CN110144318A - 无色素低分子量威兰胶生产菌株及其构建方法与应用 - Google Patents
无色素低分子量威兰胶生产菌株及其构建方法与应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN110144318A CN110144318A CN201910323921.4A CN201910323921A CN110144318A CN 110144318 A CN110144318 A CN 110144318A CN 201910323921 A CN201910323921 A CN 201910323921A CN 110144318 A CN110144318 A CN 110144318A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- gene
- crtb
- seq
- srtw
- gelr
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 title claims abstract description 42
- 239000000049 pigment Substances 0.000 title claims abstract description 38
- 238000010276 construction Methods 0.000 title claims description 22
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims abstract description 83
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 claims abstract description 57
- 230000000593 degrading effect Effects 0.000 claims abstract description 38
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims abstract description 27
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 claims abstract description 26
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 claims abstract description 16
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 claims abstract description 15
- 241001135759 Sphingomonas sp. Species 0.000 claims abstract description 13
- 101150081158 crtB gene Proteins 0.000 claims description 69
- 238000003209 gene knockout Methods 0.000 claims description 37
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 32
- 101710173432 Phytoene synthase Proteins 0.000 claims description 28
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims description 26
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 claims description 18
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 claims description 15
- 230000035784 germination Effects 0.000 claims description 9
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims description 9
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 9
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 9
- 238000012216 screening Methods 0.000 claims description 9
- 108010066605 Geranylgeranyl-Diphosphate Geranylgeranyltransferase Proteins 0.000 claims description 5
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 2
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 claims description 2
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 claims description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 241000227653 Lycopersicon Species 0.000 claims 3
- 235000007688 Lycopersicon esculentum Nutrition 0.000 claims 3
- 239000001054 red pigment Substances 0.000 claims 3
- 238000011534 incubation Methods 0.000 claims 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 claims 1
- 238000012856 packing Methods 0.000 abstract description 14
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 abstract description 10
- 230000008859 change Effects 0.000 abstract description 4
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 14
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 14
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 14
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 13
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 description 13
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 description 13
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 12
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 10
- 241000736131 Sphingomonas Species 0.000 description 9
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 9
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 9
- 206010010144 Completed suicide Diseases 0.000 description 8
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 7
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 7
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 7
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 7
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 6
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 5
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 5
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 5
- 239000003292 glue Substances 0.000 description 5
- 238000000034 method Methods 0.000 description 5
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 5
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 5
- YVLPJIGOMTXXLP-UHFFFAOYSA-N 15-cis-phytoene Chemical compound CC(C)=CCCC(C)=CCCC(C)=CCCC(C)=CC=CC=C(C)CCC=C(C)CCC=C(C)CCC=C(C)C YVLPJIGOMTXXLP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 229930182566 Gentamicin Natural products 0.000 description 4
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 4
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 4
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 4
- 238000011218 seed culture Methods 0.000 description 4
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 4
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 4
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 4
- CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N Gentamicin Chemical compound O1[C@H](C(C)NC)CC[C@@H](N)[C@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](NC)[C@@](C)(O)CO2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N 0.000 description 3
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 3
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 3
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 3
- 235000019441 ethanol Nutrition 0.000 description 3
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 3
- 229960002518 gentamicin Drugs 0.000 description 3
- 238000009776 industrial production Methods 0.000 description 3
- CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L magnesium sulphate Substances [Mg+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 3
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 3
- 238000011160 research Methods 0.000 description 3
- 101150025220 sacB gene Proteins 0.000 description 3
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 3
- YVLPJIGOMTXXLP-UUKUAVTLSA-N 15,15'-cis-Phytoene Natural products C(=C\C=C/C=C(\CC/C=C(\CC/C=C(\CC/C=C(\C)/C)/C)/C)/C)(\CC/C=C(\CC/C=C(\CC/C=C(\C)/C)/C)/C)/C YVLPJIGOMTXXLP-UUKUAVTLSA-N 0.000 description 2
- YVLPJIGOMTXXLP-BAHRDPFUSA-N 15Z-phytoene Natural products CC(=CCCC(=CCCC(=CCCC(=CC=C/C=C(C)/CCC=C(/C)CCC=C(/C)CCC=C(C)C)C)C)C)C YVLPJIGOMTXXLP-BAHRDPFUSA-N 0.000 description 2
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 2
- 229920002148 Gellan gum Polymers 0.000 description 2
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 description 2
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 description 2
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 2
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000009471 action Effects 0.000 description 2
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- 235000021466 carotenoid Nutrition 0.000 description 2
- 150000001747 carotenoids Chemical class 0.000 description 2
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 2
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 2
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 2
- ZPWVASYFFYYZEW-UHFFFAOYSA-L dipotassium hydrogen phosphate Chemical compound [K+].[K+].OP([O-])([O-])=O ZPWVASYFFYYZEW-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 229910000396 dipotassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 2
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 2
- 239000000216 gellan gum Substances 0.000 description 2
- 235000010492 gellan gum Nutrition 0.000 description 2
- 231100000518 lethal Toxicity 0.000 description 2
- 230000001665 lethal effect Effects 0.000 description 2
- 229910052943 magnesium sulfate Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 2
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 description 2
- 235000011765 phytoene Nutrition 0.000 description 2
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 2
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 2
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 2
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 2
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 2
- 229920001285 xanthan gum Polymers 0.000 description 2
- 239000000230 xanthan gum Substances 0.000 description 2
- 235000010493 xanthan gum Nutrition 0.000 description 2
- 229940082509 xanthan gum Drugs 0.000 description 2
- OINNEUNVOZHBOX-QIRCYJPOSA-K 2-trans,6-trans,10-trans-geranylgeranyl diphosphate(3-) Chemical compound CC(C)=CCC\C(C)=C\CC\C(C)=C\CC\C(C)=C\COP([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O OINNEUNVOZHBOX-QIRCYJPOSA-K 0.000 description 1
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- AEMOLEFTQBMNLQ-AQKNRBDQSA-N D-glucopyranuronic acid Chemical compound OC1O[C@H](C(O)=O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]1O AEMOLEFTQBMNLQ-AQKNRBDQSA-N 0.000 description 1
- SHZGCJCMOBCMKK-UHFFFAOYSA-N D-mannomethylose Natural products CC1OC(O)C(O)C(O)C1O SHZGCJCMOBCMKK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-QTVWNMPRSA-N D-mannopyranose Chemical compound OC[C@H]1OC(O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-QTVWNMPRSA-N 0.000 description 1
- 229930091371 Fructose Natural products 0.000 description 1
- 239000005715 Fructose Substances 0.000 description 1
- RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N Fructose Chemical compound OC[C@H]1O[C@](O)(CO)[C@@H](O)[C@@H]1O RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N 0.000 description 1
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 1
- IAJILQKETJEXLJ-UHFFFAOYSA-N Galacturonsaeure Natural products O=CC(O)C(O)C(O)C(O)C(O)=O IAJILQKETJEXLJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OINNEUNVOZHBOX-XBQSVVNOSA-N Geranylgeranyl diphosphate Natural products [P@](=O)(OP(=O)(O)O)(OC/C=C(\CC/C=C(\CC/C=C(\CC/C=C(\C)/C)/C)/C)/C)O OINNEUNVOZHBOX-XBQSVVNOSA-N 0.000 description 1
- SHZGCJCMOBCMKK-JFNONXLTSA-N L-rhamnopyranose Chemical compound C[C@@H]1OC(O)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O SHZGCJCMOBCMKK-JFNONXLTSA-N 0.000 description 1
- PNNNRSAQSRJVSB-UHFFFAOYSA-N L-rhamnose Natural products CC(O)C(O)C(O)C(O)C=O PNNNRSAQSRJVSB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UPYKUZBSLRQECL-UKMVMLAPSA-N Lycopene Natural products CC(=C/C=C/C=C(C)/C=C/C=C(C)/C=C/C1C(=C)CCCC1(C)C)C=CC=C(/C)C=CC2C(=C)CCCC2(C)C UPYKUZBSLRQECL-UKMVMLAPSA-N 0.000 description 1
- JEVVKJMRZMXFBT-XWDZUXABSA-N Lycophyll Natural products OC/C(=C/CC/C(=C\C=C\C(=C/C=C/C(=C\C=C\C=C(/C=C/C=C(\C=C\C=C(/CC/C=C(/CO)\C)\C)/C)\C)/C)\C)/C)/C JEVVKJMRZMXFBT-XWDZUXABSA-N 0.000 description 1
- MSFSPUZXLOGKHJ-UHFFFAOYSA-N Muraminsaeure Natural products OC(=O)C(C)OC1C(N)C(O)OC(CO)C1O MSFSPUZXLOGKHJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101100100125 Mus musculus Traip gene Proteins 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 108010013639 Peptidoglycan Proteins 0.000 description 1
- 244000046052 Phaseolus vulgaris Species 0.000 description 1
- 235000010627 Phaseolus vulgaris Nutrition 0.000 description 1
- WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M Potassium chloride Chemical compound [Cl-].[K+] WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 241001097928 Sphingomonas elodea ATCC 31461 Species 0.000 description 1
- 241001467384 Sphingomonas sp. ATCC 31555 Species 0.000 description 1
- 241000191967 Staphylococcus aureus Species 0.000 description 1
- 101100309436 Streptococcus mutans serotype c (strain ATCC 700610 / UA159) ftf gene Proteins 0.000 description 1
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L Sulfate Chemical compound [O-]S([O-])(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 description 1
- 235000005824 Zea mays ssp. parviglumis Nutrition 0.000 description 1
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 description 1
- 238000012271 agricultural production Methods 0.000 description 1
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 1
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 1
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 1
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 238000006555 catalytic reaction Methods 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 229960005091 chloramphenicol Drugs 0.000 description 1
- WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N chloramphenicol Chemical compound ClC(Cl)C(=O)N[C@H](CO)[C@H](O)C1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N 0.000 description 1
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 1
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 1
- 239000000084 colloidal system Substances 0.000 description 1
- 239000004567 concrete Substances 0.000 description 1
- 238000009833 condensation Methods 0.000 description 1
- 230000005494 condensation Effects 0.000 description 1
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 1
- 235000005822 corn Nutrition 0.000 description 1
- 239000002537 cosmetic Substances 0.000 description 1
- 235000012343 cottonseed oil Nutrition 0.000 description 1
- 239000006071 cream Substances 0.000 description 1
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 1
- XPPKVPWEQAFLFU-UHFFFAOYSA-N diphosphoric acid Chemical compound OP(O)(=O)OP(O)(O)=O XPPKVPWEQAFLFU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000009977 dual effect Effects 0.000 description 1
- 238000004043 dyeing Methods 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- CEAZRRDELHUEMR-UHFFFAOYSA-N gentamicin Chemical class O1C(C(C)NC)CCC(N)C1OC1C(O)C(OC2C(C(NC)C(C)(O)CO2)O)C(N)CC1N CEAZRRDELHUEMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000002791 glucosyl group Chemical group C1([C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O1)CO)* 0.000 description 1
- 229940097043 glucuronic acid Drugs 0.000 description 1
- 238000009655 industrial fermentation Methods 0.000 description 1
- 230000008595 infiltration Effects 0.000 description 1
- 238000001764 infiltration Methods 0.000 description 1
- 101150044508 key gene Proteins 0.000 description 1
- OAIJSZIZWZSQBC-GYZMGTAESA-N lycopene Chemical compound CC(C)=CCC\C(C)=C\C=C\C(\C)=C\C=C\C(\C)=C\C=C\C=C(/C)\C=C\C=C(/C)\C=C\C=C(/C)CCC=C(C)C OAIJSZIZWZSQBC-GYZMGTAESA-N 0.000 description 1
- 235000012661 lycopene Nutrition 0.000 description 1
- 229960004999 lycopene Drugs 0.000 description 1
- 239000001751 lycopene Substances 0.000 description 1
- 159000000003 magnesium salts Chemical class 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 230000002906 microbiologic effect Effects 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 235000013379 molasses Nutrition 0.000 description 1
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 1
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 description 1
- 239000000575 pesticide Substances 0.000 description 1
- 239000003208 petroleum Substances 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- 102000020244 polysaccharide lyase Human genes 0.000 description 1
- 108091022901 polysaccharide lyase Proteins 0.000 description 1
- 239000001103 potassium chloride Substances 0.000 description 1
- 235000011164 potassium chloride Nutrition 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 238000007639 printing Methods 0.000 description 1
- 235000004252 protein component Nutrition 0.000 description 1
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 229940005657 pyrophosphoric acid Drugs 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 1
- WWUZIQQURGPMPG-KRWOKUGFSA-N sphingosine Chemical group CCCCCCCCCCCCC\C=C\[C@@H](O)[C@@H](N)CO WWUZIQQURGPMPG-KRWOKUGFSA-N 0.000 description 1
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 1
- 239000000375 suspending agent Substances 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 239000004753 textile Substances 0.000 description 1
- 239000002562 thickening agent Substances 0.000 description 1
- 239000003053 toxin Substances 0.000 description 1
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 description 1
- ZCIHMQAPACOQHT-ZGMPDRQDSA-N trans-isorenieratene Natural products CC(=C/C=C/C=C(C)/C=C/C=C(C)/C=C/c1c(C)ccc(C)c1C)C=CC=C(/C)C=Cc2c(C)ccc(C)c2C ZCIHMQAPACOQHT-ZGMPDRQDSA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/10—Transferases (2.)
- C12N9/1085—Transferases (2.) transferring alkyl or aryl groups other than methyl groups (2.5)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
- C12P19/04—Polysaccharides, i.e. compounds containing more than five saccharide radicals attached to each other by glycosidic bonds
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y205/00—Transferases transferring alkyl or aryl groups, other than methyl groups (2.5)
- C12Y205/01—Transferases transferring alkyl or aryl groups, other than methyl groups (2.5) transferring alkyl or aryl groups, other than methyl groups (2.5.1)
- C12Y205/01032—15-Cis-phytoene synthase (2.5.1.32)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y205/00—Transferases transferring alkyl or aryl groups, other than methyl groups (2.5)
- C12Y205/01—Transferases transferring alkyl or aryl groups, other than methyl groups (2.5) transferring alkyl or aryl groups, other than methyl groups (2.5.1)
- C12Y205/01096—4,4'-diapophytoene synthase (2.5.1.96)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y205/00—Transferases transferring alkyl or aryl groups, other than methyl groups (2.5)
- C12Y205/01—Transferases transferring alkyl or aryl groups, other than methyl groups (2.5) transferring alkyl or aryl groups, other than methyl groups (2.5.1)
- C12Y205/01099—All-trans-phytoene synthase (2.5.1.99)
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
本发明公开了无色素低分子量威兰胶生产菌株，以Sphingomonas sp.HT‑1(保藏号CCTCC NO：M2012062)为出发菌株，分别构建了色素缺陷型并解除包囊结构的鞘氨醇单胞菌基因工程菌WG‑1，色素和降解酶基因缺陷型的鞘氨醇单胞菌基因工程菌WG‑2，以及色素和降解酶基因缺陷型并解除包囊结构的鞘氨醇单胞菌基因工程菌WG‑3。本发明中鞘氨醇单胞菌WG‑2菌株威兰胶产量较出发菌株提高10％～30％，达到35～45g/L，且分子量无明显变化(Mn：10000～20000kDa)；本发明中鞘氨醇单胞菌WG‑1、WG‑3菌株发酵生产低分子量威兰胶(Mn：500～1000kDa)，且解除包囊结构的WG‑3产量较WG‑1菌株提高了20～30％，达到20～25g/L。本发明所构建菌株，能够获得不同分子量范围的威兰胶产品，且显著提升了威兰胶的发酵水平。
Description
技术领域
本发明涉及微生物基因工程菌领域，具体涉及无色素低分子量威兰胶生产菌株及其构建方法与应用。
背景技术
微生物多糖是一类环保绿色的可通过生物发酵制得的产物，对人类生活和工农业生产应用具有重要的作用。微生物多糖能在科学研究和工业化生产上取得成功主要基于以下几点：(1)多糖的性质及其具有的应用价值；(2)可以通过选合适的菌种在受控条件下进行生产；(3)提取工艺的可行性；(4)不含毒素；(5)不同微生物能够合成很多非常特殊的离子型和中性多糖，这些微生物多糖在工业生产与生活的许多领域具有广泛的应用价值，可以替代很多价格不菲的化学合成品，具有良好的环境友好性和商业开发潜力。目前全世界微生物多糖需求量约为15～20万吨/年，年产值可达150-200亿美元，产量和年增长量均在10％以上，而一些新型多糖年增长量在30％以上。
上世纪80年代继黄原胶之后，美国Kelco公司陆续发现了一组新型的微生物多糖即由鞘氨醇单胞菌产生的结冷胶类多糖，引起了科学界和工业界的浓厚兴趣。该类多糖主链结构均为葡萄糖、葡萄糖醛酸、甘露糖或鼠李糖，它们具有许多优良而独特的理化特性，可以作为增稠剂、悬浮剂、稳定剂等广泛用于石油、混凝土、涂料行业，也可用于油墨、食品、纺织印染、农药、化妆品、医药等行业。
目前，微生物多糖中除了黄原胶生产规模较大，结冷胶、威兰胶、鼠李糖胶生产规模均不大，而国内直到近几年才开始威兰胶生产，但仍存在许多问题亟待解决，如威兰胶生物合成伴随着类胡萝卜素的产生，后期分离过程中大量乙醇的使用进一步提高生产成本，造成下游污染；威兰胶会附着在细胞表面上，形成包囊状结构，降低传质效率，阻碍菌胶分离等，同时研究者对不同分子量威兰胶生物合成机制及应用等方面的研究较少。因此构建解除包囊结构的色度缺陷型生产菌株不仅利于提高工业生产效率，降低成本，更能获得多元分子量的威兰胶产品，有助于拓宽威兰胶的下游应用领域。
发明内容
发明目的：为了解决现有威兰胶生产过程中乙醇用量大及菌胶分离困难的问题，本发明提供了一种解除包囊结构且色素缺陷的鞘氨醇单胞菌基因工程菌作为无色素低分子量威兰胶的生产菌株。
本发明进一步的目的是提供上述解除包囊结构且色素缺陷的鞘氨醇单胞菌基因工程菌的构建方法。
本发明更进一步的目的是提供鞘氨醇单胞菌基因工程菌在制备生产无色素低分子量威兰胶中的应用。
目前为止，鞘氨醇单胞菌中类胡萝卜素合成途径的研究较少。
技术方案：为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：
一种鞘氨醇单胞菌基因工程菌，所述鞘氨醇单胞菌基因工程菌中八氢番茄红素合成酶基因crtB失活；
或者，八氢番茄红素合成酶基因crtB和分选酶基因srtW同时失活；
或者，八氢番茄红素合成酶基因crtB和降解酶基因gelR同时失活；
或者，八氢番茄红素合成酶基因crtB、分选酶基因srtW和降解酶基因gelR同时失活。
所述八氢番茄红素合成酶基因crtB是细菌体内类胡萝卜素合成过程中，催化牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸(GGPP)缩合形成第一个类胡萝卜素——八氢番茄红素的关键酶。
所述分选酶基因srtW是存在于革兰氏阴性菌必须的膜蛋白组分，与胞外多糖以及其他胞外聚合体的生物合成有很大相关性，最早发现于金黄色葡萄球菌中，催化和引导细胞表面蛋白共价结合到细胞壁肽聚糖上。
所述降解酶基因gelR是类似于编码细菌和真菌多糖裂解酶的蛋白质。
所述八氢番茄红素合成酶基因crtB失活是指八氢番茄红素合成酶基因crtB丧失编码八氢番茄红素合成酶的能力，或者编码的八氢番茄红素合成酶没有活性；
所述分选酶基因srtW失活是指分选酶基因srtW丧失编码分选酶的能力，或者编码的分选酶没有活性；
所述降解酶基因gelR失活是指降解酶基因gelR丧失编码降解酶的能力，或者编码的降解酶没有活性。
其中，所述的鞘氨醇单胞菌基因工程菌的出发菌为Sphingomonas sp.HT-1，该菌株已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号CCTCC No：M 2012062，该菌株的详细信息已经在申请号为201210086289.4的中国专利中详细公开。
其中，所述八氢番茄红素合成酶基因crtB失活是指八氢番茄红素合成酶基因crtB被完全敲除；
所述分选酶基因srtW失活是指分选酶基因srtW被完全敲除；
降解酶基因gelR失活是指分降解酶基因gelR被完全敲除。
其中，所述八氢番茄红素合成酶基因crtB的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；
所述选酶基因srtW的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；
所述降解酶基因gelR的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
上述无色素低分子量威兰胶生产菌株的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)分别构建八氢番茄红素合成酶基因crtB基因敲除片段、分选酶基因srtW基因敲除片段、降解酶基因gelR基因敲除片段，将上述三种基因敲除片段分别导入敲除质粒中，得到八氢番茄红素合成酶基因crtB基因敲除质粒、分选酶基因srtW基因敲除质粒、降解酶基因gelR基因敲除质粒；
(2)将八氢番茄红素合成酶基因crtB基因敲除质粒转化出发菌，经筛选得到八氢番茄红素合成酶基因crtB失活的基因工程菌；
将分选酶基因srtW基因敲除质粒转化出发菌，经筛选得到分选酶基因srtW失活的基因工程菌；
将降解酶基因gelR基因除质粒转化出发菌，经筛选得到降解酶基因gelR失活的基因工程菌。
通过两步同源重组构建八氢番茄红素合成酶基因(crtB)与分选酶基因(srtW)的敲除菌株WG-1，构建八氢番茄红素合成酶基因(crtB)与降解酶基因(gelR)的敲除菌株WG-2，构建八氢番茄红素合成酶基因(crtB)与分选酶基因(srtW)与降解酶基因(gelR)的敲除菌株WG-3。
以敲除编码八氢番茄红素合成酶crtB基因为例，具体的敲除方法如下：
(1a)以S.sp.HT-1基因组为模板，PCR扩增crtB上下游同源片段，以自杀型载体pJQ200SK为出发质粒，构建crtB敲除载体pJQ-△crtB；
(2a)将pJQ-△crtB转化至大肠杆菌S17-1感受态细胞中，涂布于含50μg/mL庆大霉素的LB固体培养基上。倒置于37℃培养箱中过夜培养。挑取克隆子进行验证，所得阳性菌株命名为E.coli S17-pJQ-△crtB
(3a)同源重组获得crtB基因敲除重组子：
同源重组分两步进行：
第一次同源重组：利用接合转移的手段，在辅助菌E.coli HB101(pRK2013)的作用下，将携带crtB上下游基因片段的敲除质粒pJQ-△crtB转化至S.sp.HT-1中，挑取单交换克隆子扩大培养；
第二次同源重组：利用pJQ200SK中sacB基因做反向筛选，获得双交换菌株。最终构建得到色素缺陷型鞘氨醇单胞菌基因工程菌S.sp.HT-1(△crtB)。
在敲除多个基因时，可以将之前已经敲除一个基因或两个基因的菌株作为出发菌。
步骤(1)中，所述八氢番茄红素合成酶基因crtB基因敲除片段的构建方法如下：
以Sphingomonas sp.HT-1基因组为模板，SEQ ID NO.14和SEQ ID NO.15、SEQ IDNO.16和SEQ ID NO.17为引物分别扩增八氢番茄红素合成酶基因crtB基因上游同源臂crtB-L和下游同源臂crtB-R；以上游同源臂crtB-L和下游同源臂crtB-R为模板、SEQ IDNO.14和SEQ ID NO.14为引物，通过重叠PCR扩增，得到八氢番茄红素合成酶基因crtB基因敲除片段；
分选酶基因srtW基因敲除片段的构建方法如下：
以Sphingomonas sp.HT-1基因组为模板，SEQ ID NO.22和SEQ ID NO.23、SEQ IDNO.24和SEQ ID NO.25为引物分别扩增分选酶基因srtW基因上游同源臂srtW-L和下游同源臂srtW-R，再以上游同源臂srtW-L和下游同源臂srtW–R为模板，SEQ ID NO.23和SEQ IDNO.25为引物，通过重叠PCR扩增，得到分选酶基因srtW基因敲除片段；
降解酶基因gelR基因敲除片段的构建方法如下：
以Sphingomonas sp.HT-1基因组为模板，SEQ ID NO.28和SEQ ID NO.29、SEQ IDNO.30和SEQ ID NO.31为引物分别扩增降解酶基因gelR基因上游同源臂gelR-L和下游同源臂gelR–R，以上游同源臂gelR-L和下游同源臂gelR–R为模板，SEQ ID NO.28和SEQ IDNO.31为引物，通过重叠PCR扩增，得到降解酶基因gelR基因敲除片段。
其中，所述敲除质粒为pJQ200SK，具有蔗糖致死性，是广泛用于革兰氏阴性菌中基因置换和修饰的自杀型质粒，保存于ATCC(美国模式培养物集存库)商标号为77483。
上述无色素低分子量威兰胶生产菌株在制备威兰胶中的应用。
当受体菌为Sphingomonas sp.CCTCC NO：M2012062时，用于发酵制备威兰胶；所述发酵阶段发酵温度为30～42℃，发酵pH为4.0～10.0，发酵过程不添加外源物调控pH。发酵培养基配方如下：碳源为葡萄糖、蔗糖、果糖、可溶性淀粉、糖蜜和淀粉水解液中的任意一种或几种的混合物，浓度为20～70g/L；所述氮源为蛋白胨、酵母膏、玉米浆、豆粕粉、棉籽饼粉、尿素、(NH4)2SO4和NH4Cl中的任意一种或几种的混合物，浓度为1～10g/L；所述无机盐为钾盐、镁盐、磷酸盐和硫酸盐中的任意一种或几种混合物，浓度为0.1～10g/L，溶剂为水。
上述无色素低分子量威兰胶生产菌株制备得到的威兰胶。本发明得到的威兰胶如鞘氨醇单胞菌基因工程菌WG-1、WG-3所产低分子量威兰胶具有无色素、易与细胞分离、提取有机溶剂用量少等特性。
有益效果：
本发明的鞘氨醇单胞菌基因工程菌可应用于结冷胶类多糖的生产中，去除了产物色素，解除包囊结构并生产低分子量威兰胶(分子量范围：700-1000KDa)，提高了鞘氨醇单胞菌的多糖产量，色素和降解酶基因缺陷型的鞘氨醇单胞菌WG-1菌株多糖产量较出发菌株提高10％～30％，达到40～45g/L，且分子量无明显变化；色素和降解酶基因缺陷型并解除包囊结构的鞘氨醇单胞菌WG-3菌株能够生产低分子量威兰胶，产量达到20～30g/L。本发明所构建菌株，显著提升了威兰胶的发酵水平，获得了不同分子量范围的威兰胶产品，在农业、医药领域方面具有较好的应用价值。
附图说明
图1为基于自杀型质粒pJQ200SK的两步同源重组基因敲除示意图；
图2色素缺陷型重组鞘氨醇单胞基因工程菌与原始菌株对比图，A图中左边为s.spHT-1，右边为s.sp-△crtB；B图中左边为s.sp HT-1，右边为s.sp-△crtB。
图3包囊结构解除重组鞘氨醇单胞基因工程菌与原始菌株电镜图，A图为原始菌株，B图为包囊结构解除重组鞘氨醇单胞基因工程菌；
图4离心实验对比，A分选酶基因没有被敲除的对照组中胶体仍包裹在细胞表面，菌体不能被离心下来，B分选酶敲除菌株胶与菌体脱离，菌体被离心下来；
图5包囊结构解除重组鞘氨醇单胞基因工程菌产低分子量威兰胶GPC(凝胶渗透色谱)结果图；
图6为色素缺陷型威兰胶生产鞘氨醇单胞菌(重组鞘氨醇单胞菌)在37℃、自然pH条件下发酵过程曲线；
具体实施方式
实施例1色素缺陷型重组鞘氨醇单胞基因工程菌构建。
步骤一、S.sp.HT-1中类胡萝卜素合成途径关键酶基因鉴定
(1)简并引物设计
根据同源性较高的两株菌Sphingomonas sp.ATCC31555(生产威兰胶)和Sphingomonas elodea ATCC31461(生产结冷胶)的全基因组序列。在GenBank中搜索这两株菌的类胡萝卜素合成途径关键酶相关基因序列，通过Vector NTI 11.5.1软件设计简并引物(表1)。
表1 类胡萝卜素合成途径关键酶相关基因的PCR扩增简并引物
(2)关键酶基因克隆与鉴定
S.sp.HT-1基因组提取选用TaKaRa公司的基因组提取试剂盒，具体方法参见说明书。以S.sp.HT-1基因组为模板，利用简并引物扩增类胡萝卜素合成途径关键酶基因，PCR体系、条件参见表2。所得片段经纯化后送至金斯瑞生物科技有限公司测序。利用NCBI数据库对测序所得序列进行Blast，确定所得基因的功能。
表2 PCR反应体系
表3 PCR反应条件
步骤二、类胡萝卜素合成途径关键酶基因crtB敲除菌株构建
将八氢番茄红素合成酶crtB基因上/下游基因序列进行重叠PCR后构建至自杀型载体pJQ200SK上，转化至E.coli S17-1感受态细胞中。利用接合转移的手段，在辅助菌E.coli HB101(pRK2013)的作用下，将携带crtB上下游基因片段的自杀型质粒pJQ-△crtB转化至威兰胶生产菌S.sp.HT-1中。通过两次同源重组，获得crtB敲除菌株。
(1)crtB上下游基因片段扩增
根据上一步中S.sp.HT-1中crtB基因测序结果，利用Vector NTI 11.5.1软件设计引物扩增crtB上、下游基因序列，引物序列参见表4。PCR体系、条件参见表5。所得片段经纯化后送至金斯瑞生物科技有限公司测序。
表4 构建crtB敲除菌株所需引物
(2)重叠PCR
以纯化的crtB-L/crtB-R片段为模板，以crtB-L-F/crtB-R-R为引物，进行重叠PCR。重叠PCR产物经纯化后送至金斯瑞生物科技有限公司测序。
表5 重叠PCR体系
表6 重叠PCR条件
(3)crtB基因敲除载体构建
以自杀型载体pJQ200SK为出发质粒，利用BamH I/Xba I双切得到线性化载体。利用诺唯赞ClonExpress One Step Multis Cloning Kit连接重叠PCR纯化后片段和载体，具体方法参见试剂盒说明书。
(4)连接产物转化至大肠杆菌S17-1感受态细胞
将连接体系转化至大肠杆菌S17-1感受态细胞，涂布于含50μg/mL庆大霉素的LB固体培养基上。倒置于37℃培养箱中过夜培养。挑取克隆子进行验证，所得阳性菌株命名为E.coli S17-pJQ-△crtB。
(5)同源重组获得crtB基因敲除重组子
同源重组分两步进行。第一次同源重组通过庆大霉素和链霉素双抗筛选获得单交换的突变株，第二次同源重组质粒pJQ200SK中sacB基因做反向筛选，获得双交换菌株。在该转化系统中，pJQ200SK含有庆大霉素抗性基因，sacB反向筛选基因，oriT-RP4转移起点以及P15A-origin复制起点。该质粒可以在大肠杆菌宿主中复制，但不能在鞘氨醇单胞菌中复制。因此，pJQ200SK进入到鞘氨醇单胞菌中，只有整合在染色体上，才能正常复制，表现出庆大霉素抗性以及蔗糖致死特性。
第一次同源重组：利用接合转移的手段，在辅助菌E.coli HB101(pRK2013)的作用下，将携带crtB上下游基因片段的自杀型质粒pJQ-△crtB转化至威兰胶生产菌S.sp.HT-1中。挑取单交换克隆子扩大培养。
第二次同源重组：将单交换克隆子接种到含有5％(w/v)蔗糖的威兰胶种子培养基中过夜培养。将培养液稀释涂布到有5％(w/v)蔗糖的威兰胶固体培养基上，于30℃静置培养72h。挑取白色单菌落扩增crtB基因验证。将crtB敲除的菌株命名为S.sp.-△crtB。
实施例2色素缺陷且包囊结构解除型重组鞘氨醇单胞基因工程菌构建
构建方法同实施例1，不同的是受体菌株是实施例1中的S.sp.-△crtB，敲除基因为srtW基因，核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示，引物序列见表7、表8，将分选酶srtW基因上/下游基因序列进行重叠PCR后构建至自杀型载体pJQ200SK上，转化至E.coli S17-1感受态细胞中。利用接合转移的手段，在辅助菌E.coli HB101(pRK2013)的作用下，将携带srtW上下游基因片段的自杀型质粒pJQ-△srtW转化至威兰胶生产菌S.sp.-△crtB中。挑取单交换克隆子扩大培养。第二步将单交换克隆子接种到含有5％(w/v)蔗糖的威兰胶种子培养基中过夜培养。将培养液稀释涂布到有5％(w/v)蔗糖的威兰胶固体培养基上，于30℃静置培养72h。挑取单菌落扩增庆大霉素基因(Gm)以及srtW基因验证。将srtW敲除的菌株S.sp.-△crtB-△srtW命名为S.sp WG-1。
表7 分选酶基因的PCR扩增简并引物
表8 构建srtW敲除菌株所需引物
实施例3色素缺陷且降解酶基因敲除型重组鞘氨醇单胞基因工程菌构建。
构建方法同实施例1，不同的是受体菌株是实施例1中的S.sp.-△crtB，敲除基因为gelR基因，核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示，引物序列表见表9，得到S.sp.-△crtB-△gelR菌株命名为S.sp.WG-2。
表9 构建gelR敲除菌株所需引物
实施例4色素缺陷解除包囊结构且降解酶基因敲除型重组鞘氨醇单胞基因工程菌构建。
构建方法同实施例1，不同的是受体菌株是实施例2中的S.sp.WG-2，敲除基因为gelR基因，核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示，引物序列表见表9，得到S.sp.-△crtB-△srtW-△gelR菌株命名为S.sp.WG-3。
实施例5重组鞘氨醇单胞基因工程菌用于威兰胶发酵生产。
分别将重组鞘氨醇单胞菌(受体菌为Sphingomonas sp.CCTCC NO：M2012062)，S.sp.WG-1，S.sp.WG-2，S.sp.WG-3和对照组S.sp.-△crtB接种于鞘氨醇单胞菌平板/斜面培养基，30℃培养24h。接一环菌于装有135mL种子培养基的1000mL三角瓶中，转速200r/min，30℃培养16h。将培养好的种子液按体积百分比为3％的L发酵培养基的7.5L发酵罐中，于37℃、自然pH下培养66h。通过最适温度、自然pH条件下威兰胶合成能力考察发现，色素和分选酶基因敲除的重组鞘氨醇单胞菌S.sp.WG-1产小分子量(Mn：700-900kDa)威兰胶产量较对照组菌S.sp.-△crtB产量下降；而色素降解酶基因敲除的重组鞘氨醇单胞菌S.sp.WG-2较对照组菌S.sp.-△crtB威兰胶产量提升10％～25％，达到40.5±0.8g/L，分子量没有明显变化，Mn在10000-15000kDa；而色素分选酶降解酶基因同时敲除的重组鞘氨醇单胞菌S.sp.WG-3产小分子量威兰胶产量较S.sp.WG-1菌株产量提升20％～30％，达到22.5±0.20g/L。在相同培养条件下，出发菌Sphingomonas sp.CCTCC NO：M2012062培养72h产生高分子量(Mn：12000-15000kDa)威兰胶的产量为36.5g/L。提高实际工业发酵过程中的产胶量，并解决了后期分离乙醇用量大、成本高的问题，同时开发了低分子量威兰胶的生产方法，拓宽了微生物多糖在工业领域的应用。
Sphingomonas sp.WG-1/WG-2/WG-3菌落平板上形态没有明显变化，但颜色变为乳白色(附图2A)，解除包囊结构的S.sp.WG-1发酵液通过扫描电镜下观察，srtW基因敲除后，威兰胶的包裹结构明显减少(附图3)，呈现菌胶分离状(图4)，为下游分离奠定良好基础。
鞘氨醇单胞菌种子培养基：葡萄糖20g/L，酵母膏1g/L，蛋白胨3g/L，K2HPO4·3H2O2g/L，MgSO4 0.1g/L，pH 7.2～7.4。
鞘氨醇单胞菌发酵培养基配方如下：葡萄糖50g/L，酵母提取物8g/L，K2HPO4·3H2O3 g/L，MgSO4 0.4 g/L。
序列表
<110> 南京工业大学
<120> 无色素低分子量威兰胶生产菌株及其构建方法与应用
<160> 21
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 930
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
atgagccaac cgccgctgct tgaccacgcc acgcagacca tggccaacgg ctcgaaaagt 60
tttgccaccg ctgcgaagct gttcgacccg gccacccgcc gtagcgtgct gatgctctac 120
acctggtgcc gccactgcga tgacgtcatt gacgaccaga cccacggctt cgccagcgag 180
gccgcggcgg aggaggaggc cacccagcgc ctggcccggc tgcgcacgct gaccctggcg 240
gcgtttgaag gggccgagat gcaggatccg gccttcgctg cctttcagga ggtggcgctg 300
acccacggta ttacgccccg catggcgctc gatcacctcg acggctttgc gatggacgtg 360
gctcagaccc gctatgtcac ctttgaggat acgctgcgct actgctatca cgtggcgggc 420
gtggtgggtc tgatgatggc cagggtgatg ggcgtgcggg atgagcgggt gctggatcgc 480
gcctgcgatc tggggctggc cttccagctg acgaatatcg cccgggatat tattgacgat 540
gcggctattg accgctgcta tctgcccgcc gagtggctgc aggatgccgg gctgaccccg 600
gagaactatg ccgcgcggga gaatcgggcc gcgctggcgc gggtggcgga gcggcttatt 660
gatgccgcag agccgtacta catctcctcc caggccgggc tacacgatct gccgccgcgc 720
tgcgcctggg cgatcgccac cgcccgcagc gtctaccggg agatcggtat taaggtaaaa 780
gcggcgggag gcagcgcctg ggatcgccgc cagcacacca gcaaaggtga aaaaattgcc 840
atgctgatgg cggcaccggg gcaggttatt cgggcgaaga cgacgagggt gacgccgcgt 900
ccggccggtc tttggcagcg tcccgtttag 930
<210> 2
<211> 711
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
atgttcaacc ggcgtgacct tatgatcggc gcgggctgct tcgcggccgc cggcgcctcg 60
ctcgccctga agccgcgcaa gcggatggac ctgctgggca atgcaaagct cgattcgctg 120
ctgccgcatg cgttcggccc ctggcgcgcg gaagataccg gtgcgctgat cgcgccgccg 180
cgcgaaggca gcttggaaga caagctctat aaccagaccg tcagccgcgt gttctcgcgc 240
gaagacggcg cggtggtgat gatgctgatc gcctatggca acgcccagac cgatctgctg 300
cagctgcacc ggcccgaagt ctgctatccc tttttcggct tcaccgtcga acgcagcgaa 360
gcgcagacca ttcccgtcgc caacggcatt gcggtgccgg gccgagcgct taccgcgtcc 420
agcttcaacc gcaccgagca gatcctctac tggacgcgtg tcggcgatta tcttccgcag 480
gacggcaatc agcagctgat ggcgcggctg aagagccaga tggccgggtg gatcgtcgat 540
ggcgtgttgg tccgcatttc cagcatcacc gcggacgttg cagagggtac cgcgatcaac 600
ctcgatttcg cccgccagct gatcgccacc ctgccgggcg cggcgctgcc gccgctgctc 660
ggaaccagct tcgccaaggc gttcgaagcg cagcacccgc cccgtagctg a 711
<210> 3
<211> 2013
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
tttcgcagcc ttgatggcgg cgtccagttc gctctgattc ctcacgatga tgtccggcat 60
cgtggtgtgc acggtgatgg acgtataggt ccccgccgca agcttgatcg tctcgccccc 120
cgtcacattc accggcttgc tcgcatcgag cgaggtgatc gtgacgggcg tggtgaaggt 180
gttttgtgcg gccgtgacgt tcttcaccac caggttgctg ctgttgatga tctgcagggt 240
cacgacattg ctggagccga tgatccggtt cgcgtaatta tagtcctgtg ccggctggaa 300
cccccagccc atcgacttcg tcacatcgcc cgtacccccg ctcagggtca cgccgtcgat 360
ggcgaaatga tcgaccgagg aattcttgat cgtcaccccc ttgctttctc gcagcagaag 420
gtcgtggaag ttgttgccct gcagggtgac accgtcgacg gtgaggacgt tcatccccag 480
catgttgttg tcgatgacga cgttcgacgc ttcggcgaaa ttggtgtgat cgcggcgatt 540
gttcgtcatg aactggatgg cgtcgggatg ctcaccattc accggataga ggttggtgaa 600
gtccccctgc atcatcacgt tattggtgat cgtgatgttc gtgttgccct tggtcttgcc 660
gatgttttcg tagggaatgc tggattcatt gcccatgaat acgccctgga aggccaggcc 720
cagaacgaca ttgatgccgt gcgtgaaacc attctggtac acgagattgt ttttgatcgt 780
atcggcgatc gcatccatct tcgagatgat ggtattggag tccacggtga cgttcttgcc 840
aacctggtcc acgacattgt tggtgacctt gccgccggtc acgccgtcca ggcggatcca 900
gtccgttgca agcacggcgt tgttcgattg agtaatgccg ctcgacgttg cggtgatgac 960
gttcgccagt tgcgccttcg atccggccat gagatcgccg atcttgcgaa gagtgaccgc 1020
gacctgcgcg gcaaacgcgc tgcctgcagg cggctgatac ccgacaccac tgacgatcag 1080
ctgcagatcc agcagcaggt tggcgccggt cgaggtctgt gctgccgcct gctccttggc 1140
cgccttcgtg gtctcgtccg tgctccagcg cgtctggtcc acgattccgg tcgcagtgaa 1200
ctcgaagccg gtgccggtct tcacctggaa catgccgttg ctgatggcgg tgagatccag 1260
gtcgaagttg agcgtgaagg cgggcagcgc gaagagttga cgtgaattgt cccgcgtaag 1320
ccagctctgg ttgacgccca tgatctggcc gaccgcgccc gtcgcggtgg cacgcttcat 1380
ctgcccggcg gcattcttga cggtgaagac cagttcgccg tccgcccgga gcgagattcc 1440
cgcgatcttg tgggtggccg tgtcggtcat cttggcgccg ctcgtcgcga cggtatagct 1500
tcccttcacc acgccatcga catagatgat cgccttgccc ttcgcgctgt cataggtcag 1560
gctgccgatg tacagtccgg catattcgac cgcccgcgtg ctgccgacga tcgttcccga 1620
gagggcagcg tcgcgcatct cgatctcgcc cacgctgccg ctgaagacag cgttgaacgg 1680
ggtggtcggc tggctggcgg cggtcgccgc ggcattcagc gcaaggatct gggacgcact 1740
ggtgccgaga atggttacgg cgctggcggc caagctgctg gtgaggctgg gcttcacggt 1800
cgatcccccc agcgtcagcg tgccggtggt cgccgccggc agcgccgtcg acgtgaccgg 1860
ggccgcattc atggcgatcg cctgggcgag cgacacttgc gcgacggacg ccgtcgatgc 1920
ggtggcgaac aggctattcg ccacggacag gctgcccgtc gccgagacgg ccgcagtgcc 1980
tcagacgtga tagaagtcct gcaccaactt ctt 2013
<210> 4
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
ttcctgcagc ccgggggatc ccactatgcg cccaccgact t 41
<210> 5
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
gcgtccacag tcctgccgtg accgtcggcg atatcgt 37
<210> 6
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
acgatatcgc cgacggtcac ggcaggactg tggacgc 37
<210> 7
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
accgcggtgg cggccgctct agagctggtg agcggcgcta a 41
<210> 8
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
atgttacgca gcagcaac 18
<210> 9
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
cgaattgtta ggtggcgg 18
<210> 10
<211> 52
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
ttcctgcagc ccgggggatc ccaggatcct ggtaaaggcg caggaagagg cg 52
<210> 11
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
cttatgatcg gcgcgggccc gccccgtagc tgaacgaaaa a 41
<210> 12
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
gttcagctac ggggcgggcc cgcgccgatc ataaggtcac gccggttg 48
<210> 13
<211> 51
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
cgcggtggcg gccgctctag atggatggtc gaccgagtca cggcgccgct g 51
<210> 14
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
atgttacgca gcagcaac 18
<210> 15
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
cgaattgtta ggtggcgg 18
<210> 16
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
ttcctgcagc ccgggggatc ccttgcccca caggagatcc c 41
<210> 17
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
gatgaagcca cccacaagat cgcg 24
<210> 18
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
atcttgtggg tggcttcatc cccagggcga aa 32
<210> 19
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
cgcggtggcg gccgctctag agcgtcgaga gtgttgcccg 40
<210> 20
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
atgttacgca gcagcaac 18
<210> 21
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
cgaattgtta ggtggcgg 18
Claims (10)
1.无色素低分子量威兰胶生产菌株，其特征在于，所述菌株中八氢番茄红素合成酶基因crtB失活；
或者，八氢番茄红素合成酶基因crtB和分选酶基因srtW同时失活；
或者，八氢番茄红素合成酶基因crtB和降解酶基因gelR同时失活；
或者，八氢番茄红素合成酶基因crtB、分选酶基因srtW和降解酶基因gelR同时失活。
2.根据权利要求1所述的无色素低分子量威兰胶生产菌株，其特征在于，所述的鞘氨醇单胞菌基因工程菌的出发菌为Sphingomonas sp.HT-1。
3.根据权利要求1所述的无色素低分子量威兰胶生产菌株，其特征在于，所述八氢番茄红素合成酶基因crtB失活是指八氢番茄红素合成酶基因crtB被完全敲除，；
所述分选酶基因srtW失活是指分选酶基因srtW被完全敲除；
降解酶基因gelR失活是指降解酶基因gelR被完全敲除。
4.根据权利要求1所述的无色素低分子量威兰胶生产菌株，其特征在于，所述八氢番茄红素合成酶基因crtB的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；
所述选酶基因srtW的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；
所述降解酶基因gelR的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
5.权利要求1所述的无色素低分子量威兰胶生产菌株的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)分别构建八氢番茄红素合成酶基因crtB基因敲除片段、分选酶基因srtW基因敲除片段、降解酶基因gelR基因敲除片段，将上述三种基因敲除片段分别导入敲除质粒中，得到八氢番茄红素合成酶基因crtB基因敲除质粒、分选酶基因srtW基因敲除质粒、降解酶基因gelR基因敲除质粒；
(2)将八氢番茄红素合成酶基因crtB基因敲除质粒转化出发菌，经筛选得到八氢番茄红素合成酶基因crtB失活的基因工程菌；
将分选酶基因srtW基因敲除质粒转化出发菌，经筛选得到分选酶基因srtW失活的基因工程菌；
将降解酶基因gelR基因除质粒转化出发菌，经筛选得到降解酶基因gelR失活的基因工程菌。
6.根据权利要求5所述无色素低分子量威兰胶生产菌株的构建方法，其特征在于，步骤(1)中，所述八氢番茄红素合成酶基因crtB基因敲除片段的构建方法如下：
以Sphingomonas sp.HT-1基因组为模板，SEQ ID NO.14和SEQ ID NO.15、SEQ IDNO.16和SEQ ID NO.17为引物分别扩增八氢番茄红素合成酶基因crtB基因上游同源臂crtB-L和下游同源臂crtB-R；以上游同源臂crtB-L和下游同源臂crtB-R为模板、SEQ IDNO.14和SEQ ID NO.14为引物，通过重叠PCR扩增，得到八氢番茄红素合成酶基因crtB基因敲除片段；
分选酶基因srtW基因敲除片段的构建方法如下：
以Sphingomonas sp.HT-1基因组为模板，SEQ ID NO.22和SEQ ID NO.23、SEQ IDNO.24和SEQ ID NO.25为引物分别扩增分选酶基因srtW基因上游同源臂srtW-L和下游同源臂srtW-R，再以上游同源臂srtW-L和下游同源臂srtW–R为模板，SEQ ID NO.23和SEQ IDNO.25为引物，通过重叠PCR扩增，得到分选酶基因srtW基因敲除片段；
降解酶基因gelR基因敲除片段的构建方法如下：
以Sphingomonas sp.HT-1基因组为模板，SEQ ID NO.28和SEQ ID NO.29、SEQ IDNO.30和SEQ ID NO.31为引物分别扩增降解酶基因gelR基因上游同源臂gelR-L和下游同源臂gelR–R，以上游同源臂gelR-L和下游同源臂gelR–R为模板，SEQ ID NO.28和SEQ IDNO.31为引物，通过重叠PCR扩增，得到降解酶基因gelR基因敲除片段。
7.根据权利要求5所述无色素低分子量威兰胶生产菌株的构建方法，其特征在于，所述敲除质粒为pJQ200SK。
8.权利要求1～4任一所述无色素低分子量威兰胶生产菌株在制备威兰胶中的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，包括如下步骤：将鞘氨醇单胞菌基因工程菌接种于含碳源、氮源、无机盐和水的无菌发酵培养基中，在合适生长的条件下进行通风、搅拌培养，生成的威兰胶发酵液经提取得到威兰胶；所述的合适生长的条件是：初始pH为6.5～8.0、培养温度为35～42℃、培养时间为60～72小时。
10.权利要求1～4任一所述无色素低分子量威兰胶生产菌株制备得到的威兰胶。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201910323921.4A CN110144318B (zh) | 2019-04-22 | 2019-04-22 | 无色素低分子量威兰胶生产菌株及其构建方法与应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201910323921.4A CN110144318B (zh) | 2019-04-22 | 2019-04-22 | 无色素低分子量威兰胶生产菌株及其构建方法与应用 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN110144318A true CN110144318A (zh) | 2019-08-20 |
| CN110144318B CN110144318B (zh) | 2021-03-26 |
Family
ID=67593812
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201910323921.4A Active CN110144318B (zh) | 2019-04-22 | 2019-04-22 | 无色素低分子量威兰胶生产菌株及其构建方法与应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN110144318B (zh) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN111088273A (zh) * | 2019-12-24 | 2020-05-01 | 中国农业大学 | 一种获得超慢生根瘤菌同源单/双交换突变体的方法 |
| CN114214234A (zh) * | 2021-12-21 | 2022-03-22 | 江苏大学 | 一种低分子量结冷胶生产菌株及其筛选方法与应用 |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101501213A (zh) * | 2005-02-04 | 2009-08-05 | Cp凯尔科美国公司 | 多糖粘液形成菌的靶基因缺失 |
| CN101979587A (zh) * | 2010-10-14 | 2011-02-23 | 浙江大学 | 少动鞘氨醇单胞菌的八氢番茄红素脱氢酶基因及其应用 |
| CN102618468A (zh) * | 2012-03-28 | 2012-08-01 | 南京工业大学 | 一种耐温型产碱杆菌及其在威兰胶生产中的应用 |
| CN104845896A (zh) * | 2014-09-23 | 2015-08-19 | 中国石油大学(华东) | 生产威兰胶的菌株及方法 |
-
2019
- 2019-04-22 CN CN201910323921.4A patent/CN110144318B/zh active Active
Patent Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101501213A (zh) * | 2005-02-04 | 2009-08-05 | Cp凯尔科美国公司 | 多糖粘液形成菌的靶基因缺失 |
| US20110171721A1 (en) * | 2005-02-04 | 2011-07-14 | Cp Kelco U.S., Inc. | Targeted Gene Deletions for Polysaccharide Slime Formers |
| CN101979587A (zh) * | 2010-10-14 | 2011-02-23 | 浙江大学 | 少动鞘氨醇单胞菌的八氢番茄红素脱氢酶基因及其应用 |
| CN102618468A (zh) * | 2012-03-28 | 2012-08-01 | 南京工业大学 | 一种耐温型产碱杆菌及其在威兰胶生产中的应用 |
| CN104845896A (zh) * | 2014-09-23 | 2015-08-19 | 中国石油大学(华东) | 生产威兰胶的菌株及方法 |
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| NCBI: "GenBank: EU026118.1", 《NCBI GENBANK》 * |
| NCBI: "GenBank: M38423.1", 《NCBI GENBANK》 * |
| NCBI: "GenBank: U51197.1", 《NCBI GENBANK》 * |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN111088273A (zh) * | 2019-12-24 | 2020-05-01 | 中国农业大学 | 一种获得超慢生根瘤菌同源单/双交换突变体的方法 |
| CN114214234A (zh) * | 2021-12-21 | 2022-03-22 | 江苏大学 | 一种低分子量结冷胶生产菌株及其筛选方法与应用 |
| CN114214234B (zh) * | 2021-12-21 | 2023-09-26 | 江苏大学 | 一种低分子量结冷胶生产菌株及其筛选方法与应用 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN110144318B (zh) | 2021-03-26 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN106190921B (zh) | 一种谷氨酸棒状杆菌与应用 | |
| CN101215592B (zh) | 生产普鲁兰多糖的发酵方法 | |
| CN101948794A (zh) | 产植物类黄酮合成相关酶的工程乳酸菌及其构建和应用 | |
| CN105483153B (zh) | 酿酒酵母代谢工程改造提高s-腺苷-l-蛋氨酸生产水平的方法 | |
| CN110195023A (zh) | 一种酿酒酵母菌株及其应用 | |
| CN112280795A (zh) | 糖基转移酶基因的用途 | |
| CN110144318A (zh) | 无色素低分子量威兰胶生产菌株及其构建方法与应用 | |
| CN102146414B (zh) | 玫瑰孢链霉菌基因工程菌的构建方法及其应用 | |
| CN101235393B (zh) | 促进灵芝酸和灵芝多糖生物合成的发酵方法 | |
| CN112625988A (zh) | 一种大肠杆菌发酵培养基及发酵培养方法和应用 | |
| CN108456652A (zh) | 一种鞘氨醇单胞菌基因工程菌及其构建方法与应用 | |
| CN106635940A (zh) | 一株高产氨基葡萄糖枯草芽孢杆菌的构建方法与应用 | |
| CN109486688A (zh) | 一种里氏木霉基因工程菌及其制备方法和应用 | |
| CN113073074A (zh) | 一种高效合成核黄素的基因工程菌及其应用 | |
| CN114015612B (zh) | 一株无色素黄单胞菌及其在发酵生产无色素黄原胶中的应用 | |
| CN105483190B (zh) | 酿酒酵母基因工程改造提高s-腺苷-l-蛋氨酸产量的方法 | |
| CN106754486A (zh) | 一株高产海藻糖合酶的假单胞菌及其发酵产酶方法 | |
| CN112725372B (zh) | 提高威兰胶表达的多酶复合体载体及高产威兰胶的重组菌 | |
| CN106701649A (zh) | 生产l‑谷氨酰胺的菌株和生产l‑谷氨酰胺的方法 | |
| CN109055417A (zh) | 一种重组微生物、其制备方法及其在生产辅酶q10中的应用 | |
| CN108330113B (zh) | 一株高底物专一性酰基转移酶的珍贵束丝放线菌及其应用 | |
| CN106010999A (zh) | 基因工程菌株、培养方法及该基因工程菌株的用途 | |
| CN105463007B (zh) | 基于离子束介导技术构建重组大肠杆菌生产辅酶i的方法 | |
| CN117070367B (zh) | 出芽短梗霉ncps2022-m及培养方法 | |
| CN103361390B (zh) | 一种发酵生产吡咯喹啉醌过程中消除副产物多糖的方法及其应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| CB02 | Change of applicant information |
Address after: No.5, Xinfan Road, Gulou District, Nanjing, Jiangsu Province, 210000 Applicant after: NANJING TECH University Address before: Nanjing University of technology, No.30 Puzhu South Road, Pukou District, Nanjing, Jiangsu Province Applicant before: NANJING TECH University |
|
| CB02 | Change of applicant information | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |