CN103149165A - 橙色大白菜类胡萝卜素提取与测定方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种橙色大白菜类胡萝卜素提取与测定方法，以乙醇和丙酮以体积比1：1配制提取溶剂，在料液比（g/mL）为1：20，温度60℃条件下，浸提50min，提取效果最好；利用分光光度法进行类胡萝卜素总量测定；利用RP-HPLC法进行类胡萝卜素组分测定，建立了大白菜类胡萝卜素的RP-HPLC测定法，测定过程选择的流动相由甲醇和乙腈组成，流速1.00mL/min，柱温30℃，检测波长440nm，进样量10μL；以叶黄素、番茄红素、β-胡萝卜素为标样，建立了RP-HPLC法测定叶黄素、番茄红素、β-胡萝卜素的线性方程。

Description

橙色大白菜类胡萝卜素提取与测定方法

技术领域

本发明涉及类胡萝卜素的提取方法，特别是一种橙色大白菜类胡萝卜素提取与测定方法。

背景技术

大白菜[Brassica campestris ssp．pekinensis（Lour.）Olsson]是中国最主要的蔬菜，产量和面积均居各类蔬菜之首，普通大白菜富含Vc、矿质元素钾、钙、镁、锌等。橙色大白菜中除了具有普通大白菜的营养成分外，还含有多酚、类胡萝卜素等抗氧化物质^[1]。类胡萝卜素是构成植物叶、花和果实颜色的重要成分之一^[2]，只能由植物或微生物合成，是人体必需的营养成分。在植物中，类胡萝卜素可以协助吸收光能，防止光氧化产生的破坏作用；在动物体内，类胡萝卜素具有清除自由基、延缓衰老、保护眼睛、预防肿瘤、血栓等功能^[3-6]。因此，类胡萝卜素的种类和含量是评估水果和蔬菜品质的重要参数。研究类胡萝卜素种类与含量，对了解大白菜种质资源保健价值、改善营养品质，保障人民健康具有重要意义。

类胡萝卜素的提取方法主要有超临界CO₂萃取方法^[7]、超声波法^[8]、酶法^[9]、微波法^[10-11]和有机溶剂提取方法，但没有任何一种方法是适合所有材料的。根据申请人所作的资料检索，尚未见有关大白菜中类胡萝卜素的最佳提取工艺报道^[12]。

以下是申请人检索的相关参考文献：

[1]Mitsuru W，Keiichi M，Jun A.Carotenoid pigment composition，polyphenol content，and antioxidant activities of extracts from orange-coloredChinese cabbage[J].LWT-Food Science and Technology，2011，44（5）：1971-1975。

[2]陈鹏飞，刘栓桃，张志刚等，大白菜的类胡萝卜素种类鉴定[J].中国农学通报，2011，27(19):137-143。

[3]李娟，橙色大白菜类胡萝卜素和黄酮提取测定方法及其积累规律的研究[D].陕西·杨凌：西北农林科技大学，2007。

[4]尹晴红，谢一芝，陈明等，银杏废叶中类胡萝卜素的提取[J].金陵科技学院学报，2005，21（3）：69-72。

[5]刘云，王保健，林亲雄等，油菜籽中天然类胡萝卜素的提取工艺研究[J].食品工业科技，2009，30（2）：234-236。

[6]张金云，武红霞，邢姗姗等，杧果类胡萝卜素提取条件研究[J].中国南方果树，2010，39（4）：14-19。

[7]郝磊，张坤生，超临界CO₂萃取玉米蛋白粉中类胡萝卜素的研究[J].食品研究与开发，2007，28（2）：57-60。

[8]熊犍，冯凌凌，叶君，超声辐射对玉米类胡萝卜素提取的影响[J].华南理工大学学报:自然科学版，2006，34(3):82-85。

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[10]陶能国，张继红，张妙玲等，微波法提取枸杞中类胡萝卜素的工艺研究[J].湘潭大学自然科学学报，2008，30(2):48-51。

[11]Tong Y，Gao，L J，Xiao，G M，et al.Microwave pretreatment-assistedethanol extraction of chlorophylls from spirulina platensis[J].Journal of FoodProcess Engineering，2012，35（5）：792-799。

[12]姬小明，邵惠芳，刘金霞等，类胡萝卜素的提取及分离方法研究进展[J].河南科学，2008，26（11）：1337-1339。

[13]朱广廉，钟诲文，张爱琴，植物生理学实验[M].北京：北京大学出版社，1990：51-54。

[14]李雪雁，陈海强，丁婷婷等，韭菜中提取类胡萝卜素[J].食品研究与开发，2009，30（10）：86-88。

[15]韦进宝，从黄姜中提取类胡萝卜素[J].技术与市场，2009，16（1）。

[16]Kumar M，Moon U R，Mitra A.Rapid separation of carotenes andevaluation of their in vitro antioxidant properties from ripened fruit waste ofAreca catechu–A plantation crop of agro-industrial importance[J].IndustrialCrops and Products，40（2012）：204–209。

发明内容

本发明的目的在于，提供一种橙色大白菜类胡萝卜素提取与测定方法，该方法以橙色大白菜球叶为材料，探讨有机溶剂提取法的最佳条件，以期得到有机溶剂提取大白菜的最佳工艺条件，为测定橙色大白菜中类胡萝卜素含量及其主要成分提供重要的科学依据。

为了实现上述任务，本发明采取如下的技术解决方案：

一种橙色大白菜类胡萝卜素提取与测定方法，其特征在于，具体包括下列步骤：

1）以乙醇和丙酮以体积比1：1配制提取溶剂，在料液比（g/mL）为1：20，温度60℃条件下，浸提50min，得到橙色大白菜类胡萝卜素提取液；

2）测定橙色大白菜提取液中类胡萝卜素，以叶黄素、番茄红素、β-胡萝卜素为标样，利用分光光度法进行类胡萝卜素总量测定；

3）测定橙色大白菜提取液中类胡萝卜素组分，以叶黄素、番茄红素、β-胡萝卜素为标样，建立叶黄素、番茄红素、β-胡萝卜素测定的线性方程，采用RP-HPLC法进行类胡萝卜素主要组分测定；

其中：叶黄素的线性方程为：Y=5500x+6661.8，线性范围（g/mL）=0.05～100，相关系数为0.9994；

番茄红素的线性方程为：Y=55919x-16632，线性范围（g/mL）=0.05～100，相关系数为0.9997；

β-胡萝卜素的线性方程为：Y=168727x-64974，线性范围（g/mL）=0.05～100，相关系数为0.9991；

RP-HPLC法测定过程所选择的流动相由甲醇和乙腈组成，即甲醇：乙腈＝55：45，流速1.00mL/min，柱温30℃，检测波长440nm，进样量10μL。

本发明的橙色大白菜类胡萝卜素提取与测定方法，通过单因素试验和L₁₂（4³）正交试验筛选出有机溶剂的最佳提取条件，利用分光光度法对类胡萝卜素的总量进行测定，利用RP-HPLC（reverse phase high-performanceliquid chromatography）法进行类胡萝卜素主要成分的测定。

结果表明，橙色叶球大白菜类胡萝卜素提取的最佳工艺是以乙醇和丙酮组成的提取溶剂，在料液比（g/mL）为1：20，温度60℃条件下，浸提50min。在此条件下，金冠1号大白菜叶球中类胡萝卜素得率最高，为3.304mg/100g·FW。

以叶黄素、番茄红素、β-胡萝卜素为标样，利用分光光度法和RP-HPLC法进行类胡萝卜素测定，两种方法测定橙色大白菜类胡萝卜素含量的相关系数达到0.973。

建立了大白菜类胡萝卜素的RP-HPLC测定法，其流动相为甲醇：乙腈＝55：45，流速1.00mL/min，柱温30℃，检测波长440nm，进样量10μL。建立了RP-HPLC法测定叶黄素、番茄红素、β-胡萝卜素3种色素的线性方程。得到的橙色大白菜类胡萝卜素平均总含量为3.285mg/100g·FW，是普通大白菜中的类胡萝卜素含量的2.467倍,橙色大白菜类胡萝卜素的主要成分是叶黄素、番茄红素和β-胡萝卜素。

附图说明

图1是不同提取温度对金冠1号球叶类胡萝卜素得率的影响图；

图2是不同有机溶剂对金冠1号类胡萝卜素得率的影响图；图中的数字表示的溶剂是：1、乙醇，2、丙酮，3、异丙醇，4、四氢呋喃，5、乙醇和丙酮混合溶剂（乙醇：丙酮=1：1），6、乙醇和丙酮混合溶剂（乙醇：丙酮=1:2）；7：乙醇和丙酮混合溶剂（乙醇：丙酮=2:1），8、四氢呋喃和丙酮混合溶剂（四氢呋喃：丙酮=1:1）。

图3是提取时间对金冠1号类胡萝卜素得率的影响图；

图4是萃取次数对金冠1号类胡萝卜素得率的影响图；

图5是类胡萝卜素混标色谱图；图中的数字1、2、3的峰分别代表叶黄素、番茄红素、β-胡萝卜素；

图6是普通大白菜秦白2号球叶的色谱图

图7是橙色大白菜金冠2号功能外叶的色谱图；

图8是橙色大白菜金冠2号球叶的色谱图。

以下结合附图和实施例对本发明作进一步的详细说明。

具体实施方式

需要说明的是，在以下的实施例中，与本申请相关的文献会被引用。

1、材料

种子材料选用橙色大白菜金冠1号（张鲁刚，惠麦侠，张明科.彩色大白菜新品种“金冠1号”的选育[J].北方园艺，2005，04：67-68+97）、金冠2号（张鲁刚，惠麦侠，张明科.彩色大白菜新品种“金冠2号”的选育[J].西北农业学报，2007，01：204-206）、11J11（原名01S915,为金冠2号大白菜的亲本，公开于《西北农业学报》2007，01期、205页，张鲁刚，惠麦侠，张明科.彩色大白菜新品种“金冠2号”的选育[J]：204-206）；普通大白菜秦白2号（柯桂兰，赵利民.秦白2号大白菜的选育[J].陕西农业科学，1990，04：3-4）、秋早60（张鲁刚，惠麦侠，张明科.“秋早55”和“秋早60”大白菜特征特性与栽培技术[J].西北园艺（蔬菜），2012，02：50-51+66）、11J15（原名92S24，，公开于《中国蔬菜》，2010，14期、35页第16行，牛娜，郑晨光，张鲁刚，胥宇建，张立志，付文婷.大白菜裂球性状的遗传与RAPD标记[J].44-48）、12S1320（为黄芽菜选系，韦顺恋，宋敏霞.浙江黄芽菜的收集和鉴定[J].中国蔬菜，1994，01：29-32），是本领域公知的品种，均由西北农林科技大学园艺学院白菜研究室提供。

仪器选用本领域常规的仪器，包括分光光度计SHIMADZU UV-1700，数控超声波清洗器KQ-500DE，高压液相色谱仪岛津2010AH，旋转蒸发器RE-52AA，SHZ-Ⅲ型循环水真空泵。

试剂为色谱级叶黄素标准品、色谱级番茄红素标准品、色谱级β胡萝卜素标准品、色谱级甲醇、色谱级乙腈、超纯水；分析纯无水乙醇、甲醇、丙酮、碳酸钙、BHT（2，6-二叔丁基对甲苯酚）。

2、方法

2.1材料种植

2011年7月20日将金冠1号、金冠2号、11J11、秦白2号、秋早60、11J15、12S1320种子在西北农林科技大学杨凌蔬菜试验站育苗，常规管理，于2011年8月10日定值。试验地前茬一致，地势平坦，土壤质地、墒情和肥力均等。栽培后按照常规的田间栽培措施进行管理。

2.2试验设计

以金冠1号为试材进行类胡萝卜素提取方法试验，大白菜进入结球期采样，取叶球由外数第6-8片叶及球心部分于-80℃保存。采用单因素试验和L₁₂（4³）正交试验设计。

单因素为：提取温度、料液比、提取时间、有机溶剂体积比和提取次数。

正交试验4个因素及其水平是：提取温度（A），15℃、30℃、60℃；提取时间（B），30min、50min、70min；有机溶剂乙醇：丙酮体积比（C），1：1、1：2、2：1；料液比（D），1：10、1：15、1：20。测定时，取-80℃下保存的新鲜样品2g，放于研钵中，加入适量石英砂、CaCO₃、适量浓度为0.1%的BHT（2，6-二叔丁基对甲苯酚）溶液，再加入适量有机溶剂进行研磨，提取类胡萝卜素，测定总含量。

2.3分光光度法测定类胡萝卜素含量

按照朱广廉的方法^[13]，在440nm、645nm、663nm三个波段下测出样品的吸光值，按照公式C_K=4.7A₄₄₀-5.454A₆₄₅-2.1654A₆₆₃求得白菜样品中的类胡萝卜素总得率。

2.4RP-HPLC法测定类胡萝卜素含量

色谱条件：Nova-pak C₁₈柱（4.6mm×15cm）；流动相：由甲醇和乙腈组成，即甲醇：乙腈＝55：45；流速：1.00mL/min；柱温：30℃；检测波长：440nm；进样量：10μL。

标准曲线制作：分别精确配制1μg/mL的叶黄素溶液、1μg/mL的番茄红素溶液和1μg/mL的β-胡萝卜素溶液，超滤后上机。进样量分别为4μL、8μL、10μL、12μL、16μL、20μL，经数据系统自动处理，折算为相同体积的不同样液质量浓度，并以样液浓度为X轴，峰面积为Y轴分别制作出叶黄素、番茄红素、β-胡萝卜素标准曲线（计算回归方程）。

样品测定：制备好的样液10μL注入高效液相色谱，在前述测定条件下记录叶黄素、番茄红素、β-胡萝卜素的峰面积，依保留时间分别通过标准曲线查得样液中的各组分质量浓度，用外标法计算各组分含量。

2.5数据处理

试验数据采用EXCEL和DPS软件处理分析。

3结果与分析

3.1有机溶剂提取法的单因素优化

3.1.1提取温度

由图1可知，橙色大白菜金冠1号球叶样品，用乙醇：丙酮=1:1作提取剂，在料液比1：15，提取时间30min的条件下，类胡萝卜素得率在15℃-60℃之间呈现缓慢的直线上升，在60℃时达到最大，60℃-70℃缓慢下降，70℃-90℃呈直线下降。

3.1.2有机溶剂的确定

称取金冠1号（整株白菜橙色叶球去除主叶脉，将叶片切碎混匀），各2g，料液比为1：15，提取温度15℃，提取时间60min，分别用丙酮、四氢呋喃、异丙醇、甲醇、乙醇、乙醇：丙酮（1：1）、乙醇：丙酮（1：2）、乙醇：丙酮（2：1）、四氢呋喃：丙酮（1：1）、正己烷：丙酮：乙醇（2：1：1）、石油醚、三氯甲烷、正己烷等13种提取液提取，结果发现用石油醚、三氯甲烷、正己烷提取时，提取物贴在研钵壁上，说明类胡萝卜素不溶于这类有机溶剂，不易被提取。用正己烷、丙酮和乙醇混合溶剂（正己烷：丙酮：乙醇=2：1：1）提取时，溶液分成上下两层，大部分类胡萝素溶于上层溶液，但仍有小部分溶解在下层溶液中，萃取不完全。由图2可知，有机溶剂5（乙醇：丙酮=1：1）的提取效果最好。

3.1.3料液比

取金冠1号叶球部分鲜样，按料液比（g/mL）分别为1：10、1：15、1：20、1：25、1：30，向锥形瓶中加入乙醇和丙酮的混合溶剂（乙醇：丙酮=1：1）在15℃下避光浸提1h。结果表明，料液比（g/mL）从1：10到1：20时，类胡萝卜素得率由1.476mg/100g·FW上升到2.473mg/100g·FW，料液比大于1：20后，类胡萝卜素得率趋于平缓，分别为2.356mg/100g·FW、2.322mg/100g·FW。后三组料液比处理间差异不显著，从节省有机溶剂考虑，选择料液比（g/mL）1：20为宜。

3.1.4提取时间

用30mL乙醇：丙酮（1：1）在60℃下分别提取30min、50min、60min、70min、80min、90min。结果表明，随着提取时间增加，类胡萝卜素的得率逐渐增加，提取70min时得率最高，因此提取时间以70min最好（图3）。

3.1.5提取次数

用30mL的乙醇和丙酮混合溶剂（乙醇：丙酮=1：1）在60℃下，每次提取时间1h，每次加入提取溶剂30mL，紫外分光光度计下测金冠1号叶片提取液中叶黄素、番茄红素、胡萝卜素的吸光值如图4所示。

由图4可知，第一次萃取，叶黄素在λ＝443nm下，紫外分光光度计测得的吸光值是0.500；第二次萃取后，吸光值为0.048；第三次萃取后，吸光值为0.010，可见萃取两次即可把98.21%的叶黄素提取出来。随着萃取次数的增多，提取液由最初的黄色渐渐过渡到无色透明状。

3.2有机溶剂提取影响因素的正交优化

从以上单因素试验可以看出，白菜类胡萝卜素提取得率受到提取时间、有机溶剂、提取温度、料液比这4个因素的影响较大，为了全面考察这4个因素的作用大小和优化组合，设计了如表1所示的4因素3水平的正交试验。

表1：正交试验级差及显著性分析

由表中的正交试验极差R值可以看出，各因素变化对橙色大白菜金冠1号类胡萝卜素提取率的影响程度依次为A＞C＞B＞D，即提取温度A的变化对类胡萝卜素得率的影响最大，其中K₃值最大，表明水平A₃效果较好；影响最小的因子是D料液比，其K₃值最大，表明水平D₃效果较好；B提取时间影响因素中K₁值最大，表明水平B₁效果较好；C乙醇与丙酮体积比影响因素中K₁值最大，表明水平C₁效果较好，这与单因素分析结果基本相符。从各因素级差分析结果看最优组合为A₃B₁C₁D₃，从实际测定值差异显著性分析可知，最优组合为A₃B₂C₁D₃，说明因素之间有互作发生。本试验采取提取时间较长的组合A₃B₂C₁D₃，即最佳提取工艺为组合2，提取温度为60℃，每次提取50min，提取溶剂为乙醇和丙酮的混合溶剂（乙醇：丙酮=1：1），料液比（g/mL）为1：20。

3.3用紫外分光光度计测定橙色白菜叶球中类胡萝卜素的总含量

分别将普通大白菜秦白2号、秋早60、11J15与橙色大白菜金冠1号、金冠2号、11J11叶球部分切碎混匀，各取2g鲜样，按照3.2中建立的有机溶剂最佳提取工艺进行提取。通过紫外分光光度计，先测得类胡萝卜素提取液在440nm、645nm、663nm的吸光值，再根据公式^[13]算出总的类胡萝卜素的浓度，最后再算出绝对含量。

结果表明（表3），橙色白菜叶球中类胡萝卜素的绝对含量是普通白菜中的类胡萝卜素含量的2.467倍。

3.4RP-HPLC法对类胡萝卜素成分及含量的测定结果

3.4.1RP-HPLC法对普通大白菜与橙色大白菜中类胡萝卜素主要成分的分析

选用甲醇：乙腈＝55：45为流动相，流速1.00mL/min，柱温30℃，检测波长440nm，进样量10μL。分别得到标准品、普通大白菜“秦白2号”、“秋早60”、“11J15”、“12S1320”和橙色大白菜“金冠1号”、“11J11”、“金冠2号”的色谱图。结果发现普通大白菜色谱图中的特征峰都一样，橙色大白菜色谱图中的特征峰也相同。

图5是叶黄素、番茄红素、β-胡萝卜素标准品的色谱图，叶黄素的出峰时间为4.7min，番茄红素的出峰时间为29.36min，β-胡萝卜素的出峰时间为49min左右，由于机子稳定性的缘故，每次标品的出峰时间会有一点差别。图6是普通大白菜“秦白2号”的球叶的色谱图，与混标的色谱图相比，秦白2号球叶中含有叶黄素（1）和β-胡萝卜素（3）及4种未知成分（4、5、6、7），没有番茄红素；图7是橙色白菜“金冠2号”功能外叶中类胡萝卜素的色谱图，与普通大白菜“秦白2号”球叶的色谱图相似，它只含叶黄素和β-胡萝卜素及4种未知成分，没有番茄红素。图8是橙色白菜橙色球叶部分中类胡萝卜素的色谱图，与普通大白菜“秦白2号”的球叶的色谱图相比，除了具有普通大白菜“秦白2号”的球叶的所有类胡萝卜素成分外，橙色白菜中还存在番茄红素的各种同分异构体，并且β-胡萝卜素的峰明显增高，考虑到“金冠2号”功能外叶中没有番茄红素，说明番茄红素积累需要无光条件。

3.4.2RP-HPLC法对类胡萝卜素主要成分含量的测定

标准曲线的线性方程：在最佳色谱实验条件下，即用甲醇：乙腈＝55：45为流动相，流速1.00mL/min，柱温30℃，检测波长440nm，建立了本方法测定叶黄素、番茄红素、β-胡萝卜素3种色素的线性方程，计算了线性范围和相关系数，见表2。

在最佳色谱条件下对橙色大白菜金冠1号、金冠2号、11J11与普通大白菜秦白2号、11J15、秋早60中的叶黄素、番茄红素、β-胡萝卜素含量进行了测定，结果见表3。

表2：叶黄素、番茄红素、β-胡萝卜素标准曲线

类胡萝卜素	线性方程	线性范围(μg/mL）	相关系数
				叶黄素	Y=5500x+6661.8	0.05～100	0.9994
番茄红素	Y=55919x-16632	0.05～100	0.9997
				β-胡萝卜素	Y=168727x-64974	0.05～100	0.9991

表3：6种大白菜中的叶黄素、番茄红素、β-胡萝卜素含量测定

注：*紫外分光光度计测定的橙色白菜叶球中类胡萝卜素的总含量；

**RP-HPLC与分光光度计法测定的类胡萝卜素含量比值。

由表3可知，橙色白菜叶球中含有叶黄素、番茄红素和β-胡萝卜素，普通白菜中含有叶黄素、β-胡萝卜素，不含番茄红素；橙色白菜叶球中叶黄素含量低于普通大白菜、β-胡萝卜素含量高于普通大白菜；普通白菜中的类胡萝卜素以叶黄素为主，平均占84.0%，橙色白菜叶球类胡萝卜素中的叶黄素平均为15.7%，番茄红素、β-胡萝卜素平均为75.3%和9%。不同橙色大白菜中叶黄素、番茄红素和β-胡萝卜素的含量不同，但三种胡萝卜素含量的趋势一致；不同普通大白菜中叶黄素和β-胡萝卜素的含量也不同，其中β-胡萝卜素的含量相差接近2倍。

比较RP-HPLC法和紫外分光光度计测定的类胡萝卜素值，结果RP-HPLC法测定的叶黄素、番茄红素和β-胡萝卜素三种主要类胡萝卜素总量是紫外分光光度计测定总值的63.2-33.6%，但橙色大白菜中两种结果的相关系数达到0.973，说明RP-HPLC法和紫外分光光度测定的橙色大白菜类胡萝卜素含量具有很高的一致性。

3.4.3 RP-HPLC方法精密度、准确度的测定

取橙色大白菜叶球，将其切碎混匀，取2g已测知类胡萝卜素含量的球叶样品，加入1mL5μg/mL的叶黄素标准品，按上述最佳方法提取并测定，记录色谱峰面积，计算回收率。平均回收率为1.08％，RSD值1.32％。

将同一样品提取液在相同的色谱条件下连续测定5次，计算该测定方法的精密度，其结果的相对标准偏差RSD为1.28％。

将同一样品提取液在相同色谱条件下分别在0、1、2、3、4、5、6h各测定1次，计算该测定方法的稳定性，其结果的相对标准偏差RSD为1.54％。

Claims (1)

1.一种橙色大白菜类胡萝卜素提取与测定方法，其特征在于，具体包括下列步骤：

1）以乙醇和丙酮以体积比1：1配制提取溶剂，在料液比（g/mL）为1：20，温度60℃条件下，浸提50min，得到橙色大白菜类胡萝卜素提取液；

2）测定橙色大白菜提取液中类胡萝卜素，以叶黄素、番茄红素、β-胡萝卜素为标样，利用分光光度法进行类胡萝卜素总量测定；

3）测定橙色大白菜提取液中类胡萝卜素组分，以叶黄素、番茄红素、β-胡萝卜素为标样，建立叶黄素、番茄红素、β-胡萝卜素测定的线性方程，采用RP-HPLC法进行类胡萝卜素主要组分测定；

其中：叶黄素的线性方程为：Y=5500x+6661.8，线性范围（g/mL）=0.05～100，相关系数为0.9994；

番茄红素的线性方程为：Y=55919x-16632，线性范围（g/mL）=0.05～100，相关系数为0.9997；

β-胡萝卜素的线性方程为：Y=168727x-64974，线性范围（g/mL）=0.05～100，相关系数为0.9991；

RP-HPLC法测定过程所选择的流动相由甲醇和乙腈组成，即甲醇：乙腈＝55：45，流速1.00mL/min，柱温30℃，检测波长440nm，进样量10μL。

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