DE69034017T2

DE69034017T2 - Eine zur Herstellung von Polyhydroxybutyrat oder einem anderen Polyhydroxyalkanoat geeignete Pflanze oder pflanzliche Zelle

Info

Publication number: DE69034017T2
Application number: DE69034017T
Authority: DE
Inventors: Oliver P. Peoples; Anthony J. Sinskey
Original assignee: Massachusetts Institute of Technology
Current assignee: Massachusetts Institute of Technology
Priority date: 1989-07-10
Filing date: 1990-07-10
Publication date: 2003-07-31
Anticipated expiration: 2010-07-11
Also published as: WO1991000917A1; DK0482077T3; CA2062816A1; JP2005278656A; JP2004329219A; JP2003189858A; DE69032713T2; ES2131489T3; EP0482077A1; JP2005287517A; EP0482077B1; JP2007143567A; ATE227340T1; CA2062816C; ATE172497T1; DE870837T1; JP3964436B2; ES2125222T3; EP0870837B1; JP3703983B2

Description

Hintergrund der Erfindung

Die Regierung der Vereinigten Staaten besitzt Rechte an dieser Erfindung aufgrund von Zuwendungen des National Institute of Health, Office of Naval Research und der National Science Foundation.
Synthese durch Bakterien war lange das einzige Mittel zur Herstellung von vielen der komplexeren Biopolymeren. Erst in letzter Zeit wurden Wege zur Synthese dieser Polymere bestimmt. Es waren viele Anstrengungen nötig, die verschiedenen an diesen Wegen beteiligten Enzyme und Cofaktoren zu isolieren. Die Regulation ihrer Expression war weitgehend empirisch, d. h. es wurden die Konzentration der Nährstoffe oder andere Faktoren, wie der Sauerstoffpegel, verändert und die Wirkung auf die Polymerproduktion und -zusammensetzung gemessen.
Um über die Produktion dieser komplexen Biopolymere Kontrolle zu besitzen und sie in einer speziellen Weise zu modifizieren, ist es nötig, ein System zum Bestimmen der für die Synthese erforderlichen chemischen Stufen zu planen, die für diese chemischen Stufen verantwortlichen Proteine zu isolieren und zu charakterisieren, die für diese Proteine codierenden Gene zu isolieren, zu sequenzieren und zu klonieren und die Mechanismen zur Regulation der Geschwindigkeit und des Grades der Expression dieser Gene zu identifizieren, zu charakterisieren und zu nutzen.
Polyhydroxybutyrat, ein technisch einsetzbares komplexes Biopolymer, ist ein intrazelluläres Reservematerial, das von einer großen Zahl von Bakterien erzeugt wird. Poly beta-hydroxybutyrat (PHB), der polymere Ester von D(-)-3- Hydroxybutyrat, wurde zum ersten Mal im Jahr 1925 in Bacillus megaterium entdeckt. Sowohl die chemischen als auch die physikalischen Eigenschaften dieses einzigartigen Polyesters machten ihn zu einem attraktiven biologischen Material für ausgedehnte Untersuchungen. PHB besitzt eine Vielzahl potentieller Anwendungsmöglichkeiten, einschließlich der Verwendbarkeit als biologisch abbaubares/thermoplastisches Material, als Quelle chiraler Zentren für die organische Synthese bestimmter Antibiotika und als Matrix für Arzneimittelabgabe und Knochenersatz. In vivo wird das Polymer intern zu Hydroxybutyrat, einem normalen Bestandteil von humanem Blut, abgebaut.
Die enzymatische Synthese der hydrophoben kristallinen PHB- Granulatkörnchen aus dem C&sub2;-Biosynthon Acetyl-CoA wurde in einer Anzahl von Bakterien untersucht. Drei Enzyme, Beta- Ketothiolase, Acetoacetyl-CoA-Reductase und PHB-Polymerase, sind an der Umwandlung von Acetyl-CoA zu PHB beteiligt.
Thiolasen sind allgegenwärtige Enzyme, die die Synthese und Spaltung von Kohlenstoff-Kohlenstoff-Bindungen katalysieren und dadurch im Zellstoffwechsel eine zentrale Rolle einnehmen. Unterschiedliche Thiolaseenzyme sind an den Wegen der Biosynthese von Terpenoiden, Steroiden, Macroliden und anderer sowie am Abbau von Fettsäuren beteiligt. In Z. ramigera wird die Kondensation von zwei Acetyl-CoA-Gruppen unter Bildung von Acetoacetyl-CoA durch Beta-Ketothiolase katalysiert. Das Acetoacetyl-CoA wird anschließend durch eine NADP-spezifische Reductase unter Bildung von D(-)-Beta- Hydroxybutyryl-CoA, dem Substrat für PHB-Polymerase, reduziert.
Beta-Ketothiolase (Acetyl-CoA-CoA-C-Acetyltransferase, E. C. 2.3.1.9) wurde in A. beijerinckii (Senior und Dawes, Biochem. J., 134, 225-238 (1973)), A. eutrophus (Oeding und Schlegel, Biochem. J., 134, 239-248 (1973)), Clostridium pasteurianum (Bernt und Schlegel, Arch. Microbiol., 103, 21-30 (1975)) und Z. ramigera (Nishimura et al., Arch. Microbiol., 116, 21-27 (1978)) untersucht. Die Klonierung und Expression der Z. randgera-Acetoacetyl-CoA- Reductasegene wurde in der US-A-067 695, äquivalent zu WO 89/00202, beschrieben. Dieses Gen wurde dann als Hybridisierungssonde zur Isolierung des Reductasegens aus anderen Bakterienarten, einschließlich Alcaligenes eutrophus und Nocardia verwendet.
Die an der PHB-Biosynthese in Z. ramigera beteiligte Reductase ist für das D(-)-Isomer von Hydroxybutyryl-CoA stereospezifisch und verwendet ausschließlich NADP(H) als Cofaktor. Die am besten charakterisierte Acetoacetyl-CoA- Reductase ist die aus Zoogloea, die von Saito et al., Arch. Microbiol., 114, 211-217 (1977), und Tomita et al., Biochemistry of Metabolic Processes, 353, Hrsg. D. Lennon et al. (Elsevier, Holland, 1983) beschrieben wurde. Dieses NADP- spezifische Enzym mit einem Molekulargewicht von 92000 wurde von Fukui et al., Biochim. Biophys. Acta, 917, 365-371 (1987), bis zur Homogenität, wenn auch nur in geringen Mengen, gereinigt. Nach der Beschreibung in der US-A-067695, äquivalent zu WO 89/00202, wurde das Beta-Ketothiolaseenzym von Z. ramigera nun kloniert, exprimiert und dessen Produkt bis zur Homogenität gereinigt. Das klonierte Gen wurde zur Identifizierung und Isolierung des entsprechenden Beta- Ketothiolasegens in anderen Bakterienarten, einschließlich Alcaligenes eutrophus und Nocardia verwendet.
Die PHB-Polymerase in Z. ramigera ist für D-Beta- Hydroxybutyryl-CoA stereospezifisch. Synthetasen aus anderen Bakterien, wie A. eutrophus, können andere Substrate, beispielsweise D-Beta-Hydroxyvaleryl-CoA, nutzen, da die Zugabe von Propionat zu A. eutrophus-Kulturen zum Einbau von C&sub5;- und C&sub4;-Einheiten in ein PHB/HV-Copolymer führt. Griebel und Merrick, J. Bacteriol., 108, 782-789 (1971), trennten die PHB-Polymerase von nativen PHB- Granulatkörnchen von B. megaterium, wobei die gesamte Enzymaktivität bei diesem Prozeß verlorenging. Sie konnten die Aktivität nur durch Zugabe von PHB-Granulat zu einer oder zwei Fraktion(en) des Proteins wiederherstellen. In jüngerer Zeit untersuchten Fukui et al., Arch. Microbiol., 110, 149-156 (1976), und Tomita et al. (1983) dieses Enzym in Z. ramigera und sie reinigten hierbei partiell die nicht-granulatgebundene PHB-Polymerase. Ein Verfahren zur Klonierung, Expression und Verwendung ihres Produkts bei der Synthese neuer Polymere wurde in der US-A-067695, äquivalent zu WO 89/00202, beschrieben.
Es zeigte sich, daß ein ganzer Bereich von Polyhydroxyalkanoat(PHA)-Speicherpolymeren von Bakterien einschließlich A. eutrophus und P. oleovarans erzeugt wird. Die PHA-Polymere sind Heteropolymere des D-Isomers von Beta- Hydroxyalkanoaten, wobei die Variation in der Länge der Seitenketten (CH&sub3;-C&sub8;H&sub1;&sub7;) auftritt. Beispielsweise baut A. eutrophus, wenn es in Gegenwart von 5-Chlorpentansäure gezüchtet wird, 3-Hydroxybutyrat, 3-Hydroxyvalerat und 5- Hydroxyvalerat in das Polymer ein.
Betrachtet man die extrem hohen Ausbeuten dieses Polymers, die durch klassische Fermentationsverfahren erzielbar sind, und die Tatsache daß PHB und PHA mit einem Molekulargewicht von über 10000 für vielfältige Anwendungsmöglichkeiten geeignet sind, ist es günstig, neue PHB-ähnliche Biopolymere zu entwickeln, um Anwendungsmöglichkeiten zu verbessern oder neue zu schaffen.
Die Produktion von anderen Poly-beta-hydroxyalkanoaten als PHB durch Monokulturen von A. eutrophus und Pseudomonas oleovarans wurde von deSmet et al. in J. Bacteriol., 154, 870-878 (1983), berichtet. Bei beiden Bakterien wurden die Polymere durch kontrollierte Fermentation produziert. A. eutrophus erzeugt beim Züchten auf Glucose und Propionat ein Heteropolymer von PHB-PHV, wobei der PHV-Gehalt etwa 30% erreicht. P. oleovarans erzeugt beim Züchten auf Octan ein Homopolymer von Poly-beta-hydroxyoctanoat. Von Nocardia wird berichtet, daß es beim Züchten auf n-Butan Copolymere von PHB-PH-2-Butenoat bildet. Die Bestimmung der Endzusammensetzung von 3-Hydroxybutyratpolymeren durch kontrollierte Fermentation unter Verwendung ausgewählter Substrate ist ebenfalls in der US-A-4 477 654 von Holmes et al. beschrieben.
Da eine Vielzahl von Enzymen, die bezüglich ihrer Substratspezifität variieren, und Verfahren zur Expression der Gene, die für die Enzyme codieren, in anderen Wirten, insbesondere Pflanzen, zur Verfügung stehen, ist es möglich, eine wirtschaftliche, biologisch abbaubare Alternative zu den gegenwärtig verfügbaren, aus Erdöl derivatisierten Kunststoffen, insbesondere Polypropylen bereitzustellen.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist daher die Bereitstellung weiterer Enzyme zur Verwendung bei einem Verfahren zur Synthese von komplexen Biopolymeren, insbesondere PHB, PHA und ähnlichen Polymeren.
Eine weitere Aufgabe dieser Erfindung sind die Isolierung, Sequenzierung und Klonierung zusätzlicher Gene, die für diese Proteine zur Polymersynthese codieren, sowie Maßnahmen zur Regulation der Geschwindigkeit und des Grades der Expression dieser Gene.
Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung gereinigter Proteine, die von den Genen mit Codierung für die Proteine zur Synthese von Polyhydroxybutyrat und Polyhydroxyalkanoat exprimiert werden.
Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung von Verfahren zur Verwendung dieser Proteine und Regulatorsequenzen zur Schaffung neuer Biopolymere mit Polyesterskeletten.
Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung einer wirtschaftlichen Quelle für biologisch abbaubare Polyhydroxyalkanoate und neuartige verwandte Polymere unter Verwendung von sowohl Bakterien- als auch Pflanzenzellen zur Produktion.

Zusammenfassung der Erfindung

Ein Gegenstand der Erfindung ist eine rekombinante Pflanze oder Pflanzenzelle gemäß der Definition in Anspruch 1.
Beispiele zeigen die Isolierung, Charakterisierung und Expression der an der Produktion von PHB- und PHA-Polymeren beteiligten Gene. Gene mit Codierung für die Enzyme beim PHB- und PHA-Syntheseweg (Beta-Ketothiolase, Acetoacetyl- CoA-Reductase und PHB-Polymerase oder PHA-Polymerase) aus Zoogloea ramigera, Stamm I-16-M, Alcaligenes eutrophus, Nocardia salmonicolor und Pseudomonas oleovarans wurden identifiziert oder isoliert und in einem nicht-PHB- produzierenden Organismus, E. coli, exprimiert.
Die Gene werden zur Expression und Synthese von PHB, PHA und neuen Polymeren in Pflanzenzellen eingeführt. Spezielle Modifizierungen der Polymere umfassen eine Variation der Kettenlänge der Polymere und den Einbau unterschiedlicher Monomere in die Polymere zur Erzeugung von Copolymeren mit unterschiedlichen physikalischen Eigenschaften.

Kurze Beschreibung der Zeichnungen

Fig. 1 ist die Thiolasegensequenz von Zoogloea ramigera. Die Sequenzen, die sich an zu den "-10"- und "-35"- Consensus-Regionen von E. coli homologen Positionen stromaufwärts der Transkriptionsstartstelle (fettgedruckter Pfeil) befinden (-100 bis -95 und -122 bis -116), sind unterstrichen. Eine mögliche Ribosomenbindungsstelle ist unterstrichen (-11 bis -8).
Fig. 2 ist die vollständige Nucleotidsequenz aus 2,3 kb von Z. ramigera-DNA, die sich stromabwärts des Thiolasegens im Klon pUCDBK1 befindet und die für die Acetoacetyl-CoA- Reductase codiert. Es ist die von der ersten Sal1-Stelle bis zur zweiten Sma1-Stelle sich erstreckende Sequenz aus 2094 bp angegeben. Ebenfalls angegeben ist das Translationsprodukt des Acetoacetyl-CoA-Reductase-Strukturgens, das sich vom ATG bei Nucleotid 37 bis zum TGA-Stoppcodon bei Nucleotid 760 erstreckt. Die eingerahmten Aminosäurereste 2 bis 6 sind mit denen identisch, die durch Edmanabbau des gereinigten Proteins erhalten wurden. Eine mögliche Ribosomenbindungsstelle ist unterstrichen und ein möglicher Transkriptionsterminator ist durch Pfeile angezeigt. Restriktionsstellen für Sal1 und Sma1 sind angegeben.
Fig. 3 zeigt die Nucleotidsequenz eines entsprechenden 2- kb-Fragments von A. eutrophus-DNA, das in das Plasmid pAeT3 kloniert ist. Es sind die Translationsprodukte der A. eutrophus-Thiolase- und -Acetoacetyl-CoA-Reductasegene, die sich von den Nucleotiden 40 bis 1219 bzw. 1296 bis 2034 erstrecken, angegeben. Die bei der Konstruktion der Überproduktionsvektoren pAT und pAR verwendeten Schnittstellen von Restriktionsendonucleasen sind angegeben. Pst 1 = Pst 1; Ava = 2 und Dde = Dde 1.
Fig. 4 ist die Nucleotidsequenz der PHB-Polymerase (phbC)- Stelle von Alcaligenes eutrophus H16. Das Translationsprodukt des offenen Leserasters von Position 842 bis Position 2608, die vorhergesagte Aminosäuresequenz der PHB- Polymerase, ist angegeben. Ebenfalls angegeben ist das Translationsprodukt der ersten 72 Nucleotide des phbA-Gens. Eine zur Bildung einer Haarnadel Struktur fähige Sequenz (Position 2660) ist durch die Pfeile angegeben.
Fig. 5 zeigt die möglichen Codierungsregionen des P. oleovarans-PHA-Polymerasegens, die offenen Leseraster ORF1, ORF2 und ORF3. ORF1 beginnt beim AGT-Initiationscodon- Nucleotid 554 und endet beim TGA-Stoppcodon-Nucleotid 2231 und codiert für ein Polypeptid mit 559 Aminosäuren mit Mr = 62300 Dalton. ORF2 beginnt beim ATG-Initiationscodon- Nucleotid 2297 und endet beim TAA bei 3146 und codiert für ein Protein mit 283 Aminosäuren mit Mr = 31400 Dalton. ORF3 beginnt beim ATG bei 3217 und endet beim TGA bei 4948 und codiert für ein Protein mit 577 Aminosäuren mit Mr = 64400 Dalton.
Fig. 6 ist die Nucleotidsequenzanalyse des gesamten 6-kb- Fragments, das das P. oleovarans-phbC-Gen enthält.

Detaillierte Beschreibung der Erfindung

Die im folgenden angegebenen Verfahren wurden verwendet, um Gene mit Codierung für Beta-Ketothiolase, Acetoacetyl-CoA- Reductase, PHB-Polymerase und PHA-Polymerase sowie deren Expressionsprodukte zu isolieren, die deren Expression regulierenden Sequenzen zu identifizieren und charakterisieren und die Wirkung der Kulturbedingungen und der Substrat verfügbarkeit auf die Polymerproduktion zu bestimmen. Verfahren zur Konstruktion von Systemen zur Produktion PHB- und PHA-ähnlicher Biopolymere werden ebenfalls beschrieben. Durch Kombination dieser Enzyme Pflanzenzellen mit den entsprechenden Substraten unter kontrollierten Kulturbedingungen bezüglich verfügbarem Sauerstoff und Temperatur kann eine Vielzahl von Polymeren aufgebaut werden. Die Enzyme oder die deren Expression kontrollierenden Nucleotidsequenzen können ebenfalls modifiziert werden, um die Menge der Expression oder die Substratspezifität zu ändern, wodurch ferner die gebildeten Polymere variiert werden. Ein weiterer Vorteil besteht darin, daß Substrate, die normalerweise mit ganzen Zellen nicht verwendet werden können, unter Verwendung der isolierten Enzyme hergestellt werden können.
Die Verfahren, Gene und Produkte ihrer Expression und die Polymersynthese werden detailliert in den folgenden nicht beschränkenden Beispielen beschrieben.

Medien und Kulturbedingungen

Zoogloea ramigera, Stamm I-16M (ATCC 19623) wurde anfänglich zur Untersuchung der Genetik des PHB-Biosynthesewegs verwendet. Z. ramigera-DNA wurde aus 200-ml-Kulturen in der mittleren logarithmischen Phase wie folgt gereinigt: Die Zellen wurden durch Zentrifugation geerntet, in 20 mM Tris- HCl eines pH-Werts von 8,2 gewaschen und in 10 ml Tris-HCl resuspendiert. Die Zellen wurden anschließend durch Zugabe von 10 ml 24%igem (Gew./Vol.) Polyethylenglycol 8000 und 2 ml 25 mg/ml Lysozym in Sphäroplasten überführt und anschließend 30 min bei 37ºC inkubiert. Die Sphäroplasten werden durch Zentrifugation geerntet, in 5 ml TE-Puffer (10 mM Tris-HCl, pH-Wert 8,0, 1 mM EDTA) resuspendiert und mit 300 ml 10%igem (Gew./Vol.) SDS versetzt. Die Zellen wurden dann durch 10minütige Inkubation bei 55ºC lysiert. Weitere 10 ml TE wurden zugegeben und das Lysat wurde 1 h lang bei 37ºC mit RNAse (50 ug/ml) und Proteinase K (30 ug/ml) inkubiert. Die DNA wurde anschließend durch CsCl-Gradientenzentrifugation gereinigt.
E. coli-Stämme wurden in LB (Luria Bertani)-Medium (NaCl, 10 g/l; Trypton, 10 g/l; Hefeextrakt, 10 g/l) oder 2XTY- Medium (NaCl, 5 g/l; Trypton, 16 g/l; Hefeextrakt 10 g/l) gezüchtet. Zur Produktion von PHB oder PHA durch rekombinante Plasmide enthaltende E. coli wurde Minimalmedium verwendet, wobei dieses durch eine Verringerung der (NH&sub4;)&sub2;SO&sub4;- Konzentration auf 0,04% modifiziert wurde.
A. eutrophus-Stämme wurden in Trypticase-Soja-Nährmedium (TSB, BBL Microbiology systems, Cockeysville, Md) oder einem definierten Minimalmedium mit der Zusammensetzung 0,39 g/l MgSO&sub4;; 0,45 g/l K&sub2;SO&sub4;; 12 ml 1,1 M H&sub3;PO&sub4;; 15 mg/l FeSO&sub4;·7 H&sub2;O; 24 ml Spurenelemente (20 mg/l CuSO&sub4;·5 H&sub2;O; 100 mg/l ZnSO&sub4;·6 H&sub2;O; 100 mg/l MnSO&sub4;·4 H&sub2;O; 2,6 g/l CaCl&sub2;·2 H&sub2;O) gezüchtet. Der pH-Wert wurde mit NaOH auf 6,8 eingestellt und das Medium wurde im Autoklaven sterilisiert. NH&sub4;Cl wurde bis zu einer Endkonzentration von 0,1% oder 0,01% als Stickstoffquelle und Fructose bis zu einer Endkonzentration von 0,5-1% (Gew./Vol.) zugesetzt.
Plasmid-DNA-Präparationen wurden unter Verwendung des Verfahrens von Birnboim und Doly in Nucleic Acids Res., 7, 1513-1523 (1979), nach der Beschreibung von Ish-Horowicz und Burke, Nucleic Acids Res., 9, 2989-2998 (1981), durchgeführt. Lambda-DNA wurde nach Standardverfahren, die in Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY 1982), beschrieben sind, hergestellt. Die DNA-Sequenzanalyse wurde unter Verwendung der Klonierungsvektoren M13mp18 und M13mp19 (Yanisch-Perron et al., Gene 33, 103- 109 (1985)) und des Didesoxykettenterminationsverfahrens von Sanger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74, 5463-5467 (1997), durchgeführt. α-[³&sup5;S]-dATP und das Klenow-Fragment von DNA-Polymerase 1 wurden von Amersham bezogen. Die Sequenzdaten wurden auf einem VAX-System compiliert und analysiert.
Eine Rekombinationsbibliothek zufälliger Z. ramigera- Chromosomen-DNA-Fragmente wurde unter Verwendung des Lambda-gt11-Expressionsvektors nach der Beschreibung von Young und Davis, Science, 222, 778-782 (1983), konstruiert. Z. ramigera-DNA wurde zunächst unter Verwendung von EcoRI- Methylase methyliert und dann partiell mit DNAse1 in Gegenwart von Mg²&spplus; nach den Lehren von Anderson, Nucleic Acids, 9, 3015-3026 (1981), verdaut. Die Enden der partiell verdauten DNA-Fragmente wurden unter Verwendung von Klenow- Polymerase ausgebessert und mit EcoRI-Linkern versehen. Dann wurde die DNA vollständig mit einem Überschuß von Eco-RI verdaut. Fragmente einer Größe von 2-8 kb wurden auf einem 1,5%-Agarosegel nach der Größe selektiert, durch Elektroelution gereinigt und mit EcoRI-verdauter phosphorylierter. Lambda-gt11-DNA ligiert. Die Ligationen wurden 18 h lang bei 4ºC unter Einsatz von 2 ug Lambda-gt11-DNA und 1 ug fragmentierter chromosomaler DNA in einem Gesamtvolumen von 10 ul durchgeführt. Das Ergebnis der Ligationsreaktionen wurde unter Verwendung von aus den E. coli-Stämmen BHB2688 und BHB2690, Hohn und Murray, Proc. Natl. Acad. Sci., USA. 74, 3259-3263 (1977), hergestellten Lambdaextrakten gemäß der Beschreibung von Maniatis et al. (1982) in vitro verpackt. Die gepackte Phage wurde ausplattiert und auf E. coli Y1088 amplifiziert.
Das Durchmustern der Lambda-gt11-Expressionsbibliothek wurde unter Verwendung von Anti-Thiolase-Antikörpern von Kaninchen und einer Modifikation des von Young und Davis, Science, 222, 778-782 (1983), beschriebenen Verfahrens durchgeführt.
Restriktionsendonucleasen, T4-DNA-Ligase und DNA-Polymerase 1 wurden von New England Biolabs erhalten und unter den vom Hersteller angegebenen Bedingungen eingesetzt. Alkaliphosphatase aus Kalbseingeweiden wurde von Boehringer Mannheim Corporation bezogen. Alle Routinemanipulationen von DNA einschließlich der Plasmidreinigungen, E. coli-Transformationen und dergleichen wurden unter Verwendung der von Maniatis et al. (1982) beschriebenen Verfahren durchgeführt. Chromosomale DNA wurde aus A. eutrophus-Stämmen, die bis zur späten logarithmischen Phase in TSB wachsengelassen wurden, gereinigt. Die Übertragung von restriktionsverdauten DNA-Proben von Agarosegelen auf Nitrocellulosefilter, die Vorhybridisierung und Hybridisierung mit ³²P-markierten DNA-Sonden erfolgte nach der Beschreibung von Peoples et al., J. Biol. Chem. 262, 97-102 (1987). Die schnelle Plasmidisolierung aus rekombinanten A. eutrophus-Stämmen zur Restriktionsanalyse wurde nach dem alkalischen Extraktionsverfahren von Birnboim und Doly, Nucleic Acids Res. 7, 1513-1523 (1979), durchgeführt.

Konjugation in A. eutrophus

Die Konjugationsübertragung des Plasmids mit einem breiten Wirtsbereich pLAFR3 oder der rekombinanten Derivate von pLAFR3 in A. eutrophus wurde nach dem von Easson et al., J. Bacteriol. 169, 4518-4524 (1987), beschriebenen Verfahren durchgeführt. In diesem Fall wurden jedoch die aufnehmenden A. eutrophus-Zellen nicht ultraschallbehandelt und die Transkonjuganten wurden auf mineralischen Agarplatten mit A. eutrophus, die 0,01% NH&sub4;Cl als Stickstoffquelle, 1% (Gew./Vol.) Fructose als Kohlenstoffquelle und 10 ug/ml Tetracyclin enthielten, selektiert.
Zur Tn5-Mutagenese wurde ein spontan streptomycinresistenter Stamm von A. eutrophus 11599 (1599 S1) verwendet. Die Übertragung von pRK602 (Tn5) wurde wie im vorhergehenden geschildert durchgeführt, wobei E. coli MM294A (pRK602) als der einzige Donor verwendet wurde. Tn5 enthaltende A. eutrophus-Stämme wurden anhand von Wachstum auf Streptomycin (500 ug/ml) und Kanamycin (100 ug/ml) selektiert.

Identifizierung des Z. ramigrera-Thiolasegens

Thiolase-Antiserum wurde in weiblichen Neuseeländischen Weißen Riesen unter Verwendung von gereinigtem Thiolaseprotein nach Standardverfahren hergestellt. Der Antikörpertiter wurde mittels des Ouchterlony-Doppeldiffusionstests, Acta Pathol. Microbiol. Scand. 26, 507-515 (1949), bestimmt. Gereinigter Antikörper wurde aus dem Serum durch Chromatographie auf Protein-A-Agarose gemäß Bighee et al., Mol. Immunol. 20, 1353-1357 (1983), gewonnen. Etwa 4 · 10&sup4; an E. coli Y1090 adsorbierte rekombinante Phagen wurden auf 15-cm-LB-Agarplatten ausplattiert und 3 h lang bei 42ºC inkubiert. Auf die Platten wurden dann Nitrocellulosefilter (Schleicher & Schuell, BA85), die zuvor mit 10 mM IPTG gesättigt worden waren, gelegt und das Ganze wurde weitere 4 h lang bei 37ºC inkubiert. Die Filter wurden entfernt, 10 min lang in TBST (50 mM Tris-HCl, pH 7,9, 150 mM NaCl, 0,05% Tween-20) gewaschen, in TBST mit 20% (v/v) fetalem Kalbsserum 30 min lang inkubiert und in TBST gespült. Der erste Antikörper wurde durch Inkubieren der Filter in 10 ml TBST mit gereinigtem Anti-Thiolase-Antikörper (10ul) während 1 h bei Raumtemperatur gebunden. Die Filter wurden anschließend gewaschen, wobei nach jeweils 5 min TBST gewechselt wurde. Der gebundene erste Antikörper wurde unter Verwendung eines Biotin-Avidin-Meerrettichperoxidase- Nachweissystems (Clontech Laboratories) und eines Meerret tichperoxidasefarbentwicklungsreagens (Bio-Rad Laboratories, Richmond, VA) nachgewiesen.
Die Proteine wurden durch Natriumdodecylsulfat/Polyacrylamidgelelektrophorese gemäß dem Verfahren von Laemmli, Mature 222, 680-685 (1970), aufgetrennt und elektrophoretisch auf Nitrocellulosefilter (Schleicher & Schuell, BA85) im wesentlichen gemäß der Beschreibung von Burnette, Anal. Biochem. 112, 195-203 (1981), übertragen. Nach der Übertragung über Nacht bei 30 V wurden die Filter in TBS (TBST ohne Tween-20) gespült und in TBS mit 5% Rinderserumalbumin inkubiert. Mit Antithiolaseserum reagierende Proteine wurden anschließend durch 1- bis 2stündiges Inkubieren der Filter in 100 ml TBS, 1% Gelatine, das 2 ml Antithiolaseserum enthielt, nachgewiesen. Der gebundene erste Antikörper wurde anschließend unter Verwendung von Anti-Kaninchen- IgG-Meerrettichperoxidase-Konjugat von Ziegen und Meerrettichperoxidasefarbentwicklungsreagens (Bio-Rad Laboratories, Richmond, CA) nachgewiesen.
DNA-Blots wurden unter Verwendung von auf Agarosegelen aufgetrennten DNA-Fragmenten nach dem Sandwich-Blotting- Verfahren von Smith und Summers, Anal. Biochem. 109, 123- 129 (1980), das auf der von Southern, J. Mol. Biol., 98, 503-517 (1975) entwickelten Technik beruht, hergestellt. Die Filter wurden mit DNA-Sonden, die bis zu einer hohen spezifischen Aktivität (0,1-1 · 10&sup8; cpm/ug DNA) mit [α- ³²P]dATP durch Nick-Translation markiert waren, hybridisiert (Rigby et al., J. Mol. Biol., 113, 237-251 (1977)). Die Vorhybridisierungen und Hybridisierungen wurden bei 65ºC in versiegelten Polythentaschen durchgeführt. Die Vorhybridisierungs/Hybridisierungslösung enthielt 5 · SSCP (1 · SSCP enthält 0,15 M NaCl, 0,15 M Natriumcitrat, 10 mM Na&sub2;HPO&sub4;, 10 mM NaH&sub2;PC), 5 · Denhardt-Lösung, 0,1% (Gew./Vol.) SDS, 10 mM EDTA und 100 ug/ml ultraschallbehan delte denaturierte Lachs-DNA. Die Filter wurden 8-18 h lang vorhybridisiert und 16-18 h lang hybridisiert, wobei 10&sup7; cpm markierte DNA-Sonde pro Filter verwendet wurden.
Die Lysogene der rekombinanten Lambda-gt11-Kl one wurden in E. coli Y1089 gemäß der Beschreibung von Young und Davis, Science 222, 778-782 (1983), hergestellt. Zur Herstellung und Analyse Lambda-codierter Proteine wurden Lysogene bei 30ºC in LB (100 ml) wachsengelassen, bis sie einen OD&sub6;&sub0;&sub0;- Wert von 0,5 erreichten. Der Prophage wurde durch eine 20minütige Inkubation bei 45ºC induziert, mit bis zu 5 mM IPTG versetzt, worauf die induzierten Lysogene 1 h lang bei 37ºC inkubiert wurden. Die Zellen wurden geerntet, in Testpuffer (0,1 M Tris-HCl, pH-Wert 7,5, 5 mM Beta- Mercaptoethanol, 5% (v/v) Glycerin) resuspendiert, durch Ultraschallbehandlung lysiert, der Zellabfall wurde durch Zentrifugation pelletisiert und die Zellextrakte wurden bei -20ºC gelagert. Die Proteinkonzentrationen der Bakterienlysate wurden nach dem Verfahren von M. M. Bradford in Anal. Biochem. 72, 248-254 (1976), unter Verwendung von Rinderserumalbumin als Standard getestet. Thiolase- Enzymtests wurden gemäß der Beschreibung von Nishimura et al., Arch. Microbiol. 116, 21-27 (1978), durchgeführt.
DNA-Fragmente wurden in die M13-Vektoren mp10 und mp11 kloniert und durch das Didesoxykettenterminationsverfahren von Sanger et al., Nucleic Acids Res. 10, 141-158 (1980), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74, 5463-5467 (1977), sequenziert. Der M13-Sequenzierungsprimer und andere Reagenzien wurden von Amersham Corp. bezogen. G/C-reiche Regionen wurden unter Verwendung von dITP anstelle von dGTP gemäß der Beschreibung von Mills und Kramer, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76, 2232-2235 (1979), resequenziert. Die computergestützte Sequenzanalyse wurde unter Verwendung der Staden-Programme, Nucleic Acids Res. 10, 141-158 (1984), durchgeführt.
Etwa 2 · 10&sup5; Rekombinanten wurden aus 1 ug gereinigter Target-DNA erhalten und in E. coli Y1088 amplifiziert. Insgesamt 10&sup5; amplifizierte Phagen wurden unter Verwendung von gereinigten Anti-Thiolase-Antikörpern von Kaninchen durchmustert. Bei der anfänglichen Durchmusterung wurden 10 möglicherweise positive Klone (LDBK1-LDBK10) identifiziert. Die Analyse mittels Restriktionsverdauungen zeigte, daß die Klone LDBK2-10 identisch sind. Die Klone LDBK1 und LDBK2 wurden zur weiteren Untersuchung ausgewählt. LDBK1 weist ein aus 2 EcoRI-Fragmenten mit 3,6 kb und 0,75 kb zusammengesetztes Insert auf. LDBK2 weist ein aus 3 EcoRI-Fragmenten mit 1,65 kb und 1,08 kb zusammengesetztes Insert auf.
Die durch die LDBK1- und LDBK2-Insertionssequenzen codierten Proteine wurden sowohl bezüglich der Thiolaseenzymaktivität als auch der Kreuzreaktion mit Kaninchen- Antithiolaseserum analysiert. Es wurden lysogene Stämme von E. coli Y1089, die LDBK1- und LDBK2-Phagen-DNA enthielten, hergestellt. Es wurden für jeden Klon mehrere Lysogene erhalten. Zwei von diesen, Y1089/LDBK1 und Y1089/LDBK2, wurden für anschließende Untersuchungen verwendet. Ein Lysogen des Lambda-gt11-Vektors, BNN97/Lambda-gt11, wurde als Kontrolle verwendet. Die Ergebnisse der Thiolaseenzymtests zeigen deutlich, daß die Proteine von Y1089/LDBK1 eine beträchtliche Menge an Thiolaseaktivität enthalten. Ferner ist die Thiolaseaktivität durch die Zugabe von IPTG auf das mehr als Fünffache induzierbar. Dies zeigt, daß die Expression der thiolasecodierenden Sequenzen unter der Transkriptionskontrolle des im Lambda-gt11-Vektor enthaltenen lac- Promotors steht. Weder die Y1089/LDBK2- noch die BNN97/Lambda-gt11-Proteinlysate zeigen selbst bei Induktion mit IPTG irgendeine deutliche Thiolaseenzymaktivität.
Die Größe der für die ursprüngliche positive Reaktion auf Kaninchen-Anti-Thiolase-Antikörper verantwortlichen Proteine wurde durch Western-Blotting-Experimente untersucht. Proteinlysate wurden durch SDS/Polyacrylamidgelelektrophorese aufgetrennt, auf Nitrocellulosefilter übertragen und mit Kaninchen- Antithiolaseserum durchmustert. Die Ergebnisse zeigen ein immunreaktives Protein mit 40000 Dalton sowohl im IPTG- induzierten als auch im nicht-ITPG-induzierten Lysat von Y1089/LDBK1.
Das LDBK1-Insert wurde einer Restriktionskartierung unterzogen. Das große 3,6-kb-EcoRI-Fragment, das die gesamte Thiolasegenregion enthält, wurde zur leichteren Manipulation in den Plasmidvektor pUC8 subkloniert. Die Restriktionsanalyse eines der erhaltenen Subklone, von pUCDKB1, bestätigte die Restriktionskarte dieses Fragments in LDBK1. pUCDBK1-DNA wurde bis zu einer starken spezifischen Aktivität mit ³²P markiert und mit Nitrocellulosefiltern hybridisiert, die Z. ramigera-Chromosomen-DNA, die mit den gleichen zur Restriktionskartierung von pUCDBK1 verwendeten Enzymen verdaut worden war, enthielten. Southern-Hybridisierungsexperimente bestätigen, daß das 5,4-kb-Genomfragment sowohl mit einem 1,45-kb-SalI/EcoRI- als auch dem 1,05-kb- SalI-Fragment von pUCDBK1 hybridisiert. Auf der Grundlage des Ergebnisses des Southern-Hybridisierungsexperiments ist das klonierte pUCDBK1-Insert in dem Z. ramigera-Genom nur einmal enthalten.
Die DNA-Sequenzanalyse des pUCDBK1-Inserts wurde unter Verwendung des M13/Sanger-Didesoxykettenterminationsverfahrens durchgeführt. Zur Lokalisierung der Gencodierungsregion wurden einzelne DNA-Sequenzen in allen sechs Leserastern bezüglich Homologie zur NH&sub2;-terminalen Aminosäuresequenz durchmustert. Unter Verwendung dieses Ansatzes wurde die Gencodierungsregion innerhalb des 1,45-kb-EcoRI/SalI- Fragments identifiziert. Die vollständige Nucleotidsequenz des Plus-Strangs des Gens ist in Fig. 1 angegeben. 290 bp stromabwärts der EcoRI-Stelle liegt der Anfangspunkt des Thiolase-Strukturgens, was durch Vergleich der DNA-Sequenz mit der NH&sub2;-terminalen Aminosäuresequenz zugeordnet wurde. Die NH&sub2;-terminale Sequenz liegt in dem einzelnen langen offenen Leseraster, das sich von Position -89 bis zum Stoppcodon (TAG) bei Nucleotid 1174 erstreckt. Beginnend mit einem Serin und über 25 Reste hinweg ist die experimentell bestimmte NH&sub2;-terminale Sequenz identisch zu den Resten 2 bis 26 der translatierten DNA-Sequenz angeordnet. Die Translation der DNA-Sequenz wurde anschließend zur Ableitung der übrigen Aminosäuresequenz von Rest 27 bis 391 (Nucleotide 79 bis 1173) verwendet. Die Translation der DNA-Sequenz von Nucleotid 1 bis 1174 (in diesem Leseraster) codiert daher für ein Polypeptid mit 391 Aminosäuren mit einem berechneten Mr von 40598. Dieser Wert ist in sehr guter Übereinstimmung mit dem durch SDS/Polyacrylamidgelelektrophorese bestimmten Wert von Mr von 42000.
Zwei weitere Beweisstücke bestätigen, daß dieses Translationsprodukt die korrekte Aminosäuresequenz von Thiolase darstellt. Erstens lokalisierte eine Suche nach der vorhergesagten Aminosäuresequenz für das Peptid der aktiven Stelle (NH&sub2;-Gly-Met-Asn-Gln-Leu-Cys-Gly-Ser-Gly-COOH) dieses Peptid bei den Resten 84-92. Und schließlich sind die aus dem Translationsprodukt vorhergesagte Aminosäurezusammensetzung und die experimentell bestimmte in ausgezeichneter Übereinstimmung. Der G/C-Gehalt des 1,46-kb-EcoRI-SalI-Fragments ist hoch, nämlich 66,2%. Bei getrennter Betrachtung weisen die 5'-flankierenden 290 bp einen G/C-Gehalt von 57,4% und die Strukturgenregion einen Gehalt von 68,4% auf. Die Aminosäuresequenz bestätigt, daß die Z. ramigera-Thiolase 5 Cysteinreste enthält. Das Cystein der aktiven Stelle von Z. ramigera liegt bei Rest Cys-89. Weitere Cysteine, die an Inter- oder Intradisulfidbindungen beteiligt sein können, sind Cys-125, Cys-323, Cys-377 und Cys-387. Die NH&sub2;- terminale Sequenzanalyse ergab ein Serin an Position 1.
Sieben Nucleotide stromaufwärts des ATG-Startcodons befindet sich eine potentielle Ribosomenbindungsstelle, 5'- CTGAGGA-3', die durch Homologie mit der E. coli-Sequenz identifiziert wurde. Weitere Startcodons einschließlich zweier GTGs, die die Translation in einigen Bakteriengenen initiieren können, befinden sich weiter stromaufwärts. Bei der Untersuchung der 5'-flankierenden Region bezüglich Homologie mit den "-10"- und "-35"-E. coli-Promotorelementen wurde eine potentielle "-35-Region" bei den Resten -122 bis -116 und eine entsprechende "-10-Region", 5'-TATAAT-3', bei Position -100 bis -95 identifiziert. Ein Poly(T)-Trakt bei Position -255 bis -266 ist ebenfalls vorhanden. Es ist klar, daß die einzige Bearbeitung von Thiolase nach der Translation in der Entfernung des N-Formylmethioninrests besteht, da alternative Startcodons, ATC oder GTG, entweder außerhalb des Rasters liegen oder vor dem Anfangspunkt des Strukturgens einen Stoppcodon innerhalb des Rasters auf weisen.
Das 1,5-kb-Sal1-EcoR1-Fragment von pUCDBK1 enthält das gesamte Z. ramigera-Thiolasestrukturgen plus 283 bp der 5'- flankierenden DNA. Es wurde eine Reihe von Plasmidkonstruktionen durchgeführt, bei denen dieses DNA-Fragment in den tac-Promotorvektor pKK223-3 (oder Derivate hiervon) insertiert wurde. pZT3 wurde durch Schneiden von pUCKBK1 mit Sal1, Glätten der Enden mit Klenow-Polymerase und Hinzufügen von EcoR1-Linkern hergestellt. Nach der Verdauung mit EcoR1 wurde das 1,5-kb-Fragment über eine Agarosegel gereinigt und in die EcoR1-Stelle von pKK223-3 insertiert. Rekombinante Klone, in denen das Gen in korrekter Orientierung in Bezug auf den tac-Promotor insertiert ist, wurden durch Restriktionsanalyse im Anschluß an eine Transformation von E. coll JM105 identifiziert.
Anschließend wurde eine Reihe von Klonen, in denen in den das 5'-Ende des Thiolasegens flankierenden 283 bp Sequenzen deletiert waren, konstruiert. pUCDBK1-DNA wurde mit EcoR1 verdaut und mit Bal31-Nuclease behandelt. Nach der Verdauung mit Sal1 wurden die Enden der Fragmente mit Klenow ausgebessert und EcoR1-Linker hinzugefügt. Die Plasmid-DNA wurde mit EcoR1 gespalten und Fragmente im richtigen Größenbereich, 1,2-1,4 kb, wurden über ein Agarosegel gereinigt und in die EcoR1-Stelle von pKK223-3 ligiert. Die interessierenden Klone wurden durch Restriktionskartierung identifiziert und das Ausmaß der 5'-Deletion wurde durch DNA-Sequenzierung bestimmt. In dieser Serie von Klonen, pZT3.1-pZT3.5, verblieben beim Klon mit der größten Deletion, pZT3.5, 84 bp der 5'-flankierenden DNA und es wurde daher ein anschließendes Bal31-Deletionsexperiment wie folgt durchgeführt: pZT3.5-DNA wurde mit EcoR1 vollständig verdaut und mit Bal31-Nuclease behandelt; die Enden wurden unter Verwendung von Klenow-Polymerase ausgebessert und mit EcoR1-Linkern ligiert. Es folgte eine vollständige Verdauung mit EcoR1 und BamH1. Die der NH&sub2;-terminalen Region von Thiolase entsprechenden Fragmente wurden aus einem Agarosegel eluiert, mit M13mp-11-DNA, die mit BamH1-EcoR1 verdaut worden war, ligiert und auf E. coli JM101 ausplattiert. Einzelsträngige DNA wurde aus 50 Transformanten präpariert und das Ausmaß der 5'-Deletion wurde durch T-Tracking analysiert. Doppelsträngige DNA wurde in vitro aus interessierenden Klonen präpariert und die EcoR1-Bam1-Inserts wurden durch Restriktionsverdauung und Elution aus einem Agarosegel wiedergewonnen.
Zur Rekonstruktion des intakten Thiolasegens wurde das 290- bp-BamH1-HindIII-Fragment von pZT3.5 in einen durch Deleti on der BamH1-Stelle stromaufwärts des tac-Promotors von pKK223-3 abgeleiteten Vektor (pKK226) ligiert; dieser C- terminale Vektor wurde anschließend zur Rekonstruktion der interessierenden NHa-Termini der Deletion durch Bal31 verwendet; die Klone pZT3.5.1 und pZT3.5.2 wurden in anschließenden Untersuchungen verwendet.
Die Wirkung der Deletion von Sequenzen in den 283 bp von DNA, die den Thiolase-ATG-Translationsinitiationscodon flankieren, wurde durch Analysieren des Grades der Thiolaseaktivität, die von den Plasmiden pZT3.1-pZT3.5.2 erzeugt wurde, bestimmt. 100-ml-Kulturen von E. coli JM105, die die einzelnen Plasmide enthielten, wurden mit ITPG 15 h lang induziert und bezüglich des Thiolasegrads getestet. Das herausragendste Merkmal bei diesen Ergebnissen ist der sehr hohe Grad an Thiolaseexpression, der mit den Klonen pZT3.3-pZT3.5-2 erhalten wurde, wobei das Maximum bei 178 U/mg für pZT3.5 erreicht wurde. Dies stellt eine Zunahme um das 5,9-fache im Vergleich zu Plasmid pZT3, das die gesamten 283 bp der 5'-flankierenden DNA enthält, dar. Die Daten zeigen, daß die zwischen -84 (pZT3.5) und -168 (pZT3.2) gelegenen, die Thiolase 5'-flankierenden Sequenzen die Expression des Thiolasegens mit dem tac-Promotor stark hemmen. Die Lokalisierung dieser Sequenzen läßt sich auf den Bereich zwischen -84 (pZT3.5) und -124 (pZT3.4) einengen, da die Deletion dieser Region zum maximalen Grad einer tac- gesteuerten Thiolaseexpression führt. Weitere Deletionen bis -37 (pZT3.5.1) und -26 (pZT3.5.2) erhöhen der Grad der Thiolaseexpression nicht und es wird tatsächlich eine geringe Abnahme beobachtet. Es ist wichtig festzustellen, daß der zeitliche Verlauf der Induktion für diese Reihe von Klonen der gleichen Kinetik wie bei pZT3 folgt und durch die Deletionen nicht merklich beeinflußt wird.
Um zu bestimmen, ob der Thiolasepromotor in der Region von -84 (pZT3.5) bis -124 (pZT3.4) liegt, wurden S1-Nuclease- Schutzexperimente gemäß dem Verfahren von Berg und Sharp, Cell 12, 721-732 (1977) an Z. ramigrera-RNA durchgeführt. Die gesamte RNA wurde aus einer 100-ml-Kultur in der mittleren logarithmischen Phase durch das heißes Phenol/Glasperlen-Extraktionsverfahren von Hinnenbusch et al., J. Biol. Chem. 258, 5238-5247 (1983), isoliert. Die 5'-³²P- markierte DNA-Sonde wurde wie folgt hergestellt: 10 g Plasmid-pZT3.1-DNA wurde vollständig mit Ava1 verdaut und anschließend mit CIP behandelt; die Ava1-Restriktionsfragmente wurden am 5'-Ende mit [gamma-³²P]-ATP und Polynucleotidkinase markiert; nach einer EcoR1-Verdauung wurde die DNA auf einem 8%-Acrylamidgel aufgetrennt und das ³²P-markierte Sondenfragment mit 280 bp eluiert und durch Ethanolfällung wiedergewonnen. Die Sonde (10000 cpm) und 11 ug RNA wurden gepoolt, gefriergetrocknet, in 10 ug Hybridisierungspuffer (40 mM Röhrchen, pH-Wert 6,4; 1 mM EDTA, pH- Wert 8,0; 0,4 M NaCl; 80% (v/v) Formamid) resuspendiert, 10 min bei 90ºC denaturiert und über Nacht bei 55ºC reassoziieren gelassen. 235 ul eisgekühlter S1-Nucleasepuffer (0,25 M NaCl; 30 mM NaOAc; 1 mM ZnSO&sub4;; 200 ug einzelsträngige Kalbsthymus-DNA), der 2000 Einheiten S1-Nuclease enthielt, wurden zugesetzt und das Ganze anschließend 30 min bei 37ºC inkubiert. Das Reaktionsgemisch wurde einmal mit Phenol/Chloroform extrahiert und in Gegenwart von 0,2 M NaOAc und 10 ug Hefe-tRNA-Träger einer Ethanolfällung unterzogen. Die hierbei erhaltenen Fragmente wurden auf einem DNA-Sequenzierungsgel mit 6% (Gew./Vol.) Acrylamid, 7 M Harnstoff analysiert. Für Größenstandards wurden die Maxam- Gilbert-G- und -C-Sequenzierungsreaktionen an 50000 cpm 5'- ³²P-markierter Sonden-DNA durchgeführt. Die Ergebnisse zeigen deutlich ein geschütztes Fragment und daß die RNA- Startstelle sich am C- oder T-Rest, Position -86 oder -87, befindet. Eine Kontrolle zeigt, daß bei Abwesenheit von Z. ramigera-RNA die Sonde vollständig abgebaut wird, was auf das Vorhandensein der Thiolasepromotorregionen etwa 10 bp (-96) und 35 bp (-121) stromaufwärts zeig. Die nichttranslatierte 5'-Region der Thiolase ist 86 bp lang.
Aus den Ergebnissen der Induktionsexperimente wird deutlich, daß das Thiolasegen in hohem Grade in einer löslichen katalytisch aktiven Form in E. coli exprimiert werden kann. S1-Nucleaseuntersuchungen kartieren die Transkriptionsstartstelle für das Thiolasegen in Z. ramigera bei den Nucleotiden -86/-87.
Untersuchungen ergaben, daß zwar eine "-35"-Region des Thiolasepromotors erkannt wird und diese die RNA-Polymerase bindet, jedoch die "-10"-Region die Rate der Transkriptionsinitiation bestimmt. Im Falle von pZT3 führt beispielsweise die gleichzeitige Bindung eines RNA- Polymerasemoleküls an sowohl den Vektor als auch die Insertpromotoren zu einer raschen Initiation der Transkription durch den tac-Promotor, was anschließend durch die Gegenwart des an den Zoogloea-Promotor gebundenen Polymerasemoleküls gehemmt wird. Je näher die beiden Promotoren gebunden sind, desto geringer ist die Möglichkeit der gleichzeitigen Bindung von Polymerase an beide und desto geringer ist die Hemmung. Dies stellt daher ein Mittel zur Kontrolle der Expressionsrate des Enzyms dar.

Identifizierung des Z. ramigera-Reductasegens

Nach der Identifizierung der Promotorregion des Thiolasegens und der Feststellung, daß mögliche Terminatorsequenzen stromabwärts des Thiolase-TAG-Stoppcodons nicht vorhanden sind, wurden die restlichen 2 kb der im Klon pUCDBK1 vorhandenen Zoogloea-DNA sequenziert und bezüglich des Reductasegens geprüft. Eine Reihe von Expressionsplasmiden (pZT1-pZT3), die entweder das gesamte pUDCBKl-Insert oder Fragmente hiervon enthielten, wurden in dem E. coli-tac- Promotorvektor pKK223.3 konstruiert. In jedem Plasmid befindet sich das Thiolasegen in der zur Expression durch den tac-Promotor korrekten Orientierung. Es ist wohl zu erwarten, daß der tac-Promotor nicht nur die Expression von Thiolase sondern die Expression jeglicher in den stromabwärts gelegenen 2,3 kb lokalisierter Gene in einer Operon- ähnlichen Organisation steuert. Der Klon pZT1 wurde konstruiert, indem das gesamte 3,8-kb-EcoR1-Z. ramigera-DNA- Insert von pUCDBK1 in die EcoR1-Stelle des Vektors pKK223-3 insertiert wurde. Anschließend wurde pZT2 in direkter Weise durch Deletion des 850-bp-Sma1-Fragments von pZT1 abgeleitet. pZT3 wird gemäß der Beschreibung zur Indentifizierung des Thiolasepromotors konstruiert. Eine Reihe von tac- Promotor-Induktionsexperimenten wurde mit jedem der rekombinanten Klone pZT1, pZT2 und pZT3 durchgeführt. Der Vektor pKK223-3 wurde als Kontrolle verwendet.
E. coli-Zellen, die die einzelnen Plasmide enthielten, wurden durch die Zugabe von Isopropyl-beta-D-galactopyranosid (IPTG) bis zu einer Endkonzentration von 2 mM gezüchtet und induziert. Nach 15stündiger Induktion wurden Kulturen von 10 ml geerntet und durch Ultraschallbehandlung lysiert. Die Zelllysate jedes Klons wurden anschließend sowohl durch Enzymtest als auch über SDS-PAGE analysiert. Bei keinem dieser Lysate wurde eine PHB-Polymeraseaktivität nachgewiesen. Alle drei rekombinanten Plasmide pZT1, pZT2 und pZT3 zeigen beträchtliche Grade von Thiolaseaktivität. Ferner zeigen die Lysate von pZT1 und pZT2 vergleichbar hohe Grade von AcAc-CoA-Reductaseaktivität bei Verwendung von NADPH als Cofaktor. In keinem der Lysate wird Reductaseaktivität nachgewiesen, wenn NADH als Cofaktor verwendet wird. Die Kontrolle, pKK223-3, weist weder Thiolase- noch Reductaseaktivitäten auf. Zur Bestätigung, daß die Lysate von pZT1 und pZT2 tatsächlich die richtige Reductase enthalten, wur den diese Lysate auch bezüglich Oxidation von D(-)-Beta- Hydroxybutyryl-CoA getestet. In beiden Fällen wurde mit NADP als Elektronenakzeptor eine Enzymaktivität beobachtet.
Jedes der im vorhergehenden beschriebenen Lysate wurde auch durch SDS-PAGE analysiert. Die Ergebnisse zeigen das Vorhandensein des Thiolaseproteins bei etwa 42000 Dalton in den Proteinlysaten von pZT1, pZT2 und pZT3, wobei dieses in der Kontrolle, pKK223-3, nicht vorhanden ist. Die Lysate von pZT1 und pZT2 weisen auch ein kleines Protein mit 25000 Dalton auf, das in dem Lysat von pZT3 oder der Kontrolle nicht vorhanden ist und das der AcAc-CoA-Reductase entspricht. Die Ergebnisse zeigen, daß das AcAc-CoA-Reductasegen stromabwärts des Thiolasegens lokalisiert ist. Das gesamte Strukturgen für dieses Enzym muß zwischen dem 3'-Ende der Thiolase und der ersten Sma1-Stelle stromabwärts in pUCDBK1 lokalisiert sein.

Identifizierung der Translationsstartstelle und Überexpression des Reductasegens

Die gesamte Nucleotidsequenz mit 2339 bp, die sich 2,3 kb stromabwärts der ersten Sal1-Stelle in pUCDBK1 befindet, ist in Fig. 2 angegeben. Die Computeranalyse der Sequenzdaten, bei der die Information über die Verwendung von Codons aus dem Thiolasegen als Standard verwendet wurde, identifizierte 3 offene Leseraster. Die Daten der N-terminalen Proteinsequenz wurden aus dem in induzierten Lysaten von pZT1 und pZT2 nach präparativer SDS-PAGE und Elektroelution vorliegenden 25000-Dalton-Band erhalten. Diese Daten wurden, zur Bestätigung der Translationsstartstelle für das entsprechende Gen verwendet. Die experimentell bestimmten N- terminalen fünf Aminosäuren stimmen mit den aus der DNA- Sequenz des ersten offenen Leserasters vorhergesagten Resten 2 bis 6 überein. Die Translation dieses offenen Le serasters sagt ein Polypeptid mit einem Molekulargewicht von 25000 voraus. Das Translationsprodukt des ersten offenen Leserasters, das bei ATG, Nucleotid 37, beginnt und am TGA-Stoppcodon-Nucleotid endet, ist in Fig. 2 angegeben. Dies ist die vorhergesagte primäre Aminosäuresequenz des Acetoacetyl-CoA-Reductaseproteins.
Es ist offensichtlich, daß das Acetoacetyl-CoA-Reductasegen in den Klonen pZT1 und pZT2 in ziemlich hohen Graden in E. coli exprimiert werden kann. In diesen beiden Fällen ist jedoch die Expression des Reductasegens über den tac- Promotor aufgrund des Vorhandenseins des Thiolasestrukturgens und der 5'-flankierenden Sequenz nicht optimal. Es wurde ein einfacherer Acetoacetyl-CoA-Reductaseüberproduktionsvektor pZR14 konstruiert. pUCDBK1-DNA wurde vollständig mit Sal1 und Sma1 verdaut und die Sal1-Enden wurden unter Verwendung des Klenow-Fragments von DNA- Polymerase ausgebessert. Es folgte die Zugabe von EcoR1- Linkern und die Verdauung mit EcoR1 und dann die Auftrennung der Fragmente durch Agarosegelelektrophorese. Das 1,05-kb-Fragment, das dem Acetoacetyl-CoA-Reductase- Strukturgen plus 36, das 5'-Ende flankierenden bp und 266, das 3'-Ende flankierenden bp entsprach, wurde gereinigt und an die EcoR1-Stelle von pKK223-3 ligiert. pZR14 wurde anschließend als die korrekte Restriktionskarte mit dem Reductasegen in der richtigen Orientierung aufweisend identifiziert. Es wurden Induktionsexperimente an pZR14 gemäß der Beschreibung für pZT1, pZT2 und p ZT 3 durchgeführt. Acetoacetyl-CoA-Reductase wurde exprimiert.

Identifizierung der Thiolase- und Reductasegene in A. eutrophus

Die bei der Isolierung der ersten beiden PHB-Gene von Zoogloea verwendeten Verfahren wurden zur Identifizierung, Isolierung und Charakterisierung von Genen einer anderen, PHB erzeugenden Art, Alcaligenes eutrophus, angewandt, wobei die Zoogloea-Thiolasegenregion als Hybridisierungssonde zur Lokalisierung homologer Sequenzen verwendet wurde.
Durch die anschließende Sequenzanalyse eines 2-kb-Pst1- Fragments von A. eutrophus-DNA, das in pUC8 kloniert worden war (Klon pAeT3), wurde die entsprechende Thiolasegenregion in dem A. eutrophus-H16-Genom identifiziert. Die stromabwärts gelegenen Sequenzen in pAeT3 sind ebenfalls zur NADP- gebundenen Reductasegenregion aus dem Zoogloea-Klon pUCDBK1 homolog. Die Sequenzen der Alcaligenes-Thiolase- und Reductasegene sind in Fig. 3 angegeben.
Die Klonierung der einzelnen Thiolase- und Reductasegene von pAeT3 in pKK223.3 führt zur Expression der entsprechenden Enzyme. Die Vergleiche der Thiolaseproteinsequenzen von Zoogloea und A. eutrophus zeigen, daß die beiden Proteine zu 63% homolog sind, wobei die aktive Stelle Cys-89 eingeschlossen ist.
Die Thiolasegenregionen sowohl von A. eutrophus als auch von Zoogloea wurden als Hybridisierungssonden zum Durchmustern der DNA von Nocardia und Pseudomonas oleovarans nach homologen Genen verwendet. Verfahren zur Identifizierung der Thiolase-, Reductase- und anderer Synthetasegene aus anderen Arten mit homologen Sequenzen über die beschriebenen hinaus sind dem Fachmann bekannt.

Identifizierung des Z. ramigera-PHB-Polymerasegens

Die PHB-Polymerase-von Z. ramigera nutzt D(-)- Hydroxybutyryl-CoA-Monomere, wobei sie diese in Oxoesterverknüpfungen in einer templatunabhängigen Kopf-Schwanz- Kondensation polymerisiert und dadurch lineare Polymere er gibt. Diese Polymere können bis zu 10000 Monomereinheiten bei einem Molekulargewicht von über 1 · 10&sup6; enthalten. Das Polymer wird rasch unlöslich und sammelt sich als diskrete Granulatkörnchen in der Zelle an.
Ein Konjugationstransfersystem auf der Basis von Derivaten des Plasmids mit breitem Wirtsbereich pRK290 nach der Beschreibung von Ditta et al. in Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77, 7347-7351 (1980), Transposon-Mutagenese und Komplementationsanalyse können in Verbindung mit der Isolierung, Charakterisierung und Komplementation PHB-negativer Mutanten zur Isolierung des PHB-Polymerasegens für Z. ramigera und A. eutrophus verwendet werden. Gemäß der Beschreibung von Schlegel et al., Arch. Microbiol. 71, 283-294 (1970), wird Anfärben mit Sudanschwarz zum Nachweis PHB-negativer Mutanten verwendet. Die Komplementation der Mutanten wird durchmustert, indem die Zellen gezüchtet, geerntet und lysiert werden, wobei PHB freigesetzt wird, das anschließend zur Bestimmung des Vorhandenseins und der Molekulargewichtsverteilung gereinigt werden kann. Die Thiolase-, Reductase- und PHB-Polymeraseaktivitäten in den Lysaten werden ebenfalls getestet.

Identifizierung des A. eutrophus-PHB-Polymerasegens

Diese Techniken werden ebenfalls zur Klonierung, Sequenzierung und Expression des PHB-Polymerasegens (phbC) in Alcaligenes eutrophus Hl 6 angewandt, wobei die Komplementation von Poly(β)-hydroxybutyrat-negativen Mutanten von A. eutrophus H16 verwendet wird. Die Ergebnisse zeigen, daß die für die drei Enzyme des PHB-Biosynthesewegs codierenden Gene als phbC-phbA-phbB organisiert sind. Die Expression aller drei Gene in E. coli führt zu einer deutlichen Produktionsmenge von PHB (50% Trockenzellgewicht) in diesen Bakterien. phbC codiert für ein Polypeptid mit Mr = 63900 mit einem von typischen Membranproteinen verschiedenen Hydropathieprofil, was anzeigt, daß an der PHB-Biosynthese wahrscheinlich kein Membrankomplex beteiligt ist.
Die Strategie, PHB-negative Mutanten eines Derivats (11599 S1, Tabelle 1) von A. eutrophus H16 zu konstruieren, zu charakterisieren und zu komplementieren, wurde zur Identifizierung und Isolierung des Gens (der Gene) mit Codierung für PHB-Polymerase verwendet. Durch Transposon-Mutagenese war es möglich, DNA-Hybridisierungsanalyse zur Kartierung der chromosomalen Lokalisierung der Tn5-Insertionssequenz in interessierenden Stämmen zu verwenden. 32 potentiell PHB-negative Mutanten wurden bei Zucht auf Minimalagarplatten mit Stickstoffbeschränkung über ihren Phänotyp opaker Kolonien identifiziert. Aufgrund des zur Anreicherung für PHB-Mangelstämme verwendeten Verfahrens war es nicht überraschend, durch DNA-Hybridisierung unter Verwendung einer Tn5-DNA-Sonde herauszufinden, daß die 32 Mutanten nur drei Klassen angehörten. Es wurden dann detailliertere DNA- Hybridisierungsuntersuchungen verwendet, um einen Vertreter jeder Klasse, d. h. die Stämme PHB #2, PHB #3 und PHB #19, zu analysieren. Aus diesen Untersuchungen konnte man folgern, daß sich im Falle des Stamms PHB #2 und des Stamms PHB #3 die den opaken Phänotyp verursachende Tn5- Insertionssequenz in dem Chromosom etwa 1, 2 kb bzw. 1,6 kb stromaufwärts der phbA-phbB-Gene befand, siehe Fig. 3. Im Stamm PHB #19 befand sich die Tn5-Insertionssequenz an anderer Stelle auf dem A. eutrophus-Chromosom.
Das experimentelle Vorgehen und die Materialien, die bei der Isolierung und Charakterisierung von phbC eingesetzt wurden, sind im folgenden angegeben. Die Verfahren und Materialien sind ähnlich denen, die zur Isolierung der phbA- und phbB-Gene beschrieben wurden.
Die Bakterienstämme und Plasmide sind in Tabelle 1 angegeben. Die Medien und Kulturbedingungen sind wie im vorhergehenden geschildert. Tabelle 1 Bakterienstämme und Plasmide
Die Manipulationen der DNA waren ähnlich den im vorhergehenden geschilderten. Restriktionsendonucleasen, T4-DNA- Ligase und DNA-Polymerase 1 wurden von New England Biolabs erhalten und nach den Angaben des Herstellers verwendet. Kalbseingeweide-Alkaliphosphatase wurde von Boehringer Mannheim Corporation bezogen. Alle routinemäßigen DNA- Manipulationen einschließlich der Plasmidreinigungsschritte, der E. coli-Transformationen und dergleichen wurden nach Verfahren, die von Maniatis et al. beschrieben wurden, durchgeführt. Chromosomale DNA wurde aus A. eutrophus- Stämmen gereinigt und in TSB bis zur späten logarithmischen Phase wie zuvor beschrieben wachsengelassen. Die Übertragung von restriktionsverdauten DNA-Proben von Agarosegelen auf Nitrocellulosefilter, die Vorhybridisierung und Hybridisierung mit ³²P-markierten DNA-Sonden erfolgten wie im vorhergehenden beschrieben. Die rasche Plasmidisolierung aus rekombinanten A. eutrophus-Stämmen zur Restriktionsanalyse wurde nach dem alkalischen Extraktionsverfahren durchgeführt.

Konjugation in A. eutrophus

Die Konjugationsübertragung des Plasmids mit breitem Wirtsbereich pLAFR3 oder rekombinanter Derivate von pLAFR3 in A. eutrophus wurde nach dem im vorhergehenden geschilderten Verfahren durchgeführt. In diesem Fall wurden jedoch die aufnehmenden A. eutrophus-Zellen nicht ultraschallbehandelt und die Transkonjuganten wurden auf mineralischen Agarplatten mit A. eutrophus, die 0,01% NH&sub4;Cl als Stickstoffquelle, 1% (Gew./Vol.) Fructose als Kohlenstoffquelle und 10 ug/ml Tetracyclin enthielten, selektiert.
Zur Tn5-Mutagenese wurde ein spontan streptomycinresistenter Stamm von A. eutrophus 11599 (1599S1) verwendet. Der Transfer von pRK602 (Tn5) wurde wie im vorhergehenden geschildert durchgeführt, wobei E. coli MM294A (pRK602) als einziger Donor verwendet wurde. Die Tn5 enthaltenden Stämme von A. eutrophus wurden bezüglich Wachstum auf Streptromycin (500 ug/ml) und Kanamycin (100 ug/ml) selektiert.

Amplifikation und Identifizierung von PHB-Mangelmutanten

Zur Identifizierung der PHB-Mangelstämme von A. eutrophus wurden die von Schlegel und Oeding, Radiation and Radioiso topes for Industrial Microorganisms, International Atomic Energy Agency, Vienna, 223-231 (1971), beschriebenen Amplifikations- und Durchmusterungsverfahren verwendet. Mit einem Pool von etwa 10&sup5; Kanr-Transkonjuganten (Tn5- Insertionsmutanten) wurden 10 ml mineralisches Medium mit 0,01 NH&sub4;Cl, 1% Fructose und 100 ug/ml Kanamycin beimpft und das Ganze 18 h bei 30ºC inkubiert. Diese Kultur wurde anschließend zum Beimpfen von 100 ml des gleichen Mediums verwendet und das Ganze 30 h bei 30ºC inkubiert. Zur Amplifizierung der PHB-Mangelmutanten wurden etwa 109 Zellen enthaltende aliquote Teile dieser Kultur auf Saccharosestufengradienten durch Dichte-Gleichgewichtszentrifugation fraktioniert und auf mineralischen Agarplatten mit 0,01% NH&sub4;Cl, 1% Fructose und 100 ug/ml Kanamycin ausplattiert. Nach 4- bis 5tägigem Wachstum bei 30ºC ließen sich ohne Schwierigkeiten opake (ohne PHB) und weiße (mit PHB). Kolonien unterscheiden. Durch quantitative Bestimmung der Menge des durch sowohl die opaken als auch die weißen Kolonien erzeugten PHBs wurde bestätigt, daß opake Kolonien einen PHB-Mangel aufwiesen, während weiße Kolonien PHB enthielten.

Analyse der Proteine

Zur Durchführung von Tests bezüglich β-Ketothiolase, NAD PH-gebundener Acetoacetyl-CoA-Reductase und PHB- Polymerase wurden 100-ml-Kulturen von A. eutrophus-Stämmen 40 h bei 30ºC in TSB wachsengelassen. Bei Tn5- Mutantenstämmen wurde Kanamycin mit 100 ug/ml und bei pLAFR3 oder dessen Derivate enthaltenden Stämmen Tetracyclin mit 10 ug/ml zugesetzt. Die Zellen wurden durch Zentrifugation geerntet, in 2 ml Lysepuffer (10 mM Tris-HCl, pH-Wert 8,0; 5 mM β-Mercaptoethanol; 5 mM EDTA, 0,02 mM Phenylmethylsulfonylfluorid; 10% (v/v) Glycerin) resuspendiert und durch Ultraschallbehandlung lysiert. Ein aliquo ter Teil des Lysats wurde für die β-Ketothiolase- und Acetoacetyl-CoA-Reductasetests durch Zentrifugation von Zellabfällen befreit. Die β-Ketothiolase-Aktivität wurde durch Messen der Thiolyserate von Acetoacetyl-CoA gemäß der Beschreibung von Davis et al., J. Biol. Chem. 262, 82-89 (1987), bestimmt, wobei Acetoacetyl-CoA NADPH als Cofaktor aufwies. Die PHB-Polymerasetests wurden durchgeführt, indem Proben des Rohlysats verwendet wurden und der Grad des Einbaus von D-³H-Hydroxybutyryl-CoA (spezifische Aktivität etwa 2 uCi/umol) gemäß der Beschreibung von Fukui et al., Arch. Microbiol. 110, 149-156 (1976), bestimmt wurde. Die Proteinkonzentrationen wurden nach dem Verfahren von Bradford, Anal. Biochem. 72, 248-254 (1976) unter Verwendung der Biorad-Testlösung und von Rinderserumalbumin als Standard bestimmt. Die Markierungsversuche der Maxizellen von E. coli wurden nach der Beschreibung von Sancar et al., J. Bacteriol. 137, 692-693 (1979), durchgeführt.

Reinigung und quantitative Bestimmung von PHB

Zur Bestimmung der Menge von PHB in unterschiedlichen Stämmen wurden 100-ul-Aliquots der Rohlysate 1 h bei 37ºC mit 1,2 ml 5%iger Natriumhypochloritlösung behandelt. Das unlösliche PHB wurde anschließend durch 10minütiges Zentrifugieren in einer Mikrozentrifuge geerntet, nacheinander mit 1 ml H&sub2;O, 1 ml Aceton, 1 ml Ethanol gewaschen und im Vakuum getrocknet. Die PHB-Konzentrationen wurden dann spektrophotometrisch gemäß der Beschreibung von Law und Siepecky, J. Bacteriol. 82, 33-36 (1961), unter Verwendung einer Standardkurve bestimmt und in Form von mg PHB/mg Protein angegeben.

Konstruktion der Plasmide und Komplementationsanalyse

Die Plasmide pLA29, pLA40, pLA41 und pLA42 wurden zur Kom plementationsanalyse der PHB-negativen A. eutrophus-Stämme konstruiert, wobei Restriktionsfragmente des pAeT29-Inserts in den Vektor mit breitem Wirtsbereich pLAFR3 kloniert wurden. pLAFR3 ist ein Derivat von pLAFR1, beschrieben von Friedman et al., Gene 18, 289-296 (1982), das eine pUC8- Polylinkerklonierungsstelle in die EcoR1-Stelle insertiert enthält. Es wurden unterschiedliche Fragmente von pAeT9 in pLAFR3 kloniert. pLA29 wurde konstruiert, indem das gesamte 15-kb-EcoR1-Insert von pAeT29 in die EcoR1-Stelle von pLAFR3 ligiert wurde. Zur Erleichterung der Konstruktion von pLA40, pLA41 und pLA42 wurden die entsprechenden Fragmente zuerst in pUC18 kloniert, wobei die Plasmide pAeT40, pAeT41 und pAeT42 erzeugt wurden. Die Fragmente wurden dann durch Verdauung mit BamH1 und EcoR1 aus den pUC18-Plasmiden herausgeschnitten, im Anschluß an eine Agarosegelelektrophorese gereinigt und in mit BamH1/HindIII verdautes pLAFR3 ligiert. Zur Konstruktion von pAeT40 wurde pAeT29-DNA vollständig mit Nde1 verdaut und die kohäsiven Enden wurden unter Verwendung des Klenowfragments von DNA-Polymerase aufgefüllt. Nach Auftrennung der Fragmente auf einem Agarosegel wurde das interessierende 7-kb-Fragment durch Elektroelution gereinigt, in die Sma1-Stelle von pUC18 ligiert und das rekombinante Plasmid pAeT40 anschließend durch Restriktionsanalyse nach der Transformation von E. coli-DH5α- Zellen identifiziert. Diese Konstruktion beseitigt die Acetoacetyl-CoA-Reductaseaktivität, da sich eine der Nde1- Stellen innerhalb des Strukturgens für dieses Enzym befindet. Zur Konstruktion von pAeT41 wurde mit Sma1/EcoR1 verdaute pAeT29-DNA auf einem Agarosegel aufgetrennt und das 5-kb-Sma1/EcoR1-Fragment gereinigt und in das mit Sma1/EcoR1 verdaute pUC18 ligiert, wobei das korrekte Plasmid erhalten wird. Zur Konstruktion von pAeT42 wurde eine Deletion des 2,3-kb-Pst1-Fragments, das die β-Ketothiolase- und Acetoacetyl-CoA-Reductasestrukturgene enthält, durch partielle Pst1-Verdauung von pAeT41-DNA und Religati on verwendet.

Hybridisierungskartierung der Tn5-Insertionen

Es wurden eine Bibliothek von 10&sup5; einzelnen Tn5- Insertionsmutanten von A. eutrophus 11599 S1 konstruiert und 32 potentiell PHB-negative Kolonien durch ihren Phänotyp opaker Kolonien auf Minimalplatten mit Stickstoffbeschränkung, wie im vorhergehenden geschildert, identifiziert. Diese wurden weiter unter Verwendung von Southern- DNA-Hybridisierungsanalyse charakterisiert. Für die DNA- Hybridisierungsuntersuchungen wurde restriktionsverdaute chromosomale DNA der einzelnen Stämme unter Verwendung von sowohl einer Tn5-DNA-Sonde (Plasmid pRK602) als auch zwei Plasmiden, pAeT10 und pAeT29, die die A. eutrophus-phbA- phbB-Stelle (Fig. 3) enthalten, analysiert.
Die 32 "opaken" Stämme stellten multiple Kopien von nur drei unterschiedlichen Mutantenarten dar. Diese drei unterschiedlichen Mutantenarten werden durch die Stämme PHB#2, PHB#3 und PHB#19 dargestellt. Für die Stämme PHB#2 und PHB#3 wird das Transposon Tn5 in chromosomale Pst1- Fragmente mit 2,3 kb bzw. 0,6 kb insertiert. Diese beiden chromosomalen Pst1-Fragmente befinden sich auf den 15 kb von A. eutrophus-DNA, die in das Plasmid pAeT29 kloniert sind, jedoch nicht in den phbA-phbB-Strukturgenen. Der Stamm PHB#19 weist Tn5 insertiert in ein Pst1-Fragment auf, das auf dem pAeT29-Plasmid nicht vorhanden ist.
Es wurden detailliertere DNA-Hybridisierungsexperimente auf der chromosomalen DNA von Stamm PHB#2 und Stamm PHB#3 zur Kartierung der Stelle der Tn5-Insertion in jede dieser Mutanten durchgeführt. Die chromosomale DNA von jedem dieser Stämme sowie vom Wildtypstamm H16 und Stamm PHB#19 wurde mit Sal1, Sma1 und BglII verdaut, bidirektional auf Ni trocellulosefilter übertragen und mit Tn5-DNA (pRK602)- und pAeT29-DNA-Sonden zur Kartierung der Stelle der Tn5- Insertionen in den Stämmen PHB#2 und PHB#3 hybridisiert.
Die Ergebnisse einer biochemischen Analyse des Wildtyps H16 und der einzelnen mutierten Stämme PHB#2, PHB#3 und PHB#19 sind in Tabelle 2 angegeben. 100-ml-Kulturen der einzelnen Stämme in der stationären Phase wurden geerntet, lysiert und bezüglich PHB-Gehalt und β-Ketothiolase-, NADP- spezifische Acetoacetyl-CoA-Reductase- und PHB-Polymeraseaktivitäten getestet. Unter diesen Zuchtbedingungen ergibt der Wildtyp H16 eine signifikante Menge an PHB (1,3 mg PHB/mg Protein, Tabelle 2) und zeigt einen hohen Grad an allen drei Enzymaktivitäten. Die mutanten Stämme PHB#2 und PHB#3 erzeugen im wesentlichen kein PHB und Stamm PHB#19 erzeugt nur 5% der Wildtypmenge (Tabelle 2). Eine PHB- Polymeraseaktivität konnte in keinem dieser mutierten Stämme nachgewiesen werden, jedoch zeigt das Vorhandensein von PHB im Lysat von Stamm PHB#19, daß das Enzym da ist, obwohl die Aktivität vermutlich unter der Nachweisgrenze des Tests liegt. Die β-Ketothiolase-Aktivitäten in allen drei Mutanten sind größenordnungsmäßig auf 45% (PHB#2) bis 38% (PHB#19) der des Wildtypstamms H16 verringert. In ähnlicher Weise liegen die NADP-spezifischen Acetoacetyl-CoA- Reductaseaktivitäten bei etwa 50% der Höhe des Wildtyps. Aus diesen Daten wurde gefolgert, daß das PHB-Polymerasegen stromaufwärts von phbA-phbB lokalisiert ist und daß die Expression der letzteren Gene durch die Tn5-Insertion stromaufwärts im Falle der Stämme PHB#2 und PHB#3 beeinflußt wird.
Eine Reihe von Plasmiden, die Fragmente des A. eutrophus- Inserts des Plasmids pAeT29 enthielten, wurden zur Komplementationsanalyse der PHB-negativen Mutanten in dem Vektor mit breitem Wirtsbereich pLAFR3 konstruiert.
Jedes der rekombinanten Plasmide pLA29, pLA40, pLA41 und pLA42 wurde in die einzelnen A. eutrophus-Stämme durch Konjugation eingeführt und die hierbei erhaltenen Transkonjuganten wurden bezüglich der Wiederherstellung des weißen (PHB-positiven) Phänotyps auf Platten mit Stickstoffbeschränkung analysiert. Die Plasmide pLA29, pLA40, pLA41 und pLA42, die alle die Region stromaufwärts von phbA-phbB, in die Tn5 im Chromosom der Stämme PHB#2 und PHB#3 insertiert ist, enthalten, komplementierten in jedem dieser beiden Stämme die Mutation, wobei der Phänotyp der weißen Kolonien wiederhergestellt wurde. Alle vier rekombinanten Plasmide stellten auch den Phänotyp der Kolonie des Wildtyps beim mutierten Stamm PHB#19 wieder her. Im Falle dieses Stamms befindet sich die Tn5-Insertion außerhalb der Region des A. eutrophus-Chromosoms, die in jedem der Plasmide enthalten ist. Kontrollexperimente unter Verwendung des Vektors pLAFR3 ergaben den Phänotyp der opaken Kolonie, wenn dieser in die einzelnen drei mutierten Stämme eingeführt wurde.
Die biochemische Analyse der einzelnen komplementierten Stämme wurde wie für die Charakterisierung der Mutanten beschrieben durchgeführt. Diese Ergebnisse sind ebenfalls in Tabelle 2 angegeben. Die Einführung von pLA29 in die einzelnen mutierten Stämme führt zu einer Wiederherstellung der PHB-Polymeraseaktivität und der PHB-Biosynthese (Tabelle 2). Darüber hinaus wurde eine etwa 3- bis 5fache Zunahme des Grades der β-Ketothiolase- und NADP-spezifischen Acetoacetyl-CoA-Reductaseaktivitäten beobachtet. Plasmid pLA40 und pLA41 stellen auch die PBH-Polymerase- und PHB-Erzeugung für die Stämme PHB#2 (Tabelle 2), PHB#3 und PHB#19 wieder her, obwohl im Falle von pLA40 das phbB- Gen während der Konstruktion dieses Plasmids zerrissen wurde. Schließlich stellt das Plasmid pLA42 die PHB- Polymeraseaktivität und die PHB-Produktion für alle drei mutierten Stämme wieder her, obwohl die phbA-phbB-Gene deletiert wurden. Im Falle von Stämmen, die dieses Plasmid enthalten, bleiben die β-Ketothiolase- und NADP-spezifische Acetoacetyl-CoA-Reductaseaktivitäten auf der gleichen Höhe wie bei den mutierten Stämmen (Tabelle 2). Tabelle 2 Biochemische Analyse mutierter und komplementierter A. eutrophus-H16-Stämme
1. mg/mg Protein
2. Einheiten/mg Protein
3. cpm/min/mg Protein
ND: nicht nachweisbare Aktivität
Die aufgeführten Ergebnisse sind der Mittelwert aus zwei oder mehr Experimenten.
Wie im vorhergehenden geschildert wurden die auf dem Plasmid pAeT29 lokalisierten phbA-phbB-Gene in E. coli unter der Kontrolle des A. eutrophus-Promotors exprimiert. Die Identifizierung des phbC-Gens stromaufwärts von phbA-phbB zusammen mit der beobachteten Abnahme der Thiolase- und Reductaseenzymaktivitäten in den Stämmen PHB#2 und PHB#3 zeigt, daß alle drei Gene von einem einzigen stromaufwärts von phbC lokalisierten Promotor exprimiert werden. Um dies zu untersuchen, wurden Kulturen von die Plasmide pAeT41 und pAeT42 enthaltenden Stämmen von E. coli unter Bedingungen mit Stickstoffbeschränkung wachsengelassen, bis die Zellen die stationäre Phase erreichten. An diesem Punkt wurden die Zellen geerntet, lysiert und analysiert. E. coli, das pUC18 enthielt, wurde als Kontrolle verwendet. Die in Tabelle 3 angegebenen Ergebnisse von β-Ketothiolase-, Acetoacetyl- CoA-Reductase-, PHB-Polymerase- und PHB-Konzentrationstests zeigen, daß das Lysat von E. coli mit dem Plasmid pAeT41 einen signifikanten Grad an sowohl Enzymaktivität als auch PHB-Produktion aufweist.
Eine Maxizellenanalyse der E. coli-Stämme, die im vorhergehenden geschildert wurde, wurde zur Bestimmung des Molekulargewichts der durch die Plasmide pAeT41 und pAeT42 codierten Polypeptide verwendet. Das Plasmid pAeT10 wurde in die Analyse einbezogen, da dieses Plasmid die A. eutrophus- phbA-phbB-Gene durch den lacZ-Promotor des pUC8-Vektors exprimiert. Weitere Proteinbanden mit Mr 40000 und Mr 26000 sind in Proben, die das Plasmid pAeT10 bzw. pAeT41 enthalten, vorhanden. Beide Plasmide exprimieren die phbA-phbB- Gene, die für β-Ketothiolase (Mr 41000) und NADP-spezifische Acetoacetyl-CoA-Reductase (Mr 26000) codieren. Keines dieser beiden Proteine ist im Extrakt von Zellen, die das die phbA-phbB-Gene nicht enthaltende Plasmid pAeT42 enthalten, vorhanden. Kontrollexperimente, in denen der Vektor pUC8 eingesetzt wurde, ergaben bei Mr 41000 oder Mr 26000 kein Signal. Beide Plasmide, pAeT41 und pAeT42, exprimieren das PHB-Polymerase(phbC)-Gen in E. coli und in Proben, die Extrakte von diese Plasmide enthaltenden Zellen enthalten, ist ein Signal mit Mr von 58000 klar zu beobachten. Dieses Protein fehlt wiederum bei einer Probe, die Extrakte von Zellen, die das das phbC-Gen nicht enthaltende Plasmid pAeT10 enthalten, und auch bei einer Kontrollprobe von pUC8 enthaltenden Zellen. Eine weitere Bande bei etwa Mr 30000 tritt in allen Proben auf und zeigte sich auch bei Kontrollexperimenten von pUC8 enthaltenden Zellextrakten, wobei es sich vermutlich um ein Vektorprotein handelt. Aus diesen Daten wurde gefolgert, daß das in E. coli exprimierte phbC-Gen für ein Polypeptid mit etwa M 58000 codiert. Tabelle 3 Biochemische Analyse von rekombinanten E. coli-Stämmen zur Bestimmung der Expression von phbC-A-B in E. coli
ND: keine nachweisbare Aktivität
Die angeführten Ergebnisse sind der Mittelwert aus zwei oder mehr Experimenten.

Nucleotidsequenzanalyse von phbC

Das in das Plasmid pAeT42 klonierte chromosomale 2-kb-Sma1- Pst1-A. eutrophus-DNA-Fragment enthält das gesamte Strukturgen für phbC und vermutlich die Regulatorsequenzen. Dieses Fragment wurde ausgehend von beiden DNA-Strängen mehr fach unter Verwendung des Didesoxysequenzierungsverfahrens wie im vorhergehenden beschrieben sequenziert. Ein einzelnes langes offenes Leseraster erstreckt sich von Nucleotid 820 bis zu einem TGA-Stoppcodon bei Nucleotid 2608. Potentielle Translationsinitiationscodons sind an Position 842 (ATG), 1067 (ATG) und 1097 (ATG) vorhanden. Eine Translation ausgehend von diesen potentiellen Startstellen sollte Proteine mit Mr 63940, Mr 55513 bzw. Mr 54483 ergeben. Eine signifikante Homologie der Aminosäuresequenz zwischen dem Translationsprodukt ausgehend vom ATG bei Position 842 bis zum ATG an Position 1067 und dem P. oleovarans-PHA-Polymerasegenprodukt, die im folgenden beschrieben ist, zeigt, daß das erste ATG (Position 842) vermutlich richtig ist. Fig. 4 gibt die gesamte Nucleotidsequenz dieser Region von der Sma1-Stelle bis zu den ersten 30 stromabwärts lokalisierten Nucleotiden des phbA-Gens an. Das Translationsprodukt des offenen Leserasters vom ATG an Position 842 bis zum TGA an Position 2609 ist ebenfalls angegeben. Die durch das phbC-Gen in Plasmid pAeT42 codierte PHB-Polymerase ist ein Polypeptid mit 589 Aminosäuren mit einem Mr = 63940. Die N-terminalen 10 Aminosäuren des phbA-Genprodukts sind ebenfalls in Fig. 4 angegeben. Weitere Merkmale der in Fig. 4 angegebenen Nucleotidsequenz umfassen den C-Terminus eines offenen Leserasters, der stromaufwärts der Sma1-Stelle beginnt und am TGA-Stoppcodon an Position 76 endet. 85 bp stromabwärts des phbC-TGA-Stoppcodons (Position 2609) befindet sich der ATG-Startcodon für das phbA-Strukturgen (Position 2969). Aus diesen Daten wird deutlich, daß die drei Enzyme des A. eutrophus-PHB-Biosynthesewegs durch drei Gene, die gemäß der Darstellung in Fig. 4 als phbC-phbA- phbB organisiert sind, codiert sind.
Die Expression von phbC allein in E. coli erzeugt weder PHB noch signifikante Grade an PHB-Polymeraseaktivität (Plasmid pAeT42). E. coli scheint nicht fähig, D-(-)-Hydroxybutyryl- CoA als Substrat für PHB-Polymerase in Abwesenheit der A. eutrophus-phbA-phbB-Gene synthetisieren zu können. Da das Insert von pAeT42 sowohl den Promotor als auch das Strukturgen für phbC enthält (das Plasmid pLA42 komplementiert alle PHB-negativen Mutanten, Tabelle 2), läßt sich folgern, daß bei Fehlen eines verfügbaren Substrats PHB-Polymerase in E. coli inaktiv ist oder abgebaut wird.
Die Nucleotidsequenz des A. eutrophus-Chromosomen-DNA- Inserts in Plasmid pLA42 mit Codierung für PHB-Polymerase sagt ein einziges Polypeptid mit Mr 63940 (Fig. 4) voraus. Obwohl PHB-Polymerase bisher nicht gereinigt und charakterisiert wurde, ergeben die Untersuchungen an Maxizellen von E. coli einen Mr-Wert von 58000 für dieses Polypeptid, was in angemessener Übereinstimmung mit dem aus der Gensequenz vorhergesagten Wert steht.
Einige Jahre lang wurde vorgeschlagen, daß an der Polymerisation von (D)-β-Hydroxybutyryl-CoA eine membrangebundene Polymerase beteiligt ist, die eine Art Barriere zwischen der wäßrigen Umgebung des Cytoplasmas und den hydrophoben kristallinen PHB-Granulatkörnchen bildet. Das Hydropathieprofil des PHB-Polymerasepolypeptids zeigt nicht eine typische eine Membran aufspannende Struktur an. Darüber hinaus zeigen NMR-Untersuchungen nativer PHB-Granulatkörnchen in Methylobacterius, daß sich diese Granulatkörnchen in einem mobilen im Gegensatz zu einem hochkristallinen festen Zustand befinden. Diese Daten zusammen machen die Vorstellung glaubwürdig, daß zur PHB-Biosynthese tatsächlich ein komplexes membrangebundenes Polymerisationssystem nicht erforderlich ist. Der für PHB-Polymerase in der Literatur vorgeschlagene Mechanismus umfaßt zwei Teilreaktionen. Der anfänglichen Bildung einer Acyl-S-Enzym-Zwischenverbindung folgt der Transfer zu einem Primerakzeptor in der zweiten Reaktion. Die vorhergesagte Primärstruktur von PHB-Poly merase weist fünf Cysteinreste, Cys&sub2;&sub4;&sub6;, Cys&sub3;&sub1;&sub9;, Cys&sub3;&sub8;&sub2;, Cys&sub4;&sub3;&sub8; und Cys&sub4;&sub5;&sub9;, auf.

Identifizierung des P. oleovarans-PHA-Polymerasegens

Die an der Biosynthese von Polyhydroxyalkanoat(PHA)polyestern in Pseudomonas oleovarans beteiligten Gene wurden ebenfalls wie folgt isoliert.
Im Jahre 1983 identifizierten de Smet et al., J. Bacteriol. 154, 870-878, ein von Pseudomonas oleovarans TF4-1L (ATCC 29347) produziertes Polymer als Poly-B-hydroxyoctanoat. Anschließende Untersuchungen zeigten, daß P. oleovarans eine Reihe von PHB-Biopolymeren erzeugen konnte, wobei dies von der verwendeten Kohlenstoffquelle, d. h. n-Alkanen und 1- Alkenen (Lageveen et al., Appl. Environ. Microbiol. 54, 2924-2932 (1988)) oder Fettsäuren (Brandl et al., Appl. Environ. Microbiol. 54, 1977-1982 (1988)), abhängt. Der Weg hierzu scheint die Umwandlung der Alkane/Alkene in die Fettsäuren zu umfassen, die dann den Fettsäure-B- Oxidationsweg einschlagen, was zur Bildung des D-Isomers von B-Hydroxyacyl-CoA führt, das durch PHA-Polymerase in das Polymer überführt wird. Bei P. oleovarans konnte der Einbau von B-Hydroxybutyrat nicht gezeigt werden, woraus sich ergibt, daß 1) dieses die Thiolase/Reductaseenzyme nicht besitzt oder 2) die PHA-Polymerase B-Hydroxybutyrat als Substrat nicht nutzen kann. Der breite Bereich von Substraten, der durch die P. oleovarans-PHA-Polymerase verwendet wird, macht das für dieses Enzym codierende Gen für die Biopolymerentechnik von Polyestern besonders interessant.
Es wurde dem zum Isolieren der A. eutrophus-B-Ketothiolase und der NADP-spezifischen Acetoacetyl-CoA-Reductase verwendeten Verfahren mit Verwendung des Z. ramigera-B-Ketothio lasegens als DNA-Hybridisierungssonde wie im vorhergehenden geschildert gefolgt, um das P. oleovarans-PHA-Polymerasegen zu isolieren. Durch Southern-DNA-Hybridisierung von chromosomaler P. oleovarans-DNA wurde ein 6-kb-EcoR1-Restriktionsfragment mit starker Homologie zum A. eutrophus-PHB- Polymerasegen (phbC) identifiziert. Das 6-kb-EcoR1-Fragment wurde nach Standardverfahren in den E. coli-Plasmidvektor pUC18 kloniert, wobei das Plasmid pP023 erhalten wurde. Die mit dem A. eutrophus-phbC-Gen hybridisierte Region ist wie in Fig. 5 angegeben lokalisiert. Die Nucleotidsequenzanalyse des gesamten 6-kb-Fragments identifizierte drei mögliche proteincodierende Regionen (die in Fig. 5 angegebenen offenen Leseraster ORF1, ORF2 und ORF3). ORF1 beginnt am ATG- Initiationscodonnucleotid 554 und endet am TGA-Stoppcodonnucleotid 2231 (Fig. 6). Dieses offene Leseraster ist in der Region des pP023-Inserts enthalten, das mit dem A. eutrophus-phbC-Gen hybridisiert.
ORF1 codiert für ein Polypeptid mit 559 Aminosäuren mit einem Mr-Wert von 62300 Dalton. Ein Vergleich der durch Translation von ORF1 vorhergesagten Proteinsequenz mit der Aminosäuresequenz der A. eutrophus-PHB-Polymerase unter Verwendung des Programms ALIGN ergab eine 52%ige Identität zwischen den beiden Proteinen. ORF3 beginnt an der ATG- Position 2297 und endet an der TAA-Position 3146 und codiert für ein Protein mit 577 Aminosäuren mit einem Mr-Wert von 64400 Dalton. Die vorhergesagten Polypeptidprodukte von ORF1 und ORF2 weisen eine 40%ige und 42%ige absolute Identität mit dem phbC-Genprodukt auf. ORF1 komplementiert jeden PHA-negativen Stamm, der isoliert und getestet werden konnte, was bestätigt, daß dieses Gen für die normalerweise exprimierte PHA-Polymerase codiert. Vermutlich codiert auch ORF3 für eine PHA-Polymerase. Genexpressionsuntersuchungen ergeben jedoch, daß ORF3 nicht normal exprimiert wird.
ORF2 beginnt an der ATG-Position 3217 und endet an der TGA- Position 4948 und codiert für ein Protein mit 283 Aminosäuren mit einem Mr-Wert von 31400 Dalton. Das Gen codiert vermutlich für eine PHA-Depolymerase.

Synthese von PHB, PHA und ähnlichen Polymeren

Es wurde im vorhergehenden festgestellt, daß es möglich ist, neue Stämme mit PHB-Produktion zu konstruieren, indem die A. eutrophus-PHB-Biosynthesegene in E. coli eingeführt werden, was zu einer Ansammlung von PHB bis zu einem Trockenzellgewicht von 50% führt. Die Konstruktion neuer oder verbesserter Stämme mit Polyesterproduktion ist nun durch die Expression entweder der PHB-Biosynthesegene von A. eutrophus oder des PHA-Polymerasegens und von ORF2 und ORF3 von P. oleovarans in einer Anzahl von Systemen möglich. Es können Plasmide konstruiert werden, die die A. eutrophus-B- Ketothiolase- und NADP-spezifische Acetoacetyl-CoA- Reductasegene in P. oleovarans unter der Kontrolle des xylS-Promotors in den Expressionsplasmiden mit breitem Wirtsbereich pNM185 (Mermod et al., J. Bacteriol. 167, 447- 454 (1986)) oder pERD20/pERD21 (Ramos et al., FEBS LETTERS 226, 241-246 (1986)), alternativ in den Expressionsvektoren mit breitem Wirtsbereich pMMB24/pMMB22 mit einem tac- Promotor (Bagdasarian et al., Gene 26, 273-282 (1983)) exprimieren. Diese gleichen Vektoren können auch zur Expression des A. eutrophus-PHB-Polymerasegens oder der drei in das Plasmid pP023 klonierten P. oleovarans-Gene (Fig. 5) verwendet werden.
Es wurden zwei Plasmide, pLAP1 und pLAP2, konstruiert, um das P. oleovarans-PHA-Polymerasegen und ORF2 (pLAP1) oder das PHA-Polymerasegen und ORF2 plus ORF3 (pLAP2) unter der Kontrolle des A. eutrophus-phbC-Promotors zu exprimieren (Fig. 4).
Zur Konstruktion dieser Plasmide wurde das 810-bp-Sma1- BstB1-Restriktionsfragment, das die ersten 810 Nucleotide des A. eutrophus-Inserts in dem den phbC-Promotor enthaltenden Plasmid pAeT42 umspannt, in die singuläre Sma1- Stelle in den E. coli-Vektor pUC19 ligiert, wobei das Plasmid pAeTB1 erhalten wird. Der Promotor des P. oleovarans- PHA-Polymerasegens wurde entfernt, indem die Exonuclease Bal31 zur Deletion von 170 bp vom Ende der mit Fsp1 verdauten pP023-DNA verwendet wurde und das PHA-Polymerasestrukturgen plus ORF2 durch anschließendes Verdauen mit Cla1 und Klonieren des Fragments in den mit Sma1/Cla1 verdauten pBLSK+-Vektor wiederhergestellt wurde (Stratagene, La Jolla, CA 92037). Es wurde nachgewiesen, daß das Insert pPOB10 die letzten 19 bp stromaufwärts des ATG-Startcodons des PHA-Polymerasestrukturgens (Nucleotid 535, Fig. 6), das vollständige PHA-Polymerasestrukturgen und ORF2 enthielt. Das Strukturgen und ORF2 konnten anschließend auf einem 2,6-kb-BamH1-Xho1-Fragment gewonnen und in mit BamH1/Sal1 verdautes pAeTB1 ligiert werden, wobei das Plasmid pAeP1 erhalten wird. Das gesamte Insert von pAeP1, das das phbC- Promotor-PHA-Polymerasestrukturgen-ORF2-Konstrukt enthielt, wurde anschließend als 3,4-EcoR1-Hind111-Fragment ausgeschnitten und in die Polylinkerregion des Vektors mit breitem Wirtsbereich pLAFR3 zur Konjugation in A. eutrophus- Stämme kloniert. Zur Konstruktion von pAeP2 wurden das 2,6- kb-BamH1-Cla1-Fragment von pPOB10 und das 2,5-kb-Cla1-Xho1- Fragment von pP023, das ORF3 enthielt, mit mit BamH1/Sal1 verdautem pAeTB1 ligiert, wobei pAeP2 erhalten wurde. Erneut konnte das phbC-PHA-Polymerase-ORF2-ORF3-Konstrukt als 5,9-kb-EcoR1-HindIII-Fragment ausgeschnitten und in die Polylinkerregion von pLAFR3 kloniert werden, wobei pLAP2 erhalten wird. pLAP1 sollte sowohl die PHA-Polymerase als auch ORF2 in A. eutrophus und pLAP2 zusätzlich ORF3 exprimieren. Für den Fall, daß die Gene nicht exprimiert werden, können sie in die im vorhergehenden beschriebenen Expressionsvektoren mit breitem Wirtsbereich für die B- Ketothiolase- und NADP-spezifischen Acetoacetyl-CoA- Reductasegene insertiert werden.
Die PHB-Polymerase- und PHA-Polymerasegene sollten sich als unschätzbar für die Produktion von PHA-Polymeren in Bakterien- und Pflanzensystemen erweisen. Die klonierten und charakterisierten Gene können jedoch durch die Konstruktion von Fusionen der beiden Polymerasen oder durch chemische Mutagenese weiter modifiziert werden. Funktionelle Polymeraseenzyme könnten dann in einem geeigneten Organismus durch die Ansammlung von Polymer, was durch das phänotypische Aussehen oder eine erhöhte Dichte nachweisbar ist, ausgewählt werden. Dies ist ein direkter Ansatz zur Änderung der Spezifität des Enzyms zur Schaffung neuer Polymerasen.

Modifikation der Polymersynthese durch Variation des Grades der Enzymexpression

Nach der Isolierung und Charakterisierung der Polymergene und -genprodukte aus einer Vielzahl von Organismen, was an Z. ramigera, A. eutrophus, N. salmonicolor und P. oleovarans aufgezeigt wurde, kann ein Verfahren zur Steuerung der Expression der Genprodukte angegeben werden. Die Überproduktion des Zoogloea-Thiolasegens wurde durch die zur Festlegung der Transkriptionsstartstelle und des Promotors von Z. ramigera verwendeten Untersuchungen demonstriert. Eine Überproduktion macht die Reinigung der Enzyme bis zur Homogenität möglich und liefert analysenreine Mengen zur Analyse und zum Vergleich von Substratspezifitäten. Darüber hinaus können die gereinigten Enzyme zur Synthese stereospezifischer Substrate zur in-vitro-Polymersynthese verwendet werden. Ist ferner der für die Polymerüberproduktion verantwortliche Transkriptionsregulationsmechanismus unter einer Vielzahl von Umgebungsbedingungen einmal aufgeklärt, können in-vitro-Systeme zur enzymatischen Synthese bekannter Polymere und neue Polymere zur Bereitstellung neuer Materialien entwickelt werden. Die neuen Materialien werden anschließend bezüglich der chemischen Zusammensetzung, des Molekulargewichts und der rheologischen Eigenschaften analysiert, so daß aus den Polymeren ein möglichst großer Nutzen gezogen werden kann.
Ein Überproduktionssystem für die Z. ramigera-Thiolase in E. coli wurde unter Verwendung des künstlichen tac- Promotors konstruiert, wobei eine Reihe von Thiolase- Expressionsplasmiden erzeugt wurde. Das optimale Konstrukt wird in E. coli-Zellen induziert, wobei etwa 20-30% des gesamten löslichen Zellproteins als Thiolase erhalten werden. Dieses Verfahren liefert Thiolase in analysenreinen Mengen, im Durchschnitt 150 mg reine Thiolase aus 1 l Kultur.
Es sind im wesentlichen zwei Bedingungen, unter denen eine Genregulation in Z. ramigera und A. eutrophus auftreten kann: wenn unter den Bedingungen einer Nährstoffbeschränkung an Kohlenstoffmangel leidende Zellen anschließend mit einer Kohlenstoffquelle versorgt werden und wenn Zellen, die unter Bedingungen einer Nährstoffbeschränkung gewachsen sind, große Mengen an PHB angesammelt haben und die Nährstoffbeschränkung fällt, was zu einem PHB-Abbau führt.
Die Transkriptionsregulation der Polymerbiosynthesegene wird wie folgt bestimmt. Unter verschiedenen Bedingungen gewachsene Kulturen werden sowohl für Enzymtests (Thiolase, Reductase und Synthetase) als auch zur RNA-Reinigung abgeerntet. Die RNA-Proben werden in einer Reihe von Northern- Hybridisierungsexperimenten unter Verwendung der klonierten Gene als Sonden analysiert. Geeignete RNA-Hybridisierungsverfahren umfassen die Glyoxylierung von RNA (McMaster und Carmichael, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74, 4835 (1977)); Formaldehyd/Agarose-Gelelektrophorese (Lehrach et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 16, 4743 (1977)); Transfer auf Nitrocellulose- oder Nylonfilter (Thomas, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77, 5201 (1980)) und Hybridisierung mit durch Nick-Translation ³²P-markierten DNA-Sonden (Rigby et al., J. Mol. Biol. 113, 237 (1977)). DNA-Sonden werden aus den Klonen pUCDBK1 (Z. ramigera) und PAeT3 (A. eutrophus) hergestellt. Ein Ergebnis dieser Untersuchungen ist das Erkennen der Operon-Organisation der Gene und der Länge der mRNA.
Die Mengen der einzelnen biosynthetischen Enzyme werden manipuliert und die Wirkung hiervon auf die Polymersynthese wird registriert. Es ist notwendig, das bzw. die geschwindigkeitsbestimmende(n) Enzym(e) auf dem Biosyntheseweg zu bestimmen, so daß man den Fluß durch diesen Weg durch Überproduktion des geschwindigkeitsbestimmenden Enzyms bzw. der geschwindigkeitsbestimmenden Enzyme erhöhen kann; es ist nötig, die Wirkung der Überproduktion des einzelnen Enzyms auf den Einbau unterschiedlicher monomerer Einheiten, d. h. das Verhältnis von PHB : PHV in dem von A. eutrophus bei Züchten auf Butyrat erzeugten Copolymer, und das Ergebnis der Expression der Gene von einer Art in eine andere Art, beispielsweise der Expression von Zoogloea-Genen in A. eutrophus und umgekehrt sowie anderer isolierter und charakterisierter heterologer Gene aus anderen Organismen, z. B. Nocardia und P. oleovarans in Zoogloea und A. eutrophus zu bestimmen.
Um eine Überproduktion von Genen der Polymerbiosynthese in multiplen Wirtsorganismen zu erreichen, muß man Expressionsvektoren mit breitem Wirtsbereich, die in diesen Bakterien arbeiten, verwenden. In einem Fall erfolgt eine Enzym überproduktion über die Gendosierung. Beispielsweise kann das gesamte die Promotorregion enthaltende pUCDBK1-Insert in den Vektor pSUP104 (Simon et al., Molecular Genetics of the Bacteria-Plant Interaction. A. Pobler, Hrsg. (Spring- Verlag, NY 1983)) kloniert und zur Transformation von Z. ramigera I-16-M verwendet werden. Das Ausmaß der Überproduktion des einzelnen Enzyms wird durch Enzymtests registriert. Ein ähnlicher Versuch kann für eine beliebige Zahl anderer Gene, beispielsweise Thiolase, Thiolase und Reductase, Reductase, Reductase und Synthetase und dgl., unternommen werden. Zweitens können Gene unter die Transkriptionskontrolle hocheffizienter Promotoren, d. h. tac (Gill et al., J. Bact. 167, 611-615 (1986)) und tol (Mermod et al., J. Bact. 167, 447-454 (1986)), gestellt werden. In diesem Falle werden die Konstrukte in Mutanten, denen das entsprechende Gen fehlt, konjugiert. Die Expression des interessierenden Gens bzw. der interessierenden Gene der Polymerbiosynthese können dann entsprechend der Bestimmung unter Verwendung von Enzymtests zur Registrierung des Grades der Überproduktion stark reguliert werden. Da jedes Konstrukt getestet wird, kann die Registrierung der Wirkung auf die Polymersynthese in routinehafter Weise, d. h. über die Geschwindigkeit und die Menge der Synthese, begonnen werden.

Modifikation der Polymersynthese durch Änderung des verfügbaren Substrats oder der Enzymspezifität

Die Faktoren, die das Molekulargewicht der von verschiedenen Bakterien produzierten PHB oder PHA bestimmen, können durch Analysieren der Molekulargewichtsverteilung der durch die verschiedenen Bakterien produzierten Polymere ermittelt werden. Es besteht kein Zweifel darüber, daß eine Anzahl von PHB-produzierenden Mikroorganismen die Fähigkeit aufweisen, andere Monomere als D-(-)-Hydroxybutyrat in die Po lymerkette einzubauen. Bezüglich des von A. eutrophus produzierten PHB-PHV-Copolymers wurde vorgeschlagen, daß Propionat zuerst in Propionyl-CoA umgewandelt wird, das dann als Substrat für β-Ketothiolase fungiert. Die in Überproduktionssystemen verfügbare hohe Ausbeute an reinen Enzymen ist notwendig, um den Bereich der alternativen Substrate, die jedes der drei PHB-Biosyntheseenzyme nützen kann, und die Arten neuer PHB-ähnlicher Polymere, die in einem in- vitro-System mit strikter Kontrolle der verfügbaren Substrate synthetisiert werden können, zu bestimmen.
Obwohl die Thiolase- und Reductaseenzyme einen wesentlichen Teil der Biosynthese von PHB und PHB-ähnlichen Polymeren darstellen, bestimmt letztendlich die PHB-Polymerase die neuen Polymerarten, die hergestellt werden können. Dies wird durch die Entwicklung eines in-vitro-Systems, das das Enzym zum Testen eines ganzen Bereichs von Substraten verwendet, erleichtert, wobei viele dieser Substrate nicht in die Zelle eintreten können und deshalb bezüglich Einbau in PHB durch einen Fermentationsprozeß nicht getestet werden können.
Die Überproduktion und Reinigung von mehr als einem Reductaseenzym liefert ein Verfahren, die Kinetik und Spezifität der Enzyme zu vergleichen. Die Zoogloea-Reductase wurde als NADP-spezifisch beschrieben, jedoch nutzt das A. eutrophus-Enzym offensichtlich entweder NAD oder NADP. Die Stereospezifität dieses Enzyms kann es zu einem nützlichen Reagens zur Synthese von D-Substraten für PHB-Polymeraseuntersuchungen machen. Unter den zu testenden Acetoacetylderivaten sind der Oxoester von CoA sowie Oxopantetheinpivaloat (OPP) und die Methylenanaloga. Das Keton, jedoch nicht der Oxoester der Methylenanaloga wird durch Zoogloea- Thiolase gespalten.
Verschiedene längerkettige Alkylderivate, insbesondere die linearen C&sub5;-C&sub8;-3-Oxothiolester, -Oxoester und -Methylenketone können ebenfalls als Substrate für die PHB- Polymerase geeignet sein, wobei das Vorhandensein von C&sub5;-C&sub8;- Betahydroxyalkanoaten in B. megaterium bekannt ist, sowie Olefine, Alkohole und Epoxide.
In Rohextrakten von Z. ramigera ist D-Betahydroxybutyryl- CoA, jedoch nicht L-Hydroxybutyryl-CoA ein Substrat für PHB-Polymerase. Vermutlich können andere D-Hydroxyacyl-CoA- Verbindungen alternative Substrate oder Cosubstrate, wie D- Betahydroxyvaleryl-CoA (HV-CoA) nutzen. [2-³H]HB-CoA und Beta [3-¹&sup4;C]-HV-CoA, die jeweils ohne weiteres durch enzymatische oder chemische Synthese herstellbar sind, können als Substrate und zur Registrierung des ³H- und ¹&sup4;C-Gehalts und der Verhältnisse in den ausgefällten oder durch Gelfiltration aufgetrennten Polymeren verwendet werden. Dadurch können wohl Blockcopolymerbereiche, beispielsweise (HB)&sub5;&sub0;&sub0;(HV)&sub1;&sub0;&sub0;&sub0;(HB)&sub5;&sub0;&sub0;, durch sorgfältige Kontrolle der Substratverhältnisse und der austretenden Gruppen in der Elongationsphase, beispielsweise HB-oxo-CoA- und HV-S-CoA- Monomere, konstruiert werden.
Weitere alternative Substrate einschließlich verzweigtkettiger Betahydroxyacyl-CoAs können getestet werden. Das Testen kann nicht in ganzen Zellen erfolgen, da derartige Verbindungen normalerweise nicht in die Zellen transportiert werden. Alternative Substrate können bezüglich Hemmung normaler [¹&sup4;C]-PHB-Bildung zunächst durch Einbau von löslichem [¹&sup4;C]-HB-CoA in unlösliches Polymer, dann als Copolymerisationscosubstrate und schließlich bezüglich Homopolymerisation getestet werden. Alternative Substrate können bezüglich Km, Vmax relativ zu HB-CoA und bezüglich der Polymergröße, die durch kalibrierte Gelfiltrationsuntersuchungen bestimmt wird, getestet werden.
Verfahren zur Produktion von PHB auf kontinuierlicher Basis.
PHB wird in Bakterien produziert und gespeichert, wenn diese unter Bedingungen einer Nährstoffbegrenzung, üblicherweise Bedingungen mit Stickstoffbegrenzung (beispielsweise 0,1% Stickstoff in Abhängigkeit von der-Art) gezüchtet werden, obwohl auch ein Züchten der Bakterien unter Bedingungen, die begrenzten Sauerstoff, Phosphat oder eine andere Nicht-Kohlenstoff-Nährstoffquelle liefern, ebenfalls eine PHB-Synthese und -Speicherung induziert. Beispielsweise sammelt Azotobacter beijerinckii, ein stickstoffixierendes Bakterium, PHB bis zu einem Trockenzellgewicht von 70% an, wenn es auf Glucose/Ammoniumsalzen unter Sauerstoff beschränkung gezüchtet wird. Eine Steigerung des verfügbaren Sauerstoffs führt zu einer Abnahme der PHB-Synthese und einer gleichzeitigen Verringerung der Menge von zwei der Biosyntheseenzyme. Die Verringerung der Enzymmengen zeigt einen regulatorischen Mechanismus oder regulatorische Mechanismen mit Funktion auf dem genetischen Niveau an. Die Stickstoffbeschränkung des Wachstums von Alcaligenes eutrophus führt zu Ausbeuten von PHB von bis zu 80% Trockenzellgewicht. In ähnlicher Weise erhöhen Halobacterium und Pseudomonas sp. die PHB-Produktion unter Stickstoffbeschränkung.
Unter nicht-beschränkenden Bedingungen wird das PHB in normalerweise PHB-produzierenden Organismen rasch durch abbauende Enzyme abgebaut. Man kann diese Organismen in der Weise mutieren, daß die abbauenden Enzyme inaktiv oder zerstört werden, so daß das unter beschränkenden Wachstumsbedingungen angesammelte PHB unter nicht-beschränkenden Bedingungen nicht abgebaut werden kann. Damit diese Bakterien das Wachstum wieder aufnehmen, wird das PHB in das Medium ausgeschüttet. Alternativ ist es möglich, die erforderlichen Enzyme in einen Organismus einzuführen, der PHB nicht metabolisiert (Biosynthese oder Abbau), so daß der Organismus große Mengen an PHB unter beschränkenden Bedingungen ansammeln und bei einer Veränderung der Bedingungen zu nicht-beschränkenden Bedingungen das PHB in das Medium freisetzen kann.
Durch zyklischen Wechsel zwischen beschränkenden und nicht- beschränkenden Bedingungen kann die maximale Menge an PHB (bezogen auf die Extinktion der Bakterien, die als Funktion des Polymergehalts zunimmt) angesammelt, und anschließend das angesammelte Polymer durch Veränderung der Bedingungen zu nicht-beschränkenden Bedingungen, die die Replikation der Bakterien stimulieren, freigesetzt werden. Die Organismen können in üblichen bekannten Fermentationssystemen zur kontinuierlichen Entfernung des das Polymer enthaltenden Mediums ohne Aufbrechen der Bakterien gezüchtet werden.

Expression in Pflanzen und Produktion von PHB- und PHA- Polymeren

Wie im vorhergehenden in Bezug auf bakterielle Expressionssysteme beschrieben, können die Gene mit Codierung für die Thiolase, Reductase und/oder die Polymerase für PHB oder PHA in Pflanzen einer Vielzahl von Arten zur Erzeugung des gewünschten polymeren Produkts exprimiert werden. Die Vorteile eines derartigen Systems sind unmittelbar ersichtlich, nämlich die Verringerung der Abhängigkeit von Kunststoffen auf Erdölbasis und die Schaffung eines wirtschaftlich günstigen Ertrags für Pflanzen, die auf einer Vielzahl von Böden wachsen können.
Die erste Forderung an Pflanzengentechnik ist ein System zur Einführung der Fremd-DNA in Pflanzengewebe. Die gegen wärtig geläufigsten Vektoren sind die tumorinduzierenden (Ti-)Plasmide von Agrobacterium tumefaciens, die die DNA durch Infektion einführen. Pflanzen-DNA-Viren können ebenfalls als Vektoren verwendet werden, beispielsweise Vektoren auf der Grundlage von Blumenkohlmosaikviren- oder Geminivirusvektoren. Es gibt ferner eine Anzahl von Verfahren mit direktem Gentransfer zu Pflanzenzellen, die die chemisch stimulierte DNA-Aufnahme durch Protoplasten, Elektroporation, Elektroinjektion von intakten Pflanzenzellen, liposomenvermittelte Transformation von Protoplasten und DNA- Transformation durch direkte Injektion in Pflanzen umfassen. Eine chemisch stimulierte Aufnahme umfaßt die Inkubation von Protoplasten mit Donor- und Träger-DNA in Gegenwart von 13% (Gew./Vol.) Polyethylenglycol in 40 mM CaCl&sub2;. Es wird eine Nachinkubation durchgeführt, wobei die PEG- Konzentrationen schrittweise mit der schrittweisen Zunahme der CaCl&sub2;-Konzentration verringert werden. Elektroporation ist ein Verfahren, bei dem elektrische Pulse mit hoher Feldstärke zur reversiblen Permeabilisierung von Zellmembranen zur Erleichterung der Aufnahme großer Moleküle, einschließlich DNA, verwendet werden. Elektroinjektion und direkte Injektion weisen den Vorteil auf, daß sie nicht die vorherige Bildung von Protoplasten erfordern. Diese Verfahren sind dem Fachmann bekannt. Siehe hierzu beispielsweise den Übersichtsartikel von C. P. Lichtenstein und S. L. Füller, "Vectors for the genetic engineering of plants", Genetic Engineering, Hrsg. P. W. J. Rigby, Band 6, 104-171 (Academic Press Ltd. 1987).
Die Gene können in das Cytoplasma, die Mitochondrien oder die Chloroplasten entweder direkt oder unter Verwendung von Targetsequenzen eingeführt werden. Vektoren und Targetsequenzen und Promotoren für Pflanzen sind den Fachleuten bekannt und im Handel bei Pharmacia-LKB Biotechnology, 800 Centennial Ave., Piscataway, NJ 08854-9932, und Stragene, La Jolla, CA, erhältlich.
Jede Art von Pflanze, die ein geeignetes Kohlenstoffsubstrat erzeugt, kann zur Polymerproduktion technisch eingesetzt werden. Der hier im Zusammenhang mit der Herstellung von Polymeren in Pflanzen verwendete Ausdruck "Polymer" umfaßt PHB, PHA und neue Polymere auf Kohlenstoffbasis, die aus Fettsäuren unter Verwendung der beschriebenen Polymerasen synthetisiert wurden. Wenn die Pflanze die geeigneten Fettsäuren nicht bildet, können die Thiolase- und Reductasegene zusammen mit einer oder mehr Polymerase(n) in die Pflanze eingeführt werden. Die A. eutrophus-Polymerase polymerisiert C4- und C5-Substrate. Die P. oleovarans-Polymerase wirkt auf längere Substrate, beispielsweise C6- bis C18-Fettsäuren, jedoch nicht auf kurzkettige Fettsäuren. Die Pflanzen können auch vorzugsweise durch Mutagenese zur Blockierung der Abbauwege von Glycerinester und Fettsäuren modifiziert werden, so daß die Pflanze das geeignete Substrat bildet.
Die Gene können in jede Art von Pflanze eingeführt werden. Getreidepflanzen sind bevorzugt, beispielsweise Mais, Weizen und Reis, da diese in weitem Umfang angebaut werden und ihre genetischen Systeme gut charakterisiert sind. Andere geeignete landwirtschaftliche Pflanzen umfassen Tabak und hohe Ölsaatpflanzen, insbesondere die Varietäten, die in Wüsten- oder mineralisiertem Boden wachsen.
Die Gene könne auch in Pflanzenzellkultursysteme eingeführt werden, von denen viele den Fachleuten bekannt sind. Die Zellkultur einer Vielzahl von Getreide- und anderen landwirtschaftlichen Arten ist detailliert in Handbook of Plant Cell Culture, Band 4, herausgegeben von D. A. Evans, W. R. Sharp und P. V. Ammirato (Macmillan Publishing Co. NY 1986) beschrieben. Ein spezielles Beispiel eines Pflanzensystems, an dem viele gentechnische Arbeiten durchgeführt wurden, ist Arabidopsis thaliana. Eine Polymerproduktion in Zellkultur kann nicht nur durch Einführen der geklonten Gene, sondern auch durch Variation der Substrate und Zuchtbedingungen, wie bezüglich der Produktion in Bakterien beschrieben, manipuliert werden.
Modifikationen und Variationen der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren zur Herstellung von Polyhydroxybutyrat und Polyhydroxybutyrat ähnlichen Polymeren mit Kohlenstoff- Kohlenstoff-Skeletten unter Verwendung von Gentechnologie gemäß der vorhergehenden detaillierten Beschreibung und die hierbei gebildeten Polymere sind einem Fachmann geläufig. Derartige Variationen und Modifikationen liegen im Umfang der beigefügten Ansprüche.

Claims

1. Rekombinante Pflanze oder Pflanzenzelle, die ein Gen bakterieller Herkunft mit Codierung für eine Polyhydroxybutyratpolymerase und/oder ein Gen bakterieller Herkunft mit Codierung für eine Polyhydroxyalkanoatpolymerase und bei Bedarf ein Gen bakterieller Herkunft mit Codierung für eine Acetoacetyl-CoA- Reduktase enthält, wobei, wenn die Pflanze oder Pflanzenzelle das Gen oder die Gene enthält, dieses Polyhydroxybutyrat oder ein anderes Polyhydroxyalkanoat produzieren kann.

2. Rekombinante Pflanze oder Pflanzenzelle nach Anspruch 1, die des weiteren ein Gen bakterieller Herkunft mit Codierung für eine Acetoacetyl-CoA-Reduktase und/oder ein Gen bakterieller Herkunft mit Codierung für β- Ketothiolase enthält.

3. Rekombinante Pflanze oder Pflanzenzelle nach Anspruch 1 oder 2, wobei das Polymerasegen aus einem Bakterium stammt, das aus aus der Gruppe von Zoogloea, Azotobacter, Alcaligenes, Bacillus, Nocardia, Clostridium, Halobacterium, Pseudomonas und Rhodospirillium ausgewählt ist.

4. Rekombinante Pflanze oder Pflanzenzelle nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei das Gen mit Codierung für eine Polymerase aus Alcaligenes eutrophus oder aus Pseudomonas oleovorans oder aus Zoogloea ramigera stammt.

5. Rekombinante Pflanze oder Pflanzenzelle nach Anspruch 2, wobei das Gen mit Codierung für β-Ketothiolase aus Zoogloea ramigera oder Alcaligenes eutrophus stammt.

6. Rekombinante Pflanze oder Pflanzenzelle nach Anspruch 2, wobei das Gen mit Codierung für Acetoacetyl-CoA- Reduktase aus Zoogloea ramigera oder Alcaligenes eutrophus stammt.

7. Rekombinante Pflanze oder Pflanzenzelle nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei das Polymerasegen in die Pflanze unter Verwendung eines Vektors, der aus Agrobacterium-tumefaciens-Plasmiden und Pflanzenviren ausgewählt ist, eingeführt wurde.

8. Rekombinante Pflanze oder Pflanzenzelle nach einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei die Pflanze oder Pflanzenzelle eine Getreidepflanze oder -pflanzenzelle ist.

9. Rekombinante Pflanze oder Pflanzenzelle nach einem der Ansprüche 1 bis 8, worin die Glycerinester- und Fettsäureabbauwege blockiert sind.

10. Verfahren zur Herstellung einer rekombinanten Pflanze oder Pflanzenzelle gemäß der Definition in einem der Ansprüche 1 bis 9 durch Einführen der jeweiligen Gene bakterieller Herkunft mit Codierung für eine Polyhydroxybutyratpolymerase, eine Polyhydroxyalkanoatpolymerase, eine Acetoacetyl-CoA-Reduktase und/oder für eine β-Ketothiolase gemäß der Definition in den Ansprüchen, in eine Pflanze oder Pflanzenzelle.

11. Verfahren zur Herstellung von Polyhydroxybutyrat oder einem anderen Polyhydroxyalkanoat, wobei das Verfahren das Kultivieren einer Pflanze oder Pflanzenzelle nach einem der Ansprüche 1 bis 9 und die Herstellung des Polymers durch die Polymerase umfasst.