KR101672407B1 - 바이오에너지 생산을 위한 방사선변이 미세조류 - Google Patents

Abstract

본 발명은 바이오에너지 생산을 위한 방사선변이 미세조류에 관한 것으로, 보다 상세하게는 바이오에탄올 또는 바이오디젤의 효율적인 생산을 위해 미세조류에 감마선을 조사함으로써, 세포 내 전분 또는 지질의 생산성을 증가시킨 방사선변이 미세조류에 관한 것이다. 본 발명을 통해 비조사 대조구에 비해 생장속도가 빠르고, 높은 세포 포화도를 보임을 확인하였다. 또한 전분축적량 및 지질축적량이 대조구에 비해 2.3배 및 1.7배 증가함을 확인하여, 바이오에탄올과 바이오디젤 생산에 모두 유용하게 사용할 수 있을 것으로 기대된다.

Description

바이오에너지 생산을 위한 방사선변이 미세조류{radiated microalgae mutant for bio-energy production}

본 발명은 바이오에너지 생산을 위한 방사선변이 미세조류에 관한 것으로, 보다 상세하게는 바이오에탄올 또는 바이오디젤의 효율적인 생산을 위해 미세조류에 감마선을 조사함으로써, 세포 내 전분 또는 지질의 생산성을 증가시킨 방사선변이 미세조류에 관한 것이다.

인류는 무분별한 화석연료 사용으로 지구온난화와 에너지원 고갈이라는 이중고에 직면하고 있어 재생가능한 지속적 에너지 자원에 대한 전 세계적인 요구는 매년 지수적으로 증가되고 있다. 국내에서도 최근 신ㅇ재생에너지 개발에 적극적으로 나서고 있지만 아직까지는 시작 단계이다. 바이오에너지는 화석에너지와는 달리 이산화탄소를 발생시키지 않는 친환경적 에너지로서, 이산화탄소와 태양에너지를 포획하는 광합성 과정을 통하여 에너지가 축적된 유기 탄소 화합물이 생성되고 이렇게 해서 저장된 바이오매스로부터 에너지를 추출하는 것이다.

바이오에너지는 재생가능하며 유해성분이 거의 없는 비독성 에너지이고, 미생물에 의해 완전히 분해되며 이산화탄소를 고정해서 생산되므로 온실효과를 감소시킨다. 현재 육상자원을 이용한 바이오에너지 연구가 진행되고 있으나, 식량자원 및 식량 재배면적과 경쟁 등 육상자원 이용의 한계점이 드러나면서 미세조류를 이용하고자 하는 정책과 연구들이 전 세계적으로 시작되고 있다. 바이오에너지는 대표적으로 바이오에탄올/부탄올과 바이오디젤이 있는데, 거대조류(macroalgae)를 중심으로 바이오에탄올/부탄올의 생산 연구가 진행되고 있으며, 미세조류(microalgae)를 중심으로 바이오디젤 연구가 진행되고 있다.

미세조류의 형질전환을 통한 활용의 예로 대한민국 공개특허공보 10-2012-0045631 및 대한민국 공개특허공보 10-2009-0112023에 개시되어 있다. 미세조류는 형질전환이 어렵고 시간이 많이 걸리는 단점을 가지고 있다. 또한 형질전환 기술을 이용한 상업화에 있어서 GMO(genetically modified organism) 문제 때문에 형질전환체를 바이오에너지 생산을 위해 직접적으로 활용하기 어려운 문제점이 있다.

상기 문제점을 해결하기 위해 본 발명에서는 미세조류를 이용한 전분(바이오에탄올) 또는 지질(바이오디젤) 생산을 위해, 방사선을 이용하여 전분 또는 지질의 생산성이 증가된 미세조류 변이체를 제작하고자 하였다.

본 발명은 클라미도모나스 레인하드티(Chlamydomonas reinhardtii)에 방사선을 조사하여 바이오에탄올 및 바이오디젤 함량이 증가된 클라미도모나스 레인하드티 변이체(KCTC12615BP)에 관한 것이다.

남조류(cyanobacteria)를 포함하는 미세조류는 각종 지질, 탄화수소, 지방 알코올 및 기타 복합 오일들을 생산하는 것으로 보고되었다(Metzger and Largeau 2005; Guschina and Harwood 2006; Schirmer 등 2010; Tan 등 2011). 모든 미세조류가 바이오디젤 생산에 적합하지는 않다 하더라도, 일부 미세조류 균주들이 바이오디젤 연료로서의 이용 가능성을 보여주고 있다(Chisti 2007). 클라미도모나스 레인하르티는 가장 널리 보급되어 있는 미세조류 모델 시스템들 중 하나로, 이는 바이오연료 공급원으로서 바람직한 특징들을 갖는다. 클라미도모나스 레인하르티가 질소 결핍에 반응하여 바이오디젤 생산에 사용될 수 있는 지질들을 과축적한다는 것이 증명되었으며(Riekhof 등 2005; Wang 등 2009; Siaut 등 2011), 황 결핍이 클라미도모나스 레인하르티(Sato 등 2000)에서 총 지질 함량을 증진시킨다는 것도 알려져 있는 바이다(Sato 등 2000).

본 발명에서 상기 방사선은 제한되지는 않으나 감마선 또는 X-선일 수 있으며, 상기 감마선은 제한되지는 않으나 바람직하게 시간당 50 내지 150 Gy로 50 내지 300 Gy의 선량이 되도록 조사할 수 있다. 상기 범위의 선량으로 조사할 때 전분 및 지질의 함유량이 가장 많이 증가하는 것을 확인하여, 방사선 선량의 조사에 따른 비용 및 유해성 등을 고려할 때 효과적으로 바이오에탄올 및 바이오디젤 생산에 활용이 가능하다.

또한 본 발명은 a) 클라미도모나스 레인하드티(Chlamydomonas reinhardtii) 균주에 방사선을 조사하는 단계; 및 b) 상기 방사선 조사된 균주를 배양하고 배지에 도말한 후, 전분 및 지질 함량이 증가한 변이체를 선별하는 단계; 를 포함하는 것을 특징으로 하는 바이오에탄올 및 지방산이 트랜스에스테르화된 바이오디젤의 함량이 증가한 클라미도모나스 레인하드티 (Chlamydomonas reinhardtii) 변이체의 생산방법에 관한 것이다.

바이오디젤은 바이오매스에 포함된 지방산(fatty acid)의 트랜스에스테르화 (transesterification) 과정에 의해 메틸 에스터 또는 에틸 에스터 형태로 생산되며 부산물로 글리세롤이 생성된다. 바이오디젤(biodiesel)은 페트로디젤(petrodiesel)과는 달리 연소될 때 배출되는 독성물질이 현저하게 낮은 친환경적 에너지이다. 본 발명에서 상기 지방산은 제한되지는 않으나 C₁ 내지 C₂₀의 탄소수를 가지는 특징이 있다.

본 발명은 방사선을 조사한 미세조류 변이체에 관한 것으로, 비조사 대조구에 비해 생장속도가 빠르고, 높은 세포 포화도를 보임을 확인하였다. 또한 전분축적량 및 지질축적량이 대조구에 비해 2.3배 및 1.7배 증가함을 확인하여, 바이오에탄올과 바이오디젤 생산에 모두 유용하게 사용할 수 있을 것으로 기대된다.

도 1은 Arti-BE1의 생장특성 분석에 관한 것이다. 대조군 cc-124, 고바이오매스 변이체 Arti-BE1.
도 2는 Arti-BE1의 세포내부 전분 및 지질 축적 관찰 결과이다.
도 3은 Arti-BE1의 전분 함량 분석에 관한 것이다.
도 4는 Arti-BE1의 지질 함량 분석에 관한 것이다.

이하 본 발명을 실시예를 참조하여 상세히 설명한다. 그러나 이들은 본 발명을 보다 상세하게 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 권리범위가 하기의 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

[실시예]

[실시예 1] 미세조류에 감마선 조사를 통한 변이체 선별

미세조류 클라미도모나스 레인하드티(Chlamydomonas reinhardtii, cc-124, 미국 텍사스대학)를 25 ℃의 TAP 배지(Gibco)에서 8일간 배양하였다. 배양액을 원심분리기로 분리하여 상등액을 제거한 후, 수집한 세포에 100 Gy/h로 150 Gy 선량의 감마선을 조사하였다. 상기 세포를 2일간 암상태로 정치배양한 후, TAP 고체 배지에 도말하여 25 ℃에서 15일간 배양하고 콜로니로부터 변이체(요오드용액을 고체배지에 도말하여 색의 변화가 있는 콜로니)를 선별하였다. 1차로 선별된 변이체를 질소가 결핍된 TAP-N(Gibco) 배지에서 2일간 배양한 후, 요오드용액을 가하여 색의 변화를 관찰하고 전분축적량이 증가한 변이체 Arti-BE1을 선별하였다.

상기 Arti-BE1 변이체를 클라미도모나스 레인하르티 Arti-BE1(Chlamydomonas reinhardtii Arti-BE1)으로 명명하고 한국생명공학연구원(KCTC)에 2014년 7월 1일자로 기탁(KCTC12615BP)하였다.

[실시예 2] Arti-BE1 변이체의 생장특성

TAP 배지 50 mL 플레이트 두 개에 OD₇₅₀ 0.1로 대조구와 Arti-BE1 변이체를 각각 접종하고, 매 24시간마다 OD₇₅₀를 측정하였다.

도 1에서와 같이 배양 2일째까지 상기 변이체와 cc-124 대조구를 비교하여 보면 비슷한 성장 속도를 보이나, 배양 3일째 대조구 대비 20% 높은 OD₇₅₀ 1.55의 생장을 보였으며, 배양 4일째 최대 포화도인 OD₇₅₀ 1.69를 나타내었다. 이로부터 Arti-BE1의 세포포화도가 대조구에 비해 15% 높으며, 이는 더 많은 바이오매스(biomass)를 생산하는 것을 의미한다.

[실시예 3] Arti-BE1 세포 내 전분 및 지질 축적

TAP 배지 50 mL 플레이트 두 개에 대조구와 Arti-BE1 변이체를 각각 접종한 후 5일간 배양하고, 질소가 결핍된 TAP-N(Gibco) 배지에서 4일간 배양하고 세포를 고정시켜 TEM(transmitted electron microscopy; Tecnai, FEI, Netherlands) 분석하였다.

도 2에서와 같이, Arti-BE1은 cc-124 대조구와 비교하여 전분 및 지질이 세포 내에 더 많이 축적되었음을 확인할 수 있었다.

Arti-BE1의 전분 축적량

TAP 배지 50 mL 플레이트 두 개에 대조구와 Arti-BE1 변이체를 각각 접종한 후 5일간 배양하고, 질소가 결핍된 TAP-N(Gibco) 배지에서 2일간 배양하고 세포를 건조시켰다. Starch assay kit(Sigma)를 사용하여 건조된 20 mg 세포의 전분 함유량을 측정하였다.

도 3에서와 같이, Arti-BE1의 전분 함량은 건조 중량의 약 34%인 6.8 mg으로 cc-124 대조구와 비교하여 약 2배 높은 것을 확인하였다.

Arti-BE1의 지방산(지질) 축적량

TAP 배지 50 mL 플레이트 두 개에 대조구와 Arti-BE1 변이체를 각각 접종한 후 질소가 결핍된 TAP-N(Gibco) 배지에서 2일, 8일간 배양하였다. 지방산 함량 검정하기 위하여 gas chromatography (GC) 분석법을 이용하여 지방산량을 측정하였다. 총지방 분리는 20 mg의 동결건조 샘플을 사용하여 수행하였고 추출법은 Sasser (1990)의 방법을 사용하였다. 분석 장비는 아래와 같다; gas chromatography (YL-6100GC, 영린과학, 한국), INNOWAX capillary column (Agilent, 미국, 30 m x 0.32 mm x 0.5 μm). 각각의 지방산은 표준물질(standard)인 Supelco^® 37 Component FAME Mix (Sigma, 미국)와 비교하여 사용하여 분석하였다

도 4에서와 같이, 배양 2일째 cc-124 대조구의 지방산 함량은 건조 중량의 약 19%인 3.8 mg, Arti-BE1의 지방산 함량은 약 24%인 4.8 mg이었으며, 배양 8일째에는 각각 약 19%, 33%인 3.8 mg, 6.6 mg으로 Arti-BE1이 cc-124 대조구에 비해 1.6배 높은 지방산 함량을 나타내었다.

[비교예 1]

실시예 1의 방사선 선량을 1 Gy로 조사한 것을 제외하고 나머지 과정은 실시예 1 내지 실시예 4와 동일하게 하여 수행하였다.

[비교예 2]

실시예 1의 방사선 선량을 1 kGy로 조사한 것을 제외하고 나머지 과정은 실시예 1 내지 실시예 4와 동일하게 하여 수행하였다.

[표 1] 변이체의 생장 특성 및 전분/지방산 함량 측정

상기 결과로부터, 미세조류 클라미도모나스 레인하드티에 상기 실시예 범위의 감마선을 조사한 결과 바이오매스(biomass) 생산성이 15%, 전분 축적량이 100%, 지방산 함량이 60% 증가함을 확인하여 바이오에탄올 및 바이오디젤 생산에 효과적으로 사용될 수 있음을 확인하였고, 세포 생장 및 전분/지방산 함량이 최대로 증가함을 확인하여 본 발명을 완성하였다.

한국생명공학연구원 KCTC12615BP 20140701

Claims (7)

1. 클라미도모나스 레인하드티(Chlamydomonas reinhardtii)에 방사선을 조사하여 전분 및 지질 함량이 증가된 클라미도모나스 레인하드티 변이체(KCTC12615BP).
2. 제 1항에 있어서,
   상기 방사선은 감마선 또는 X-선인 것을 특징으로 하는 클라미도모나스 레인하드티 변이체.
3. 제 2항에 있어서,
   상기 감마선은 시간당 50 내지 150 Gy로 50 내지 200 Gy의 선량이 되도록 조사하는 것을 특징으로 하는 클라미도모나스 레인하드티 변이체.
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