ES2565563T3

ES2565563T3 - Método para preparar bibliotecas de ácidos nucleicos

Info

Publication number: ES2565563T3
Application number: ES11747926.1T
Authority: ES
Inventors: Michael G. Pollack; Allen E. Eckhardt; Arjun Sudarsan; Vijay Srinivasan; Jeremy Rouse; Uichong Yi; Nicholas Trotta; Rahul Dhopeshwarkar; Prasanna Thwar; Gregory F. Smith; Scott Norton; Peter Linnartz
Original assignee: Advanced Liquid Logic Inc
Current assignee: Advanced Liquid Logic Inc
Priority date: 2010-02-25
Filing date: 2011-02-22
Publication date: 2016-04-05
Anticipated expiration: 2031-02-22
Also published as: AU2016204653A1; AU2011221243B2; WO2011106314A3; US20150038344A1; JP2013520202A; PL2539450T3; DK2539450T3; US20130225450A1; AU2016204653B2; EP2539450A2; EP2539450B1; US20130225452A1; WO2011106314A2; CA2825984A1; AU2011221243A1; EP3072968A1; EP2539450A4; JP2016127851A; HUE027972T2; US20130203606A1

Abstract

Un método para preparar una biblioteca de ácidos nucleicos en gotitas en contacto con aceite, que comprende: (a) preparar extremos romos de fragmentos de ácido nucleico en gotitas en el aceite para producir fragmentos de ácido nucleico de extremos romos; (b) fosforilar los fragmentos de ácido nucleico de extremos romos en gotitas en el aceite para producir fragmentos de ácido nucleico fosforilados; (c) acoplar colas-A a los fragmentos de ácido nucleico fosforilados en las gotita en el aceite para producir fragmentos de ácido nucleico con colas-A; y (d) acoplar adaptadores de ácidos nucleicos a los fragmentos de ácido nucleico con colas-A en gotitas en el aceite para producir la biblioteca de ácidos nucleicos que comprende fragmentos de ácido nucleico ligados al adaptador.

Description

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reacción independiente. El método puede incluir también dispensar una segunda serie de gotitas de reactivo y transportar cada gotita de la segunda serie de gotitas de reactivo en un carril de reacción sin causar que ninguna gotita de la segunda serie de gotitas de reactivo atraviese ninguna región de cualquier otro carril de reacción que haya sido previamente atravesado por una gotita de muestra. El método también puede incluir fusionar cada gotita de muestra con una de la segunda serie de gotitas de reactivo. El método también puede incluir hacer avanzar cada gotita de muestra a lo largo de su carril de reacción independiente.

5 Definiciones

Tal como se usa en el presente documento, los siguientes términos tienen los significados que se indican.

"Activar", con referencia a uno o más electrodos, significa afectar un cambio en el estado eléctrico de los uno o más electrodos que, en presencia de una gota, resulta en una operación de gotitas. La activación de un electrodo se puede lograr usando corriente alterna o continua. Cualquier voltaje adecuado puede ser utilizado. Por ejemplo, un electrodo puede ser activado mediante un voltaje que sea mayor de aproximadamente 50 V, o más de aproximadamente 100 V, o más de aproximadamente 150 V, o más de aproximadamente 200 V, o más de aproximadamente 250 V, o de aproximadamente 275 V a aproximadamente 375 V, o aproximadamente de 300 V. Cuando se usa corriente alterna, se puede emplear cualquier frecuencia adecuada. Por ejemplo, un electrodo puede ser activado mediante una corriente alterna con una frecuencia de aproximadamente 1 Hz a aproximadamente 1000 Hz, desde aproximadamente 1 Hz a aproximadamente 100 Hz, o desde aproximadamente 10 Hz a aproximadamente 60 Hz, o desde aproximadamente 20 Hz a aproximadamente 40 Hz, o a aproximadamente 30 Hz.

"Perla", con respecto a las perlas de un accionador de gotitas, significa cualquier perla o partícula que sea capaz de interactuar con una gotita en o en proximidad con un accionador de gotitas. Las perlas pueden tener cualquiera de una amplia variedad de formas, tales como esférica, generalmente esférica, en forma de huevo, en forma de disco, cúbica, amorfa y otras formas tridimensionales. La perla puede, por ejemplo, ser capaz de ser sometida a una operación de gotitas en una gotita en un accionador de gotitas o ser de otro modo configurada con respecto a un accionador de gotitas de una manera que permita que una gotita en el accionador de gotitas sea puesta en contacto con la perla en el accionador de gotitas y/o apague el accionador de gotitas. Las perlas se pueden proporcionar en una gotita, en un hueco de operaciones de gotitas, o sobre una superficie de operaciones de gotitas. Las perlas se pueden proporcionar en un depósito que sea externo a un hueco de operaciones de gotitas o que esté situado aparte de una superficie de operaciones de gotitas, y el depósito puede estar asociado con una trayectoria de fluido y/o la trayectoria del electrodo que permita que una gotita que incluye las perlas sea puesta en un hueco de operaciones de gotitas o en contacto con una superficie de operaciones de gotitas. Las perlas pueden fabricarse utilizando una amplia variedad de materiales, incluidos, por ejemplo, resinas y polímeros. Las perlas pueden ser de cualquier tamaño adecuado, incluyendo por ejemplo, microperlas, micropartículas, nanoperlas y nanopartículas. En algunos casos, las perlas son magnéticamente sensibles; en otros casos las perlas no son significativamente magnéticamente sensibles o no son magnéticamente sensibles. Para perlas magnéticamente sensibles, el material magnéticamente sensible puede constituir sustancialmente la totalidad de una perla, una parte de una perla, o sólo un componente de una perla. El resto de la perla puede incluir, entre otras cosas, material polimérico, revestimientos y restos que permitan la unión de un reactivo de ensayo. Ejemplos de perlas adecuadas incluyen microperlas de citometría de flujo, micropartículas de poliestireno y nanopartículas, micropartículas de poliestireno funcionalizadas y nanopartículas, micropartículas y nanopartículas de poliestireno revestidas, microperlas de sílice, microesferas y nanoesferas fluorescentes, microesferas y nanoesferas fluorescentes funcionalizadas, microesferas y nanoesferas fluorescentes revestidas, micropartículas y nanopartículas teñidas de color, micropartículas y nanopartículas magnéticas, micropartículas y nanopartículas superparamagnéticas (por ejemplo, partículas de DYNABEADS®, disponibles de Invitrogen Group, Carlsbad, CA), micropartículas y nanopartículas fluorescentes, micropartículas y nanopartículas magnéticas revestidas, micropartículas y nanopartículas ferromagnéticas, micropartículas y nanopartículas ferromagnéticas revestidas, y los descritos en la publicación de Patente de Estados Unidos nº 20050260686, titulada "Multiplex flow assays preferably with magnetic particles as solid phase", publicada el 24 de noviembre de 2005; 20030132538, titulada "Encapsulation of discrete quanta of fluorescent particles", publicada el 17 de julio de 2003; 20050118574, titulada "Multiplexed Analysis of Clinical Specimens Apparatus and Method", publicada el 2 de junio de 2005; 20050277197. Bajo el título "Microparticles with Multiple Fluorescent Signals and Methods of Using Same," publicada el 15 de diciembre 2005; 20060159962, titulada "Magnetic Microspheres for use in Fluorescence-based Applications," publicada el 20 de julio, 2006. Las perlas pueden ser pre-acopladas con una biomolécula u otra sustancia que sea capaz de unirse y formar un complejo con una biomolécula. Las perlas pueden ser pre-acopladas con un anticuerpo, proteína o antígeno, sonda de ADN / ARN o cualquier otra molécula con una afinidad para una diana deseada. Ejemplos de técnicas de accionador de gotitas para inmovilizar perlas magnéticamente sensibles y/o perlas no magnéticamente sensibles y/o realizar protocolos de operaciones de gotitas usando perlas se describen en la Solicitud de Patente de Estados Unidos Nº 11 / 639.566, titulada "Droplet-Based Particle Sorting," presentada el 15 de diciembre del 2006; la solicitud de patente de EE.UU. nº 61 / 039.183, titulada "Multiplexing Bead Detection in a Single Droplet," presentada el 25 de marzo de 2008; la solicitud de patente de EE.UU. nº 61 / 047.789, titulada "Droplet Actuator Devices and Droplet Operations Using Beads," presentada el 25 de abril de 2008; la solicitud de patente de EE.UU. nº 61 / 086.183, titulada "Droplet Actuator Devices and Methods for Manipulating Beads," presentada el 5 de agosto de 2008; Solicitud de Patente Internacional Nº PCT / US2008 / 053545, titulada "Droplet Actuator Devices and Methods Employing Magnetically responsive beads," presentada el 11 de febrero de 2008; Solicitud de Patente Internacional No. PCT/US2008/058018, titulada "Bead-based

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área de la huella de la gotita sea similar a la zona de electrohumectación; en otras palabras, las 1x-, 2x-, 3x-gotitas se controlan y operan de manera útil usando 1, 2 y 3 electrodos, respectivamente. Si la huella de las gotitas es mayor que el número de electrodos disponibles para la realización de una operación de gotita en un momento dado, la diferencia entre el tamaño de las gotitas y el número de electrodos debe típicamente no ser mayor que 1; en otras palabras, una gotita 2x es controlada de manera útil usando 1 electrodo y una gotita 3x es controlada de manera útil por medio de 2 electrodos. Cuando las gotitas incluyen perlas, es útil que el tamaño de la gotita sea igual al número de electrodos que controlan la gotita, por ejemplo, transportando la gotita. Sin embargo, cabe señalar que mediante la variación de la tensión superficial, la velocidad del transporte, etc., pueden ser transportadas gotitas muy grandes por medio de electrodos o series de electrodos que tienen una huella que es significativamente menor que la huella de la gotita; por lo tanto, mientras que la frase anterior describe una regla útil, no debe interpretarse como limitante de la invención.

"Fluido de relleno" significa un fluido que es inmiscible, o sustancialmente inmiscible con una gotita. En algunas realizaciones, un fluido de relleno está asociado con un sustrato de operaciones de gotitas de un accionador de gotitas, cuyo fluido es suficientemente inmiscible con una fase de la gotita para hacer a la fase de la gotita someterse a operaciones de gotitas mediadas por electrodo. Por ejemplo, el hueco de un accionador de gotitas está típicamente relleno de un líquido de relleno. El fluido de relleno puede, por ejemplo, ser un aceite de baja viscosidad, tal como un aceite de silicona o un líquido de relleno de hexadecano. El fluido de relleno puede rellenar todo el hueco del accionador de gotitas o puede revestir una o más superficies del accionador de gotitas. Los fluidos de relleno pueden ser conductores o no conductores. Los fluidos de relleno pueden, por ejemplo, estar dopados con tensioactivos u otros aditivos. Por ejemplo, los aditivos pueden ser seleccionados para mejorar las operaciones de las gotitas y/o reducir la pérdida de sustancias reactivas o diana de las gotitas, la formación de microgotitas, la contaminación cruzada entre las gotitas, la contaminación de las superficies del accionador de gotitas, la degradación de los materiales del accionador de gotitas, etc. La composición del fluido de relleno, incluido el dopaje del tensioactivo, puede ser seleccionada para el funcionamiento con los reactivos utilizados en los protocolos específicos de ensayo y para la interacción o no interacción efectiva con los materiales del accionador de gotitas. Ejemplos de fluidos de relleno y formulaciones de fluidos de relleno adecuadas para uso con la invención se proporcionan en Srinivasan et al, Patente Internacional Pub. Nos. WO / 2010/027894, titulada "Droplet Actuators, Modified Fluids and Methods," publicada el 11 de marzo de 2010, y el documento WO / 2009/021173, titulado "Use of Additives for Enhancing Droplet Operations," publicado el 12 de febrero de 2009; Sista et al., Patente Internacional Pub. Nº WO / 2008/098236, titulada, "Droplet Actuator Devices and Methods Employing Magnetically responsive beads," publicada el 14 de agosto de 2008; y Monroe et al, publicación de patente de EE.UU. Nº 20080283414, titulada "Electrowetting Devices," presentada el 17 de mayo de 2007. Se hace notar que cualquiera de las etapas de preparación de bibliotecas descritas en este documento puede llevarse a cabo en un fluido de relleno, por ejemplo, un fluido de relleno que rellene sustancialmente un hueco de operaciones de gotitas de un accionador de gotitas. En una realización, el fluido de carga comprende aceite de silicona que tiene una viscosidad cinemática en el intervalo de aproximadamente 1 a aproximadamente 6,5 cSt, o de aproximadamente 1,5 a aproximadamente 5,5 cSt, o de aproximadamente 2 a aproximadamente 5 cSt. Este aceite de silicona puede estar dopado con un agente tensioactivo. En una realización, el fluido de relleno para la realización de la construcción de la biblioteca incluye de aproximadamente 2 cSt a aproximadamente 7 cSt del aceite de silicona con de aproximadamente 0,0001 a aproximadamente 1% v/v de un agente tensioactivo soluble en aceite, o de aproximadamente 0,001 a aproximadamente 0,1% v/v de un tensioactivo soluble en aceite, o de aproximadamente 0,001 a aproximadamente 0,01% v/v de un agente tensioactivo soluble en aceite, o de aproximadamente 0,005 a aproximadamente 0,01% v/v de un agente tensioactivo soluble en aceite. Por lo tanto, en una realización, la descripción proporciona un kit que comprende un cartucho de accionador de gotitas y un fluido de relleno que tiene tales características. En otra realización, el fluido de relleno para la realización de la construcción de la biblioteca incluye de aproximadamente 2 cSt a aproximadamente 7 cSt de aceite de silicona con de aproximadamente 0,0001 a aproximadamente 1% v/v de un éster de ácido graso de sorbitán, o de aproximadamente 0,001 a aproximadamente 0,1% v/v de un éster de ácido graso de sorbitán, o de aproximadamente 0,001 a aproximadamente 0,01% v/v de un éster de ácido graso de sorbitán, o de aproximadamente 0,005 a aproximadamente 0,01% v/v de un éster de ácido graso de sorbitán. Por lo tanto, en una realización, la descripción proporciona un kit que comprende un cartucho de accionador de gotitas y un líquido de relleno que tiene tales características. En otra realización, el fluido de relleno para la realización de la construcción de la biblioteca incluye de aproximadamente 2 cSt a aproximadamente 7 cSt de aceite de silicona con de aproximadamente 0,0001 a aproximadamente 1% v/v de un éster de sorbitán que es soluble en el aceite de silicona, o de aproximadamente 0,001 a aproximadamente de 0,1% v/v de un éster de sorbitán que es soluble en el aceite de silicona, o de aproximadamente 0,001 a aproximadamente 0,01% v/v de un éster de sorbitán que es soluble en el aceite de silicona, o de aproximadamente 0,005 a aproximadamente 0,01% v/v de un éster de sorbitán que es soluble en el aceite de silicona. Por lo tanto, en una realización, la descripción proporciona un kit que comprende un cartucho de accionador de gotitas y un líquido de relleno que tiene tales características. En otra realización, el fluido de relleno para la realización de la construcción de la biblioteca incluye de aproximadamente 2 cSt a aproximadamente 7 cSt de aceite de silicona con de aproximadamente 0,0001 a aproximadamente 1% v/v de trioleato de sorbitán, o de aproximadamente 0,001 a aproximadamente 0,1% v/v de un éster de trioleato de sorbitán,

o de aproximadamente 0,001 a aproximadamente 0,01% v/v de trioleato de sorbitán, o de aproximadamente 0,005 a aproximadamente 0,01% v/v de un éster de trioleato de sorbitán. El trioleato de sorbitán está disponible como una formulación de tensioactivo de SPAN® 85 de Sigma Aldrich. Por lo tanto, en una realización, la descripción proporciona un kit que comprende un cartucho de accionador de gotitas y un líquido de relleno que tiene tales

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La Figura 9 ilustra una vista superior de un ejemplo de un accionador de gotitas que es adecuado para uso en la realización de un protocolo de construcción de la biblioteca de ácidos nucleicos multiplexada;

La Figura 10 ilustra una vista superior de otro ejemplo de una disposición de electrodos configurada para el procesamiento de ácidos nucleicos en un accionador de gotitas para la construcción de una biblioteca de ácidos nucleicos;

La Figura 11 ilustra una vista superior de otro ejemplo de una disposición de electrodos configurada para el procesamiento de ácidos nucleicos en un accionador de gotitas para la construcción de una biblioteca de ácidos nucleicos;

La Figura 12 ilustra una vista superior de otro ejemplo de una disposición de electrodos configurada para el procesamiento de ácidos nucleicos en un accionador de gotitas para la construcción de una biblioteca de ácidos nucleicos;

Las Figuras 13A y 13B ilustran una vista superior y una vista en perspectiva, respectivamente, de otro ejemplo de un accionador de gotitas adecuado para su uso en la realización de un protocolo de construcción de la biblioteca de ácidos nucleicos multiplexada;

La figura 13C ilustra una vista superior de un ejemplo de implementación del sustrato superior del accionador de gotitas de las Figuras 13A y 13B;

La Figura 14 ilustra una vista superior de un ejemplo de un sustrato inferior del accionador de gotitas de las figuras 13A y 13B, que tiene una disposición de electrodos patrón sobre el mismo;

La Figura 15 ilustra una vista superior de un ejemplo de un sustrato inferior de un accionador de gotitas que tiene una disposición de electrodos patrón sobre el mismo para un transporte de gotitas optimizado y el tiempo de encaminamiento;

La Figura 16 ilustra una vista superior del sustrato inferior de la Figura 15 en relación a las aberturas para el llenado de los depósitos de fluido en el accionador soportados por la disposición de los electrodos de la figura 15;

Las Figuras 17, 18, 19, 20 y 21 ilustran vistas de los distintos depósitos de fluido que son compatibles con la disposición de electrodos de la figura 15;

Las Figuras 22A y 22B ilustran vistas en perspectiva de un accionador de imán;

La Figura 23 ilustra una vista superior de un ejemplo de un dispositivo mecánico para sostener uno o más accionadores de imán y uno o más mecanismos calentadores;

Las Figuras 24A y 24B ilustran una vista en perspectiva de ejemplos de un conjunto de imanes Halbach;

Las Figuras 25A y 25B ilustran la relación de los campos magnéticos de, por ejemplo, la matriz de imanes Halbach de la Figura 24A a los electrodos de un accionador de gotitas;

Las Figuras 26A y 26B ilustran otra vista (es decir, una vista superior) del accionador de gotitas de las Figuras 25 A y 25B en relación a la matriz de imanes Halbach de las Figuras 24A y 24B;

La figura 27 ilustra un diagrama de flujo de un método de concentración de muestra en un accionador de gotitas;

Las figuras de 28A a 28D ilustran una vista lateral y vistas en sección transversal de un conjunto de rodillos que incluye una disposición de otros componentes que pueden ser útiles con respecto al accionador de gotitas;

Las Figuras 29A y 29B ilustran una vista superior y una vista en sección transversal, respectivamente, de un ejemplo de una parte de un accionador de gotitas y muestran un proceso de descarga de gotitas de deshecho;

La Figura 30 ilustra una vista en sección transversal de otra realización del accionador de gotitas de las Figuras 29A y 29B;

La Figura 31 ilustra vistas superiores de una porción de un ejemplo de una disposición de electrodos y una secuencia de disposición de depósito para dispensar gotitas 2X;

La Figura 32 ilustra vistas superiores de la disposición de electrodos de la figura 31 y una secuencia de disposición de depósito para dispensar gotitas 1X;

La Figura 33 ilustra vistas superiores de otra realización de la disposición de electrodos de la figura 31 y otra secuencia de disposición de depósito para dispensar gotitas 1X; y

Las figuras de 34A a 34E ilustran vistas superiores de un ejemplo de una parte de una disposición de electrodos de un accionador de gotitas y muestran un proceso de integración de amplificación por PCR y el análisis por HRM para

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las perlas. La etapa de preparación de extremos romos 105 se puede omitir cuando se utiliza un esquema de fragmentación que produce fragmentos de extremos romos.

En la etapa de fosforilación 110, se puede usar T4 polinucleótido quinasa para fijar un fosfato al extremo 5'-hidroxilo del ácido nucleico de extremos romos. En un accionador de gotitas, esta etapa puede llevarse a cabo mediante el uso de operaciones de gotitas que dispensen una gotita que comprenda reactivos de fosforilación y la fusión de aquella gotita con una gotita que comprenda el ácido nucleico de extremos romos producido en la etapa 105. Después de preparar los extremos romos, el ácido nucleico se puede purificar (por ejemplo, usando un protocolo de lavado basado en perlas) para eliminar la enzima y el exceso de reactivo que pueda interferir con las etapas siguientes. En el accionador de gotitas, esta etapa de lavado puede llevarse a cabo mediante la captura del ácido nucleico en perlas y la realización de un protocolo de lavado basado en gotitas, como se describe en el presente documento. El ácido nucleico puede entonces ser liberado de las perlas. Téngase en cuenta que la etapa de preparación de extremos romos 105 y la etapa de fosforilación 110 se pueden combinar fácilmente. Por ejemplo, en el kit de preparación de la muestra de ADN emparejado ILLUMINA®, y el juego de reactivos de preparación de la muestra de ADN de NEBNEXT®, y otros kits disponibles en el mercado, los reactivos de preparación de extremos romos y de fosforilación se combinan habitualmente. La purificación de ácidos nucleicos para las etapas combinadas se puede lograr utilizando un protocolo de lavado de gotitas de fusión-y-división basado en perlas como se describe para las etapas individuales. Téngase en cuenta también que, si la etapa de extremos romos 105 y la etapa de fosforilación 110 están separadas, no es necesario realizar una etapa de lavado entre ellas. Una gotita que comprende los reactivos de preparación de extremos romos se puede dispensar y fusionar, usando operaciones de gotitas, con la gotita de la muestra; a continuación, una gotita que comprende las enzimas de fosforilación puede ser dispensada y fusionada, mediante operaciones de gotitas, con la gotita incluyendo la muestra y los reactivos de preparación de extremos romos. El ácido nucleico en la gotita producido de esta manera puede entonces ser capturado y purificado como se describe en el presente documento.

En una etapa de producción de colas-A 115, puede utilizarse la exo-ADN polimerasa (3 '→ 5') de Klenow para añadir A-colas en ambos extremos de los fragmentos de ácido nucleico de extremos romos fosforilados. La reacción se produce preferiblemente a aproximadamente 37°C. En presencia de dATP, la exo-ADN polimerasa I (3 '→ 5') de Klenow cataliza adiciones 3' de no plantilla. En el accionador de gotitas, esta etapa puede llevarse a cabo mediante el uso de operaciones de gotitas para dispensar una gotita que comprende reactivos de preparación de colas-A y fusionar aquella gotita con una gotita que comprenda el ácido nucleico fosforilado producido en la etapa 110. En el accionador de gotitas, esta reacción puede llevarse a cabo a temperaturas tan bajas como la temperatura ambiente

o tan altas como 37°C o más en algunos casos. Después de la reacción de preparación de colas-A, la DNA polimerasa de Klenow I puede ser inactivada, por ejemplo, inactivando químicamente mediante la realización de operaciones de gotitas para fusionar la gotita de la reacción con una gotita que comprenda un reactivo de inactivación, o inactivando por calor mediante la incubación de la gotita de reacción a una temperatura y duración seleccionada para conseguir la activación deseada. La temperatura es típicamente elevada por encima de la temperatura ambiente, por ejemplo, de aproximadamente 35 a aproximadamente 75°C durante aproximadamente 20 a aproximadamente 60 minutos. Alternativamente, el ácido nucleico puede ser purificado y la enzima eliminada usando un protocolo de lavado basado en perlas en el que el ácido nucleico puede ser capturado en perlas que se someten al protocolo de lavado.

En la etapa de ligación del adaptador 120, se puede utilizar la ligasa DNA T4 para acoplar los adaptadores de ácido nucleico a los fragmentos de ácido nucleico de colas-A. La ligasa ADN T4 cataliza la formación de un enlace fosfato entre los extremos terminales cohesivos que presentan un extremo 5'-fosfato y 3'-hidroxilo yuxtapuestos en el ácido nucleico dúplex. La reacción puede, por ejemplo, producirse a una temperatura y durante un tiempo seleccionado para conseguir el acoplamiento del adaptador deseado, por ejemplo, a aproximadamente 20°C durante aproximadamente 30 minutos. En el accionador de gotitas, esta etapa puede llevarse a cabo mediante el uso de operaciones de gotitas para dispensar una gotita que comprende los adaptadores y los reactivos de ligación y fusionar aquella gotita con una gotita que comprenda el ácido nucleico de colas-A producido por la etapa 115. Después de la ligación, el ácido nucleico se puede purificar (por ejemplo, usando un protocolo de lavado basado en perlas) para eliminar los adaptadores no incorporados que interferirán con las posteriores etapas de amplificación de PCR. En el accionador de gotitas, esta etapa de lavado puede llevarse a cabo mediante la captura del ácido nucleico en perlas y la realización de un protocolo de lavado basado en gotitas, como se describe en el presente documento. El ácido nucleico puede entonces ser liberado de las perlas. En ciertas realizaciones, la relación de adaptador a ácido nucleico es mayor que aproximadamente 10:1, o mayor de aproximadamente 15:1, o mayor de aproximadamente 20:1, o mayor de aproximadamente 25:1, o mayor de aproximadamente 30:1 molar o superior. En aún otra realización, la relación de adaptador y ácidos nucleicos es de aproximadamente 1:1 a aproximadamente

10:1. El ácido nucleico liberado puede entonces ser amplificado utilizando cualquier técnica de amplificación de ácidos nucleicos. La amplificación puede llevarse a cabo en el accionador de gotitas, por ejemplo, usando un proceso de ciclo térmico de flujo continuo, o el ácido nucleico puede ser retirado del accionador de gotitas para la amplificación en un dispositivo separado. Sin embargo, en un aspecto, los solicitantes han descubierto que los procesos de la invención proporcionan un rendimiento que es mucho mayor que el proceso típico de construcción de bibliotecas. En consecuencia, en ciertas realizaciones, los métodos de la invención proporcionan la secuenciación de la biblioteca de ácidos nucleicos después de la construcción de la biblioteca sin una etapa de amplificación intermedia. En ciertas realizaciones, los métodos proporcionan la secuenciación de la biblioteca de ácidos nucleicos

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Tabla 1. Protocolo de banco de 3 etapas de la construcción de bibliotecas de extremos emparejados

Preparación de extremos romos: Preparación de colas-A Ligación del adaptador

Tampón de preparación de extremos romos 10X: 2,5 µL Tampón 10X 5 µL Tampón 2X 50 µL

dNTP 1 mM: 2,5 µL dATP 1 mM 1,65 µL 50 µM cada mezcla de adaptador P1 & P2 3 µL

Mezcla de enzimas de preparación de extremos romos: 1 µL Mezcla Klenow (3'-5' exo) 1 µL Mezcla de ADN ligasa rápida 5 µL

Agua: 9 µL Agua 2,35 µL Agua 2 µL

ADNg: 10 µL ADN de extremos romos 40 µL ADN de colas-A 40 µL

Incubado a 25°C durante 30 min Limpiado con perlas CHARGESWITCH® Eluido en 40 μL de tampón de elución: Incubado a aproximadamente 37°C durante 30 min Limpiado con perlas CHARGESWITCH® Eluido en 40 μL de tampón de elución Incubado a 25 °C durante 5 min Limpiado con perlas CHARGESWITCH® Eluido en 40 μL de tampón de elución

Otro ejemplo de un protocolo de construcción de la biblioteca de fragmentos de ácido nucleico es un protocolo de transposición in vitro a alta densidad. En el protocolo de transposición, se puede utilizar un derivado hiperactivo de la transposasa Tn5 para catalizar la integración de oligonucleótidos sintéticos (es decir, transposones manipulados genéticamente) en ADN diana a una alta densidad. En este ejemplo, se puede utilizar una transposasa, tal como la tecnología de Nextera Transposome™, para generar roturas de ADN bicatenario aleatorias. El complejo Transposome™ incluye extremos de transposón libres y una transposasa. Cuando se incuba este complejo con ADN de doble cadena, el ADN está fragmentado y la cadena transferida del oligonucleótido del extremo del transposón se une covalentemente al extremo 5' del fragmento de ADN. En algunas aplicaciones específicas de plataforma (por ejemplo, plataforma de secuenciación de Illumina), los extremos de transposones podrán ser completados con sitios de los cebadores de secuenciación. Mediante la variación del tampón y de las condiciones de reacción (por ejemplo, la concentración de complejos de Transposome™), puede ser controlada la distribución de tamaños de la biblioteca de ADN fragmentado y marcado. La tecnología Nextera puede ser utilizada para generar bibliotecas di-marcadas, con codificación de barras opcional, compatible con las plataformas de secuenciación, tales como las plataformas de secuenciación de Roche/454 o Illumina/Solexa.

Un protocolo de microfluidos digital para la construcción de bibliotecas de catalizada por transposasa puede incluir, pero no se limita a, las siguientes etapas: el ácido nucleico puede ser fragmentado y marcado utilizando un complejo de la enzima transposasa que incluya transposasa y extremos del transposón libre (por ejemplo, el complejo Transposome™ de Nextera). En algunas aplicaciones específicas de plataforma (por ejemplo, la plataforma de secuenciación Illumina), los extremos de transposones podrán ser completados con sitios de los cebadores de secuenciación. La integración del transposón y la transferencia de cadena se producen a través de una ruptura escalonada, dentro del ADN de doble cadena del ácido nucleico diana. El ácido nucleico diana puede ser marcado en el extremo 5' con la secuencia del transposón. La reacción tiene lugar preferiblemente a 55°C. En un accionador de gotitas, esta etapa puede llevarse a cabo mediante el uso de operaciones de gotitas para dispensar y combinar una gotita de muestra y una gotita que comprenda los reactivos de la enzima transposasa y el tampón de reacción. Los reactivos de la enzima transposasa se pueden seleccionar para aplicaciones específicas de la plataforma (por ejemplo, la mezcla de enzimas de Nextera™ para las bibliotecas compatibles con Illumina; mezcla de enzimas de Nextera™ para bibliotecas compatibles 454 de Roche). Después de la fragmentación y el marcaje, el ácido nucleico se puede purificar (por ejemplo, mediante un protocolo de lavado basado en perlas) para eliminar la enzima y los reactivos que puedan interferir con las etapas siguientes. En el accionador de gotitas, esta etapa de lavado puede llevarse a cabo mediante la captura del ácido nucleico en perlas y la realización de un protocolo de lavado basado en gotitas, como se describe en el presente documento. El ácido nucleico puede entonces ser liberado de las perlas.

Puede ser utilizada la supresión PCR con una reacción de cuatro cebadores para agregar adaptadores de oligonucleótidos específicos de la plataforma y códigos de barras opcionales a los ácidos nucleicos fragmentados y marcados. La biblioteca di-marcada resultante puede ser enriquecida para fragmentos que contienen ambos marcadores. En un ejemplo, la supresión PCR con una reacción de cuatro cebadores puede utilizarse para añadir

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estándar, 300 ng de muestra de entrada, 150 ng de MRSA estándar, y 1000 ng de muestra de entrada. El análisis en gel se realizó utilizando el software Image J para determinar la salida de la biblioteca.

Tabla 2. Rendimiento calculado del análisis en gel: imagen17

MRSA de entrada (ng): Salida de la biblioteca (ng)

1000: 643,6

300: 134,6

100: 48,1

30: 21,4

10: 5,6

El experimento se repitió 7 veces más en 7 accionadores de gotitas separadas. La Figura 3 muestra una gráfica del rendimiento calculado a partir del análisis en gel de agarosa de 7 carreras adicionales del protocolo de construcción de la biblioteca en el accionador usando 10, 30, 100, 300 ó 1000 ng de ADN de MRSA de 278 pb. Los datos en la Figura 3 se resumen en la Tabla 3.

Tabla 3. Rendimiento calculado de 7 amplificaciones de biblioteca adicionales: imagen18

Entrada (ng): Salida promedio (ng) Dev Std Rendimiento (%)

1000: 320 97 32,0

300: 56 14 18,7

100: 34 10 33,6

30: 8 4 27,4

10: 3 1 27,6

Los protocolos de manipulación de gotitas, de la bioquímica de reacción y otros parámetros del sistema pueden ser

10 seleccionados además para mejorar el rendimiento del protocolo de construcción de la biblioteca de microfluidos digital automatizada. La selección de las condiciones de la reacción bioquímica pueden, por ejemplo, ser facilitadas mediante la evaluación del rendimiento de cada etapa de reacción.

En una realización, la recuperación cuantitativa o el rendimiento de ADN después de cada etapa del protocolo se puede medir en el accionador usando fosfato radiactivo incorporado o un marcador fluorescente unido al nucleótido 15 incorporado. Por ejemplo, en la etapa de preparación de extremos romos (en referencia al protocolo de la Figura 1), la T4 polinucleótido quinasa se une a un fosfato al extremo 5'-hidroxilo del ADN de extremos romos. Mediante el uso de ATP radiomarcado (γ-32P ATP) en el tampón de reacción de la quinasa, el fosfato terminal unido al ADN de extremos romos será radiomarcado y puede ser controlado fácilmente. Del mismo modo, la γ-fosfato en el dATP puede ser radio-marcada para el seguimiento de la etapa de producción de colas-A. Todos los nucleótidos en la

20 secuencia del adaptador pueden ser radio-marcados en su α-fosfato y la etapa de ligación del adaptador se puede monitorizar cuantitativamente con alta sensibilidad.

En otra realización, la calidad de la secuencia ligada al adaptador (por ejemplo, sin degradación), el sesgo (por ejemplo, el tamaño del inserto, el contenido de GC), y la reproducibilidad pueden ser evaluadas. En este ejemplo, la construcción de bibliotecas se puede realizar utilizando amplicones de ADN de diferentes tamaños y el contenido de 25 GC. La calidad de la secuencia ligada al adaptador se puede evaluar mediante la recopilación de los fragmentos procesados y la evaluación de las secuencias de ADN utilizando un secuenciador comercial. El proceso de construcción de la biblioteca se puede evaluar para medir la reproducibilidad mediante la realización del protocolo

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sobre la misma muestra de ADN en múltiples ocasiones. La variabilidad entre los diferentes depósitos en el accionador de gotitas puede ser evaluada mediante la carga de la misma muestra de ADN en diferentes depósitos en el accionador.

Pueden ser seleccionados los parámetros de operación de los microfluidos digitales, tales como el tiempo de

5 incubación, el número de ciclos de lavado, la velocidad del transporte de gotitas y los volúmenes de reactivo de carga por cualquier experto en la técnica en vista de la presente descripción. Debido a que las escalas de longitud de mezcla y la relación del volumen a la superficie son más pequeñas en un sistema digital de gotitas de microfluidos en comparación con un sistema de banco, se puede reducir sustancialmente el tiempo de incubación en el sistema de la gotita. Un tiempo de incubación sustancialmente reducido para reacciones enzimáticas combinadas

10 con un protocolo automatizado (es decir, menos tiempo manual) puede reducir el tiempo total del proceso de construcción de la biblioteca.

7.2 Purificación de ácidos nucleicos

Los protocolos para la construcción de la biblioteca en un accionador de gotitas pueden incluir las etapas de purificación del ácido nucleico basado en perlas. Las perlas pueden ser magnéticamente sensibles o no ser

15 sustancialmente magnéticamente sensibles. En una realización, cualquiera de las etapas enzimáticas descritas en este documento puede ir seguida de una etapa de purificación del ácido nucleico basado en perlas. Las etapas de purificación de ácidos nucleicos y de limpieza son a menudo las etapas limitantes del rendimiento en un protocolo de construcción de biblioteca.

En un ejemplo, pueden ser utilizadas perlas que cambian la carga, tales como las perlas de limpieza PCR

20 CHARGESWITCH® (disponible de Invitrogen Life Technologies). Las perlas de limpieza PCR CHARGESWITCH® son perlas paramagnéticamente sensibles que pueden capturar el ácido nucleico típicamente de 90 pb hasta 4 kpb a pH 5, y liberar el ácido nucleico capturado a pH 8. En un ejemplo, el uso de perlas de CHARGESWITCH® en las etapas de limpieza de un protocolo de construcción de la biblioteca de microfluidos digital puede ser seleccionado por el ajuste de la capacidad de tamponamiento y el pH del tampón de elución se utiliza para eluir el ADN unido de

25 las perlas. Las Tablas 4 y 5 muestran los efectos de la composición del tampón de elución y el número de lavados en tanto por ciento de recuperación del ácido nucleico. El pH de los tampones se ajustó usando HCl 12 M.

Tabla 4. Condiciones de elución y % de recuperación en el protocolo de construcción de la biblioteca del extremo emparejado (recuperación en el accionador vs. en el banco)

Condiciones de elución: Dilución Cantidad de entrada a la PCR si el rendimiento es el 100% Cantidad real recuperada del accionador % Recuperado en el accionador Cantidad real recuperada de la reelución del banco % Recuperación en banco

Tris 10 mM, pH 8,5, 2 lavados de 55 C: 100X 240 pg 618 fg 0,3% 300 pg 125%

10.000X: 2,4 pg 10 fg 0,4% 3,8 pg 158%

100.000X: 240 fg 12 ag <0,1% N/A N/A

Tris 100 mM, pH 9,5, 2 lavados de 55 C: 100X 240 pg 1900 fg 0,8% 370 pg 154%

10.000X: 2,4 pg 40 fg 1,7% 4,1 pg 171%

100.000X: 240 fg N/A N/A N/A N/A

Tris 100 mM, pH 9,5, 6 lavados de 55 C: 100X 240 pg N/A N/A 480 fg 0,2%

10.000X: 2,4 pg 2,9 pg 120% 5,6 fg 0,2%

100.000X: 240 fg 369 fg 153% N/A N/A

Tris 10 mM,: 100X 240 pg 1200 fg 0,5% N/A N/A

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pH 9,5, 6 lavados de 55 C: 10.000X 2,4 pg 16 fg 0,7% 1,07 pg 45%

100.000X: 240 fg 13 ag <0,1% N/A N/A

Tris 50 mM, pH 9,0, 6 lavados de 55 C: 100X 240 pg N/A N/A 15 pg 6,3%

10.000X: 2,4 pg 6 pg 250% 64 fg 2,7%

100.000X: 240 fg 510 fg 212% N/A N/A

Tabla 5. Optimización de las condiciones de elución en el protocolo de construcción de la biblioteca de extremos emparejados

Condiciones de elución: Dilución Cantidad de entrada a la PCR si el rendimiento es el 100% Cantidad real recuperada del accionador % Recuperado en el accionador Cantidad calculada % de 48 ng

Tris 10 mM, pH 8,5, 2 lavados de 55 C: 100X 240 pg 618 fg 0,3% 30,4 ng 63%

10.000X: 2,4 pg 10 fg 0,4% 38,2 ng 80%

100.000X: 240 fg 12 ag <0,1% N/A N/A

Tris 100 mM, pH 9,5, 2 lavados de 55 C: 100X 240 pg 1900 fg 0,8% 37 ng 77%

10.000X: 2,4 pg 40 fg 1,7% 41,3 ng 86%

100.000X: 240 fg N/A N/A N/A N/A

Tris 100 mM, pH 9,5, 6 lavados de 55 C: 100X 240 pg N/A N/A 48 pg 0,1%

10.000X: 2,4 pg 2,9 pg 120% 56 pg 0,1%

100.000X: 240 fg 369 fg 153% N/A N/A

Tris 10 mM, pH 9,5, 6 lavados de 55 C: 100X 240 pg 1200 fg 0,5% N/A N/A

10.000X: 2,4 pg 16 fg 0,7% 107 ng 223%

100.000X: 240 fg 13 ag <0,1% N/A N/A

Tris 50 mM, pH 9,0, 6 lavados de 55 C: 100X 240 pg N/A N/A 1,5 ng 3,1%

10.000X: 2,4 pg 6 pg 250% 64 fg 1,3%

100.000X: 240 fg 510 fg 212% N/A N/A

El protocolo de microfluidos digital que se utiliza para evaluar la química del tampón de elución y el número de lavados incluye las siguientes etapas llevadas a cabo utilizando las operaciones de gotitas mediadas por electrohumectación en un hueco de operaciones de gotitas de un accionador de gotitas: Una gotita de∼350 nL que contenía un dsDNA de MRSA de 278 pb (138 ng/µL) se combinó usando operaciones de gotitas con una gotita de∼350 nL que contenía perlas de CHARGESWITCH® (25 mg/ml) en tampón de unión (pH 5) para producir una gotitade∼700 nL. Después de una incubación de 1 minuto a temperatura ambiente, la gotita de ∼700 nL se combinó con

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una gotita de tampón de lavado de ∼700 nL, las perlas se inmovilizaron utilizando un imán y la gotita se dividió para producir una gotita que contenía perlas y una gotita de sobrenadante. Después se llevaron a cabo varios ciclos de lavado (2 ó 6 ciclos), las perlas CHARGESWITCH® se volvieron a suspender en una gotita de tampón de lavado de∼350 nL. A continuación, la gotita que contenía la perla se combinó con una gotita de tampón de elución de ∼350 nL para producir una gotita de elución de 700 nL. Después de una incubación de 2 minutos, las perlas CHARGESWITCH® se inmovilizaron dentro del campo magnético de un imán permanente y la gotita de elución de∼700 nL fue transportada lejos de las perlas en un depósito en el accionador. Lagotita deeluciónde ∼700 nL se recuperó desde el depósito y se ajustó a 10 µL de volumen con agua. Si la recuperación de ADN era del 100%, entonces debía haber 4,8 pg de entrada de ADN para el ensayo qPCR. Las perlas CHARGESWITCH® se recuperaron del accionador de gotitas y se llevó a cabo otra elución usando 20 µL de tampón de elución en el banco para eluir cualquier ADN no eluido en el accionador de gotitas. Un ensayo de PCR cuantitativa (qPCR) se realizó para estimar la recuperación del ADN. Las muestras se diluyeron 100X, 10.000X y 100.000X. Cinco µL de cada muestra se analizó en un ensayo de qPCR de 50 µL. Las muestras se analizaron frente a una curva estándar para los 278 amplicones de MRSA. Si la eficiencia de recuperación del ADN era del 100%, entonces la entrada de ADN en el ensayo qPCR debía ser 240 pg, 2,4 pg y 240 fg (100X, 10.000X y 100.000X diluciones, respectivamente).

La Figura 4 muestra un gráfico 400 de una comparación de la aplicación en banco y en el accionador de gotitas de las etapas de elución y de limpieza del ácido nucleico. Las condiciones de elución se utilizaron en un protocolo completo de construcción de la biblioteca del extremo emparejado que se realiza en el banco y en el accionador de gotitas. Los datos muestran que en el banco y en el accionador de gotitas la elución es comparable.

Las figuras de 5A a 5M ilustran vistas superiores de un ejemplo de una parte de una disposición de electrodos 500 de un accionador de gotitas y muestran un proceso de preparación de ácidos nucleicos para la construcción de una biblioteca. El método de las figuras de 5A a 5M es un ejemplo de un protocolo de construcción de la biblioteca en el que el ácido nucleico se inmoviliza en perlas magnéticamente sensibles y se utilizan un imán móvil y una serie de operaciones de fusión y de división para purificar el ácido nucleico entre cada etapa en el protocolo de construcción de la biblioteca.

La disposición de electrodos 500 puede incluir una disposición de electrodos de operaciones de gotitas 510 (por ejemplo, mediante electrodos de electrohumectación). Las operaciones de las gotitas se llevan a cabo mediante los electrodos de operaciones de gotitas 510 sobre una superficie de operaciones de gotitas o en un hueco de operaciones de gotitas. Una zona de inmovilización de perlas 512 puede estar asociada con la disposición de electrodos 500. Un imán móvil 514 puede estar alineado con y moverse dentro y fuera de la zona de inmovilización de la perla 512. El imán 514 se puede usar para retener a las perlas magnéticamente sensibles durante las operaciones de gotitas. En particular, el imán 514 puede estar dispuesto de tal manera que al menos uno de los electrodos de operaciones de gotitas 510 y, opcionalmente, otros electrodos, están dentro del campo magnético. El imán 514 puede, por ejemplo, ser un imán permanente o un electroimán.

La gotita de muestra 516 puede ser transportada usando operaciones de gotitas a lo largo de los electrodos de operaciones de gotitas 510. La gotita de muestra 516 puede ser, por ejemplo, una gotita 2X, lo que significa que su presencia en el hueco de operaciones de gotitas es de aproximadamente 2 veces el área de un electrodo de operaciones de gotitas 510. La gotita de muestra 516 puede contener el ácido nucleico 518 a procesarse para la construcción de una biblioteca de ácidos nucleicos. En una realización, una muestra de ácido nucleico puede ser cortada, y el ácido nucleico cortado puede ser cargado en el hueco de operaciones de gotitas de un accionador de gotitas. Los ácidos nucleicos pueden, por ejemplo, ser fragmentados al azar por cizallamiento hidrodinámico o fuerzas mecánicas o ser fragmentados por digestión enzimática. En otra realización, una muestra de ácido nucleico, tal como el ácido nucleico, puede ser fragmentada al azar en un accionador de gotitas. En un ejemplo, se puede utilizar una corriente de baja frecuencia para agitar una gotita de muestra de tal manera que el ácido nucleico dentro de la gotita se cizalle. En otro ejemplo, una gotita puede ser expandida y contraída alternativamente para crear patrones de fluidos dentro de la gotita que sean suficientes para cizallar los ácidos nucleicos En otro ejemplo, la aplicación de una corriente de baja frecuencia y la expansión y contracción alternante de una gotita se puede utilizar para cizallar a los ácidos nucleicos. El cizallamiento en el accionador de ácidos nucleicos puede ser controlado para dar fragmentos de un intervalo de tamaños predecible. El ácido nucleico cizallado 518 puede ser de un tamaño seleccionado antes de la elaboración de la construcción de una biblioteca de fragmentos de ácido nucleico. En un ejemplo, el ácido nucleico cizallado 518 se puede separar por electroforesis en gel. Un ejemplo de un proceso de preparación de cizallado de ácido nucleico para la construcción de una biblioteca en un accionador de gotitas puede incluir, pero no se limita a, las siguientes etapas.

La figura 5 muestra una muestra de gotita 516 que se coloca en el camino del electrodo 510 lejos de la zona de inmovilización de las perlas 512 y el imán 514. El imán 514 puede, por ejemplo, estar situado en un instrumento en el que se monta el accionador de gotitas, montado en el propio accionador de gotitas, situado en el hueco de operaciones de las gotitas, o en cualquier otra posición que permita la inmovilización de las perlas en la gotita durante la ejecución de un protocolo de lavado de perlas de gotitas tal como se describe en el presente documento. Las figuras 5B y 5C muestran un proceso de incubación en el que la gotita de reactivo 520 se fusiona usando operaciones de gotitas con la gotita de muestra 516. Como se ilustra, la gotita de reactivo 520 es una gotita 1X (por ejemplo, de aproximadamente 250 a aproximadamente 500 nL), lo que significa que su presencia es aproximadamente el área de un electrodo de operaciones de gotitas 510. En la Figura 5C, la gotita de la muestra

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Tabla 6. Ejemplo de carga de volúmenes y gotitas para los depósitos del accionador de gotitas 1300

Depósito: Volumen de Carga de Reactivo (µL) Número de Gotitas Requeridas (en términos de 1X) Volumen Total de Gotitas (µL)

1316A: Enzima de Preparación de Extremos Romos: 50 µL 5 (un 1X por carril) aproximadamente 2 µL

1316B: Perlas: 100 µL 60 (seis 2X por carril) aproximadamente 20 µL

1316C: Enzima para la Preparación de Colas-A: 50 µL 5 (un 1X por carril) aproximadamente 2 µL

1316D: Ligasa: 50 µL 5 (un 1X por carril) aproximadamente 2 µL

1317A: Tampón de Elución: 165 µL 40 (ocho 1X por carril) aproximadamente 14 µL

1317B,1317C, 1317D, 1317E: Etanol al 70%: 165 µL cada uno 120 (doce 2X por carril) aproximadamente 40 µL

de 1318G a 1318L: ADN en perlas: 20 µL cada uno 10 cada uno (cinco 2X por carril) aproximadamente 3,3 µL

de 1320G a 1320L: 10x adaptadores de ADN: 1,5 µL cada uno 1 cada uno (un 1X por carril) aproximadamente 330 µL

La Figura 14 ilustra una vista superior de un ejemplo del sustrato inferior 1310 del accionador de gotitas 1300 de las Figuras 13A y 13B, que tiene una disposición de electrodos 1314 conformada sobre la misma. En este ejemplo, los electrodos de dispensación de reactivo están colocados en una parte central de la disposición de electrodos 1314, flanqueada a cada lado por un conjunto de 6 electrodos de dispensación de entrada de muestra y un conjunto de 6 electrodos de procesamiento de la muestra.

La disposición de electrodos 1314 incluye múltiples electrodos de dispensación. Por ejemplo, la disposición de electrodos 1314 puede incluir uno o más electrodos de dispensación de reactivo 1410, por ejemplo, 9 electrodos de dispensación de reactivo 1410, para la dispensación de diferentes fluidos de reactivo (por ejemplo, reactivos para la preparación de extremos romos, reactivos para la preparación de colas-A, reactivos de ligación del adaptador, soluciones de perlas, tampón de lavado, tampón de elución). La disposición de electrodos 1314 también puede incluir uno o más electrodos de dispensación de entrada de la muestra 1412 para dispensar fluidos de muestra (por ejemplo, dos filas (o columnas) de 6 electrodos de dispensación de entrada de la muestra 1412 para dispensar el ácido nucleico). La disposición de electrodos 1314 también puede incluir uno o más electrodos de dispensación del adaptador 1414 para dispensar marcadores de adaptador-código de barras (por ejemplo, dos filas (o columnas) de 6 electrodos de dispensación de adaptador 1414).

La disposición de electrodos 1314 también puede incluir múltiples electrodos de recogida. Por ejemplo, la disposición de electrodos 1314 puede incluir uno o más electrodos de recogida de salida de muestra 1416 para recibir fluidos de muestra procesados (por ejemplo, dos filas (o columnas) de 6 electrodos de recogida de salida de muestra 1416 para recibir gotitas de ácido nucleico transformadas). La disposición de electrodos 1314 también puede incluir uno o más electrodos de recogida de residuos 1418 para la recogida de fluidos de residuos (por ejemplo, los electrodos de recogida de residuos 1418a y 1418b). Los electrodos de dispensación de reactivo 1410, los electrodos de dispensación de la muestra 1412, los electrodos de dispensación del adaptador 1414, los electrodos de recogida de salida de muestra 1416 y los electrodos de recogida de residuos 1418 están sustancialmente alineados con los depósitos de fluido que se integran en el sustrato superior 1312 del accionador de gotitas 1300 de las Figuras 13A, 13B y 13C.

Los electrodos de dispensación de reactivos 1410, los electrodos de dispensación de entrada de muestra 1412, los electrodos de dispensación del adaptador 1414, los electrodos de recogida de salida de muestra 1416 y los electrodos de recogida de residuos 1418 están interconectados a través de una disposición de electrodos de gotitas de operaciones 1420 (por ejemplo, mediante electrodos de electrohumectación). Por ejemplo, una trayectoria de electrodos de operaciones de gotitas 1420 se extienden desde cada electrodo de dispensación de entrada de la muestra 1412 y su correspondiente electrodo de recogida de salida de la muestra 1416 forma carriles de electrodos específicos 1422, por ejemplo, 13 carriles de electrodos específicos 1422. Los carriles de electrodos específicos

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Claims

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