有し
ないTBST)ですすぎ、5%ウシ血清アルブミンを添
加したTBS中でインキュベートした。次に、抗チオラ
ーゼ血清と反応するタンパク質を、フィルターを100
mlの1%ゼラチン入りTBSに2mlの抗チオラーゼ
血清を添加したものと共に1−2時間インキュベートす
ることにより検出した。結合した第一抗体は、ヤギ抗ウ
サギIgGのホースラディッシュペルオキシダーゼ複合
体およびホースラディッシュペルオキシダーゼ発色試薬
(Bio−Rad Laboratories、 Ri
chmond. CA)を用いて検出した。
【0049】アガロースゲルから分離したDNA断片を
用い、Southern,J. Mol.Biol.、
98、503−517(1975)の開発した方法に
基づくSmithおよびSummers、 Anal.
Biochem.109、123−129(1980)
のサンドイッチブロット法によりDNAプロットを調製
した。フィルターは、Rigbyら、J.Mol.Bi
ol.、 113、237−251(1977)のニッ
クトランスレーション法により[α−32P]dATPで
高比活性(0.1〜1×108cpm/μgDNA)に
ラベルしたDNAプローブとハイブリダイズさせた。プ
レハイブリダイゼーションおよびハイブリダイゼーショ
ンは、シールされたポリテン(polythene)バ
ッグ中で65℃にて行った。プレハイブリダイゼーショ
ン/ハイブリダイゼーション液は5×SSCP(1×S
SCPは0.15M NaCl、0.15Mクエン酸ナ
トリウム、10mM Na2HPO4、10mM NaH
2PO4を含有)、5×デンハー液、0.1%(w/v)
SDS、10mM EDTAおよび100μg/ml超
音波処理変性サケDNAを含有した。フィルターを8〜
18時間プレハイダリダイズさせ、フィルター当り10
7cpmのラベル化DNAプローブを用いて16〜18
時間バイブリダイズさせた。
【0050】溶原性λgt11組換えクローンはYou
ngおよびDavis、 Science、 222、
778−782(1983)に記載のようにE.co1
iY1089で調製した。λファージにコードされるタ
ンパク質の調製および分析のために、溶原菌をLB(1
00ml)で30℃にて、0.5 OD600に達するま
で生育させた。プロファージは45℃で20分間インキ
ュベートして誘導し、IPTGを5mMになるように添
加して、誘導された溶原菌を37℃で1時間インキュベ
ートした。細胞を集め、アッセイ緩衝液(0.1M T
ris−HCl、pH7.5、5mM βメルカプトエ
タノール、5%(v/v)グリセロール)に再懸濁し、
超音波処理により溶菌させ、遠心により細胞残渣をペレ
ット化して、細胞抽出物を−20℃で貯蔵した。細菌溶
解物のタンパク質濃度は、M.M.Bradford、
Anal.Biochem.72、248−254(1
976)の方法により標準としてウシ血清アルブミンを
用いてアッセイした。チオラーゼ酵素のアッセイはNi
shimuraら、Arch.Microbio1.1
16、21−27(1978)の記載に従い行った。
【0051】DNA断片はMベクターmp10およびm
p11にクローン化し、Sangerら、Nuclei
c Acids Res.10、141−158(19
80)、Proc.Natl.Acad.Sci.US
A 74、5463−5467(1977)のジデオキ
シ鎖終結法により配列決定した。M13配列決定用プラ
イマーおよび他の試薬はAmersham Corp.
から購入した。G/Cに富む領域はMillsおよび
Kramer、 Proc.Natl.Acad.Sc
i.USA 76.2232−2235(1979)に
記載のように、dGTPの代わりにdITPを用いて再
度配列決定した。コンピューターを用いた配列解析はN
uC1eic Acids Res.10、141−1
58(1984)のStadenプログラムを用いて行
った。
【0052】精製された目的のDNA1μgから、約2
×105個の組換え体が得られ、これをE.co1i
Y1088で増幅させた。合計105個の増幅ファージ
を、精製したウサギ抗チオラーゼ抗体を用いてスクリー
ニングした。最初のスクリーニングで10個の潜在的陽
性クローンが確認された(LDBK1−LDBK1
0)。制限酵素分解による分析により、LDBK2−1
0のクローンは同一であることが示された。クローンL
DBK1およびLDBK2を以下の研究のために選択し
た。LDBK1は3.6kbおよび0.75kbの2個
のEcoRI断片を含む挿入物を有する。LDBK2は
1.65kbおよび1.08kbの3個のEcoRI断
片を含む挿入物を有する。
【0053】LDBK1およびLDBK2の挿入配列に
コードされるタンパク質は、チオラーゼ酵素活性および
ウサギ抗チオラーゼ血清との交叉反応について分析し
た。LDBK1およびLDBK2ファージDNAを含む
溶原性株E.coli Y1089を調製した。各クロ
ーンからいくつかの溶原菌が得られ、その内の2つ、Y
1089/LDBK1およびY1089/LDBK2を
以下の研究に用いた。λgt11ベクターであるBNN
97/λgt11の溶原菌をコントロールとして用い
た。チオラーゼ酵素アッセイの結果は、Y1089/L
DBK1由来のタンパク質はチオラーゼ活性をかなり含
有していることを明確に示した。さらに、チオラーゼ活
性はIPTG添加により、5倍より多くまでも誘導可能
である。このことはチオラーゼをコードする配列の発現
はλgt11ベクターに含まれるlacプロモーターの
転写制御下に置かれていることを示す。Y1089/L
DBK2もBNN97/λgt11も、そのタンパク質
溶菌物は、IPTGで誘導した場合でさえも、有意なチ
オラーゼ活性を示さない。
【0054】ウサギ抗チオラーゼ抗体に対し最初に陽性
反応を生じたタンパク質のサイズは、ウエスタンブロッ
ト実験により調べた。タンパク質溶菌物はSDSポリア
クリルアミトゲル電気泳動で分離し、ニトロセルロース
フィルターに写し、ウサギ抗チオラーゼ血清でスクリー
ニングした。結果は、Y1089/LDBK1のIPT
G誘導およびIPTG非誘導溶菌物の両者に、免疫反応
陽性の40,000ダルトンタンパク質が示された。
【0055】LDBK1挿入物の制限酵素地図を作成し
た。完全なチオラーゼ遺伝子領域を含有する大きな3.
6kb EcoRI断片は、操作を容易とするためプラ
スミドベクターpUC8にサブクローンした。得られた
サブクローンの一つであるpUCDKB1の制限酵素分
析から、LDBK1のこの断片の制限地図を確立した。
pUCDBK1のDNAは32Pで高比活性にラベル化
し、Z.ramigeraクロモソームDNAをpUC
DBK1の制限酵素地画に用いたのと同じ酵素で消化し
たものを含むニトロセルロースフィルターにハイブリダ
イズさせた。サザンハイブリダイゼーション実験によ
り、5.4kbゲノム断片はpUCDBK1からの1.
45kb SalI/EcoRI断片および1.05k
bSalI断片の両方にハイブリダイズすることが確認
された。サザンハイブリダイゼーション実験に基づき、
クローン化されたpUCDBK1挿入物はZ.rami
geraゲノムに唯1つだけ示される。
【0056】pUCDBK1挿入物のDNA配列分析
は、M13/サンガ−ジデオキシ鎖終結法を用いて行っ
た。遺伝子をコードする領域を位置付けるため、6個の
リーディングフレームの全てについて、各々のDNA配
列をアミノ酸配列のNH2末端との相同性についてスキ
ャンした。これらの手法を用いることにより、1.45
kb EcoRI/SalI断片内の遺伝子コーディン
グ領域を同定した。遺伝子のプラス鎖の完全ヌクレオチ
ド配列を図1および配列表の配列番号1に示す。Eco
RI部位から290bp下流には、DNA配列をNH2
末端アミノ酸配列と比較して帰属されたチオラーゼ構造
遺伝子の開始点がある。このNH2末端配列は、−89
位からヌクレオチド1174位の終止コドン(TAG)
まで伸びる単一の長いオープンリーディングフレーム内
にある。セリンに始まり25残基伸びる部分は実験的に
決定したNH2末端配列であり、これはDNA配列の解
読による2位から26位の残基と同一である。次に、D
NA配列を解読して残余の残基27位から391位(ヌ
クレオチド79位から1173位)までのアミノ酸配列
を推定した。このようにして、ヌクレオチド1位から1
174位(上記リーディングフレーム内)のDNA配列
はアミノ酸391個の算出分子量40,598のポリペ
プチドをコードする(配列番号2)。この値はSDSポリ
アクリルアミドゲル電気泳動で決定した分子量42,0
00と非常によく一致する。
【0057】他の2つの証拠から、この翻訳産物はチオ
ラーゼの正しいアミノ酸配列であることが確認される。
まず、活性部位ペプチドと推定されるアミノ酸配列(N
2−G1y−Met−Asn−Gln−Leu−Cy
s−Gly−Ser−Gly−COOH)を検索すると
84位−92位残基に存在した。さらに、翻訳産物から
推定されるアミノ酸組成は実験的に得られたものと非常
によく一致している。1.46kb EcoRI−Sa
lI断片のG/C含有量は66.2%と高い。分けて考
えると、5’−フランキング290bpのG/C含有量
は57.4%であり、構造遺伝子領域では68.4%で
ある。アミノ酸配列から、Z.ramigeraチオラ
ーゼが5個のシステイン残基を有することが確認され
る。Z.ramigera活性部位のシステインは残基
Cys−89である、他の分子内または分子間ジスルフ
ィド結合に関与するシステインはCys−125、Cy
s−323、Cys−377およびCys−387であ
る。NH2末端配列の分析は、1位がセリンであること
を示した。
【0058】ATG開始コドンから7ヌクレオチド上流
にはE.coli配列との相同性から確認される、可能
なリボソーム結合部位5’−CTGAGGA−3’があ
る。ある種の細菌の遺伝子で翻訳開始可能な、2つのG
TGを含む他の開始コドンが、さらに上流に存在する。
5’−フランキング領域を、E.coliプロモーター
エレメントの”−10”および”−35”との相同性に
ついて調べることにより残基−122位から−116位
に可能な”−35”領域が、また−100位から−95
位に対応する”−10”領域である5’−TATAAT
−3’が確認された。ポリ(T)トラクトもまた−25
5位から−266位に存在する。N−ホルミルメチオニ
ン残基の除去のみがチオラーゼの翻訳後プロセシングで
あることが明かである。なぜなら、他の開始コドンであ
るATCまたはGTGはフレームからはずれているか、
または構造遺伝子の開始前にインフレームの終止コドン
があるからである。
【0059】pUCDBK1の1.5Kb SalI−
EcoRI断片は完全なZ.ramigeraのチオラ
ーゼ構造遺伝子に加えて283bpの5’−フランキン
グDNAを含んでいる。このDNA断片がtacプロモ
ーターのベクターpKK223−3(またはその誘導
体)内に挿入された一連のプラスミド構築物を作成し
た。pZT3の作成のために、pUCKBK1をSal
Iで開裂させ、クレノウポリメラーゼで平滑末端にし、
EcoRIリンカーを付加する。EcoRIで消化した
後、1.5Kb断片をアガロースゲルから精製して、p
KK223−3のEcoRI部位に挿入した。tacプ
ロモーターに対して正しい方向に挿入された遺伝子を有
する組換えクローンは、制限酵素分析の後E.co1i
JM105を形質転換することにより確認した。
【0060】次に、チオラーゼ遺伝子の5’末端に隣接
する283bpの配列が欠失した一連のクローンを構築
した。pUCDBK1 DNAをEcoRIで消化し、
Bal31ヌクレアーゼで処理した。SalI消化の
後、断片の末端をクレノウで修復し、EcoRIリンカ
ーを付加した。プラスミドDNAをEcoRIで開裂さ
せ、1.2−1.4kbの正しいサイズ範囲内の断片を
アガロースゲルから精製して、pKK223−3のEc
oRI部位にライゲートした。目的のクローンを制限酵
素地図により同定し、5’−欠失の程度をDNA配列決
定により測定した。これらの一連のクローン、pZT
3.1−pZT3.5の内、最も欠失の長いクローンは
残った5’−フランキングDNAが84bpであった。
従って続くBal31欠失を以下のように行った:pZ
T3.5 DNAをEcoRIで完全に消化し、Bal
31ヌクレアーゼで処理した;クレノウポリメラーゼで
末端を修復して、EcoRIリンカーを付加し、Eco
RIおよびBamHIで完全に消化した後、チオラーゼ
のNH2末端領域に相当する断片をアガロースゲルから
溶出して、BamHI−EcoRI消化したM13mp
11 DNAにライゲートし、E.co1i JM1
01上にプレートした;50個の形質転換体から一本鎖
DNAを調製し、5’−欠失の程度をT−トラッキング
で分析した;目的のクローンからインビトロで二本鎖D
NAを調製し、EcoRI−BamHI挿入物を制限酵
素消化およびアガロースゲルからの溶出により回収し
た。
【0061】完全なチオラーゼ遺伝子を再構築するため
に、pKK223−3からtacプロモーター上流のB
amHI部位を欠失させた誘導体ベクター(pKK22
6)に、pZT3.5からの290bpのBamHI−
HindIII断片をライゲートした;このC末端ベク
ターを次に、目的のBal31が欠失したNH2末端を
再構築するために用いた;クローンpZT3.5.1お
よびpZT3.5.2を以下の研究に用いた。
【0062】チオラーゼのATG翻訳開始コドンに隣接
した283bpのDNAの配列欠失の効果は、プラスミ
ドpZT3.1−pZT3.5.2の産生するチオラー
ゼ活性レベルを分析することにより測定した。各プラス
ミドを含むE.coli JM105培養物の100m
lをIPTGと共に15時間、インキュベートし、チオ
ラーゼレベルをアッセイした。これらの結果のうち最も
注目すべきことは、クローンpZT3.3−pZT3.
5.2を用いて得られるチオラーゼの発現レベルは非常
に高く、pZT3.5で最大の178U/mgが得られ
たことである。これは完全な283bpの5’フランキ
ングDNAを含むプラスミドpZT3に比較して、5.
9倍の増加を示している。このデータは、−84(pZ
T3.5)と−168(pZT3.2)との間に位置す
るチオラーゼ5’フランキング配列が、チオラーゼ遺伝
子のtacプロモーターからの発現を強く阻害すること
を示す。これらの配列の位置は−84(pZT3.5)
および−124(pZT3.4)の間に限定し得る。な
ぜならば、この領域を欠失させると、tac−誘起のチ
オラーゼ発現が最大レベルとなるためである。さらに−
37(pZT3.5.1)まで、および−26(pZT
3.5.2)までの欠失は、チオラーゼの発現レベルを
増加せず、実際僅かに減少が観察された。この一連のク
ローンの誘導のタイムコースはpZT3と同じキネティ
ックスに従い、欠失によってそれとわかるほど影響され
ないことは注目に値する。
【0063】チオラーゼプロモーターが領域−84(p
ZT3.5)から−124(pZT3.4)に存在する
か否かを決定するために、BerkおよびSharp、
Cell 12、721−732(1977)の方法に
従いZ.ramigeraRNAについてS1ヌクレオ
チド保護実験を行った。全RNAを100mlの対数増
殖期中期の培養物から、Hinnenbuschら、
J.Biol.Chem.258、5238−5247
(1983)の熱フェノール/ガラスビーズ抽出法によ
り単離した。5’−32Pラベル化DNAプローブは以下
のように調製した:10μgのプラスミドpZT3.1
DNAをAvaIで完全に消化し、続いてCIPで処理
した;AvaI制限酵素断片の5’末端を、[γ−
32P]−ATPおよびポリヌクレオチドキナーゼでラベ
ル化した;EcoRI消化の後、DNAを8%アクリル
アミドゲルで分離して、32Pラベル化した280bpの
プローブ断片を溶出し、工クノール沈澱により回収し
た。プローブ(10,000cpm)および11μgR
NAをプールし、凍結乾燥し、10μgハイブリダイゼ
ーション緩衝液(40mM PIPES、pH6.4;
1mM EDTA、pH8.0; 0.4M NaC
l; 80%(v/v)ホルムアミド)に再懸濁して、
90℃で10分間変性させ、55℃で一晩アニールさせ
た。2000単位のS1ヌクレアーゼを含有する235
μlの氷冷S1ヌクレアーゼ緩衝液(0.25M Na
Cl: 30mM NaOAc; 1mM ZnS
4; 200μg一本鎖子牛胸腺DNA)を添加した
後、37℃で30分間インキュベートした。反応混合物
をフェノール−クロロホルムで1回抽出し、0.2M
NaOAcおよび10μgイーストtRNAキャリアー
の存在下でエタノール沈澱を行った。得られた断片を6
%(w/v)アクリルアミド、7M尿素のDNA配列決
定ゲルで分析した。サイズ標準としてマキサムギルバー
トのGおよびC配列決定反応を、50,000cpmの
5’−32P−ラベル化プローブDNAで行った。結果
は、保護された断片を明確に示し、そしてRNA開始部
位が、−86位または−87位のCまたはT残基に位置
することを明かに示した。コントロールは、Z.ram
igera RNAの非存在下でプローブは完全に分解
されることを示し、このことはチオラーゼのプロモータ
ー領域が約10bp(−96)および35bp(−12
1)上流に存在することを実証する。チオラーゼの5’
非翻訳領域の長さは86bpである。
【0064】誘導実験の結果から、チオラーゼ遺伝子が
E.coliにおいて可溶性で触媒活性な形態で高レベ
ルで発現し得ることを明確に示した。S1ヌクレアーゼ
の実験で、Z.ramigeraのチオラーゼ遺伝子の
転写開始部位をヌクレオチド−86/−87位に位置付
けてきた。
【0065】チオラーゼプロモーターの”−35”領域
が認識され、RNAポリメラーゼを結合することが示さ
れているけれども、転写開始速度を決定するのは”−1
0”領域である。例えばpZT3の場合、ベクターおよ
び挿入プロモーターの両方にRNAポリメラーゼ分子が
同時に結合することにより、tacプロモーターから速
やかに転写が開始される結果となり、次にこのtacプ
ロモーターがZoogloeaプロモーターに結合した
ポリメラーゼ分子の存在により阻害されるのであろう。
2つのプロモーターが接近している程、ポリメラーゼの
両者への同時の結合チャンスは少なくなり、同時に阻害
が低くなる。従って、これにより、酵素の発現速度を制
御する1つの手段が提示される。Z.ramigeraレダクターゼ遺伝子の確認 チオラーゼ遺伝子のプロモーター領域を確認し、チオラ
ーゼTAG終止コドンの下流に、可能なターミネーター
配列が存在しないことを確認した後、クローンpUCD
BK1に存在する残余の2kbのZoogloeaDN
Aを配列決定して、レダクターゼ遺伝子について調べ
た。完全なpUCDBK1挿入またはその断片を含有す
る一連の発現プラスミド(pZT1〜pZT3)を、
E.colitacプロモーターベクターpKK22
3.3中に構築した。各プラスミドはtacプロモータ
ーに対して発現のために正しい方向に位置するチオラー
ゼ遺伝子を有する。tacプロモーターはチオラーゼの
発現を指令するのではなく、オペロン様タイプの機構の
2.3kb下流に位置する任意の遺伝子の発現を指令す
ると予想するのが理にかなっている。クローンpZT1
は、pUCDBK1の完全な3.8kbEcoRI
Z.ramigera DNA挿入を、ベクターpKK
223−3のEcoRI部位に挿入することにより構築
した。続いて、pZT2をpZT1から、850bp
SmaI断片を欠失させる直接的な方法で派生させた。
pZT3はチオラーゼプロモーターの確認についての記
載のようにして構築する。一連のtacプロモーター誘
導実験は、各々の組換えクローンpZT1、pZT2お
よびpZT3で行った。ベクターpKK223−3をコ
ントロールとして用いた。
【0066】各々のプラスミドを含有するE.coli
細胞を生育させ、イソプロピル−β−D−カラクトピラ
ノシド(IPTG)を最終濃度2mMとなるように添加
することにより誘導させた。15時間誘導を行った後、
10mlの培地を収穫し、超音波で溶菌させた。次に各
クローンから細胞溶解物を、酵素アッセイおよびSDS
−PAGEの両者で分析した。どちらの細胞溶解物から
もPHBポリメラーゼ活性は検出されなかった。3つの
組換えプラスミドpZT1、pZT2およびpZT3の
各々は、チオラーゼ活性を相当なレベルで示した。さら
に、pZT1およびpZT2からの細胞溶解物は、NA
DPHを補助因子とするAcAc−CoAレダクターゼ
活性を比較的高レベルで有する。NADPHを補助因子
として用いる場合は、どの細胞溶解物にもレダクターゼ
活性が検出されない。コントロールのpKK223−3
はチオラーゼ活性もレダクターゼ活性も有さない。pZ
T1およびpZT2の細胞溶解物は実際に、正しいレダ
クターゼを含有するということを確認するために、この
細胞溶解物もまたD(−)β−ヒドロキシブチリル−C
oAの酸化についてアッセイした。どちらの場合にも、
NADPを電子受容体として用いて酵素活性が観察され
た。
【0067】上記細胞溶解物の各々はSDS−PAGE
でも分析した。結果は、pZT1、pZT2およびpZ
T3の細胞溶解物タンパク質中に42,000ダルトン
付近のチオラーゼタンパク質が存在することを示す。こ
のタンパク質はコントロールであるpKK223−3の
細胞溶解物には存在しない。pZT1およびpZT2の
細胞溶解物は、pZT3またはコントロールには存在し
ない小さな25,000ダルトンタンパク質も有し、こ
のタンパク質はAcAcCoAレダクターゼに相当す
る。結果は、AcAc−CoAレダクターゼ遺伝子はチ
オラーゼ遺伝子の下流に位置することを示す。この酵素
の完全な構造遺伝子はpUCDBK1のチオラーゼの
3’末端と下流の最初のSmaI部位との間に位置する
にちがいない。レダクターゼ遺伝子の転写開始部位の確
認と過剰発現 pUCDBK1の最初のSalI部位の2.3kb下流
に位置する、2339bpの完全ヌクレオチド配列を図
2および配列表の配列番号3に示す。チオラーゼ遺伝子
のコドン使用情報を標準として用いて配列データのコン
ピューター分析を行い、3つのオープンリーディングフ
レームを同定した。pZT1およびpZT2の誘導され
た細胞溶解物中に存在する25,000ダルトンのバン
ドを、次に調製用SDS−PAGEにかけて電気溶出
し、N末端タンパク質配列のデータを得た。このデータ
を用いて対応する遺伝子の転写開始部位を確立した。実
験で決定したN末端の5個のアミノ酸は、最初のオープ
ンリーディングフレームのDNA配列から推定される2
位〜6位の残基と一致する。このリーディングフレーム
の翻訳により、分子量25,000のポリペプチドが推
定される(配列番号4)。ヌクレオチド37位のATGに
始まりTGA終止コドンヌクレオチドに終わる最初のオ
ープンリーディングフレームの翻訳産物を図2および配
列表の配列番号4に示す。これはアセトアセチルCoA
レダクターゼタンパク質の推定される一次アミノ酸配列
である。
【0068】クローンpZT1およびpZT2のアセト
アセチルCoAレダクターゼ遺伝子はE.coliで、
納得できるほど高レベルで発現可能である。しかし、両
方の場合共、tacプロモーターからのレダクターゼ遺
伝子の発現は、チオラーゼ構造遺伝子および5’フラン
キング配列の存在のために至適ではない。より単純なア
セトアセチル−CoAレダクターゼ過剰産生ベクターと
してpZR14を構築した。pUCDBK1 DNAを
SalIとSmaIとで完全に消化し、SalI末端を
DNAポリメラーゼのクレノウ断片で修復した。Eco
RIリンカーを付加しEcoRIで消化した後、断片を
アガロースゲル電気泳動で分離した。アセトアセチルC
oAレダクターゼ構造遺伝子に、5’末端の36bpフ
ランキングおよび3’末端の266bpフランキングを
加えたものに相当する1.05kb断片を精製し、pK
K223−3のEcoRI部位にライゲートした。次
に、このpZR14が、レダクターゼ遺伝子が正しい方
向に入った正しい制限酵素地図を有することを確認し
た。pZR14の誘導実験をpZT1、pZT2および
pZT3についての記載と同様にして行った。アセトア
セチルCoAレダクターゼが発現した。A.eutrophusでのチオラーゼおよびレダクタ
ーゼ遺伝子の確認 Zoogloeaから最初の2つのPHB遺伝子を単離
した方法を適用し、Zoogloeaチオラーゼ遺伝子
領域を相同な配列の位置を決めるハイブリダイゼーショ
ン用プローブとして用いて、他のPHB産生種であるA
lcaligenes eutrophusから遺伝子
を同定し、単離し、特徴付けた。
【0069】次に、pUC8にクローン化された(クロ
ーンpAeT3)A.eutrophus DNAの2
kb PstI断片の配列を分析して、A.eutro
phus H16ゲノム中の対応するチオラーゼ遺伝子
領域を同定した。pAeT3の下流の配列もまた、Zo
ogloeaクローンpUCDBK1のNADP−関与
レダクターゼ遺伝子領域と相同である。Alcalig
enesチオラーゼおよびレダクターゼ遺伝子の配列を
図3および図4(図4は図3に示す配列の続きの配列を
示している)、ならびに配列表の配列番号5に、そして
それらの推定されるアミノ酸配列を配列表の配列番号6
および7にそれぞれ示す。
【0070】チオラーゼおよびレダクターゼ遺伝子をp
AeT3からpKK223.3にクローニングすること
により、各々の酵素の発現が得られる。Zoogloe
aとA.eutrophusとでチオラーゼタンパク質
配列を比較することにより、2つのタンパク質が活性部
位Cys−89を含め63%について相同であることが
確立された。
【0071】A.eutrophusおよびZoogl
oeaチオラーゼ遺伝子領域は両方とも、Nocard
iaおよびPseudomonas oleovara
nsDNAを相同な遺伝子についてスクリーニングする
ための、ハイブリダイゼーション用プローブとして用い
た。チオラーゼ、レダクターゼおよび他の合成酵素の遺
伝子を、相同な配列を有する上記以外の他の種から、同
定する手法は当業者に周知である。Z.ramigeraのPHBポリメラーゼ遺伝子の確
Z.ramigera由来のPHBポリメラーゼは、D
(−)−ヒドロキシルブチル−CoAを利用し、これら
を鋳型に依存しないヘッドトゥーテイル縮合反応による
オキソエステル結合で重合し、直鎖状のポリマーを得
る。これらのポリマーは、最大で10,000個のモノ
マーユニットを含み得、1×106以上の分子量となり
得る。このポリマーは迅速に不溶性となり、細胞中で独
立した顆粒として蓄積される。
【0072】広域宿主プラスミドpRK290の誘導体
を基にした接合移入システムは、Dittaらの、Pr
oc.Natl.Acad.Sci.USA77、73
47−7351(1980)に記載され、Z.rami
geraおよびA.eutrophusについてPHB
ポリメラーゼ遺伝子を単離するために、PHB陰性変異
体の単離、特徴付けおよび補完性に関連して、トランス
ポゾン変異誘発および相補性分析が使用し得る。Sch
legelらの、Arch.Microbiol.7
1、283−294(1970)に記載されている様
に、スダンブラック染色がPHB陰性変異体の検出に用
いられる。生育させ、収穫し、そしてPHBを放出させ
るために細胞を溶解することにより、変異体の補完性を
スクリーニングし、次いでこれを精製し、その存在およ
び分子量分布を測定し得る。溶解液中のチオラーゼ、リ
ダクターゼおよびPHBポリメラーゼの活性もまた試験
される。A.eutrophusのPHBポリメラーゼ遺伝子の
確認 これらの技術はまた、A.eutrophus H16
のポリ(β)−ヒドロキシブチレート−陰性変異体の補
完性を用いて、Alcaligenes eutrop
hus H16中にPHBポリメラーゼ遺伝子(phb
C)クローニング、配列決定、および発現させることに
も応用される。PHBの生合成経路の3つの酵素をコー
ドしている遺伝子は、phbC−phbA−phbBと
統合されていることが結果から示された。E.coli
中で3つ全ての遺伝子を発現させたところ、この細菌で
は顕著なレベル(乾燥細胞の50%)のPHB産生があ
った。phbCは、典型的な膜タンパク質とは異なる親
水性の特性の、Mr=63,900のポリペプチドをコ
ードしており、このことは、PHBの生合成には恐らく
膜複合体が含まれないことを示している。
【0073】A.eutrophus H16の誘導体
(11599 S1、表1)のPHB−陰性変異体の構
築、特徴付けおよび相補性のための方針をPHBポリメ
ラーゼをコードする遺伝子(複数の遺伝子の場合も)の
確認および単離に用いた。トランスポゾン変異誘発を用
いたことにより、全ての興味ある株へのTn5挿入のク
ロモソーム中での位置決めにDNAハイブリダイゼーシ
ョン分析の使用が可能となった。窒素を制限した最少寒
天プレートで生育させた時の、不透明なコロニー(op
aque colony)表現型により、32個の潜在
的なPHB陰性変異体が確認された。3つのクラスに属
するだけなのに、Tn5のDNAプローブを用いたDN
Aハイブリダイゼーションで32もの変異体が見つかっ
たのは、これがPHB−欠損株を濃縮するために用いら
れる方法であるため、驚くことではない。次に、各クラ
スからの代表、即ち、PHB #2、PHB #3およ
びPHB #19を分析するためにさらに詳細なDNA
ハイブリダイゼーション実験を行った。これらの実験に
より、PHB #2およびPHB #3株の場合不透明
な表現型を引き起こすTn5挿入はクロモソーム中、図
3および図4に示した様に、phbA−phbB遺伝子
からそれぞれ約1.2kbおよび1.6kb上流に位置
していると結論される。PHB #19株の場合、Tn
5挿入はA.eutrophusクロモソームの他の場
所に位置している。
【0074】phbCの、単離および特徴付けに用いた
実験方法および実験材料は以下の通りである。この実験
方法および実験材料は、phbAおよびphbB遺伝子
の単離に関して記述したものと類似である。
【0075】細菌株およびプラスミドは表1に示してあ
る。培地および培養条件は上述の通りである。
【0076】
【表1】
【0077】DNAの操作方法は上述したのと類似であ
る。制限エンドヌクレアーゼのT4DNAリガーゼおよ
びDNAポリメラーゼ1は、New England
Biolabsから入手し製造者の指示に従い使用し
た。ウシの腸のアルカリフォスファターゼは、Boeh
ringer Mannheim Corporati
onから購入した。常法のDNA操作方法は、プラスミ
ドの精製、E.coliの形質転換、その他を含め全
て、Maniatisらの記載した方法を用いて行っ
た。クロモソームDNAは前述した様に、TBS中で対
数増殖期後期まで生育させたA.eutrophus株
から精製した。アガロースゲルからニトロセルロースフ
ィルターへの制限酵素消化されたDNA試料の転写、プ
リハイブリダイゼーションおよび32P−標識DNAプロ
ーブとのハイブリダイゼーションは前述した通りであ
る。制限酵素分析用の、A.eutrophusのリコ
ンビナント株からのプラスミドの迅速な単離は、アルカ
リ抽出法で行った。A.eutrohus中への接合 A.eutrophus中への、広域宿主プラスミドp
LAFR3あるいはpLAFR3のリコンビナント誘導
体の接合移入は、前述したのと同じ方法を用いて行っ
た。しかしこの場合、受容細胞であるA.eutroh
us細胞は超音波処理せず、そして接合移入体(Tra
nsconjugants)は、0.01%のNH4
lを窒素源、1%(w/v)のフルクトースを炭素源と
して10μg/mlのテトラサイクリンを含んだA.e
utrohus無機質寒天プレート上で選択した。
【0078】Tn5変異誘発用には、11599(15
99 S1)のA.eutrohusストレプトマイシ
ン自然耐性株を用いた。pRK602(Tn5)の移入
は、上述の様にE.coliのMM294A(pRK6
02)を唯一のドナーとして用いて行った。Tn5を含
んだA.eutrophus株は、ストレプトマイシン
(500μg/ml)およびカナマイシン(100μg
/ml)上で生育させることにより選択した。PHB−欠損変異体の増幅および確認 A.eutrophusのPHB−欠損株を確認するた
めの増幅およびスクリーニングの方法は、Schleg
elおよびOedingの、Radiation an
d Radioisotopes for Indus
trial Microorganisms. Int
ernational AtomicEnergy A
gency、Vienna、223−231(197
1)に記載されているものを使用した。約105個のK
anr接合移入体(Tn5挿入変異体)のプールを、
0.01%のNH4Cl、1%のフルクトースおよび1
00μg/mlのカナマイシンを含んだ10mlの無機
質培地に接種し、そして30℃で18時間培養した。こ
の培養物を次に100mlの同じ培地に接種し、30℃
で30時間培養した。PHB−欠損変異株を増幅するた
めに、この培養物から109の細胞を含んだ一部を、密
度平衡遠心分離によりショ糖の段階グラジエントで分画
し、そして0.01%のNH4Cl、1%のフルクトー
スおよび100μg/mlのカナマイシンを含んだ無機
塩寒天プレート上に蒔いた。30℃で4から5日間生育
させた後、不透明な(PHB−欠損)および白(PHB
−含有)のコロニーが容易に区別できた。不透明なおよ
び白の両方のコロニーにより産生されたPHBのレベル
を定量することにより、不透明なコロニーはPHB−欠
損で、白コロニーはPHBを含有することが確認され
た。タンパク質の分析 β−ケトチオラーゼ、NADPH−関与のアセトアセチ
ル−CoAリダクターゼおよびPHB−ポリメラーゼの
アッセイを行うために、100mlのA.eutrop
hus株の培養物を30℃で40時間TBS中で生育さ
せた。Tn5変異体株用には100μg/mlの濃度の
カナマイシンを加え、そしてpLAFR3あるいはその
誘導体を含んだ株用には10μg/mlのテトラサイク
リンを加えた。遠心分離で細胞を回収し、2mlの細胞
溶解バッファー(10mMのTris HCl、pH
8.0;5mMのβ−メルカプトエタノール;5mMの
EDTA、0.02mMのフェニル−メチル−スルフォ
ニル−フルオライド;10%v/vのグリセリン)に再
懸濁し、そして超音波処理で細胞溶解した。細胞溶解液
の一部を遠心分離して細胞残渣デブリスを除去し、β−
ケトチオラーゼおよびアセトアセチル−CoAレダクタ
ーゼのアッセイ用とした。β−ケトチオラーゼ活性は、
DavisらのJ.Biol.Chem.262、82
−89(1987)に記載された様に、NADPHを補
助因子として、アセトアセチル−CoAのアセトアセチ
ル−CoAのチオリシスの速度の測定により決定され
た。PHBポリメラーゼアッセイは粗細胞溶解液を用い
て行い、そして、FukuiらのArch. Micr
obiol、110、149−156(1976)に記
載された様に、D−3H−ヒドロキシブチル−CoA
(約2μCi/μmolの放射比活性)の取り込みレベ
ルを測定した。タンパク質濃度は、Bradfordの
Anal.Biochem.72、248−254(1
976)の方法により、Bioradのアッセイ溶液お
よび標準物としてウシ血清アルブミンを用いて決定され
た。E.coliのmaxi−cell標識実験は、S
ancarらのJ.Bacteriol.137、69
2−693(1979)に記載された様に行った。PBHの精製および定量 異なった株のPHBレベルを調べるために、粗細胞溶解
液の100μlを5%の次亜塩素酸ナトリウム1.2m
lにて37℃にて1時間処理した。不溶のPHBを次
に、10分間微量遠心管で遠心分離し回収し、1mlの
2O、1mlのアセトン、1mlのエタノールで連続
して洗浄し、減圧下で乾燥した。次にPHB濃度は、L
awおよびSlepeckyのJ.Bacterio
l.82、33−36(1961)に記載されている様
に分光光度計で標準曲線を用いて定量し、mg PHB
/mgタンパク質で表した。プラスミドの構築および相補正分析 プラスミドpLA29、pLA40、pLA41および
pLA42は、pAeT29の制限酵素断片を広域宿主
ベクターpLAFR3に挿入するクローニングで構築
し、PHB−陰性のA.eutrophus株を相補性
分析した。pLAFR3はpLAFR1の誘導体で、F
riedmanのGene 18、289−296(1
982)に記載され、EcoRI部位へ挿入されたpU
C8ポリリンカークローニング部位を有する。pAeT
9の異なった断片をpLAFR3ヘクローニングした。
pLA29は、pAeT29からの15kbのEcoR
I部位挿入体全体をpLAFR3のEcoRI部位へつ
なげることで構築した。pLA40、pLA41および
pLA42を構築するため、先ずpUC18へ対応する
断片をクローニングし、プラスミドpAeT40、pA
eT41およびpAeT42を生成した。次にこの断片
をBamHIおよびEcoRIによる消化でpUC18
から切り出し、アガロースゲル電気泳動で精製し、そし
てBamHI/HindIIIで消化したpLAFR3
につなげた。pAeT40を構築するため、pAeT2
9のDNAをNdeIで完全に消化しDNAポリメラー
ゼのクレノウ断片を用いて結合性末端を埋めた。アガロ
ースゲル上で断片を分画した後、目的の7kb断片を電
気溶出で精製し、pUC18のSmaI部位につなげ、
そして次にE.coliのDH5α細胞を形質転換した
後に制限酵素分析によりリコンビナントプラスミドpA
eT40を確認した。NdeI部位の一つがこの酵素の
構造遺伝子の中にあるために、この構築によりアセトア
セチル−CoAリダクターゼ活性は除去される。pAe
T41の構築は、SmaI/EcoRI消化されたpA
eT29のDNAをアガロースゲルで分画し、そして5
kbのSmaI/EcoRI断片を精製し、SmaI/
EcoRI消化したpUC18につなぎ、正しいプラス
ミドを得た。β−ケトチオラーゼおよびアセトアセチル
−CoAレダクターゼの構造遺伝子を有する2.3kb
のPstI断片の欠損は、pAeT41のDNAをPs
tIにより部分消化し、そして再びつなぐことにより行
い、pAeT42を構築した。Tn5挿入物のハイブリダイゼー−ションによるマッピ
ング 105個のA.eutrophus 11599 S1
のTn5挿入変異体のライブラリーを構築し、そして3
2個の潜在的にPHB−陰性のコロニーを、前述の様に
窒素制限最少プレート上での不透明なコロニー表現型で
確認した。これらはさらにSouthern DNAハ
イブリダイゼーション分析により特徴付けられた。DN
Aハイブリダイゼーション実験は、制限酵素消化された
各株からのクロモソームDNAを、それぞれTn5 D
NAプローブ〈プラスミドpRK602)と、でA.e
utrohusのphbA−phbB遺伝子座(図3)
を含んだ2つのプラスミドpAeT10およびpAeT
29とを用いて分析して行った。
【0079】32個の「不透明な」株は、たった三つの
明確な変異体タイプの雑多なコピーを表している。これ
らの三つの明確な変異体タイプは、株PHB #2、P
HB#3およびPHB #19で表される。株PHB
#2およびPHB #3では、トランスポゾンTn5は
それぞれ2.3kbおよび0.6kbのクロモソームの
PstI断片に挿入された。これらのクロモソームのP
stI断片の両方は、pAeT29にクローニングされ
た15kbのA.eutrophusのDNA上に位置
付されたが、phbA−phbB構造遺伝子上にはなか
った。株PHB #19は、PstI断片にTn5を挿
入したが、pAeT29プラスミド上にはなかった。
【0080】さらに詳細なDNAハイブリダイゼーショ
ン実験を、PHB #2およびPHB #3からのクロ
モソームDNAに対して行い、これらの変異体のそれぞ
れでのTn5挿入部位の位置決めをした。これらの株の
それぞれ、および野生株H16およびPHB #19か
らのクロモソームDNAをSalI、SmaIおよびB
glIIで消化し、ニトロセルロースフィルターの両面
へ転写し、そしてTn5 DNA(pRK602)プロ
ーブおよびpAeT29 DNAプローブとハイブリダ
イゼーションさせて、PHB #2およびPHB #3
株中でのTn5挿入の位置をマッピングした。
【0081】野生株H16および、各変異株PHB #
2、PHB #3およびPHB #19の生化学分析の
結果を表2に示した。各株の定常相の培養物を100m
lを回収し、細胞溶解し、そしてPHB含量およびβ−
ケトチオラーゼ、NADP特異的アセトアセチル−Co
AリダクターゼおよびPHBポリメラーゼ活性に関して
アッセイした。これらの生育条件下では、野生株H16
は有意なレベルのPHB(1.3mgPHB/mgタン
パク質、表2)を産生し、三つの酵素活性全てが高いレ
ベルであった。変異株PHB #2およびPHB #3
は、PHBを実質的に産生せず、そしてPHB #19
株は野生株のレベルのたった5%しか産生しなかった
(表2)。PHBポリメラーゼ活性はこれら三つの変異
株全てで検出されなかったが、しかしPHB #19株
の細胞溶解液中にPHBが存在していることは、酵素活
性がアッセイの検出レベルよりも恐らく低いが、酵素が
存在していることを示している。三つの変異体全てのβ
−ケトチオラーゼ活性は、野生株H16の45%(PH
B #2)から38%(PHB #19)のオーダーに
減少していた。同様に、NADP−特異的アセトアセチ
ル−CoAリダクターゼ活性は、野生株の50%付近で
あった。PHB−ポリメラーゼ遺伝子はphbA−ph
bBから上流に位置し、後者の遺伝子の発現はPHB
#2およびPHB #3株の場合上流に挿入されたTn
5に影響されることがこれらのデータから結論される。
【0082】A.eutrohusを挿入したpAeT
29の断片を含んだ一連のプラスミドを、広域宿主ベク
ターpLAFR3中で構築して、PHB−陰性変異体の
相補性分析を行った。
【0083】各リコンビナントプラスミドpLA29、
pLA40、pLA41およびpLA42は、連結によ
り各A.eutrophus株に導入され、そして得ら
れた連結体は、白(PHBプラス)の表現型の復活に関
して窒素制限プレート上で分析された。プラスミドpL
A29、pLA40、pLA41およびpLA42は、
それぞれPHB #2およびPHB #3株のクロモソ
ーム中にTn5が挿入されたphbA−phbBから上
流の領域を含み、これらの二つの株のそれぞれの変異を
相補し、白いコロニーの表現型を復活している。4つの
リコンビナントプラスミド全てはまた、変異株PHB
#19に対して野生株コロニーの表現型を復活した。こ
の株の場合、Tn5挿入体は各プラスミドに含まれてい
るA.eutrophusのクロモソーム領域の外側に
位置した。ベクターpLAFR3を用いた対照実験で
は、三つの変異株のそれぞれに導入すると不透明なコロ
ニー表現型が得られた。
【0084】各相補株の生化学分析は、変異株の特徴付
けに関して記述したように行い、そしてこれらの結果も
また表2に示してある。各変異株にpLA29を導入す
ると、PHBポリメラーゼ活性およびPHB生合成が復
活した(表2)。さらに、約3から5倍のレベルのβ−
ケトチオラーゼおよびNADP−特異的アセトアセチル
−CoAリダクターゼ活性が観察された。プラスミドp
LA40およびpLA41はまた、PHB−ポリメラー
ゼおよびPHB産生をPHB #2(表2)、PHB
#3およびPHB #19に復活させたが、pLA40
の場合には、phbB遺伝子はこのプラスミドの構築中
に破壊された。最後に、プラスミドpLA42は、三つ
の変異株全てにPHBポリメラーゼ活性およびPHB産
生を復活したが、phbA−phbB遺伝子は欠損して
いた。このプラスミドを含んだ株の場合、β−ケトチオ
ラーゼおよびNADP−特異的アセトアセチル−CoA
リダクターゼ活性は、野生株と同じレベルで残っていた
(表2)。
【0085】
【表2】
【0086】上述の様に、プラスミドpAeT29上に
位置するphbA−phbBは、A.eutrophu
sプロモーターの制御下でE.coli中で発現した。
PHB #2およびPHB #3株での、phbC遺伝
子がphbA−phbBから上流に確認されたことと、
チオラーゼおよびリダクターゼ活性の減少の観察とか
ら、これら三つの遺伝子全てはphbCから上流に位置
する単一のプロモーターから発現されていることが示さ
れた。このことから、プラスミドpAeT41およびp
AeT42を含んだE.coli株の培養物を、細胞が
静止期相に達するまで窒素制限条件下で生育させ、その
時点で細胞を回収し、分析した。pUC18を含んだ
E.coliを対照として用いた。β−ケトチオラー
ゼ、アセトアセチル−CoAリダクターゼ、PHBポリ
メラーゼおよび濃度のアッセイの結果は表3に示されて
おり、pAeT41を含んだE.coliの細胞溶解液
は、各酵素活性およびPHB産生が顕著なレベルである
ことを示している。
【0087】上述のE.coli株のMaxi−cel
l分析を、プラスミドpAeT41およびpAeT42
にコードされたポリペプチドの分子量の決定に用いた。
このプラスミドは、pUC8ベクターのlacZプロモ
ーターからのA.eutrophusのphbA−ph
bB遺伝子を発現していたので、プラスミドpAeT1
0もこの分析に含められた。プラスミドpAeT10お
よびpAeT41を含んだ試料中で、付加的なタンパク
質バンドがそれぞれMr 40,000およびMr 2
6,000に存在した。これらのプラスミドの両方は、
β−ケトチオラーゼ(Mr 41,000)およびNA
DP−特異的アセトアセチル−CoAレダクターゼ(M
r 26,000)をコードするphbA−phbB遺
伝子を発現している。これら2つのタンパク質のいづれ
も、phbA−phbB遺伝子を含まないプラスミドp
AeT42を含んだ細胞の抽出液中には存在しなかっ
た。ベクターpUC8を用いた対照実験では、Mr 4
1,000あるいはMr 26,000にはシグナルを
与えなかった。プラスミドpAeT41およびpAeT
42の両者は、E.coli中でPHBポリメラーゼ遺
伝子(phbC)を発現し、そしてこれらのプラスミド
を含んだ細胞の抽出物を含んだ試料中には、Mr58,
000のシグナルが明瞭に現れた。さらに、このタンパ
ク質は、phbC遺伝子を含まないプラスミドpAeT
10を含んだ細胞からの抽出液を含んだ試料中には存在
せず、そしてpUC8を含んだ細胞の対照試料にも存在
しない。Mr 30,000付近の付加的なバンドは、
全ての試料中に存在し、そしてpUC8を含んだ細胞抽
出液の対照実験でもまた見いだされ、それ故これはベク
ターのタンパク質であろうと思われる。これらのデータ
からE.coliで発現されているphbC遺伝子は約
Mr58,000のポリペプチドをコードしていると考
えられる。
【0088】
【表3】
【0089】phbCのヌクレオチド配列分析 プラスミドpAeT42中にクローニングされたA.e
utrophusクロモソームDNAの2kbのSma
I−PstI断片は、phbCおよび恐らく調節配列の
完全な構造遺伝子を含んでいる。この断片は、上述のジ
デオキシ配列決定方法を用いて、DNA鎖の両方から何
回も配列決定された。単一の長いオープンリーディング
フレームは、ヌクレオチド820からヌクレオチド26
08のTGA停止コドンまで延びている。潜在的な翻訳
開始コドンは、位置842(ATG)、1067(AT
G)および1097(ATG)に存在する。これらの潜
在的な開始部位から翻訳すると、それぞれMr 63,
940、Mr 55,513およびMr 54,483
のタンパク質が生成される。位置842のATGからの
翻訳生成物と、位置1067のATGからの翻訳生成物
および以下に記述するP.oleovaransのPH
Aポリメラーゼ遺伝子の生成物との間のアミノ酸配列に
顕著に相同性があることは、恐らく最初のATG(位置
842)が正しいことを示している。図5および配列表
の配列番号8は、SmaI部位から下流に位置するph
bA遺伝子の最初の30のヌクレオチドまでの、この領
域の全部のヌクレオチド配列を表している。位置842
のATGから位置2609のTGAまでの、このオープ
ンリーディングフレームの翻訳生成物もまた示してあ
る。プラスミドpAeT42のphbC遺伝子にコード
されたPHBポリメラーゼは、Mr=63,940の5
89アミノ酸のポリペプチドである(配列番号9)。ph
bA遺伝子産生物のN−末端の10個のアミノ酸もまた
図5に示されている。図5に示されたヌクレオチド配列
の付加的な特徴には、SmaI部位から上流で始まり、
位置76のTGA停止コドンで終わる、オープンリーデ
ィングフレームのC−末端が含まれる。phbCのTG
A停止コドン(位置2609)から85bp下流の位置
にphbA構造遺伝子のATG開始コドン(位置296
9)がある。これらのデータから、A.eutroph
usのPHB生合成経路の三つの酵素は、図5に示した
様にphbC−phbA−phbBとして統合された三
つの遺伝子にコードされていることは明白である。
【0090】E.coli中でphbCのみを発現させ
ると、PHBあるいは顕著なレベルのPHBポリメラー
ゼ活性のいづれも産生されない(プラスミドpAeT4
2)。E.coliはA.eutrophusのphb
A−phbB遺伝子が存在しないと、PHBポリメラー
ゼを基質としてD−(−)−ヒドロキシルブチリル−C
oAを合成できない様である。pAeT42の挿入体は
phbC用のプロモーターおよび構造遺伝子を含んでい
るので(プラスミドpLA42はPHB−陰性変異株の
全て相補する、表2)、E.coli中では使用できる
基質がない場合に、PHBポリメラーゼは活性がないか
分解されると考えられる。
【0091】PHBポリメラーゼをコードする、プラス
ミドpLA42中にA.eutrophusクロモソー
ムDNAを挿入した核酸配列は、Mr 63,940の
単一のポリペプチド(図4)を予測させる。PHBポリ
メラーゼは以前には精製および特徴付されていないが、
E.coliのmaxi−cell実験の結果はこのペ
プチドがMr=58,000であることを示し、遺伝子
配列から予想されるのと良く一致している。
【0092】何年もの間、(D)−β−ヒドロキシブチ
リル−CoAの重合は、膜に結合したポリメラーゼが関
与し、サイトプラズムの水性の環境と疎水性の結晶性P
HB顆粒との間に一種のバリアーを形成する、と提唱さ
れていた。PHBポリメラーゼポリペプチドの親水性の
性質は、典型的な膜貫通構造を示唆しない。さらに、M
ethylobacteriusの天然のPHB顆粒の
NMRによる研究では、高度に結晶性で固体の状態とは
逆で、これらの顆粒は流動性の状態であることが示され
た。これらのデータを合わせると、PHBの生合成には
複雑な膜に結合した重合系を全く必要としないという考
えに保証を与える。文献で提案されたPHBポリメラー
ゼ用の機構には二つの部分的反応が含まれる。最初のア
シル−S−酵素中間体の形成の次に、第二の反応でプラ
イマー受容体への転移が起こる。PHBポリメラーゼの
予測される一次構造には5つのシステイン残基Cys
246、Cys319、Cys382、Cys438およびCys
459がある。P.oleovarans PHAポリメラーゼ遺伝子
の確認 Pseudomonas oleovarans中での
ポリヒドロキシアルカノエート(PHA)ポリエステル
の生合成に関与する遺伝子もまた以下の様に単離され
た。
【0093】1983年にde SmetらはJ.Ba
cteriol. 154、870−878で、Pse
udomonas oleovarans TF4−1
L(ATCC 29347)により産生されるポリマー
であるポリ−β−ヒドロキシオクタノエートを確認し
た。引き続きの研究で、P.oleovaransは、
使用する炭素源に依存して一連のPHAバイオポリマー
を産生し得ることが示された。炭素源は、例えば、n−
アルカンおよび1−アルケン(Lageveenら、A
ppl.Environ.Microbiol. 5
4、2924−2932(1988))、あるいは脂肪
酸(Brandlら、Appl.Environ.Mi
crobiol. 54、1977−1982(198
8)である。この経路は、アルカン/アルケンの脂肪酸
への変換を含む様であり、次にこの脂肪酸がβ−酸化経
路に入り、β−ヒドロキシアセチル−CoAのD異性体
の形成が起こり、PHAポリメラーゼによりポリマー中
に取り込まれる。1)チオラーゼ/リダクターゼ酵素を
有さない、あるいは2)PHAポリメラーゼはβ−ヒド
ロキシルブチレートを基質として使用できないことか
ら、P.oleovaransは、β−ヒドロキシルブ
チレートの取り込みを示していない。P.oleova
ransのPHAポリメラーゼに使用される広い範囲の
基質により、この酵素をコードする遺伝子は、ポリエス
テルのバイオポリマー工学において特別の興味をもたれ
ている。
【0094】Z.ramigeraのβ−ケトチオラー
ゼ遺伝子をDNAハイブリダイゼーションプローブとし
て用い、A.eutrophusのβ−ケトチオラーゼ
およびNADP−特異的アセトアセチル−CoAリダク
ターゼを単離するために用いたアプローチを、上述の通
り行い、P.oleovaransのPHAポリメラー
ゼ遺伝子を単離した。P.oleovaransクロモ
ソームDNAのサザンDNAハイブリダイゼーションに
より、A.eutrophusのPHBポリメラーゼ遺
伝子(phbC)に高い相同性を示す6kbのEcoR
1制限酵素断片が確認された。この6kbのEcoR1
制限酵素断片は、E.coliプラスミドベクターであ
るpUC18中に標準的な方法でクローニングされ、プ
ラスミドpPO23を得た。A.eutrophusの
phbC遺伝子にハイブリダイゼーションする領域は、
図6に示した様に位置づけされた。完全な6kbの断片
のヌクレオチド配列分析により、三つの潜在的なタンパ
ク質コード領域(図6に示されたオープンリーディング
フレームORF1、ORF2およびORF3)が確認さ
れた(配列番号10)。ORF1は、ヌクレオチド554
のATG開始コドンから始まりヌクレオチド2231の
TGA停止コドンで終わる(図7、図8および図9。図
8に示される配列は図7に示される配列の、そして図9
に示される配列は、図8に示される配列の続きの配列を
それぞれ示す)。このオープンリーディングフレーム
は、A.eutrophusのphbC遺伝子とハイブ
リダイゼーションするpPO23挿入領域に含まれてい
る。
【0095】ORF1は、Mr=62,300ダルトン
の559アミノ酸のポリペプチドをコードしている(配
列番号11)。ORF1を翻訳して推定したタンパク質
の配列と、A.eutrophusのPHBポリメラー
ゼとを、プログラムALIGNを用いて比較し、二つの
タンパク質の間に52%の同一性のあることが判明し
た。ORF3は、位置2297のATGから始まり、位
置3146のTAAで終わり、そしてMr=64,40
0ダルトンの577アミノ酸のタンパク質をコードして
いる(配列番号13)。ORF1およびORF3の推定さ
れたポリペプチド産生物は、phbC遺伝子産物と40
%および42%の絶対同一性があった。単離され試験し
得た全てのPHA陰性株はORF1で相補され、この遺
伝子が通常に発現されるPHAポリメラーゼをコードし
ていることが確認された。ORF3はまた、PHAポリ
メラーゼをコードしていると信じられている。しかし、
遺伝子発現試験はORF3が通常は発現されないことを
示している。
【0096】ORF2は、位置2297のATGから始
まり位置3146のTAAで終わり、そしてMr=3
1,400ダルトンの283アミノ酸のタンパク質をコ
ードしている(配列番号12)。この遺伝子は、PHAデ
ポリメラーゼをコードしていると考えられる。PHB、PHAおよび類似ポリマーの合成 以上により、A.eutrophusのPHB生合成遺
伝子をE.coliへ導入することにより、新しいPH
B産生株を構築することか可能で、乾燥細胞重量の50
%までのPHBの蓄積が得られることが確立された。新
しいあるいは改良されたポリエステル産生株の構築が、
多くのシステムで、A.eutrophusからのPH
B生合成遺伝子、あるいはP.oleovaransか
らのPHAポリメラーゼ遺伝子およびORF2およびO
RF3のいづれかにより現在可能となった。A.eut
rophusのβ−ケトチオラーゼおよびP.oleo
varans中のNADP−特異的アセトアセチル−C
oAリダクターゼ遺伝子を、広域宿主発現ベクターpN
M185(Mermodら、J.Bacteriol.
167、447−454(1986)、あるいはpE
RD20/pERD21(Ramosら、FEBS L
ETTERS 226、241−246(1986)の
中で、xylSプロモーターの制御下で発現するプラス
ミドが構築し得る。あるいは、広域宿主tacプロモー
ター発現ベクターpMMB24/pMMB22(Bag
dasarianら、Gene 26、273−282
(1983))による。これらと同じベクターが、A.
eutrophusのPHBポリメラーゼ遺伝子あるい
はプラスミドpPO23にクローニングされた三つの
P.oleovarans遺伝子の発現に使用し得る
(図6)。
【0097】二つのプラスミドpLAP1およびpLA
P2が構築され、これらはP.oleovaransの
PHAポリメラーゼ遺伝子およびORF2(pLAP
1)あるいはPHAポリメラーゼ遺伝子およびORF2
プラスORF3(pLAP2)をA.eutrophu
sのphbCプロモーターの制御下で発現するはずであ
る(図5)。
【0098】これらのプラスミドを構築するため、ph
bCプロモーターを含んだプラスミドpAeT42中の
A.eutrophus挿入体の最初の810ヌクレオ
チドを含んだ、810bpのSmaI−BstB 1制
限酵素断片をE.coliベクターpUC19中の唯一
のSmaI部位につなげ、プラスミドpAeTB1を得
た。Fsp1消化したpPO23のDNAの端から17
0bp上流までエクソヌクレアーゼBal31を用いて
除去し、P.oleovaransのPHAポリメラー
ゼ遺伝子プロモーターを除去し、そして引続きCla1
で消化することによりPHAポリメラーゼ構造遺伝子プ
ラスORF2を回収し、そしてこの断片をSmaI/C
la1消化したpBLSK+ベクター(Stratag
ene、La Jolla、CA 92037)にクロ
ーニングした。pPOB10の挿入は、PHAポリメラ
ーゼ構造遺伝子のATG開始コドン(ヌクレオチド53
5、図7)からすぐ上流の19bpを含むことで、完全
なPHAポリメラーゼ構造遺伝子およびORF2である
ことを確認した。構造遺伝子とORF2は次に、2.6
kbのBamHI−Xho1断片上に回収され得、そし
てBamHI/SalI消化したpAeTB1につな
げ、プラスミドpAeP1を得た。phbCプロモータ
ー−PHAポリメラーゼ構造遺伝子−ORF2構築物を
含んだpAeP1の完全な挿入体を、次に3.4のEc
oR1−HindIII断片に切り取り、そして広域宿
主ベクターpLAFR3のポリリンカー領域にクローニ
ングし、A.eutrophus株中にとりこんだ。p
AeP2を構築するために、pPOB10からの2.6
kbのBamHI−Cla1断片と、ORF3を含んだ
pPO23からの2.5kbのCla1−Xho1断片
とを、BamHI/SalI消化したpAeTB1とつ
なげ、pAeP2を得た。もう一度、phbC−PHA
ポリメラーゼ−ORF2−ORF3構築物を、5.9k
bのEcoR1−HindIII断片として切り取り、
そしてpLARF3のポリリンカー領域ヘクローニング
し、pLAP2を得た。pLAP1は、A.eutro
phus中のPHAポリメラーゼおよびORF2の両方
を発現するはずであり、そしてpLAP2はそれに加え
てORF3を発現するはずである。もしこれらの遺伝子
が発現されないなら、β−ケトチオラーゼおよびNAD
P−特異的アセトアセチル−CoAリダクターゼ遺伝子
用に上述した、広い宿主領域を有する発現ベクターに挿
入し得る。
【0099】PHBポリメラーゼおよびPHAポリメラ
ーゼ遺伝子は、細菌および植物システム中では、PHA
ポリマーの産生の役に立たないことを証明しなければな
らない。しかし、クローニングされ特徴付けられた遺伝
子は、さらに二つのポリメラーゼの融合による構築ある
いは化学的変異誘発により改変し得る。機能的なポリメ
ラーゼ酵素は次に、表現型による外観あるいは増大した
密度によりポリマーの蓄積が検出できる適切な生物体中
で選択できる。これは、酵素の特異性を変える、新規の
ポリメラーゼを創製するための直線的なアプローチであ
る。酵素の発現レベルの変化によるポリマー合成の改変 Z.ramigera、A.eutrophus、N.
salmonicolor、およびP.oleovar
ansで示した様に、一連の生物体からのポリマー遺伝
子および遺伝子産生物の単離および特徴付けの後、遺伝
子産生物の発現を制御する手段が確立し得る。Zoog
loeaのチオラーゼ遺伝子の過剰生産は、Z.ram
igeraの転写開始部位およびプロモーターを定義す
るために使用する実験で示された。過剰産生は酵素を均
一まで精製することを可能にし、そして分析および基質
特異性の比較のための試薬に用い得る量を与える。加え
て、精製された酵素は、in vitroのポリマー合
成用の立体特異的基質の合成に使用し得る。さらに、ポ
リマーの過剰生産に対応する転写調節機構が一連の環境
条件下で解明されたなら、既知のポリマーおよび新規の
ポリマーの酵素的合成用のin vitroシステムが
開発され、新しい物質が提供される。この新しい物質
は、次にこのポリマーの最適の利用がなされる様に、化
学組成、分子量およびレオロジー特性に関して分析され
る。
【0100】E.coli中でのZ.ramigera
チオラーゼの過剰生産システムは、合成されたtacプ
ロモーターを用いて構築され、一連のチオラーゼ発現プ
ラスミドを生成し、E.coli細胞中に導入された最
適の構築体が総可溶性細胞タンパク質の約20−30%
のチオラーゼを与える。この方法は試薬に用い得る量の
チオラーゼを与え、平均150mgの純粋なチオラーゼ
が1Lの培養物から得られる。
【0101】Z.ramigeraおよびA.eutr
ophusの遺伝子調節が起こると予想される本質的に
二つの条件がある;栄養制限条件下で炭素が不足した細
胞に引続いて炭素源を与え、次いで栄養制限条件下で生
育した細胞が大量のPHBを蓄積させ、そして栄養制限
条件を取り去ると、PHBの分解が起こる。
【0102】ポリマーの生合成遺伝子の転写調節は、以
下の様に決定される。種々の条件下で生育した培養物
を、酵素アッセイ(チオラーゼ、リダクターゼおよびシ
ンセターゼ)およびRNA精製の両方ために回収する。
RNA試料をクローニングされた遺伝子をプローブとし
て、一連のノーザンハイブリダイゼーション実験で分析
する。有用なRNAハイブリダイゼーションの方法論に
は、RNAのグリオキシル化(McMasterおよび
CarmichaelのProc.Natl.Aca
d.Sci.USA 74、4835(1977));
ホルムアルデヒド/アガロースゲル電気泳動(Lehr
achらのProc.Natl.Acad.Sci.U
SA 16、4743(1977));ニトロセルロー
スあるいはナイロンフィルターへの移動(Thomas
のProc.Natl.Acad.Sci.USA 7
7、5201(1980));およびニックトランスレ
ーションにより32Pで標識したDNAプローブとのハイ
ブリダイゼーション(RigbyらのJ.Mol.Bi
ol. 113、237(1977))が含まれる。D
NAプローブは、クローンpUCDBK1(Z.ram
igera);およびpAeT3(A.eutroph
us)から調製した。これらの実験の結果の一つとし
て、遺伝子のオペロンの統合およびmRNAの長さの確
定ができた。
【0103】それぞれの生合成酵素のレベルを操作し、
そしてポリマー合成におけるその効果をモニターした。
速度制限酵素(あるいは複数の場合も有り得る)を過剰
産生することで経路の流量を増大させるためには、生合
成経路中の速度制限酵素(あるいは複数の場合も有り得
る)を確認することが必要である;各酵素の過剰生産の
効果は、異なるモノマーユニットの取り込み、即ちブチ
レートで生育させたA.eutrophusにより産生
されたコポリマー中のPHB:PHVの比率に影響す
る;そして一つの種からの遺伝子を他の種の中で発現さ
せ、例えば、Zoogloeaの遺伝子をA.eutr
ophusで、およびその逆に、および他の生物体から
の他の単離および特徴付けられた不均一な遺伝子を、例
えばNocardiaおよびP.oleovarans
をZoogloeaおよびA.eutrophus中で
発現させる。
【0104】複数の宿主生物体中でポリマー生合成遺伝
子を過剰生産させるためには、これらの細菌中で機能す
る広域宿主発現ベクターを使用しなければならない。一
つの例として、遺伝子投与量による酵素の過剰生産を行
った。例えば、プロモーター領域を含んだ完全なpUC
DBK1挿入体は、ベクターpSUP104(A.Po
bler編集のMolecular Genetics
of the Bacteria−Plant In
teraction、(Spring−Verlag、
NY 1983)中にSimonらが記載)ヘクローニ
ングし得、そしてZ.ramigera I−16−M
を形質転換するのに使用し得る。各酵素の過剰生産の度
合は酵素アッセイでモニターされ得る。同様のアプロー
チが、いかなる数の他の遺伝子にも行い得る;例えば、
チオラーゼ;チオラーゼおよびリダクターゼ;リダクタ
ーゼ;リダクターゼおよびシンセターゼ、その他。第二
に、遺伝子は、高効率のプロモーター、即ちtac(G
illらのJ.Bact.167、611−615(1
986)およびtol(MermodらのJ.Bac
t. 167、447−454(1986)の転写調節
下に置き得る。この場合構築物は、対応した遺伝子を欠
損した変異体へ連節される。ポリマーの生合成遺伝子あ
るいは目的の遺伝子の発現は、次に過剰生産のレベルを
酵素アッセイを用いてモニターし定量することで、厳密
に調節し得る。各構築物を試験するので、ポリマー合成
の効果、即ち合成の速度およびレベルをルーチン的にモ
ニターすることができる。得られる基質あるいは酵素の特異性を変えることによる
ポリマー合成の改変 異なった細菌によって産生されたPHBあるいはPHA
の分子量を決定する因子は、種々の細菌により産生され
たポリマーの分子量分布を分析することで解明できる。
多くのPHB−生産微生物が、D(−)−ヒドロキシル
ブチレート以外のモノマーをポリマー鎖に組み込む能力
にはほとんど疑問はない。A.eutrophusによ
り産生されたPHB−PHVコポリマーの場合、プロピ
オネートが先ずプロピオニル−CoAに変換され、次に
これがβ−ケトチオラーゼの基質として働くと提案され
ている。過剰生産システムから得られる高い収量の純粋
な酵素が、三つのPHB−生合成酵素のそれぞれが利用
し得る代わりの基質の範囲を決定するために必要であ
り、そして得られる基質が厳格に制御し得るin vi
troシステム中で、種々のタイプのPHB−様の新ポ
リマーが合成され得る。
【0105】チオラーゼおよびリダクターゼ酵素は、P
HBおよびPHB−様のポリマーの生合成の本質的な部
分であるが、生成される新しいタイプのポリマーを最終
的に決定するのはPHBポリメラーゼである。このこと
は、その多くは細胞中に入らず、そのため発酵工程によ
るPHBへの取り込みを試験できない基質についても、
全部の範囲の基質を試験することが、酵素を用いたin
vitroシステムの開発により、容易となった。
【0106】一つ以上のリダクターゼ酵素の過剰産生お
よび精製により、酵素の反応速度および特異性を比較す
る手段が提供された。Zoogloeaのリダクターゼ
は、NADP−特異的であると報告されているが、A.
eutrophusの酵素は明かにNADあるいはNA
DPのいづれかを使用する。この酵素の立体特異性は、
この酵素をPHBポリメラーゼの研究用のD−基質の合
成用の有用な試薬として得る。アセトアセチル誘導体の
内試験されるものは、CoAのオキソエステルおよびオ
キソパンテテインピヴァロエート(OPP)およびその
メチレン誘導体である。このメチレンアナログのオキソ
エステルではなくケトンがZoogloeaのチオラー
ゼにより分解される。
【0107】種々のより長い鎖のアルキル誘導体が、特
にC5からC8の直鎖の3−オキソチオールエステル、オ
キソエステルおよびメチレンケトン、もまたPHBポリ
メラーゼの基質として有用であり得、B.megate
rium中のC5−C8−β−ヒドロキシアルカノエート
が存在すれば、オレフィン、アルコールおよびエポキシ
ドも基質として有用であり得る。
【0108】Z.ramigeraの粗抽出物中の、L
−ヒドロキシルブチリルCoAではなくD−β−ヒドロ
キシルブチリルCoAはPHBポリメラーゼの基質であ
る。他のD−ヒドロキシルアシルCoA種も代わりの基
質あるいはD−β−ヒドロキシバレリルCoA(HV−
CoA)の様な共基質として利用できると予測されてい
る。[2−3H]HB−CoAおよびβ−[3−14C]
−HV−CoAは、それぞれ酵素的あるいは化学的合成
により簡単に調製でき、そして基質として使用し得、そ
して沈澱したあるいはゲル濾過で分離したポリマー中の
3Hおよび14C含量あるいは比率をモニターし得る。ブ
ロックコポリマー領域、例えば(HB) 500(HV)
1000(HB)500'は、例えば、HB−oxo−CoAお
よびHV−S−CoAモノマーの様な基質の比率および
延長期での脱離基を慎重に制御することで構築し得ると
予測できる。
【0109】分岐したβ−ヒドロキシアシルCoA類を
含んだ付加的な他の基質も試験し得る。この様な化合物
は通常細胞中へ輸送されないので、全細胞中では試験は
行えない。他の基質は、正常な[14C]−PHB形成の
阻害に関して、先ず可溶性の[14C]−HBCoAを不
溶性のポリマーに取り込ませることで、次いで共重合の
共基質として、そして最後にホモポリマー化で、試験さ
れ得る。代わりの基質は、HB−CoA’に対する
m、Vmax、および、キャリブレートされたゲル濾過実
験で決定されるポリマーサイズで試験される。連続してPHBを産生する方法 PHBは、栄養制限条件下、通常は窒素制限条件(例え
ば、0.1%窒素、種に依存する)で生育させると、細
菌中で産生され貯蔵され、酸素、リン酸あるいは他の非
−炭素栄養源を制限してもまたPHB合成および貯蔵は
誘起される。例えば、窒素固定細菌Azotobact
er beijerinckiiは、酸素制限下、グル
コース/アンモニウム塩で生育すると、乾燥細胞重量の
70%までをPHBとして蓄積する。利用可能な酸素を
増大させるとPHB合成が減少し、そして二つの生合成
酵素のレベルの減少を伴う。酵素レベルの減少は遺伝子
レベルで働いている調節機構(あるいは複数の場合も有
り得る)を反映する。Alcaligenes eut
rophusの生育の窒素制限は、乾燥細胞重量の80
%までのPHB収量を与える。同様に、Halobac
teriumおよびPseudomonas sp.も
窒素制限下でPHB産生を増大させる。
【0110】非制限条件下では、通常はPHBを産生す
る生物体中のPHBは、分解酵素により迅速に分解す
る。制限条件下の生育で蓄積されたPHBは非制限条件
下では分解されないので、この分解酵素が不活性な様に
あるいは欠失している様に、これらの生物体を変異する
ことができる。これらの細菌を生育させるために、PH
Bは培地中に排出されても良い。あるいは、PHBを代
謝(生合成および分解)しない必須酵素を生物体へ導入
し、その生物体に制限条件下で大量のPHBを蓄積さ
せ、そして条件が非制限に変化したときに、生物体が培
地中へPHB放出するようにし得る。
【0111】制限および非制限条件をくりかえすこと
で、最大量のPHBを蓄積することができ(ポリマー含
量の関数として増殖する細菌の吸光度に基づき)、細菌
の複製を促進する非制限条件へ変化させることで、蓄積
されたポリマーを培地中へ放出させる。細菌を破壊する
ことなくポリマーを含んだ培地を連続除去することで、
生物体は通常の発酵システムで培養できる。 植物中での発現、および、PHBおよびPHAポリマー
の産生 上述の様に細菌発現システムを用いて、チオラーゼ、リ
ダクターゼ、および/あるいはPHB用のポリメラー
ゼ、あるいはPHAをコードしている遺伝子は、種々の
種の植物中で発現され得、所望するポリマー性の産生物
を産生する。この様なシステムの利点は、石油に基づく
プラスティックヘの依存の減少、および種々の土壌の上
で生育可能な植物用の経済的に有用な作物の創製、等で
即座に明白となる。
【0112】植物の遺伝子工学用の第一に要求されるこ
とは、外来DNAを植物組織へ運搬するシステムであ
る。現時点で最も一般的なベクターは、Agrobac
terium tumefaciensの腫瘍誘起(T
i)プラスミドであり、感染によりDNAを運搬する。
カリフラワーモザイクウイルスあるいはGeminiウ
イルスベクターを基にしたベクターの様な、植物DNA
ウイルスもまたベクターとして使用し得る。植物細胞へ
直接遺伝子を転移する多くの方法があり、プロトプラス
トによる化学的に刺激されたDNAの取り込み、エレク
トロポーレーション、無処理の植物細胞のエレクトロイ
ンジェクション、リポソームを介したプロトプラストの
形質転換、および植物への直接注入によるDNA形質転
換、が含まれる。化学的に刺激した取り込みは、プロト
プラストをドナーおよびキャリアーDNAを13%(w
/v)のポリエチレングリコールの存在下で40mMの
CaCl2中でインキュベートすることが必要である。
ポスト−インキュベーションを行い、CaCl2濃度を
徐々に上昇させると共にPEG濃度を徐々に低くする。
エレクトロポーレーションは、高い電圧の電気パルスを
用い、細胞膜を可逆的に透過性とし、DNAを含む大き
な分子の取り込みを容易にする。電気注入および直接注
入は、最初にプロトプラストの形成を行う必要がないと
いう利点を有する。これらの方法は、当業者には既知で
ある。例えば、C.P.Lichtensteinおよ
びS.L.Fullerによる総説、”Vectors
forthe genetic engineeri
ng of plants”、Genetic Eng
ineering、 P.W.J.Rigby編集vo
l.6、104−171(Academic Pres
s Ltd. 1987)を参照。
【0113】遺伝子は、サイトプラズム、ミトコンドリ
ア、あるいはクロロプラストヘ、直接あるいはターゲッ
ティング用配列のいづれかを用いて、導入し得る。ベク
ターおよびターゲッティング用配列および植物用のプロ
モーターは、当業者に既知であり、そしてPharma
cia−LKB Biotechnology、800
Centennial Ave.、Piscataw
ay、NJ 08854−9932およびStrage
ne、La Jolla、CAから市販されている。
【0114】有用な炭素基質を産生する全てのタイプの
植物は、ポリマー産生のために改良し得る。植物中での
ポリマーの産生に関して用いる場合、用語「ポリマー」
は、PHB、PHA、および開示したポリメラーゼを使
用して脂肪酸から合成される炭素を基にした新規のポリ
マーを含む。もしも植物が適切な脂肪酸を形成しない場
合、チオラーゼおよびリダクターゼ遺伝子を一つあるい
はそれ以上のポリメラーゼと共に植物に導入し得る。
A.eutrophusのポリメラーゼは、C4および
C5基質を重合する。P.oleovaransのポリ
メラーゼは、C6からC18の脂肪酸の様に、より長い
基質に働き、短い鎖の脂肪酸には働かない。好ましくは
変異誘発により、グリセリンエステルおよび脂肪酸分解
経路をブロックして植物が適切な基質を形成する様に改
変し得る。
【0115】遺伝子は、全てのタイプの植物へ導入し得
る。広く生育され、これらの遺伝的システムは良く特徴
付けられているために、トウモロコシ、小麦および米の
様な、穀物植物が好ましい。他の有用な農耕用の植物に
は、タバコおよび高脂肪種子植物、特に荒れ他あるいは
無機塩を含んだ土壌で生育するこれらの変種が含まれ
る。
【0116】これらの遺伝子は、また、植物細胞培養シ
ステムヘも導入でき、これらの多くは当業者に既知であ
る。種々の穀物および他の農耕用の作物の培養は、D.
A.Evans、W.R.SharpおよびP.V.A
mmirato編集のHandbook of Pla
nt Cell Culture vol.4(Mac
millan Publishing Co.NY 1
986)に詳細に記載されている。多くの遺伝子研究が
行われた植物システムの特別な例は、Arabidop
sis thalianaである。細菌中での産生に関
して記述したように、細胞培養中でのポリマー産生は、
クローニングされた遺伝子の導入のみならず、基質およ
び条件の変化により操作できる。
【0117】本発明の、炭素−炭素骨格を有するポリヒ
ドロキシブチレートおよびポリヒドロキシブチレート−
様のポリマーを、上述の詳細な記述に従ったリコンビナ
ント技術を用いて作る方法、および得られるポリマー、
の改変および変更は当業者には明白である。この様な変
更および改変は添付した請求項の範囲内にあるものと見
なされる。
【図面の簡単な説明】
【図1】Zoogloea ramigera由来のチ
オラーゼの遺伝子配列を示す図である。転写開始部位
(太い矢印)の上流(−100から−95、および−1
22から−116)で、E.co1i”−10”およ
び”−35”コンセンサス領域と相同な位置にある配列
を下線で示す。リポソーム結合部位と考えられる部位を
下線で示す(−11から−8)。
【図2】クローンpUCDBK1のチオラーゼ遺伝子の
下流にある、アセトアセチルCoAレダクターゼをコー
ドするZ.ramigera DNAの2.3kbの完
全なヌクレオチド配列を示す図である。初めのSalI
部位から次のSmaI部位まで伸びる2094bpの配
列が示されている。ヌクレオチド37のATGからヌク
レオチド760のTGA終止コドンまで伸びるアセトア
セチルCoAレダクターゼ構造遺伝子の翻訳産物も示
す。四角で囲んだアミノ酸残基2位から6位は、精製タ
ンパク質のエドマン分解で得られる配列と同一である。
可能なリボソーム結合部位を下線で示し、可能なターミ
ネーターは矢印で示す。SalIおよびSmaIの制限
酵素部位が示されている。
【図3】プラスミドpAeT3にクローニングされた
A.eutrophusDNAの、相当する2kb断片
のヌクレオチド配列の一部を示す図である。図4と合わ
せてこの2kb断片の全体を示し、ヌクレオチド40〜
1219および1296〜2034に伸びるA.eut
rophusチオラーゼとアセトアセチルCoAリダク
ターゼ遺伝子との転写産物を示す。図4と合わせて過剰
産生ベクターpATおよびpARの構築に用いた制限エ
ンドヌクレアーゼ開裂部位もまた示される。Pst1=
Pst1;Ava=2およびDde=Dde1。
【図4】プラスミドpAeT3にクローニングされた
A.eutrophusDNAの、相当する2kb断片
のヌクレオチド配列の一部を示す図である。図3に示す
配列の続きの配列を示す図である。
【図5】Alcaligenes eutrophus
H16のPHBポリメラーゼ(phbC)遺伝子座の
ヌクレオチド配列を示す図である。オープンリーディン
グフレーム842位から2608位の転写産物で、推定
するPHBポリメラーゼのアミノ酸配列を示す。phb
A遺伝子の最初の72個のヌクレオチドの転写産物も示
す。ヘアピン構造を形成可能な配列(2660位)を矢
印で示す。
【図6】P.oleovarans PHAポリメラー
ゼ遺伝子の可能なコーディング領域、オープンリーディ
ングフレームORF1、ORF2、およびORF3を示
す図である。ORF1は開始コドンATGのヌクレオチ
ド554に始まって終止コドンTGAのヌクレオチド2
231に終わり、アミノ酸559個からなるMr=6
2,300ダルトンのポリペプチドをコードする。OR
F2は開始コドンATGのヌクレオチド2297に始ま
ってTAAのヌクレオチド3146に終わり、アミノ酸
283個からなるMr=31,400ダルトンのタンパ
ク質をコードする。ORF3はATGのヌクレオチド3
217に始まってTGAのヌクレオチド4948に終わ
り、アミノ酸557個からなるMr=64,400ダル
トンのタンパク質をコードする。
【図7】P.oleovarans phbC遺伝子を
含有する6kb断片の完全なヌクレオチド配列分析の一
部を示す図である。図8および図9と合わせてこの6k
b断片の全部の配列を示す。
【図8】P.oleovarans phbC遺伝子を
含有する6kb断片の完全なヌクレオチド配列分析の一
部を示す図である。図7に示す配列の続きの配列を示す
図である。
【図9】P.oleovarans phbC遺伝子を
含有する6kb断片の完全なヌクレオチド配列分析の一
部を示す図である。図8に示す配列の続きの配列を示す
図である。
【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> Massachusetts Institute of Technology <120> Method for Producing Novel Polyester Biopolymers <130> F1-98938I73 <140> <141> <160> 11 <170> PatentIn Ver. 2.0 <210> 1 <211> 1524 <212> DNA <213> Zoogloea ramigera <220> <221> CDS <222> (291)..(1463) <400> 1 gaattcctca tccccgtgtt cctcttttct tttttgagcc ttgcgagtat ccgcaaaaag 60 acgcttcctg acaatcgaat tgtgcgatgc ggcgagggat gctgcgcaac atggattttc 120 atgctgcgcg gccccccgca tgaaatttta gcgccgcggg atatcccgtt tgactctcct 180 tctccgcttt gccagttttg atttcgggag aaccgccggg ctcgcgccgt tcgtgcgccg 240 gacccggttc caaggccggc cgcaaggctg ccagaactga ggaagcacat atg agc 296 Met Ser 1 acc ccg tcc atc gtc atc gcc agc gcc cgc acc gcg gtc ggt tcc ttc 344 Thr Pro Ser Ile Val Ile Ala Ser Ala Arg Thr Ala Val Gly Ser Phe 5 10 15 aac ggc gct ttc gcc aac acg ccc gcc cat gaa ctc ggg gcg acc gtg 392 Asn Gly Ala Phe Ala Asn Thr Pro Ala His Glu Leu Gly Ala Thr Val 20 25 30 att tcg gcg gtt ctc gag cgc gcg ggc gtt gcg gcg ggc gag gtg aac 440 Ile Ser Ala Val Leu Glu Arg Ala Gly Val Ala Ala Gly Glu Val Asn 35 40 45 50 gag gtg att ctc ggc cag gtg ctg ccg gcc ggc gaa ggc cag aac ccg 488 Glu Val Ile Leu Gly Gln Val Leu Pro Ala Gly Glu Gly Gln Asn Pro 55 60 65 gcc cgc cag gcc gcc atg aag gcc ggc gtg ccg cag gag gcg acc gcc 536 Ala Arg Gln Ala Ala Met Lys Ala Gly Val Pro Gln Glu Ala Thr Ala 70 75 80 tgg ggc atg aac cag ctt tgc ggc tcg ggc ctg cgc gcc gtc gcg ctc 584 Trp Gly Met Asn Gln Leu Cys Gly Ser Gly Leu Arg Ala Val Ala Leu 85 90 95 ggc atg cag cag atc gcc acg ggc gat gcg agc atc atc gtc gcc ggc 632 Gly Met Gln Gln Ile Ala Thr Gly Asp Ala Ser Ile Ile Val Ala Gly 100 105 110 ggc atg gaa tcc atg tcc atg gcc ccg cat tgc gcg cat ctg gcc ggc 680 Gly Met Glu Ser Met Ser Met Ala Pro His Cys Ala His Leu Ala Gly 115 120 125 130 gtg aag atg ggc gat ttc aag atg atc gac acg atg atc aag gac ggc 728 Val Lys Met Gly Asp Phe Lys Met Ile Asp Thr Met Ile Lys Asp Gly 135 140 145 ctg acc gac gcc ttc tac ggc tac cac atg ggc acg acc gcc gag aat 776 Leu Thr Asp Ala Phe Tyr Gly Tyr His Met Gly Thr Thr Ala Glu Asn 150 155 160 gtc gcc aag cag tgg cag ctt tcc cgc gac gag cag gac gcc ttc gcc 824 Val Ala Lys Gln Trp Gln Leu Ser Arg Asp Glu Gln Asp Ala Phe Ala 165 170 175 gtc gcc tcg cag aac aag gcc gag gcc gcc cag aag gac ggc cgc ttc 872 Val Ala Ser Gln Asn Lys Ala Glu Ala Ala Gln Lys Asp Gly Arg Phe 180 185 190 aag gac gag atc gtt ccc ttc atc gtc aag ggc cgc aag ggc gac atc 920 Lys Asp Glu Ile Val Pro Phe Ile Val Lys Gly Arg Lys Gly Asp Ile 195 200 205 210 acg gtc gat gcc gac gaa tat atc cgc cac ggc gcg acg ctc gat tcc 968 Thr Val Asp Ala Asp Glu Tyr Ile Arg His Gly Ala Thr Leu Asp Ser 215 220 225 atg gcg aag ctc cgc ccg gcc ttc gac aag gaa ggc acg gtg acg gcc 1016 Met Ala Lys Leu Arg Pro Ala Phe Asp Lys Glu Gly Thr Val Thr Ala 230 235 240 ggc aac gcc tcc ggc ctc aat gac ggc gcg gcc gcg gcc ctc ctg atg 1064 Gly Asn Ala Ser Gly Leu Asn Asp Gly Ala Ala Ala Ala Leu Leu Met 245 250 255 agc gaa gcg gaa gcc tcg cgc cgc ggc atc cag ccg ctc ggc cgc atc 1112 Ser Glu Ala Glu Ala Ser Arg Arg Gly Ile Gln Pro Leu Gly Arg Ile 260 265 270 gtt tcc tgg gcg acg gtc ggc gtc gat ccc aag gtc atg ggc acc ggc 1160 Val Ser Trp Ala Thr Val Gly Val Asp Pro Lys Val Met Gly Thr Gly 275 280 285 290 ccg atc ccg gcc tcc cgc aag gcg ctc gag cgc gcc ggc tgg aag atc 1208 Pro Ile Pro Ala Ser Arg Lys Ala Leu Glu Arg Ala Gly Trp Lys Ile 295 300 305 ggc gat ctc gac ctc gtg gaa gcc aac gaa gcc ttc gcg gcg cag gcc 1256 Gly Asp Leu Asp Leu Val Glu Ala Asn Glu Ala Phe Ala Ala Gln Ala 310 315 320 tgc gcg gtc aac aag gac ctc ggc tgg gat ccg tcc atc gtc aac gtc 1304 Cys Ala Val Asn Lys Asp Leu Gly Trp Asp Pro Ser Ile Val Asn Val 325 330 335 aac ggc ggt gcc atc gcc atc ggc cac ccg atc ggc gcg tcc ggc gcc 1352 Asn Gly Gly Ala Ile Ala Ile Gly His Pro Ile Gly Ala Ser Gly Ala 340 345 350 cgc atc ctc aac acg ctc ctc ttc gag atg aag cgt cgc ggc gcc cgc 1400 Arg Ile Leu Asn Thr Leu Leu Phe Glu Met Lys Arg Arg Gly Ala Arg 355 360 365 370 aag ggt ctc gcc acg ctc tgc atc ggc ggc ggc atg ggc gtg gcg atg 1448 Lys Gly Leu Ala Thr Leu Cys Ile Gly Gly Gly Met Gly Val Ala Met 375 380 385 tgc atc gag agc ctt taggcgtcag cttatccaaa actttgccat gacctgccgc 1503 Cys Ile Glu Ser Leu 390 cggcgagggc gacaggtcga c 1524 <210> 2 <211> 391 <212> PRT <213> Zoogloea ramigera <400> 2 Met Ser Thr Pro Ser Ile Val Ile Ala Ser Ala Arg Thr Ala Val Gly 1 5 10 15 Ser Phe Asn Gly Ala Phe Ala Asn Thr Pro Ala His Glu Leu Gly Ala 20 25 30 Thr Val Ile Ser Ala Val Leu Glu Arg Ala Gly Val Ala Ala Gly Glu 35 40 45 Val Asn Glu Val Ile Leu Gly Gln Val Leu Pro Ala Gly Glu Gly Gln 50 55 60 Asn Pro Ala Arg Gln Ala Ala Met Lys Ala Gly Val Pro Gln Glu Ala 65 70 75 80 Thr Ala Trp Gly Met Asn Gln Leu Cys Gly Ser Gly Leu Arg Ala Val 85 90 95 Ala Leu Gly Met Gln Gln Ile Ala Thr Gly Asp Ala Ser Ile Ile Val 100 105 110 Ala Gly Gly Met Glu Ser Met Ser Met Ala Pro His Cys Ala His Leu 115 120 125 Ala Gly Val Lys Met Gly Asp Phe Lys Met Ile Asp Thr Met Ile Lys 130 135 140 Asp Gly Leu Thr Asp Ala Phe Tyr Gly Tyr His Met Gly Thr Thr Ala 145 150 155 160 Glu Asn Val Ala Lys Gln Trp Gln Leu Ser Arg Asp Glu Gln Asp Ala 165 170 175 Phe Ala Val Ala Ser Gln Asn Lys Ala Glu Ala Ala Gln Lys Asp Gly 180 185 190 Arg Phe Lys Asp Glu Ile Val Pro Phe Ile Val Lys Gly Arg Lys Gly 195 200 205 Asp Ile Thr Val Asp Ala Asp Glu Tyr Ile Arg His Gly Ala Thr Leu 210 215 220 Asp Ser Met Ala Lys Leu Arg Pro Ala Phe Asp Lys Glu Gly Thr Val 225 230 235 240 Thr Ala Gly Asn Ala Ser Gly Leu Asn Asp Gly Ala Ala Ala Ala Leu 245 250 255 Leu Met Ser Glu Ala Glu Ala Ser Arg Arg Gly Ile Gln Pro Leu Gly 260 265 270 Arg Ile Val Ser Trp Ala Thr Val Gly Val Asp Pro Lys Val Met Gly 275 280 285 Thr Gly Pro Ile Pro Ala Ser Arg Lys Ala Leu Glu Arg Ala Gly Trp 290 295 300 Lys Ile Gly Asp Leu Asp Leu Val Glu Ala Asn Glu Ala Phe Ala Ala 305 310 315 320 Gln Ala Cys Ala Val Asn Lys Asp Leu Gly Trp Asp Pro Ser Ile Val 325 330 335 Asn Val Asn Gly Gly Ala Ile Ala Ile Gly His Pro Ile Gly Ala Ser 340 345 350 Gly Ala Arg Ile Leu Asn Thr Leu Leu Phe Glu Met Lys Arg Arg Gly 355 360 365 Ala Arg Lys Gly Leu Ala Thr Leu Cys Ile Gly Gly Gly Met Gly Val 370 375 380 Ala Met Cys Ile Glu Ser Leu 385 390 <210> 3 <211> 2094 <212> DNA <213> Zoogloea ramigera <220> <221> CDS <222> (37)..(759) <400> 3 gtcgactcaa aaaatcagtc taggggagtg agcgac atg agc agg gta gca ttg 54 Met Ser Arg Val Ala Leu 1 5 gta acg ggg gga tcg cgg ggc atc ggc gca gcc att tcg att gcg ctg 102 Val Thr Gly Gly Ser Arg Gly Ile Gly Ala Ala Ile Ser Ile Ala Leu 10 15 20 aag gcg gcg gga tac aag gtg gct gcc agc tat gcc ggc aat gac gat 150 Lys Ala Ala Gly Tyr Lys Val Ala Ala Ser Tyr Ala Gly Asn Asp Asp 25 30 35 gcg gcc aag ccc ttc aag gcg gaa acg ggc atc gcc gtc tac aag tgg 198 Ala Ala Lys Pro Phe Lys Ala Glu Thr Gly Ile Ala Val Tyr Lys Trp 40 45 50 gac gtg tcg agc tac gag gcc tgc gtc gag ggg atc gcc aag gtg gag 246 Asp Val Ser Ser Tyr Glu Ala Cys Val Glu Gly Ile Ala Lys Val Glu 55 60 65 70 gcc gat ctc ggc ccg att gac gtt ctc gtc aac aat gcg ggc atc acc 294 Ala Asp Leu Gly Pro Ile Asp Val Leu Val Asn Asn Ala Gly Ile Thr 75 80 85 aag gac gcg atg ttc cac aag atg acg ccc gac cag tgg aat gcg gtc 342 Lys Asp Ala Met Phe His Lys Met Thr Pro Asp Gln Trp Asn Ala Val 90 95 100 atc aac acc aac ctc acg ggt ctc ttc aac atg acc cat ccg gtc tgg 390 Ile Asn Thr Asn Leu Thr Gly Leu Phe Asn Met Thr His Pro Val Trp 105 110 115 tcc ggc atg cgc gac cgc agc ttc ggc cgc atc gtc aac atc tcc tcg 438 Ser Gly Met Arg Asp Arg Ser Phe Gly Arg Ile Val Asn Ile Ser Ser 120 125 130 atc aac ggc cag aag ggc cag atg ggt cag gcg aac tat tcc gcc gcc 486 Ile Asn Gly Gln Lys Gly Gln Met Gly Gln Ala Asn Tyr Ser Ala Ala 135 140 145 150 aag gcc ggc gac ctc ggc ttc acc aag gcg ctg gcg cag gaa ggc gcg 534 Lys Ala Gly Asp Leu Gly Phe Thr Lys Ala Leu Ala Gln Glu Gly Ala 155 160 165 gcc aag ggc atc acg gtc aac gcc atc tgc ccc ggc tat atc ggt acg 582 Ala Lys Gly Ile Thr Val Asn Ala Ile Cys Pro Gly Tyr Ile Gly Thr 170 175 180 gaa atg gtg cgc gcc att ccg gaa aag gtg ctg aac gag cgg atc atc 630 Glu Met Val Arg Ala Ile Pro Glu Lys Val Leu Asn Glu Arg Ile Ile 185 190 195 ccg cag atc ccg gtc ggc cgc ctc ggc gag ccg gac gag atc gcc cgc 678 Pro Gln Ile Pro Val Gly Arg Leu Gly Glu Pro Asp Glu Ile Ala Arg 200 205 210 atc gtc gtc ttc ctc gcc tcg gac gag gcc ggc ttc atc acc ggc tcg 726 Ile Val Val Phe Leu Ala Ser Asp Glu Ala Gly Phe Ile Thr Gly Ser 215 220 225 230 acc atc tcg gcg aac ggc ggc cag ttc ttc gtc tgataccggc cacacgaaac 779 Thr Ile Ser Ala Asn Gly Gly Gln Phe Phe Val 235 240 ggaacgcggc gccttcgggc gccgttttca tgtggtatgc tggtcgaaag gagagccccg 839 atgaaacagg aaaagctgga tgaggcggcg attgccgagg cgctggcatc cctcgaagga 899 tggattcgct cggctgacgg catcgccatc gagaagcgct acacgttcaa gagcttccgc 959 gaggcgttcg gcttcatgac cgagggcgcg ctggcggcgg agaaattcaa ccaccatccc 1019 gaatggttca acgtctacaa tcgcgtcgac gtgcggctga ccaaccacga tgcgggcggg 1079 ctgaccgagc tggacttcaa gctggcggcg gcgatggaga aggcggcggc ctttcgcacg 1139 aagagttgaa gcggcgtgaa cgcattccca tatgatcagc gccggactgt tccggcgctg 1199 ccacccgagg gaggccttga atggacgatg tgaagatcgg cgagattctg ctgcccggcg 1259 acaaggacga gcaggagcgt caggaaagcc gcgtgaggcg gcggttctgg ccggctctca 1319 agcgcgcgat gcggcaggtt cccttcgccc gcgatctcgt cgcgtcctac tattgcgcgc 1379 tcgatcccca cacgccggcc cgggcgcgcg gcatcctgct ggcggcgctc gcctattttg 1439 tgctgccgct cgacggcata ccggatttct tcgcgctcgt cggctttttc gacgacgttg 1499 ccgtgctgac ggccgccttc gcggcgatcc gcggccatgt tcgcgacgac cattacgcgg 1559 ccgccgaccg ggcgcttgcg gacgagccgg acatgcaacc cttcggttga gccggccggc 1619 ccgcaatcgg gtcaaattct tgccctattc cttgtgccat taggcatctc gacgggttca 1679 tctcaccaaa tggggactgg gcacgcccgc ttttcacgaa aaggctgcgg cggacttcga 1739 cacggtttcg tcccggtgcg gcgcggaaga cctcggcaaa atgcgtgcgt gttgacggtt 1799 tggtaacctg aattaagtca aaataaatca aatcgtcatc aagcatggcc gacaccggcg 1859 tgaaaggcat ccgccttcgg ccggcaatca ctggcaagac aaccggcagg aaaacatgtt 1919 cgtaagaaag ctcgcaaccg cactcgccct cgtccttgcg accgcaggcg ttgcctcggc 1979 gcaaacgccg acgcgcattc agcagttcaa tgcctggggc gcctattcct atcaggcgaa 2039 tggcggcaag gtctgctacg tgctgtccgt gccgaaggaa aagacgccgc ccggg 2094 <210> 4 <211> 241 <212> PRT <213> Zoogloea ramigera <400> 4 Met Ser Arg Val Ala Leu Val Thr Gly Gly Ser Arg Gly Ile Gly Ala 1 5 10 15 Ala Ile Ser Ile Ala Leu Lys Ala Ala Gly Tyr Lys Val Ala Ala Ser 20 25 30 Tyr Ala Gly Asn Asp Asp Ala Ala Lys Pro Phe Lys Ala Glu Thr Gly 35 40 45 Ile Ala Val Tyr Lys Trp Asp Val Ser Ser Tyr Glu Ala Cys Val Glu 50 55 60 Gly Ile Ala Lys Val Glu Ala Asp Leu Gly Pro Ile Asp Val Leu Val 65 70 75 80 Asn Asn Ala Gly Ile Thr Lys Asp Ala Met Phe His Lys Met Thr Pro 85 90 95 Asp Gln Trp Asn Ala Val Ile Asn Thr Asn Leu Thr Gly Leu Phe Asn 100 105 110 Met Thr His Pro Val Trp Ser Gly Met Arg Asp Arg Ser Phe Gly Arg 115 120 125 Ile Val Asn Ile Ser Ser Ile Asn Gly Gln Lys Gly Gln Met Gly Gln 130 135 140 Ala Asn Tyr Ser Ala Ala Lys Ala Gly Asp Leu Gly Phe Thr Lys Ala 145 150 155 160 Leu Ala Gln Glu Gly Ala Ala Lys Gly Ile Thr Val Asn Ala Ile Cys 165 170 175 Pro Gly Tyr Ile Gly Thr Glu Met Val Arg Ala Ile Pro Glu Lys Val 180 185 190 Leu Asn Glu Arg Ile Ile Pro Gln Ile Pro Val Gly Arg Leu Gly Glu 195 200 205 Pro Asp Glu Ile Ala Arg Ile Val Val Phe Leu Ala Ser Asp Glu Ala 210 215 220 Gly Phe Ile Thr Gly Ser Thr Ile Ser Ala Asn Gly Gly Gln Phe Phe 225 230 235 240 Val <210> 5 <211> 2328 <212> DNA <213> Unknown <220> <221> CDS <222> (40)..(1218) <220> <221> CDS <222> (1296)..(2033) <220> <223> Description of Unknown Organism:aAlcaligenes eutrophus <400> 5 ctgcaggttc cctcccgttt ccattgaaag gactacaca atg act gac gtt gtc 54 Met Thr Asp Val Val 1 5 atc gta tcc gcc gcc cgc acc gcg gtc ggc aag ttt ggc ggc tcg ctg 102 Ile Val Ser Ala Ala Arg Thr Ala Val Gly Lys Phe Gly Gly Ser Leu 10 15 20 gcc aag atc ccg gca ccg gaa ctg ggt gcc gtg gtc atc aag gcc gcg 150 Ala Lys Ile Pro Ala Pro Glu Leu Gly Ala Val Val Ile Lys Ala Ala 25 30 35 ctg gag cgc gcc ggc gtc aag ccg gag cag gtg agc gaa gtc atc atg 198 Leu Glu Arg Ala Gly Val Lys Pro Glu Gln Val Ser Glu Val Ile Met 40 45 50 ggc cag gtg ctg acc gcc ggt tcg ggc cag aac ccc gca cgc cag gcc 246 Gly Gln Val Leu Thr Ala Gly Ser Gly Gln Asn Pro Ala Arg Gln Ala 55 60 65 gcg atc aag gcc ggc ctg ccg gcg atg gtg ccg gcc atg acc atc aac 294 Ala Ile Lys Ala Gly Leu Pro Ala Met Val Pro Ala Met Thr Ile Asn 70 75 80 85 aag gtg tgc ggc tcg ggc ctg aag gcc gtg atg ctg gcc gcc aac gcg 342 Lys Val Cys Gly Ser Gly Leu Lys Ala Val Met Leu Ala Ala Asn Ala 90 95 100 atc atg gcg ggc gac gcc gag atc gtg gtg gcc ggc ggc cag gaa aac 390 Ile Met Ala Gly Asp Ala Glu Ile Val Val Ala Gly Gly Gln Glu Asn 105 110 115 atg agc gcc gcc ccg cac gtg ctg ccg ggc tcg cgc gat ggt ttc cgc 438 Met Ser Ala Ala Pro His Val Leu Pro Gly Ser Arg Asp Gly Phe Arg 120 125 130 atg ggc gat gcc aag ctg gtc gac acc atg atc gtc gac ggc ctg tgg 486 Met Gly Asp Ala Lys Leu Val Asp Thr Met Ile Val Asp Gly Leu Trp 135 140 145 gac gtg tac aac cag tac cac atg ggc atc acc gcc gag aac gtg gcc 534 Asp Val Tyr Asn Gln Tyr His Met Gly Ile Thr Ala Glu Asn Val Ala 150 155 160 165 aag gaa tac ggc atc aca cgc gag gcg cag gat gag ttc gcc gtc ggc 582 Lys Glu Tyr Gly Ile Thr Arg Glu Ala Gln Asp Glu Phe Ala Val Gly 170 175 180 tcg cag aac aag gcc gaa gcc gcg cag aag gcc ggc aag ttt gac gaa 630 Ser Gln Asn Lys Ala Glu Ala Ala Gln Lys Ala Gly Lys Phe Asp Glu 185 190 195 gag atc gtc ccg gtg ctg atc ccg cag cgc aag ggc gac ccg gtg gcc 678 Glu Ile Val Pro Val Leu Ile Pro Gln Arg Lys Gly Asp Pro Val Ala 200 205 210 ttc aag acc gac gag ttc gtg cgc cag ggc gcc acg ctg gac agc atg 726 Phe Lys Thr Asp Glu Phe Val Arg Gln Gly Ala Thr Leu Asp Ser Met 215 220 225 tcc ggc ctc aag ccc gcc ttc gac aag gcc ggc acg gtg acc gcg gcc 774 Ser Gly Leu Lys Pro Ala Phe Asp Lys Ala Gly Thr Val Thr Ala Ala 230 235 240 245 aac gcc tcg ggc ctg aac gac ggc gcc gcc gcg gtg gtg gtg atg tcg 822 Asn Ala Ser Gly Leu Asn Asp Gly Ala Ala Ala Val Val Val Met Ser 250 255 260 gcg gcc aag gcc aag gaa ctg ggc ctg acc ccg ctg gcc acg atc aag 870 Ala Ala Lys Ala Lys Glu Leu Gly Leu Thr Pro Leu Ala Thr Ile Lys 265 270 275 agc tat gcc aac gcc ggt gtc gat ccc aag gtg 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tgcggtcttc 6297 ttcgcctgtt tctcggcctt ctcgccatcc tttaccagcg agtcgaacag cttcgggccg 6357 tcctggtcga tcttcgaata gataccaagc cccgccagcc agatcttgcg ggagtacttc 6417 tcgatcccgc cgacccagga gctgccttct ttctcggaat tc 6459 <210> 11 <211> 559 <212> PRT <213> Unknown <400> 11 Met Ser Asn Lys Asn Asn Asp Glu Leu Gln Arg Gln Ala Ser Glu Asn 1 5 10 15 Thr Leu Gly Leu Asn Pro Val Ile Gly Ile Arg Arg Lys Asp Leu Leu 20 25 30 Ser Ser Ala Arg Thr Val Leu Arg Gln Ala Val Arg Gln Pro Leu His 35 40 45 Ser Ala Lys His Val Ala His Phe Gly Leu Glu Leu Lys Asn Val Leu 50 55 60 Leu Gly Lys Ser Ser Leu Ala Pro Glu Ser Asp Asp Arg Arg Phe Asn 65 70 75 80 Asp Pro Ala Trp Ser Asn Asn Pro Leu Tyr Arg Arg Tyr Leu Gln Thr 85 90 95 Tyr Leu Ala Trp Arg Lys Glu Leu Gln Asp Trp Ile Gly Asn Ser Asp 100 105 110 Leu Ser Pro Gln Asp Ile Ser Arg Gly Gln Phe Val Ile Asn Leu Met 115 120 125 Thr Glu Ala Met Ala Pro Thr Asn Thr Leu Ser Asn Pro Ala Ala Val 130 135 140 Lys Arg Phe Phe Glu Thr Gly Gly Lys Ser Leu Leu Asp Gly Leu Ser 145 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360 365 Met Arg Pro Asn Asp Leu Ile Trp Asn Tyr Trp Val Asn Asn Tyr Leu 370 375 380 Leu Gly Asn Glu Pro Pro Val Phe Asp Ile Leu Phe Trp Asn Asn Asp 385 390 395 400 Thr Thr Arg Leu Pro Ala Ala Phe His Gly Asp Leu Ile Glu Met Phe 405 410 415 Lys Ser Asn Pro Leu Thr Arg Pro Asp Ala Leu Glu Val Cys Gly Thr 420 425 430 Pro Ile Asp Leu Lys Gln Val Lys Cys Asp Ile Tyr Ser Leu Ala Gly 435 440 445 Thr Asn Asp His Ile Thr Pro Trp Gln Ser Cys Tyr Arg Ser Ala His 450 455 460 Leu Phe Gly Gly Lys Ile Glu Phe Val Leu Ser Asn Ser Gly His Ile 465 470 475 480 Gln Ser Ile Leu Asn Pro Pro Gly Asn Pro Lys Ala Arg Phe Met Thr 485 490 495 Gly Ala Asp Arg Pro Gly Asp Pro Val Ala Trp Gln Glu Asn Ala Thr 500 505 510 Lys His Ala Asp Ser Trp Trp Leu His Trp Gln Ser Trp Leu Gly Glu 515 520 525 Arg Ala Gly Glu Leu Lys Lys Ala Pro Thr Arg Leu Gly Asn Arg Ala 530 535 540 Tyr Ala Ala Gly Glu Ala Ser Pro Gly Thr Tyr Val His Glu Arg 545 550 555 <210> 12 <211> 283 <212> PRT <213> Unknown <400> 12 Met Pro Gln Pro Tyr Ile Phe Arg Thr Val Glu Leu Asp Asn Gln Ser 1 5 10 15 Ile Arg Thr Ala Val Arg Pro Gly Lys Pro His Leu Thr Pro Leu Leu 20 25 30 Ile Phe Asn Gly Ile Gly Ala Asn Leu Glu Leu Val Phe Pro Phe Ile 35 40 45 Glu Ala Leu Asp Pro Asp Leu Glu Val Ile Ala Phe Asp Val Pro Gly 50 55 60 Val Gly Gly Ser Ser Thr Pro Arg His Pro Tyr Arg Phe Pro Gly Leu 65 70 75 80 Ala Lys Leu Thr Ala Arg Met Leu Asp Tyr Leu Asp Tyr Gly Gln Val 85 90 95 Asn Val Ile Gly Val Ser Trp Gly Gly Ala Leu Ala Gln Gln Phe Ala 100 105 110 His Asp Tyr Pro Glu Arg Cys Lys Lys Leu Val Leu Ala Ala Thr Ala 115 120 125 Ala Gly Ala Val Met Val Pro Gly Lys Pro Lys Val Leu Trp Met Met 130 135 140 Ala Ser Pro Arg Arg Tyr Val Gln Pro Ser His Val Ile Arg Ile Ala 145 150 155 160 Pro Thr Ile Tyr Gly Gly Gly Phe Arg Arg Asp Pro Glu Leu Ala Met 165 170 175 Gln His Ala Ser Lys Val Arg Ser Gly Gly Lys Met Gly Tyr Tyr Trp 180 185 190 Gln Leu Phe Ala Gly Leu Gly Trp Thr Ser Ile His Trp Leu His Lys 195 200 205 Ile Gln Gln Pro Thr Leu Val Leu Ala Gly Asp Asp Asp Pro Leu Ile 210 215 220 Pro Leu Ile Asn Met Arg Leu Leu Ala Trp Arg Ile Pro Asn Ala Gln 225 230 235 240 Leu His Ile Ile Asp Asp Gly His Leu Phe Leu Ile Thr Arg Ala Glu 245 250 255 Ala Val Ala Pro Ile Ile Met Lys Phe Leu Gln Gln Glu Arg Gln Arg 260 265 270 Ala Val Met His Pro Arg Pro Ala Ser Gly Gly 275 280 <210> 13 <211> 577 <212> PRT <213> Unknown <400> 13 Met Pro Ala Lys Val Ser Thr Ala Lys Trp Leu Arg Arg Gly Ser Val 1 5 10 15 Ala Met Lys Asp Lys Pro Ala Lys Gly Thr Pro Thr Leu Pro Ala Thr 20 25 30 Ser Met Asn Val Gln Asn Ala Ile Leu Gly Leu Arg Gly Arg Asp Leu 35 40 45 Ile Ser Thr Leu Arg Asn Val Ser Arg Gln Ser Leu Arg His Pro Leu 50 55 60 His Thr Ala His His Leu Leu Ala Leu Gly Gly Gln Leu Gly Arg Val 65 70 75 80 Ile Leu Gly Asp Thr Pro Leu Gln Pro Asn Pro Arg Asp Pro Arg Phe 85 90 95 Ser Asp Pro Thr Trp Ser Gln Asn Pro Phe Tyr Arg Arg Gly Leu Gln 100 105 110 Ala Tyr Leu Ala Trp Gln Lys Gln Thr Arg Leu Trp Ile Glu Glu Ser 115 120 125 His Leu Asp Asp Asp Asp Arg Ala Arg Ala His Phe Leu Phe Asn Leu 130 135 140 Ile Asn Asp Ala Leu Ala Pro Ser Asn Ser Leu Leu Asn Pro Leu Ala 145 150 155 160 Val Lys Glu Leu Phe Asn Ser Gly Gly Gln Ser Leu Val Arg Gly Val 165 170 175 Ala His Leu Leu Asp Asp Leu Arg His Asn Asp Gly Leu Pro Arg Gln 180 185 190 Val Asp Glu Arg Ala Phe Glu Val Gly Gly Asn Leu Ala Ala Thr Ala 195 200 205 Gly Ala Val Val Phe Arg Asn Glu Leu Leu Glu Leu Ile Gln Tyr Lys 210 215 220 Pro Met Ser Glu Lys Gln His Ala Arg Pro Leu Leu Val Val Pro Pro 225 230 235 240 Gln Ile Asn Lys Phe Tyr Ile Phe Asp Leu Ser Ser Thr Asn Ser Phe 245 250 255 Val Gln Tyr Met Leu Lys Asn Gly Leu Gln Val Phe Met Val Ser Trp 260 265 270 Arg Asn Pro Asp Pro Arg His Arg Glu Trp Gly Leu Ser Ser Tyr Val 275 280 285 Gln Ala Leu Glu Glu Ala Leu Asn Ala Cys Arg Ser Ile Ser Gly Asn 290 295 300 Arg Asp Pro Asn Leu Met Gly Ala Cys Ala Gly Gly Leu Thr Met Ala 305 310 315 320 Ala Leu Gln Gly His Leu Gln Ala Lys His Gln Leu Arg Arg Val Arg 325 330 335 Ser Ala Thr Tyr Leu Val Ser Leu Leu Asp Ser Lys Phe Glu Ser Pro 340 345 350 Ala Ser Leu Phe Ala Asp Glu Gln Thr Ile Glu Ala Ala Lys Arg Arg 355 360 365 Ser Tyr Gln Arg Gly Val Leu Asp Gly Ala Glu Val Ala Arg Ile Phe 370 375 380 Ala Trp Met Arg Pro Asn Asp Leu Ile Trp Asn Tyr Trp Val Asn Asn 385 390 395 400 Tyr Leu Leu Gly Lys Thr Pro Pro Ala Phe Asp Ile Leu Tyr Trp Asn 405 410 415 Ala Asp Ser Thr Arg Leu Pro Ala Ala Leu His Gly Asp Leu Leu Asp 420 425 430 Phe Phe Lys Leu Asn Pro Leu Thr His Pro Ala Gly Leu Glu Val Cys 435 440 445 Gly Thr Pro Ile Asp Leu Gln Lys Val Glu Leu Asp Ser Phe Thr Val 450 455 460 Ala Gly Ser Asn Asp His Ile Thr Pro Trp Asp Ala Val Tyr Arg Ser 465 470 475 480 Ala Leu Leu Leu Gly Gly Asp Arg Arg Phe Val Leu Ala Asn Ser Gly 485 490 495 His Ile Gln Ser Ile Ile Asn Pro Pro Gly Asn Pro Lys Ala Tyr Tyr 500 505 510 Leu Ala Asn Pro Lys Leu Ser Ser Asp Pro Arg Ala Trp Leu His Asp 515 520 525 Ala Lys Arg Ser Glu Gly Ser Trp Trp Pro Leu Trp Leu Glu Trp Ile 530 535 540 Thr Ala Arg Ser Gly Pro Leu Lys Ala Pro Arg Ser Glu Leu Gly Asn 545 550 555 560 Ala Thr Tyr Pro Pro Leu Gly Pro Ala Pro Gly Thr Tyr Val Leu Thr 565 570 575 Arg
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 FI C12R 1:19) (C12N 15/09 ZNA C12R 1:05) (C12N 15/09 ZNA C12R 1:01) (71)出願人 596096696 77 Massachusetts Ave nue,Cambridge,MA 02139 USA (72)発明者 アンソニー ジェイ. シンスキー アメリカ合衆国 マサチューセッツ 02115,ボストン, コモンウェルス ア ベニュー 285

Claims (16)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項1】 生物中でポリエステルバイオポリマーを
    構築する方法であって、 ポリヒドロキシブチレートの合成に必要な酵素をコード
    する遺伝子の発現のために、生物を選択する工程、 該生物に、ポリヒドロキシブチレートポリメラーゼをコ
    ードする単離された構造遺伝子を該生物中の該遺伝子の
    発現の調節配列と組み合わせて導入する工程、および発
    現した該酵素がポリヒドロキシブチレートを合成するた
    めに適切な基質を提供する工程、を包含する、方法:こ
    こで、該単離された構造遺伝子が、 【化1】 のヌクレオチド配列を有する遺伝子、および、該ヌクレ
    オチド配列とハイブリダイズし、かつポリヒドロキシブ
    チレートポリメラーゼ活性を有するポリペプチドをコー
    ドする遺伝子からなる群から選択され、該ハイブリダイ
    ゼーションが、5×SSCP(1×SSCPは、0.1
    5M NaCl、0.15Mクエン酸ナトリウム、10
    mM NaH2PO4、および10nM Na2HPO4
    含む)、5×デンハート液、0.1%(w/v) SD
    S、10mM EDTAおよび100μg/ml超音波
    処理変性サケDNAを含む溶液中で約16から18時間
    の期間、65℃の温度で実施される。
  2. 【請求項2】 前記酵素をそれらの基質特異性に基づい
    て選択する工程をさらに包含する、請求項1に記載の方
    法。
  3. 【請求項3】 前記酵素をコードする遺伝子を改変する
    ことにより該酵素の基質特異性を変化させる工程をさら
    に包含する、請求項1に記載の方法。
  4. 【請求項4】 特定のインデューサーに反応して、ポリ
    マーの合成に必要な酵素をコードする遺伝子の発現を制
    御する調節配列を発現ベクターに提供する工程をさらに
    包含する、請求項1に記載の方法。
  5. 【請求項5】 ポリマー合成の特定のインデューサーが
    温度変化および特定の基質からなる群から選択される、
    請求項4に記載の方法。
  6. 【請求項6】 前記遺伝子がZoogloea、Azo
    tobacter、Alcaligenes、Baci
    llus、Nocardia、Clostridiu
    m、Halobacterium、Escherich
    ia、PsuedomonasおよびPhodospi
    rilliumからなる群から選択される細菌に由来す
    る、請求項1に記載の方法。
  7. 【請求項7】 ポリマー合成に必要な酵素の少なくとも
    1つが欠損した細菌生物中で前記遺伝子を発現させる工
    程をさらに包含する、請求項1に記載の方法。
  8. 【請求項8】 前記遺伝子を植物中で発現させる工程を
    さらに包含する、請求項1に記載の方法。
  9. 【請求項9】 前記遺伝子が、ヒドロキシアシルCoA
    基質のD異性体に立体特異的な酵素をコードする、請求
    項1に記載の方法。
  10. 【請求項10】 ポリヒドロキシブチレートまたはその
    コポリマーを合成するための生物であって、 ポリヒドロキシブチレートの合成に必要な酵素をコード
    する遺伝子、およびポリヒドロキシブチレートポリメラ
    ーゼをコードする単離された構造遺伝子を、適切な基質
    と反応してポリヒドロキシブチレートまたはそのコポリ
    マーを合成し得る該生物中で該遺伝子の発現のための調
    節配列と組み合わせて発現する、生物。
  11. 【請求項11】 前記生物が細菌である、請求項10に
    記載の生物。
  12. 【請求項12】 前記生物が植物である、請求項10に
    記載の生物。
  13. 【請求項13】 前記基質が、アセトアセチル誘導体、
    オレフィン、エステル、アルコール、ジオール、エポキ
    シド、D−ヒドロキシブチリルCoA、D−βヒドロキ
    シバレリルCoA、分岐βヒドロキシアシルCoA、D
    −3−ヒドロキシブチリルCoAのアシルCoAモノマ
    ー類似体、4−ヒドロキシブチルCoA、アシルチオエ
    ステルCoA、3ヒドロキシ−4−ペンテノイル−Co
    Aおよびこれらの組み合わせからなる群から選択され
    る、請求項1に記載の方法。
  14. 【請求項14】 前記生物が、ポリヒドロキシブチレー
    トポリメラーゼタンパク質を発現する、請求項10に記
    載の生物。
  15. 【請求項15】 請求項12に記載の生物であって、前
    記ポリヒドロキシブチレートポリメラーゼ遺伝子が、A
    grobacterium tumefaciensプ
    ラスミドおよび植物DNAウイルスからなる群から選択さ
    れるベクターを用いて該生物に導入された、生物。
  16. 【請求項16】 前記ポリヒドロキシブチレートポリメ
    ラーゼ遺伝子が、細胞質、ミトコンドリア、またはクロ
    ロプラスト中に導入された、請求項12に記載の生物。
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Families Citing this family (59)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5480794A (en) * 1987-06-29 1996-01-02 Massachusetts Institute Of Technology And Metabolix, Inc. Overproduction and purification of soluble PHA synthase
GB9108756D0 (en) * 1991-04-24 1991-06-12 Ici Plc Production of polyalkanoate in plants
GB9115245D0 (en) * 1991-07-16 1991-08-28 Ici Plc Production of polyalkanoate
CA2113412C (en) * 1991-07-19 2000-01-25 Christopher R. Somerville Transgenic plants producing polyhydroxyalkanoates
US5610041A (en) * 1991-07-19 1997-03-11 Board Of Trustees Operating Michigan State University Processes for producing polyhydroxybutyrate and related polyhydroxyalkanoates in the plastids of higher plants
US5569595A (en) * 1991-09-27 1996-10-29 Center For Innovative Technology Production of poly-β-hydroxybutyrate in prokaryotic host cells
GB9223332D0 (en) * 1992-11-06 1992-12-23 Ici Plc Production of polyhydroxyalkanoate in plants
AU5676394A (en) * 1992-11-20 1994-06-22 Agracetus, Inc. Transgenic cotton plants producing heterologous bioplastic
WO1995021257A1 (en) * 1994-02-03 1995-08-10 Center For Innovative Technology Improved production of poly-beta-hydroxyalkanoates in transformed prokaryotic hosts
CN1079835C (zh) * 1994-06-01 2002-02-27 普罗克特和甘保尔公司 利用空气分级作用回收聚羟基链烷酸酯的方法
MX9605952A (es) * 1994-06-01 1997-12-31 Procter & Gamble Proceso para la recuperacion de polihidroxialcanoatos utilizando fraccionacion centrifuga.
US6083729A (en) * 1995-10-26 2000-07-04 Metabolix, Inc. Methods for isolating polyhydroxyalkanoates from plants
EP0870053A4 (en) * 1995-12-19 2002-09-11 Univ Minnesota METABOLIC PROCESS FOR THE MANUFACTURE OF POLYHYDROXYALCANOATE MONOMER SYNTHASES
GB9605704D0 (en) * 1996-03-19 1996-05-22 Zeneca Ltd Microorganisms and processes using them
WO1997038110A2 (en) * 1996-04-05 1997-10-16 Kieta Holding S.A. Compositions and methods relating to drug discovery and detection and treatment of gastrointestinal diseases
US5811272A (en) * 1996-07-26 1998-09-22 Massachusetts Institute Of Technology Method for controlling molecular weight of polyhydroxyalkanoates
JP3062459B2 (ja) * 1996-08-14 2000-07-10 理化学研究所 ポリエステル重合酵素遺伝子及びポリエステルの製造方法
EP0977865A1 (en) * 1997-02-13 2000-02-09 James Madison University Methods of making polyhydroxyalkanoates comprising 4-hydroxybutyrate monomer units
US6391611B1 (en) 1997-04-01 2002-05-21 Japan Science And Technology Corporation Polyester synthase and a gene coding for the same
JPH10276781A (ja) * 1997-04-01 1998-10-20 Rikagaku Kenkyusho ポリエステル重合酵素及び該酵素をコードする遺伝子
EP0881293A1 (en) * 1997-05-28 1998-12-02 Eidgenössische Technische Hochschule Zürich Institut für Biotechnologie Production of medium chain length poly-3-hydroxy alkanoates in Escherichia coli, and monomers derived therefrom
ATE323152T1 (de) 1997-09-19 2006-04-15 Metabolix Inc Biologische systeme zur herstellung von polyhydroxyalkanoate polymeren die 4-hydroxysäure enthalten
EP1044278A1 (en) * 1998-01-05 2000-10-18 Monsanto Company Biosynthesis of medium chain length polyhydroxyalkanoates
CA2317314C (en) 1998-01-07 2003-12-30 Metabolix, Inc. Animal nutrition compositions
US6586658B1 (en) 1998-03-06 2003-07-01 Metabolix, Inc. Modification of fatty acid metabolism in plants
US6143952A (en) * 1998-03-31 2000-11-07 Regents Of The University Of Minnesota Modified pseudomonas oleovorans phaC1 nucleic acids encoding bispecific polyhydroxyalkanoate polymerase
US6103956A (en) * 1998-03-31 2000-08-15 Regents Of The University Of Minnesota Polyhydroxyalkanoate synthesis in plants
DE69942060D1 (de) 1998-04-08 2010-04-08 Metabolix Inc Verfahren für die trennung und reinigung von biopolymeren
JP2002516384A (ja) 1998-05-22 2002-06-04 メタボリックス,インコーポレイテッド ポリヒドロキシアルカノエートバイオポリマー組成物
AU5247999A (en) * 1998-07-30 2000-02-21 Metabolix, Inc. Production of block copolymers of polyhydroxyalkanoates in biological systems
EP1100928B1 (en) * 1998-07-30 2006-02-01 Metabolix, Inc. Bifunctional enzymes for biopolymer production
DE69938105T2 (de) * 1998-08-04 2009-01-29 Metabolix, Inc., Cambridge Herstellung von polyhydroxyalkanoaten aus polyolen
CA2339421C (en) * 1998-08-18 2011-10-11 Metabolix, Inc. Transgenic microbial polyhydroxyalkanoate producers
WO2000052183A1 (en) * 1999-03-05 2000-09-08 Monsanto Technology Llc Multigene expression vectors for the biosynthesis of products via multienzyme biological pathways
US7026526B2 (en) 2000-02-11 2006-04-11 Metabolix, Inc. Multi-gene expression constructs containing modified inteins
JP3848047B2 (ja) 2000-03-30 2006-11-22 キヤノン株式会社 ポリヒドロキシアルカノエート合成酵素及び該酵素をコードする遺伝子
JP3848046B2 (ja) * 2000-03-30 2006-11-22 キヤノン株式会社 ポリヒドロキシアルカノエート合成酵素及び該酵素をコードする遺伝子
US6803220B2 (en) 2000-03-30 2004-10-12 Canon Kabushiki Kaisha Polyhydroxyalkanoate synthase and gene encoding the same enzyme
US6875596B2 (en) 2000-03-30 2005-04-05 Canon Kabushiki Kaisha Polyhydroxyalkanoate synthase and gene encoding the same enzyme
JP3848048B2 (ja) * 2000-03-30 2006-11-22 キヤノン株式会社 ポリヒドロキシアルカノエート合成酵素及び該酵素をコードする遺伝子
US6808910B2 (en) 2000-03-30 2004-10-26 Canon Kabushiki Kaisha Polyhydroxyalkanoate synthase and gene encoding the same enzyme
US6803219B2 (en) 2000-03-30 2004-10-12 Canon Kabushiki Kaisha Polyhydroxyalkanoate synthase and gene encoding the same enzyme
US6812013B2 (en) 2000-03-30 2004-11-02 Canon Kabushiki Kaisha Polyhydroxyalkanoate synthase and gene encoding the same
EP1334181B1 (en) 2000-11-17 2010-03-17 Metabolix, Inc. Production of medium chain length polyhydroxyalkanoates from fatty acid biosynthetic pathways
US6808907B2 (en) * 2001-03-27 2004-10-26 Canon Kabushiki Kaisha Method and apparatus for producing polyhydroxyalkanoate
CA2800359A1 (en) 2005-03-16 2006-09-28 Metabolix, Inc. Chemically inducible expression of biosynthetic pathways
AU2008229076B2 (en) 2007-03-16 2014-05-15 Genomatica, Inc. Compositions and methods for the biosynthesis of 1,4-butanediol and its precursors
EP3514242A3 (en) 2008-09-10 2019-08-28 Genomatica, Inc. Microrganisms for the production of 1,4-butanediol
BRPI1012685A2 (pt) 2009-03-05 2015-09-15 Metabolix Inc método para melhorar as características de uma planta, método para propagação de plantas transgênicas, método para supertransformação de plantas transgênicas, planta trasngênica produzida pelo método, semente da planta transgênica e matéria-prima de biorefinaria
EP2403949A1 (en) 2009-03-05 2012-01-11 Metabolix, Inc. Stable, fertile, high polyhydroxyalkanoate producing plants and methods of producing them
VN29801A1 (ja) 2009-06-04 2012-05-25
US20120174253A1 (en) 2009-09-15 2012-07-05 Nii Patterson Generation of high polyhydroxybutrate producing oilseeds
CN102686719A (zh) 2009-10-30 2012-09-19 株式会社大赛璐 具有1,3-丁二醇生产功能的基因重组微生物及其应用
WO2011066076A1 (en) 2009-11-25 2011-06-03 Genomatica, Inc. Microorganisms and methods for the coproduction of 1,4-butanediol and gamma-butyrolactone
WO2011100601A1 (en) 2010-02-11 2011-08-18 Metabolix, Inc. Process for gamma-butyrolactone production
PL2770836T3 (pl) 2011-10-25 2018-12-31 Marrone Bio Innovations, Inc. Frormulacje, kompozycje i metabolity z Chromobacterium i ich zastsowanie
CN104685058B (zh) 2012-06-04 2020-07-07 基因组股份公司 制造4-羟基丁酸酯、1,4-丁二醇和相关化合物的微生物和方法
IT201800003441A1 (it) * 2018-03-12 2019-09-12 Bio On Spa Poliidrossialcanoati per l’uso nella prevenzione del cancro colorettale.
CN110699391B (zh) * 2019-11-01 2023-05-30 山东省农业科学院农产品研究所 一种微波辅助碱法预处理牡丹果荚制备生物塑料聚-β-羟丁酸的方法

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1229123A3 (en) * 1987-06-29 2004-11-03 Massachusetts Institute Of Technology Method for producing polyester biopolymers

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