JP2005537017A - Nadh再生のためのリンゴ酸デヒドロゲナーゼの使用 - Google Patents
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Abstract
本発明は、エナンチオマー富化された有機化合物の製造方法に関する。特に本発明は、共役酵素的反応系において、NAD(P)Hが有機化合物の製造のための1種の酵素により消費され、かつNAD(P)Hが同時に第2の酵素系により再生される酵素的操作方法に関する。また、本発明により前記のように機能する反応系及び菌体触媒を提案する。
Description
本発明は、エナンチオマー富化された有機化合物の製造方法に関する。特に本発明は、共役酵素反応系において、NAD(P)Hが有機化合物製造のための1種の酵素により消費され、かつNAD(P)Hが同時に第2の酵素系により再生される酵素的操作方法に関する。また、本発明により前記のように機能する反応系、及び有利な菌体触媒又は好適なプラスミドを提案する。
光学活性有機化合物、例えばアルコール又はアミノ酸を生物触媒経路により製造することは、ますます重要性を増してきている。とりわけ、2種のデヒドロゲナーゼを共役させて使用すると共に補因子を再生させることは、これらの化合物、特にアルコール又はアミノ酸の大規模な工業的合成のための経路として明らかになっている(DE19753350号、EP118750号)。
トリメチルピルビン酸の還元的アミノ化においてカンジダ・ボイジニ由来のNAD依存性ギ酸デヒドロゲナーゼを用いてNADHを現場で再生させ、L−t−ロイシンを得る(ボンマリウスその他著、テトラへドロン アシンメトリー 1995年、6号、2851〜2888頁(Bommarius et al. Tetrahedron Asymmetry 1995,6,2851-2888)。
水性媒体中で効率的に利用される生物触媒は更に、これらの触媒特性及び効率の他に、多数の合成金属含有触媒と比較すると、金属含有出発物質、特に重金属を含有し、かつ従って毒性の物質の使用を省くことができるという利点を有している。不斉還元の場合における高価かつ更に危険な還元剤、例えばボランの使用をも省くことができる。
今までのところ、これらの系において首尾良く利用されるFDH、例えばカンジダ・ボイジニ由来のものは、この酵素分類の4〜8U/mgという比活性が極めて低いという欠点を有している。このことにより高価な酵素を大量に使用することが必要となると共に、このように設計される方法を工業的規模で経済的側面において有利に実施するのが望ましい場合であっても、再循環は装置の観点から困難である。
リンゴ酸デヒドロゲナーゼ(MDH)は、“リンゴ酸酵素”と呼ばれ、リンゴ酸からピルビン酸への酸化的脱炭酸を触媒する。種々の生物由来の多くのリンゴ酸デヒドロゲナーゼは公知であり、例えば特に高等動物、植物又は微生物由来のものである。4つの類型のリンゴ酸デヒドロゲナーゼ間で区別がなされ、これらは酵素分類E.C.1.1.1.37〜1.1.1.40に分類されている(http://www.genome.ad.jp)。NAD及び/又はNADPは、リンゴ酸デヒドロゲナーゼの類型に応じて補因子として要求される。
L−リンゴ酸からピルビン酸への酸化的脱炭酸反応の不可逆性に基づいて、リンゴ酸デヒドロゲナーゼの使用はまた、上記の系において好都合な補因子の再生に関して好適である。NADについての再生のためのリンゴ酸デヒドロゲナーゼの使用は、例えばスイエその他による1992年からの研究(S−I.スイエ、M.カワゴエ、S.イヌタ著、カナダ工業化学誌 1992年、70号、306〜312頁(S.-I. Suye,M.Kawagoe,S.Inuta,Can.J.Chem.Eng.1992,70,306-312)に記載されている。ここでは、リンゴ酸デヒドロゲナーゼによるNADHの再生は、NADHが消費されるアラニンデヒドロゲナーゼによるピルビン酸の還元的アミノ化のために使用されている。ピルビン酸はL−リンゴ酸から酸化的脱炭酸により形成され、かつ直ちに次の段階においてアラニンデヒドロゲナーゼにより更に消費される。従って反応液中におけるピルビン酸の濃縮は回避され、このことはまたピルビン酸の化学量論的範囲での量の存在により生ずる酵素のいかなる阻害の問題を解決する。それにもかかわらず、記載されている系は専らアラニンの製造に限定される(またS.−I.スイエ著、発酵生物工学の最近の研究と発展 1998年、1号、55〜64頁(S.-I. Suye,Recent Res.Devel.Ferment.Bioeng.1998,1,55-64)を参照のこと)。
興味深いことには、技術的に高度な可能性があるにもかかわらず、スイエの研究グループによるこれらの研究を別にして、ケトンの還元又はケト酸の還元的アミノ化の間に酸化された補因子NAD+を再生させるために“リンゴ酸デヒドロゲナーゼ”を使用する更なる研究は記載されていない。
従って本発明の課題は、1種の物質の製造に限定されることがない、リンゴ酸デヒドロゲナーゼを使用する、上記したように共役酵素反応系により得られるキラル有機化合物、例えばアミノ酸又はアルコールの更なる製造方法を提供することであった。特に、本方法を工業的規模で、特に経済的側面及び環境的側面において有利に利用することが望ましい。
前記課題は、本発明の請求項1の特徴を有する方法により解決される。請求項2から7は、好ましい実施態様に関する。請求項8及び9は、本発明にかかる反応系又は相応して機能する菌体触媒を保護する。請求項10は、好ましいプラスミドを保護する。
エナンチオマー富化された有機化合物を共役酵素反応系において製造するにあたり、NAD(P)Hを消費する有機物質の第1の酵素的変換と、L−リンゴ酸を酸化してピルビン酸及びCO2とするリンゴ酸デヒドロゲナーゼによる第2の酵素的変換におけるNAD(P)Hの再生よりなる方法において、第2の酵素的変換から形成したピルビン酸が第1の酵素的変換において基質として利用されない結果として、前記課題が全く予期されず、但し代わりに実に有利な方法により解決される。例えば、アミノ酸デヒドロゲナーゼと、脱炭酸作用を有するリンゴ酸デヒドロゲナーゼとを一緒に同時に使用することが、交差反応を起こすことなく問題無く可能であるということは、全く驚くべきこととみなすことができる。更に、一次反応の基質及び生成物のリンゴ酸デヒドロゲナーゼに対する阻害作用は見られず、その逆も同様である。特に、副生物として形成されたピルビン酸が、同時に利用されるリンゴ酸デヒドロゲナーゼ自体又はアルコールデヒドロゲナーゼ又はアミノ酸デヒドロゲナーゼに対する阻害作用を有しないことは、有望な特性である。
エナンチオマー富化されたアルコール又はアミノ酸は、有利には本発明にかかる方法を用いて製造される。この場合には、広く知られている安価なアルコールデヒドロゲナーゼ又はアミノ酸デヒドロゲナーゼが、第1の酵素的変換のための酵素として考えられる。原則的に当業者は、基質のスペクトル、当該酵素の安定性及び変換速度といった性質によりこれらを自由に選択する。この起源の公知の酵素は、K.ドローズ、H.ヴァルトマン(編)、有機合成における酵素触媒 第3巻、ワイリーVCH社、ヴァインハイム、2002年、第15章(K.Drauz,H.Waldmann(eds.),Enzyme Catalysis in Organic Synthesis,volume III,Wiley-VCH,Weinheim,2002,chapter 15)に記載されている。生物ロドコッカス・エリスロポリス由来のアルコールデヒドロゲナーゼ(S−ADH)又はラクトバチルス・ケフィア(Lactobacillus kefir)由来のアルコールデヒドロゲナーゼ(R−ADH)(R.エリスロポリス由来のADH:J.ピータース、T.ツェリンスキー、M.−R.クーラ著、ロドコッカス・エリスロポリスから単離された新規カルボニル還元酵素の精製と特性、生物工学誌 1994年、33号、283〜292頁(J.Peters,T.Zelinski,M.-R.Kula,Purification and characterizarion of a novel carbonyl reductase silated from Rhodococcus erythropolis,J.Biotechnol.1994,33,283-292))(ラクトバチルス・ケフィア由来のADH:C.W.ブラッドショウ、W.フンメル、C.−H.ウォン著、ラクトバチルス・ケフィアのアルコールデヒドロゲナーゼ:合成のための有用な触媒、有機化学誌 1992年、57号、1532〜1536頁(C.W.Bradshaw,W.Hummel,C.-H.Wong, Lactobacillus kefir Alcohol Dehydrogenase: A Useful Catalyst for Synthesis,J.Org.Chem.1992.57,1532-1536))が、特に有利である。好ましいアミノ酸デヒドロゲナーゼに関しては、当業者は、例えばロイシンデヒドロゲナーゼ又はフェニルアラニンデヒドロゲナーゼ(A.ボンマリウス:有機合成における酵素触媒作用(編:K.ドローズ、H.ヴァルトマン)第3巻、ワイリーVCH社、ヴァインハイム、2002年、第15.3章(A.Bommarius in: Enzyme Catalysis in Organic Synthesis(eds.: K.Drauz,H.Waldmann),volume III,Wiley-VCH,Weinheim,2002,chapter 15.3)を参照とする。
リンゴ酸デヒドロゲナーゼはまた、当業者に知られている(上記文献又はデュッセルドルフ大学のS.ナムニ(S.Naamnieh,University of Duesseldorf)による学位論文、調製項目を参照のこと)。ここではまた、当業者は、その目的のために最も効率的に利用できるデヒドロゲナーゼを選択する。原則的には、利用する他の酵素の反応過程についての障害を引き起こさない程度にNAD(P)Hを再生させるリンゴ酸デヒドロゲナーゼである。本文中では、E.コリK12由来の公知のリンゴ酸デヒドロゲナーゼが好ましい。遺伝子の単離及びクローニングは、デュッセルドルフ大学のS.ナムニの学位論文に記載されている、調製項目70頁以下参照のこと。
原則的に、本発明にかかる方法は純水溶液中で実施できる。しかしながら、例えば水溶性が不十分な基質に関しては、反応を最適化するために、水溶性有機溶剤を任意の所望の割合で水溶液に添加することも可能である。考えられるそのような溶剤は、特にエチレングリコール、DME又はグリセロールである。しかしながら、水相を有する多相系、特に2相系は、更にまた本発明にかかる方法のための溶剤混合物として機能できる。水溶性ではない所定の溶剤の使用については、既に以下に証明済みである(DE10233107号)。この文献でのこの点に関する記載はまた、本明細書においても適宜当てはまるものである。
原則的に、当業者は反応の間の温度を自由に選択する。当業者は、好ましくは生成物をできる限り高い収率で、できる限り高い純度で、できる限り短時間で得ようとする。更に、利用する酵素は利用温度下で十分に安定であり、かつ反応はできる限り高いエナンチオ選択性を伴って進行することが望ましい。好熱性生物由来の酵素の使用に関しては、全般的に100℃の温度が反応の温度範囲の上限を示しうる。−15℃は、確かに水系の下限として好適である。有利には10〜60℃、特に好ましくは20〜40℃の温度間隔が設定されることが望ましい。
反応の間のpHは、当業者により酵素の安定性及び変換速度に基づいて決定され、かつ本発明にかかる方法のために適宜調節される。E.コリ由来のリンゴ酸デヒドロゲナーゼについては、最適pHが>10であることが判明している。一般的に、酵素に好ましいpH5〜11の範囲が選択される。好ましくは5.5〜10.0、特に6.0〜9.0のpH範囲であってよい。
本発明はまた、エナンチオマー富化された有機化合物を製造するにあたり、NAD(P)Hを消費する有機基質の第1の酵素的変換と、L−リンゴ酸を酸化してピルビン酸及びCO2とするリンゴ酸デヒドロゲナーゼによる第2の酵素的変換におけるNAD(P)Hの再生よりなる共役酵素反応系であって、第2の酵素的変換から形成したピルビン酸を、第1の酵素的変換において基質として利用しない反応系を提供する。本発明にかかる方法に関して既に挙げたものと同様の有利かつ好ましい実施態様は、原則的に本反応系に当てはまる。本反応系は、有利には例えば回分操作及び連続操作の両方で操作できる、攪拌槽、攪拌槽のカスケード又は膜反応器中で利用する。本発明に関しては、膜反応器は、触媒が該反応器中に封入されている一方で、低分子量の物質が該反応器に供給されるか又は該反応器から出ることができる任意の反応容器を意味するとして理解される。ここでは膜は反応領域中に直接的に組み込まれていてよく、又はその外部で別個の濾過モジュール内に導入してよく、その際には反応溶液は該濾過モジュールを連続的に又は断続的に通過して流れ、かつ滞留生成物は反応器中を再循環する。好適な実施態様は、特にWO98/22415号及びヴァンドレイその他著、1998年の年鑑、プロセス工学と化学工学、VDI社、151頁以下参照(Wandrey et al.in Yearbook 1998,Verfahrenstechnik und Chemieingenieurwesen, VDI p.151);ヴァンドレイその他著、有機金属化合物を用いる応用均一系触媒作用、第2巻、VCH社、1996年、832頁以下参照(Wandrey et al. in Applied Homogeneous Catalysis with Organometallic Compounds,vol.2,VCH 1996,p. 832);クラーグルその他著、応用化学 1996年、6号、684頁以下参照(Kragl et al.,Angew.Chem.1996,6,684)に記載されている。バッチ操作及び半連続操作の他に、ここではこの装置において可能な連続操作を十字流濾過様式(図3)又は全量濾過(図2)において所望されるように実施できる。両方の変法は、原則的に先行技術に記載されている(生物分離のための工学プロセス、編:L.R.ヴェターレイ、ハインマン、1994年、135〜165頁(Engineering Processes for Bioseparations,ed.:L.R.Weatherley,Heinemann,1994,135-165);ヴァンドレイその他著、テトラヘドロン アシンメトリー 1999年、10号、923〜928頁(Wandrey et al.,Tetrahedron Asymmetry 1999,10,923-928))。
本発明はまた、クローニングされた有機基質の変換のための第1の酵素の遺伝子と、クローニングされたリンゴ酸デヒドロゲナーゼの遺伝子とを有し、NAD(P)Hを消費する第1の酵素的変換においてエナンチオマー富化された有機化合物の製造を可能にし、かつL−リンゴ酸を酸化してピルビン酸及びCO2とするリンゴ酸デヒドロゲナーゼによる第2の酵素的変換においてNAD(P)Hの再生を可能にする菌体触媒であって、第2の酵素的変換から形成したピルビン酸が、第1の酵素的変換において基質として利用されない菌体触媒を提供する。本発明にかかる菌体触媒は、好ましくはアミノ酸デヒドロゲナーゼ活性又はアルコールデヒドロゲナーゼ活性を有する酵素(ポリペプチド)と、特に上記の生物に由来するリンゴ酸デヒドロゲナーゼ活性を有する酵素とを有する。使用できる微生物は、原則的にこの目的のために当業者にとって考えられる全種の生物、例えば酵母、例えばハンゼヌラ・ポリモルファ(Hansenula polymorpha)、ピチアの種、又はサッカロセミス・セレビシエ、原核生物、例えばE.コリ又はバチルス・ズブチルス若しくは真核生物、例えば哺乳動物細胞又は昆虫細胞である。この目的のためには、好ましくはE.コリ株を使用するのが望ましい。以下のものが極めて特に好ましい:E.コリXL1 Blue、NM522、JM101、JM109、JM105、RR1、DH5α、TOP10−又はHB101。DE10155928号に挙げられているものと同様の生物は、好ましくは宿主生物として利用される。そのような生物の利点は、両方のポリペプチド系が同時に発現することであり、このことは本発明にかかる反応のために培養されるべき組換え生物が1種のみであることを意味する。ポリペプチドの発現をこれらの変換速度に関して調整させるために、相応のコーディング核酸配列を種々のコピー数を有する種々のプラスミドに提供してよく、及び/又は種々の効力のプロモーターを核酸配列の種々の強度の発現のために使用してもよい。そのように調整された酵素系においては、有利には中間化合物の蓄積が生ずることがなく、かつ当該反応は最適な総括速度で進行できる。しかしながら、このことは当業者に十分に知られている(ゲリッセン,G.;ピオンテック,M.;ダレムス,U.;イェンツェロスキー,V.;ガヴァガン,J.W.;ディコシモ,R.;アントン,D.L.;ヤノビッチ,Z.A.著(1996年)、生物触媒としての組換えハンゼヌラ・ポリモルファ、ホウレンソウグリコール酸オキシダーゼ(GO)及びS.セレビジエカタラーゼT(CTT1)遺伝子の同時発現、応用微生物工学、46号、46〜54頁(Gellissen, G.; Piontek,M.; Dahlems, U. ; Jenzelewski, V.; Gavagan, J.W.; DiCosimo, R.; Anton, D.L.; Janowicz, Z.A.(1996), Recombinant Hansenula polymorpha as a biocatalyst.Coexpression of the spinach glycollate oxidase (GO) and the S.cerevisiae catalase T(CTT1) gene, Appl. Microbiol. Biotechnol. 46, 46-54);ファーヴィック,M.;ロンドン,M.;ドーメン,J.;ダレムス,U.;ゲリッセン,G.;ストラッサー,A.W.著;DE19920712号(Farwick,M.; London, M.; Dohmen, J.; Dahlems, U.; Gellissen, G.; Strasser, A.W.; DE19920712))。本発明にかかる菌体触媒が場合により、本発明にかかる反応において形成されたピルビン酸を更に代謝し、ともかくこれを栄養源として使用することは極めて特に有利である。このように設計された菌体触媒は、ピルビン酸が反応の副生物としては得られず、かつ従ってまたピルビン酸を更なる工程段階において実際に所望されるキラル生成物から除去する必要がないということをも意味する。菌体触媒の製造は、原則的に当業者に知られている手段により実施できる(サムブルーク,J.;フリッチュ,E.F.及びマニアティス,T.著(1989年)、分子クローニング:実験室用取扱説明書、第2版、コールドスプリングハーバーラボラトリー出版、ニューヨーク(Sambrook,J.;Fritsch,E.F.and Maniatis,T.(1989),Molecular Cloning:a laboratory manual,2nd ed.,Cold Spring Harbor Laboratory Press,New York);バルバス,P.及びボリヴァー,F.著(1990年)、E.コリにおける発現プラスミドベクターの設計と構築、酵素学的研究法、185号、14〜37頁(Balbas,P.and Bolivar,F.(1990),Design and construction of expression plasmid vectors in E.coli,Methods Enzymol.185,14-37);ロドリゲス,R.L.及びデンハルト,D.T(編)(1998年)、ベクター:分子クローニングベクターとその使用に関する研究、205〜225頁、バターワース社、ストーンハム(Rodriguez,R.L. and Denhardt,D.T(eds)(1998),Vectors:a survey of molecular cloning vectors and their uses,205-225,Butterworth,Stoneham)。一般的操作(PCR、クローニング、発現等)に関しては、以下の文献及び該文献での引用物をも参照にできる:Universal GenomeWalkerTM Kit User Manual、Clontech社、3/2000及びその引用文献;トリグリア T.;ピーターソン,M.G.及びケンプ,D.J.著(1988年)、公知配列の境界外部にあるDNAセグメントのインビトロ増幅操作、核酸研究、16号、8186頁(Triglia T.;Peterson,M.G. and Kemp,D.J.(1988),A procedure for in vitro amplification of DNA segments that lie outside the boundaries of known sequences,Nucleic Acids Res.16,8186);サムブルーク,J.;フリッチュ,E.F.及びマニアティス,T.著(1989年)、分子クローニング:実験室用取扱説明書、第2版、コールドスプリングハーバーラボラトリー出版、ニューヨーク(Sambrook,J.;Fritsch,E.F. and Maniatis, T.(1989), Moleculer cloning:a laboratory manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York);ロドリゲス,R.L.及びデンハルト,D.T(編)(1988年)、ベクター:分子クローニングベクターとその使用に関する研究、バターワース社、ストーンハム(Rodriguez, R.L.and Denhardt, D.T(eds)(1988), Vectors: a survey of molecular cloning vectors and their uses, Butterworth, Stoneham)。
本発明はまた、リンゴ酸デヒドロゲナーゼの遺伝子と、NAD(P)Hの消費を伴う有機基質の変換のための酵素の遺伝子とが存在する遺伝子構築物を含有するプラスミドを提供する。考えられる起源のプラスミド又はベクターは、原則的にこの目的のために当業者に利用可能な全ての実施態様となる。そのようなプラスミド及びベクターは、例えばスチュディエ(Studier)ら(スチュディエ,W.F.;ローゼンバーク A.H.;ダン J.J.;デュベンドロフ J.W.;著(1990年)、クローニングされた遺伝子の直接的発現のためのT7RNAポリメラーゼの使用、酵素学的研究法、185号、61〜89頁(Studier,W.F.;Rosenberg A.H.;Dunn J.J.;Dubendroff J.W.;(1990),Use of the T7 RNA polymerase to direct expression of cloned genes, Methods Enzymol.185,61-89))又はNovagen社、Promega社、New England Biolabs社、Clontech社又はGibco BRL社の冊子に見出すことができる。更なる好ましいプラスミド及びベクターは:グローヴァー,D.M.著(1985年)、DNAクローニング:実用的アプローチ、第1〜3巻、IRL出版社、オックスフォード(Glover,D.M.(1985),DNA cloning: A Practical Approach,vol.I-III,IRL Press Ltd.,Oxford);ロドリゲス,R.L.及びデンハルト,D.T(編)(1988年)、ベクター:分子クローニングベクターとその使用に関する研究、179〜204頁、バターワース社、ストーンハム(Rodriguez,R.L. and Denhardt,D.T(eds)(1988),Vectors: a survey of molecular cloning vectors and their uses,179-204,Butterworth,Stoneham);ゲッデル,D.V.著(1990年)、異種遺伝子発現系、酵素学的研究法、185号、3〜7頁(Goeddel,D.V.(1990),Systems for heterologous gene expression,Methods Enzymol.185,3-7);サムブルーク,J.;フリッチュ,E.F.及びマニアティス,T.著(1989年)、分子クローニング:実験室用取扱説明書、第2版、コールドスプリングハーバーラボラトリー出版、ニューヨーク(Sambrook,J.;Fritsch,E.F. and Maniatis,T.(1989),Molecular cloning: a laboratory manual,2nd ed.,Cold Spring Harbor Laboratory Press,New York)に見出すことができる。本発明にかかる核酸を含有する遺伝子構築物を宿主生物内で特に好ましい方法でクローニングできるプラスミドは:pUC18(Roche Biochemicals社製)、pKK−177−3H(Roche Biochemicals社製)、pBTac2(Roche Biochemicals社製)、pKK223−3(Amersham Pharmacia Biotech社製)、pKK−233−3(Stratagene社製)又はpET(Novagen社製)である。プラスミドpkk/phe/mali(図5)は、本文中において有利である。このプラスミド及び相応の組換え微生物の調製は、デュッセルドルフ大学のS.ナムニによる学位論文に記載されている、調製項目70頁以下参照のこと。
使用については、本発明にかかる方法の当該ポリペプチドは、均一に精製された化合物又は組換え方法により調製された酵素のような自由な形態で使用できる。これらのポリペプチドは更にまた、インタクトな寄生生物の構成成分として又は任意の所望の程度まで精製された、宿主生物の破砕された細胞塊と組み合わせて利用することもできる。また、酵素を固定化した形態で使用することも可能である(シャルマ B.P.;ベイリー L.F.及びメッシング R.A.著(1982年)、固定化生体材料−技術と使用、応用化学 94号、836〜852頁(Sharma B.P.;Bailey L.F.and Messing R.A.(1982),Immobilisierte Biomaterialiern-Techniken und Anwendungen,Angew.Chem.94,836-852)。固定化は、有利には凍結乾燥により実施する(パラドッカー,V.M.;ドーディック,J.S.著(1994年)、ほぼ無水の有機溶剤中に溶解したα−キモトリプシンの水様の活動性、アメリカ化学協会誌 116号、5009〜5010頁(Paradkar,V.M.;Dordick,J.S.(1994),Aqueous-Like Activity of α-Chymotrypsin Dissolved in Nearly Anhydrous Organic Solvents,J.Am.Chem.Soc.116,5009-5010);モリ,T.;オカハタ,Y.著(1997年)、均一な有機溶剤中における有効なグリコシル転移触媒としての脂質被覆の配糖体加水分解酵素の多様性、テトラヘドロン レタース 38号、1971〜1974頁(Mori,T.;Okahata,Y.(1997), A variety of lipi-coated glycoside hydrolases as effective glycosyl transfer catalysts in homogeneous organic solvents,Tetrahedron Lett.38,1971-1974);オタミリ,M.;アドレクルーツ,P.;マティアソン,B.著(1992年)、酵素を活性形態でトルエン中に可溶化させる手段としてのキモトリプシンとエチルセルロースとの複合体形成、生物触媒 6号、291〜305頁(Otamiri,M.;Adlercreutz,P.;Matthiasson,B.(1992),Complex formation between chymotrypsin and ethyl cellulose as a means to solubilize the enzyme in active form in toluene,Biocatalysis 6,291-305)。界面活性物質、例えばAerosol OT又はポリビニルピロリドン又はポリエチレングリコール(PEG)又はBrij52(ジエチレングリコールモノセチルエーテル)(カミヤ,N.;オカザキ,S.−Y.;ゴトウ,M.著(1997年)、無水ベンゼン中における触媒として活性な界面活性剤−西洋ワサビペルオキシダーゼ複合体、生物工学技術 11号、375〜378頁(Kamiya,N.;Okazaki,S.-Y.;Goto,M.(1997), Surfactant-horseradish peroxidase complex catalytically active in anhydrous benzene,Biotechnol.Tech.11,375-378)の存在下における凍結乾燥が、極めて特に好ましい。Eupergit(R)、特にEupergit C(R)又はEupergit 250L(R)(Roehm社製)(Eupergit.RTM.C、酵素の固定化用担体の工業的可能性、カシャルスキー−カツィア,E.;クレマー,D.M.著 分子触媒B誌:酵素(2000年)、10号(1〜3)、157〜176頁(Eupergit.RTM.C,a carrier for immobilization of enzymes of industrial potential.Katchalski-Katzir,E.;Kraemer,D.M.Journal of Molecular Catalysis B:Enzymatic (2000),10(1-3),157-176)上での固定化が、殊に好ましい。Ni−NTA上にHisタグ(ヘキサ−ヒスチジン)が追加されたポリペプチドを結合させて固定化することは、同様に好ましい(ポリヒスチジンアフィニティータグを使用するタンパク質精製、ボーンホースト,ジョシュア A.;ファルケ,ジョセフ J.著 酵素学研究法(2000年)、326号、245〜254頁(Purification of proteins using polyhistidine affinity tags.Bornhorst,Joshua A.;Falke,Joseph J.Methods in Enzymology(2000),326,245-254)。また、CLECとしての使用が考えられる(セント.クレア,N.;ワン,Y.−F.;マルゴリン,A.L.著(2000年)、アルコールデヒドロゲナーゼの補因子結合の架橋酵素結晶(CLEC)、応用化学国際版 39号、380〜383頁(St.Clair,N.;Wang,Y.-F.;Margolin,A.L.(2000),Cofactor-bound cross-linked enzyme crystals(CLEC) of alcohol dehydrogenase,Angew.Chem.Int.Ed.39,380-383)。これらの手段により、有機溶剤のために不安定になるポリペプチドから、水性溶剤と有機溶剤との混合物中で又は完全に有機媒質中で機能できるものを生成させることが可能である。
本発明にかかる方法は、E.コリ由来のMDHとNAD依存性ロイシンデヒドロゲナーゼ(バチルス・セレウス由来のLeuDH;Sigma社製)とが共役するように実施できる。LeuDHは、NADHを消費しながら、脂肪族ケト酸、例えばケトイソカプロン酸から相応のL−アミノ酸、例えばL−ロイシンへの還元的アミノ化を触媒する(式(1))。
反応経過はHPLCによりモニタリングした。結果は、MDHの代わりにFDHを用いた同様の変換と比較した以下の第1表から見られる。
第1表:共役され、補酵素の再生を伴うバッチ中におけるMDH及びFDHによるL−ロイシンの形成の比較(HPLC)。それぞれの場合において、10mMのケトイソカプロン酸と、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ(MDH)による再生のために100mMのL−リンゴ酸を又はギ酸デヒドロゲナーゼ(FDH)による再生のために100mMのギ酸を利用した。
また、アルコールデヒドロゲナーゼとリンゴ酸デヒドロゲナーゼとを組み合わせて使用することについても調査した。E.コリ由来のMDHと、ロドコッカス・エリスロポリス由来のNAD依存性S特異性アルコールデヒドロゲナーゼ(RE−ADH;DE10218689号)とを共役させる。ここでは、MDHの有用性を、式4によるケトン(p−Cl−アセトフェノン=pCAp)の還元により試験する。
第2表:時間の関数としての、ケトンのp−Cl−アセトフェノン(10mM使用)の減少と、酵素的に形成されたアルコールのp−Cl−フェニルエタノール(100%、10mMに相当)の増加。
エナンチオマー富化された又はエナンチオマー富化というのは、混合物中で光学対掌体の一方がその他方と一緒に>50%にのぼり存在しているという事実を説明するものである。
示される構造は、1つの立体中心が存在すれば、考えられる2種のエナンチオマーに符号し、1つ以上の立体中心が分子中に存在すれば、これらは考えられる全種のジアステレオマーに符号し、かつ1種のジアステレオマーに関しては、当該化合物についてその範囲内で考えられる2種のエナンチオマーに符号する。
生物カンジダ・ボイジニは、American Type Culture CollectionにATCC32195の番号下で寄託されており、一般に入手できる。
本明細書中で言及した先行技術文献はまた、開示に含まれるものとみなす。
図面の簡単な説明:
図2は、全量濾過用の膜反応器を示す。基質1をポンプ2により、膜5を収容する反応器領域3内に移送させる。攪拌子を用いて作動させる反応器領域内には、溶剤の他に、触媒4、生成物6及び未反応の基質1が存在する。低分子量物6を、主として膜5により濾別する。
図2は、全量濾過用の膜反応器を示す。基質1をポンプ2により、膜5を収容する反応器領域3内に移送させる。攪拌子を用いて作動させる反応器領域内には、溶剤の他に、触媒4、生成物6及び未反応の基質1が存在する。低分子量物6を、主として膜5により濾別する。
図3は、十字流濾過用の膜反応器を示す。ここでは、基質7をポンプ8により撹拌反応器領域内に移送させ、その際に該領域には同様に溶剤、触媒9及び生成物14が存在する。存在してよい熱交換器12を介して十字流濾過セル15内に導びかれる溶剤流を、ポンプ16により設定する。ここでは、低分子量の生成物14を膜13により取り出す。次いで、高分子量の触媒9を溶剤流と一緒に、適すれば再び熱交換器12を介し、適すればバルブ11を介して反応器10内に戻す。
実施例1:
ここで使用するE.コリK12由来のMDHの製造については、デュッセルドルフ大学のS.ナムニによる学位論文、調製項目70頁以下参照のこと。
ここで使用するE.コリK12由来のMDHの製造については、デュッセルドルフ大学のS.ナムニによる学位論文、調製項目70頁以下参照のこと。
E.コリ由来のMDHの精製及び生物化学的特性:
a)精製
E.コリの粗抽出物(発現株:E.コリ派生物JM105)からの組換えMDHの精製を、精製プロトコールにより実施した(ストルス L.,及びドネリー M.I.著(1997年)、エッセリシア・コリ変異体内におけるNAD(+)依存性リンゴ酸酵素の過剰発現によるコハク酸の製造、応用環境微生物学 63号:2695〜2701頁(Stols L.,and Donnelly M.I.(1997).Production of succinic acid through overexpression of NAD(+)-dependent malic enzyme in an Escherichia coli mutant. Appl Environ Microbiol 63:2695-701)。最初に組換え細菌細胞を、ガラスビーズを用いる粉砕により破砕した(破砕用緩衝液はトリス/HCl 100mM pH7.5)。次いで、Q−セファロースによる精製段階を実施した。Q−セファロースによる精製の後に、約7.3U/mgのMDHの比活性を測定することができた。この酵素を更なるクロマトグラフィー段階、ヒドロキシアパタイト及びフェニルセファロースにより精製することによりMDHを均一に精製することができ、その際、比活性は133U/mgであった。
a)精製
E.コリの粗抽出物(発現株:E.コリ派生物JM105)からの組換えMDHの精製を、精製プロトコールにより実施した(ストルス L.,及びドネリー M.I.著(1997年)、エッセリシア・コリ変異体内におけるNAD(+)依存性リンゴ酸酵素の過剰発現によるコハク酸の製造、応用環境微生物学 63号:2695〜2701頁(Stols L.,and Donnelly M.I.(1997).Production of succinic acid through overexpression of NAD(+)-dependent malic enzyme in an Escherichia coli mutant. Appl Environ Microbiol 63:2695-701)。最初に組換え細菌細胞を、ガラスビーズを用いる粉砕により破砕した(破砕用緩衝液はトリス/HCl 100mM pH7.5)。次いで、Q−セファロースによる精製段階を実施した。Q−セファロースによる精製の後に、約7.3U/mgのMDHの比活性を測定することができた。この酵素を更なるクロマトグラフィー段階、ヒドロキシアパタイト及びフェニルセファロースにより精製することによりMDHを均一に精製することができ、その際、比活性は133U/mgであった。
第3表:E.コリ由来の組換えMDHの精製の概要。
b)生物化学的特性
Km値
L−リンゴ酸については0.29mMのKm値が測定され、かつ補酵素NAD+については0.14mMのKm値が測定された。両方のKm値は、<1mMという低い範囲にあり、かつこれらは、2種の基質が酵素により良好な親和性を伴って認識されることを示す。これら2つの値は、MDHをNADHの再生のために使用できることを示唆する。
Km値
L−リンゴ酸については0.29mMのKm値が測定され、かつ補酵素NAD+については0.14mMのKm値が測定された。両方のKm値は、<1mMという低い範囲にあり、かつこれらは、2種の基質が酵素により良好な親和性を伴って認識されることを示す。これら2つの値は、MDHをNADHの再生のために使用できることを示唆する。
最適pH(図1)
MDHは、11以上という比較的高いpH値で最大の活性を示す。それにもかかわらず、低pH値での活性の降下は比較的小さく、例えばpH8.0では72%の活性が、pH7.0では67%の活性が依然として存在する。
MDHは、11以上という比較的高いpH値で最大の活性を示す。それにもかかわらず、低pH値での活性の降下は比較的小さく、例えばpH8.0では72%の活性が、pH7.0では67%の活性が依然として存在する。
最適温度
MDHの最適温度は、約55℃である(図4)。
MDHの最適温度は、約55℃である(図4)。
実施例2:
a)ロイシンデヒドロゲナーゼとリンゴ酸デヒドロゲナーゼとの共役
E.コリ由来のMDHとNAD依存性ロイシンデヒドロゲナーゼ(バチルス・セレウス由来のLeuDH;Sigma社製)とを共役させる。LeuDHは、NADHを消費しながら、脂肪族ケト酸、例えばケトイソカプロン酸から、相応のL−アミノ酸、例えばL−ロイシンへの還元的アミノ化を触媒する。
a)ロイシンデヒドロゲナーゼとリンゴ酸デヒドロゲナーゼとの共役
E.コリ由来のMDHとNAD依存性ロイシンデヒドロゲナーゼ(バチルス・セレウス由来のLeuDH;Sigma社製)とを共役させる。LeuDHは、NADHを消費しながら、脂肪族ケト酸、例えばケトイソカプロン酸から、相応のL−アミノ酸、例えばL−ロイシンへの還元的アミノ化を触媒する。
試験用バッチ(全量1ml;特に記載が無い限り、原液の濃度を括弧内に示す):
526μlのヘペス緩衝液(200mMヘペス、pH8.5、10mMのMgCl2を有する);143μlの硫酸アンモニウム溶液(試験物中500mM);100μlのケトイソカプロン酸(100mM);20μlのNAD+(50mM);200μlのL−リンゴ酸(500mM、Na塩、ヘペス緩衝液に溶解、pH8.5);1μlのLeuDH(試験物中0.5U);10μlのMDH(試験物中1.5U;部分精製品)。
526μlのヘペス緩衝液(200mMヘペス、pH8.5、10mMのMgCl2を有する);143μlの硫酸アンモニウム溶液(試験物中500mM);100μlのケトイソカプロン酸(100mM);20μlのNAD+(50mM);200μlのL−リンゴ酸(500mM、Na塩、ヘペス緩衝液に溶解、pH8.5);1μlのLeuDH(試験物中0.5U);10μlのMDH(試験物中1.5U;部分精製品)。
試験用バッチを30℃でインキュベートし、かつ0、10、30、60及び120分後に試料を採り出し(50μl;エッペンドルフ反応容器)、かつ3分間にわたり95℃で加熱し、反応を停止する。変性したタンパク質を10分間にわたり13000rpmで遠心分離(エッペンドルフベンチ型遠心機)することにより除去し、かつオルト−フタルアルデヒド(OPA)を用いて誘導体化した後に上清をHPLCにより分析する。
OPA(=オルト−フタルジアルデヒド)を用いる誘導体化:
140μlのホウ酸Na緩衝液(100mM;pH10.4);40μlの試料又は標準物;20μlのOPA/IBLC試薬(=オルト−フタルジアルデヒド/N−イソブチリル−L−システイン)。この反応溶液20μlをHPLC分析のために注入する。
140μlのホウ酸Na緩衝液(100mM;pH10.4);40μlの試料又は標準物;20μlのOPA/IBLC試薬(=オルト−フタルジアルデヒド/N−イソブチリル−L−システイン)。この反応溶液20μlをHPLC分析のために注入する。
HPLC分析:
結果については第1表を参照のこと:
結果については第1表を参照のこと:
b)比較実験:ロイシンデヒドロゲナーゼとギ酸デヒドロゲナーゼとの共役
同時に実施した比較用バッチにおいては、上記と同様の成分を使用し、但しリンゴ酸デヒドロゲナーゼの代わりに0.5Uのギ酸デヒドロゲナーゼ(カンジダ・ボイジニ由来のFDH;Sigma社製)を利用し、かつ100mMのL−リンゴ酸の代わりに100mMのギ酸を再生用基質として使用した。
同時に実施した比較用バッチにおいては、上記と同様の成分を使用し、但しリンゴ酸デヒドロゲナーゼの代わりに0.5Uのギ酸デヒドロゲナーゼ(カンジダ・ボイジニ由来のFDH;Sigma社製)を利用し、かつ100mMのL−リンゴ酸の代わりに100mMのギ酸を再生用基質として使用した。
結果については第1表を参照のこと。
実施例3:MDHとアルコールデヒドロゲナーゼとの共役:
E.コリ(発現株:E.コリ派生物JM105)由来のMDHと、ロドコッカス・エリスロポリス由来のNAD依存性S特異性アルコールデヒドロゲナーゼ(RE−ADH)とを共役させる。ここでは、MDHの有用性をケトン(p−Cl−アセトフェノン)の還元により試験する。
E.コリ(発現株:E.コリ派生物JM105)由来のMDHと、ロドコッカス・エリスロポリス由来のNAD依存性S特異性アルコールデヒドロゲナーゼ(RE−ADH)とを共役させる。ここでは、MDHの有用性をケトン(p−Cl−アセトフェノン)の還元により試験する。
試験用バッチ(全量1ml;特に記載が無い限り、原液の濃度を括弧内に示す):
678.7μlのヘペス緩衝液(100mMヘペス、pH8.5、10mMのMgCl2を有する);1.3μlのp−Cl−アセトフェノン(試験物中10mM);20μlのNAD+(50mM);200μlのL−リンゴ酸(500mM、Na塩、ヘペス緩衝液に溶解、pH8.5);15μlのRE−ADH(試験物中1U);85μlのMDH(試験物中1U;部分精製品)。
678.7μlのヘペス緩衝液(100mMヘペス、pH8.5、10mMのMgCl2を有する);1.3μlのp−Cl−アセトフェノン(試験物中10mM);20μlのNAD+(50mM);200μlのL−リンゴ酸(500mM、Na塩、ヘペス緩衝液に溶解、pH8.5);15μlのRE−ADH(試験物中1U);85μlのMDH(試験物中1U;部分精製品)。
試験用バッチを30℃でインキュベートし、かつ0、10、20、30及び60分後に、試料(50μl)を採り出し、100μlのエチルアセテートを添加し、かつ上相をガスクロマトグラフィーにより、アルコールのp−Cl−フェニルエタノールの形成について分析する。
結果については第2表を参照のこと。
実施例4:異種発現用の発現ベクターの構築
増幅される断片の配列に基づいて、制限切断部位とリボソーム結合部位のコドンとが統合されたプライマーを構築した。組換えpUC18からのリンゴ酸デヒドロゲナーゼの増幅後に、このPCR断片を組換えrecPhe−pKK−223−3発現ベクター中に、PheDH配列の後部にPstI及びHindIII制限切断部位でクローニングした(図8−菌体変換によるL−Phe合成のための異種発現用プラスミドの構築物)。
増幅される断片の配列に基づいて、制限切断部位とリボソーム結合部位のコドンとが統合されたプライマーを構築した。組換えpUC18からのリンゴ酸デヒドロゲナーゼの増幅後に、このPCR断片を組換えrecPhe−pKK−223−3発現ベクター中に、PheDH配列の後部にPstI及びHindIII制限切断部位でクローニングした(図8−菌体変換によるL−Phe合成のための異種発現用プラスミドの構築物)。
PCR:
5’順方向:N’−リンゴ酸デヒドロゲナーゼ−pst
5’CTGCAGAGCCCAGGGATGGATATTCAAAAA 3’
濃度100ピコモル/μl
5’逆方向:C’−リンゴ酸デヒドロゲナーゼ−Hin
5’AAGCTTTTAGATGGAGGTACGGCGGTAGTC 3’
濃度100ピコモル/μl
5’順方向:N’−リンゴ酸デヒドロゲナーゼ−pst
5’CTGCAGAGCCCAGGGATGGATATTCAAAAA 3’
濃度100ピコモル/μl
5’逆方向:C’−リンゴ酸デヒドロゲナーゼ−Hin
5’AAGCTTTTAGATGGAGGTACGGCGGTAGTC 3’
濃度100ピコモル/μl
第4表:組換えpUC18プラスミドからのリンゴ酸デヒドロゲナーゼの増幅のためのPCRプロトコール。テンプレートDNAの濃度を変えた。
1サイクルの構成:
変性段階:94℃
アニーリング段階:59℃
増幅段階:72℃
変性段階:94℃
アニーリング段階:59℃
増幅段階:72℃
クローニング:
組換えプラスミドの新たな構築物(図5)により、コンピテントE.コリ細胞JM105又はHB101を形質転換した。
組換えプラスミドの新たな構築物(図5)により、コンピテントE.コリ細胞JM105又はHB101を形質転換した。
標準的な形質転換をハナハン(Hanahan)のプロトコール(ハナハン D.著(1983年)、プラスミドを用いるエッセリシア・コリの形質転換に関する研究、分子生物学誌 166号:557〜580頁(Hanahan D,(1983).Studies on transformation of Escherichia coli with plasmids.J Mol Biol 166:557-80.)により実施した。このために、100〜200μlのコンピテントE.コリ細胞を氷上で溶かし、かつライゲーション用バッチからのDNA40ngを添加した。プラスミドと細胞との懸濁液を30分間にわたり氷上で冷却し、かつ次いで42℃で90秒にわたり加熱し、かつ直ちに再び氷上で冷却した。300μlのLB培地を添加した後に、再生のために細胞を約45分間にわたり37℃でインキュベートした。次いで、この培養物200μlを、抗生物質を含有するLBプレート上に全て平板培養し、37℃でオーバーナイトでインキュベートした。
リボソーム結合部位と一緒にリンゴ酸デヒドロゲナーゼの3’側からPheDHまでをPstI及びHindIII切断部位でクローニングすると、2種の酵素を同時に発現させることができた。注:これらの細胞の実験用調製物についての更なる詳細な情報は:デュッセルドルフ大学のS.ナムニの学位論文、調製項目に記載される。
実施例5:PheDHとリンゴ酸デヒドロゲナーゼの同時発現
ポジティブクローンのうち、その幾つかを発現のために選択した。特定のクローンの個々のコロニーを、5mlのLBamp培地に植え替え、かつOD580=0.6に達した後に、1mMのIPTGを用いて誘導した。この誘導はオーバーナイトで実施し、かつ回収した細胞を超音波を用いて破砕した。
ポジティブクローンのうち、その幾つかを発現のために選択した。特定のクローンの個々のコロニーを、5mlのLBamp培地に植え替え、かつOD580=0.6に達した後に、1mMのIPTGを用いて誘導した。この誘導はオーバーナイトで実施し、かつ回収した細胞を超音波を用いて破砕した。
組換え株HB101は、100U/mlのリンゴ酸デヒドロゲナーゼ活性及び同様に130U/mlのPheDH活性を示す。組換え株JM105のこれら2種の酵素の活性は明らかに高く、リンゴ酸デヒドロゲナーゼについては、〜600U/ml、かつPheDHについては、〜1200U/mlである。
これら2種の組換え株を、10lの発酵槽内で培養し、かつこれらの2種の酵素の活性を測定した。
第5表:LB培地を有する10lの発酵槽内において回分発酵時に発現した酵素の活性の測定。
表示データから、E.コリ株JM105が両方の酵素について顕著に良好な活性を示すことが見られるので、更なる全ての実験をこの株を用いて実施した。
実施例6:活性の最適化
得られた粗抽出物の最大限の活性を利用可能とするために、幾つかのパラメータを調査し、かつ変化させた。
得られた粗抽出物の最大限の活性を利用可能とするために、幾つかのパラメータを調査し、かつ変化させた。
異種発現された2種の酵素は、最良の安定性の特性を異なる条件下で示す。両方の酵素についての同じ系における最適の特性を測定するのは興味深いことであった。以下の実験は、この事実に基づいて実施した。
a)破砕用緩衝液の最適化
1gの細胞JM105を、BSA(1.5g/l)を30%で有する/有さない0.1Mのトリス又は0.1MのKpi緩衝液中で破砕した。この破砕を、超音波を用いて連続70サイクルにわたり実施した。この緩衝液の他に、1.5g/lのBSAを酵素の安定化のために添加した。
1gの細胞JM105を、BSA(1.5g/l)を30%で有する/有さない0.1Mのトリス又は0.1MのKpi緩衝液中で破砕した。この破砕を、超音波を用いて連続70サイクルにわたり実施した。この緩衝液の他に、1.5g/lのBSAを酵素の安定化のために添加した。
第6表:破砕用緩衝液の作用時における活性の比較。
BSAを添加すると、両方の場合において活性が増加する。破砕用緩衝液はまた、活性に影響を及ぼした。ここでは、個々の酵素により好適な破砕用緩衝液が異なることが見られた。Kpi緩衝液は、リンゴ酸デヒドロゲナーゼよりもPheDHについてより好適であるが、Kpi緩衝液中のリンゴ酸デヒドロゲナーゼの活性の低下は比較的小さいので、組換え細胞をこの緩衝液中で異種発現の後に引き続いて破砕した。
b)安定性を調査するための破砕の継続時間
また、破砕の継続時間についても調査し、かつこの操作の間にわたる酵素の安定性についての臨界点を測定した。これらのデータから、最適な破砕の継続時間を得ることができた(図9−超音波により種々の時間で破砕した後のPheDH及びリンゴ酸デヒドロゲナーゼの安定性測定。細胞を、60及び30秒の処理の後に中間的に30秒にわたり冷却した。
また、破砕の継続時間についても調査し、かつこの操作の間にわたる酵素の安定性についての臨界点を測定した。これらのデータから、最適な破砕の継続時間を得ることができた(図9−超音波により種々の時間で破砕した後のPheDH及びリンゴ酸デヒドロゲナーゼの安定性測定。細胞を、60及び30秒の処理の後に中間的に30秒にわたり冷却した。
以下の懸濁液をこの実験のために使用した:
1g 組換え細胞(JM105)
3ml Kpi緩衝液0.1M
1g 組換え細胞(JM105)
3ml Kpi緩衝液0.1M
超音波を用いた細胞の長い処理の間に、PheDHの活性は劇的に低下する一方で、リンゴ酸デヒドロゲナーゼの活性は保持される。従って、1gの組換えE.コリJM105を25%破砕する理想的な破砕条件は、4×30秒の超音波処理と氷浴中での3×30秒の中間的な冷却である。
超音波を用いた長い処理の間に試料を加熱すると、酵素を変性させることができる。この実験においてタンパク質の量を測定し、かつ該量は以下に見られる。
第7表:種々の時間で破砕した後の発現した2種の酵素、即ちPheDH及びリンゴ酸デヒドロゲナーゼのタンパク質定量。細胞を、60及び30秒の処理の後に30秒にわたり中間的に冷却した。
リンゴ酸デヒドロゲナーゼを均一に精製すると、466U/mgの比活性を実現することが可能であった。この精製段階を第8表にまとめた。
第8表:組換えリンゴ酸デヒドロゲナーゼの精製。
c)Km値の測定
KM値を、リンゴ酸デヒドロゲナーゼの基質及び補酵素について測定した。このKM値は、均一な又は部分的に精製された組換えリンゴ酸デヒドロゲナーゼ試料について測定した。
L−リンゴ酸:0.29mM
NAD+ 0.14mM
KM値を、リンゴ酸デヒドロゲナーゼの基質及び補酵素について測定した。このKM値は、均一な又は部分的に精製された組換えリンゴ酸デヒドロゲナーゼ試料について測定した。
L−リンゴ酸:0.29mM
NAD+ 0.14mM
実施例7:L−フェニルアラニン合成と補酵素NADH再生との共役
共役反応の重要な要因は、2種の酵素の最適pH及び熱安定性である。酵素の安定性の他に、更なる要因、例えば種々の基質の酵素に対する影響がその役割を担う。
共役反応の重要な要因は、2種の酵素の最適pH及び熱安定性である。酵素の安定性の他に、更なる要因、例えば種々の基質の酵素に対する影響がその役割を担う。
最適pHに関しては、速度論的研究を行い、かつ合成のpH依存性を測定した。pHの増加に伴う活性の増加が図10から見られ、2種の酵素が最も高い活性を示していないが補酵素は安定したままであるpH8.0を、補酵素の安定性の理由のために合成用に選択する(図10−リンゴ酸デヒドロゲナーゼ及びPheDHの最適pH。pHが増加するにつれて、2種の酵素の活性は増加する。測定を部分精製された酵素を用いて実施した。フェニルアラニンデヒドロゲナーゼについては、還元的アミノ化を測定した)。
共役酵素反応についての第2の要因は、2種の酵素が比較的長時間にわたり安定したままである好適な温度である。従って、更なる実験を実施して最適温度を決定した(図11−最適温度。測定をpH8.5、かつ0.1Mヘペス緩衝液中で実施した)。
図11から見られるように、両方の酵素の最適温度は50℃である。30℃で測定した活性は、60%にすぎない。
リンゴ酸デヒドロゲナーゼは45℃で比較的長時間にわたり安定である。しかしながら、PheDHがこの温度値で不安定になるので、比較的長時間にわたる両方の酵素及び補酵素の安定性を保証できるように、合成を30℃で実施した。
酵素はこれらの最適な活性を、特定の好適な緩衝液中で達成する。2種の酵素を、2種の異なる緩衝液を用いて、それぞれの場合において反応用バッチ中で試験した(第9表)。
第9表:種々の反応用緩衝液中におけるPheDH及びリンゴ酸デヒドロゲナーゼの活性の比較。これらの活性は、最適物についての百分率で見られる。
ヘペス緩衝液中のPheDHの活性はそれほど低下しないので、共役酵素反応をこの緩衝液中で実施した。
緩衝液、pH及び温度値を決定すると、補因子(NADH)の再生を伴う共役酵素反応によるフェニルアラニンの合成のための好適な条件及び媒質を選択することができた。
30mMのフェニルピルビン酸、100mMの硫酸アンモニウム、100mMのヘペス緩衝液、70mMのL−リンゴ酸、2mMのNAD+、2mMのMg2+、25UのPheDH(部分精製品)及び30Uのリンゴ酸デヒドロゲナーゼを利用した。試料をHPLCにより分析する。合成を数時間にわたりモニタリングした。4時間後に、利用した基質であるフェニルピルベートの約50%がL−フェニルアラニンに変換された(図12−L−Pheについての速度論の形成。L−Pheの形成を現場で実施した)。
実施例8:菌体変換
以下の培地を、菌体変換用の標準バッチとして使用した:
0.1M ヘペス緩衝液(pH8.0)
40mM フェニルピルビン酸
0.1M L−リンゴ酸
0.1M 硫酸アンモニウム
2mM MgCl2
以下の培地を、菌体変換用の標準バッチとして使用した:
0.1M ヘペス緩衝液(pH8.0)
40mM フェニルピルビン酸
0.1M L−リンゴ酸
0.1M 硫酸アンモニウム
2mM MgCl2
変換を30℃で、かつ1gの組換えE.コリ細胞を用いて実施した。形成されたフェニルアラニンをHPLCにより検出した(図6)。
組換えE.コリ細胞によるL−Pheの形成を20時間にわたりモニタリングし、かつ収率を測定した(図7)。
20時間にわたるインキュベーションの後では、形成された生成物L−Pheの代謝を検出できなかった。
1 基質、 2 ポンプ、 3 反応器領域、 4 触媒、 5 膜、 6 生成物、 7 基質、 8 ポンプ、 9 触媒、 10 反応器、 11 バルブ、 12 熱交換器、 13 膜、 14 生成物、 15 十字流濾過セル、 16 ポンプ
Claims (10)
- エナンチオマー富化された有機化合物を共役酵素反応系において製造するにあたり、NAD(P)Hを消費する有機基質の第1の酵素的変換と、L−リンゴ酸を酸化して酸化ピルビン酸及びCO2とするリンゴ酸デヒドロゲナーゼによる第2の酵素的変換におけるNAD(P)Hの再生よりなる方法であって、第2の酵素的変換から形成したピルビン酸を、第1の酵素的変換において基質として利用しないことを特徴とする方法。
- 第1の酵素的変換を、アルコールデヒドロゲナーゼ又はアミノ酸デヒドロゲナーゼを使用して進行させることを特徴とする請求項1に記載の方法。
- アルコールデヒドロゲナーゼとして、ラクトバチルス・ケフィア又はロドコッカス・エリスロポリス由来のADHを使用し、かつアミノ酸デヒドロゲナーゼとして、ロイシンデヒドロゲナーゼ又はフェニルアラニンデヒドロゲナーゼを使用することを特徴とする請求項2に記載の方法。
- E.コリ、特にE.コリK12由来のリンゴ酸デヒドロゲナーゼを使用することを特徴とする請求項1から3までの何れか1項に記載の方法。
- 反応を、水性の単相又は多相の溶剤混合物中で実施することを特徴する請求項1から4までの何れか1項に記載の方法。
- 反応の間の温度が、20〜40℃であることを特徴とする請求項1から5までの何れか1項に記載の方法。
- 反応の間のpHが、6〜9であることを特徴とする請求項1から6までの何れか1項に記載の方法。
- エナンチオマー富化された有機化合物を製造するにあたり、NAD(P)Hを消費する有機基質の第1の酵素的変換と、L−リンゴ酸を酸化してピルビン酸及びCO2とするリンゴ酸デヒドロゲナーゼによる第2の酵素的変換におけるNAD(P)Hの再生よりなる共役酵素反応系であって、第2の酵素的変換から形成したピルビン酸が、第1の酵素的変換において基質として利用されないことを特徴とする反応系。
- クローニングされた有機基質の変換のための第1の酵素の遺伝子と、クローニングされたリンゴ酸デヒドロゲナーゼの遺伝子とを有し、NAD(P)Hを消費する第1の酵素的変換においてエナンチオマー富化された有機化合物の製造を可能にし、かつL−リンゴ酸を酸化してピルビン酸及びCO2とするリンゴ酸デヒドロゲナーゼによる第2の酵素的変換においてNAD(P)Hの再生を可能にする菌体触媒であって、第2の酵素的変換から形成したピルビン酸を第1の酵素的変換において基質として利用されない菌体触媒。
- リンゴ酸デヒドロゲナーゼの遺伝子と、NAD(P)Hの消費を伴う有機基質の変換のための酵素の遺伝子とが存在する遺伝子構築物を含有するプラスミド。
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