JP2003502344A - β−細胞機能およびIGT疾患およびII型糖尿病の存在を判定するための診断検査試薬としてのGLP−1 - Google Patents

β−細胞機能およびIGT疾患およびII型糖尿病の存在を判定するための診断検査試薬としてのGLP−1

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Abstract

(57)【要約】 【課題】 グルカゴン様ペプチド−1(GLP−1)は、公知の最も有能な向インシュリン性ホルモンであり、II型糖尿病の患者においてインシュリン分泌を強力に刺激することが認められている。 【解決手段】 本発明はβ−細胞機能を簡単にテストするためにβ−細胞刺激テストにおいてGLP−1又はその生物学的活性類似体を使用する。このテストはインシュリン分泌能についての情報を与えるもので、簡単であり、再現性に優れ、副作用も有意なものではない。

Description

【発明の詳細な説明】
【0001】 (発明の技術分野) 本発明は、グルコース耐性障害の診断指標として、更に糖尿病の警告指標とし
て個人のβ−細胞機能の損傷を検知することに関する。
【0002】 β−細胞機能の評価は、多くの異なる状況、例えば、治療中の糖尿病患者をモ
ニターする場合;家族検査において糖尿病発症の危険性を予測する場合;すい臓
又はランゲルハンス島の移植後の状態を知る場合などにおいて興味深いものであ
る。正確なβ−細胞の質量を直接測定することはできない。代用として、グルカ
ゴン試験は、日常生活におけるβ−細胞機能を測定するものとして広く認められ
ている。なぜならば、グルカゴンの1mgの静脈内投与後6分後の血漿C−ペプ
チド濃度は、殆どの場合、標準食事後の最大C−ペプチド濃度に相当することが
証明されているからである(Faber OK、Binder C(1977)
);グルカゴンに対するC−ペプチドの応答;真性糖尿病における残留β−細胞
機能についてのテスト;Diabetes 26:605−610;Madsb
ad S, Krarup T, McNair Pら(1981)真性糖尿病
の治療の選択におけるC−ペプチドのグルカゴン刺激に対する応答の実用的価値
;Acta Med.Scand.210:153−156)。最大分泌能力の
評価が5gのL−アルギニンの輸液を用いた技術的要求が高く長期間に亘る高血
糖クランプを用いて行われてきた(Ward WK,Bolgiano DC,
McKnight B, Halter JB, Porte D(1984
)、 非インシュリン依存型真性糖尿病の患者におけるβ−細胞分泌能の減退;
J.Clin.Invest. 74:1318−1328)。しかし、このテ
ストは時間がかかり、患者に可成りの不快および苦痛を与えることが知られてい
る。
【0003】 グルコース耐性障害(IGT)は米国人の間で一般的なものである。グルコー
ス耐性障害の羅病率は、20−74歳の一般的人口における11%に対し、40
−75歳の年齢の者で、糖尿病の家族のもので、体重が正常より120%より大
きい者では24%に上昇する。グルコース耐性障害を有する者は心血管疾患や非
インシュリン依存型真性糖尿病(NIDDM)の高い危険性を有し、2型糖尿病
として知られている。
【0004】 グルコース耐性障害は、すい臓β−細胞機能の初期の微妙な欠陥と、それに伴
うインシュリン抵抗により特徴付けられる。これらの初期の欠陥には、インシュ
リン分泌の適当なレベルでの血漿グルコース濃度の小さな変化に対するβ−細胞
の減退した感受性および応答性、並びにグルコースインシュリン分泌投与−応答
曲線の右側への緩やかなシフトが含まれる。β−細胞のグルコース感受能および
高速インシュリン分泌応答能は、2時間グルコースレベルの上昇が極めて小さい
とき、IGTの間における極めて初期の段階で喪失する。IGTにおけるグルコ
ース制御の経時的劣化はβ−細胞機能の漸進的障害に殆ど基づくものであり、多
くの場合、グルコース制御の決定的喪失およびNIDDMの有害な開始をもたら
す。 上記事情から、信頼性が高く、可成りの悪性の副作用や患者への苦痛および不
快を生じさせることのないグルコース耐性障害指標テストとして、β−細胞機能
を測定するための迅速的で簡単なテストについての実際的、かつ、継続的要望が
存在することが理解されるであろう。本発明はこの継続的要望を達成することを
第1の目的とする。
【0005】 (発明の概要) グルカゴン様ペプチド−1(GLP−1)は、公知の最も有能な向インシュリ
ン性ホルモンであり、II型糖尿病の患者においてインシュリン分泌を強力に刺激
することが認められ、本発明はβ−細胞機能を簡単にテストするためにβ−細胞
刺激テストにおいてGLP−1又はその生物学的活性類似体を使用する。このテ
ストはインシュリン分泌能についての情報を与えるもので、簡単であり、再現性
に優れ、副作用も有意なものではない。
【0006】 (発明の具体的説明) 腸内分泌ホルモンであるグルカゴン様ペプチド−1はβ−細胞分泌物に対して
知られている最も有能な刺激剤である。更に、真性II型糖尿病の患者において非
常に有効であることが証明されている。すなわち、高血糖クランプを8−9mm
ol/Lで維持した条件のもとで、軽度のII型糖尿病の患者のグループに対しG
LP−1を輸液した結果、健康人の対照グループで認められたものと同様の程度
のインシュリンおよびC−ペプチド応答が得られた。更に、経口用抗糖尿病薬の2
次的効能不全のため長期間の疾患およびインシュリン治療を受けていていた患者
において、GLP−1の輸液により、十分なインシュリン分泌がもたらされ、同
時にグルカゴン分泌が抑制され、血糖を正常化することができた。他の生理学的
に重要な内分泌ホルモンであるグルコース依存型向インシュリン性ポリペプチド
(GIP)の作用と比較して、GLP−1の作用は非常に優れている。II型糖尿
病の患者の同様のグループに対するGIPの輸液はインシュリン分泌および血糖
に対し、殆ど効果を示さなかった(Nauck MA, Heimesaat
MM, Orskov C, Holst JJ, Ebert R, Cre
utzfeldt W(1993)、真性II型糖尿病の患者における、合成ヒト
胃抑制ポリペプチドを除いての、グルカゴン様ペプチド−1[7−36アミド]
の持続的内分泌活性; J.Clin.Invest. 91:301−307
; Krarup T(1988)、 免疫反応胃抑制ポリペプチド;Endo
cr. Rev. 9:122−134)。この差をβ−細胞のレベルでの作用
機構で説明することは困難である。なぜならば、これら2種のペプチドは同一の
細胞内機構を活性化するとおもわれるからである(すなわち、アデニレートシク
ラーゼの活性化によりcAMPが形成され、これはβ−細胞に対する更なる全て
の作用が説明できると思われる)。それにも拘らず、II型糖尿病の患者に対する
GLP−1の顕著な効果のため、β−細胞機能のテストにこのペプチドを利用す
ることは適当なアプローチであると思われる。理論的には、β−細胞の分泌能は
、1)β−細胞の総質量、2)適用された刺激物に対する個々の細胞の感度、3
)個々の細胞の分泌能に依存する。糖尿病において、これら3つの因子の全てが
損傷するものと思われる。特にII型糖尿病においては、グルコースに対する感度
が損傷し、そのため、β−細胞の感度が最も維持される刺激物を選択することが
重要である。このような刺激物としてGLP−1が利用できるであろう。このこ
との調査のため、本発明者等は、種々の投与量および投与モードについて、GL
P−1に対するβ−細胞分泌応答を食事に対する応答、グルカゴンに対する応答
および高血糖クランプの間に注射されたアルギニンに対する応答と比較した。こ
れらの実施例における検査の内の投与量−応答についての検査の結果、患者にお
ける標準食事、2.5nmolのGLP−1および1mgのグルカゴンで、イン
シュリンおよびC−ペプチドについての同様のピーク濃度が得られることが見出
された。しかし、GLP−1はグルカゴンよりも副作用が少くない。GLP−1
のより高い投与量で可成り大きい応答が得られ、従って、GLP−1の単一の注
射に対する最大の応答は、本検査で使用した2.5nmolより若干高い投与量
で得られるものと思われる。他方、より高い投与量により、より多くの患者が副
作用を示した。正常のヒトにおいては、すべての投与量で同様の応答が得られた。
興味深いことに、いずれの刺激物に対する絶対的応答は患者の場合と実質的に同
一であり、GLP−1の向インシュリン作用がII型糖尿病患者で広く維持される
という考察を確認することができた。投与量−応答の関係が患者については存在
するが、健康人については存在しないという事実はβ−細胞のGLP−1に対す
る感度が患者において幾分減少することを示唆するものである。グルカゴンに対
する応答は同様であり、グルカゴンがβ−細胞分泌に対する刺激物としてGLP
−1と同様に効果的であることを示唆している(しかし、有効性は可成り低く、
副作用は大きい)。患者および健康人の更に大きいグループにおいて得られた結
果は上記投与量−応答についての検査で得られたものと同様であった。
【0007】 以下に記載する投与量−応答についての検査において、GLP−1の全ての投
与量は、予想した通り、血漿グルコース濃度を低下させたが、食事テストおよび
グルカゴンテストでは血漿グルコース濃度は増大した。すなわち、β−細胞に対
するグルコースの信号がより小さいため、GLP−1の作用が低く予測されたも
のと思われる。なぜならば、高血糖症は、殆どのインシュリン分泌促進薬に対す
るβ−細胞の応答を増大するからである。しかし、この作用はII型糖尿病患者に
おいては小さい。従って、実施例の第2部においては、GLP−1に対するβ−
細胞の応答についての高血糖症の作用が試験された。ここで、健康人と患者との
間で顕著な差異が認められた。すなわち、健康人においては、分泌応答がほぼ4
倍に増大したが、患者においてはその応答の増加は僅かに過ぎなかった。これは
、一方において、おそらく糖尿病β−細胞のグルコース非感受性を説明するもの
であり、他方において、GLP−1の2.5nmolの投与量が、糖尿病患者に
おけるほぼ最大のβ−細胞応答を引き出すよう作用することを示唆するものと思
われる。しかし、これらの実験は静脈内投与においてGLP−1の極めて急速な
劣化を考慮に入れていない。単一の静脈内投与が最大の応答を引き出すには短す
ぎる短時間、GLP−1の血漿濃度を上昇させ得ることが考えられる。実際に、
血漿GLP−1の直接的測定により、2.5nmolの静脈注射後10−15分
で既に完全なGLP−1の基底濃度が認められた。GLP−1の更なる継続的作
用を検査するため、静脈内投与を皮下注射と比較した。この場合、GLP−1は
先に実証された最大許容投与量を与えた。これらの実験において、完全なGLP
−1の残存濃度が90分もの長時間,持続した。しかし、得られたインシュリン
およびC−ペプチドの最大濃度は、静脈内投与後に得られたものと異なることは
なかった。従って、GLP−1の継続的投与がピーク応答を更に増大させること
はなかった。グルコース/GLP−1組合せの注射の間におけるインシュリンお
よびC−ペプチドの応答は、β−細胞分泌能が健康な人のものと比較してII型糖
尿病患者のグループにおいて約25%に損傷されることを示すものであった。
【0008】 最大分泌能を検査するため、グルコース/GLP−1組合せの応答と、高血糖
クランプ+アルギニンの応答と比較した(Ward WK,Bolgiano
DC, McKnight B, Halter JB, Porte D(1
984)、 非インシュリン依存型真性糖尿病の患者におけるβ−細胞分泌能の
減退;J.Clin.Invest. 74:1318−1328)。漸増する
インシュリンおよびC−ペプチドの応答は糖尿病患者のものと同様であった。4
5分間の高血糖クランプの間のβ−細胞のプライミング作用は、アルギニンクラ
ンプの間における、より高い絶対インシュリンおよびC−ペプチド応答を示唆す
るものと思われる。
【0009】 すなわち、II型糖尿病患者においても、β−細胞の最大分泌速度は、非常に高
濃度のグルコース(すなわち、患者の日常のグルコースレベルより可成り高い)
と、GLP−1又はアルギニンなどの追加の分泌促進薬との組合せによってのみ
引き出すことができる。しかし、例えば混合食事の摂取などの生理学的刺激によ
って引き出されるインシュリン量を分泌させる患者の能力は、GLP−1の2.
5nmolの少量の静脈投与により、迅速、かつ、簡便に測定することができ、
患者に深いを感じさせることもない。 外来患者病院における最善のテストをグルコース/GLP−1組合せの注射に
よって行うことができ、GLP−1による刺激の前にII型糖尿病患者および健康
人において同様の基底血糖が得られる。
【0010】 GLP−1は、静脈内で又は皮下的に投与することができ、連続的又はブロス
注射により投与することができる。グルコースの注射又は輸液の前後、又は同時
に全て投与することができる。以下の投与量を用いることができる。連続的輸液
の場合において、静脈内投与(I.V.)によるときは、0.1 pmol/k
g/分ないし10 pmol/kg/分、皮下投与(S.C.)によるときは、
0.1 pmol/kg/分ないし25 pmol/kg/分である。また、単
一投与(ブロス投与)で、I.V.によるときは、0.005 nmol/kgな
いし20 nmol/kg、S.C.によるときは、0.1nmol/kgない
し100 nmol/kgである。
【0011】 “GLP−1”又はグルカゴン様ペプチドの用語は、擬似体を含み、本発明の
趣旨で使用する場合、グルカゴン様ペプチド、関連するペプチド、グルカゴン様
ペプチド−1の類似体、つまりGLP−1(7−36)アミドレセプター蛋白質
のようなグルカゴン様ペプチド−1(GLP−1)レセプター蛋白質に結合する
ものを含むものであり、GLP−1の天然の生物学的に活性な型であるGLP−
1(7−36)アミドに対応する生物学的作用をインシュリン分泌に関して有す
るものである(Goke,BおよびByrne,M,Diabetic Medi
cine;1996,13:854−860)。GLP−1レセプターは、細胞
表面たんぱく質であり、例えば、インシュリン生産すい臓β−細胞に見出すこと
ができる。グルカゴン様ペプチドおよびその類似体には、向インシュリン活性を
有し、GLP−1レセプター分子の作動薬、つまりGLP−1レセプター分子を
活性化させる種であって、更に特にインシュリン生産β−細胞に対し第2メッセ
ンジャー活性を有するものを含む。このレセプターを介して活性を示すグルカゴ
ン様ペプチドの作動薬については以下の文献がある。すなわち、EP07081
79A2;Hjorth,S.A.その他、J.Biol.Chem.269(
48):30121−30124(1994);Siegel,E.G.その他
、Amer.Diabetes Assoc.57th Scientific
Sessions,Boston(1997);Adelhorst,K.そ
の他、J.Biol.Chem.269(9):6275−6278(1994
);Deacon C.F.その他、16th International
Diabetes Federation Congress Abstrac
ts,Diabetologia Supplement(1997);Irw
in,D.M.その他、Proc.Natl.Acad.Sci.USA.94
:7915−7920(1997);Mosjov,S.Int.J.Pept
ide Protein Res.40:333:343(1992)などであ
る。
【0012】 グルカゴン様分子には、GLP−1の作動薬を表し、つまりGLP−1レセプタ
ー分子を活性化させるポリヌクレオチドであって、更に特にインシュリン生産β
−細胞に対し第2メッセンジャー活性を有するものを含む。β−細胞の作動薬で
あるGLP−1擬似体は、特にGLP−1レセプターを活性化させるようにした
化合物を含む。グルカゴン様ペプチド−1拮抗薬も知られている。つまり、Wa
tanabe、Y.その他、J.Endocrinol.140(1):45−
52(1994)に記載され、これにはエクセンジン(9−39)アミン、エク
センジン類似体を含み、これはGLP−1レセプターの拮抗薬である(例えば、
WO97/46584)。最近の文献にはBlack Widow GLP−1
およびSer GLP−1が開示されている(例えば、G.G.Holz,J
.F.Hakner/Comparative Biocccchemistr
y and Physiology,Part B121(1998)177−
184およびRitzel,その他、A synthetic glucago
n−like peptide−1 analog with improve
d plasma stability,J.Endocrinol 1998
Oct.;159(1):93−102)。
【0013】 その他の例としては、化学的に合成されたグルカゴン様ポリペプチド、そのポ
リペプチド又はそのフラグメントであり、これらは実質的に同族体である。“実
質的に同族体”とは核酸およびアミノ酸配列についてのもので、特定の対象の配
列,例えば変異体で、1以上の置換、欠失又は付加によって対照配列と異なるも
のである。その実質的作用は対象の配列と対照の配列との間に好ましくない機能
的非類似性を生じさせない。本発明の目的において、50%を超える同族体を有
する配列、好ましくは90%を超える同族体を有する配列のもの、血漿グルコー
スレベルに対するβ−細胞の応答を向上させる同等の生物学的活性を有するもの
、均等な発現特性を有するものは、実質的に実質的に同族体ということができる
。同族体の判定を目的とする場合、完成された配列からの先端切断は無視される
べきである。同族性の程度の小さい配列,生物学的活性が同等のもの、均等の発
現特性を有するものは均等物であると解される。
【0014】 哺乳動物のGLPペプチドおよびグルカゴンは同一の遺伝子でコード化される
。回腸において、表現型はGLPペプチドホルモンの2つの主なクラス、すなわ
ち、GLP−1およびGLP−2に処理される。表現型ペプチドから処理された
4つのGLP−1関連ペプチドが知られている。GLP−1(1−37)は、配
列、His Asp Glu Phe Glu Arg His Ala Gl
u Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Se
r Tyr Leu Glu Gly Gln Ala Ala Lys Gl
u Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Ar
g Gly (SEQ. ID NO:1)を有する。GLP−1(1−37)
は翻訳後処理によりアミド化され、GLP−1(1−36)NH を生じさせ
、これは配列、His Asp Glu Phe Glu Arg His A
la Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val S
er Ser Tyr Leu Glu Gly Gln Ala Ala L
ys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys G
ly Arg(NH)(SEQ. ID NO:2)を有する。若しくは、こ
れは酵素処理されGLP−1(7−37)を生じさせ、これは配列、His A
la Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val S
er Ser Tyr Leu Glu Gly Gln Ala Ala L
ys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys G
ly Arg Gly(SEQ. ID NO:3)を有する。GLP−1(7
−37)はアミド化され、更にアミド化されGLP−1(7−36)アミドを生
じさせ、これはGLP−1分子の天然型であり、配列、His Ala Glu
Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser
Tyr Leu Glu Gly Gln Ala Ala Lys Glu
Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg
(NH)(SEQ. ID NO:4)を有する。
【0015】 腸内L細胞はGLP−1(7−37)(SEQ. ID NO:3)およびG
LP−1(7−36)(NH)(SEQ. ID NO:4)を1ないし5の
割合でそれぞれ分泌する。これらのGLP−1の欠失型はその場における半寿命
が10分未満の短いものであり、アミノジペプチダーゼGLP−1IVにより不
活性化され、Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Va
l Ser Ser Tyr Leu Glu Gly Gln Ala Al
a Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Ly
s Gly Arg Gly(SEQ. ID NO:5);およびGlu G
ly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser T
yr Leu Glu Gly Gln Ala Ala Lys Glu P
he Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg (
NH)(SEQ. ID NO:6)をそれぞれ生じさせる。これらのペプチ
ド、Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Se
r Ser Tyr Leu Glu Gly Gln Ala Ala Ly
s Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gl
y Arg Gly(SEQ. ID NO:5);およびGlu Gly T
hr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr L
eu Glu Gly Gln Ala Ala Lys Glu Phe I
le Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg (NH
(SEQ. ID NO:6)は肝臓のグルコース生産に影響を及ぼすことが予
測されるが、すい臓からのインシュリンの生産又は放出に対し刺激を与えること
はない。 GLP−1と同族の6種のペプチドがアメリカドクトカゲの毒液に存在する。
これらの配列が表1にGLP−1と比較して記載されている。
【0016】 表 1 a.H A E G T F T S D V S S Y L E G Q A A K E F I A W L V K G R NH2 b.H S D G T F T S D L S K Q M E E E A V R L F I E W L K N G G P S S
G A P P P S NH2 c. D L S K Q M E E E A V R L F I E W L K N G G P S S
G A P P P S NH2 d.H G E G T F T S D L S K Q M E E E A V R L F I E W L K N G G P S S
G A P P P S NH2 e.H S D A T F T A E Y S K L L A K L A L Q K Y L E S I L G S S T S P
R P P S S f.H S D A T F T A E Y S K L L A K L A L Q K Y L E S I L G S S T S P
R P P S g.H S D A I F T E E Y S K L L A K L A L Q K Y L A S I L G S R T S P
P P NH2 h.H S D A I F T Q Q Y S K L L A K L A L Q K Y L A S I L G S R T S P
P P NH2 a=GLP−1(SEQ. ID NO:4) b=Exendin 3(SEQ. ID NO:7) c=Exendin 4(9−39(NH(SEQ. ID NO:8) d=Exendin 4(SEQ. ID NO:9) e=Helospectin I(SEQ. ID NO:10) f=Helospectin II(SEQ. ID NO:11) g=Helodermin(SEQ. ID NO:12) h=Q ,QHelodermin(SEQ. ID NO:13)
【0017】 表1の欄外に記載されているように、主な同族体は:ペプチドcおよびhはb
およびgからそれぞれ得られたものである。6種の天然のペプチド(a,b,d
, e,fおよびg)は位置、1,7,11,18において一致する。GLP−
1およびイクセンジン(exendin)3,4(a,b及びd)は更に位置、
4,5,6,8,9,15,22,23,25,26,29において一致する。
位置2において、A,SおよびGは構造的に類似する。位置3において、Dおよ
びE(AspおよびGlu)は構造的に類似する。位置22,23において、F
(Phe)およびI(Ile)は構造的にY(Tyr)およびL(Leu)にそ
れぞれ類似する。同様に、位置26において、LおよびIは構造的に均等である
。 すなわち、GLP−1の30の残基の内、イクセンジン(exendin)3
,4は15個の位置で同一であり、5個の更なる位置において均等である。根本
的構造変化が明らかに位置は、残基、16,17,19,21,24,27,2
8,30のみに認められる。イクセンジンもカルボキシル基末端に9個の余分な
残基を有する。
【0018】 GLP−1様ペプチドは、化学的固相ペプチド合成により作ることができる。
GLP−1は更に、例えば、Sambrook and Maniatisに記
載されている標準手法を用いた従来の組換え技術により,作ることもできる。こ
こで、“組換え”とは組換え(例えば、微生物又は哺乳動物の)発現システムから
たんぱく質が得られることを意味するものであり、GLP−1又はその生物学的
に活性な類似体についての発現遺伝子を含むよう遺伝子的に変質される。 GLP−1様ペプチドは、種々の方法により組換え細胞培養から回収、精製す
ることができる。その方法の例としては、限定されるものでないが、例えば、硫
酸アンモニウム又はエタノール析出法、酸抽出法、カチオン又はアニオンクロマ
トグラフィ法、ホスホセルロースクロマトグラフィ法、疎水性相互作用クロマト
グラフィ法、アッフィニティクロマトグラフィ法、ヒドロキシアパタイトクロマ
トグラフィ法、レクチンクロマトグラフィ法などを用いることができる。高性能
液体クロマトグラフィ(HPLC)法は最終の精製工程で使用することができる
【0019】 本発明のポリペプチドは天然の精製された製品であっても、あるいは、化学的
合成法によるもの、原核生物又は真核生物宿主(培養による、又はin viv
oにおけるバクテリア、酵母、高級植物、昆虫、哺乳動物の細胞)から組換え技
法により製造されたものであってもよい。組換え技法にて使用される宿主の種類
にもよるが、本発明のポリペプチドは一般にグリコシル化されていないが、グリ
コシル化されていてもよい。 GLP−1活性は標準的方法、すなわち、一般的には、レセプター結合活性ス
クリーニング法により判定することができる。この方法は、表面にGLP−1レ
セプターを発現する適当な細胞、例えば、RINmSF細胞又はINS−1細胞
のようなインシュリノマ細胞ラインを用いる(Mosjov、S.(1992)
およびEP0708170A2参照)。放射免疫検定法を用い、膜へのトレーサ
の特異的結合を測定することに加え、cAMP活性又はグルコース依存インシュ
リン生産も測定する。1つの方法として、本発明のレセプターをコード化するポ
リヌクレオチドを使用し細胞のトランスフェクションを行い、GLP−1レセプ
ターたんぱく質を発現させてもよい。すなわち、これらの方法はレセプター作動
物質をスクリーニングするために使用することができ、これは、そのような細胞
をスクリーニングされるべき化合物と接触させ、その化合物が信号を発するか否
か、すなわち、レセプターを活性化するか否かを判定するものである。
【0020】 ポリクローンおよびモノクローン抗体を利用し、上述の方法で使用されるGL
P−1様ペプチドを検知し、精製し、識別することができる。ABGA1178
のような抗体は完全な、かつ、継ぎ合わせていないGLP−1(1−37)又は
N−末端−欠失GLP−1(7−37)又は(7−36)アミドを検知すること
ができる。他の抗体は、前駆分子のC−末端の先端を検知することができ、その
手法により減法を介して生物学的に活性な欠失ペプチド、すなわち、GLP−1
(7−37)又は(7−36)アミドの量を計算することができる(Orsko
vその他、Diabetes,1993、42:658−661;Orskov
その他、J.Clin.Invest.1991、87:415−423)。
【0021】 他のスクリーニング法としては、レセプター活性により生じた細胞外pH又は
イオン変化を測定するシステムにおいてGLP−1レセプターを発現する細胞、
例えばトランスフェクトされたCHO細胞を使用する方法がある。例えば、潜在
的作動物質を、GLP−1たんぱく質レセプターを発現する細胞と接触させ、第
2のメッセンジャー応答、例えば、信号変換、イオン又はpHの変化を測定し、
潜在的作動物質が有効か否かを判定する。
【0022】 本発明のグルカゴン様ペプチド−1レセプター結合たんぱく質は適当な薬剤担
体との組合せで使用することもできる。そのような組成は、ポリペプチドの治療
有効量と、薬理学的に許容し得る担体又は賦形剤とからなる。担体の例としては
、塩水、緩衝塩水、デキストローゼ、水、グリセロール、エタノール、ラクトース
、ホスフェート、マンニトール、アルギニン、トレハロースおよびこれらの混合
物である。その調合は投与の型に適合するようなされるもので、それについては
当業者にとって自明であろう。GLP−1ペプチドは、その生物学的活性を向上
させ、持続させるために、このペプチドのin vivoでの半寿命を向上させ
る公知の薬剤と組合わせて使用することもできる。例えば、投与の前に、分子又
は化学的部位を本発明の組成物に共有結合させてもよい。その他、この向上剤を
上記組成物と同時に投与するようにしてもよい。さらに、この向上剤は、GLP
−1様ペプチドの酵素劣化を抑制する公知の分子を含むものであってもよく、こ
れをGLP−1様ペプチド組成物と同時に又は投与後に投与するようにしてもよ
い。 以下の実施例は説明のためのものであり、本発明のテスト法を制限することを
意図するものではない。もちろん、テストで使用される分子、手法を或る程度の
変更は当然なしうるものであり、それらも、文字通り、又は均等論により、本発
明の趣旨および範囲に包含されるものである。
【0023】 (実施例) 本発明の検査は3つの部分に分割されている。その第1部の目的は、インシュ
リン分泌に対するGLP−1刺激の投与量−応答の関係を確立するため(GLP
−1を、2.5、 5、 15、 25nmol用いて)、標準の食事テスト後
、およびグルカゴンテスト(I.V.で1mg投与)後の応答を比較するもので
ある。その第2部の目的は、選択された投与量のより大きいグループ(II型糖尿
病患者12人と、対応する健康人12人)における作用効果を評価し、更に血漿グ
ルコースを15mmol/Lにまで増大させてグルコースの輸液と併用させたと
きのGLP−1の効果を検査することである。その第3部の目的は、上記第2部
のグルコース+GLP−1組合せの注射を、最大分泌能の判定に使用されたアル
ギニンを用いた従前の高血糖クランプと比較することである。 第1部:6人のII型糖尿病患者(4人の男性と2人の女性;平均値(範囲):年
齢56歳(48−67歳);BMI:31.1kg/m(27−38kg/m );HbA1c:9.6%(7.0−12.5%)および6人の健康人(4人の
男性と2人の女性;平均値(範囲):年齢56歳(51−70歳);BMI:31.
6kg/m(26−37kg/m);HbA1c:5.5%(5.2−5.
8%)。 第2部:患者グループを更に6人のII型糖尿病男性患者を含めるよう
にした(平均値(範囲):年齢59歳(49−69歳);BMI:30.0kg/m
(26−35kg/m);HbA1c:8.9%(8.1−10%)および
更に6人の健康人(平均値(範囲):年齢57歳(50−64歳);BMI:30.
4kg/m(28−34kg/m);HbA1c:5.7%(5.5−6%
)、従って、このグループは合計12人のII型糖尿病患者と、これに対応する1
2人の健康人からなるものであった。7人の患者は食事のみで治療し、5人は食
事と、経口抗糖尿病薬(スルホニル尿素および/又はビグアニド)で治療した。
6人の患者は高血圧症の履歴があり、サイアザイド、ACE抑制剤および/又は
カルシウム拮抗薬で治療した。 第3部:8人のII型糖尿病患者(7人の男性と
1人の女性;平均値(範囲):年齢55歳(49−69歳);BMI:30.9kg
/m(27−35kg/m);HbA1c:7.6%(6.3−8.6%)
および8人の健康人(平均値(範囲):年齢55歳(51−64歳);BMI:31
.1kg/m(25−38kg/m);HbA1c:5.4%(5.0−6
.0%)。4人の患者は食事のみで治療し、4人は食事と、経口抗糖尿病薬(ス
ルホニル尿素および/又はビグアニド)で治療した。5人の患者は高血圧症の履
歴があり、サイアザイド、ACE抑制剤および/又はカルシウム拮抗薬で治療し
た。全てのII型糖尿病患者は国家糖尿病データグループ(National D
iabbetes Data Group)の基準に従って診断された。いずれ
の患者も腎機能障害はなく(正常な血清クレアチンレベル(<130μmol/
L)およびミクロアルブミン尿症はなかった)、増殖性網膜症や肝臓障害もなか
った。いずれの健康人も家族に糖尿病の履歴はなく、経口耐グルコーステスト(
OGTT)も正常であった。全ての人は口頭および書面による情報を受けたのち
、テストに参加することに同意した。
【0024】 全ての経口抗糖尿病薬の投与は検査の72時間前に中止した。一晩の断食(1
0PM)後、被験者は横臥の状態で2本の針を肘静脈に挿入して検査した。つま
り、一方の針はGLP−1、グルカゴン、L−アルギニンおよび/又はグルコー
スの注射のため、他方は血液のサンプリングのためである。
【0025】 第1部: 全ての参加者に対し、6日間の別々の日にランダムな順序で、食事
テスト、グルカゴン(1mg)のI.V.ボーラス注射、又はGLP−1の異な
る投与量(2.5,5,15,25nmol)により検査した。食事テストは:
標準の朝食の摂取前、15分、10分および0分、摂取後、15分、30分、4
5分、60分、75分、90分、120分、150分、180分の各時点で血液
を静脈から採取した。この食事は、566kcal(2370kJ)で、34%
の脂肪、47%の炭水化物、19%のたんぱく質からなるものであった。グルカ
ゴンの静脈内投与又はGLP−1のI.V.投与について:1mg(=287n
mol)の生合成グルカゴン(GlucaGen,Novo Nordisk,
Bagsvaerd,デンマーク)のI.V.ボーラス投与、又はGLP−1の
4種の異なる投与量による投与の前、15分、10分および0分、投与後、2分
、3分、4分、6分、8分、10分、15分、20分、30分、45分の各時点
で血液を静脈から採取した。合成GLP−1(7−36)アミドはPenisu
la Europe(Meyerside,英国)から購入した。ペプチドは2
%ヒト血清アルブミン(Albumin Nordisk,Novo Nord
isk,Bagsvaerd,デンマーク;B型肝炎表面抗原およびヒト免疫欠
損ウイルス抗体が全くないことが保証されたもの)を含む滅菌水に溶解させ、滅
菌ろ過を行った。各被験者に対する適当な量のペプチドを調剤し、ガラスアンプ
ルに入れ、実験日まで滅菌状態で凍結保存した。
【0026】 第2部: β−細胞を異なる3日間検査した。ランダムな順序で、標準食事テ
スト、I.V.グルカゴンテスト(1mg)、および2.5nmolのGLP−
1のボーラス注射により検査した。更に、絶食時血漿グルコース(FPG)が1
5mmol/L未満のII型糖尿病患者(12人中、9人)および全ての健康人に
対し、グルコース+GLP−1組合せの注射を行った。ゼロ時間(0分)で、5
0%グルコース(w/v)を1分間、輸液し、血漿グルコースを15mmol/
Lに増大させた(計算方法は:(15mmol/L−絶食時血漿グルコース)x
35mgグルコース x 体重(kg))。更に3分後、2.5nmolのG
LP−1のボーラス注射を2分間行った。I.V.注射の後、GLP−1が急速
に代謝され[7,8]、従ってβ−細胞に対する十分な効果が求められる前に分
裂され、この方法では最大の効果を得ることが不可能であると思われる。血漿G
LP−1の更なる持続的上昇効果を検査するため、II型糖尿病患者の8人と、7
人の健康人に対し、GLP−1の皮下注射を行った(1.5nmolのGLP−
1/kg体重を臍周縁部に注射した)[9]。15分後、上述のグルコース(5
0%w/v)の静脈内投与により、血漿グルコースは15mmol/Lに増大し
た。GLP−1の投与の前、15分、10分および0分、投与後、10分、20
分、30分、40分、50分、60分、70分、80分、90分の各時点で血液
を静脈から採取した。この実験の結果を、同じ8人の患者と、7人の健康人に対
するI.V.グルコース/GLP−1組合せの注射によるものと比較した(8人
の患者の内の2人については、FPGが15mmol/Lであったため、グルコ
ース/GLP−1組合せの注射の代わりに、グルコースの事前の投与を行うこと
なくGLP−1の注射を行った。)。
【0027】 第3部: 異なる2日間、ランダムな順序で、グルコース/GLP−1組合せ
の注射、又は5gのL−アルギニンモノ塩酸塩を用いた高血糖クランプを行い、
最大分泌能を予測した。高血糖クランプの間、ゼロ時間で、グルコース(50%
w/v)を注射し、血漿グルコースを30mmol/Lに増大させた(計算方法
は:(30mmol/L−絶食時血漿グルコース)x 35mgグルコース x
体重(kg))。グルコースの連続的輸液により血漿グルコースを30mmo
l/Lに維持した。この値は血漿グルコースのベッド際の測定により5分毎に調
整した。45分の時点において、5gのL−アルギニンモノ塩酸塩を30秒間、
ボーラスとして注射した。血漿グルコースの上昇前、15分、10分および0分
、上昇後、5分、10分、15分、20分、25分、30分、35分、40分、
45分、47分、48分、49分、51分、53分、55分、60分、65分、
70分、75分、90分の各時点で血液を静脈から採取した。L−アルギニンは
50mLの滅菌水に溶解、調剤し、ガラスアンプルに入れ、実験日まで4℃で保
存した。血液をフッ化チューブ中に採取し、グルコースについて測定し、更に、
アプロチニン(aprotinin;500 KIU/mL 血液;Trasy
lol,Bayer,Leverkusen,ドイツ国)を伴った冷却EDTA
チューブ中に採血し、ペプチドを分析した。これらチューブは直ちに,氷上で冷
却し、4℃で20分以内で遠心分離し、血漿を-20℃で分析時まで貯蔵した。
この実験の間、参加者全てについて副作用について尋ね、結果を表2に示す。
【0028】 グルコース分析器(Yellow Springs Instrument
Model 23A,米国)を用いたグルコースオキシダーゼ法により、実験の
間、血漿グルコース濃度を測定した。血漿インシュリン濃度は、ヒトインシュリ
ンのスタンダードと、抗体コード番号2004を用い、Albanoらの方法に
従って測定した。この検査法の感度は、約3pmol/Lであり、検査内変動率
は48pmol/Lで8%である。C-ペプチド濃度は、ポリクローン抗体M1
230[12]を用いたHedingら[11]に記載された放射免疫検定法(
RIA)を用いて判定した。稀に見られるプロインシュリン変換中間型:DES
(64,65)−プロインシュリンは強力に交差反応し(126%)、それに対
し、プロインシュリン様免疫反応性の優勢型:DES(31,32)および完全
なプロインシュリンはC-ペプチド(100%)に対し、13−15%反応する
。検知限界はほぼ60pmol/Lであり、検査内変動率は5%であり、検査間
変動率は7.3%である。血漿サンプルをGLP−1免疫反応性についてGLP
−1分子の各末端に対し特異的なRIAsを用いて検査した。N-末端免疫反応
性を、抗血清93242[13]を用いて測定した。この抗血清はGLP−1(
1−36)アミドとほぼ10%で交差反応し、GLP−1(8−36)アミドお
よびGLP−1(9−36)アミドと0.1%未満で交差反応する。この検査は
5pmol/Lの検知限界を有する。GLP−1のC-末端免疫反応性を抗血清No
.89390を用い、合成GLP−1(7−36)アミド(=プログルカゴン7
8−107アミド)のスタンダードに対し測定した。この抗血清No.89390
の交差反応は、C−末端切欠フラグメントに対しては0.01%未満、GLP−
1(9−36)アミドに対しては83%未満であった。検知限界は1pmol/
Lである。
【0029】 第1部: インシュリンおよびC−ペプチドの濃度を図1に示す。インシュリ
ンおよびC-ペプシドのピーク濃度はGLP−1又はグルカゴンのI.V.注射後
6-10分の時点、更に、食事(食事のデータは示していない)後、90分(患者
の場合)および30-90分(健康人の場合)に認められた。II型糖尿病患者お
よび健康人についてのインシュリンおよびC−ペプチドの平均ピーク濃度を表1
に示す。同様の結果が、所定のサンプリング時間(例えば、輸液後6分)での値を
比較した場合に得られた。2.5nmolのGLP−1投与、標準食事テスト、
1mgのグルカゴンの投与の後のインシュリンおよびC−ペプチドのピーク濃度
は、個々のピーク濃度を比較した場合、有意な差が認められなかった(p=0.
059、ANO.VA)。II型糖尿病患者においては、GLP−1の投与量を多
くすることにより、インシュリン(p=0.0033)およびC−ペプチド(p
=0.0006)の応答がより高くなった(繰返し測定、ANOVA)。“Po
st hoc”比較の結果、インシュリンに関するGLP−1対食事テスト(p
<0.05およびp<0.01)において、15nmolと25nmol(GL
P−1)との間に有意差は認められなかった。更に、C−ペプチドについての、
2.5nmolと25nmolのGLP−1(p<0.05)、15および25
nmolのGLP−1対グルカゴンテスト(p<0.05およびp<0.01)
、25nmolのGLP−1対食事テスト(p<0.05)間においても有意差
は認められなかった。健康人においては、異なる6日間における応答において有
意差は認められなかった(インシュリン(p=0.57)およびC−ペプチド(
p=0.12))。
【0030】 基底血漿GLP−1濃度は、4−10pmol/Lであった。完全なGLP−1の基
底濃度は、4種の異なる投与量のI.V.注射後10-30分で再び到達した。
GLP−1の投与量の増加に伴い、血漿GLP−1のピーク濃度も直線的に増大
し(図2)、この傾向はII型糖尿病患者および健康人について同様であった。
【0031】 これらのテストの間に記録された副作用が表2に示されており、参加者の42
ないし67%の者が満足感の減退を訴え、GLP−1の低い投与量(2.5およ
び5nmol)でも33%ないし50%の者が吐き気を訴えた。グルカゴンテス
トでは、参加者の83%の者が満足感の減退を訴え、75%の者が吐き気を訴え
た。GLP−1の投与量を増加したところ(15および25nmol)、参加者
の100%の者が満足感の減退を訴え、67%ないし83%の者が吐き気を訴え
、副作用の増加が認められた。GLP−1の全ての投与量において、可成りの血
漿グルコース低下作用が糖尿病患者(4日間の実験日における平均FPGは:1
1mmol/Lないし12.6mmol/L)(この場合、PGは0.8ないし
1.4mmol/L減少し、投与量間に有意な差はない)並びに健康人(FPG
は:5.3mmol/Lないし5.5mmol/L)(この場合、PGは1.0
ないし1.3mmol/L減少し、投与量間に有意な差はない)の双方に認めら
れた。グルカゴンテストおよび食事テストの間の平均FPGは、II型糖尿病患者
の場合、それぞれ10.8mmol/Lおよび11.4mmol/Lであり、健
康人の場合、それぞれ5.3mmol/Lおよび5.6mmol/Lであった。
【0032】 この検査の第2部からのインシュリンおよびC−ペプチドの平均濃度を図3に
示す。インシュリンおよびC-ペプシドのピーク濃度は、2.5nmolのGLP
−1投与、標準食事テスト、グルカゴンテストにおいて、II型糖尿病患者および
健康人について同様であった(但し、25nmolのGLP−1対食事テスト(
p<0.05)における健康人のC−ペプチド応答を除く)(表3)。健康人に
ついて、グルコース/GLP−1組合せ注射の場合に、25nmolのGLP−
1の単独投与と比較してインシュリンおよびC−ペプチドの増加が認められた(
p<0.001)(患者についてのNS)。
【0033】 この検査の第2部において副作用の発生は少なく、グルカゴンテストでは、参
加者の54%の者が満足感の減退を訴え、46%の者が吐き気を訴え、これに対
し、2.5nmolのGLP−1テストでは、参加者の42%の者が満足感の減
退を訴え、29%の者が吐き気を訴えた。グルコース+GLP−1組合せの注射
の間において、19%の患者が満足感の減退および吐き気を訴えた。この副作用
に関し、患者グループと、対照グループとの間に差異は認められなかった(表2
)。II型糖尿病患者においては、グルコース濃度が15mmol/Lで、1.5
nmolのGLP−1/kg体重を皮下投与した後のインシュリンおよびC−ペ
プチドの平均ピーク応答と、グルコース+GLP−1組合せへの応答との間に有
意な差は認められなかった(>0.05)。健康人に対しては、インシュリンに関
しては有意な差は認められなかったが(>0.05)、C−ペプチド(P=0.
046)に関しては若干の差が認められた(図4)。5日間の実験日における平
均FPGは、糖尿病患者の場合、それぞれ10.2mmol/Lおよび11.2
mmol/Lであり、健康人の場合、それぞれ5.3mmol/Lおよび5.5
mmol/Lであった。
【0034】 研究第3部からの血漿インシュリンおよびC−ペプチド濃度が図5および表4
に示されている。インシュリンおよびC-ペプシドのピーク濃度はグルコース+
GLP−1組合せの輸液の間のGLP−1のボーラス注射の終了後6-10分の
時点並びに高血糖クランプの間のアルギニンの注射後4分の時点で認められた。
II型糖尿病患者のインシュリンおよびC−ペプチド(かっこ内)の平均濃度はG
LP−1の注射の時点で63±11(811±111)pmol/L、45分の高血糖
クランプの後、5gのL-アルギニン注射の直前において189±46(168
2±280)pmol/Lであった。健康人についての対応する結果は、それぞれ61
±14(689±58)pmol/L、463±126(2657±307)pmol/Lで
あった。インシュリンおよびC−ペプチド(かっこ内)応答の増加はGLP−1
注射時とアルギニン注射時の濃度の差として計算し、ピーク応答はII型糖尿病患
者については、グルコース+GLP−1組合せのテストの間では、411±13
0(1483±309)pmol/Lであり、高血糖クランプの間では、628±22
6(1360±250)pmol/Lであった(p=0.19(p=0.63))。同
じく、健康人ではそれぞれ1342±302(3364±502)pmol/L、19
21±338(3391±388)pmol/Lであった(p=0.008(p=0.
92))。II型糖尿病患者のインシュリンおよびC−ペプチド(かっこ内)の絶
対平均ピーク濃度はグルコース+GLP−1輸液の間では、475±141(2
295±379)pmol/L、高血糖クランプの間では、816±268(3043
±508)pmol/Lであった(p=0.09(p=0.02))。健康人について
の対応する結果は、それぞれ1403±308(4053±533)pmol/L、2
384±452(6047±652)pmol/Lであった(p=0.003(p=0
.0003))。FPG平均は、II型糖尿病患者については、グルコース/GL
P−1組合せ注射の当日では8.9mmol/L、高血糖クランプの当日では9
.2mmol/Lであった。同じく、健康人ではそれぞれ5.5mmol/L、
5.6mmol/Lであった。
【0035】 表1 (検査の第1部におけるII型糖尿病患者および対照健康人についてのピ
ークインシュリンおよびC-ペプシド濃度) 患者 対照 P −値 (平均±SEM) (平均±SEM)(対t−テスト) 2.5nmol GLP-1 インシュリン(pmol/L) 268±47 270±18 (p=0.95) C-ペプチド(pmol/L) 1771±237 1788±110 (p=0.95) 5nmol GLP-1 インシュリン(pmol/L) 318±32 340±67 (p=0.72) C-ペプチド(pmol/L) 1970±172 1716±254 (p=0.55) 15nmol GLP-1 インシュリン(pmol/L) 348±39 343±57 (p=0.81) C-ペプチド(pmol/L) 2049±169 1769±215 (p=1.0) 25nmol GLP-1 インシュリン(pmol/L) 360±29 359±60 (p=0.49) C-ペプチド(pmol/L) 2195±164 2144±248 (p=0.19) グルカゴン テスト(1mg) インシュリン(pmol/L) 265±45 360±39 (p=0.98) C-ペプチド(pmol/L) 1643±178 1874±158 (p=0.38) 食事テスト インシュリン(pmol/L) 197±31 386±61 (p=0.95) C-ペプチド(pmol/L) 1735±218 2398±265 (p=0.77)
【0036】 表2 (GLP−1テストの間の副作用(患者および対照)) 第1部 2-1/2 5 15 25 グルカゴン nmol nmol nmol nmol テスト (n=12) (n=12) (n=12) (n=12) (n=12) 満足感の変化(%) 67 42 100 100 83 発汗(%) 17 17 83 67 33 吐き気(%) 50 33 67 83 75 第2部 2-1/2 グルコース/GLP−1 グルカゴン テスト nmol テスト (n-24) (n=24) (n=21) 満足感の変化(%) 42 19 54 発汗(%) 13 10 25 吐き気(%) 29 19 46
【0037】 表3 (検査の第2部におけるII型糖尿病患者および対照健康人についてのピ
ークインシュリンおよびC-ペプシド濃度) 患者 対照 P−値 (平均±SEM) (平均±SEM) (対t−テスト) 2.5nmol GLP-1 インシュリン(pmol/L) 390±74 356±51 (p=0.68) C-ペプチド(pmol/L) 2144±254 2001±130 (p=0.64) グルコース+GLP-1 インシュリン(pmol/L) 465±87 1412±187 (p=0.002)* C-ペプチド(pmol/L) 2384±299 4391±416 (p=0.001)* グルカゴンテスト(1mg) インシュリン(pmol/L) 329±50 420±61 (p=0.28) C-ペプチド(pmol/L) 1780±160 1995±99 (p=0.27) 食事テスト インシュリン(pmol/L) 277±42 543±89 (p=0.01)* C-ペプチド(pmol/L) 2181±261 2873±210 (p=0.03)*
【0038】 表4 (検査の第3部におけるII型糖尿病患者および対照健康人についてのピ
ークインシュリンおよびC-ペプチド濃度) 患者 対照 P−値 (平均±SEM) (平均±SEM) (対t−テスト) グルコース+GLP-1 インシュリン(pmol/L)475±141 1403±308 (p=0.03)* C-ペプチド(pmol/L) 2295±379 4053±533 (p=0.03)* 高血糖 クランプ 816±268 2384±452 (p=0.02)* インシュリン(pmol/L)3043±508 6047±652 (p=0.01)* C-ペプチド(pmol/L)
【0039】 上記説明から、上述のように投与されたGLP−1が、患者がII型糖尿病を患
っているか、又はその危険性があるか否かを判定するため外来患者のインシュリ
ン分泌能をテストするための最適のものであることが理解されるであろう。従っ
て、上記目的の全てを達成し得る。
【図面の簡単な説明】
【図1A】 II型糖尿病患者の血漿インシュリン平均濃度を示すもので、x−x線はGLP
−1が2.5nmolの場合、o−o線はGLP−1が5nmolの場合、■−
■線はGLP−1が15nmolの場合、▲−▲線はGLP−1が25nmol
の場合、●−●線はグルカゴンが1mgの場合を実験の第1部として示すグラフ
図。
【図1B】 健康人の血漿インシュリン平均濃度を示すもので、x−x線はGLP−1が2
.5nmolの場合、o−o線はGLP−1が5nmolの場合、■−■線はG
LP−1が15nmolの場合、▲−▲線はGLP−1が25nmolの場合、
●−●線はグルカゴンが1mgの場合を実験の第1部として示すグラフ図。
【図1C】 II型糖尿病患者のC−ペプチド濃度を示すもので、x−x線はGLP−1が2
.5nmolの場合、o−o線はGLP−1が5nmolの場合、■−■線はG
LP−1が15nmolの場合、▲−▲線はGLP−1が25nmolの場合、
●−●線はグルカゴンが1mgの場合を実験の第1部として示すグラフ図。
【図1D】 健康人のC−ペプチド濃度を示すもので、x−x線はGLP−1が2.5nm
olの場合、o−o線はGLP−1が5nmolの場合、■−■線はGLP−1
が15nmolの場合、▲−▲線はGLP−1が25nmolの場合、●−●線
はグルカゴンが1mgの場合を実験の第1部として示すグラフ図。
【図2】 II型糖尿病患者糖尿病(◆−◆線)および健康人(□−□線)について、C−
末端(上方曲線)およびN−末端(下方曲線)に向けられたRIAによるピーク
血漿GLP−1濃度を示す図。
【図3A】 II型糖尿病患者の血漿インシュリン平均濃度を示すもので、x−x線はGLP
−1が2.5nmolの場合、●−●線はグルカゴンが1mgの場合、□−□線
はグルコース/GLP−1組合せを注射の場合を実験の第2部として示すグラフ
図。
【図3B】 健康人の血漿インシュリン平均濃度を示すもので、x−x線はGLP−1が2
.5nmolの場合、●−●線はグルカゴンが1mgの場合、□−□線はグルコ
ース/GLP−1組合せを注射の場合を実験の第2部として示すグラフ図。
【図3C】 II型糖尿病患者のC−ペプチド濃度を示すもので、x−x線はGLP−1が2
.5nmolの場合、●−●線はグルカゴンが1mgの場合、□−□線はグルコ
ース/GLP−1組合せを注射の場合を実験の第2部として示すグラフ図。
【図3D】 健康人のC−ペプチド濃度を示すもので、x−x線はGLP−1が2.5nm
olの場合、●−●線はグルカゴンが1mgの場合、□−□線はグルコース/G
LP−1組合せを注射の場合を実験の第2部として示すグラフ図。
【図4A】 II型糖尿病患者の血漿インシュリン平均濃度を示すもので、x−x線はグルコ
ース/GLP−1組合せを注射した場合、◆−◆線はGLP−1を皮下投与し、
ついでグルコース注射注射した場合を示すグラフ図。
【図4B】 健康人の血漿インシュリン平均濃度を示すもので、x−x線はグルコース/G
LP−1組合せを注射した場合、◆−◆線はGLP−1を皮下投与し、ついでグ
ルコース注射注射した場合を示すグラフ図。
【図4C】 II型糖尿病患者のC−ペプチド濃度を示すもので、x−x線はグルコース/G
LP−1組合せを注射した場合、◆−◆線はGLP−1を皮下投与し、ついでグ
ルコース注射注射した場合を示すグラフ図。
【図4D】 健康人のC−ペプチド濃度を示すもので、x−x線はグルコース/GLP−1
組合せを注射した場合、◆−◆線はGLP−1を皮下投与し、ついでグルコース
注射注射した場合を示すグラフ図。
【図5A】 II型糖尿病患者の血漿インシュリン平均濃度を示すもので、x−x線はグルコ
ース/GLP−1組合せを注射した場合、◆−◆線はアルギニンを用いた高血糖
クランプを用いた場合を示すグラフ図。
【図5B】 健康人の血漿インシュリン平均濃度を示すもので、x−x線はグルコース/G
LP−1組合せを注射した場合、◆−◆線はアルギニンを用いた高血糖クランプ
を用いた場合を示すグラフ図。
【図5C】 II型糖尿病患者のC−ペプチド濃度を示すもので、x−x線はグルコース/G
LP−1組合せを注射した場合、◆−◆線はアルギニンを用いた高血糖クランプ
を用いた場合を示すグラフ図。
【図5D】 健康人のC−ペプチド濃度を示すもので、x−x線はグルコース/GLP−1
組合せを注射した場合、◆−◆線はアルギニンを用いた高血糖クランプを用いた
場合を示すグラフ図。
【手続補正書】特許協力条約第34条補正の翻訳文提出書
【提出日】平成13年6月5日(2001.6.5)
【手続補正1】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 EP(AT,BE,CH,CY, DE,DK,ES,FI,FR,GB,GR,IE,I T,LU,MC,NL,PT,SE),OA(BF,BJ ,CF,CG,CI,CM,GA,GN,GW,ML, MR,NE,SN,TD,TG),AP(GH,GM,K E,LS,MW,MZ,SD,SL,SZ,TZ,UG ,ZW),EA(AM,AZ,BY,KG,KZ,MD, RU,TJ,TM),AE,AL,AM,AT,AU, AZ,BA,BB,BG,BR,BY,CA,CH,C N,CR,CU,CZ,DE,DK,DM,EE,ES ,FI,GB,GD,GE,GH,GM,HR,HU, ID,IL,IN,IS,JP,KE,KG,KP,K R,KZ,LC,LK,LR,LS,LT,LU,LV ,MA,MD,MG,MK,MN,MW,MX,NO, NZ,PL,PT,RO,RU,SD,SE,SG,S I,SK,SL,TJ,TM,TR,TT,TZ,UA ,UG,UZ,VN,YU,ZA,ZW Fターム(参考) 4C085 HH20 KA36 KA40 KB78 KB82 KB95 LL15 4H045 AA30 BA09 CA40 DA30 EA27 EA28 EA30

Claims (17)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項1】 個人におけるβ−細胞分泌能を評価する方法であって、グル
    コースおよびグルカゴン様ペプチド−1又は生物学的に活性な類似体を投与し;
    健康人の標準的応答との対比で該個人の応答を測定し、該個人がβ−細胞機能損
    傷を有するか否かを判定することを特徴とする方法。
  2. 【請求項2】 受容体結合化合物が、(a)グルカゴン様ペプチド−1のア
    ミノ酸配列からなるペプチド,および(b)上記グルカゴン様ペプチド−1とは
    1以上の置換、欠失又は挿入によって異なるアミノ酸配列からなる変異体ペプチ
    ドの内から選択されるものである請求項1記載の方法。
  3. 【請求項3】 該受容体結合化合物がグルカゴン様ペプチド−1である請求
    項2記載の方法。
  4. 【請求項4】 該受容体結合化合物が、配列、His Ala Glu G
    ly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser T
    yr Leu Glu Gly Gln Ala Ala Lys Glu P
    he Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg G
    ly (SEQ. ID NO:3)を有するグルカゴン様ペプチド−1(7−
    37)である請求項2記載の方法。
  5. 【請求項5】 該受容体結合化合物が、配列、His Ala Glu G
    ly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser T
    yr Leu Glu Gly Gln Ala Ala Lys Glu P
    he Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg (
    NH) (SEQ. ID NO:4)を有するグルカゴン様ペプチド−1(
    7−36)アミドである請求項2記載の方法。
  6. 【請求項6】 該受容体結合化合物が、変異体ペプチドであって、それが該
    アミノ酸配列における置換、欠失および挿入の組合せにおいて上記グルカゴン様
    ペプチド−1のアミノ酸配列からの10を超えるアミノ酸によって異なるもので
    はない請求項2記載の方法。
  7. 【請求項7】 該受容体結合化合物のin vivoでの半寿命を向上させる薬剤
    を更に含む請求項1記載の方法。
  8. 【請求項8】 該受容体結合化合物がポリヌクレオチドにより表されるもの
    である請求項1記載の方法。
  9. 【請求項9】 グルコース/GLP−1又はその生物学的活性類似体の組合
    せを患者に同時に輸液する請求項1記載の方法。
  10. 【請求項10】 患者に、最初にグルコースをついで後にGLP−1を輸液
    する請求項1記載の方法。
  11. 【請求項11】 GLP−1の投与が0.05nmolないし100nmo
    lをボーラスで静脈内におこなうものである請求項1記載の方法。
  12. 【請求項12】 投与が、10nmolないし1000nmolをボーラス
    で皮下におこなうものである請求項1記載の方法。
  13. 【請求項13】 患者に、GLP−1又はその生物学的活性類似体を0.1
    pmol/kg/分ないし10 pm/kg/分で静脈内に連続的に輸液する
    請求項1記載の方法。
  14. 【請求項14】 投与が0.5ないし50 pm/kg/分で皮下に連続的
    に輸液するものである請求項1記載の方法。
  15. 【請求項15】 個人が、グルコース耐性阻害を有するものである請求項1
    記載の方法。
  16. 【請求項16】 個人におけるβ−細胞のグルコースに対する応答を評価す
    る方法であって、グルコースおよびグルカゴン様ペプチド−1又は生物学的に活
    性な類似体を投与し;健康人の標準的応答との対比で該個人の応答を測定し、該
    個人がβ−細胞機能損傷を有するか否かを判定することを特徴とする方法。
  17. 【請求項17】 個人が、グルコース耐性阻害を有するものである請求項1
    記載の方法。
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