JPS58152479A - 膜結合型アルコ−ル脱水素酵素の製造法 - Google Patents
膜結合型アルコ−ル脱水素酵素の製造法Info
- Publication number
- JPS58152479A JPS58152479A JP57035184A JP3518482A JPS58152479A JP S58152479 A JPS58152479 A JP S58152479A JP 57035184 A JP57035184 A JP 57035184A JP 3518482 A JP3518482 A JP 3518482A JP S58152479 A JPS58152479 A JP S58152479A
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- JP
- Japan
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- acetic acid
- membrane
- acid bacteria
- bound
- ethanol
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は膜結合型アルコール脱水素酵素(以下、ADH
と略称する。)の製造法に関する。さらに詳しくは酢酸
11に属する細■を好気的に培養して膜結合蓋ムDHを
製造するKあたり、該細菌の培地にエタノールを添加す
ることによって高収率で膜結合型ADHを製造する方法
に関する。
と略称する。)の製造法に関する。さらに詳しくは酢酸
11に属する細■を好気的に培養して膜結合蓋ムDHを
製造するKあたり、該細菌の培地にエタノールを添加す
ることによって高収率で膜結合型ADHを製造する方法
に関する。
酢酸■は古くから食酢製造に用いられ、強力な酢酸生成
能を有することから多くの研究の対象となってきた。そ
して最近、酢酸菌は肝臓、酵母。
能を有することから多くの研究の対象となってきた。そ
して最近、酢酸菌は肝臓、酵母。
+ +細菌などに
存在するNAD もしくはNADP 要求性のADH
やアルデヒド説水素1I11紮(以下、ムLDHと略称
する。)あるいはメタノール資化amのADHと比較し
て分子量、補酵素要求性、最適pH,基質に対するh値
などから見て明らかに異なった新しいタイプの層結合!
JADH,ALDHをもつことが示“された(アグリカ
ルチエラル・アンド・バイオロジカル・ケミストリー、
42巻 llK2O45〜2056頁、1978年;同
誌42巻。
存在するNAD もしくはNADP 要求性のADH
やアルデヒド説水素1I11紮(以下、ムLDHと略称
する。)あるいはメタノール資化amのADHと比較し
て分子量、補酵素要求性、最適pH,基質に対するh値
などから見て明らかに異なった新しいタイプの層結合!
JADH,ALDHをもつことが示“された(アグリカ
ルチエラル・アンド・バイオロジカル・ケミストリー、
42巻 llK2O45〜2056頁、1978年;同
誌42巻。
第2331〜2340頁、1978年11誌44巻、J
IE503〜515頁、1980年;fj1誌45巻、
第1889〜1890頁、1981年;特開昭54−1
29189号;4111昭56−5092号)。さらに
(1)反応が酸化方向に不可逆的に進むこと、t2Jエ
タノールの酸化反応の生成物であるアセトアルデヒドや
酢11によって反応が阻害を受けにくいこと、体)酸性
域で強い活性を示すことから各種食品中や血液中のエタ
ノールやアセトアルデヒドの定量には従来使用されてき
た酵母起源のADH,ALDHより非常に適しているこ
とが明らかにされ、定量用酵素としての応用などその用
途が期待されている(アグリカルチユラル・アンド・バ
イオロジカル・ケミストリー、42巻、第2063〜2
069頁、1978キ;同誌44巻、第503〜515
頁、1980年)。
IE503〜515頁、1980年;fj1誌45巻、
第1889〜1890頁、1981年;特開昭54−1
29189号;4111昭56−5092号)。さらに
(1)反応が酸化方向に不可逆的に進むこと、t2Jエ
タノールの酸化反応の生成物であるアセトアルデヒドや
酢11によって反応が阻害を受けにくいこと、体)酸性
域で強い活性を示すことから各種食品中や血液中のエタ
ノールやアセトアルデヒドの定量には従来使用されてき
た酵母起源のADH,ALDHより非常に適しているこ
とが明らかにされ、定量用酵素としての応用などその用
途が期待されている(アグリカルチユラル・アンド・バ
イオロジカル・ケミストリー、42巻、第2063〜2
069頁、1978キ;同誌44巻、第503〜515
頁、1980年)。
ところが膜結含橿ムDH,ALDHを採取する方法は、
これらの酵素が繭体内酵素であるため菌体を破砕して得
た膜画分から抽出する方法に頼らざるを得ない。例えば
アグリカルチユラル・アンド・バイオロジカル・ケミス
トリー、42巻、第2063〜2069夏、1978年
では、膜結合gADl−1をトリトンX−100のよう
な界面活性剤による可溶化、DRAB−セファデックス
カラムクロ!トゲラフイー、ヒドロキシアパタイトカラ
ムクロマトグラフィーなと煩雑な工程をへて精製が行な
われている。これらのことから目的とする膜結合型AD
H,ALDHの単位酵素あたりの製造費が高く、工業的
展開に著しい支障となっている。
これらの酵素が繭体内酵素であるため菌体を破砕して得
た膜画分から抽出する方法に頼らざるを得ない。例えば
アグリカルチユラル・アンド・バイオロジカル・ケミス
トリー、42巻、第2063〜2069夏、1978年
では、膜結合gADl−1をトリトンX−100のよう
な界面活性剤による可溶化、DRAB−セファデックス
カラムクロ!トゲラフイー、ヒドロキシアパタイトカラ
ムクロマトグラフィーなと煩雑な工程をへて精製が行な
われている。これらのことから目的とする膜結合型AD
H,ALDHの単位酵素あたりの製造費が高く、工業的
展開に著しい支障となっている。
さらに酢酸菌による膜結合型ADH,ALDH製造上の
大きな問題として酢W/IIは生育が乏しく、一般細菌
に比べて発酵液量当りの菌体量が少ないため酵素の生産
性が著しく低いことが指摘される。
大きな問題として酢W/IIは生育が乏しく、一般細菌
に比べて発酵液量当りの菌体量が少ないため酵素の生産
性が著しく低いことが指摘される。
本発明者らは酢!!IIK含まれる膜結合型ADHの有
用性に鑑み、この酵素を産業上有利に製造する条件につ
いて鋭意研究を重ねた結果、該酵素活性が培地中に・含
有される炭素源の種類によって大きく変動すること及び
特に培養の対数増殖期以前の任意の時期にエタノールを
酢*ii増殖培地に含有せしめれば、酢#繭体の膜結合
[ADH含量が著しく増加する事実を発見して本発明を
完敗するに到った。
用性に鑑み、この酵素を産業上有利に製造する条件につ
いて鋭意研究を重ねた結果、該酵素活性が培地中に・含
有される炭素源の種類によって大きく変動すること及び
特に培養の対数増殖期以前の任意の時期にエタノールを
酢*ii増殖培地に含有せしめれば、酢#繭体の膜結合
[ADH含量が著しく増加する事実を発見して本発明を
完敗するに到った。
すなわち本発明は栄養培地に酢酸面を培養し。
培養物から膜結合[ADHを採取することからなる該酵
素の製造法において、該酢酸菌の対数増殖期が終了する
以前の時期に前記培地にエタノールを添加することを特
徴とする膜結合型ADHの製造方法に関するものである
。
素の製造法において、該酢酸菌の対数増殖期が終了する
以前の時期に前記培地にエタノールを添加することを特
徴とする膜結合型ADHの製造方法に関するものである
。
以下、本発明についてさらに具体的Kll明する。
本発明に使用することのできる微生物としては、酢ae
giiに属し膜結合型ADHを生産する1株であればい
ずれも好適に用いることができる。アセトバクター属に
属する1株としては例えばアセトバクター・アセチIF
O−3283,アセトバクター・ランセンスNR)’L
L−B−65.アセ゛トバクター・パスツリアヌスIF
O〜3223.アセトバクター・オウランチウスIFO
−3248などがある。一方、グルコノバクタ−属に属
する菌株としてはグルコノバクタ−・オキシダンスIF
O−3287./ルコノパクター・セリヌスIFO−3
269.グルコノバクタ−・ロゼウスIAM−1838
などが好適に用いられる。また1本発明者らが食酢の発
酵−から新規に分離したアセトバクター・MK−17株
およびアセトバクター・MK−06株は膜結合型ADH
の活性が強いので本発明に極めて有利に利用できる。
giiに属し膜結合型ADHを生産する1株であればい
ずれも好適に用いることができる。アセトバクター属に
属する1株としては例えばアセトバクター・アセチIF
O−3283,アセトバクター・ランセンスNR)’L
L−B−65.アセ゛トバクター・パスツリアヌスIF
O〜3223.アセトバクター・オウランチウスIFO
−3248などがある。一方、グルコノバクタ−属に属
する菌株としてはグルコノバクタ−・オキシダンスIF
O−3287./ルコノパクター・セリヌスIFO−3
269.グルコノバクタ−・ロゼウスIAM−1838
などが好適に用いられる。また1本発明者らが食酢の発
酵−から新規に分離したアセトバクター・MK−17株
およびアセトバクター・MK−06株は膜結合型ADH
の活性が強いので本発明に極めて有利に利用できる。
アセトバクター・MK−17株およびアセトバクター・
MK−06株の菌学的性質はそれぞれ特願昭55−14
5724号および特願昭56−164307号の明細書
に開示されており、それぞれ微工研薗を第5747号お
よび微工研薗寄第6173号として寄託されている。
MK−06株の菌学的性質はそれぞれ特願昭55−14
5724号および特願昭56−164307号の明細書
に開示されており、それぞれ微工研薗を第5747号お
よび微工研薗寄第6173号として寄託されている。
これらの細面の培養に用いる培地は通常の酢酸菌用の培
地が広く用いられる。すなわち炭素源としては資化可能
な炭素化合物であれば良く、例えばグルコース、フラク
トース、シュクロース、マルトース、クルコン酸、グリ
セロール、マンニトール。
地が広く用いられる。すなわち炭素源としては資化可能
な炭素化合物であれば良く、例えばグルコース、フラク
トース、シュクロース、マルトース、クルコン酸、グリ
セロール、マンニトール。
ソルビトール、澱粉質含有穀類の糖化液などが。
窒素源としては、たとえば硫酸アンモニウム、酵母エキ
ス、ペプトン、コーンステイープリカーなどの無機およ
び有機窒素源が用いられる。またカリウム、カルシウム
、!グネシウム、ナトリウム。
ス、ペプトン、コーンステイープリカーなどの無機およ
び有機窒素源が用いられる。またカリウム、カルシウム
、!グネシウム、ナトリウム。
リン酸、鉄などの塩類やビタミン、アミノ酸、核酸塩基
類などの微量要素が必要に応じて使用される。
類などの微量要素が必要に応じて使用される。
ここで本発明の目的を達するためKは、酢augrの増
殖培地にエタノールを0.1〜4%(V/V )、好ま
しくは0.2〜2 % (v/v )の範囲で含有せし
めることが肝要である。エタノール濃度が4%を越えて
も酵素含量の高い1体が得られるが、エタノールの酸化
生成物である酢酸の(酢酸面に対する)増殖阻害作用が
大きくなり、その結果単位液量当りの繭体量が減少する
ので好ましくない。またエタノールの添加は当該−一が
活発な増殖を続ける所謂、対数増殖期が終了する以前の
任意の時期、好ましくは対数増殖期の中期以前に行なえ
ば本発明の効果が達成される。培養は好気的に行なわれ
、表面培養、振盪培養2通気攪拌培養などいずれでもよ
いが、増殖速度が大きい点で通気攪拌培養が好ましい。
殖培地にエタノールを0.1〜4%(V/V )、好ま
しくは0.2〜2 % (v/v )の範囲で含有せし
めることが肝要である。エタノール濃度が4%を越えて
も酵素含量の高い1体が得られるが、エタノールの酸化
生成物である酢酸の(酢酸面に対する)増殖阻害作用が
大きくなり、その結果単位液量当りの繭体量が減少する
ので好ましくない。またエタノールの添加は当該−一が
活発な増殖を続ける所謂、対数増殖期が終了する以前の
任意の時期、好ましくは対数増殖期の中期以前に行なえ
ば本発明の効果が達成される。培養は好気的に行なわれ
、表面培養、振盪培養2通気攪拌培養などいずれでもよ
いが、増殖速度が大きい点で通気攪拌培養が好ましい。
培養温度は繭が発育する範囲内で適宜変更しうるが通常
25〜38℃、好ましくは28〜35°Cである。培養
時間は種々の条件によって異なるが、振盪または通気攪
拌培養の場合は通常20〜120時間、表面培養の場合
は通常120〜480時間培養する。培養時のpHは2
.0〜7.0、好ましくは2.5〜6.0の範囲で行な
われる。
25〜38℃、好ましくは28〜35°Cである。培養
時間は種々の条件によって異なるが、振盪または通気攪
拌培養の場合は通常20〜120時間、表面培養の場合
は通常120〜480時間培養する。培養時のpHは2
.0〜7.0、好ましくは2.5〜6.0の範囲で行な
われる。
上記の様な条件で培養した酢酸菌に属する各種細菌の培
養物から膜結合型ADHを得るには、既知の各種処理手
段を任意に採用することができる。
養物から膜結合型ADHを得るには、既知の各種処理手
段を任意に採用することができる。
例えば遠心分離などにより集菌した菌体を適当な緩衝液
に懸濁させた後1例えばDyno−Mill KDLl
lに通して菌体を破壊した後、低速(7000rpmで
10分、0℃)で遠沈して沈降する未破壊菌体を除き、
次にその上澄液を為速(27000rpmで90分、0
℃)で遠沈する。沈澱した膜画分に界面活性剤、例えば
Triton X −100を加えて酵素を可溶化した
後、イオン交換クロマトグラフィー、@着りロマトグラ
フィーあるいはゲル1過法などの通常の精製手段を単独
Kまたは適宜組み合せて適用し、任意に精製された酵素
を得ることができる。
に懸濁させた後1例えばDyno−Mill KDLl
lに通して菌体を破壊した後、低速(7000rpmで
10分、0℃)で遠沈して沈降する未破壊菌体を除き、
次にその上澄液を為速(27000rpmで90分、0
℃)で遠沈する。沈澱した膜画分に界面活性剤、例えば
Triton X −100を加えて酵素を可溶化した
後、イオン交換クロマトグラフィー、@着りロマトグラ
フィーあるいはゲル1過法などの通常の精製手段を単独
Kまたは適宜組み合せて適用し、任意に精製された酵素
を得ることができる。
本発明によって培養収穫した酢酸菌体の膜結合をADH
の含有量は、従来のエタノールを含有しない糖質培地で
培養して得られた酢酸菌体の膜結合型ADH含有量より
著しく高く、またエタノールを主要な炭素源として培養
して高濃度の酢酸を製造する所■、酢酸発酵法に比較し
て菌体の生産性が高い点で画期的であり、ここに初めて
膜結合型ADHを産業上有利KIl造することを可能に
したものである。なお、本発1jljKよれば酢酸菌体
中には通常、膜結合@ALDHも含有されるので、必要
により通常の手段によって分離、精製することができる
。
の含有量は、従来のエタノールを含有しない糖質培地で
培養して得られた酢酸菌体の膜結合型ADH含有量より
著しく高く、またエタノールを主要な炭素源として培養
して高濃度の酢酸を製造する所■、酢酸発酵法に比較し
て菌体の生産性が高い点で画期的であり、ここに初めて
膜結合型ADHを産業上有利KIl造することを可能に
したものである。なお、本発1jljKよれば酢酸菌体
中には通常、膜結合@ALDHも含有されるので、必要
により通常の手段によって分離、精製することができる
。
次に本発明を実施例により具体的KaQ11する。
なお、実施例中の膜結合型ADH及びALDHの力価は
、アグリカルチエラル・アンド・ノ(イオロジカル・ケ
ミストリー、42巻、第2045〜2056頁、197
8年および同誌44巻、第503〜515阪、1980
年の方法に準じて測定した。
、アグリカルチエラル・アンド・ノ(イオロジカル・ケ
ミストリー、42巻、第2045〜2056頁、197
8年および同誌44巻、第503〜515阪、1980
年の方法に準じて測定した。
すなわちマツキルベインノ(ツファー(p)l 6.
O)0.7−に0.1Mフェリシアン化カリウム水溶液
0.1−と酵素液0.1−を加え、30℃で5分間放置
後、エタノールもしくはアセトアルデヒドの1M水溶液
を0.1−加え反応を開始する。10分間反応後、デュ
パノール溶液を0.5117加えて反応を停止せしめ、
さらに蒸留水を3.5−加え、37℃で20分間放置後
、660nmの吸光度を測定し、1分間に1マイクロモ
ルの基質を酸化する酵素活性を1単位(ユニット)とし
た。
O)0.7−に0.1Mフェリシアン化カリウム水溶液
0.1−と酵素液0.1−を加え、30℃で5分間放置
後、エタノールもしくはアセトアルデヒドの1M水溶液
を0.1−加え反応を開始する。10分間反応後、デュ
パノール溶液を0.5117加えて反応を停止せしめ、
さらに蒸留水を3.5−加え、37℃で20分間放置後
、660nmの吸光度を測定し、1分間に1マイクロモ
ルの基質を酸化する酵素活性を1単位(ユニット)とし
た。
また酵素含量は乾燥菌体単位重量あたりのユニット数で
表わした。
表わした。
実施例1
水道水ll当りグルコース30g、酵母エキス21ポリ
ペプトン2vを含有する培地201(pH5,0)を3
01容ジャーファーメンタ−に入れて殺菌後、メンプラ
ン法によって除菌したエタノールを2憾になるように添
加し本培養培地とした。
ペプトン2vを含有する培地201(pH5,0)を3
01容ジャーファーメンタ−に入れて殺菌後、メンプラ
ン法によって除菌したエタノールを2憾になるように添
加し本培養培地とした。
この培地にエタノールを含有しない上記培地で30°C
130時間振盪培養した第1表に示す各種酢酸面の種培
養液11を接種し、通気量101/mi、n 、攪拌数
50Orpm、温度28°Cで培養を開始した。培養液
中のエタノール濃度を連続的に追跡し、エタノール濃度
が0,5%になった時点で培地中のエタノール濃度が0
.5%に保たれるように前配本培養培地を連続的に供給
し、同時に同じ速度で発酵槽より培養液を抜き出して連
続培養に移行した。培養液を遠心分離して1体を得、膜
結合型ADHの活性を測定した。同様にエタノールを全
く含有しない培地で培養して得た一体の酵素活性を測定
し、酵素含量を比較した結果を第1表に示した。なお、
培養液中のエタノール濃度は廃ガス中のエタノール濃度
を質量分析器を用いて連続的に測定した値から算出した
。また、酢酸菌体中の膜結合型ALDH含有量(U/9
・dry cell )を測定した結果を第2表に示す
。
130時間振盪培養した第1表に示す各種酢酸面の種培
養液11を接種し、通気量101/mi、n 、攪拌数
50Orpm、温度28°Cで培養を開始した。培養液
中のエタノール濃度を連続的に追跡し、エタノール濃度
が0,5%になった時点で培地中のエタノール濃度が0
.5%に保たれるように前配本培養培地を連続的に供給
し、同時に同じ速度で発酵槽より培養液を抜き出して連
続培養に移行した。培養液を遠心分離して1体を得、膜
結合型ADHの活性を測定した。同様にエタノールを全
く含有しない培地で培養して得た一体の酵素活性を測定
し、酵素含量を比較した結果を第1表に示した。なお、
培養液中のエタノール濃度は廃ガス中のエタノール濃度
を質量分析器を用いて連続的に測定した値から算出した
。また、酢酸菌体中の膜結合型ALDH含有量(U/9
・dry cell )を測定した結果を第2表に示す
。
/
実施例2
水道水11当りグルコース50g、酵母エキス2g、ポ
リペラトン29を含有する液体培地2O−(pH6,0
)を分注・収繭した50〇−容坂ロフラスコにアセトバ
クター・MK−17株(微工研繭寄第5747号)を接
種し、28°Cで18時間振盪培養を行なった。この前
培養液を上記と同一組成の培地50−を含む500−坂
ロフラスコへ101m種し、28℃で振盪培養を行なっ
た。この時、培養0時間後、15時間後−か手勢蒋發お
よび80時間後の各時間にメンプラン法によって除1し
たエタノールを2襲になるように、培地に添加した区、
及び無添加区の5試験区で培養を行ない48時間後に培
養を終了した。培養終了液を遠心分離して得た菌体の膜
結合型ADH及び膜結合型ALDHの含量はそれぞれ第
3表及び第4表に示す如くであった。なお660 nr
uにおける吸光度で測定したエタノール無添加区の生育
曲線は第1図の如くであつた。
リペラトン29を含有する液体培地2O−(pH6,0
)を分注・収繭した50〇−容坂ロフラスコにアセトバ
クター・MK−17株(微工研繭寄第5747号)を接
種し、28°Cで18時間振盪培養を行なった。この前
培養液を上記と同一組成の培地50−を含む500−坂
ロフラスコへ101m種し、28℃で振盪培養を行なっ
た。この時、培養0時間後、15時間後−か手勢蒋發お
よび80時間後の各時間にメンプラン法によって除1し
たエタノールを2襲になるように、培地に添加した区、
及び無添加区の5試験区で培養を行ない48時間後に培
養を終了した。培養終了液を遠心分離して得た菌体の膜
結合型ADH及び膜結合型ALDHの含量はそれぞれ第
3表及び第4表に示す如くであった。なお660 nr
uにおける吸光度で測定したエタノール無添加区の生育
曲線は第1図の如くであつた。
第1図は実施例2で用いた酢酸菌(エタノール無添加区
)の生育曲線である。 特許出願人 株式会社 中埜酢店
)の生育曲線である。 特許出願人 株式会社 中埜酢店
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 1)栄養培地に酢酸菌を培養し、培養物から膜結合型ア
ルコール脱水素酵素を採取することからなる該酵素の製
造法において、鋏酢酸−の対数増殖期が終了する以前の
時期に前記培地にエタノールを添加することを特徴とす
る膜結合型アルコール脱水素酵素の製造法。 2)エタノールの添加量が0.1〜4%(v/v )で
ある特許請求の範囲第1項記載の製造法。 3)酢酸−がアセトバクター・MK−06株(微工研−
寄第6173号)またはアセトバクター・MK−17株
(黴工研繭寄第5747号)である特許請求の範囲第1
項記載の製造法。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP57035184A JPS58152479A (ja) | 1982-03-08 | 1982-03-08 | 膜結合型アルコ−ル脱水素酵素の製造法 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP57035184A JPS58152479A (ja) | 1982-03-08 | 1982-03-08 | 膜結合型アルコ−ル脱水素酵素の製造法 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPS58152479A true JPS58152479A (ja) | 1983-09-10 |
Family
ID=12434756
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP57035184A Pending JPS58152479A (ja) | 1982-03-08 | 1982-03-08 | 膜結合型アルコ−ル脱水素酵素の製造法 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JPS58152479A (ja) |
-
1982
- 1982-03-08 JP JP57035184A patent/JPS58152479A/ja active Pending
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
J.FERMENT TECHNOL * |
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