CN111518779B

CN111518779B - 一种恶唑环化酶基因及其编码蛋白和应用

Info

Publication number: CN111518779B
Application number: CN202010381885.XA
Authority: CN
Inventors: 张怡轩
Original assignee: Shenyang Pharmaceutical University
Current assignee: Shenyang Pharmaceutical University
Priority date: 2020-05-08
Filing date: 2020-05-08
Publication date: 2022-03-11
Anticipated expiration: 2040-05-08
Also published as: CN111518779A

Abstract

本发明属于基因工程领域，具体涉及一种链霉菌恶唑环化酶Itm15蛋白及其编码基因，还涉及所述的恶唑环化酶在恶唑类天然产物合成中的应用。本发明提供了一种恶唑环化酶基因，它的核苷酸序列为与SEQ ID No:1核苷酸序列具有80％以上同源性且编码相同功能蛋白质的核苷酸序列。还提供了一种恶唑环化酶基因编码的蛋白，它的氨基酸序列为由SEQ ID No：2所述的氨基酸序列经过一个或者几个氨基酸残基的取代、缺失或者添加且具有与SEQ ID No:2所述的氨基酸残基序列相同活性的氨基酸序列。本发明所述的恶唑环化酶基因可以用于恶唑类天然产物合成的基因工程中。

Description

一种恶唑环化酶基因及其编码蛋白和应用

技术领域

本发明属于基因工程领域，具体涉及一种链霉菌恶唑环化酶Itm15蛋白及其编码基因，还涉及所述的恶唑环化酶在恶唑类天然产物合成中的应用。

背景技术

链霉菌是高等放线菌，具有发育良好的分支菌丝，菌丝无横隔，菌落小而致密，不易挑取并具有多种颜色。链霉菌是放线菌中最大的族群，可产生一千多种抗生素类物质，许多重要的抗生素如放线菌素、链霉素、四环素和维利霉素等均可由链霉菌产生；此外，链霉菌可产生多种物质的分解酵素。因此，链霉菌产生的次级代谢产物除了可用于医药行业外，在农作物生产和环境保护方面，均有重要应用。

近年来，含有恶唑环的天然产物不断从链霉菌等微生物中分离，此类化合物的种类不断增多，如microncin、oxazolomycin和ulapualides，表现出重要的抗菌、抗肿瘤和抗艾滋病病毒的活性。研究表明，含有恶唑环的化合物可分为两类，一类是原核核糖体合成的多肽和翻译后修饰多肽(prokaryotic ribosomally synthesized andposttranslationally modified peptides，RiPPs)，另一类是聚酮类化合物。RiPPs类化合物中的恶唑环合成底物直接来源于半胱氨酸和丝氨酸残基，直链肽段经相关蛋白复合体在ATP的参与下催化直链肽段环化，形成不具有芳香性的五元杂环，然后经FMN依赖的蛋白催化不具有芳香性的五元环脱水最终形成恶唑环。含有恶唑环的聚酮类化合物一般经过PKS-NRPS杂合基因簇合成，虽然此类化合物的生物合成基因簇是已知的，但恶唑环的合成机制始终没有得到解析。化学方法合成恶唑环通常需要多步反应并且收率较低，因此通过酶催化方法合成恶唑环具有反应速度快能源利用率高等先天优越性。

发明内容

本发明提供了一种恶唑环化酶基因及其编码蛋白和应用，该基因转录、翻译恶唑环化酶，从而使体外恶唑环的形成成为可能。

本发明提供了一种恶唑环化酶基因，它的核苷酸序列如SEQ ID No:1所示。

本发明提供了一种恶唑环化酶基因，它的核苷酸序列为与SEQ ID No:1核苷酸序列具有80％以上同源性且编码相同功能蛋白质的核苷酸序列。

本发明提供了一种恶唑环化酶基因编码的蛋白，它的氨基酸序列如SEQ ID No:2所示。

本发明提供了一种恶唑环化酶基因编码的蛋白，它的氨基酸序列为由SEQ ID No：2所述的氨基酸序列经过一个或者几个氨基酸残基的取代、缺失或者添加且具有与SEQ IDNo:2所述的氨基酸残基序列相同活性的氨基酸序列。

本发明的恶唑环化酶基因来源于一株链霉菌，基因名称为itm15，其编码的蛋白名称为Itm15，以下该基因的简称为itm15，该蛋白的简称Itm15。

本发明所述的恶唑环化酶来源于一株链霉菌，其DNA序列可通过化学方法人工合成。

本发明提供了一种重组表达载体，它包括SEQ ID No:1或与SEQ ID No:1核苷酸序列具有80％以上同源性且编码相同功能蛋白质的核苷酸序列。

本发明提供了一种转化子，它包括含有所述的重组表达载体的宿主细胞。

本发明所述的一种转化子，它的宿主为微生物、动物、植物或转基因细胞系。

本发明提供了一种恶唑环化酶基因的应用，它用于恶唑类天然产物合成的基因工程中。

本发明提供的恶唑环化酶基因(itm15)获取方式为：

一、基因组DNA的获取

由基因合成公司合成itm15的基因序列，并存放于大肠杆菌DH5α中；挑取含有itm15基因序列的大肠杆菌DH5α菌体，加入无菌去离子水，高温裂解菌体，使基因组DNA溶解于无菌去离子水中，离心后，即得到含有itm15基因的上清液，于4摄氏度保存备用；

二、链霉菌恶唑环化酶基因(itm15)的克隆

使用1微升步骤一获得的基因组DNA为模板，使用高保真Taq酶进行普通PCR扩增，以获得itm15全长。其中

所用的引物如下：

itm15-F:GTGTCCAGCTGCCAGGTCTGCTC

itm15-R:TCAGCTCAGCCGGATGCCGAGG

将PCR产物连接至Trans-T1(Trans gene公司)载体，测序后经拼接获得具有完整编码区的链霉菌恶唑环化酶基因itm15的ORF序列SEQ ID No:1。

三、大肠杆菌表达载体的构建

使用带有NdeⅠ和BamHⅠ酶切位点的引物扩增itm15序列，通过酶切酶连的方式克隆至pET28a载体。

带有NdeⅠ酶切位点的引物序列如下：

Itm15-F-NdeⅠ:ggaattcCATATGGTGTCCAGCTGCCAGGTCTGCTC

带有BamHⅠ酶切位点的引物序列如下：

Itm15-R-BamHⅠ:cgcGGATCCTCAGCTCAGCCGGATGCCGAGG

其中小写字母代表核酸内切酶保护碱基，大写字母是作为引物的基因序列，下划线部分为引入的酶切位点。

将获得的目的片段经胶回收试剂盒(天根公司)回收，将回收得到的带有酶切位点的itm15片段和pET28a载体分别使用NdeⅠ和BamHⅠ双酶切后，使用T4 DNA连接酶，将酶切后的itm15和pET28a载体连接，得到重组表达载体pET28a-itm15。

四、itm15基因的表达及恶唑环化酶Itm15蛋白的获得

将步骤三获得的表达载体pET28a-itm15转入大肠杆菌。经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导后即可获得恶唑环化酶(Itm15)蛋白。诱导itm15表达后，以离心的方式获得大肠杆菌，经超声破碎菌体和镍柱分离后得到纯化的Itm15环化酶蛋白。

五、酶活检测

将步骤四获得的纯化后的恶唑环化酶Itm15蛋白在适宜反应条件下，加入辅酶和反应底物，利用LC-MS检测目标产物分子量。

本发明的itm15基因来源于一株链霉菌，其基因工程受体适用于多种生物。

利用本发明的itm15基因作为目的基因构建表达载体，转化方法可用电击转化或化学转化。该表达载体可以利用T7启动子进行诱导表达。可采用聚丙烯酰胺凝胶电泳快速检测itm15基因的表达与否及表达量。

本发明首次发现恶唑环化酶Itm15，并证实该酶在体外可催化直链底物脱水环化形成恶唑环。

本发明所述的恶唑环化酶Itm15在体外可催化直链底物脱水环化形成恶唑环的合成反应见图4。

本发明获得编码该酶的基因序列，为利用基因工程技术改进天然产物结构，提高天然产物活性提供了基础。

通过本发明提供的itm15基因及Itm15蛋白，对目标生物进行基因工程改造，其产业价值着重于两个方面，一是通过利用恶唑环化酶，提高工业生产中能源利用率和反应效率；二是将恶唑环化酶Itm15用于合成新的、高活性天然产物中。

从链霉菌中分离得到了一类聚酮类的恶唑天然产物，通过对该类化合物生物合成基因簇的进化分析，结合异源表达和体外化学反应工作，首次找到了聚酮类化合物中参与恶唑环化形成的酶。对以链霉菌为代表的Itm15的发现和功能鉴定有利于提高对生物体内恶唑环环化的生化机制的认识，将该酶应用到化学合成中，将有利于简化反应步骤和节约能源，可用于化学原料、医药中间体的合成中。

附图说明

图1为itm15的核苷酸和氨基酸序列；其中“*”代表终止密码子；

图2为不同物种恶唑环化酶蛋白序列的多序列比对结果。标记区域为保守的氨基酸序列。

图3为Itm15体外反应后的LC-MS分析图；红框内区域为目标分子量。

图4为Itm15体外反应催化直链底物脱水形成环化底物的过程。

具体实施方式

本发明内容不仅限于上述各实施例的内容，含有本发明基因的重组表达载体、转基因细胞系及宿主菌均属本发明的保护范围。

实施例1

本实施例的itm15基因获得过程如下：

1)链霉菌itm15基因编码区的获取

使用其他菌株中可能编码恶唑环化酶的疑似基因的开放阅读框架，利用tblastx方法搜索链霉菌基因组中的同源序列，发现一个恶唑环化酶基因itm15。将itm15基因序列递交至基因合成公司(苏州金唯智公司)，获得含有itm15基因序列的大肠杆菌DH5α菌株；根据itm15基因序列设计PCR引物，通过PCR方法从目标大肠杆菌DH5α菌株中扩增得到itm15开放阅读框架(图1所示)。

挑取0.1-0.7mg目标大肠杆菌DH5α菌株菌体于PCR管中，加入50-150微升无菌去离子水，95-99摄氏度裂解菌体15-20min，8000-10000rpm/min离心2-4分钟，上清即为含有itm15基因的DNA混合液，4摄氏度保存备用。使用1微升DNA混合液作为PCR扩增模板，反应结束后将PCR产物连接至transT1载体上，该基因全长1134bp，共编码含有377个氨基酸残基的蛋白序列和1个终止密码子。

2)恶唑环化酶Itm15表达载体的构建

利用1-3微升步骤1)中获得的含有itm15基因的DNA混合液为模板，设计两端引物分别含有NdeⅠ和BamHⅠ限制性内切酶位点，扩增itm15基因(引物由苏州金唯智公司合成)。PCR程序如下：94-99摄氏度预变性5-10分钟；90-95摄氏度变性3-5min，45-55摄氏度退火30-60秒，72摄氏度延伸60-90秒，32-35个循环后，72摄氏度后延伸5-10分钟。反应结束后，使用天根胶回收试剂盒，将带有酶切位点的itm15基因片段回收。使用NdeⅠ和BamHⅠ限制性内切酶对目的片段和pET28a载体质粒在37摄氏度下酶切1-3小时。反应结束后使用天根胶回收试剂盒，将酶切后的itm15目的基因片段和pET28a载体片段进行胶回收，得到酶切后的itm15和pET28a基因片段。使用T4 DNA连接酶(Takara公司)将itm15和pET28a于16-28摄氏度连接过夜，得到Itm15表达载体pET28a-itm15。3)恶唑环化酶Itm15的异源表达和功能鉴定

将步骤2)构建好的含有itm15基因片段的表达载体pET28a-itm15使用电击转化或化学转化的方法转入大肠杆菌BL21(DE3)细胞中，在每毫升含有50微克卡那霉素LB培养基上过夜筛选，挑取单克隆于含有相同浓度卡那霉素的LB液体培养基中37摄氏度培养OD600为0.3-0.8，加入50-100微升异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG，0.5mmol·L^-1)诱导表达6-12小时。诱导带有表达载体的大肠杆菌BL21(DE3)表达后，离心收集细胞，使用超声破碎或反复冻融的方式破碎细胞，得到Itm15粗蛋白，并使用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析。粗蛋白经过镍柱纯化后得到纯化的Itm15蛋白，使用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析。

实施例2

恶唑环化酶Itm15的功能验证

为了验证Itm15的功能，采用的是大肠杆菌体外酶活鉴定系统。以1-乙酰氨基-2-丙酮(CAS:7737-16-8)为底物，使用LC-MS分析是否生成了底物脱水后的目标分子的分子量。

4)恶唑环化酶Itm15酶反应条件

取将经过镍柱纯化后的恶唑环化酶Itm15蛋白20-100微克，加入终浓度为2-10mM的ATP，加入终浓度为3-8mM的1-乙酰氨基-2-丙酮(CAS:7737-16-8)底物，轻摇反应体系，混匀后于25-30摄氏度孵育4-12小时。

5)目的产物的提取及LC-MS分析

将反应后的反应体系加入1-2倍体积的氯仿萃取3-5次，收集氯仿层，室温干燥。待反应产物完全干燥后，加入适量体积的含有8％乙腈的水溶液，作为LC-MS样品备用。使用安捷伦1260/6520HPLC/Q-TOF(Aglient，USA)质谱联用仪以ESI为离子源在正离子条件下收集底物脱水分子量质谱信号。进一步证明Itm15可以催化直链底物环化生成恶唑环。收率20％。

SEQUENCE LISTING

<110> Shenyang Pharmaceutical University

<120> 一种恶唑环化酶基因及其编码蛋白和应用

<130> 2020

<160> 2

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1134

<212> DNA

<213> Streptomyces sp. SYP-A7193

<400> 1

gtgtccagct gccaggtctg ctcgctcaaa gccggtcatc cgggagtggt tctcgacgac 60

cagagggtgt gcaacctgtg caacctggac ttcgccgagg acctgctcgt caactaccgg 120

tacaccagcg aggtgttcac cgagttccag caggcgccgc ccggcaccgg cgagtacgac 180

tgcctgttca tgtacagcgg cggcaaggac agcacgtaca tgctggacaa gttcgccaac 240

gagtacggca agcgggtgct ggccttcacc ttcgacgtgc ccttcgagag cgagcacgcc 300

gcccagaaca tcgcgctggc ccgggagaag atcccggcga cgttcgtcct cgacgccgac 360

gacgacaaca tcaagctgat gatgcgcgag gtgttcaacc gccccgcgcc gaagaagccc 420

ggcaagtacc tcgacgagaa gctgccctgc gtctcctgcc gcaccttctt cgtgctgcgc 480

gcgatcctca tggcctaccg ccagaagatc ccgtacatcg cgctgtgcgc cgacccgcag 540

cagatcctca ccatggagtc caacgtccgg gagatcgtgc gcgacttcta caagacgttc 600

ggcgagcgcc tcgtcgacac gctcttcggc gggcagctgg aggagctgct cttcgacgac 660

gacgagaacc tgccgaagat cgtcttcccg ttcatcgcca tgcggcacga gtacgacccc 720

gaccgcatcg tcgaggaact gcgcgccaag ggcctctacc agtcgtcgcc gatggagacc 780

cactgcacgc tcttcccgct gctgaactac tactcgtact cgaacttcga ctgcatgttc 840

tacaagctca acgcgtccag ccacgtgcgg tccgtgaagc gcaacgcctc ctacgaccgc 900

aacaccttca gtatcaagtt cccgcgctcg ctcgacctcg ccgacgtgga ggaccggctc 960

ggcaaggtcg tcaaggagat cgcggcgggc gagggcgacc gcgacgagca cgagcgcagc 1020

ctcatcgacc tcttccagcg catggacgcc tccgaggacg ccgcacgctt cgtcgcccgc 1080

agcttcctcg acatgcgatc cgtcgccgcc gacctcggca tccggctgag ctga 1134

<210> 2

<211> 377

<212> PRT

<213> Streptomyces sp. SYP-A7193

<400> 2

Val Ser Ser Cys Gln Val Cys Ser Leu Lys Ala Gly His Pro Gly Val

1 5 10 15

Val Leu Asp Asp Gln Arg Val Cys Asn Leu Cys Asn Leu Asp Phe Ala

20 25 30

Glu Asp Leu Leu Val Asn Tyr Arg Tyr Thr Ser Glu Val Phe Thr Glu

35 40 45

Phe Gln Gln Ala Pro Pro Gly Thr Gly Glu Tyr Asp Cys Leu Phe Met

50 55 60

Tyr Ser Gly Gly Lys Asp Ser Thr Tyr Met Leu Asp Lys Phe Ala Asn

65 70 75 80

Glu Tyr Gly Lys Arg Val Leu Ala Phe Thr Phe Asp Val Pro Phe Glu

85 90 95

Ser Glu His Ala Ala Gln Asn Ile Ala Leu Ala Arg Glu Lys Ile Pro

100 105 110

Ala Thr Phe Val Leu Asp Ala Asp Asp Asp Asn Ile Lys Leu Met Met

115 120 125

Arg Glu Val Phe Asn Arg Pro Ala Pro Lys Lys Pro Gly Lys Tyr Leu

130 135 140

Asp Glu Lys Leu Pro Cys Val Ser Cys Arg Thr Phe Phe Val Leu Arg

145 150 155 160

Ala Ile Leu Met Ala Tyr Arg Gln Lys Ile Pro Tyr Ile Ala Leu Cys

165 170 175

Ala Asp Pro Gln Gln Ile Leu Thr Met Glu Ser Asn Val Arg Glu Ile

180 185 190

Val Arg Asp Phe Tyr Lys Thr Phe Gly Glu Arg Leu Val Asp Thr Leu

195 200 205

Phe Gly Gly Gln Leu Glu Glu Leu Leu Phe Asp Asp Asp Glu Asn Leu

210 215 220

Pro Lys Ile Val Phe Pro Phe Ile Ala Met Arg His Glu Tyr Asp Pro

225 230 235 240

Asp Arg Ile Val Glu Glu Leu Arg Ala Lys Gly Leu Tyr Gln Ser Ser

245 250 255

Pro Met Glu Thr His Cys Thr Leu Phe Pro Leu Leu Asn Tyr Tyr Ser

260 265 270

Tyr Ser Asn Phe Asp Cys Met Phe Tyr Lys Leu Asn Ala Ser Ser His

275 280 285

Val Arg Ser Val Lys Arg Asn Ala Ser Tyr Asp Arg Asn Thr Phe Ser

290 295 300

Ile Lys Phe Pro Arg Ser Leu Asp Leu Ala Asp Val Glu Asp Arg Leu

305 310 315 320

Gly Lys Val Val Lys Glu Ile Ala Ala Gly Glu Gly Asp Arg Asp Glu

325 330 335

His Glu Arg Ser Leu Ile Asp Leu Phe Gln Arg Met Asp Ala Ser Glu

340 345 350

Asp Ala Ala Arg Phe Val Ala Arg Ser Phe Leu Asp Met Arg Ser Val

355 360 365

Ala Ala Asp Leu Gly Ile Arg Leu Ser

370 375

Claims

1. 恶唑环化酶基因在恶唑类天然产物合成中的应用，其特征在于，所述的恶唑环化酶基因的核苷酸序列如SEQ ID No:1所示，所述的恶唑类天然产物为2，5-二甲基恶唑。

2. 恶唑环化酶基因的编码蛋白在恶唑类天然产物合成中的应用，其特征在于，所述的恶唑环化酶基因的编码蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No:2所示，所述的恶唑类天然产物为2，5-二甲基恶唑。