KR20030009389A - 유문동-유문-십이지장 운동성에 대한 글루카곤 유사펩티드-1 (7-36)의 효과 - Google Patents

유문동-유문-십이지장 운동성에 대한 글루카곤 유사펩티드-1 (7-36)의 효과 Download PDF

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Abstract

본 발명은 건강한 피검자 및 다양한 질환을 앓고 있는 환자에서, 약제 조성물과 관련된 부작용 없이 유문동-유문 운동성을 억제하는 효과적인 방법을 제공한다. GLP-1은 유문동-십이지장 운동성을 저하시키고, 위장관 질환, 예컨대, 설사, 수술후 덤핑 증후군 및 과민성 대장 증후군을 치료하거나 예방하고, 내시경 과정에서 예비투약시키는데 사용될 수 있다.

Description

유문동-유문-십이지장 운동성에 대한 글루카곤 유사 펩티드-1 (7-36)의 효과 {EFFECTS OF GLUCAGON-LIKE PEPTIDE-1 (7-36) ON ANTRO-PYLORO-DUODENAL MOTILITY}
발명의 배경
1. 발명의 분야
본 발명은 GLP-1을 사용하여 유문동-유문-십이지장 운동성을 억제하는 것 및, 내시경 동안 불쾌함을 완화하고 위장관 질환의 증상을 완화하기 위한 방법에 관한 것이다.
2. 관련 기술의 설명
글루카곤은 위십이지장 운동성의 가변적인 감소를 초래하기 위하여 널리 사용되어 왔다. 글루카곤의 효과는 용량 의존적인 것으로 보이며 최소 유효 용량은 0.5mg이다. 그러나, 글루카곤은 결장경 검사 평가를 용이하게 하지 않으며[참조: Norfleet, Gastrointest. Endosc., 24, 164-5, 1978], 2mg의 고용량에서는 유문동의 수축을 감소시키지 못한다[참조: Gregerson et al., Scand. J. Gastroenterol. 23 (Supp 152), 42-47 (1988)]. 또한, 글루카곤은 당뇨병 환자에서는 금기이고[참조: Paul & Freyschmidt, ROFO Rortschr. Geb. Rontgenstr. Nuklearmed, 125, 31-7 (1996)], 고가이며 그 효능이 의심받아 왔다.
글루카곤의 사용과 관련된 부작용은 오심 및 구토를 포함한다. 상기 효과는용량 의존적이며 1mg의 용량에서 나타날 수 있다[참조: Larsen et al., Scand. J. Gastroenterol, 21, 634-640, 1986; Gregersen et al., supra, Diamant Handbook Experimental Pharm, Lefevre ed., Vol. 66/2, 611-643, 1983]. 운동성을 충분히 감소시키는데 필요한 투여량은 종종 1mg을 초과하기 때문에, 글루카곤으로 인한 부작용은 흔한 것이다. 이러한 부작용은 환자를 극도로 불편하게 하고 종종 내시경 절차를 중단 또는 실패하게 만든다.
히요스카민 술페이트는 진경 활성을 가지며 과민성 대장 증후군의 치료에 사용되어 왔고 유해한 부작용도 가지고 있다[참조: Lahoti et al., Gastrointest. Endosc. 46, 139-142 (1997)]. 소마토스타틴 유사체인 오트레오사이드는 또한 신속한 해독 과정중의 임상적으로 심각한 설사 및 수술후 덤핑 증후군을 치료하는데 사용되어 왔고 효과가 있는 것으로 입증되었지만, 허용되지 않는 서맥의 발생과 관련이 있고, 부작용으로 인해 장기간 사용이 제한된다.
프로글루카곤 유래의 글루카곤 유사 펩티드-1 (7-36) 아미드 (GLP-1)은 소화관의 L-세포로부터 식후 방출되는 위장관 호르몬이다[참조: Goeke et al., Eur. J. Clin. Invest. 21, 135-44 (1991); Schirra et al., J. Clin. Invest. 97, 92-103 (1996)]. 사람에서의 종래의 연구에 의하면 합성 GLP-1은 액체 및 고체 음식물의 위배출(gastric emptying)을 실질적으로 지연시키는 것으로 나타났다[참조: Schirra et al., J. Endocrinol. 156, 177-86 (1998); Wettergren et al., Dig. Dis. Sci. 38, 665-673 (1993); Schirra et al., Proc. Assoc. Am. Physicians 109, 84-97 (1997)]. 유문동-유문-십이지장 영역의 운동성에 의해 조절되는 경유문 박동성 흐름이 위배출의 주된 메카니즘이다[참조: Malbert & Mathis, Gastroenterol. 107, 37-46 (1994); Anvari et al., J. Physiol. (London) 488, 193-202 (1995)]. 유문동 수축 및 특히 유문동-십이지장 협동 수축은 액체의 위배출 속도[참조: Schirra et al., J. Clin. Invest. 97, 92-103 (1996); Camilleri et al., Am J Physiol 249 G580-585 (1985); Houghton et al., Gastroenterol. 94, 1276-84 (1988)] 및 고체의 위배출 속도[참조: Fraser et al., Am. J. Physiol. 264, G195-201 (1993)]과 관련이 있는 것으로 나타났다. 유문에 의해 발생된 긴장성(tonic) 국소 상(phasic) 압력은 중요한 억제 메카니즘을 제공하여 위 배출을 감소시킨다[참조: Anvari et al., J. Physiol. (London) 488, 193-202 (1995); Heddle et al., Dig. Dis. Sci. 38, 856-69 (1993); Heddle et al., Gut 29, 1349-57 (1988); Tougas et al., Gut 33, 466-471 (1992)].
요약
따라서, 본 발명의 목적은 최소의 부작용을 작는 유효한 치료학적 조성물을 사용하여 유문동-십이지장 운동성을 억제하는 방법을 제공하는 것이다. GLP-1은 저혈당증을 초래하지 않는 것으로 잘 알려져 있으며, 본 출원에서 논의된 실험 동안 저혈당증을 초래하지 않았고 어떠한 다른 부작용도 초래하지 않았다. 따라서, GLP-1 분자 및 약제학적으로 적합한 부형제를 포함하는 제형 단위 또한 기재되어 있다.
관련된 특징으로, 본 발명은 또한 내시경 절차 이전 또는 도중에 GLP-1 분자를 투여하는 단계를 포함하는, 내시경 절차에서의 예비투약 방법을 포함한다.
본 발명의 다른 구체예는 치료적 유효량의 GLP-1 분자를 환자에게 투여하는 단계를 포함하는, 과민성 대장 증후군, 비감염성 급성 및 만성 설사 및 수술후 덤핑 증후군을 포함하지만 이에 한정되지 않는 위장관계 질환을 치료 또는 예방하는 방법이다.
추가로, 상기와 같이 GLP-1 분자를 투여함으로써 마약 금단증상과 관련된 증상을 치료 또는 예방하는 방법이 본 발명에 포함된다.
다른 구체예에서, 본 발명은 GLP-1 분자에 대한 안타고니스트의 치료적 유효량을 환자에게 투여하는 단계를 포함하는, 유문 운동성 억제를 필요로 하는 환자에서 유문 운동성을 억제하는 방법을 포함한다.
도면의 설명
도 1. 11명의 건강한 지원자에서 식염수 또는 지질(2.5kcal/min)의 십이지장 동시 관류 동안 식염수, GLP-1 (7-36) 아미드 0.4 및 1.2pmol/kg/min의 정맥내 주입에 반응하는 GLP-1의 혈장 면역반응성. 평균 ±SEM. 통계적 분석에 대해서는 표 3 참조.
도 2. 11명의 건강한 지원자에서 식염수(A) 또는 지질(2.5kcal/min, B)의 십이지장 동시 관류 동안, 식염수, GLP-1 (7-36) 아미드 0.4 및 1.2pmol/kg/min의 정맥내 주입에 반응하는 유문동 및 십이지장의 수축 빈도(상부 패널) 및 크기(하부 패널). 평균 ±SEM. 통계적 분석에 대해서는 표 1 참조.
도 3. 11명의 건강한 지원자에서 식염수(상부 패널) 또는 지질 (2.5kcal/min, 하부 패널)의 십이지장 동시 관류 동안, 식염수, GLP-1 (7-36) 아미드 0.4 및 1.2pmol/kg/min의 정맥내 주입에 반응하는 분리된 유문 압력 웨이브(A) 및 유문 긴장도 (B). 평균 ±SEM. *: 화살표로 표시한 시간 지점의 비교에 대해 p<0.05 (대응 t-검정). 추가의 통계적 분석에 대해서는 표 2 참조.
도 4. 11명의 건강한 지원자에서 식염수(상부 패널) 또는 지질 (2.5kcal/min, 하부 패널)의 십이지장 관류에 있어서 십이지장 제 III기형 활동성의 발생. 11명의 피검자중 7명에서 소화간 상태(interdigestive state)에서 저용량의 GLP-1의 시작 또는 식후 연구에서 십이지장 지질 관류의 시작 후 10분 내에 각각 활동성 프론트(activity front)가 나타났다. 흑색 막대의 길이는 수축 프론트(contraction front)의 길이를 나타낸다.
도 5. 식염수(A) 또는 지질 (2.5kcal/min, B)의 십이지장 관류 동안 GLP-1 0.4pmol/kg/min의 정맥내 주입 효과를 나타내는 압력계 기록. 소화간 상태(A)에서, GLP-1은 즉각적으로 유문동 십이지장 운동성을 억제하고, 기본 유문 압력의 지속적인 증가와 함께 IPPW의 단시간 지속되는 자극을 유도한다. 십이지장 지질 관류(B) 동안, 유문동 및 십이지장 수축성은 GLP-1에 의해 제거되며, 기본 유문 압력은 IPPW의 자극에 의한 유사한 지질 단독의 효과에 부가하여 추가로 증가된다.
도 6. 11명의 건강한 자원자에서 식염수 또는 지질(2.5 kcal/min)의 십이지장 동시 관류 동안, 혈장 글루코스(A) 및 글루카곤(B), 인슐린(C) 및 췌장 폴리펩티드(D)의 면역반응성에 대한 식염수, GLP-1(7-36)아미드 0.4 및 1.2 pmol·kg-1·min-1의 정맥내 주사의 영향.
상세한 설명
종래 인간에 대한 연구는 합성 GLP-1이 액체 및 고체 음식물의 위 배출을 실질적으로 지연시킨다는 것을 보여준다[참고문헌: Schirra et al., J. Endocrinol, 156, 177-86(1998); Wettergren et al., Dig. Dis. Sci. 38, 665-673(1993); Schirra et al., Proc Assoc Am Physicians 109, 84-97(1997)]. 이것의 인슐린분비(insulinotropic) 및 글루카곤안정(glucagonostatic) 작용 이외에, 위 배출속도의 감소는 건강한 피검자 및 당뇨병을 가진 환자에게서 GLP-1의 글루코스-저하 효과와 상당히 관련된다[참조: Schirra et al., J. Endoncrinol, 156, 177-86(1998); Schirra et al., Proc Assoc Am Physicians 109, 84-97(1997)]. 인접한 위에 의해 발생하는 강직성 압력에 독립적으로, 유문동-유문-십이지장 영역의 운동에 의해 조절되는 경유문 박동성 흐름은 위 배출의 주된 메카니즘이다[참조: Malbert & Mathis, Gastroenterol. 107, 37-46(1994); Anvari et al., J. Physiol. (London) 488, 193-202(1995)]. 전정 수축, 및 특히 유문동-십이지장 협동 수축은 액체의 위 배출 속도(Schirra et al., J. Clin. Invest. 97, 92-103(1996); Camilleri et al., Am J Physiol 249, G580-585(1985); Houghton et al., Gastroenterol. 94, 1276-84(1998)) 및 고체의 위 배출 속도(Fraser et al., Am. J. Physiol. 264, G195-201(1993))와 관련이 있는 것으로 나타났다. 유문에 의해 발생된 강직성 및 국부 상 압력의 증가는 위 배출을 감소시키는 중요한 제동 메카니즘을 제공한다[참조: Anvari et al., J. Physiol. (London) 488, 193-202 (1995); Heddle et al., Dig. Dis. Sci. 38, 856-69(1993); Heddle et al., Gut 29, 1349-57(1998); Tougaset al., Gut 33, 466-471(1992)].
본원은 합성 GLP-1의 경사 투여가 인간의 소화간 및 식후 상태 동안에 유문동-유문-십이지장 영역의 운동에 미치는 영향을 설명하며, 후자는 지질의 십이지장 관류를 통해 유도된다. 경구 음식 섭취 대신에 지질의 십이지장 관류가 사용되어 위 배출에 독립적으로 일정한 십이지장 영양분 부하를 제공한다. 이러한 특수한 식사는 안정한 식후 운동 형태를 수립하고, 혈장 글루코스 및 인슐린 가동역을 최소화 하기 위하여 선택되었다. 마지막으로, GLP-1의 효과를 유문 운동의 전통적 생리학적 자극제인 지질의 효과와 비교하였다.
GLP-1이 다양한 위장관 질환을 예방하거나 치료하는데 유용한 경제적인 치료학적 조성물을 제공하는 것을 발견하였다. 게다가, GLP-1은 내시경을 위한 예비투약 및 마약 금단현상의 치료에 사용될 수 있다. 기타 약제는 GLP-1과 동일한 유효성을 갖지 못하며, 종종 부작용을 수반한다. 그러한 부작용으로는 메스꺼움 및 구토가 있으며, 이것에 제한되지 않는다. 이러한 부작용은 GLP-1으로 치료된 환자에게서는 발견되지 않았다.
위 운동성의 평가
유문동-십이지장 활성의 억제는 당업자에게 공지된 방법을 사용하여 운동성을 기록하므로써 직접적으로 평가된다. 수축 결과는 컴퓨터 및 유효한 소프트웨어(Katschinski et al., Gastroenterol. 103, 383-91(1992)])로 분석되며, 10 mmHg 이상의 진폭을 갖고 2초 이상 지속되는 피크만이 진정 수축으로 간주되었다. 십이지장 제 Ⅲ기는 반구측으로 전파된 십이지장내에서 2분 이상 동안 ≥10/분의 주파수로 발생한 규칙적인 수축의 빈도로서 정의된다.
한 구체예에서, 데이타는 2개의 전정 및 3개의 십이지장 측공으로부터 각각 유도된 값을 요약(주파수, 운동지수) 또는 평균(진폭)하여 전정 및 십이지장에서 개별적으로 10분 단위로 분석하였다. 운동지수는 수축 동안의 영역으로서 확인되었고, mmHg·s·min-1로서 표현되었다. 전정 수축은, 압력 웨이브의 개시가 전정 측공 중 하나에서 기록된 후 5초내에 가장 인접한 십이지장 측공에서 기록된 압력파의 개시가 발생하는 경우 및 두 모든 압력 웨이브가 양자 모두 둘 사이의 모든 측공에서 기록되는 경우에 유문동-유문-십이지장으로 전파된 파장인 것으로 결정되었다.
본원에 사용된 유문동-유문-십이지장 운동의 "억제"는 운동지수의 감소를 의미한다. 운동성을 측정하는 다른 방법이 사용될 수 있다. 당업자는 운동성의 완전 억제를 포함하는 상당한 억제가 유용할 것이라는 것을 이해할 것이다. 유문 상태는 기본 상태로부터의 변화값로서 계산될 수 있으며, 기본 상태는 실험을 시작하기 전에 기저 기간 동안의 평균 유문 상태로서 결정된다.
GLP-1 분자
본원의 "GLP-1 분자"는 하기를 포함한다. 포유류 GLP 펩티드 및 글루카곤은 동일한 유전자에 의해 인코딩된다. 회장에서, 표현형은 2가지 주된 부류의 GLP 펩티드 호르몬, 즉 GLP-1 및 GLP-2로 처리된다. GLP-1(1-37)은 서열 His Asp Glu Phe Glu Arg His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu GlyGln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly (SEQ ID NO:1)을 포함한다. GLP-1(1-37)은 후-전사적으로 아미드화되어 GLP-1(1-36)NH2를 산출하며, 이것은 서열 His Asp Glu Phe Glu Arg His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg (NH2) (SEQ ID NO: 2)을 갖거나; 또는 효소적으로 처리되어 GLP-1(7-37)를 산출하며, 이것은 서열 His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly (SEQ ID NO: 3)을 갖는다. GLP-1(7-37)은 또한 아미드화되어 GLP-1(7-36)아미드를 산출하며, 이것은 GLP-1 분자의 자연형이고, 서열 His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg (NH2) (SEQ ID NO: 4)을 갖는다. 마찬가지로, GLP-1(1-36)(NH2)은 GLP-1(7-36)(NH2)로 처리될 수 있다.
장의 L세포는 GLP-1(7-37)(SEQ ID NO: 3) 및 GLP-1(7-36)NH2(SEQ ID NO: 4)를 1 대 5의 비율로 각각 분비한다. 이러한 GLP-1의 절단형은 원래 장소에서 짧은 반감기, 즉 10분 미만을 가지며, 아미노디펩티다아제 Ⅳ에 의해 불활성화 되어 Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly(SEQ ID NO: 5); 및 Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu ValLys Gly Arg(NH2)(SEQ ID NO: 6)를 각각 갖는다. 펩티드 Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly(SEQ ID NO: 5) 및 Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg (NH2) (SEQ ID NO: 6)는 간장의 글루코스 생산에 영향을 미치는 것으로 고려되었으나, 췌장으로부터의 인슐린의 생산 또는 방출을 자극하지는 않는다.
본원의 용어 "GLP-1 분자"는 GLP-1(1-37), GLP-1(1-36)NH2, GLP-1(7-37), GLP-1(7-36)NH2("GLP-1(7-36)아미드")(집합적으로 "GLP-1 펩티드"로 명명)을 포함한다. 본 발명은 재조합 사람 GLP-1 펩티드 뿐만 아니라 재조합이든 합성이든 다른 종으로부터 유래된 GLP-1 펩티드의 사용을 포함한다.
"GLP-1 분자"는 GLP-1 펩티드의 생물학적으로 활성인 변형체, 유사체 및 유도체를 나타낸다. "생물학적으로 활성인"이란 본원에서는 GLP-1(7-36) 생물학적 활성을 의미하며, 변형체의 활성은 본래의 GLP-1(7-36)아미드보다 적게 또는 크게 유효할 수 있다. GLP-1(7-36)아미드는 GLP-1의 본래 생물학적으로 활성적인 형태이다. [참조: Goeke & Byrne, Diabetic Medicine, 13, 854-860(1996)]. 본 발명의 GLP-1 분자는 GLP-1의 아고니스트, 즉 특히 인슐린 생산 β-세포에서 관찰되는 GLP-1 수용체 분자 및 이의 2차 메신저 활성의 활성제를 발현하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. β-세포의 아고니스트이기도 한 GLP-1 모방체(mimetic)는 예를 들어, GLP-1 수용체를 활성화하기 위하여 특이적으로 고안된 화학적 화합물을 포함한다.
GLP-1 분자의 생물학적 활성은 당업자에게 널리 공지된 바와 같이 체내 및 체외 동물 모델 및 인간 연구에 의해 측정될 수 있다. GLP-1 분자로는 GLP-1 수용체 예를 들어, GLP-1(7-36)아미드 수용체, 및 이의 2차 메신저 캐스케이드와 결합하거나 활성화시키는 펩티드, 펩티드 모방체 또는 다른 분자의 임의의 분자가 포함된다. GLP-1 수용체는 예를 들어, 인슐린-생산 췌장 β세포상에서 발견되는 세포-표면 단백질이다. GLP-1(7-36) 수용체는 당 기술 분야에서 그 특성이 규명되었다. 화학물질 또는 단백질이 GLP-1 수용체와 결합하거나 이를 활성화하는지 여부를 측정하는 방법은 당업자에게 공지되어 있고, 바람직하게는 복합적인 화학 라이브러리(chemical libraries)와 고처리량 스크리닝 기술(high throughput screening techniques)의 도움으로 수행된다. GLP-1 분자는 인슐린 분비 활성을 가지며, 특히 인슐린 생산 β세포상에서 GLP-1 수용체 분자 및 이의 2차 메신저 활성의 작용 물질인, 즉 이를 활성화시키는 종(species)을 포함한다.
GLP-1 생물학적 활성은 표준 방법, 일반적으로 세포 표면에 GLP-1 수용체를 발현하는 적절한 세포 예를 들어, RINmSF 세포 또는 INS-1 세포와 같은 인슐리노마 세포주를 제공하는 단계를 포함하는 수용체-결합 활성 스크리닝 방법에 의해 측정될 수 있다[참조: Mojsov, Int Pept Protein Res 40, 333-43, 1992 and EPO708170A2]. 또한, GLP-1 수용체를 발현하도록 조작된 세포가 사용될 수 있다. 방사면역측정법(radioimmunoassay)을 사용하여 트레이서와 막의 특이적 결합을 측정하고, 또한, cAMP 활성 또는 글루코스 의존 인슐린 생산을 측정할 수 있다. 한방법에서, 본 발명의 수용체를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 세포에 트랜스펙션시켜서 GLP-1 수용체 단백질을 생산하도록 한다. 이와 같이, 예를 들어, 상기 방법은 상기 세포를 화합물과 접촉시켜서 수용체 아고니스트를 스크리닝하고, 상기 화합물이 신호를 발생하는지, 즉 수용체를 활성화하는지 여부를 측정하는데 이용될 수 있다.
폴리클로날 및 모노클로날 항체는 본원에서 기술된 방법에서 사용되는 GLP-1 유사 펩티드를 검출하고, 정제하고, 동정하기 위하여 사용될 수 있다. ABGA1178과 같은 항체는 온전한, 프로세싱되지 않은 GLP-1(1-37) 또는 N-터미날-절단된 GLP-1(7-37) 또는 (7-36)아미드를 검출한다. 다른 항체는 전구 분자의 C-터미날의 맨 끝 부분에서 검출하고, 상기 방법은 감산에 의하여 생물학적으로 활성화된, 절단된 펩티드 예를 들어, GLP-1(7-37)아미드의 양을 계산할 수 있게 된다[참조: Orskov et al., Diabetes 42: 658-661, 1993; Orskov et al., J. Clin. Invest. 87: 415-423, 1991].
다른 스크리닝 기법은 수용체 활성화에 의해 유발된 세포외 pH 또는 이온 변화를 측정하는 시스템에서, GLP-1 수용체를 발현하는 세포 예를 들어, 트랜스펙션된 CHO 세포를 사용하는 것을 포함한다. 예를 들어, 잠재적인 아고니스트를 GLP-1 단백질 수용체를 발현하는 세포와 접촉시키고, 2차 메신저 반응 예를 들어, 신호 전달과정 또는 이온 또는 pH 변화를 측정하여, 잠재적인 아고니스트가 효과적인지를 측정할 수 있다.
GLP-1(7-36)아미드 수용체를 통해 활성을 나타내는 글루카곤-유사 펩티드의아고니스트는 설명되어 있다[참조: EP 0708179 A2; Hjorth et al., J. Biol. Chem. 269: 30121, 1994; Siegel et al., Amer. Diabetes Assoc. 57thScientific Session, Boston, 1997; Hareter et al., Amer. Diabetes Assoc. 57thScientific Session, Boston, 1997; Adelhorst et al., J. Biol. Chem. 269, 6275, 1994; Deacon et al., 16thInternational Diabtes Federation Congress Abstracts, Diabetologia Supplement, 1997; Irwin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94: 7915, 1997; Mojsov, Int. J. Peptide Protein Res. 40: 333, 1992; Goeke & Byrn, Diabetic Medicine 13; 854, 1996]. 최근의 공개 문헌은 블랙 위도우(Black Widow) GLP-1 및 Ser2GLP-1을 공개하고 있다[참조: Holz & Hakner, Comp. Biochem. Physiol., Part B 121; 177, 1998 및 Ritzel et al., J. Endocrinol 159: 93, 1998].
또한, "GLP-1 분자"는 본원에서 정의된 생물학적으로 활성적인 GLP-1 변이체를 발현하는 폴리뉴클레오티드에 의해 인코딩된 펩티드를 포함한다. 또한 본 발명은 GLP-1(7-36) 아미드와 비교하여 하나 이상의 아미노산 치환, 첨가 또는 결손을 함유하는 펩티드인 GLP-1 분자를 포함한다. 한 구체예에서, 치환, 결손 또는 첨가의 개수는 30 아미노산 이하, 25 아미노산 이하, 20 아미노산 이하, 15 아미노산 이하, 10 아미노산 이하, 5 아미노산 이하 또는 이들 사이의 임의의 정수이다. 본 발명의 한 양태에서, 치환은 하나 이상의 "보존적" 치환을 포함한다. "보존적" 치환은 아미노산 잔기를 생물학적 활성이 유사한 다른 잔기로 대체하는 것을 의미한다. 보존적 치환은 하나의 소수성 잔기 예를 들어, 이소루신, 발린, 루신 또는 메티오닌을 다른 하나로 대체하거나, 하나의 극성 잔기를 다른 하나로 대체 예를 들어, 아르기닌을 라이신으로, 글루타민산을 아스파르산으로, 또는 글루타민을 아스파라긴으로 대체하는 것 등을 포함한다. 하기 표는 보존적 아미노산 치환을 예시하나 이에 제한되지 않는다.
본래 잔기 치환체의 예
ALAARGASNASPCYSGLNGLUGLYHISILELEULYSMETPHESERTHRTRPTYRVALPRO SER, THRLYSHIS, SERGLU, ASNSERASN, HISASP, GLUALA, SERASN, GLNLEU, VAL, THRILE, VALARG, GLN, GLU, THRLEU, ILE, VALLEU, TYRTHR, ALA, ASNSER, ALAARG, SERPHEILE, LEU, ALAALA
또한, GLP-1 펩티드 변이체는 화학적으로 유도되고 변형된 상기 설명된 펩티드, 예를 들어 비천연 아미노산 잔기(예: 타우린 잔기, β- 및 γ-아미노산 잔기 및 D-아미노산 잔기)를 가지고, C-터미날 작용기 변형 예를 들어 아미드, 에스테르, 및 C-터미날 케톤 변형 및 N-터미날 작용기 변형 예를 들어 아실화된 아민, 쉬프 염기(schiff bases), 또는 예를 들어 아미노산 피로글루타민산에서 관찰되는 사이클화된 펩티드를 포함한다.
또한, 본 발명에는, (1) SEQ ID NOS: 1,2,3,4 및 (2) 이들의 절단된 서열과 50% 초과의 서열 동일성을 갖는 펩티드 서열 및 바람직하게는 90% 초과의 서열 동일성을 갖는 펩티드 서열이 포함된다. 본원에서 사용된 바와 같이, 서열 동일성은 당 기술분야에 널리 공지된 표준 알고리즘을 사용한 두 분자의 비교를 의미한다. 본 발명의 서열 둥일성을 계산하기 위한 바람직한 알고리즘은 스미스-워터맨 알고리즘(Smith-Waterman algorithm)이고, 여기서 SEQ ID NOS: 1이 길이에 걸쳐 폴리뉴클레오티드 상동물의 동일성에 대한 백분율을 규정하기 위한 대조 서열로 사용된다. 일치, 불일치, 및 삽입 또는 결손의 파라미터 값은 다른 것보다 생물학적으로 보다 실현가능한 결과를 산출하기 위한 일부 파라미터 값이 있으나, 임의적으로 선택된다. 스미스-워터맨 알고리즘을 위한 파라미터 값의 하나의 바람직한 세트는 일치된 잔기에 대해 1을, 불일치된 잔기(단일 뉴클레오티드 또는 단일 아미노산이 잔기)에 대해 -1/3을 사용하는 "최대 유사 시그먼트(maximum similarity segment)" 에 제시되어 있다[참조: Waterman, Bull. Math. Biol. 46: 473-500, 1984]. 삽입 및 결손(indel), x는 하기와 같이 웨이팅(weight)된다:
xk= 1 + k/3,
상기에서 k는 주어진 삽입 또는 결손(Id)된 잔기의 수이다.
예를 들어, 18 아미노산 치환체 및 3 아미노산의 삽입을 제외하고는, SEQ ID NO: 1의 42 아미노산 잔기 서열과 동일한 서열은 하기 식에 의해 주어진 백분율 동일성을 가진다:
[(1×42 일치)-(α×18 불일치) - (1+ 3/3 indel)]/42 = 81% 동일성
또한 본 발명의 "GLP-1 분자"에는 GLP-1과 상동성인 길라 기형 독액(Gila monster venom)의 6개의 펩티드가 포함된다. 이들의 서열을 표 I에서 GLP-1의 서열과 비교하였다.
펩티드(a,b,d,e,f 및 g)는 위치 1, 7, 11 및 18에서 상동이다. GLP-1과 엑센딘은 위치 4, 5, 6, 8, 9, 15, 22, 23, 25, 26 및 29에서 추가로 상동이다. 위치 2에서, A, S 및 G는 구조적으로 유사하다. 위치 3에서, 잔기 D 및 E (Asp 및 Glu)는 구조적으로 유사하다. 위치 22 및 23에서, F(Phe) 및 I(Ile)는 각각Y(Tyr) 및 L(Leu)와 구조적으로 유사하다. 마찬가지로, 위치 26에서, L 및 I는 구조적으로 동등하다. 따라서, GLP-1의 30개 잔기중에서, 엑센딘 3 및 4가 15개 위치에서 동일하고, 5개의 부가적 위치에서 동등하다. 급진적 구조 변화가 분명히 나타나는 위치는 잔기 16, 17, 19, 21, 24, 27, 28 및 30에서 뿐이었다. 또한, 엑센딘은 카르복실 말단에 9개의 추가 잔기를 지닌다.
본 발명의 GLP-1 분자는 고체상 화학적 펩티드 합성에 의해 제조될 수 있는 펩티드이다. 이러한 펩티드는 예를 들어 샘브룩(Sambrook)과 마니아티스(Maniatis)의 문헌에 기술된 표준 절차를 사용하는 통상적인 재조합 기술에 의해 또한 제조될 수 있다. 본원에 사용된 용어 "재조합(recombinant)"은 특정 유전자가 본원에 기술된 GLP-1 분자를 인코딩하는 폴리누클레오티드를 함유하도록 유전학적으로 변형된 재조합(예를 들어, 미생물 또는 포유류) 발현 시스템으로부터 유래됨을 의미한다.
GLP-1 유사 펩티드는 암모늄 술페이트 또는 에탄올 침전, 산 추출, 음이온 또는 양이온 교환 크로마토그래피, 포스포셀룰로스 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피, 수산화인회석 크로마토그래피 및 렉틴 크로마토그래피를 포함하지만 이들에 제한되지 않는 방법에 의해 재조합 세포 배양물로부터 회수되어 정제될 수 있다. 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)가 최종 정제 단계를 위해 사용될 수 있다.
본 발명의 GLP-1 분자 펩티드는 천연 정제된 생성물 또는 화학적 합성 방법의 생성물일 수 있거나, 원핵 또는 진핵 숙주로부터 (예를 들어, 배양액 중에서 또는 생체내에서 세균, 효모, 고등 식물, 곤충 및 포유류 세포에 의해) 재조합 기술에 의해 생성될 수 있다. 재조합식 제조 방법에서 사용되는 숙주에 따라, 본 발명의 폴리펩티드는 일반적으로 글리코실화되지 않지만, 글리코실화될 수도 있다.
본 발명의 특히 바람직한 GLP-1 분자는 GLP-1(7-36)아미드, 및 GLP-1(7-37) 및 엑센딘-4 이다.
펩티드 함량이 87.1%이고 펩티드 순도가 99%를 초과하는 합성 GLP-1(7-36)아미드는 구입되고 수득될 수 있다. 당 분야에 공지된 방법에 따르면, 상기 펩티드는 1% 인간 혈청 알부민에 용해되고, 0.2㎛ 니트로셀룰로스 필터를 통해 여과된 후, -70℃에서 저장될 수 있다 [13]. 샘플은 발열물질 및 세균 증식 표준 기술에 대해 시험된다.
특정한 메카니즘에 구속되지는 않지만, 본 발명은 GLP-1의 하기 운동 효과가 유문동-십이지장 운동성 감소의 중요한 매개인자임을 제시해준다: (i) 일반적인 전정 웨이브(antral wave)의 억제, (ii) 특수한 경유문(transpyloric) 전파된 전정 웨이브의 감소 및 (iii) 국소화된 위상성 및 긴장성 유문 수축의 동시 자극. 개(dog)의 경우, 유사한 운동 패턴이 합성 GLP-1이 주입된 칼로리가 없는 액상 음식물의 위 배출의 억제 및 경유문 흐름의 감소와 관련있는 것으로 입증되었다 [참조: Anvari et al., Dig. Dis. Sci. 43, 1133-40 (1998)]. 인간의 경우, 피하 주사된 GLP-1은 혼합된 액상 음식물의 위 배출 지체기(lag phase)의 연장에 대응하는 전정 및 유문동-십이지장 협동 수축을 용량 의존적으로 억제한다[참조: Schirra et al. Proc.Assoc.Am. Physicians 109, 84-97 (1997)]. 또한, 사람 실험으로부터 수득한 예비 데이터는 본 발명의 실험에서와 동일한 투여량을 사용하는 정맥내 GLP-1에 응답하는 근위 위(proximal stomach)의 강력한 이완을 나타낸다[참조: Wank et al., Gastroenterol. 114, A1190 (abstract)(1998)]. 따라서, 외인성 GLP-1은 구동력을 감소시키고 위 방수유출의 제동 메카니즘을 자극하여, 위 배출을 결정하는 것으로 알려진 모든 운동 부위에 강한 영향을 미친다.
제형 단위(dosage unit)의 포뮬레이팅
본 발명의 또 다른 구체예는 GLP-1 및 약제학적으로 적합한 부형제를 포함하는, 환자의 유문동-십이지장 운동성을 억제하는 데에 사용되는 제형 단위에 관한 것이다. 바람직하게는, 제형 단위는 약 0.4 내지 2.4 pmol·kg-1·min-1이다. 더욱 바람직하게는, 제형 단위는 약 0.8 내지 1.2 pmol·kg-1·min-1이다. 본 발명의 목적상, "약"이란 용어는 +/- 10%로서 규정된다. 예를 들어, 약 0.4 내지 2.4 pmol·kg-1·min-1은 0.196 내지 2.64 pmol·kg-1·min-1을 의미한다.
본 발명의 조성물은 경구 또는 비경구 투여에 의해 전신적 또는 국소적으로 사용될 수 있다. 대안적으로, 본 발명의 조성물은 정맥 주사 또는 피하 주사로서 적용될 수 있다. 의사 또는 환자에 의한 사용을 위해, 본 발명의 조성물은 일정량의 GLP-1 분자, 예를 들어 GLP-1(7-36)아미드를 단독으로 함유하거나 이를 또 다른 항운동성 작용제와 함께 함유하는 제형으로 제공될 수 있다. 이는 유문동-십이지장 운동성의 억제에 사용하는 것과 관련하여 1회 투여 또는 다회 투여의 경우 효과적일 것이다. 당업자에 의해 인식되는 바와 같이, 치료용 작용제의 유효량은 환자의 연령 및 체중, 환자의 신체 조건 및 그 밖의 인자를 포함하는 다수의 인자에 따라 달라질 것이다. 바람직하게는, GLP-1 분자는 정맥내 투여되고, 제형 단위는 약 0.4 내지 2.4 pmol·kg-1·min-1이다. 더욱 바람직하게는, 제형 단위는 약 0.8 내지 1.2 pmol·kg-1·min-1이다.
본 발명의 경구 투여용 고형 조성물로는 정제, 제제(preparation), 과립 등이 있다. 이러한 고형 조성물의 경우, 1종 이상의 활성 성분이 1종 이상의 비활성 희석제, 예를 들어 락토스, 만니톨, 글루코스, 히드록시프로필 셀룰로스, 미세결정질 셀룰로스, 전분, 폴리비닐 피롤리돈, 마그네슘 알루미네이트 메타실리케이트 등과 혼합될 수 있다. 일반적인 워크업(work-up)에 따르면, 본 발명의 조성물은 비활성 희석제 이외의 첨가제를 함유할 수 있으며, 이러한 첨가제로는 예를 들어 마그네슘 스테아레이트와 같은 윤활제, 섬유성 칼슘 글루코네이트와 같은 붕해제; 시클로덱스트린과 같은 안정제, 예를 들어 α,β- 또는 γ-시클로덱스트린; 디메틸-α-, 디메틸-β-, 트리메틸-β-, 또는 히드록시프로필-β-시클로덱스트린과 같은 에테르화 시클로덱스트린; 글루코실-, 말토실-시클로덱스트린과 같은 분지형 시클로덱스트린; 포르밀화 시클로덱스트린, 황 함유 시클로덱스트린; 인지질 등이 있다. 상기 시클로덱스트린이 사용되는 경우, 때때로 시클로덱스트린을 갖는 봉입체 화합물이 형성되어 안정성을 향상시킬 수 있다. 또한, 때때로 인지질이 리포솜을 형성하기 위해 사용됨으로써 안정성을 향상시킬 수 있다.
정제 또는 알약은 위 또는 장에서 가용성인 박막, 예컨대 당, 젤라틴, 히드록시프로필 셀룰로오스, 히드록시프로필메틸 셀룰로오스 프탈레이트로 코팅될 수 있다. 또한, 이들은 젤라틴과 같은 흡수될 수 있는 물질을 사용하여 캡슐로서 형성될 수 있다.
경구 투여를 위한 액체 조성물은 약제학적으로 허용되는 에멀션, 용액, 현탁액, 시럽, 엑릭서 뿐만 아니라 일반적으로 사용되는 불활성 희석제를 함유할 수 있다. 이러한 조성물은 불활성 희석제에 추가적으로 윤활제와 현탁제, 감미료, 향신료, 보존제, 용해제, 항산화제 등과 같은 애쥬번트을 함유할 수 있다. 상세한 첨가제들은 약제학 분야의 일반적인 임의의 교본에 기재된 것들로부터 선택될 수 있다. 이러한 액체 조성물은 연질 캡슐내에 직접 포함될 수 있다.
본 발명에 따른 비경구 투여를 위한 용액, 예컨대, 좌약, 관장제 등은 멸균된 수용액 또는 비-수용액, 현탁액, 에멀션, 계면활성제 등을 포함한다. 수용액 및 현탁액에는 예컨대, 증류수, 생리학적 식염수 및 링커액이 포함된다.
비-수용액 및 현탁액에는 예컨대, 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 지방산 트리글리세라이드, 올리브 오일과 같은 식물성 오일, 에탄올과 같은 알코올, 폴리소르베이트 등이 포함된다. 이러한 조성물은 보존제, 습윤제, 에멀션화제, 분산제, 항산화제 등과 같은 애쥬번트를 함유할 수 있다.
유문동-십이지장 운동성의 억제
본 발명은 치료가 필요한 환자에게서 유문동 십이지장 운동성을 억제시키는 방법을 포함하며, 상기 방법은 GLP-1 분자를 포함하는 조성물을 치료학적 유효량으로 환자에게 투여하는 것을 포함한다. 바람직한 구체예에서, 상기 GLP-1 분자는GLP-1(7-36)아미드이다. 명세서를 통해 기재한 바와 같이, GLP-1 분자는 다양한 방법을 사용하여 투여될 수 있다. 또한, 본원에 기재한 바와 같이, 본 발명의 방법을 사용하여, 유문동 십이지장 운동성을 억제시키는 것이 도움이 되는 다양한 환자들이 존재한다. 본원에 사용하는 용어 "환자"는 사람을 포함하는 임의의 포유동물을 칭한다.
GLP-1을 사용한 예비투약
본 발명은 내시경 과정에서 예비투약하는 방법을 포함하며, 상기 방법은 GLP-1 분자를 포함하는 조성물을 치료학적 유효량으로 환자에게 투여하는 것을 포함한다. 예비투약은 유문동 십이지장 운동성을 감소시킴으로써 내시경 과정 등에서 환자의 불쾌감을 감소시키기 위한 것이다. 위장관 평활근의 수축 또는 경련은 임상학자가 내시경 과정을 성공적으로 수행할 수 있도록 하기 위해 자주 극복해야만 하는 기술적 장애를 일으킨다. "예비투약"은 상기 내시경 과정 직전 또는 동안에 GLP-1 분자의 투여를 포함한다. "직전"이란 상기 과정을 시작하기 약 1시간 전까지, 또는 스코프를 삽입하기 전을 의미하고, "동안"이란 맹장 삽관을 포함하여 상기 과정 동안의 임의의 시간 또는 스코프를 제거하기 전 또는 제거하는 동안을 의미한다. 직전은 약 45, 30, 20, 15, 10, 5분 이하, 또는 상기 과정을 시작하거나 스코프를 삽입하기 1분전에 GLP-1 분자를 투여하는 것을 포함한다. 용어 "내시경" 또는 "스코프"를 결장경, 위경, 장내시경, 사이토스코프 또는 다른 타입의 의학적 내시경을 칭하기 위해 사용하였다.
용어 "내시경 과정"은 검사 및 치료학적 목적을 위해 위장관의 직접적인 가시화를 제공하기 위해 위장관내로 도입되는 기구를 사용하는 진단학적 과정을 칭한다. 이러한 목적에는 직접적인 가시화, 생검, 총담관에의 접근, 유체 흡인 및 이물질, 폴립 및 다른 병변의 제거가 포함된다. 특정 내시경 과정의 하나의 예는 식도위-십이지장내시경검사법이며, 이는 식도 루멘, 위 및 십이지장의 검사를 위해 사용된다. 다른 예로서, 내시경적역행성담도췌관조영술(ERCP)은 췌장관, 총담관 및 쓸개 담낭을 포함하여, 전체 담도를 가시화시킬 수 있다. 내시경 과정의 추가예는 결장내시경술, 에스(S)상결장경검사, 바륨 관장 검사이다.
위장관 장애의 치료 및 예방
본 발명의 또 다른 일면은 치료학적 유효량의 GLP-1 분자를 포함하는 조성물을 환자에게 투여하는 것을 포함하여 치료가 필요한 환자의 비감염성 급성 및 만성 설사를 치료하거나 예방하는 방법이다. "급성"은 짧고 비교적 심각한 경과로서 정의되고 "만성"은 좀 더 긴 기간에 걸쳐 지속되는 것을 의미한다[참조: Dorland's Medical Dictionary, 27thEdition]. "비감염성"은 감염성 질환과 같이, 감염에 의해 일어나지 않거나, 감염에 의해 소통될 수 없음을 함축하고 있다.
관련 맥락에서, 본 발명은 치료가 필요한 환자의 수술후 "덤핑 증후군"을 치료하거나 예방하는 방법을 포함하며, 상기 방법은 치료학적 유효량의 GLP-1 분자를 포유동물에게 투여하는 것을 포함한다. 덤핑 증후군은 위 수술후 이환율의 가장 보편적인 원인중 하나이고 식도 수술중 미주신경의 손상후에 환자에서 일어날 수 있다(Vecht et al). 이것은 위장 및 현관운동 증후군 둘 모두에 의해 특징화된다.위장관 증상에는 식후 포만감, 경련성 복통, 오심, 구토 및 폭발성 설사가 포함된다. 혈관운동 증상에는 발한, 무력증, 현기증, 홍조, 두근거림 및 눕고 싶은 강한 욕구가 포함된다. 심각한 덤핑 증후군에 걸린 환자는 증상을 최소화시키기 위해 음식 섭취를 제한할 수 있으며 이 결과 체중이 감량되고 영양실조가 된다. 심각한 경우에, 최후의 방법으로서 덤핑 증후군의 수술 치료가 사용된다.
심각한 덤핑을 위한 약제학적 치료에는 옥트레오티드 아세테이트(Sandoz), 지효성 소마토스타틴 유사체가 포함되며, 이를 사용하여 일부 성공을 거두었다. 옥트레오티드는 피하적으로 투여되며 위 공복을 지연시키고, 인슐린 방출을 억제하고, 장 펩티드 분비를 감소시키는 작용을 한다. 그러나, 옥트레오티드는 주입 부위 통증, 타키필락시스, 의인성 당뇨병, 흡수불량 및 담석증을 포함하는, 몇가지 합병증을 수반한다.
또 다른 구체예에서, 본 발명은 치료가 필요한 환자의 과민성장증후군(IBS)을 치료하거나 예방하는 방법을 포함하며, 상기 방법은 치료학적 유효량의 GLP-1 분자를 환자에게 투여하는 것을 포함한다.
IBS는 확인될 수 있는 유기적 원인과 관련이 없는 만성적인 위장 증상에 의해 특징화되는 장애의 이종 그룹이라고 생각된다. 복통 및 변비증에 의해 특징화되는 IBS의 "경련성" 종류가 만성 설사 및 식후 절박과 관련된 IBS 보다 보편적인 것으로 생각된다. 그러나, 상기 언급한 바와 같이, "설사 현저형" 종류 또한 보편적이다.
IBS의 정의 및 진단은 다소 논쟁상에 있지만, IBS 및 다른 기능성 또는 비-기관적 GI 장애의 정의 및 이들의 진단을 위한 임상학적 기준에 대한 어떤 합의에 도달하려는 시도가 최근 수년간 수행되고 있다[참조: Drossman et al., supra; Hasler et al., supra; Camilleri et al., supra; Drossman et al., supra; Thompson et al., 1989, Gastroenterol. Intl. 2:92-95; Manning et al., 1978, Br. Med. J. 2:653-654 and Thompson et al., supra]. 소위 "진단 기준(Rome criteria)"에 따라서, 유기적 원인과 관련이 없는 급성 설사를 앓고 있으나 심각한 복부 통증은 수반하지 않는 환자는 기능성 설사를 갖는 것으로 분류되며, 유기적 원인과 관련이 없는 급성 설사를 앓고 있으며 심각한 복부 불쾌감을 수반하는 환자들은 설사 현저성의 IBS를 갖는 것으로 분류된다[참조: Drossman et al., supra; Hasler et al., supra; Camilleri et al., supra; Drossman et al., supra; Thompson et al., supra; Manning et al., supra].
또 다른 양태에서, 본 발명은 치료학적 유효량의 GLP-1 분자를 환자에 투여하는 것을 포함하여 환자의 마약 금단과 관련된 증상을 치료하거나 예방하는 방법에 관한 것이다. 임상적으로 심각한 설사는 보통 헤로인 및 메타돈과 같은 마약에 중독된 사람의 금단시 급성 상태 동안 관찰될 수 있다. 묽은 변 및 설사는 종종 오피오이드 금단시 급성 반응을 수반한다. 처리 동안 환자를 진정시킬 경우, 이러한 문제가 더욱 심각해질 수 있는데, 이는 대장 조절을 상실하기 때문이다.
유문 운동성 평가
본 발명은 또한, 유문 운동성을 자극하는 것과 관련된 치료학적 방법에 관한 것이다. 유문 운동성을 설명하는데 사용되는 두개의 변수는 1) 인접한 전정 및 십이지장 측공에서 진폭과 관련된 웨이브(±3 sec)의 부재시 최대한의 하나의 슬리브-측공에서의 동시적 수축의 유무에 관계 없이 슬리브에 의해 기록된 수축으로서 규정된 분리된 유문압 웨이브(IPPW) 및 2) 유문 강직성이다. 유문 강직성은 슬리브에 의해 기록된 기본 압력으로부터 슬리브의 인접 말단부에서 전정 측공에 의해 기록된 기본 압력을 제하므로써 측정된다. 기본 압력은 수축이 풀린 후의 평균 압력으로서 규정되며; 이는 매 분마다 수득되며, 평균 유문 강직성을 평가하는데 사용된다.
본 발명은 또한, 치료학적 유효량의 GLP-1 안타고니스트를 환자에 투여하는 것을 포함하여, 유문 운동성을 억제하는 방법을 포함한다. 실시예에 설명된 바와 같이, GLP-1은 유문 운동성을 자극한다. GLP-1의 효과를 유문 운동성의 전형적인 생리학적 자극제인 지질의 효과와 비교하였다.
십이지장 지질의 유무에 관계 없이 GLP-1에 의한 유문 자극의 비교는, 유문 운동성 조절에 대한 새로운 견해를 제공하였다. 유문 강직성은 십이지장 지질 및 외인성 GLP-1 둘 모두를 안정적으로 증가시키며, 십이지장 지질에 대한 강직성 반응은 추가로 외인성 GLP-1에 의해 증진될 수 있다. GLP-1은 적어도 십이지장 지질 만큼 강하게 유문 강직성을 자극할 수 있다. 역으로, GLP-1은 심지어 수프라생리학적(supraphysiological) 수준에서도 십이지장 지질 만큼 강하게 IPPW를 자극시킬 수 없다. 이렇게, 십이지장 지질에 대한 위상성 유문 반응은 GLP-1 방출에 덜 의존적으로 될 수 있으며, 유문 운동성의 GLP-1 자극에 대한 메가니즘은 지질의 메카니즘과 상이할 수 있다.
하기 실시예는 본 발명을 설명하고자 하는 것이지, 본 발명의 범위를 제한하고자 하는 것은 아니다. 하기 약어는 하기 실시예에 사용된다.
IPPW분리된 유문 압력 웨이브
PP췌장 폴리펩티드
CCK콜레시스토키닌
혈장 호르몬 수준 및 GLP-1의 측정
변동율이 2% 미만인 글루코스 옥시다아제 방법(YSI 1500 G; Schlag, Bergisch-Gladbach, Germany)에 의한 글루코스 분석기를 사용하여 혈장 글루코스 농도를 측정하였다. 평균 내부분석(intraassay) 변동율이 5% 미만인 아보트 이믹스 마이크로파티클 엔자임 면역분석법(Abbott Imx Micropartical Enzyme Immunoassay)에 의해 혈장 인슐린을 측정하였다. C-펩티드, 글루카곤 및 췌장 폴리펩티드(PP)의 혈장 면역반응성을 통상적으로 구입가능한 표지 면역검정법 키트(Biermann, Bad Nauheim, Germany and Euradiagnostica, The Netherlands [PP])에 의해 분석하였다. 면역반응성(IR) GLP-1을 이전에 설명된 바와 같이[2] 특정 폴리클로날 항체 GA 1178(Affinity Research, Nottingham, Unkted Kingdon)을 사용하여 측정하였다. 분석의 검출 경계는 0.25pmol/l이다. 항혈청은 글루코스-의존적 인술리노트로픽 펩티드(GIP), 췌장 글루카곤, 글리센틴, 옥신토모둘린 또는 GLP-2와 교차반응하지 않았다. 외부- 및 내부분석 변동율이 각각 3.4% 및 10.4%이었다. 모든 값은 평균±SEM으로 나타내었다. 혈장 및 운동성 변수는 각각 매 60분 간격으로 분석하였다. 유문 강직성은 기본값으로부터의 변화값으로서 계산하고, 기본값은 실험을 시작하기 전에 총 기본적인 기간 동안의 평균 유문 강직성으로서 결정된다. 기본 상태와 비교하여 혈장 호르몬과 글루코스의 차이를 기본값(반응 곡선 아래 부분; AUC)에 대한 통합된 값으로서 측정하였다. 혈장 변수의 기본값은 각각의 실험을 시작하기 직전 두개의 기본값의 평균값으로 결정하였다. 우선 모든 샘플의 상태를 콜모고로프-스미르노프 시험(Kolmogoroff-Smirnoff test)에 의해 시험하였다. 각각의 변수에 대한 실험 세트간의 차를, 인자로서 정맥내 주입 및 십이지장 관류를 이용하여 변동의 두가지 방식의 반복된 측정 분석에 의해 분석하였다. 이러한 분석이 차이를 나타낼 경우, 스투던트-누먼-게울스 다중비교 시험(Student-Newman-Keuls multicomparison test)를 수행하였다. 차는 P<0.05에서 현저하게 나타났다.
실시예 1. 운동성 기록 및 혈액 샘플을 사람 환자로부터 취하였다.
이상 체중의 10% 이내의 체중을 갖는 23 내지 28세의 11명의 건강한 남성 지원자들이 연구에 참가하였다. 이들중 어느 누구도 약물 치료를 받고 있지 않거나, 위장관 증상 또는 전신 질환을 앓고 있지 않았다.
모든 연구를 공복하에 수행하였다. 피검자를 반 눕힌 상태에서 적어도 1주일 간격을 두고 각각 두가지의 실험을 수행하였다. 유치도관을 정맥내 주입을 위해 주전정맥(antecubital vein)으로 삽입하였다. 두번째 도관을 동맥혈화된 혈액을 샘플링하기 위해 퇴행식의 반대측 손의 배정맥(dorsal vein)으로 삽입하였다[참조:Schirra et al. Proc Assoc Am Physicians109, 84-97(1997)].
30분 이상의 기본 기간 후에 각각의 실험을 시작하였으며, 30분 이상중 마지막 15분은 낮은 운동 활동을 나타내었다(<5 전정 수축/10분). 소화간 연구일에, 0.154M 식염수를 2.5ml/분의 속도로 하부십이지장굽이(lower duodenal flexure) 영역으로 계속해서 관류시켰. 생리학적 식후 및 수프라생리학적 혈장 수준을 수득하기 위해, 소화간 실험에서 60분 동안 정맥내로 식염수를 주입하고, 0.4 및 1.2pmol·kg-1·min-1으로 GLP-1을 두번의 60분 기간 동안 주입하였다. 각각의 주입기간의 초기 10분 동안, GLP-1을 이중 용량(0.8 및 2.4pmol·kg-1·min-1)에서 주입하여 신속하게 평행 상태의 혈장 수준을 성립시켰다. 식후 연구일에, 동일한 정맥내 주입물을 2.5kcal/분의 십이지장내 지질 관류시키면서 투여하였다(2.5ml/min, Lipofundin MCT 10%, Braun Co., Melsungen, Germany). 이 지질 조제물은 50%의 중쇄 트리글리세리드(MCT) 및 50%의 장쇄 트리글리세리드(LCT, 대두유)로 구성되어 있었다. 식후 실험에서, GLP-1를 정맥 내에 주사하는 것을 중단한 후에 지질을 관류시키면서 추가의 60분 동안 연속적으로 측정하였다.
실험 내내, 정맥내 주사하기 직전, 그리고 그후 10분 간격으로 혈액 샘플을 취하였다. 혈액을 1000 아프로티닌(칼리크레인 억제 단위/ ㎖ 혈액)을 함유하는 얼음냉각시킨 EDTA관에 회수하고, 바로 원심 분리시켰다. 분석할때까지 혈장를 -20℃에서 저장하였다.
실시예 2. 유문동-유문-십이지장 영역의 운동성 기록
9-루멘의 십이지장 슬리브/측공이 있는 도뇨관(덴트슬리브(Dentsleeve; 오스트레일리아 사우쓰 오스트레일리아에 소재)를 사용하여 관류 혈압을 기록하였다. 혈압계 조립체에는 4.5cm 길이의 슬리브 센서, 2개의 전정 측정(2cm 이격되어 있음) 및 3개의 십이지장 측공(2cm 이격되어 있음)이 장착되어 있고, 이들은 각각 슬리브에 근접한 단부 및 멀리 떨어진 단부에서 시작된다. 2개 이상의 측공은 1.5cm 간격으로 이격된 슬리브를 가로질러 위치하고 있었다. 슬리브 센서로부터 12cm 떨어져 위치한 부가적인 루멘을 십이지장 관류시키는데 사용하였다.
유문에 걸쳐있는 슬리브 어레이가 설치된 십이지장 프로브의 정확한 위치를 각 실험을 시작하기 전에 형광분석법으로 검사하고, 종래 기술된 바와 같이(Schirra et al. J Clin Invest 97, 92-103(1996)) 멀리 떨어진 전정 및 근접한 십이지장 부위에서의 횡점막 전위차를 측정함으로써 각각의 연구 중에 계속 모니터링하였다. -15mV 이상의 차는 관의 정확한 횡유문 위치를 나타내고 있었다.
낮은 순응도(compliance)의 기흉압 펌프[와이오밍 그린데일에 소재한 엠도르퍼 메디칼 스페셜리스트(Amdorfer Medical Specialist) 제품]를 사용하여 0.3㎖/분의 속도에서 운동성 채널을 관류시켰다. 외부 변압기로 압력을 측정하였다. 데이터를 다중 채널 차트 시스템[스웨덴 스톡홀름에 소재한 신테틱스 메디컬(Synthetics Medical)의 PC 폴리그래프]의 스크린 상에 동시에 기록하고, 개인용 컴퓨터 메모리에 저장하였다. 데이터를 샘플링하고 8Hz에서 디지털화한 다음, 2배만큼 디지털을 스무딩(smoothing)시켰다.
실시예 3.GLP-1을 정맥내 주사하면 혈장 GLP-1의 수준이 증가된다.
GLP-1을 정맥내 주사하면 십이지장 식염수 및 지질에 관한 실험에서의 혈장GLP-1의 양이 주사를 개시한 후 20분 이내에 증가하여, 일정한 혈장 수준에 도달하였다(도 1, 표 3). 각각 십이지장 식염수를 사용한 경우의 정상 상태 혈장 수준은 6.2 ±0.6pmol/ℓ(적은 용량의 GLP-1) 및 13.1 ±0.9pmol/ℓ(고용량의 GLP-1)이었고, 십이지장 지질을 사용한 경우는 7.1 ±0.6pmol/ℓ(적은 용량의 GLP-1) 및 14.4 ±0.9pmol/ℓ(고용량의 GLP-1)이었다. 십이지장 지질은 십이지장 식염수 관류(2.4 ±0.3pmol/ℓ 대 1.4 ±0.2pmol/ℓ, P ＜ 0.05))에 비해서 미소하지만 현저하게 혈장 GLP-1을 증가시켰다. 이러한 차이는 외인성 GLP-1로 모두 로딩된 주사액을 주입한 경우에도 일정하게 유지되었다. 지질을 관류시키는 동안에 GLP-1을 중단시키고 나면, 혈장 GLP-1은 즉시 감소되고, 서서히 예비 주사값으로 복귀되었다.
혈장 글루코스 및 식염수 또는 지질(2.5kcal/분, 2.5㎖/분)을 십이지장 내로 관류시키는 경우의, GLP-1, 인슐린, 글루카곤 및 췌장 폴리펩티드의 혈장 면역반응성에 대한 생리학적 용량(적은 용량, 0.4pmol/kgㆍ분) 및 초생리학적 용량(많은 용량, 1.2pmol/kgㆍ분)의 GLP-1의 효과
GLP-1(pmol/ℓㆍ60분) 혈장 글루코스(mmol/ℓㆍ60분) 인슐린(mU/ℓㆍ60분) 글루카곤(pg/㎖ㆍ60분) 췌장 폴리펩티드(pg/㎖ㆍ60분)
십이지장내 식염수
식염수 iv. -0.8 ±1.0 0.3 ±0.1 1.5 ±1.7 22.4 ±16.2 10.8 ±29.7
GLP-1 iv.:적은 용량 25.2 ±2.6* -2.3 ±0.3* 11.3 ±2.4* -59.0 ±37.1* -90.5 ±32.7*
GLP-1 iv.:많은 용량 67.4 ±4.0*≠ -2.5 ±0.4* 11.9 ±5.1* -68.6 ±28.9* -128.9 ±33.2*
십이지장내 지질
식염수 iv. 7.5 ±1.7: -1.2 ±0.3: 25.5 ±4.4: 145.9 ±21.6: 298.5 ±66.9:
GLP-1 iv.: 적은 용량 33.8 ±2.9*: -4.7 ±0.5*: 24.7 ±4.8: 99.7 ±25.1*: 7.7 ±55.4*:
GLP-1 iv.: 많은 용량 75.2 ±3.9*: -4.5 ±0.7*: 31.4 ±8.4: 48.0 ±33.8*≠: -104.2 ±71.1*≠
식염수 iv.: 회수 17.1 ±3.1*≠ε -0.8 ±0.6≠ε 18.3 ±2.7 189.0 ±44.7≠ε 294.4 ±93.0≠ε
각 60분의 주사 기간 동안의 기본값에 대한 AUC의 평균 ±SEM. N=11. 동일한 십이지장내 관류에 있어서, *: P ＜ 0.05 vs. 식염수 iv., ≠: P ＜ 0.05 vs. 적은 용량의 GLP-1, §sms P<0.05 vs. 많은 용량의 GLP-1. 상이한 십이지장 내로의 관류에 있어서, :는 P ＜ 0.05 vs. 동일한 정맥내 주사/ 십이지장 내로의 식염수.
실시예 4.GLP-1는 상악-십이지장 운동성을 억제한다.
횡점막 전위차는 십이지장 식염수 및 십이지장 지질을 각각 사용하는 경우에 95.9 ±1.6% 및 92.5 ±2.0%의 기록 시간 동안의 프로브의 정확한 횡유문 위치를 표시하였다.
십이지장 식염수를 관류시키면서 실시한 소화간 실험에서, 적은 용량 및 많은 용량의 GLP-1 모두는 전정 및 십이지장의 수축 횟수, 수축 진폭 및 수축의 운동성 지수를 현저하게 억제시켰다(도 2A, 표 1). 유문동-십이지장 운동성은 적은 용량의 GLP-1을 투여하기 시작한 후 2분 이내에 억제되었다. 20분 이내에, 적은 용량의 GLP-1이 거의 완전하게 유문동-십이지장 운동성을 억제하였다. 훨씬 더 적은 용량의 GLP-1은 십이지장의 유문을 각각 4.5cm 및 6.5cm의 거리로 가로질러 증폭되는 전정 웨이브를 상쇄시켰다(표 2).
십이지장 식염수와 비교하여, 십이지장 지질을 관류시키면 전정 수축 및 십이지장 수축이 억제되었다. 십이지장 지질의 백그라운드에 대한, 외인성 GLP-1 용량은 전정 및 십이지장 수축의 횟수, 진폭 및 운동성 지수를 소화간 상태와 비교할만한 잔류 수준으로 감소시켰다.(도 2B, 표 1). GLP-1을 중단시키자 마자, 유문동-십이지장 운동성은 바로 증가하고, 예비주사 활성으로 복귀되었다. 수축이 지속되면, 모든 실험에서 GLP-1은 변하지 않고 그대로 남아있었다.
식염수 또는 지질(2.5kcal/분, 2.5㎖/분)을 십이지장 내로 관류시키는 경우의, 전정 운동성 및 십이지장 운동성에 대한 생리학적 용량(적은 용량, 0.4pmol/kgㆍ분)및 초생리학적 용량(많은 용량, 1.2pmol/kgㆍ분)의 GLP-1의 효과
전정 운동성수축(횟수/60분) 운동성 지수(mmHg*s/60분) 진폭(mmHg) 십이지장 운동성수축(횟수/60분) 운동성 지수(mmHg*s/60분) 진폭(mmHg)
십이지장내 식염수
식염수 iv. 69.3 ±9.9 18601 ±5758 63.0 ±7.5 183.7 ±25.1 19502 ±4321 39.5 ±3.6
GLP-1 iv.:적은 용량 12.6 ±2.8* 1478 ±564* 31.1 ±3.1* 36.0 ±14.7* 3447 ±1624* 25.0 ±2.5*
GLP-1 iv.:많은 용량 9.6 ±2.8* 957 ±322* 21.1 ±3.1*≠ 16.6 ±3.9* 1119 ±226* 17.5 ±1.9*≠
십이지장내 지질
식염수 iv. 24.3 ±4.5:# 2749 ±695: 32.5 ±3.1: 85.4 ±16.4:# 9545 ±2891:# 32.9 ±3.1:#
GLP-1 iv.:적은 용량 12.1 ±4.1* 880 ±351* 23.6 ±3.1* 29.5 ±5.8* 2776 ±890*: 26.0 ±3.3*
GLP-1 iv.:많은 용량 9.2 ±2.9*: 628 ±249* 23.0 ±2.7* 16.6 ±5.9*≠ 1174 ±499*≠ 19.2 ±3.1*≠
식염수 iv.: 회수 28.7 ±7.5*≠ε 3147 ±785≠ε 34.7 ±3.8≠ε 69.6 ±21.2≠ε 8732 ±3574≠ε 36.6 ±4.5≠ε
각 60분의 주사 기간 동안의 실제값의 평균 ±SEM의 AUC. 수축 및 운동성 지수값은, 2개의 전정 및 3개의 십이지장 측공 각각의 합을 나타낸다. N = 1. 동일한 십이지장 내로의 관류에 있어서, *는 P ＜ 0.05 vs. 식염수 iv., ≠는 P ＜ 0.05 vs. 적은 용량의 GLP-1, ε는 P ＜ 0.05 vs. 많은 용량의 GLP-1. 상이한 십이지장 내로의 관류에 있어서 :는, P ＜ 0.05 식염수 정맥내 주사/ 십이지장 내로의 식염수, #는 P ＜ 0.05 vs. 적은 용량의 GLP-1/ 십이지장내로의 식염수.
식염수 또는 지질(2.5kcal/분, 2.5㎖/분)을 십이지장 내로 관류시키는 경우의, 유문 운동성 및 유문동-유문-십이지장 웨이브 증폭에 대한 생리학적 용량(적은 용량, 0.4pmol/kgㆍ분)및 초생리학적 용량(많은 용량, 1.2pmol/kgㆍ분)의 GLP-1의효과
유문 운동성IPPW(횟수/10분) 유문 긴장성(mmHg) 유문동-유문-십이지장 증폭된 수축(횟수/60분)
십이지장내 식염수
식염수 iv. 1.6 ±0.3 0.2 ±0.5 9.8 ±1.3
GLP-1 iv.:적은 용량 10.1 ±1.9* 5.3 ±0.9* 0.0*
GLP-1 iv.:많은 용량 8.6 ±1.3* 7.3 ±1.5*≠ 0.0*
십이지장내 지질
식염수 iv. 14.7 ±1.5:# 3.1 ±0.4:# -
GLP-1 iv.: 적은 용량 15.7 ±2.5* 7.4 ±1.0*# -
GLP-1 iv.: 많은 용량 15.5 ±2.1*: 8.6 ±1.0* -
식염수 iv.: 회수 6.2 ±1.1*≠ε 5.1 ±0.8*≠ε -
각 60분의 주사 기간 동안의 기본값(긴장성) 및 실제값(IPPW)의 평균 ±SEM. N=11. 동일한 십이지장내 관류에 있어서, *dms P ＜ 0.05 vs. 식염수 iv., ≠는 P ＜ 0.05 vs. 낮은 용량의 GLP-1, §는 P<0.05 vs. 고용량의 GLP-1. 상이한 십이지장 내로의 관류에 있어서, :는 P ＜ 0.05 vs. 식엽수 iv/십이지장내로의 식염수, #는 P<0.05 vs. 적은 용량의 GLP-1/십이지장내 식염수. IPPW: 분리된 유문압 웨이브.
실시예 5. GLP-1은 유문의 운동성을 자극한다.
유문 긴장성은 소화간 상태에서의 외인성 GLP-1을 사용하여 투여량에 따라 달라지는 방식으로 증가하였다(도 3B, 표 2). 저용량의 GLP-1을 사용하는 경우에도, 10분이내로 상기 효과가 현저하였으며, GLP-1 주입 개시후 20분 이내에 그 효과가 완전히 달성되었다. 유문 긴장은, 십이지장 염수와 비교하는 경우에 십이지장 지질을 사용하여 안정하게 증가하였으며, 이것은 GLP-1 첨가(도 3B, 표 2)에 의해 추가로 증대되었다. 유문 긴장은 혈장 수준 감소에 병행하여 GLP-1의 중단 후에 꾸준히 감소하였다. 실험중 마지막 30분 동안에, 유문 긴장이 GLP-1이 없는 최초 60분과 현저히 다르지 않았으며, 이는 완전한 회복을 시사한다(마지막 30분 동안 3.0±0.7mmHg 대 실험 처음 60분 동안 3.1 ±0.4mmHg, P=0.29).
IPPW는 GLP-1의 주입한 경우 즉각적으로, 그리고 현저히 증가하였다(도 3A, 표 2). 그러나, 긴장성 유문 반응과 대조적으로, IPPW의 증가는 용량 의존적이지 않았으며, 급속한 증가 후에 현저한 감소를 나타냈다. 후자의 현상은 십이지장 지질의 바탕에 대해 지질 단독으로, 그리고 GLP-1에 대해 그러하다는 것을 지지한다. 십이지장 지질에 의한 IPPW의 자극은 GLP-1 단독의 경우에 비해 현저히 강하였으나, 십이지장 지질 및 외인성 GLP-1DMS 부가적 방식으로는 작용하지 않았다. GLP-1의 중단은 GLP-1 부재하의 처음 60분의 측정과 비교하면 IPPW를 현저히 감소시켰다.
GLP-1은 공복시 지원자들 대부분에게서 십이지장 제III기형 에피소드를 신속하게 유발한다. 십이지장 제III기형 활성은 덱스트로스(Heddle et al., Gut 29, 1349-57(1988)) 및 지질(Heddle et al., Am J Physiol 254, G671-9(1988))의 십이지장내 주입, β-엔도핀(Camilleri et al., Am J Physiol 251, G147-54(1986)) 정맥내 주입과 같은 여러 가지 자극, 냉기에 의해 유발된 기간 스트레스, 통증(Thompson et al., Gastroenterol. 83, 1200-6(1982)), 또는 미로자극(Stanghellini et al., Gastroenterol. 85, 83-91(1983)) 및 급성 과혈당증(Fraser ET AL., Gut 32, 475-8(1991))에 반응하는 것으로 이미 입증되었다. 흥미롭게도, 십이지장내 지질은 본 연구에서 십이지장 제 III기형 에피소드를 자극하였다. 그러나, 지질 관류와 함께 GLP-1 주입은 11명의 환자로부터 오직 2명에게서만 십이지장 제 III기가 동반되었다. 모든 십이지장 제 III기형 에피소드는 GLP-1DP 의하거나, 십이지장 지질에 의해 유문 자극의 개시에 강력하게 필적하였다. 그러므로, 유뮨의 초기 기 및 일시적 자극은 유문에서 기원할 수 있으며, 기능적 중요성이 여전히 불확실하다고 하더라도, GLP-1 또는 지질에 의한 유문근의 강력한 강역에 반응하여 보다 비특이적인 반응을 나타낼 수 있다. 유문의 기 및 긴장성 자극의 개시는 공복시 GLP-1의 둘 모두의 용량을 사용하여 십이지장 제 III기에 의해 병행되고, 이는 GLP-1 주입후 10분 후에 일어난다(도 4). 이러한 십이지장 제 III기는 GLP-1의 저용량 투여 후 11명의 지원자중 7명에게서 입증되었으며, GLP-1의 고용량 투여후에는 5명의 지원자에게서는 입증되었다. 11명의 지원자는 7명의 지원자는 십이지장내 지질 주입 후 유문 자극과 병행하여 십이지장 제 III기가 전개되었다. GLP-1 주입으로 보여진 유문동-유뮨-십이지장 운동성의 대표적인 패턴이 도 5에 도시된다.
실시예 6. GLP-1은 혈장 글루코스를 감소시킨다.
공복시 실험에서, 기저 혈장 글루코스 수준은 4.3±0.1mmol/l였으며, GLP-1의 두 용량 모두에서 현저히 떨어졌다(도 5A, 표 3). 혈장 글루코스 수준은 십이지장 지질의 경우에 십이지장 식염수 관류와 비교하여 약간 감소하였다. 이러한감소는 GLP-1의 두 용량 모두에서 더욱 명백하였으며, 이후 GLP-1의 중단 후에 현저히 증가하였다. 그러나, 혈장 글루코스의 최저점은 각각 GLP-1의 저용량 및 고용량을 사용한 경우 20분째에 3.58±0.12mmol/l 및 3.64±0.14mmol/l에 달하였다. 이들 최저값은 고혈당증을 나타내지 않는다.
인슐린의 기본 혈장 수준은 평균적으로 십이지장 식염수 및 지질 주입의 개시하기 전에 각각 6.0±0.7mU/l 및 6.1±0.7mU/l였다. GLP-1의 두 용량 모두, 단시간내 인슐린의 초기 상승을 유도하였고, 이후 감소하였다(도 5C). 십이지장 염수와 비교하여 보면, 십이지장 지질은 작지만 혈장 인슐린에서 현저한 증가를 이끌어냈으며, 이는 각 연구를 통해 유지되었다(표 3).
글루카곤의 기본 수준은 십이지장 식염수 및 지질을 사용한 연구에서 각각 91.5±8.8pg/ml 및 88.2±8.6pg/ml에 달하였다(차이는 현저하지 않음). 십이지장 염수 및 지질의 경우, GLP-1은 혈장 글루카곤을 현저히, 그리고 용량 의존적으로 감소시켰다(도 5B). 이후, 혈장 글루카곤은 상기 지질 실험에서 GLP-1의 중단으로 즉각적으로 증가하였다. 염수 관류와 비교하여 보면, 십이지장 지질은 글루카곤을 현저히 상승시켰으며, 이후 실험을 통해 상승을 유지하였다(표 3).
실시예 7
GLP-1은 용량 의존적으로 췌장 폴리펩티드 수준을 감소시킨다.
췌장 폴리펩티드(PP)의 억제제인 내분비 췌장의 호르몬은 강력한 미주신경의 콜린성 조절하에 있다. PP는 경구를 통한 음식 섭취 후에 피하 및 정맥내 GLP-1에 의해 사람에게서 억제된다[참조: Schirra et al., J. Endocrinol, 156, 177-86(1998); Schirra et al., Proc Assoc Am Physicians 109, 84-97(1997); Dupre et al., diabetes 44, 626-30(1995)]. PP 방출의 장 자극은 영양소의 십이지장 전달에 의한 췌장내 콜린성 리플렉스(reflex)의 자극을 필요로 하며(Schwartz, Gastroenterol. 85, 1411-25(1983)), 오랫 동안 위가 비어있는 동안 감소된 십이지장 영양소의 적재는 이러한 PP 반응을 설명할 것이다. 본 발명자에 의해 정돈된 상기 결과에서, 지질 관류에 의해 유도된 유문으로의 직접적인 PP 방출은 GLP-1 주입에 의해 용량 의존적으로 감소한 후, GLP-1 치료 중단 후에 신속하고 완전하게 회복되었다. 또한, 공복 연구에서, PP는 기저 수준 미만으로 현저히 감소하였다. 그러므로, 본 발명자들은 GLP-1이 원심성 미주신경 콜린성 작용을 억제하고, 이에 따라 PP 방출을 감소시키며, 적어도 부분적으로 중심 경로를 통해 상악동의 억제 및 십이지장 운동성에 기여한다. GLP-1의 수용체는 뇌궁밑 기관, 유일 계통 및 최하구역고 같은 뇌실주위기관에 존재한다[참조: Goeke et al., Eur. J. Neurosci 7, 2294-2300(1995)]. 또한, 위가 비는 것의 GLP-1 유도된 억제는 캅사이신 민감성 경로를 포함하며, 이는 미주신경 구심성 신경과의 상호작용을 나타내는 것으로 랫트로부터 최근 밝혀졌다[참조: Imeryuz et al., Am. J. Physiol, 273, G920-7(1997)]. 소마토스타틴을 통해 췌장 PP 세포 또는 파라크린(paracrine) 효과에 대한 GLP-1의 직접적인 작용은 GLP-1이 자극을 유발하기 때문이 아니라 그 대신에 분리된 사람 췌장 섬으로부터의 PP 방출을 억제하기 때문인 것으로 여겨진다[참조: Fehmann et al., Pancreas 11, 196-200(1995)].
췌장 폴리펩티드의 기저 혈장 수준은 평균적으로 십이지장 염수 및 지질 주입의 개시하기 전에 각각 64.3±8.6pg/ml 및 71.9±8.7pg/ml였다(P=0.32). 십이지장 지질의 경우에, 췌장 폴리펩티드의 수준은 식염수 관류에 비교하여 현저히 상승하였다(도 5D, 표 3). 정맥내 GLP-1은 십이지장 지질의 존재 및 부재하에 췌장 폴리펩티드를 용량 의존적으로 감소시켰으며, 췌장 폴리펩티드는 십이지장 염수를 사용한 실험에서 기저 수준 미만으로 현저히 감소하였다. GLP-1의 중단한 후, 췌장 폴리펩티드 수준의 즉각적인 증가가 십이지장 지질 관류를 사용한 연구에서 관찰되었으며, 이는 완전한 회복을 시시한다.

Claims (21)

  1. 치료학적 유효량의 GLP-1 분자를 환자에 투여하는 것을 포함하여, 유문동 십이지장 운동성을 억제시키는 방법.
  2. 제 1 항에 있어서, GLP-1- 분자가 GLP-1(7-36) 아미드임을 특징으로 하는 방법.
  3. 환자에서 유문동-십이지장 운동성을 억제하는데 사용하기 위한, GLP-1 및 약제학적으로 적합한 부형제를 포함하는 제형 단위.
  4. 제 3 항에 있어서, GLP-1 분자의 용량이 약 0.4 내지 2.4pmol·kg-1·min-1임을 특징으로 하는 제형 단위.
  5. 제 4 항에 있어서, GLP-1 분자의 용량이 약 0.8 내지 1.2pmol·kg-1·min-1임을 특징으로 하는 제형 단위.
  6. 제 3 항에 있어서, 약제학적으로 적합한 부형제가 경구적으로, 비경구적으로또는 피하로 수용가능함을 특징으로 하는 제형 단위.
  7. 제 3 항에 있어서, 약제학적으로 적합한 부형제가 정맥내로 수용가능함을 특징으로 하는 제형 단위.
  8. 치료학적 유효량의 GLP-1 분자를 투여하는 것을 포함하여, 내시경 과정에서 예비투약시키는 방법.
  9. 제 8 항에 있어서, GLP-1 분자가 GLP-1(7-36) 아미드임을 특징으로 하는 방법.
  10. 치료학적 유효량의 GLP-1 분자를 환자에 투여하는 것을 포함하여, 비감염성 급성 또는 만성 설사를 치료하거나 예방하는 방법.
  11. 제 10 항에 있어서, GLP-1 분자가 GLP-1(7-36) 아미드임을 특징으로 하는 방법.
  12. 치료학적 유효량의 GLP-1 분자를 환자에 투여하는 것을 포함하여, 수술후 덤핑 증후군을 치료하거나 예방하는 방법.
  13. 제 12 항에 있어서, GLP-1 분자가 GLP-1(7-36) 아미드임을 특징으로 하는 방법.
  14. 치료학적 유효량의 GLP-1 분자를 환자에 투여하는 것을 포함하여, 과민성 대장 증후군을 치료하거나 예방하는 방법.
  15. 제 14 항에 있어서, GLP-1 분자가 GLP-1(7-36) 아미드임을 특징으로 하는 방법.
  16. 치료학적 유효량의 GLP-1 분자를 환자에 투여하는 것을 포함하여, 마약 금단과 관련된 증상을 치료하거나 예방하는 방법.
  17. 제 16 항에 있어서, GLP-1 분자가 GLP-1(7-36) 아미드임을 특징으로 하는 방법.
  18. 제 1 항에 있어서, GLP-1 분자가 경구적으로 또는 비경구적으로 투여됨을 특징으로 하는 방법.
  19. 유문동 십이지장 운동성을 억제하고, 내시경 과정에서 예비투약시키고, 비감염성 급성 및 만성 설사, 수술후 덤핑 증후군, 과민성 대장 증후군 또는 마약 금단증상과 관련된 증상을 치료하거나 예방하기 위한 약제를 제조하는데 있어서의 GLP-1 분자의 용도.
  20. 제 19 항에 있어서, GLP-1 분자가 GLP-1(7-36) 아미드임을 특징으로 하는 용도.
  21. 제 19 항 또는 제 20 항에 있어서, 약제가 경구적으로 또는 비경구적으로 투여됨을 특징으로 하는 용도.
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