CN101979587A - 少动鞘氨醇单胞菌的八氢番茄红素脱氢酶基因及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种少动鞘氨醇单胞菌的八氢番茄红素脱氢酶基因的DNA序列和该酶缺失的重组菌株及其应用。所述少动鞘氨醇单胞菌(Sphingomonas sp.)的八氢番茄红素脱氢酶基因(crtI)，具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。本发明提供的少动鞘氨醇单胞菌八氢番茄红素脱氢酶基因(crtI)的DNA序列为少动鞘氨醇单胞菌类胡萝卜素生物合成途径进行遗传改造奠定基础。另外，本发明通过基因敲除的方法构建的八氢番茄红素脱氢酶缺失的少动鞘氨醇单胞菌重组菌株与野生型菌株相比，结冷胶产量不变且不产黄色素，减少了结冷胶提取时乙醇或异丙醇的用量从而降低了结冷胶的生产成本，同时，该菌株还可以应用于进一步的基因敲除或代谢工程改造。

Description

少动鞘氨醇单胞菌的八氢番茄红素脱氢酶基因及其应用

(一)技术领域

本发明涉及少动鞘氨醇单胞菌的八氢番茄红素脱氢酶基因(crtI)及其应用。

(二)背景技术

结冷胶是一种新型微生物胞外多糖，是由β-1，3-D-葡萄糖、β-1，4-D-葡萄糖醛酸和α-1，4-L-鼠李糖按摩尔比2∶1∶1组成的高分子聚合物。它与同类产品相比，具有很多优越性能，如用量少；凝固点、熔点、弹性、硬度等可调；形成的凝胶透明度、强度高；呈味性能好、热稳定性高等。由于结冷胶的良好特性，其被用作乳化剂、悬浮剂、增稠剂、稳定剂、凝胶剂、缓释剂、成膜材料等广泛应用于食品和医药行业。此外，结冷胶也可与其他胶体复配，赋予产品独特的口感和风味，应用前景广阔。

结冷胶的产生菌少动鞘氨醇单胞菌是具单极鞭毛的革兰氏阴性菌，其发酵产结冷胶的同时产生代谢副产物黄色类胡萝卜素-念珠藻黄素。而由于结冷胶的高粘性，发酵液中胞外多糖以黏性聚合物形式构成网状结构，造成类胡萝卜素色素等杂质的去除存在较大难度。传统的提取方法是将发酵液适当稀释以降低其黏度，用异丙醇或乙醇洗涤沉淀多糖。这种提取方法去除色素等杂质会消耗大量异丙醇或乙醇，从而增加了生产成本。

近年来，许多产类胡萝卜素细菌的类胡萝卜素的主要合成途径的研究取得巨大进展，已从分子水平阐释其生物合成途径，关键酶基因先后得到分离，所有的类胡萝卜素均通过类异戊二烯化合物或萜类化合物途径合成。IPP(异戊烯焦磷酸)是合成途径的前体物质，大部分细菌中IPP是由丙酮酸和3-磷酸甘油醛经MEP(2-C-甲基-D-赤藓糖醇)途径缩合合成。IPP在IPP异构酶作用下生成DMAPP(二甲基丙烯基二磷酸)，然后再与IPP缩合生成GPP(牻牛儿基焦磷酸)、FPP(法尼基二磷酸)、GGPP(牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸)。2分子GGPP在八氢番茄红素合成酶作用下形成第一个无色的类胡萝卜素-八氢番茄红素。八氢番茄红素经过连续的脱氢反应，共轭双键延长，直至形成番茄红素。催化这一反应的酶为八氢番茄红素脱氢酶。番茄红素在不同环化酶的作用下分别生成α-胡萝卜素、β-胡萝卜素，并在其他修饰酶的作用下引入酮基和(或)羟基。

但目前尚未有少动鞘氨醇单胞菌八氢番茄红素脱氢酶基因序列以及利用基因敲除技术敲除少动鞘氨醇单胞菌八氢番茄红素脱氢酶基因的报道。

(三)发明内容

本发明的目的是提供少动鞘氨醇单胞菌的八氢番茄红素脱氢酶基因的DNA序列和该酶缺失的重组菌株及其应用。

本发明采用的技术方案是：

一种少动鞘氨醇单胞菌(Sphingomonas sp.)的八氢番茄红素脱氢酶基因(crtI)，具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。该序列长度为1479bp，编码一个由492个氨基酸组成的蛋白质。

本发明还涉及一种所述crtI基因缺失的重组少动鞘氨醇单胞菌，由少动鞘氨醇单胞菌经基因敲除去除crtI基因获得。

具体的，所述重组少动鞘氨醇单胞菌由少动鞘氨醇单胞菌借助SEQID NO.2核苷酸片段经两次同源重组敲除去除SEQ ID NO.1所示的核苷酸片段获得，具体是分别将SEQ ID NO.2中crtI基因的上游(SEQ ID NO.2第79～639位碱基)下游(SEQ ID NO.2第2104～2881位碱基)片断插入敲除载体pLO3构建crtI基因敲除载体pLO3-ΔI；然后将crtI基因敲除载体pLO3-ΔI通过三亲接合方法导入少动鞘氨醇单胞菌中，经筛选得到crtI基因缺失的重组少动鞘氨醇单胞菌。SEQ ID NO.2的DNA序列包括crtI基因在内共2886bp，由如下方法获得：通过与少动鞘氨醇单胞菌亲缘关系较近的4种菌的八氢番茄红素脱氢酶基因(crtI)的氨基酸序列进行比对分析，分析保守序列，并按少动鞘氨醇单胞菌的密码子偏好性设计了2条简并引物，利用PCR的方法扩增出少动鞘氨醇单胞菌ATCC 31461 crtI的部分序列，进而通过SiteFinding-PCR技术获得包括crtI基因的完整序列及基因敲除所需的部分侧翼序列。

本发明利用分子生物学方法获得少动鞘氨醇单胞菌的八氢番茄红素脱氢酶基因(crtI)的DNA序列，并在少动鞘氨醇单胞菌ATCC31461菌株和DSM 6314菌株中分别敲除crtI基因，从而阻断少动鞘氨醇单胞菌产黄色素。

本发明还涉及所述的重组少动鞘氨醇单胞菌在微生物发酵制备结冷胶中的应用。

具体的，所述应用为：将所述重组少动鞘氨醇单胞菌菌株经活化、种子培养后，接种至适用于少动鞘氨醇单胞菌的发酵培养基，28～32℃、pH6.8～7.2摇床培养32～60h，获得含有高酰基结冷胶的乳白色发酵液。

黄色素生成缺陷的少动鞘氨醇单胞菌，是缺失crtI基因的重组菌株。其中使少动鞘氨醇单胞菌缺失crtI基因的方法可使用常规的敲除方法。本发明使用的常规基因敲除技术，具体的包括以下步骤：

1、以少动鞘氨醇单胞菌基因组为模板，利用PCR方法扩增crtI基因的上下游侧翼片断，分别将上下游片断插入常规敲除载体pLO3构建crtI基因敲除载体pLO3-ΔI；

2、将crtI基因敲除载体pLO3-ΔI通过三亲接合方法导入少动鞘氨醇单胞菌中；

3、第一次同源重组时整个敲除质粒插入基因组中的同源位点，四环素抗性筛选得到阳性重组子，并用PCR方法扩增sacB基因鉴定。将筛选得到的同源重组第一次交换阳性重组子接种入预培养培养基中传代三次，然后涂布在含8％蔗糖的筛选平板上以筛选第二次同源重组交换体。筛选得到的第二次交换同源重组体影印至含四环素的抗性平板并用PCR方法进一步鉴定，从而获得crtI基因缺失的少动鞘氨醇单胞菌。

本发明提供的少动鞘氨醇单胞菌八氢番茄红素脱氢酶基因(crtI)的DNA序列为少动鞘氨醇单胞菌类胡萝卜素生物合成途径进行遗传改造奠定基础。另外，本发明通过基因敲除的方法构建的八氢番茄红素脱氢酶缺失的少动鞘氨醇单胞菌重组菌株与野生型菌株相比，结冷胶产量基本不变且不产黄色素，减少了结冷胶提取时乙醇或异丙醇的用量从而降低了结冷胶的生产成本，同时，该菌株还可以应用于进一步的基因敲除或代谢工程改造。

(四)附图说明

图1为pLO3质粒的结构示意图；

图2为PCR法鉴定crtI基因敲除的电泳图：1～7以构建的crtI基因缺失的少动鞘氨醇单胞菌基因组为模板(831bp)，8以野生型少动鞘氨醇单胞菌基因组为模板作对照(2292bp)。

(五)具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

实施例1：少动鞘氨醇单胞菌crtI基因DNA序列的获得

对来自少动鞘氨醇单胞菌所属sphingomonadales目的Erythrobacterlitoralis HTCC2594、Erythrobacter longus、Erythrobacter sp.NAP1、Erythrobacter sp.SD-21共4种菌的八氢番茄红素脱氢酶蛋白序列(数据来自NCBI蛋白数据库)运用软件MEGA4进行了ClustalW比对，发现存在蛋白保守序列TFDA(G)GPT、VGAGTHPGAG。根据以上保守序列并查询密码子偏好性(数据来自日本kazusa Codon Usage Database)，设计如下简并引物扩增crtI基因部分序列。

上游引物：

crtIsense：5′-ACSTTYGAYGCNGGBCCSACS-3′

下游引物：

crtIanti：5′-VCCNGCVCCSGGRTGSGTVCCNGCVCCNAC-3′

从少动鞘氨醇单胞菌Sphmgomonas paucimobilis ATCC31461(从ATCC购买)中提取基因组DNA(使用AxyPrep细菌基因组DNA小量制备试剂盒)作为PCR模板利用上述的简并引物扩增出少动鞘氨醇单胞菌crtI基因的部分序列。PCR反应程序为：95℃预变性5min进入循环过程；94℃变性30sec，62℃退火30sec，72℃延伸90sec，30个循环；最后以72℃延伸10min。1％琼脂糖凝胶电泳分析。

以上引物能扩增出一致性较好，特异性较强的条带(大小为1182bp)，割胶回收(使用AxyPrep DNA凝胶回收试剂盒)后连接到pMD19-T(Takara)载体上，转化大肠杆菌Top10感受态细胞，挑取氨苄抗性克隆，菌落PCR鉴定pMD19-T中是否插入回收的PCR片段。对阳性克隆测序(Invitrogen公司测定)，并用BLAST程序对序列进行同源性分析。该片段与Erythrobacter lttoralis HTCC2594八氢番茄红素基因的同源性为72％，初步确定它是少动鞘氨醇单胞菌八氢番茄红素脱氢酶基因的DNA片段。

crtI基因完整序列及侧翼未知序列的获取采用SiteFinding-PCR方法。SiteFinding-PCR方法是一种获得测序序列信息的常规的快速高效的染色体步移方法。该方法通过模板变性、SiteFinder在低温下与基因组模板退火、单方向延伸，将SiteFinder序列引入基因组序列之中；然后根据已知序列设计的基因特异性引物与根据SiteFinder序列设计的SFP引物进行PCR。2轮PCR后，目标的侧翼分子被指数倍扩增，而非目标分子因茎环结构的抑制作用而无法完成指数扩增，从而达到选择性扩增目标分子的目的。

根据已知的该段序列分别在上下游设计了两条基因特异性引物进行SiteFinding-PCR。所用的基因特异性引物、SiteFinder、SFP引物序列如下：上游序列特异性引物：

up1：5′-ATTAGGACAGGCGGTAGAAGGG-3′

up2：5′-TCCAGCGTCACATCTTCCGAG-3′

下游序列特异性引物：

down1：5′-TCGTTCGACGTTCTACGTG-3′

down2：5′-ACTATGCGCCCACCGACTTCC-3′

SiteFinder：

SiteF1：

5′-CACGACACGCTACTCAACACACCACCACGCACAGCGTCCTCAANNNNNNCATGG-3′

SiteF2：

5′-CACGACACGCTACTCAACACACCACCACGCACAGCGTCCTCAANNNNNNCATGC-3′

SiteF3：

5′-CACGACACGCTACTCAACACACCACCACGCACAGCGTCCTCAANNNNNNGCCT-3′

SiteF4：

5′-CACGACACGCTACTCAACACACCACCACGCACAGCGTCCTCAANNNNNNGCCACG-3′

SFP引物：

SFP1：5′-CACGACACGCTACTCAACAC-3′

SFP2：5′-ACTCAACACACCACCACGCACAGC-3′

扩增得到的目标DNA片断经类似的克隆和测序后作BLAST分析，发现得到的上游目标DNA片段(875bp)包含起始密码子，下游目标DNA片段(985bp)包含终止密码子，将上述序列与crtI基因的部分序列拼接后获得一段长2886bp的DNA序列，如SEQ ID No.2所示，其中包含的crtI基因(SEQ ID No.1)全长为1479bp(SEQ ID No.2第634位碱基～第2112位碱基)。

实施例2：八氢番茄红素脱氢酶缺失的少动鞘氨醇单胞菌重组菌株的构建

1、基因敲除载体pLO3-ΔI的构建

根据获得的DNA序列设计引物。从少动鞘氨醇单胞菌Sphingomonaspaucimobilis ATCC31461(ATCC购买)中提取基因组DNA(使用AxyPrep细菌基因组DNA小量制备试剂盒)作为PCR模板。I1、I2为引物扩增crtI基因上游序列，PCR反应程序为：95℃预变性5min进入循环过程；94℃变性30sec，63℃退火30sec，72℃延伸1min，30个循环，最后以72℃延伸10min。I3、I4为引物扩增crtI基因下游序列，PCR反应程序为：95℃预变性5min进入循环过程；94℃变性30sec，64℃退火30sec，72℃延伸1min，30个循环，最后以72℃延伸10min。上述引物序列如下：

I1：5′-AGTGAGCTCCGAGGACACCTATTACAG-3′下划线为SacI酶切位点

I2：5′-TATCTAGAGCGCATCAGCGGCTCCAG-3′下划线为XbaI酶切位点

I3：5′-CGTCTAGATTGGCGTGAACATCCAAGCC-3′下划线为XbaI酶切位点

I4：5′-GACTGCAGAAGCCGACCTTGCCCATAT-3′下划线为PstI酶切位点

PCR产物1％琼脂糖凝胶电泳，然后用AxyPrep DNA凝胶回收试剂盒割胶回收。

回收的上游片断(SEQ ID NO.2第79～639位碱基)、基因敲除质粒pLO3经SacI、XbaI 37℃双酶切过夜后，上游片断PCR清洁回收(使用AxyPrep PCR清洁回收试剂盒)，质粒1％琼脂糖凝胶电泳并割胶回收后T4DNA ligase 4℃连接过夜，转化大肠杆菌S17-1感受态细胞。LB平板(添加25μg/ml的四环素)筛选阳性克隆。筛选所得阳性克隆菌落PCR验证，提取质粒进一步酶切验证并测序。通过验证的克隆提取质粒，命名为pLO3-I1。

pLO3-I1、回收的下游片段(SEQ ID NO.2第2104～2881位碱基)经XbaI、PstI37℃双酶切过夜后进行类似的克隆和验证，构建好的基因敲除载体命名为pLO3-ΔI。

2、基因敲除载体pLO3-ΔI转化

基因敲除载体pLO3-ΔI采用三亲接合方法导入少动鞘氨醇单胞菌ATCC 31461和DSM 6314中。三亲接合过程需要三种细菌：①含有重组质粒pLO3-ΔI的大肠杆菌供体菌S17-1/pLO3-ΔI；②含有辅助质粒pRK2013的大肠杆菌“协助”(helper)菌HB101/pRK2013；③少动鞘氨醇单胞菌ATCC 31461或者DSM 6314(受体菌)。当三种菌混合时，协助质粒pRK2013游动进入大肠杆菌内，提供游动(mob)和转移(tra)功能，把供体的重组质粒pLO3-ΔI转移进入少动鞘氨醇单胞菌内。该系统中重组载体质粒需要带有一个特定的转移起始点(oirT)，以使协助质粒的tra和mob基因对它起作用，被驱动转移。pLO3质粒为四环素抗性，含有蔗糖反向筛选标记sacB基因、pBR322_origin复制起点和oriT_RP4转移起点。该质粒能够在大肠杆菌中复制，但不能在少动鞘氨醇单胞菌中复制，因此pLO3质粒进入少动鞘氨醇单胞菌时，只能经同源同组整合入染色体，和染色体一起复制，而不能以游离形式存在于染色体外。利用pLO3质粒的这些特点，将欲敲除基因两侧的同源片断克隆入pLO3质粒从而定位pLO3质粒的整合位点。利用同源性DNA片断可发生重组的原理，构建基因缺失菌株。三亲接合具体方法如下所述：

少动鞘氨醇单胞菌于预培养培养基中30℃、200rpm培养过夜。以10％接种量转接预培养培养基30℃、200rpm培养8h。S17-1/pLO3-ΔI、HB101/pRK2013于加相应抗生素的LB液体培养基(抗生素添加量：四环素25μg/ml、卡那霉素50μg/ml)中37℃培养过夜。取S17-1/pLO3-ΔI、HB101/pRK2013菌液各2ml离心收集菌体(3000rpm、5min)；取少动鞘氨醇单胞菌5ml，6000rpm离心5min，弃上清，分别用无菌去离子水洗涤两次，离心。将上述3种菌合并，用5ml无菌去离子水重悬混匀后用0.45μm孔径直径5cm的滤膜抽滤。滤膜菌体朝上贴在LB平板中，37℃静置培养7h后用5ml无菌去离子水将滤膜上的菌体洗下，梯度稀释至合适浓度后涂布含25μg/ml链霉素、5μg/ml四环素的YM平板。所用的培养基组成如下：

预培养培养基：酵母膏0.2％，牛肉膏0.3％，蛋白胨0.5％，NaCl 0.1％，葡萄糖0.5％，溶剂为蒸馏水，pH7.2；

YM固体培养基：酵母粉0.3％，麦芽粉0.3％，蛋白胨0.5％，葡萄糖1％，琼脂粉1.5％，溶剂为蒸馏水，pH7.2；

注：本发明中培养基浓度均指质量体积百分比浓度，某组分浓度1％表示100mL培养基中含有1g该物质。

3、crtI基因缺失的少动鞘氨醇单胞菌重组菌株的筛选

第一次同源重组时，质粒整合入基因组。四环素抗性筛选得到的克隆提取基因组，sacB引物PCR扩增sacB基因鉴定阳性重组子。PCR反应程序为：95℃预变性5min进入循环过程；94℃变性30sec，50℃退火30sec，72℃延伸90sec，30个循环，最后以72℃延伸10min。PCR产物为1151bp片断的为阳性重组子。

上述验证引物序列如下：

sacBsense：5′-CGAACCAAAAGCCATATAAG-3′

sacBanti：5′-AGCGAAGTGTGAGTAAGTAA-3′

第二次同源重组质粒脱离基因组DNA，产生两种交换类型：缺失突变菌株(白色)和野生型菌株(黄色)。第一次同源重组筛选得到的阳性克隆接种入预培养培养基中传代三次，然后涂布在8％蔗糖筛选平板上以筛选第二次同源重组交换体。由于sacB基因编码的蔗糖果聚糖酶能使蔗糖转化为果聚糖。果聚糖对细胞有毒性，在高浓度蔗糖存在下只有丢失sacB基因才能生长。因此能利用高浓度蔗糖可反向筛选得到去除整合敲除质粒的野生型菌株或者缺失突变菌株。筛选得到的第二次交换体影印含有5μg/ml四环素的YM平板培养基，以进一步确认第二次交换抗性标记已丢失。

随机选择第二次同源重组表型为白色的交换体，分别命名为ΔI1～ΔI7，其中ΔI1～ΔI4来源于少动鞘氨醇单胞菌ATCC 31461，而ΔI5～ΔI7则来源于少动鞘氨醇单胞菌DSM 6314。用I5、I6为引物PCR进一步确认ΔI1～ΔI7是否已crtI基因敲除。PCR反应程序为：95℃预变性5min进入循环过程；98℃变性10sec，54℃退火15sec，72℃延伸3min，30个循环。同时以野生型菌株基因组为模板作PCR对照，电泳结果如图2所示，以野生型菌株基因组为模板的PCR产物为2292bp，而以crtI基因缺失的少动鞘氨醇单胞菌基因组为模板的PCR产物为831bp。经此实验证明，ΔI1～ΔI7确实为crtI基因缺失突变株。

上述引物序列如下：

I5：5′-GTCTATTGCCTGCCGTTC-3′

I6：5′-GGCTGATAGCGTGTTTTC-3′。

实施例3：crtI基因缺失的少动鞘氨醇单胞菌菌株产胶能力的测定

1、野生型菌株(Sphingomonas paucimobilis ATCC 31461)和crtI基因缺失的少动鞘氨醇单胞菌(ΔI1～ΔI7)接YM培养基斜面上，30℃培养72h；

2、一级种子培养：分别将斜面种子接入50ml一级种子培养基(盛于250ml三角瓶)，于30℃，200rpm振荡培养24h，即为一级种子液；

3、二级种子培养：分别将一级种子液以5％体积比的接种量接入100ml二级种子培养基(盛于500mL三角瓶)，于30℃，200rpm振荡培养12h，即为二级种子液；

4、发酵：将二级种子液以5％体积比的接种量接入100mL级发酵培养基中(盛于500mL三角瓶)，于30℃，200rpm振荡发酵48h；

5、分别测定对照(野生型菌株)和crtI基因缺失的少动鞘氨醇单胞菌(ΔI1～ΔI7)的发酵液的粘度及出胶率，结果如表1：

表1、野生菌株和突变菌株发酵48h出胶率、粘度

与对照相比，ΔI菌株出胶率和粘度并没有明显的变化，出胶率相对于对照菌株处于同一水平，因此选用ΔI作为生产菌株，结冷胶产量不会降低，并且可以降低后续提取中乙醇或异丙醇的用量，从而达到降低生产成本的目的。所用培养基组成为：

一级种子培养基：酵母膏0.20％；牛肉膏0.30％；蛋白胨0.50％；氯化钾0.10％，溶剂为蒸馏水，pH7.2；

二级种子培养基：葡萄糖1.50％；酵母膏.0.50％；蛋白胨0.50％；磷酸二氢钾0.06％；磷酸氢二钾0.06％；硫酸镁0.06％，溶剂为蒸馏水，pH7.2；

发酵培养基：葡萄糖3.00％；酵母膏0.05％；蛋白胨0.30％；磷酸二氢钾0.06％；磷酸氢二钾0.10％；硫酸镁0.06％；溶剂为蒸馏水，pH7.2。

实施例4：八氢番茄红素脱氢酶缺陷型菌株高酰基结冷胶的制备工艺

1、发酵液预处理：发酵液100L，用10％(v/v)的HCl调pH6.0，升温至60℃，保温1h；

2、蛋白杂质去除：降温至40℃时，用10％(w/v)NaOH调pH7.0，加入50g的溶菌酶(20万U/g，庞博生物)及100g的碱性蛋白酶(2万U/g，庞博生物)，保温2h；

3、絮凝沉淀，分离：经过预处理及蛋白去杂处理后的发酵液中加入5L浓度为20％(w/v)的CaCl₂溶液，搅拌30min后，加入30L异丙醇，继续搅拌1h后，板框压滤；

4、干燥、粉碎：压滤所得纤维料90℃干燥2h后粉碎，制得高酰基结冷胶成品，为乳白色粉末，含氮量为0.05～0.30％。

Claims (6)

1.一种少动鞘氨醇单胞菌(Sphingomonas sp.)的八氢番茄红素脱氢酶基因(crtI)，具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。

2.一种权利要求1所述crtI基因缺失的重组少动鞘氨醇单胞菌，由少动鞘氨醇单胞菌经基因敲除去除crtI基因获得。

3.如权利要求2所述的重组少动鞘氨醇单胞菌，由少动鞘氨醇单胞菌经基因敲除去除SEQ ID NO.1所示的核苷酸片段获得。

4.如权利要求3所述的重组少动鞘氨醇单胞菌，其特征在于所述基因敲除借助SEQ ID NO.2所示的核苷酸片段进行。

5.如权利要求2所述的重组少动鞘氨醇单胞菌在微生物发酵制备结冷胶中的应用。

6.如权利要求5所述的应用，其特征在于所述应用为：将所述重组少动鞘氨醇单胞菌菌株经活化、种子培养后，接种至适用于少动鞘氨醇单胞菌的发酵培养基，28～32℃、pH6.8～7.2摇床培养32～60h，获得含有高酰基结冷胶的乳白色发酵液。

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