CN102250958B - 一种体外酶反应生成的类胡萝卜素的快速提取方法 - Google Patents

一种体外酶反应生成的类胡萝卜素的快速提取方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种体外酶反应生成的类胡萝卜素的快速提取方法，属于生物工程技术领域。该方法步骤如下：将表达类胡萝卜素代谢相关酶的重组大肠杆菌菌体超声波破壁，然后加入相应的反应物质，超声波混匀，避光密闭振荡反应；再向混合液中加入10％SDS溶液，加入NaAc溶液，振荡离心，弃上清液，得蛋白质沉淀；向蛋白质沉淀中加入丙酮，搅拌，使沉淀均匀分散，然后经离心后，取上清液，滤膜过滤后，经检测，即得类胡萝卜素的丙酮溶液。本发明通过使类胡萝卜素与蛋白质共沉淀，将类胡萝卜素从大体积的体外反应溶液中浓缩到少量蛋白质沉淀中，从而减少了后续分离纯化过程。

Description

一种体外酶反应生成的类胡萝卜素的快速提取方法
技术领域
本发明涉及一种体外酶反应生成的类胡萝卜素的快速提取方法，属于生物工程技术领域。
发明背景
类胡萝卜素是一类食用天然色素，既是常用的着色剂，又具有多种生物活性。该类化合物为链状或环状含有8个异戊间二烯单位、四萜烯类头尾连接而成的多异戊间二烯化合物，不溶于水。类胡萝卜素作为天然色素在色素的种类、资源和色素的化学性质等方面不受制约，并且类胡萝卜素是非常强的抗氧化剂，能有效的清除氧自由基，具有一定防治疾病的作用。
随着科学技术的发展和人们对食品安全的重视，天然色素开发成为研究热点，微生物特别是光合细菌的类胡萝卜素代谢途径得到深入研究，可利用其类胡萝卜素代谢基因构建重组工程菌株，体外生产番茄红素等类胡萝卜素。由于类胡萝卜素不溶于水，体外酶反应的产物需要用有机溶剂萃取，主要用甲醇-石油醚萃取或丙酮-石油醚萃取。由于番茄红素等非极性类胡萝卜素难溶于甲醇，甲醇-石油醚萃取方法对于非极性类胡萝卜素萃取效果很差；丙酮-石油醚萃取方法则由于丙酮可溶于水和石油醚的特性，易产生乳浊液，影响类胡萝卜素的提取。另外，上述两种萃取方法第一步是将甲醇或丙酮与反应液混合于55～60℃保温15～20分钟，再加石油醚进行萃取，耗时较长，易造成产物的损失，因而迫切需要对现有方法进行改进，提高色素提取的效率。
发明内容
本发明针对现有体外酶反应生成的类胡萝卜素产物提取方法耗时长，提取量低的缺陷，提供一种快速高效的体外酶反应生成的类胡萝卜素的提取方法，即变性蛋白沉淀法，缩短产物提取的时间，减少产物损失，大幅提高产物提取量。
术语说明：
本发明中所述类胡萝卜素是指不溶于水的含有8个异戊间二烯单位头尾连接而成的色素物质，具体为链孢红素及其衍生物和番茄红素及其衍生物。
本发明的目的通过以下技术方案得以实现：
一种体外酶反应生成的类胡萝卜素的快速提取方法，步骤如下：
(1)将表达类胡萝卜素代谢相关酶的重组大肠杆菌菌体超声波破壁，制得类胡萝卜素代谢相关酶粗酶液；
(2)向步骤(1)制得的类胡萝卜素代谢相关酶粗酶液中加入相应的反应物质，反应体系用缓冲液定容后，超声波混匀，30℃避光密闭振荡反应1小时，得混合液；
(3)向步骤(2)制得的混合液中加入1/15～1/10体积2mol/L NaOH和1/15～1/10体积10％SDS溶液，混合均匀；再加入混合液1/2体积3mol/L NaAc溶液，振荡5～10秒，离心，弃上清液，得蛋白质沉淀；
(4)向步骤(3)制得的蛋白质沉淀中加入丙酮，搅拌1～2分钟，使沉淀均匀分散，得到含类胡萝卜素产物的丙酮溶液；
(5)将步骤(4)制得的含类胡萝卜素产物的丙酮溶液经离心后，取上清液，滤膜过滤后，经检测，即得类胡萝卜素的丙酮溶液。
所述步骤(1)中超声波破壁的条件为：22kHz，150W，30分钟。
所述步骤(1)中类胡萝卜素代谢相关酶为八氢番茄红素脱氢酶、羟基链孢红素合成酶、羟甲基链孢红素合成酶、球形烯加氧酶、番茄红素环化酶之一。
上述八氢番茄红素脱氢酶的反应物质为八氢番茄红素和其他除氧反应物、羟基链孢红素合成酶的反应物质为链孢红素、羟甲基链孢红素合成酶的反应物质为羟基链孢红素和其他除氧反应物、球形烯加氧酶的反应物质为球形烯、番茄红素环化酶的反应物质为番茄红素和其他除氧反应物。
优选的，上述八氢番茄红素、链孢红素、羟基链孢红素、球形烯或番茄红素的反应浓度为10μmol/L。
优选的，上述其他除氧反应物为葡萄糖、葡萄糖氧化酶和过氧化氢酶，葡萄糖的反应浓度为2mmol/L，葡萄糖氧化酶的反应浓度为20U/mL，过氧化氢酶的反应浓度为20000U/mL；其中U为国际标准活力单位。
所述步骤(2)中超声波混匀条件为：22kHz，50～150W，10～60秒。
所述步骤(3)中离心条件为：12000rpm离心1分钟。类胡萝卜素随蛋白质共沉淀。
所述步骤(5)中离心条件为：12000rpm离心1分钟。
所述步骤(5)中的检测采用HPLC进行产物检测，色谱柱为美国Agilent公司出售的TC-C18，流动相甲醇/乙腈(体积比为4/6)，流速1mL/分钟，柱温30℃，检测波长474nm。
所述步骤(5)中的滤膜为22μm滤膜。
以上操作步骤、实验条件及试剂如无特别说明，均采用本领域常规操作和常用试剂。
表达类胡萝卜素代谢相关酶的重组大肠杆菌菌体的制备方法，可参见文献[ZhenjianXu，Bing Tian，Zongtao Sun，Jun Lin and Yuejin Hua.Identification and Functionalanalysis of a phytoene desaturase gene from the extremely radioresistant bacteriumDeinococcus radiodurans.Microbiology，2007，153：1642-1652]。
本发明所述类胡萝卜素代谢相关酶(八氢番茄红素脱氢酶，羟基链孢红素合成酶，羟甲基链孢红素合成酶，球形烯加氧酶，番茄红素环化酶)的表达基因登录号为GenBank No.CP000661。
本发明的有益效果如下：
本发明通过对反应体系中的蛋白质进行变性处理，使类胡萝卜素与蛋白质共沉淀，将类胡萝卜素从大体积的体外反应溶液中浓缩到少量蛋白质沉淀中，从而减少了后续分离纯化过程。本发明通过对实验流程的改进，大幅缩短了操作时间，减少了产物损失，提高了产物提取量。
附图说明
图1是本发明所述球形红细菌(Rhodobacter sphearoides)No.ATCC 17025重组八氢番茄红素脱氢酶体外反应产物HPLC图谱；
其中，1、番茄红素；2、链孢红素。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步详细说明，但本发明并不受这些内容所限制。
实施例中所用八氢番茄红素脱氢酶为球形红细菌(Rhodobacter sphearoides)No.ATCC17025的类胡萝卜素代谢相关的多种酶基因(GenBank No.CP000661)连接到大肠杆菌表达载体pET-22b(Novagen，Germany)上转化大肠杆菌BL21(DE3)；得到的阳性克隆培养至OD600为0.5～0.9，加IPTG使终浓度为0.5mmol/L，25℃诱导培养30小时获得。
实施例中HPLC流动相为色谱纯，其余化学试剂均为分析纯。
实施例1：球形红细菌(Rhodobacter sphearoides)No.ATCC 17025重组八氢番茄红素脱氢酶体外反应产物提取
一种体外酶反应生成类胡萝卜素的快速提取方法，步骤如下：
(1)取200mL表达球形红细菌重组八氢番茄红素脱氢酶的大肠杆菌培养液，12000rpm离心5分钟，收集菌体细胞；将收集到的大肠杆菌细胞重悬于10mL 100mmol/L Tris·HCl(pH7.9)缓冲液中，美国Sonics公司的超声波破碎仪破碎30分钟(22kHz，150W)，制得八氢番茄红素脱氢酶粗酶液；
(2)取步骤(1)制得的八氢番茄红素脱氢酶粗酶液400μL于1.5mL离心管中，加入八氢番茄红素丙酮溶液、葡萄糖、葡萄糖氧化酶和过氧化氢酶，使终浓度分别为10μmol/L(八氢番茄红素)、2mmol/L(葡萄糖)、20U/mL(葡萄糖氧化酶)和20000U/mL(过氧化氢酶)，反应体系用缓冲液定容至500μL；用美国Sonics公司的超声波破碎仪混匀30秒(22kHz，100W)；30℃避光密闭振荡反应1小时，得混合液；
(3)向步骤(2)制得的混合液中加入30μL 2mol/L NaOH和30μL 10％SDS溶液，混合均匀；加入300μL 3mol/L NaAc(pH4.8)溶液，振荡5秒；12000rpm离心1分钟，弃掉上清，得蛋白质沉淀；
(4)向步骤(3)制得的蛋白质沉淀中加入200μL丙酮提取类胡萝卜素，搅拌2分钟，使沉淀均匀分散，得到含类胡萝卜素的丙酮溶液；
(5)将步骤(4)制得的含类胡萝卜素的丙酮溶液经12000rpm离心1分钟，取丙酮溶液，22μm滤膜过滤后，用美国Agilent公司的HPLC检测反应产物，色谱柱为TC-C18(Agilent，USA)，流动相甲醇/乙腈(体积比为4/6)，流速1mL/分钟，柱温30℃，检测波长474nm，检测结果如图1所示。
上述的所有操作没有特殊说明要求弱光条件下进行。
上述球形红细菌重组八氢番茄红素脱氢酶体外反应主产物为链孢红素，提取量为1.086μg(附图1)。
实施例2：球形红细菌(Rhodobacter sphearoides)No.ATCC 17025重组羟基链孢红素合成酶体外反应产物提取
取200mL表达球形红细菌重组羟基链孢红素合成酶的大肠杆菌培养液12000rpm离心5分钟，收集菌体细胞；菌体重悬、破碎同实施例1，取400μL破碎液加入链孢红素丙酮溶液，使链孢红素终浓度为10μmol/L，反应体系用缓冲液定容至500μL。其余操作、步骤同实施例1。
上述球形红细菌重组羟基链孢红素合成酶体外反应产物为羟基链孢红素，提取量为1.748μg。
实验例：体外酶反应体系中番茄红素提取方法比较
取实施例1中所述细胞破碎液4mL，加入20μg/mL番茄红素丙酮溶液100μL，用缓冲液定容至5mL，混匀后按500μL/份分成9份，3份为1组，共3组；分别采用甲醇-石油醚萃取、丙酮-石油醚萃取和实施例1所述变性蛋白沉淀提取方法进行产物提取。
(1)甲醇-石油醚：500μL混合液中加2.5mL甲醇55℃温浴15分钟，加入300μL石油醚(沸程30℃～60℃)振荡5分钟萃取番茄红素，离心收集上层石油醚层。
(2)丙酮-石油醚：500μL混合液中加2.5mL丙酮55℃温浴15分钟，加入300μL石油醚(沸程30℃～60℃)振荡5分钟萃取番茄红素，离心收集上层石油醚层。
(3)本发明方法(变性蛋白共沉淀-丙酮提取)：500μL混合液中加30μL 2mol/L NaOH和30μL 10％SDS溶液，混合均匀后加入300μL 3mol/L NaAc(pH4.8)溶液，充分振荡；12000rpm离心1分钟，弃掉上清；在沉淀中加200μL丙酮搅匀沉淀提取番茄红素。
产物用紫外-可见分光光度计(Thermo，USA)检测474nm吸收值。根据番茄红素标准曲线计算500μL反应液中提取到的番茄红素总量(ng)。
实验结果见表1，变性蛋白沉淀提取法耗时仅为另外两种方法的1/5，番茄红素提取量约为甲醇-石油醚法的3倍、丙酮-石油醚法的2倍；番茄红素提取率由甲醇-石油醚的27.6％和丙酮-石油醚的39.9％提高到76.8％，大幅提高了提取效率。
表1
Figure BDA0000074589380000041

Claims (2)

1.一种体外酶反应生成的类胡萝卜素的快速提取方法，步骤如下：
（1）将表达类胡萝卜素代谢相关酶的重组大肠杆菌菌体超声波破壁，制得类胡萝卜素代谢相关酶粗酶液；
（2）向步骤（1）制得的类胡萝卜素代谢相关酶粗酶液中加入相应的反应物质，反应体系用缓冲液定容后，超声波混匀，30℃避光密闭振荡反应1小时，得混合液；
（3）向步骤（2）制得的混合液中加入1/15～1/10体积2mol/L NaOH和1/15～1/10体积10% SDS溶液，混合均匀；再加入混合液1/2体积3mol/L NaAc溶液，振荡5～10秒，离心，弃上清液，得蛋白质沉淀；
（4）向步骤（3）制得的蛋白质沉淀中加入丙酮，搅拌1～2分钟，使沉淀均匀分散，得到含类胡萝卜素产物的丙酮溶液；
（5）将步骤（4）制得的含类胡萝卜素产物的丙酮溶液经离心后，取上清液，滤膜过滤后，经检测，即得类胡萝卜素的丙酮溶液；
所述步骤（1）中类胡萝卜素代谢相关酶为八氢番茄红素脱氢酶、羟基链孢红素合成酶、羟甲基链孢红素合成酶、球形烯加氧酶、番茄红素环化酶之一；
八氢番茄红素脱氢酶的反应物质为八氢番茄红素和其他除氧反应物、羟基链孢红素合成酶的反应物质为链孢红素、羟甲基链孢红素合成酶的反应物质为羟基链孢红素和其他除氧反应物、球形烯加氧酶的反应物质为球形烯、番茄红素环化酶的反应物质为番茄红素和其他除氧反应物；
上述其他除氧反应物为葡萄糖、葡萄糖氧化酶和过氧化氢酶，葡萄糖的反应浓度为2mmol/L，葡萄糖氧化酶的反应浓度为20U/mL，过氧化氢酶的反应浓度为20000U/mL。
2.如权利要求1所述的提取方法，其特征在于，所述步骤（1）中超声波破壁的条件为：22kHz，150W，30分钟。
3、如权利要求1所述的提取方法，其特征在于，上述八氢番茄红素、链孢红素、羟基链孢红素、球形烯或番茄红素的反应浓度为10μmol/L。
4、如权利要求1所述的提取方法，其特征在于，所述步骤（2）中超声波混匀条件为：22kHz，50～150W，10～60秒。
5、如权利要求1所述的提取方法，其特征在于，所述步骤（3）中离心条件为：12000rpm离心1分钟，类胡萝卜素随蛋白质共沉淀。
6、如权利要求1所述的提取方法，其特征在于，所述步骤（5）中离心条件为：12000rpm离心1分钟。
7、如权利要求1所述的提取方法，其特征在于，所述步骤（5）中的检测采用HPLC进行产物检测，色谱柱为美国Agilent 公司出售的TC-C18，流动相甲醇/乙腈的体积比为4/6，流速1mL/分钟，柱温30℃，检测波长474nm。
8、如权利要求1所述的提取方法，其特征在于，所述步骤（5）中的滤膜为22μm滤膜。
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