JP2007143567A - 新規なポリエステルバイオポリマー - Google Patents
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Abstract
【解決手段】生物中でポリエステルバイオポリマーを構築する方法であって、
ポリヒドロキシブチレートの合成に必要な酵素をコードする遺伝子の発現のため
に生物を選択する工程、この生物に、ポリヒドロキシブチレートポリメラーゼを
コードする単離された構造遺伝子を、生物中の上記遺伝子の発現の調節配列と組
み合わせて導入する工程、および発現した酵素がポリヒドロキシブチレートを合
成するために適切な基質を提供する工程を包含する。
【選択図】なし
Description
以下の方法は、βケトチオラーゼ、アセトアセチルCoAレダクターゼ、PHBポリメラーゼ、およびPHAポリメラーゼをコードする遺伝子とそれらの発現産物とを単離し、その発現を調節する配列を同定し特徴付け、そしてポリマー産生に対する培養条件および使用基質の影響を調べるために用いられた。PHBおよびPHA様バイオポリマーを製造する系を構築する技法もまた開示されている。これらの酵素を細菌または植物細胞で組み合わせ、適当な酸素および温度の制御培養条件下に適当な基質を用いることにより、様々なポリマーを作成できる。これらの発現を調節する酵素またはヌクレオチド配列もまた、発現量を変え、または基質特異性を変えて得られるポリマーをさらに変化させるために改変することが可能である。その効果は、完全細胞を用いては通常利用できなかった基質が、単離された酵素を用いることにより製造可能であることである。
PHB生合成経路の遺伝学的研究のために、まず初めにZoogloea ramigera株I−16M(ATCC19623)を用いた。Z.ramigeraDNAは200mlの対数増殖期中期の培養物から、以下のように精製した。細胞を遠心して集め、20mMのTris−HC1、PH8.2で洗浄し、10mlのTris−HC1に再懸濁した。次に10mlの24% w/vポリエチレングリコール8000および2mlの25mg/mlリゾチームを加え、次に37℃で30分インキュベートして、細胞をスフェロプラストにした。スフェロプラストを遠心して集め、5mlのTE緩衝液(10mMのTris−HC1、pH8.0.1mMのEDTA)に再懸濁し、300μ1の10% w/v SDSを添加し、55℃で10分間インキュベートして細胞を溶解した。10mlのTEをさらに添加し、細胞溶解物をRNAse(50μg/ml)およびプロテイナーゼK(30μg/ml)と共に37℃で1時間インキュベートした。次にDNAをCsC1密度勾配遠心により精製した。
はNew England Biolabsから入手し、製造業者の指示した条
件下で用いた。子牛腸アルカリホスファターゼはBoehringer Mannheim Corporationから購入した。プラスミドの精製、E.co1iの形質転換等を含む全ての慣例的DNA操作は、Maniatisら(1982)の記載した方法で行った。クロモソームDNAはA.eutrophus株から精製し、TSB中で後期対数相まで生育させた。制限酵素消化DNA試料のアガロースゲルからニトロセルロースフィルターへの転写、32P標識DNAプローブを用いたプレハイブリダイゼーションおよびハイブリダイゼーションはPeoplesら、J.Biol.Chem.、 262、97−102(1987)に記載されている。制限酵素分析のためのA.eutrophusの組換え株からの迅速なプラスミドの単離は、BirnboimおよびDoly、Nucleic Acids Res.7.1513−1523(1979)のアルカリ抽出法で行った。
広宿主プラスミドpLAFR3またはpLAFR3の組換え誘導体のA.eutrophusへの接合移入は、Eassonら、J.Bacteriol.、169、4518−4524(1987)に記載の方法により行った。但しこの場合、受容細胞A.eutrophusはソニケートせず、また接合移入体は窒素源として0.01% NH4Cl、炭素源として1%(w/v)フルクトース、および10μg/mlテトラサイクリンを含有するA.eutrophus無機塩寒天プレートで選択した。
チオラーゼ抗血清は精製されたチオラーゼタンパク質を用いて標準方法により、New Zealand白色ウサギの雌を用いて調製した。抗体力価はActa Pathol.Microbio1.Scand.26、507−515(1949)のオクタロニー二重拡散アッセイで評価した。精製抗体は血清から、Bigheeら、Mol.Immunol.20、1353−1357(1983)に従いプロテインAアガロースのクロマトグラフィーで調製した。約4×104個の組換えファージをE.co1i Y1090に吸着させて15cmのLBアガープレートにまき、42℃で3時間インキュベートした。次にプレートを、予め10mM IPTGで飽和させたニトロセルロースフィルター(Schleicher & Schull、BA85)の上に載せ、37℃でさらに4時間インキュベートした。フィルターを取り除き、TBST(50mM Tris−HCl、PH7.9、150mM NaCl、0.05% Tween−20)で10分間洗浄し、20% v/v牛胎児血清を添加したTBST中で30分間インキュベートして、TBSTですすいだ。第一抗体は精製した抗チオラーゼ抗体(10μl)を添加したTBSTの10ml中でこのフィルターを、室温で1時間インキュベートすることにより結合させた。次にフィルターを、TBSTを各5分間ずつ3回替えて洗浄した。結合した第一抗体はビオチン−アビシン ホースラディッシュペルオキシダーゼ検出系(Clontech Laboratories)およびホースラディッシュペルオキシダーゼ発色剤(Bio−Rad Laboratories、 Richmond、VA)を用いて検出した。
チオラーゼ遺伝子のプロモーター領域を確認し、チオラーゼTAG終止コドンの下流に、可能なターミネーター配列が存在しないことを確認した後、クローンpUCDBK1に存在する残余の2kbのZoogloeaDNAを配列決定して、レダクターゼ遺伝子について調べた。完全なpUCDBK1挿入またはその断片を含有する一連の発現プラスミド(pZT1〜pZT3)を、E.coli tacプロモーターベクターpKK223.3中に構築した。各プラスミドはtacプロモーターに対して発現のために正しい方向に位置するチオラーゼ遺伝子を有する。tacプロモーターはチオラーゼの発現を指令するのではなく、オペロン様タイプの機構の2.3kb下流に位置する任意の遺伝子の発現を指令すると予想するのが理にかなっている。クローンpZT1は、pUCDBK1の完全な3.8kbEcoRI Z.ramigera DNA挿入を、ベクターpKK223−3のEcoRI部位に挿入することにより構築した。続いて、pZT2をpZT1から、850bp SmaI断片を欠失させる直接的な方法で派生させた。pZT3はチオラーゼプロモーターの確認についての記載のようにして構築する。一連のtacプロモーター誘導実験は、各々の組換えクローンpZT1、pZT2およびpZT3で行った。ベクターpKK223−3をコントロールとして用いた。
pUCDBK1の最初のSalI部位の2.3kb下流に位置する、2339bpの完全ヌクレオチド配列を図2および配列表の配列番号3に示す。チオラーゼ遺伝子のコドン使用情報を標準として用いて配列データのコンピューター分析を行い、3つのオープンリーディングフレームを同定した。pZT1およびpZT2の誘導された細胞溶解物中に存在する25,000ダルトンのバンドを、次に調製用SDS−PAGEにかけて電気溶出し、N末端タンパク質配列のデータを得た。このデータを用いて対応する遺伝子の転写開始部位を確立した。実験で決定したN末端の5個のアミノ酸は、最初のオープンリーディングフレームのDNA配列から推定される2位〜6位の残基と一致する。このリーディングフレームの翻訳により、分子量25,000のポリペプチドが推定される(配列番号4)。ヌクレオチド37位のATGに始まりTGA終止コドンヌクレオチドに終わる最初のオープンリーディングフレームの翻訳産物を図2および配列表の配列番号4に示す。これはアセトアセチルCoAレダクターゼタンパク質の推定される一次アミノ酸配列である。
Zoogloeaから最初の2つのPHB遺伝子を単離した方法を適用し、Zoogloeaチオラーゼ遺伝子領域を相同な配列の位置を決めるハイブリダイゼーション用プローブとして用いて、他のPHB産生種であるAlcaligenes eutrophusから遺伝子を同定し、単離し、特徴付けた。
Z.ramigera由来のPHBポリメラーゼは、D(−)−ヒドロキシルブチル−CoAを利用し、これらを鋳型に依存しないヘッドトゥーテイル縮合反応によるオキソエステル結合で重合し、直鎖状のポリマーを得る。これらのポリマーは、最大で10,000個のモノマーユニットを含み得、1×106以上の分子量となり得る。このポリマーは迅速に不溶性となり、細胞中で独立した顆粒として蓄積される。
これらの技術はまた、A.eutrophus H16のポリ(β)−ヒドロキシブチレート−陰性変異体の補完性を用いて、Alcaligenes eutrophus H16中にPHBポリメラーゼ遺伝子(phbC)クローニング、配列決定、および発現させることにも応用される。PHBの生合成経路の3つの酵素をコードしている遺伝子は、phbC−phbA−phbBと統合されていることが結果から示された。E.coli中で3つ全ての遺伝子を発現させたところ、この細菌では顕著なレベル(乾燥細胞の50%)のPHB産生があった。phbCは、典型的な膜タンパク質とは異なる親水性の特性の、Mr=63,900のポリペプチドをコードしており、このことは、PHBの生合成には恐らく膜複合体が含まれないことを示している。
A.eutrophus中への、広域宿主プラスミドpLAFR3あるいはpLAFR3のリコンビナント誘導体の接合移入は、前述したのと同じ方法を用いて行った。しかしこの場合、受容細胞であるA.eutrohus細胞は超音波処理せず、そして接合移入体(Transconjugants)は、0.01%のNH4Clを窒素源、1%(w/v)のフルクトースを炭素源として10μg/mlのテトラサイクリンを含んだA.eutrohus無機質寒天プレート上で選択した。
A.eutrophusのPHB−欠損株を確認するための増幅およびスクリーニングの方法は、SchlegelおよびOedingの、Radiation and Radioisotopes for Industrial Microorganisms. International Atomic Energy Agency、Vienna、223−231(1971)に記載されているものを使用した。約105個のKanr接合移入体(Tn5挿入変異体)のプールを、0.01%のNH4Cl、1%のフルクトースおよび100μg/mlのカナマイシンを含んだ10mlの無機質培地に接種し、そして30℃で18時間培養した。この培養物を次に100mlの同じ培地に接種し、30℃で30時間培養した。PHB−欠損変異株を増幅するために、この培養物から109の細胞を含んだ一部を、密度平衡遠心分離によりショ糖の段階グラジエントで分画し、そして0.01%のNH4Cl、1%のフルクトースおよび100μg/mlのカナマイシンを含んだ無機塩寒天プレート上に蒔いた。30℃で4から5日間生育させた後、不透明な(PHB−欠損)および白(PHB−含有)のコロニーが容易に区別できた。不透明なおよび白の両方のコロニーにより産生されたPHBのレベルを定量することにより、不透明なコロニーはPHB−欠損で、白コロニーはPHBを含有することが確認された。
β−ケトチオラーゼ、NADPH−関与のアセトアセチル−CoAリダクターゼおよびPHB−ポリメラーゼのアッセイを行うために、100mlのA.eutrophus株の培養物を30℃で40時間TBS中で生育させた。Tn5変異体株用には100μg/mlの濃度のカナマイシンを加え、そしてpLAFR3あるいはその誘導体を含んだ株用には10μg/mlのテトラサイクリンを加えた。遠心分離で細胞を回収し、2mlの細胞溶解バッファー(10mMのTris HCl、pH8.0;5mMのβ−メルカプトエタノール;5mMのEDTA、0.02mMのフェニル−メチル−スルフォニル−フルオライド;10%v/vのグリセリン)に再懸濁し、そして超音波処理で細胞溶解した。細胞溶解液の一部を遠心分離して細胞残渣デブリスを除去し、β−ケトチオラーゼおよびアセトアセチル−CoAレダクターゼのアッセイ用とした。β−ケトチオラーゼ活性は、DavisらのJ.Biol.Chem.262、82−89(1987)に記載された様に、NADPHを補助因子として、アセトアセチル−CoAのアセトアセチル−CoAのチオリシスの速度の測定により決定された。PHBポリメラーゼアッセイは粗細胞溶解液を用いて行い、そして、FukuiらのArch. Microbiol、110、149−156(1976)に記載された様に、D−3H−ヒドロキシブチル−CoA(約2μCi/μmolの放射比活性)の取り込みレベルを測定した。タンパク質濃度は、BradfordのAnal.Biochem.72、248−254(1976)の方法により、Bioradのアッセイ溶液および標準物としてウシ血清アルブミンを用いて決定された。E.coliのmaxi−cell標識実験は、SancarらのJ.Bacteriol.137、692−693(1979)に記載された様に行った。
異なった株のPHBレベルを調べるために、粗細胞溶解液の100μlを5%の次亜塩素酸ナトリウム1.2mlにて37℃にて1時間処理した。不溶のPHBを次に、10分間微量遠心管で遠心分離し回収し、1mlのH2O、1mlのアセトン、1mlのエタノールで連続して洗浄し、減圧下で乾燥した。次にPHB濃度は、LawおよびSlepeckyのJ.Bacteriol.82、33−36(1961)に記載されている様に分光光度計で標準曲線を用いて定量し、mg PHB/mgタンパク質で表した。
プラスミドpLA29、pLA40、pLA41およびpLA42は、pAeT29の制限酵素断片を広域宿主ベクターpLAFR3に挿入するクローニングで構築し、PHB−陰性のA.eutrophus株を相補性分析した。pLAFR3はpLAFR1の誘導体で、FriedmanのGene 18、289−296(1982)に記載され、EcoRI部位へ挿入されたpUC8ポリリンカークローニング部位を有する。pAeT9の異なった断片をpLAFR3ヘクローニングした。pLA29は、pAeT29からの15kbのEcoRI部位挿入体全体をpLAFR3のEcoRI部位へつなげることで構築した。pLA40、pLA41およびpLA42を構築するため、先ずpUC18へ対応する断片をクローニングし、プラスミドpAeT40、pAeT41およびpAeT42を生成した。次にこの断片をBamHIおよびEcoRIによる消化でpUC18から切り出し、アガロースゲル電気泳動で精製し、そしてBamHI/HindIIIで消化したpLAFR3につなげた。pAeT40を構築するため、pAeT29のDNAをNdeIで完全に消化しDNAポリメラーゼのクレノウ断片を用いて結合性末端を埋めた。アガロースゲル上で断片を分画した後、目的の7kb断片を電気溶出で精製し、pUC18のSmaI部位につなげ、そして次にE.coliのDH5α細胞を形質転換した後に制限酵素分析によりリコンビナントプラスミドpAeT40を確認した。NdeI部位の一つがこの酵素の構造遺伝子の中にあるために、この構築によりアセトアセチル−CoAリダクターゼ活性は除去される。pAeT41の構築は、SmaI/EcoRI消化されたpAeT29のDNAをアガロースゲルで分画し、そして5kbのSmaI/EcoRI断片を精製し、SmaI/EcoRI消化したpUC18につなぎ、正しいプラスミドを得た。β−ケトチオラーゼおよびアセトアセチル−CoAレダクターゼの構造遺伝子を有する2.3kbのPstI断片の欠損は、pAeT41のDNAをPstIにより部分消化し、そして再びつなぐことにより行い、pAeT42を構築した。
105個のA.eutrophus 11599 S1のTn5挿入変異体のライブラリーを構築し、そして32個の潜在的にPHB−陰性のコロニーを、前述の様に窒素制限最少プレート上での不透明なコロニー表現型で確認した。これらはさらにSouthern DNAハイブリダイゼーション分析により特徴付けられた。DNAハイブリダイゼーション実験は、制限酵素消化された各株からのクロモソームDNAを、それぞれTn5 DNAプローブ〈プラスミドpRK602)と、でA.eutrohusのphbA−phbB遺伝子座(図3)を含んだ2つのプラスミドpAeT10およびpAeT29とを用いて分析して行った。
プラスミドpAeT42中にクローニングされたA.eutrophusクロモソームDNAの2kbのSmaI−PstI断片は、phbCおよび恐らく調節配列の完全な構造遺伝子を含んでいる。この断片は、上述のジデオキシ配列決定方法を用いて、DNA鎖の両方から何回も配列決定された。単一の長いオープンリーディングフレームは、ヌクレオチド820からヌクレオチド2608のTGA停止コドンまで延びている。潜在的な翻訳開始コドンは、位置842(ATG)、1067(ATG)および1097(ATG)に存在する。これらの潜在的な開始部位から翻訳すると、それぞれMr 63,940、Mr 55,513およびMr 54,483のタンパク質が生成される。位置842のATGからの翻訳生成物と、位置1067のATGからの翻訳生成物および以下に記述するP.oleovaransのPHAポリメラーゼ遺伝子の生成物との間のアミノ酸配列に顕著に相同性があることは、恐らく最初のATG(位置842)が正しいことを示している。図5および配列表の配列番号8は、SmaI部位から下流に位置するphbA遺伝子の最初の30のヌクレオチドまでの、この領域の全部のヌクレオチド配列を表している。位置842のATGから位置2609のTGAまでの、このオープンリーディングフレームの翻訳生成物もまた示してある。プラスミドpAeT42のphbC遺伝子にコードされたPHBポリメラーゼは、Mr=63,940の589アミノ酸のポリペプチドである(配列番号9)。phbA遺伝子産生物のN−末端の10個のアミノ酸もまた図5に示されている。図5に示されたヌクレオチド配列の付加的な特徴には、SmaI部位から上流で始まり、位置76のTGA停止コドンで終わる、オープンリーディングフレームのC−末端が含まれる。phbCのTGA停止コドン(位置2609)から85bp下流の位置にphbA構造遺伝子のATG開始コドン(位置2969)がある。これらのデータから、A.eutrophusのPHB生合成経路の三つの酵素は、図5に示した様にphbC−phbA−phbBとして統合された三つの遺伝子にコードされていることは明白である。
Pseudomonas oleovarans中でのポリヒドロキシアルカノエート(PHA)ポリエステルの生合成に関与する遺伝子もまた以下の様に単離された。
以上により、A.eutrophusのPHB生合成遺伝子をE.coliへ導入することにより、新しいPHB産生株を構築することか可能で、乾燥細胞重量の50%までのPHBの蓄積が得られることが確立された。新しいあるいは改良されたポリエステル産生株の構築が、多くのシステムで、A.eutrophusからのPHB生合成遺伝子、あるいはP.oleovaransからのPHAポリメラーゼ遺伝子およびORF2およびORF3のいづれかにより現在可能となった。A.eutrophusのβ−ケトチオラーゼおよびP.oleovarans中のNADP−特異的アセトアセチル−CoAリダクターゼ遺伝子を、広域宿主発現ベクターpNM185(Mermodら、J.Bacteriol. 167、447−454(1986)、あるいはpERD20/pERD21(Ramosら、FEBS LETTERS 226、241−246(1986)の中で、xylSプロモーターの制御下で発現するプラスミドが構築し得る。あるいは、広域宿主tacプロモーター発現ベクターpMMB24/pMMB22(Bagdasarianら、Gene 26、273−282(1983))による。これらと同じベクターが、A.eutrophusのPHBポリメラーゼ遺伝子あるいはプラスミドpPO23にクローニングされた三つのP.oleovarans遺伝子の発現に使用し得る(図6)。
Z.ramigera、A.eutrophus、N.salmonicolor、およびP.oleovaransで示した様に、一連の生物体からのポリマー遺伝子および遺伝子産生物の単離および特徴付けの後、遺伝子産生物の発現を制御する手段が確立し得る。Zoogloeaのチオラーゼ遺伝子の過剰生産は、Z.ramigeraの転写開始部位およびプロモーターを定義するために使用する実験で示された。過剰産生は酵素を均一まで精製することを可能にし、そして分析および基質特異性の比較のための試薬に用い得る量を与える。加えて、精製された酵素は、in vitroのポリマー合成用の立体特異的基質の合成に使用し得る。さらに、ポリマーの過剰生産に対応する転写調節機構が一連の環境条件下で解明されたなら、既知のポリマーおよび新規のポリマーの酵素的合成用のin vitroシステムが開発され、新しい物質が提供される。この新しい物質は、次にこのポリマーの最適の利用がなされる様に、化学組成、分子量およびレオロジー特性に関して分析される。
異なった細菌によって産生されたPHBあるいはPHAの分子量を決定する因子は、種々の細菌により産生されたポリマーの分子量分布を分析することで解明できる。多くのPHB−生産微生物が、D(−)−ヒドロキシルブチレート以外のモノマーをポリマー鎖に組み込む能力にはほとんど疑問はない。A.eutrophusにより産生されたPHB−PHVコポリマーの場合、プロピオネートが先ずプロピオニル−CoAに変換され、次にこれがβ−ケトチオラーゼの基質として働くと提案されている。過剰生産システムから得られる高い収量の純粋な酵素が、三つのPHB−生合成酵素のそれぞれが利用し得る代わりの基質の範囲を決定するために必要であり、そして得られる基質が厳格に制御し得るin vitroシステム中で、種々のタイプのPHB−様の新ポリマーが合成され得る。
PHBは、栄養制限条件下、通常は窒素制限条件(例えば、0.1%窒素、種に依存する)で生育させると、細菌中で産生され貯蔵され、酸素、リン酸あるいは他の非−炭素栄養源を制限してもまたPHB合成および貯蔵は誘起される。例えば、窒素固定細菌Azotobacter beijerinckiiは、酸素制限下、グルコース/アンモニウム塩で生育すると、乾燥細胞重量の70%までをPHBとして蓄積する。利用可能な酸素を増大させるとPHB合成が減少し、そして二つの生合成酵素のレベルの減少を伴う。酵素レベルの減少は遺伝子レベルで働いている調節機構(あるいは複数の場合も有り得る)を反映する。Alcaligenes eutrophusの生育の窒素制限は、乾燥細胞重量の80%までのPHB収量を与える。同様に、HalobacteriumおよびPseudomonas sp.も窒素制限下でPHB産生を増大させる。
上述の様に細菌発現システムを用いて、チオラーゼ、リダクターゼ、および/あるいはPHB用のポリメラーゼ、あるいはPHAをコードしている遺伝子は、種々の種の植物中で発現され得、所望するポリマー性の産生物を産生する。この様なシステムの利点は、石油に基づくプラスティックヘの依存の減少、および種々の土壌の上で生育可能な植物用の経済的に有用な作物の創製、等で即座に明白となる。
するシステムである。現時点で最も一般的なベクターは、Agrobacterium tumefaciensの腫瘍誘起(Ti)プラスミドであり、感染によりDNAを運搬する。カリフラワーモザイクウイルスあるいはGeminiウイルスベクターを基にしたベクターの様な、植物DNAウイルスもまたベクターとして使用し得る。植物細胞へ直接遺伝子を転移する多くの方法があり、プロトプラストによる化学的に刺激されたDNAの取り込み、エレクトロポーレーション、無処理の植物細胞のエレクトロインジェクション、リポソームを介したプロトプラストの形質転換、および植物への直接注入によるDNA形質転換、が含まれる。化学的に刺激した取り込みは、プロトプラストをドナーおよびキャリアーDNAを13%(w/v)のポリエチレングリコールの存在下で40mMのCaCl2中でインキュベートすることが必要である。ポスト−インキュベーションを行い、CaCl2濃度を徐々に上昇させると共にPEG濃度を徐々に低くする。エレクトロポーレーションは、高い電圧の電気パルスを用い、細胞膜を可逆的に透過性とし、DNAを含む大きな分子の取り込みを容易にする。電気注入および直接注入は、最初にプロトプラストの形成を行う必要がないという利点を有する。これらの方法は、当業者には既知である。例えば、C.P.LichtensteinおよびS.L.Fullerによる総説、”Vectors for the genetic engineering of plants”、Genetic Engineering、 P.W.J.Rigby編集vol.6、104−171(Academic Press Ltd. 1987)を参照。
Claims (3)
- 前記ポリマーの炭素源としてn−アルカン、1−アルケン又は脂肪酸を利用し得る細菌から得られることを特徴とする、請求項1に記載の単離ポリヌクレオチド。
- ポリエステルバイオポリマーを製造する方法であって、以下の工程:
(a)細菌宿主細胞に、適切な調節配列の支配下にある請求項1又は2に記載のポリヌクレオチドを含有する発現ベクターを導入して、該ポリヌクレオチドによりコードされるポリヒドロキシアルカノエートポリメラーゼを発現させる工程;
(b)前記工程(a)で発現が確認された宿主細胞を増殖させる工程:
(c)前記工程(b)での宿主細胞に、Pseudomonas oleovaransのポリヒドロキシアルカノエートポリメラーゼ陽性株が取り込み可能な基質から選択されるポリヒドロキシアルカノエート・ポリマーの生産のための基質を供給する工程;及び
(d)前記宿主細胞からポリエステルバイオポリマーを回収する工程、
を含むことを特徴とする、前記方法。
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