CN117178061A - 单细胞聚糖谱分析 - Google Patents

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Abstract

本公开涉及使用单细胞谱分析方法检测和分析健康和患病细胞的糖基化和蛋白质特异性糖基化模式的方法、组合物、系统和试剂盒。

Description

单细胞聚糖谱分析
相关申请的交叉引用
本申请要求2021年2月23日提交的美国临时专利申请号63/152,488的优先权权益，该申请据此全文以引用方式并入以用于任何和所有目的。
技术领域
本发明涉及糖生物学和糖组学领域。所公开的试剂盒、组合物、系统和方法允许在单细胞水平上对聚糖和糖蛋白进行谱分析。
背景技术
翻译后修饰(PTM)是细胞调节其蛋白质组功能能力的一种核心机制。鉴定和表征这些PTM仍然是蛋白质组学的主要目标。在300多种已知的蛋白质修饰中，糖基化是最丰富和复杂的PTM之一。糖基化的复杂性源于两个因素：即，构件的多样性以及在细胞内可以由这些构件组装寡糖的多种方式。与转录和翻译不同，糖基化不是模板驱动的。相反，糖基化是翻译后修饰，并且蛋白质糖基化是动态的。糖蛋白和糖脂是通过在分泌途径中将单糖和复杂寡糖酶促加成到蛋白质或脂质支架上而产生的。糖基化过程可以产生产物的显著多样性和异质性，并且糖基化可以改变蛋白质的特性，包括运输、定位、结合特异性和热力学稳定性。
糖基化期间使用的单糖构件可以以多样的线性和分支模式进行组装，以在生物体中产生复杂的碳水化合物集合，也称为其“糖组”。单糖与蛋白质支架上特定位点的结合产生了额外的结构多样性。任何一种糖蛋白的浓度也可能非常低，并且低浓度在复杂环境诸如人类生物样品中尤其具有挑战性。此外，任何一种糖蛋白都可能存在于表现出微观异质性和宏观异质性的多种糖型中。在微观异质性中，不同的聚糖结构存在于特定的修饰位点。此外，糖蛋白中聚糖修饰的位置或数量也存在差异。若干单糖是彼此的结构异构体，因此具有相同的分子量。此外，单糖之间的键连化学带来了额外的复杂性。因为糖基化是一种翻译后过程，不在基因组中编码，并且因为分泌途径中聚糖生物合成的复杂性，表征细胞表面聚糖的功能和多样性是一项具有挑战性的工作。Palaniappian和Bertozzi,Chem.Rev.116:14277-14306(2016)
因此，需要一种单细胞平台，其能够结合单细胞测序技术、转录组分析和聚糖检测，对跨越多种病理生理状态的不同细胞类型进行全面和更深入的糖基化分析。本公开满足了这一需求。
发明内容
本文提供了分析糖组的方法。本公开的一个方面提供了一种确定样品中一种或多种聚糖的存在的方法，该方法包括以下步骤：(a)将样品与(i)包含核苷酸糖和反应对的第一反应性分子的第一标志分子及(ii)第一聚糖特异性转移酶一起孵育；(b)将样品与第一报告分子混合，该第一报告分子包含(i)反应对的第二反应性分子和(ii)具有第一聚糖基序特异性报告条形码序列的第一报告寡核苷酸；(c)从样品中去除未掺入的报告分子；(d)将样品分隔到多个分区中，使得一个分区包含(i)来自样品的单细胞或单细胞裂解物和(ii)具有分区特异性条形码序列的多个核酸条形码分子；以及(e)使用第一报告寡核苷酸和多个核酸条形码分子中的一个核酸条形码分子来产生第一加聚糖条形码的核酸分子，该第一加聚糖条形码的核酸分子包含分区特异性条形码序列或其互补序列和第一聚糖基序特异性报告条形码序列或其互补序列。在一些实施方案中，第一标志分子被掺入到样品中的聚糖修饰的糖蛋白上。在一个实施方案中，第一报告分子经由第一标志分子缀合在聚糖修饰的糖蛋白上。
在一些实施方案中，确定样品中一种或多种聚糖的存在的方法还包括(a)确定第一加聚糖条形码的核酸分子或其衍生物的序列，以鉴定(i)分区特异性条形码序列或其互补序列和(ii)第一聚糖基序特异性报告条形码序列或其互补序列；和/或(b)使用鉴定的分区特异性条形码序列或其互补序列和鉴定的第一聚糖基序特异性报告条形码序列或其互补序列来确定样品中至少一种聚糖的存在和/或丰度。
在一些实施方案中，确定样品中一种或多种聚糖的存在的方法还包括：(a)将样品与(i)包含第二核苷酸糖和第二反应对的第一反应性分子的第二标志分子及(ii)第二聚糖特异性转移酶一起孵育；以及(b)将样品与第二报告分子混合，该第二报告分子包含(i)第二反应对的第二反应性分子，其中第二反应性分子能够偶联到第二反应对的第一反应性分子，和(ii)具有鉴定第二聚糖基序的报告条形码序列的第二报告寡核苷酸。在一个实施方案中，第二标志分子被掺入到样品中的聚糖修饰的糖蛋白上。在一个实施方案中，第二报告分子经由第二标志分子缀合在聚糖修饰的糖蛋白上。
在一个实施方案中，该方法还包括以下步骤：(a)使用第二报告寡核苷酸和多个核酸条形码分子中的该核酸条形码分子来产生第二加聚糖条形码的核酸分子，该第二加聚糖条形码的核酸分子包含分区特异性条形码序列或其互补序列和第二聚糖基序特异性报告条形码序列或其互补序列；(b)确定第二加聚糖条形码的核酸分子或其衍生物的序列，以鉴定(i)分区特异性条形码序列或其互补序列和(ii)第二聚糖基序特异性报告条形码序列或其互补序列；以及使用鉴定的分区特异性条形码序列或其互补序列和鉴定的第二聚糖基序特异性报告条形码序列或其互补序列来确定所述样品中第一聚糖和第二聚糖的存在和/或丰度。
在一些实施方案中，确定样品中一种或多种聚糖的存在的方法还包括：(a)将样品与(i)包含第三核苷酸糖和第三反应对的第一反应性分子的第三标志分子及(ii)第三聚糖特异性转移酶一起孵育，其中第三标志分子被掺入到样品中的聚糖修饰的糖蛋白上；以及(b)将样品与第三报告分子混合，该第三报告分子包含(i)第三反应对的第二反应性分子，和(ii)具有鉴定第三聚糖基序的报告条形码序列的第三报告寡核苷酸，其中第三报告分子经由第三标志分子缀合在聚糖修饰的糖蛋白上。在一个实施方案中，第二反应性分子能够偶联到第三反应对的第一反应性分子。
在一个实施方案中，该方法还包括以下步骤：(a)使用第三报告寡核苷酸和多个核酸条形码分子中的该核酸条形码分子来产生第三加聚糖条形码的核酸分子，该第三加聚糖条形码的核酸分子包含分区特异性条形码序列或其互补序列和第三聚糖基序特异性报告条形码序列或其互补序列；(b)确定第三加聚糖条形码的核酸分子或其衍生物的序列，以鉴定(i)分区特异性条形码序列或其互补序列和(ii)第三聚糖基序特异性报告条形码序列或其互补序列；以及(c)使用鉴定的分区特异性条形码序列或其互补序列和鉴定的第三聚糖基序特异性报告条形码序列或其互补序列来确定样品中第一聚糖、第二聚糖基序和第三聚糖的存在和/或丰度。
在一些实施方案中，确定样品中一种或多种聚糖的存在的方法还包括：(a)将样品与(i)包含第四核苷酸糖和第四反应对的第一反应性分子的第四标志分子及(ii)第四聚糖特异性转移酶一起孵育；以及(b)将样品与第四报告分子混合，该第四报告分子包含(i)第四反应对的第二反应性分子，其中第二反应性分子能够偶联到所述第四反应对的第一反应性分子，和(ii)具有鉴定第四聚糖基序的报告条形码序列的第四报告寡核苷酸。在一个实施方案中，第四标志分子被掺入到样品中的聚糖修饰的糖蛋白上。在一个实施方案中，第四报告分子经由第四标志分子缀合在聚糖修饰的糖蛋白上。
在一个实施方案中，该方法还包括以下步骤：(a)使用第四报告寡核苷酸和多个核酸条形码分子中的该核酸条形码分子来产生第四加聚糖条形码的核酸分子，该第四加聚糖条形码的核酸分子包含分区特异性条形码序列或其互补序列和第四聚糖基序特异性报告条形码序列或其互补序列；(b)确定第四加条形码的核酸分子或其衍生物的序列，以鉴定(i)分区特异性条形码序列或其互补序列和(ii)第四聚糖基序特异性报告条形码序列或其互补序列；以及(c)使用鉴定的分区特异性条形码序列或其互补序列和鉴定的第四聚糖基序特异性报告条形码序列或其互补序列来确定所述样品中第一聚糖、第二聚糖、第三聚糖和第四聚糖的存在和/或丰度。
在一些实施方案中，样品选自由组织、细胞、固定细胞、活细胞和细胞裂解物组成的组。在一些实施方案中，多个分区接收来自样品的单细胞。在一些实施方案中，来自单细胞的裂解物被包封在细胞珠粒中，包被在细胞珠粒上，包埋在细胞珠粒中，或它们的任何组合。
在一些实施方案中，确定样品中一种或多种聚糖的存在的方法还包括以下步骤：(a)提供多个细胞珠粒，该多个细胞珠粒包含细胞和报告寡核苷酸序列，该报告寡核苷酸序列包含鉴定聚糖基序的报告条形码序列；以及(b)使多个细胞珠粒经受足以裂解细胞的条件。
在一些实施方案中，足以裂解细胞的条件包括使细胞珠粒与裂解剂接触。在一些实施方案中，第一聚糖特异性转移酶、第二聚糖特异性转移酶、第三聚糖特异性转移酶或第四聚糖特异性转移酶选自由以下物质组成的组：β1-4半乳糖基转移酶、糖基转移酶、唾液酸转移酶、α1-3-岩藻糖基转移酶；人血型A抗原糖基转移酶(BgtA)；WbwK岩藻糖基转移酶；α1-2-岩藻糖基转移酶；β1-4N-乙酰氨基半乳糖转移酶；β-半乳糖苷α2-6唾液酸转移酶1；以及β-半乳糖苷α2-3唾液酸转移酶1；ST3Gal1；ST6Gal1；和CgtA。在一些实施方案中，第一标志分子、第二标志分子、第三标志分子或第四标志分子选自由以下物质组成的组：UDP-GalNAc；GDP-岩藻糖；UDP-GalNAc；和CMP-Sia。在一些实施方案中，聚糖修饰的糖蛋白包含选自由以下物质组成的组的聚糖：GlcNAc-O-R；LacNAc；Fucα1-2Gal；Galβ1-3GalNAc；Neu5Acα2-3Gal；N-聚糖；和O-聚糖。
在一些实施方案中，第一聚糖特异性转移酶、第二聚糖特异性转移酶、第三聚糖特异性转移酶或第四聚糖特异性转移酶是β1-4半乳糖基转移酶，第一标志分子、第二标志分子、第三标志分子或第四标志分子是UDP-GalNAc；并且聚糖修饰的糖蛋白上的聚糖包含GlcNAc-O-R。在一些实施方案中，第一聚糖特异性转移酶、第二聚糖特异性转移酶、第三聚糖特异性转移酶或第四聚糖特异性转移酶是α1-3-岩藻糖基转移酶，第一标志分子、第二标志分子、第三标志分子或第四标志分子是GDP-岩藻糖；并且聚糖修饰的糖蛋白上的聚糖包含LacNAc。在一些实施方案中，第一聚糖特异性转移酶、第二聚糖特异性转移酶、第三聚糖特异性转移酶或第四聚糖特异性转移酶是人血型A抗原糖基转移酶(BgtA)，第一标志分子、第二标志分子、第三标志分子或第四标志分子是UDP-GalNAc；并且聚糖修饰的糖蛋白上的聚糖包含Fucα1-2Gal。在另一个实施方案中，第一聚糖特异性转移酶、第二聚糖特异性转移酶、第三聚糖特异性转移酶或第四聚糖特异性转移酶是α1-2-岩藻糖基转移酶，第一标志分子、第二标志分子、第三标志分子或第四标志分子是GDP-岩藻糖；并且聚糖修饰的糖蛋白上的聚糖包含Galβ1-3GalNAc。在又一个实施方案中，第一聚糖特异性转移酶、第二聚糖特异性转移酶、第三聚糖特异性转移酶或第四聚糖特异性转移酶是β1-4N-乙酰氨基半乳糖转移酶，第一标志分子、第二标志分子、第三标志分子或第四标志分子是UDP-GalNAc；并且聚糖修饰的糖蛋白上的聚糖包含Neu5Acα2-3Gal。在另一个实施方案中，第一聚糖特异性转移酶、第二聚糖特异性转移酶、第三聚糖特异性转移酶或第四聚糖特异性转移酶是β-半乳糖苷α2-6唾液酸转移酶1，第一标志分子、第二标志分子、第三标志分子或第四标志分子是CMP-Sia；并且聚糖修饰的糖蛋白上的聚糖是N-聚糖。在另一个实施方案中，第一聚糖特异性转移酶、第二聚糖特异性转移酶、第三聚糖特异性转移酶或第四聚糖特异性转移酶是β-半乳糖苷α2-3唾液酸转移酶1，第二标志分子、第三标志分子或第四标志分子是CMP-Sia；并且聚糖修饰的糖蛋白上的聚糖是O-聚糖。在一些实施方案中，第一聚糖特异性转移酶是β1-4半乳糖基转移酶；第二聚糖特异性转移酶是α1-3-岩藻糖基转移酶；并且第三聚糖特异性转移酶是β-半乳糖苷α2-3唾液酸转移酶1。在一些实施方案中，第一聚糖特异性转移酶对UDP-GalNAc具有特异性；第二聚糖特异性转移酶对GDP-岩藻糖具有特异性；并且第三聚糖特异性转移酶对CMP-Sia具有特异性。在另一个实施方案中，第一聚糖特异性转移酶、第二聚糖特异性转移酶、第三聚糖特异性转移酶或第四聚糖特异性转移酶对以下物质具有特异性：GlcNAc-O-R；LacNAc；Fucα1-2Gal；Galβ1-3GalNAc；Neu5Acα2-3Gal；N-聚糖；或O-聚糖。
本公开的一个方面提供了一种确定包含一个或多个活细胞的样品中一种或多种聚糖的存在的方法，该方法包括以下步骤：(a)将样品与标志分子一起孵育，该标志分子包含合成糖和反应对的第一反应性分子；(b)将样品与报告分子混合，该报告分子包含(i)反应对的第二反应性分子和(ii)具有聚糖基序特异性报告条形码序列的报告寡核苷酸，其中报告分子经由标志分子缀合在聚糖修饰的糖蛋白上；(c)去除未掺入的报告分子；(d)将样品和多个核酸条形码分子分隔到多个分区中，使得多个分区中的一个分区包含来自样品的一个细胞和具有分区特异性条形码序列的多个核酸条形码分子；以及(e)使用报告寡核苷酸和核酸条形码分子来产生加聚糖条形码的核酸分子，该加聚糖条形码的核酸分子包含分区特异性条形码序列或其互补序列和聚糖基序特异性报告条形码序列或其互补序列。在一些实施方案中，标志分子是(i)一个或多个活细胞的一种或多种糖基转移酶的标志底物，(ii)在样品的一个或多个活细胞中掺入并加工以产生一个或多个活细胞的一种或多种糖基转移酶的一种或多种标志底物，和/或(iii)标志底物包含第一反应性分子。
在一些实施方案中，确定包含一个或多个活细胞的样品中一种或多种聚糖的存在的方法还包括：(a)确定加聚糖条形码的核酸分子或其衍生物的序列，以鉴定(i)分区特异性条形码序列或其互补序列和(ii)聚糖基序特异性报告条形码序列或其互补序列。在某个实施方案中，该方法还包括(b)使用鉴定的分区特异性条形码序列或其互补序列和鉴定的聚糖基序特异性报告条形码序列或其互补序列来确定所述样品中至少一种聚糖的存在和/或丰度。
在一些实施方案中，如本文所公开的确定包含一个或多个活细胞的样品中一种或多种聚糖的存在的方法还包括在将样品与包含反应对的第二反应性分子的报告分子一起孵育之前去除未掺入的标志分子的步骤。
在一些实施方案中，一种或多种糖基转移酶对于一个或多个活细胞是内源的或异源的；和/或合成糖被乙酰化。在一些实施方案中，将样品与标志分子一起孵育的持续时间选自包括约1秒至约30秒、约30秒至约1分钟、约1分钟至约10分钟、约5分钟至约60分钟以及约1小时至约12小时的范围的组。
在一些实施方案中，一种或多种糖基转移酶对于一个或多个活细胞是内源的或异源的；和/或合成糖被乙酰化。在一些实施方案中，将样品与标志分子一起孵育的持续时间选自包括1秒至30秒、30秒至1分钟、1分钟至10分钟、5分钟至60分钟以及1小时至12小时的范围的组。
在本文所公开的方法的一些实施方案中，反应对选自由以下物质组成的反应对的组：叠氮化物和炔烃、叠氮化物和膦、醛和氨氧基、醛和肼、醛和酰肼、酮和氨氧基、肼和酮、环丙烯和四嗪、降冰片烯和四嗪、反式环辛烯和四嗪、炔烃和四嗪、硝酮和烯烃、硝酮和炔烃、重氮基和炔烃以及异腈和四嗪。在另一个实施方案中，反应对的第二反应性分子能够偶联到反应对的第一反应性分子。
在一些实施方案中，合成糖选自由以下物质组成的组：半乳糖、唾液酸、岩藻糖、甘露糖、N-乙酰甘露糖胺和N-乙酰半乳糖胺；和/或合成糖。在另一个实施方案中，合成糖被掺入到选自由以下物质组成的组的聚糖中：唾液酸化聚糖；岩藻糖基化聚糖；胞质O-GlcNAc糖基化；和粘蛋白型O连接的聚糖。在又一个实施方案中，合成糖是聚糖类别特异性的；和/或是聚糖基序特异性的。
本公开的一个方面提供了一种检测单细胞中的蛋白质特异性糖基化模式的方法，该方法包括(a)将多个细胞与聚糖基序特异性分子一起孵育，该聚糖基序特异性分子包含缀合到聚糖基序特异性报告条形码序列的报告寡核苷酸；(b)提供组分特异性分子，该组分特异性分子包含缀合到组分特异性条形码序列的寡核苷酸；(c)去除未掺入的聚糖特异性分子和未掺入的组分特异性分子；(d)执行连接反应；(e)将多个细胞分隔到多个分区中，使得一个分区包含(i)来自样品的单细胞、单细胞裂解物、两个相邻细胞或两个相邻细胞的裂解物和(ii)具有分区特异性条形码序列的多个核酸条形码分子；以及(f)扩增聚糖组分报告序列及多个核酸条形码分子之一以产生第一加条形码的核酸分子，该第一加条形码的核酸分子包含聚糖组分报告序列或其互补序列和分区特异性条形码序列或其互补序列或其衍生物。在一些实施方案中，其中聚糖基序特异性分子结合于糖蛋白上的聚糖。在某个实施方案中，组分特异性分子结合于糖蛋白。在一个实施方案中，聚糖特异性报告条形码序列的寡核苷酸连接到组分特异性条形码序列的寡核苷酸以产生连接的聚糖组分报告序列；并且糖蛋白、聚糖基序特异性分子和组分特异性分子形成复合物。
在一些实施方案中，将多个细胞分隔在多个分区中发生在进行连接反应之前或之后。在某个实施方案中，当发生以下情形时产生连接的聚糖组分报告序列：(i)聚糖基序特异性分子和组分特异性分子结合于相同的糖蛋白；或(ii)聚糖基序特异性分子和组分特异性分子结合不同的糖蛋白，并且这些糖蛋白紧密接近。在一些实施方案中，检测单细胞中蛋白质特异性糖基化模式的方法还包括(a)确定第一加条形码的核酸分子或其衍生物的序列，以鉴定(i)分区特异性条形码序列或其互补序列和(ii)聚糖组分报告条形码序列或其互补序列；和/或(b)使用鉴定的分区特异性条形码序列或其互补序列和鉴定的聚糖组分报告条形码序列或其互补序列来鉴定蛋白质的聚糖和糖基化模式
在一个实施方案中，在存在夹板(splint)寡核苷酸的情况下进行连接。在另一个实施方案中，在存在夹板寡核苷酸的情况下进行连接，并且进一步其中所述夹板选自由三唑和核苷酸条形码夹板组成的组。在另一个实施方案中，聚糖特异性分子选自由以下物质组成的组：(a)聚糖特异性凝集素；(b)聚糖特异性抗体；(c)合成核苷酸糖；(d)合成糖；以及(e)失活的聚糖特异性转移酶。
在某个实施方案中，检测单细胞中蛋白质特异性糖基化模式的方法还包括提供聚糖特异性转移酶。
在一些实施方案中，组分特异性分子选自由抗体、凝集素、合成核苷酸糖、核苷酸糖和合成糖组成的组；和/或感兴趣的组分是蛋白质、聚糖、糖、核苷酸糖或合成核苷酸糖。
在一些实施方案中，聚糖或聚糖基序选自由O-GlcNAc残基、含LacNac的聚糖、含Fuc-α1,2-Gal的聚糖、含Galβ1-3GalNAc的聚糖、GlcNAc-O-R、Neu5Acα2-3Gal和GalT1Y289L组成的组。在一些实施方案中，分区是液滴；和/或孔。在一些实施方案中，多个核酸条形码分子的至少一个子集可释放地连接到凝胶珠粒。在一些实施方案中，多个核酸条形码分子的至少一个子集可释放地连接到凝胶珠粒，并且还包括在产生加条形码的核酸分子之前从凝胶珠粒释放核酸条形码分子。
在本文所公开的任何方法的一些实施方案中，一个分区中的多个核酸条形码分子还包含独特分子标识符(UMI)序列；和/或一个分区中的核酸条形码分子的UMI序列不同于该分区中的另一个核酸条形码分子的UMI序列。在一些实施方案中，一个分区中的多个核酸条形码分子还包含功能序列；和/或一个分区中的多个核酸条形码分子还包含捕获序列；和/或一个分区中的多个核酸条形码分子还包含捕获序列，并且该捕获序列包含：模板转换寡核苷酸(TSO)序列；或多聚T序列。在一些实施方案中，一个分区中的多个核酸条形码分子还包含捕获序列，并且该捕获序列包含多聚T序列；并且第二组分选自由DNA分析物、RNA分析物、蛋白质分析物、细胞特征、细胞表面特征和代谢物组成的组。
在一些实施方案中，该分区还包含多个附加核酸条形码分子，该多个附加核酸条形码分子包含分区特异性条形码序列和捕获序列，该捕获序列能够结合于单细胞或单细胞裂解物的第二组分或与第二组分结合的附加报告分子的序列。在某个实施方案中，第二组分不是聚糖或聚糖基序；和/或附加报告分子被配置为偶联到蛋白质或代谢物；和/或附加报告分子被配置为偶联到蛋白质或代谢物，并且进一步其中附加报告分子包含附加报告寡核苷酸，该附加报告寡核苷酸包含鉴定糖蛋白的不同报告条形码序列；和/或附加报告分子被配置为偶联到蛋白质或代谢物，并且进一步其中附加报告分子包含附加报告寡核苷酸，该附加报告寡核苷酸包含鉴定聚糖的不同报告条形码序列。
在一些实施方案中，报告寡核苷酸还包含捕获柄，该捕获柄包含与捕获序列互补的序列。在一些实施方案中，捕获柄包含与模板转换寡核苷酸(TSO)序列互补的序列；或捕获柄包含与多聚T序列互补的序列。在本文所公开的任何方法的一些实施方案中，聚糖选自由O连接的聚糖、N连接的聚糖、粘蛋白型O连接的聚糖、O连接的聚糖核心1和O连接的聚糖核心2组成的组。
所述方法用于确定样品中一种或多种聚糖的存在，确定包含一个或多个活细胞的样品中一种或多种聚糖的存在，和/或检测聚糖与另一种组分的接近度。此外，所述方法用于确定样品中一种或多种聚糖基序的存在，确定包含一个或多个活细胞的样品中一种或多种聚糖基序的存在，和/或检测聚糖基序与另一种组分的接近度。某些方法还允许确定聚糖组分的普遍性或了解糖组随时间的变化。
提供了确定样品中一种或多种聚糖或聚糖基序的存在的方法。在一个实施方案中，所述方法包括以下步骤：(a)将样品与(i)包含核苷酸糖和反应对的第一反应性分子的标志分子及(ii)第一聚糖特异性转移酶一起孵育；(b)将样品与报告分子一起孵育，该报告分子包含(i)反应对的第二反应性分子和(ii)具有聚糖基序特异性报告条形码序列的报告寡核苷酸；(c)从样品中去除未掺入的报告分子；(d)将样品分隔到多个分区中，使得一个分区包含(i)来自样品的单细胞或单细胞裂解物和(ii)具有分区特异性条形码序列的多个核酸条形码分子；以及(e)使用报告寡核苷酸和多个核酸条形码分子中的一个核酸条形码分子来产生第一加条形码的核酸分子，该第一加条形码的核酸分子包含分区特异性序列或其互补序列和报告条形码序列或其互补序列。
在各个方面，该方法还可以包括确定第一加条形码的核酸分子或其衍生物的序列，以鉴定(i)分区特异性条形码序列或其互补序列和(ii)报告条形码序列或其互补序列。所述方法中的任何方法还可以包括使用鉴定的分区特异性条形码序列或其互补序列和鉴定的报告条形码序列或其互补序列来确定细胞中至少一种聚糖或聚糖基序的存在和/或丰度。
在所述方法的各个方面，所述方法还可以包括(a)将样品与(i)包含第二核苷酸糖和第二反应对的第一反应性分子的第二标志分子及(ii)第二聚糖特异性转移酶一起孵育，以及(b)将样品与第二报告分子一起孵育，该第二报告分子包含(i)第二反应对的第二反应性分子，其中第二反应性分子能够偶联到第二反应对的第一反应性分子，和(ii)具有鉴定第二聚糖基序的报告条形码序列的第二报告寡核苷酸。所述方法还可以包括以下步骤：确定多个加条形码的核酸分子或其衍生物的序列以鉴定分区特异性条形码序列或其互补序列和报告条形码序列或其互补序列，以及使用鉴定的分区特异性条形码序列或其互补序列和鉴定的报告条形码序列或其互补序列来确定细胞中第一聚糖和第二聚糖的存在和/或丰度。
在其他方面，所述方法还可以包括(a)将样品与(i)包含第三核苷酸糖和第三反应对的第一反应性分子的第三标志分子及(ii)第三聚糖特异性转移酶一起孵育，以及(b)将样品与第三报告分子一起孵育，该第三报告分子包含(i)第三反应对的第二反应性分子，其中第二反应性分子能够偶联到第三反应对的第一反应性分子，和(ii)具有鉴定第三聚糖基序的报告条形码的第三报告寡核苷酸。在另一方面，所述方法还可以包括以下步骤：(a)确定多个加条形码的核酸分子或其衍生物的存在以鉴定(i)分区特异性条形码序列或其互补序列和(ii)报告条形码序列或其互补序列，以及(b)使用鉴定的分区特异性条形码序列或其互补序列和鉴定的报告条形码序列或其互补序列来确定第一聚糖、第二聚糖和/或第三聚糖的存在和/或丰度。
在另一方面，所述方法还可以包括将样品与(i)包含第四核苷酸糖和第四反应对的第一反应性分子的第四标志分子及(ii)第四聚糖特异性转移酶一起孵育，以及将样品与第四报告分子一起孵育，该第四报告分子包含第四反应对的第二反应性分子，其中第二反应性分子能够偶联到第四反应对的第一反应性分子；和(iii)具有鉴定第四聚糖基序的报告条形码序列的第四报告寡核苷酸。该方法的各方面还可以包括以下步骤：(a)确定多个加条形码的核酸分子或其衍生物的序列以鉴定(i)分区特异性条形码序列或其互补序列和(ii)报告条形码序列或其互补序列，以及(b)使用鉴定的分区特异性条形码序列或其互补序列来确定细胞中第一聚糖、第二聚糖、第三聚糖和第四聚糖的存在和/或丰度。
在各种方法中，样品可以选自由组织、细胞、固定细胞、活细胞和细胞裂解物组成的组。在各种方法中的任何方法中，多个分区接收来自样品的单细胞。在所述方法的其他方面，来自单细胞的裂解物被包封在细胞珠粒中，包被在细胞珠粒上，或它们的组合。所述方法的各方面还可以包括提供多个细胞珠粒，该多个细胞珠粒包含细胞和报告寡核苷酸序列，该报告寡核苷酸序列包含鉴定聚糖基序的报告条形码序列，以及使所述多个细胞珠粒经受足以裂解细胞的条件。在一些方面，足以裂解细胞的条件包括使细胞珠粒与裂解剂接触。
在所述方法中的任何方法中，聚糖特异性转移酶可以选自由以下物质组成的组：糖基转移酶、唾液酸转移酶、α1,3-岩藻糖基转移酶；BGTA；WbwK岩藻糖基转移酶；α1,2-岩藻糖基转移酶；β1-4N-乙酰氨基半乳糖转移酶；β-半乳糖苷α2,6唾液酸转移酶1；以及β-半乳糖苷α2,3唾液酸转移酶1。
各种方法还包括以下步骤：确定多个加条形码的核酸分子或其衍生物的序列以鉴定(i)分区特异性条形码序列或其互补序列和(ii)报告条形码序列或其互补序列，以及使用鉴定的分区特异性条形码序列或其互补序列和鉴定的报告条形码序列或其互补序列来确定细胞中第一聚糖基序和第二聚糖基序的存在和/或丰度。方法可以包括以下步骤：确定多个加条形码的核酸分子或其衍生物的序列以鉴定(i)分区特异性条形码序列或其互补序列和(ii)报告条形码序列或其互补序列，以及使用鉴定的分区特异性条形码序列或其互补序列和鉴定的报告条形码序列或其互补序列来确定细胞中第一聚糖基序、第二聚糖基序和第三聚糖基序的存在和/或丰度。所述方法可以包括以下步骤：确定多个加条形码的核酸分子或其衍生物的序列以鉴定(i)分区特异性条形码序列或其互补序列和(ii)报告条形码序列或其互补序列，以及使用鉴定的分区特异性条形码序列或其互补序列和鉴定的报告条形码序列或其互补序列来确定细胞中第一聚糖基序、第二聚糖基序、第三聚糖基序和第四聚糖基序的存在和/或丰度。
在一个实施方案中，提供了确定包含一个或多个活细胞的样品中一种或多种聚糖的存在的方法。所述方法包括以下步骤：(a)将包含一个或多个活细胞的样品与标志分子一起孵育，该标志分子包含合成糖和反应对的第一反应性分子，其中该标志分子是一个或多个活细胞的一种或多种糖基转移酶的标志底物；(b)将样品与报告分子一起孵育，该报告分子包含(i)反应对的第二反应性分子和(ii)具有聚糖基序特异性报告条形码序列的报告寡核苷酸；(c)去除未掺入的报告分子；(d)将样品和多个核酸条形码分子分隔到多个分区中，使得多个分区中的一个分区包含来自样品的一个细胞和具有分区特异性条形码序列的多个核酸条形码分子；以及(e)使用报告寡核苷酸和核酸条形码分子来产生加条形码的核酸分子，该加条形码的核酸分子包含分区特异性条形码序列或其互补序列和聚糖基序特异性报告条形码序列或其互补序列。在该方法的各个方面，标志分子在样品的一个或多个活细胞中掺入和加工，以产生一个或多个活细胞的一种或多种糖基转移酶的一种或多种标志底物，并且其中标志底物包含第一反应性分子。该方法的各方面还包括确定加条形码的核酸分子或其衍生物的序列，以鉴定(i)分区特异性条形码序列或其互补序列和(ii)聚糖基序特异性报告条形码序列或其互补序列。所述方法的各方面还可以包括使用鉴定的分区特异性条形码序列或其互补序列和鉴定的聚糖基序特异性报告条形码序列或其互补序列来确定样品中至少一种聚糖基序的存在和/或丰度。所述方法可以包括在将样品与包含反应对的第二反应性分子的报告分子一起孵育之前去除未掺入的标志分子的步骤。
在所述方法的各方面，一种或多种糖基转移酶对于一个或多个活细胞是内源的。在所述方法的一些方面，合成糖被乙酰化。在所述方法的某些方面，将样品与标志分子一起孵育的步骤发生的持续时间选自包括约1秒至约30秒、约30秒至约1分钟、约1分钟至约10分钟、约5分钟至约60分钟以及约1小时至约12小时的范围的组。
在所述方法的各方面，一种或多种糖基转移酶对于一个或多个活细胞是内源的。在所述方法的一些方面，合成糖被乙酰化。在所述方法的某些方面，将样品与标志分子一起孵育的步骤发生的持续时间选自包括1秒至30秒、30秒至1分钟、1分钟至10分钟、5分钟至60分钟以及1小时至12小时的范围的组。
在所述方法中的任何方法中，反应对可以选自包含以下物质的反应对的组：叠氮化物和炔烃、叠氮化物和膦、醛和氨氧基、醛和肼、醛和酰肼、酮和氨氧基、肼和酮、环丙烯和四嗪、降冰片烯和四嗪、反式环辛烯和四嗪、炔烃和四嗪、硝酮和烯烃、硝酮和炔烃、重氮基和炔烃以及异腈和四嗪。在所述方法的各方面，反应对的第二反应性分子能够偶联到反应对的第一反应性分子。
在所述方法的各个方面，合成糖选自由N-乙酰甘露糖胺和N-乙酰半乳糖胺组成的组。在所述方法的一些方面，合成糖被掺入到聚糖中，该聚糖选自由唾液酸和粘蛋白型O连接的聚糖组成的组。在所述方法的各方面，合成糖是聚糖类别特异性的。
在一个实施方案中，提供了检测聚糖与另一种组分的接近度的方法。所述方法包括以下步骤：(a)将样品与聚糖基序特异性分子一起孵育，该聚糖基序特异性分子包含具有聚糖基序特异性报告条形码序列的报告寡核苷酸；(b)提供组分特异性分子，该组分特异性分子包含具有组分特异性条形码序列的寡核苷酸；(c)去除未掺入的聚糖特异性分子和未掺入的组分特异性分子；(d)提供夹板，并且用包含聚糖特异性报告条形码序列的寡核苷酸和包含组分特异性条形码序列的寡核苷酸进行连接反应，以产生聚糖组分报告序列；(d)将样品分隔到多个分区中，使得一个分区包含(i)来自样品的单细胞、单细胞裂解物、两个相邻细胞或两个相邻细胞的裂解物和(ii)具有分区特异性条形码序列的多个核酸条形码分子；以及(e)使用聚糖组分报告序列和核酸条形码分子来产生加条形码的分子，该加条形码的分子包含聚糖组分报告序列或其互补序列和分区特异性条形码序列或其互补序列。在该方法的各方面，在存在夹板寡核苷酸的情况下进行连接。在该方法的各方面，将样品分隔在多个分区中发生在进行连接反应之前。在该方法的各方面，将样品分隔在多个分区中发生在进行连接反应之后。该方法的各方面还可以包括确定第一加条形码的核酸分子或其衍生物的序列，以鉴定(i)分区特异性条形码序列或其互补序列和(ii)聚糖组分报告条形码序列或其互补序列。所述方法还可以包括使用鉴定的分区特异性条形码序列或其互补序列和鉴定的聚糖组分报告条形码序列或其互补序列来确定与感兴趣的组分接近的聚糖的存在和/或丰度。
在各个方面，聚糖特异性分子选自由聚糖特异性凝集素、聚糖特异性抗体、合成核苷酸糖、合成糖和失活的聚糖特异性转移酶组成的组。该方法的各方面还可以包括提供聚糖特异性转移酶。在该方法的各方面，组分特异性分子选自由抗体、凝集素、合成核苷酸糖、核苷酸糖和合成糖组成的组。在各个方面，感兴趣的组分是蛋白质、聚糖、糖、核苷酸糖或合成核苷酸糖。在该方法的各方面，夹板选自由三唑或核苷酸条形码夹板组成的组。
在所述方法中的任何方法中，聚糖或聚糖基序可以选自由O-GlcNAc残基、含LacNac的聚糖、含Fuc-α1,2-Gal的聚糖、含Galβ1-3GalNAc的聚糖、GlcNAc-OR、Neu5Acα2-3Gal和GalT1Y289L组成的组。
在所述方法的任何方面，分区是液滴。在所述方法的任何方面，分区是孔。在所述方法的任何方面，多个核酸条形码分子的至少一个子集可释放地连接到凝胶珠粒。所述方法可以包括在产生加条形码的核酸分子之前从凝胶珠粒释放核酸条形码分子。在所述方法的任何方面，一个分区中的多个核酸条形码分子还包含独特分子标识符序列(UMI)。在各方面，一个分区中的核酸条形码分子的UMI序列不同于该分区中的另一个核酸条形码分子的UMI序列。在所述方法的各方面，一个分区中的多个核酸条形码分子还包含功能序列。在所述方法的任何方面，一个分区中的多个核酸条形码分子还包含捕获序列。在各个方面，捕获序列包含模板转换寡核苷酸序列。在各方面，捕获序列包含多聚T序列。
在任何方面，该分区还可以包含多个附加核酸条形码分子，该多个附加核酸条形码分子包含分区特异性条形码序列和结合序列，该结合序列能够结合于单细胞或单细胞裂解物的第二分析物。在各个方面，第二分析物不是聚糖或聚糖基序。在各个方面，第二分析物选自由DNA分析物、RNA分析物、被配置为偶联到蛋白质的附加报告分子以及被配置为偶联到代谢物的附加报告分子组成的组。在各个方面，附加报告分子包含附加报告寡核苷酸，该附加报告寡核苷酸包含鉴定感兴趣的蛋白质的不同报告条形码序列。在各个方面，附加报告分子包含附加报告寡核苷酸，该附加报告寡核苷酸包含鉴定感兴趣的代谢物的不同报告条形码序列。在其他方面，报告寡核苷酸还包含捕获柄，该捕获柄包含与捕获序列互补的序列。在一些方面，捕获序列包含与模板转换寡核苷酸(TSO)序列互补的序列。在某些方面，捕获序列包含与多聚T序列互补的序列。
在任何方面，聚糖类别可以选自由O连接的聚糖、N连接的聚糖、粘蛋白型O连接的聚糖、O连接的聚糖核心1和O连接的聚糖核心2组成的组。
本公开的另一方面提供了本文所公开的方法用于对处于与异常糖基化模式或基序相关的疾病或病症风险中或患有该疾病或病症的受试者进行筛查、诊断或分期的用途。在一些实施方案中，该疾病或病症选自由神经退行性疾病或病症、癌症、先天性糖基化障碍和炎性病症组成的组。
本公开的另一方面提供了一种用于确定包含一个或多个活细胞的样品中一种或多种聚糖的存在的组合物，该组合物包含：(i)多个标志分子，每个标志分子包含核苷酸糖和反应对的第一反应性分子，(ii)多种聚糖特异性转移酶，和(iii)多个报告分子，每个报告分子包含反应对的第二反应性分子和具有聚糖基序特异性报告条形码序列的报告寡核苷酸。本公开提供了一种用于确定样品中一种或多种聚糖的存在的组合物，该组合物包含：多个标志分子，每个标志分子包含合成糖和反应对的第一反应性分子，(ii)多个报告分子，每个报告分子包含反应对的第二反应性分子和具有聚糖基序特异性报告条形码序列的报告寡核苷酸。在一些实施方案中，标志分子是一个或多个活细胞的一种或多种糖基转移酶的标志底物。
本公开的另一方面提供了一种检测单细胞中的蛋白质特异性糖基化模式的组合物，该组合物包含(i)多个聚糖基序特异性分子，每个聚糖基序特异性分子包含缀合到聚糖基序特异性报告条形码序列的报告寡核苷酸，(ii)多个组分特异性分子，每个组分特异性分子包含缀合到组分特异性条形码序列的寡核苷酸，其中组分特异性分子结合于糖蛋白；以及任选地(iii)夹板寡核苷酸。在一些实施方案中，聚糖基序特异性分子结合于糖蛋白上的聚糖。
本公开的另一方面提供了一种用于确定样品中一种或多种聚糖的存在的试剂盒，该试剂盒包含：(i)多个标志分子，每个标志分子包含核苷酸糖和反应对的第一反应性分子，(ii)多种聚糖特异性转移酶，(iii)多个报告分子，每个报告分子包含反应对的第二反应性分子和具有聚糖基序特异性报告条形码序列的报告寡核苷酸，以及(iv)用于执行如本文所公开的确定一种或多种聚糖的存在的方法的说明书。
本公开的另一方面提供了一种用于确定包含一个或多个活细胞的样品中一种或多种聚糖的存在的试剂盒，该试剂盒包含：(i)多个标志分子，每个标志分子包含合成糖和反应对的第一反应性分子，(ii)多个报告分子，每个报告分子包含反应对的第二反应性分子和具有聚糖基序特异性报告条形码序列的报告寡核苷酸，以及(iii)用于执行如本文所公开的确定包含一个或多个活细胞的样品中一种或多种聚糖的存在的方法的说明书。在一些实施方案中，其中标志分子是一个或多个活细胞的一种或多种糖基转移酶的标志底物。
本公开的另一方面提供了一种检测单细胞中的蛋白质特异性糖基化模式的试剂盒，该试剂盒包含(i)多个聚糖基序特异性分子，每个聚糖基序特异性分子包含缀合到聚糖基序特异性报告条形码序列的报告寡核苷酸，(ii)多个组分特异性分子，每个组分特异性分子包含缀合到组分特异性条形码序列的寡核苷酸，其中组分特异性分子结合于糖蛋白；以及任选地(iii)夹板寡核苷酸，以及(iv)用于执行如本文所公开的检测单细胞中的蛋白质特异性糖基化模式的方法的说明书。在一些实施方案中，聚糖基序特异性分子结合于糖蛋白上的聚糖。
本发明的一个方面提供了一种系统，该系统包含：(a)(i)多个标志分子，每个标志分子包含核苷酸糖和反应对的第一反应性分子，(ii)多种聚糖特异性转移酶，和(iii)多个报告分子，每个报告分子包含反应对的第二反应性分子和具有聚糖基序特异性报告条形码序列的报告寡核苷酸；(b)多个核酸条形码分子。在一些实施方案中，多个核酸条形码分子中的第一核酸条形码分子包含分区条形码序列。在一些实施方案中，多个核酸条形码分子连接到珠粒，并且分区条形码序列鉴定珠粒。在一些实施方案中，该系统还包括多个分区，任选地，多个分区包括多个液滴和/或多个孔。在一些实施方案中，该系统还包括具有微流体通道结构的设备，该微流体通道结构被配置为产生多个分区，任选地，该设备包括(i)与第一源流体连通的第一通道，该第一源包含使用如本文所公开的用于确定样品中一种或多种聚糖的存在的方法标记有聚糖或聚糖特异性分子的多个细胞，(ii)与包含多个核酸条形码分子的第二源流体连通的第二通道，和(iii)连接部，该连接部使包含来自第一通道的所述多个细胞和来自所述第二通道的多个核酸条形码分子的第一相与不和所述第一相混溶的第二相接触，以产生包含所述多个细胞和所述多个核酸条形码分子的多个液滴。在一些实施方案中，所述多个液滴中的一个液滴包含所述细胞和所述条形码珠粒。
本发明的另一方面提供了一种系统，该系统包含：(a)(i)多个标志分子，每个标志分子包含合成糖和反应对的第一反应性分子，其中标志分子是一个或多个活细胞的一种或多种糖基转移酶的标志底物，(ii)多个报告分子，每个报告分子包含反应对的第二反应性分子和具有聚糖基序特异性报告条形码序列的报告寡核苷酸；(b)多个核酸条形码分子。在一些实施方案中，多个核酸条形码分子中的第一核酸条形码分子包含分区条形码序列。在一些实施方案中，多个核酸条形码分子连接到珠粒，并且分区条形码序列鉴定珠粒。在一些实施方案中，该系统还包括多个分区，任选地，其中多个分区包括多个液滴和/或多个孔。
在一些实施方案中，该系统还包括具有微流体通道结构的设备，该微流体通道结构被配置为产生多个分区，任选地，该设备包括(i)与第一源流体连通的第一通道，该第一源包含使用用于确定包含一个或多个活细胞的样品中一种或多种聚糖的存在的方法标记有聚糖或聚糖特异性分子的多个细胞，(ii)与包含多个核酸条形码分子的第二源流体连通的第二通道，和(iii)连接部，该连接部使包含来自第一通道的所述多个细胞和来自所述第二通道的多个核酸条形码分子的第一相与不和所述第一相混溶的第二相接触，以产生包含所述多个细胞和所述多个核酸条形码分子的多个液滴。在一些实施方案中，所述多个液滴中的一个液滴包含所述细胞和所述条形码珠粒。
本发明的一个方面提供了一种系统，该系统包含：(a)(i)多个聚糖基序特异性分子，每个聚糖基序特异性分子包含缀合到聚糖基序特异性报告条形码序列的报告寡核苷酸，(ii)多个组分特异性分子，每个组分特异性分子包含缀合到组分特异性条形码序列的寡核苷酸，其中组分特异性分子结合于糖蛋白；以及任选地(iii)夹板寡核苷酸；(b)多个核酸条形码分子。在一些实施方案中，聚糖基序特异性分子结合于糖蛋白上的聚糖。在一些实施方案中，多个核酸条形码分子中的第一核酸条形码分子包含分区条形码序列。在一些实施方案中，多个核酸条形码分子连接到珠粒，并且其中分区条形码序列鉴定珠粒。在一些实施方案中，该系统还包括多个分区，任选地，多个分区包括多个液滴和/或多个孔。在一些实施方案中，该系统还包括具有微流体通道结构的设备，该微流体通道结构被配置为产生多个分区，任选地，该设备包括(i)与第一源流体连通的第一通道，该第一源包含使用如本文所公开的检测单细胞中的蛋白质特异性糖基化模式的方法标记有聚糖或聚糖特异性分子的多个细胞，(ii)与包含多个核酸条形码分子的第二源流体连通的第二通道，和(iii)连接部，该连接部使包含来自第一通道的所述多个细胞和来自所述第二通道的多个核酸条形码分子的第一相与不和所述第一相混溶的第二相接触，以产生包含所述多个细胞和所述多个核酸条形码分子的多个液滴。在一些实施方案中，所述多个液滴中的一个液滴包含所述细胞和所述条形码珠粒。
在本文所提供的系统的一些实施方案中，细胞被包封在细胞珠粒中，包被在珠粒细胞上，包埋在珠粒细胞中，或它们的任何组合。在一些实施方案中，本文所提供的系统还包括与包含附加试剂的第三源流体连通的第三通道。在一个实施方案中，第一相包含附加试剂。在一些实施方案中，本文所提供的系统还包括与包含附加试剂的第四源流体连通的第四通道。在一个实施方案中，第一相包含所述附加试剂。在一些实施方案中，附加试剂是用于核酸扩增的试剂，或能实现如下目的的试剂：(i)可以降解或溶解细胞、细胞珠粒和/或条形码珠粒，(ii)降解条形码和条形码珠粒之间的键，或它们的任何组合。
前面的发明内容及下面的附图说明和具体实施方式都是示例性和说明性的。它们旨在提供本公开的进一步细节，而不应被解释为限制。根据本公开的以下详细描述，其他目的、优点和新颖特征对于本领域技术人员来说将是显而易见的。
附图说明
图1示出了用于分隔单独生物颗粒的微流体通道结构的实例。
图2示出了用于将珠粒受控分隔到离散液滴中的微流体通道结构的实例。
图3示出了携带条形码的珠粒的实例。
图4展示了携带条形码的珠粒的另一个实例。
图5示意性地示出了示例微孔阵列。
图6示意性地示出了用于加工核酸分子的示例工作流程。
图7示意性地示出了连接有核酸分子的示例标记剂。
图8A示意性地示出了标记剂的实例。图8B示意性地示出了用于加工核酸分子的另一示例工作流程。图8C示意性地示出了用于加工核酸分子的另一示例工作流程。
图9示意性地示出了携带条形码的珠粒的另一个实例。
具体实施方式
以下段落更详细地描述了本发明的不同方面。本发明的每个方面、实施方案或特征可以与本发明的任何其他方面、实施方案或特征相结合，除非明确指出相反的情况。
I.概述
过去二十年的糖生物学工作已经牢固确立了聚糖在包括免疫学、肿瘤学、发育、蛋白质折叠等生物过程中的重要性。聚糖(即碳水化合物或多糖)是一类重要的生物分子，在诸如蛋白质运输、细胞间通讯和免疫应答的生物过程中发挥着关键作用。聚糖分析(例如，质量控制、疾病诊断等)在学术研究、制药工业和医疗保健中具有巨大的价值，因为：(1)异常糖基化(例如聚糖异常)与许多疾病诸如癌症、痴呆和自身免疫性障碍相关；以及(2)许多生物制品诸如单克隆抗体的效力和稳定性受到其相关聚糖的影响。
蛋白质糖基化介导多样的细胞过程。细胞外部的糖蛋白影响诸如细胞识别、细胞信号传导和细胞粘附的过程。异常糖基化或糖基化模式，诸如天然存在的聚糖的低表达和过表达或通常局限于胚胎组织的聚糖的新表达，被认为是许多疾病或疾病阶段的标志，包括微生物发病机理、免疫缺陷、神经退行性疾病和许多癌症。聚糖在许多生物过程中发挥着关键作用，包括但不限于免疫学、肿瘤学、发育、蛋白质折叠和信号转导。与生产已经被规划好的生物分子(例如DNA或氨基酸序列)不同，聚糖是高度可变和复杂的。糖组包含关于细胞状态和细胞对其环境或其他刺激的应答的大量信息。此外，了解糖组状态和糖组的改变也可以深入了解这些疾病。鉴于聚糖在健康和疾病中的重要性，开发用于分析和表征聚糖以及含聚糖的蛋白质的方法和工具是糖生物学领域的重中之重。
已经开发了许多技术来分析细胞糖基化。然而，目前用于分析聚糖的技术本身很复杂，并且具有显著的缺点。常规检测缺乏特异性和灵敏度。此外，本领域中用于分析糖基化的许多方法是破坏性方法，不能用于功能性生物测定系统。此外，现有的多模态单细胞测序技术能够对异质细胞群体进行深入表征，并有利于鉴定复杂细胞池中独特的细胞分化状态，但不能提供细胞糖基化状态或糖组的全面概况，因为它们没有整合能够为细胞糖组提供重要见解的基本翻译后信息。
糖基化的复杂性源于许多因素，这使得用于鉴定聚糖的单细胞测定令人惊讶和意想不到。例如，与DNA转录和RNA翻译不同，糖基化不是模板驱动的过程。相反，糖基化是翻译后修饰。糖蛋白和糖脂是通过在分泌途径(例如高尔基体)中将单糖和复杂寡糖酶促加成到蛋白质或脂质支架上而产生的。糖基化可以产生显著的多样性和异质性。实际上，糖基化中使用的单糖构件有很多种，并且这些单糖可以通过多种方式在细胞内组装形成寡糖。
特别地，细胞和组织聚糖的常规检测几乎完全依赖于靶向特定类别糖蛋白的凝集素和抗体。凝集素是从各种植物、细菌和动物来源中分离的聚糖结合蛋白，并在糖蛋白的分离、纯化和表征中起着重要作用。虽然对于通过结合于保守的五糖核心结构来富集N连接的糖蛋白是有用的，但凝集素缺乏特异性并且通常被认为是混杂的。此外，使用抗体检测聚糖也具有挑战性，因为聚糖结合抗体难以产生，并且通常对目标聚糖的亲和力低。因此，凝集素和抗体在糖蛋白和糖肽富集中的应用受到低底物结合亲和力和/或不良特异性的限制。此外，当前用于分析糖基化的技术诸如质谱；亲水相互作用液相色谱(HILIC)；NMR波谱、液相色谱、电泳；和聚糖或凝集素微阵列技术是破坏性方法，不能用于功能性生物测定系统。此外，现有的多模态单细胞测序技术能够对异质细胞群体进行深入表征，并有利于鉴定复杂细胞池中独特的细胞分化状态，但不能提供细胞糖基化状态或糖组的全面概况，因为它们没有整合能够为细胞糖组提供重要见解的基本翻译后信息。
本公开提供的示例性优点
糖基化是细胞内二级蛋白质加工的重要且高度调控的机制。它在决定蛋白质结构、功能和稳定性方面起着关键作用。这些复合物的变化导致它们募集、相互作用和激活信号蛋白的方式改变。因此，在单细胞中精确鉴定糖基化以及聚糖基序的能力是非常需要的。如本文所述，新型方法能够确定不同的聚糖、聚糖基序和/或聚糖类别，这可以进一步用于阐明细胞的糖组。此外，所述方法可以用于确定至少一种聚糖或聚糖基序的丰度。此外，所述方法可以用于鉴定彼此紧密接近的聚糖。所述方法也可以用于评估蛋白质特异性糖基化。不受机理的限制，聚糖基序特异性分子与目标聚糖基序相互作用，并且组分特异性分子与感兴趣的组分相互作用。在另一个实例中，所述方法可以用于评估聚糖和基因表达、与基因表达相关的糖组的变化以及糖组和基因表达之间的关系。该分析可以用于评估整个组织或细胞集合中糖组的变化以及转录组的变化。
单细胞谱分析将提供每个细胞的糖组谱。此外，单细胞谱分析将基于单细胞水平的可测序读出(sequenceable readout)来提供细胞表面上的每种聚糖的丰度。此外，预期结果将鉴定和区分具有独特糖基化谱的细胞亚群。参见例如实施例2。
如实施例3中所述，蛋白质糖基化是真核蛋白质的最普遍的修饰之一，因为据估计超过50％的所有真核蛋白质被糖基化。存在两种主要形式的蛋白质糖基化模式：N连接的和O连接的糖基化。蛋白质的糖基化模式依赖于该蛋白质来源的组织，并反映细胞的状态。此外，异常糖基化与包括癌症发展和进展在内的几种疾病相关。糖基化也影响许多蛋白质的生物活性。例如，许多抗体的活性依赖于抗体的糖基化模式。O-聚糖改变，诸如截短的O-聚糖表位唾液酸Tn(STn)的表达，参与癌症发展和进展。此外，细胞粘附分子(诸如E-钙粘蛋白)的活性受到糖基化的影响。改变E-钙粘蛋白中的分支N-聚糖结构，或在E-钙粘蛋白上添加β1,6GlcNAc分支聚糖，会扰乱蛋白质的正常功能并促进肿瘤细胞发展和进展。相反，E-钙粘蛋白中平分型N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)N-聚糖的存在会抑制E-钙粘蛋白介导的癌症进展并防止上皮-间质转化过程。
因此，在一个方面，本文所述的方法、组合物、试剂盒和系统可以用于对处于与异常糖基化模式或基序相关的各种病症的风险中或患有这些病症的受试者进行筛查、诊断和/或分期。此类病症包括但不限于神经退行性疾病或病症(Moll等人,“Disruptedglycosylation of lipids and proteins is a cause of neurodegeneration,”Brain,143(5):1332-1340(2020))、癌症(Wang等人,Clin.Chem.Lab.Med.,2019年3月26日:57(4):407-416)、先天性糖基化障碍以及炎性病症诸如类风湿性关节炎、炎性肠病、系统性红斑狼疮、Tn综合征、肉芽肿性多血管炎、IgA肾病和糖尿病(Reily等人,“Glycosylation inhealth and disease,”Nature Rev Nephrology,15:346-366(2019))。“阶段”是指确定疾病的进展或阶段，诸如癌症阶段、神经退行性病症的发作或进展等。
最近，据报告，在阿尔茨海默病受试者中，淀粉样β斑块和神经原纤维缠结的糖基化发生改变，这表明该过程在疾病病理学中的潜在意义。Haukedal和Freude,“Implications of Glycosylation in Alzheimer’s Disease,”Front.Neurosci.,14:625348(2021),doi.org/10.3389/fnins.2020.625348。另参见Conroy等人,“Emergingroles of N-linked glycosylation in brain physiology and disorders,”Trends inEndocrinology&Metabolism,32(12):980-993(2021年12月)(“N连接的聚糖影响几乎所有的神经元功能，包括静息膜电位的维持、轴突放电和突触囊泡释放。”)。
在另一方面，涵盖如上详述的诊断方法，随后基于该诊断来治疗患者。例如，与4期诊断相比，2期癌症诊断可能具有不同的治疗方案。类似地，明确无误地诊断患有特定炎性病症、神经退行性疾病等的受试者，可以帮助开出最合适的治疗方案。
本公开提供了用于检测和分析健康和患病细胞的糖基化的出奇有效和新颖的方法、组合物、系统和试剂盒，以及使用单细胞谱分析方法检测和分析糖蛋白的蛋白质特异性糖基化状态的方法。本文所公开的单细胞平台通过结合单细胞谱分析技术、转录组分析和先进聚糖检测方法，能够对跨越多种病理生理状态的多样细胞类型进行更深入的糖基化分析。此外，本文所公开的方法是对现有技术的聚糖鉴定方法的重大和显著改进，因为它们利用了超高通量单细胞谱分析的灵敏度和特异性，该超高通量单细胞谱分析使用大量(例如，数百万)细胞的条形码对蛋白质糖基化和生物正交化学反应(例如，采用叠氮化物或炔烃标记的单糖前体或高阶聚糖的生物正交化学报告策略)进行靶向分析，从而对单细胞的糖组进行谱分析。单细胞糖基化谱分析将基于单细胞水平的可测序读出来揭示细胞表面上的每种聚糖的丰度以及糖蛋白的糖基化模式如何随患病状态而变化。此外，本文所公开的方法将在单细胞水平上鉴定和区分具有独特糖基化谱的细胞亚群和可用于诊断或作为药物开发靶标的新生物标志物。这种特异性和详细分析是目前用于分析聚糖的分析方法所无法实现的。
与本领域已知的当前方法相比，本文所公开的方法、组合物、试剂盒和系统明显优越，因为它们提供了一种多面识别系统，用于基于可测序读出来检测生理条件下的单细胞中的蛋白质及其翻译后修饰。此外，本文所公开的方法将结合细胞的转录分析提供关于糖基化状态的精确单细胞数据。
使用如本文所公开的单细胞方法检测蛋白质特异性糖基化和糖组谱分析可以用于鉴定疾病生物标志物，并将提供与健康和患病的特定细胞类型相关的翻译后修饰及蛋白质糖基化模式相关变化的前所未有的知识。本文所公开的方法还通过改进和优化邻位连接测定(PLA)并将优化的PLA整合到单细胞谱分析方法中，提供了对单细胞中蛋白质特异性糖基化状态的更灵敏和更特异的检测，从而提供了单细胞中蛋白质特异性糖基化状态的全面概况。
在一个方面，本公开提供了用于确定细胞或组织的聚糖谱或对糖组进行谱分析的方法、组合物、系统和试剂盒。在另一方面，本公开提供了用于通过组合、优化和整合以下步骤来确定样品中一种或多种聚糖的存在的方法、组合物、系统和试剂盒：使用生物正交化学反应以寡核苷酸条形码分子对高阶聚糖进行化学酶法标记，以及对化学酶法标记的聚糖进行单细胞谱分析。在另一方面，本公开提供了通过组合、优化和整合以下步骤来确定包含一个或多个活细胞的样品中一种或多种聚糖的存在的方法：使用非天然单糖对聚糖进行代谢标记，以用于糖组谱的单细胞谱分析。在又一方面，本公开提供了通过组合、优化和整合以下步骤来检测单细胞中的蛋白质特异性糖基化模式的方法：进行邻位连接测定以检测糖蛋白及其相关的翻译后修饰(例如，聚糖)，以及单细胞谱分析。在一个方面，本公开提供了用于标记特定蛋白聚糖(糖蛋白)、聚糖或聚糖基序并鉴定来自相同细胞或彼此紧密接近的细胞的聚糖或聚糖基序的方法、组合物、系统和试剂盒。每种聚糖或聚糖基序包含通过限定的键连接到糖蛋白(例如底物)的特定糖残基。
在一个方面，本公开提供了本文所公开的任何方法用于对处于与异常糖基化模式或基序相关的疾病或病症风险中或患有该疾病或病症的受试者进行筛查、诊断或分期的用途。在一些实施方案中，该疾病或病症选自由神经退行性疾病或病症、癌症、先天性糖基化障碍和炎性病症组成的组。
II.单细胞聚糖谱分析
在一个方面，本公开提供了一种确定样品中一种或多种聚糖的存在的方法，该方法包括以下步骤：(a)将样品与(i)包含核苷酸糖和反应对的第一反应性分子的第一标志分子及(ii)第一聚糖特异性转移酶一起孵育；(b)将样品与第一报告分子混合，该第一报告分子包含(i)反应对的第二反应性分子和(ii)具有第一聚糖基序特异性报告条形码序列的第一报告寡核苷酸；(c)从样品中去除未掺入的报告分子；(d)将样品分隔到多个分区中，使得一个分区包含(i)来自样品的单细胞或单细胞裂解物和(ii)具有分区特异性条形码序列的多个核酸条形码分子；以及(e)使用第一报告寡核苷酸和多个核酸条形码分子中的一个核酸条形码分子来产生第一加聚糖条形码的核酸分子，该第一加聚糖条形码的核酸分子包含分区特异性条形码序列或其互补序列和第一聚糖基序特异性报告条形码序列或其互补序列。在一些实施方案中，第一标志分子被掺入到样品中的聚糖修饰的糖蛋白上。在一些实施方案中，第一报告分子经由第一标志分子缀合在聚糖修饰的糖蛋白上。
在另一方面，本公开提供了一种确定样品中一种或多种聚糖的存在的方法，该方法包括以下步骤：(a)将所述样品与(i)包含核苷酸糖和反应对的第一反应性分子的标志分子及(ii)第一聚糖特异性转移酶一起孵育；(b)将所述样品与报告分子一起孵育，该报告分子包含(i)反应对的第二反应性分子和(ii)具有聚糖基序特异性报告条形码序列的报告寡核苷酸；(c)从所述样品中去除未掺入的报告分子；(d)将所述样品分隔到多个分区中，使得一个分区包含(i)来自样品的单细胞或单细胞裂解物和(ii)具有分区特异性条形码序列的多个核酸条形码分子；以及(e)使用报告寡核苷酸和多个核酸条形码分子中的一个核酸条形码分子来产生第一加条形码的核酸分子，该第一加条形码的核酸分子包含分区特异性条形码序列或其互补序列和报告条形码序列或其互补序列。
在一些实施方案中，该方法还包括(a)确定第一加聚糖条形码的核酸分子或其衍生物的序列，以鉴定(i)分区特异性条形码序列或其互补序列和(ii)第一聚糖基序特异性报告条形码序列或其互补序列；和/或(b)使用鉴定的分区特异性条形码序列或其互补序列和鉴定的第一聚糖基序特异性报告条形码序列或其互补序列来确定样品中至少一种聚糖的存在和/或丰度。
在本公开的各种实施方案中，样品中提供了包含糖和反应对的第一反应性分子的标志分子。糖基转移酶将糖掺入到聚糖中；反应对的第一反应性分子保持连接到糖，从而产生包含糖和反应对的第一反应性分子的聚糖。将样品与报告分子一起孵育，该报告分子包含反应对的第二反应性分子和具有聚糖基序特异性报告条形码序列的报告寡核苷酸。反应对的第一反应性分子和第二反应性分子彼此相互作用，从而将报告寡核苷酸偶联到聚糖并标记特定聚糖基序。
此外，已经认识到所述方法可以涉及使用第一反应对；第一反应对和第二反应对；第一反应对、第二反应对和第三反应对；第一反应对、第二反应对、第三反应对和第四反应对；第一反应对、第二反应对、第三反应对、第四反应对和第五反应对；或第一反应对、第二反应对、第三反应对、第四反应对、第五反应对和至少一个附加反应对。本领域技术人员将选择彼此相容、同时保持对特异性的反应对。一个反应对的第二反应性分子可以是不同反应对的第一反应性分子。
可以在所述方法中提供一种或多种糖基转移酶。当处理固定细胞或死细胞时，必须提供糖基转移酶。当所述方法涉及活细胞时，所述方法可以使用内源糖基转移酶。当所述方法涉及活细胞时，所述方法可以使用外源糖基转移酶。如本文所用，外源糖基转移酶是提供给样品的任何糖基转移酶，包括样品中的细胞中不存在的糖基转移酶和样品中的细胞内可能存在的外源糖基转移酶。当提供外源糖基转移酶时，糖基转移酶的特异性是已知的。内源糖基转移酶天然存在于细胞中。
去除未掺入的分子的方法包括但不限于用反应缓冲液洗涤、用水性缓冲液洗涤等。水性缓冲液可包括但不限于PBS、包含牛血清白蛋白(BSA)的PBS缓冲液和PBS加0.1％-1％BSA。洗涤可以进行一次或多次，例如三次洗涤循环。细胞外或被细胞吸收的未掺入的标志分子可以通过本领域已知的任何方法去除。未掺入的报告分子可以通过本领域已知的任何方法去除。
在连接第一反应性分子和第二反应性分子的反应之后，可以使用猝灭物、猝灭剂或失活剂来失活第一反应性分子或第二反应性分子。在一个实施方案中，叠氮化物反应基团可以用TCEP(三(2-羧乙基)膦盐酸盐)来失活。TCEP可以将叠氮化物反应基团转化为氨基，从而防止进一步的反应和脱靶反应。
将样品分隔到多个分区中，使得一个分区包含来自样品的单细胞或单细胞裂解物和具有分区特异性条形码序列的多个核酸条形码分子。下文将讨论分隔。
在另一方面，本公开提供了一种确定包含一个或多个活细胞的样品中一种或多种聚糖的存在的方法，该方法包括以下步骤：(a)将样品与标志分子一起孵育，该标志分子包含合成糖和反应对的第一反应性分子；(b)将样品与报告分子混合，该报告分子包含(i)反应对的第二反应性分子和(ii)具有聚糖基序特异性报告条形码序列的报告寡核苷酸；(c)去除未掺入的报告分子；(d)将样品和多个核酸条形码分子分隔到多个分区中，使得多个分区中的一个分区包含来自样品的一个细胞和具有分区特异性条形码序列的多个核酸条形码分子；以及(e)使用报告寡核苷酸和核酸条形码分子来产生加聚糖条形码的核酸分子，该加聚糖条形码的核酸分子包含分区特异性条形码序列或其互补序列和聚糖基序特异性报告条形码序列或其互补序列。
在一些实施方案中，标志分子是一个或多个活细胞的一种或多种糖基转移酶的标志底物。在一些实施方案中，标志分子在样品的一个或多个活细胞中掺入和加工，以产生一个或多个活细胞的一种或多种糖基转移酶的一种或多种标志底物。在一些实施方案中，标志分子底物包含第一反应性分子。在一些实施方案中，报告分子经由标志分子缀合在聚糖修饰的糖蛋白上。
在另一方面，本公开提供了一种确定包含一个或多个活细胞的样品中一种或多种聚糖的存在的方法，该方法包括以下步骤：(a)将所述样品与标志分子一起孵育，该标志分子包含合成糖和反应对的第一反应性分子；(b)将所述样品与报告分子一起孵育，该报告分子包含(i)所述反应对的第二反应性分子和(ii)具有聚糖基序特异性报告条形码序列的报告寡核苷酸；(c)去除未掺入的报告分子；(d)将所述样品和多个核酸条形码分子分隔到多个分区中，使得多个分区中的一个分区包含来自样品的一个细胞和具有分区特异性条形码序列的多个核酸条形码分子；以及(e)使用报告寡核苷酸和核酸条形码分子来产生加条形码的核酸分子，该加条形码的核酸分子包含分区特异性条形码序列或其互补序列和聚糖基序特异性报告条形码序列或其互补序列。在一些实施方案中，标志分子是一个或多个活细胞的一种或多种糖基转移酶的标志底物。
在又一方面，本公开提供了一种检测单细胞中的蛋白质特异性糖基化模式的方法，该方法包括(a)将多个细胞与聚糖基序特异性分子一起孵育，该聚糖基序特异性分子包含缀合到聚糖基序特异性报告条形码序列的报告寡核苷酸；(b)提供组分特异性分子，该组分特异性分子包含缀合到组分特异性条形码序列的寡核苷酸，其中组分特异性分子结合于糖蛋白；(c)去除未掺入的聚糖特异性分子和未掺入的组分特异性分子；(d)执行连接反应；(e)将多个细胞分隔到多个分区中，使得一个分区包含(i)来自样品的单细胞、单细胞裂解物、两个相邻细胞或两个相邻细胞的裂解物和(ii)具有分区特异性条形码序列的多个核酸条形码分子；以及(f)扩增聚糖组分报告序列及多个核酸条形码分子之一以产生第一加条形码的核酸分子，该第一加条形码的核酸分子包含聚糖组分报告序列或其互补序列和分区特异性条形码序列或其互补序列或其衍生物。在一些实施方案中，聚糖基序特异性分子结合于糖蛋白上的聚糖。在一些实施方案中，聚糖特异性报告条形码序列的寡核苷酸连接到组分特异性条形码序列的寡核苷酸以产生连接的聚糖组分报告序列。在一些实施方案中，糖蛋白、聚糖基序特异性分子和组分特异性分子形成复合物。
在另一方面，本公开提供了一种检测聚糖与感兴趣的组分的接近度的方法，所述方法包括：(a)将样品与聚糖基序特异性分子一起孵育，该聚糖基序特异性分子包含具有聚糖基序特异性报告条形码序列的报告寡核苷酸；(b)提供组分特异性分子，该组分特异性分子包含具有组分特异性条形码序列的寡核苷酸；(c)去除未掺入的聚糖特异性分子和未掺入的组分特异性分子；(d)用包含聚糖特异性报告条形码序列的寡核苷酸和包含组分特异性条形码序列的寡核苷酸进行连接反应，以产生聚糖组分报告序列；(e)将所述样品分隔到多个分区中，使得一个分区包含(i)来自样品的单细胞、单细胞裂解物、两个相邻细胞或两个相邻细胞的裂解物和(ii)具有分区特异性条形码序列的多个核酸条形码分子；以及(f)使用聚糖组分报告序列和核酸条形码分子来产生加条形码的分子，该加条形码的分子包含聚糖组分报告序列或其互补序列和分区特异性条形码序列或其互补序列。
对于本文所公开的任何聚糖谱分析方法，使用报告寡核苷酸和多个核酸条形码分子中的一个核酸分子来产生加条形码的核酸分子的方法可以包括但不限于连接、逆转录、扩增、引物延伸、夹板连接和模板转换。已经认识到，产生加条形码的核酸分子的过程或方法可以产生包含感兴趣的序列或感兴趣的序列的反向互补序列的加条形码的核酸分子。例如，第一加条形码的核酸分子可以包含分区特异性条形码序列或其反向互补序列和报告条形码序列或其反向互补序列。所述方法可以包括提供多个细胞珠粒，该多个细胞珠粒包含细胞和报告寡核苷酸序列，该报告寡核苷酸序列包含报告条形码序列，以及使多个细胞珠粒经受足以裂解细胞的条件。对于本文所公开的任何聚糖谱分析方法，报告条形码序列可以用于鉴定聚糖、聚糖基序、聚糖类别或聚糖组分组合。
本文所公开的任何聚糖谱分析方法还可包括对加条形码的核酸分子或其衍生物的至少一部分进行测序，以鉴定一个或多个报告条形码序列(例如，用于鉴定聚糖、聚糖基序、聚糖类别或聚糖组分的报告条形码序列)和分区特异性条形码序列。一般而言，可以确定报告条形码序列，并且可以使用鉴定的报告条形码序列或其互补序列来反向确定感兴趣的分子的存在或指示具有共用特征的分子。感兴趣的分子可以包括但不限于聚糖、聚糖基序、聚糖类别、感兴趣的分析物、代谢物和组分。共用特征可以包括但不限于共用分区、共用来源细胞、共用来源样品、共用分析加工步骤和共用代谢加工步骤。
可以确定聚糖基序特异性报告条形码序列，并且使用该聚糖基序特异性报告条形码序列来反向确定存在的特定聚糖基序；反向确定可以通过反应对的反向确定来进行。因此，报告条形码序列可以直接或间接确定感兴趣的聚糖、聚糖基序或聚糖类别的存在。可以确定分区特异性条形码序列，并且使用该分区特异性条形码序列来反向确定来自相同分区的分子。可以确定鉴定聚糖基序的报告序列，并且使用该报告序列来反向确定存在的特定聚糖基序。可以确定聚糖特异性报告条形码序列，并且使用该聚糖特异性报告条形码序列来反向确定感兴趣的聚糖的存在。
可以确定每个加条形码的核酸分子的丰度。例如，每个加条形码的核酸分子的丰度可以用于反向确定至少一种聚糖或聚糖基序的丰度。所述方法可以包括确定至少两种、至少三种、至少四种、至少五种、至少六种、至少七种、至少八种或更多种聚糖或聚糖基序的丰度。
所述方法可以与一种或多种不同的聚糖、聚糖基序、聚糖类别、分析物和感兴趣的化合物一起使用。不同聚糖、聚糖基序和/或聚糖类别的确定可以用于阐明细胞的糖组。一个分区可以包括一个附加报告分子，该附加报告分子能够偶联到附加聚糖、聚糖基序、聚糖类别、分析物或感兴趣的化合物。聚糖加工或分析、聚糖基序加工或分析和/或聚糖类别加工或分析可以与该分区中的其他分析结合。
本公开的另一方面提供了用于确定样品中一种或多种聚糖的存在或用于检测单细胞中的蛋白质特异性糖基化模式的组合物、试剂盒和系统。
A.使用化学酶法标记的聚糖谱分析
糖组谱分析的化学酶法标记方法可以用于鉴定活细胞表面上的或细胞内靶标的裂解物上的聚糖结构。所述方法涉及将样品与包含核苷酸糖和反应对的第一反应性分子的标志分子及第一聚糖特异性转移酶一起孵育。外源糖基转移酶或转移酶的特异性允许鉴定特定聚糖结构。聚糖特异性转移酶将标记的核苷酸糖掺入到聚糖中。聚糖特异性转移酶可以包括但不限于糖基转移酶、唾液酸转移酶、α1,3-岩藻糖基转移酶；BGTA；WbwK岩藻糖基转移酶；α1,2-岩藻糖基转移酶；β1-4N-乙酰氨基半乳糖转移酶；β-半乳糖苷α2,6唾液酸转移酶1；以及β-半乳糖苷α2,3唾液酸转移酶1。
本公开的一个方面提供了一种确定样品中一种或多种聚糖的存在的方法，该方法包括以下步骤：(a)将样品与(i)包含核苷酸糖和反应对的第一反应性分子的第一标志分子及(ii)第一聚糖特异性转移酶一起孵育；(b)将样品与第一报告分子混合，该第一报告分子包含(i)反应对的第二反应性分子和(ii)具有第一聚糖基序特异性报告条形码序列的第一报告寡核苷酸；(c)从样品中去除未掺入的报告分子；(d)将样品分隔到多个分区中，使得一个分区包含(i)来自样品的单细胞或单细胞裂解物和(ii)具有分区特异性条形码序列的多个核酸条形码分子；以及(e)使用第一报告寡核苷酸和多个核酸条形码分子中的一个核酸条形码分子来产生第一加聚糖条形码的核酸分子，该第一加聚糖条形码的核酸分子包含分区特异性条形码序列或其互补序列和第一聚糖基序特异性报告条形码序列或其互补序列。在一些实施方案中，第一标志分子被掺入到样品中的聚糖修饰的糖蛋白上。在一些实施方案中，第一报告分子经由第一标志分子缀合在聚糖修饰的糖蛋白上。
将样品与报告分子一起孵育，该报告分子包含反应对的第二反应性分子和具有聚糖基序特异性报告条形码序列的报告寡核苷酸。反应对的第二反应性分子与反应对的第一反应性分子相互作用，从而将具有聚糖基序特异性报告条形码序列的报告分子带到聚糖上。示例性的聚糖和聚糖基序在本领域中是已知的。聚糖或聚糖基序可以选自由以下物质组成的组但不限于以下物质：O-GlcNAc残基、含LacNac的聚糖、含Fuc-α1,2-Gal的聚糖、含Galβ1-3GalNAc的聚糖、GlcNAc-O-R、Neu5Acα2-3Gal和GalT1Y289L。聚糖类别包括但不限于O连接的聚糖、N连接的聚糖、粘蛋白型O连接的聚糖、O连接的聚糖核心I和O连接的聚糖核心2。
从样品中去除未掺入的报告分子，并将样品分隔到多个分区中，使得一个分区包含来自样品的单细胞或单细胞裂解物和具有分区特异性条形码序列的多个核酸条形码分子。使用报告寡核苷酸和多个核酸条形码分子中的一个核酸条形码分子来产生第一加条形码的核酸分子，该第一加条形码的核酸分子包含分区特异性条形码序列或其互补序列和报告条形码序列或其互补序列。
在一些实施方案中，本文所公开的方法还包括(a)确定第一加聚糖条形码的核酸分子或其衍生物的序列，以鉴定(i)分区特异性条形码序列或其互补序列和(ii)第一聚糖基序特异性报告条形码序列或其互补序列；和/或(b)使用鉴定的分区特异性条形码序列或其互补序列和鉴定的第一聚糖基序特异性报告条形码序列或其互补序列来确定样品中至少一种聚糖的存在和/或丰度。
已经认识到，在所述方法的各个方面，可以将一种或多种聚糖特异性转移酶与样品一起孵育。每种聚糖特异性转移酶优先将不同的核苷酸糖转移到聚糖中。已经认识到，多种聚糖特异性转移酶可以将核苷酸糖转移到相同的聚糖结构或不同的聚糖结构中。聚糖特异性转移酶将核苷酸糖掺入到限定的聚糖基序中。报告分子上的反应对的第二反应性分子与掺入的核苷酸糖上的反应对的第一反应性分子相互作用，并将聚糖基序特异性报告条形码序列带到聚糖上。
在所述方法的各个方面，可以使用多个标志分子。在此类情况下，第一标志分子包含第一核苷酸糖和第一反应对的第一反应性分子，并且第二标志分子包含第二核苷酸糖和第二反应对的第一反应性分子。第一核苷酸糖和第二核苷酸糖是不同的核苷酸糖。类似地，第三标志分子包含第三核苷酸糖和第三反应对的第一反应性分子。第三核苷酸糖不同于第一核苷酸糖和第二核苷酸糖。类似地，第四标志分子包含第四核苷酸糖和第三反应对的第一反应性分子。一个分区中的多个核酸分子还可包含捕获序列。报告寡核苷酸还可以包含捕获柄，该捕获柄包含与捕获序列互补的序列。捕获柄可以包含与TSO序列、多聚T序列或两者互补的序列。
第四核苷酸糖不同于第一核苷酸糖、第二核苷酸糖和第三核苷酸糖。每个附加标志分子将包含不同的附加核苷酸糖和附加反应对的第一反应性分子。多个标志分子允许在相同样品中鉴定多个聚糖基序。
在所述方法的各个方面，向样品提供多种聚糖特异性转移酶。所述方法可以涉及第二聚糖特异性转移酶、第三聚糖特异性转移酶、第四聚糖特异性转移酶、第五聚糖特异性转移酶、第六聚糖特异性转移酶、第七聚糖特异性转移酶或附加聚糖特异性转移酶。每种聚糖特异性转移酶优先将不同的核苷酸糖转移到聚糖受体上。
所述方法的其他方面可以涉及顺序标记，其中向样品提供第一聚糖特异性转移酶和第一标志分子。在孵育并洗涤或冲洗样品并且添加第一报告分子并去除未掺入的报告分子后，将第二聚糖特异性转移酶和第二标志分子与样品一起孵育。孵育后，再次洗涤或冲洗样品，并在允许第一反应性分子和第二反应性分子相互作用或偶联的条件下将样品与第二报告分子一起孵育。去除未掺入的分子。可以执行额外几轮的顺序标记。可以将第三聚糖特异性转移酶和第三标志分子与样品一起孵育。孵育后，洗涤样品，并在允许第三反应对的第一反应性分子和第二反应性分子相互作用的条件下将样品与第三报告分子一起孵育。去除未掺入的分子。可以将第四聚糖特异性转移酶和第四标志分子与样品一起孵育。孵育后，洗涤样品，并在允许第四反应对的第一反应性分子和第二反应性分子相互作用的条件下将样品与第四报告分子一起孵育。去除未掺入的分子。可以将第五聚糖特异性转移酶和第五标志分子与样品一起孵育。孵育后，洗涤样品，并在允许第五反应对的第一反应性分子和第二反应性分子相互作用的条件下将样品与第五报告分子一起孵育。去除未掺入的分子。可以将第六聚糖特异性转移酶和第六标志分子与样品一起孵育。孵育后，洗涤样品，并在允许第六反应对的第一反应性分子和第二反应性分子相互作用的条件下将样品与第六报告分子一起孵育。去除未掺入的分子。可以将第七聚糖特异性转移酶和第七标志分子与样品一起孵育。孵育后，洗涤样品，并在允许第七反应对的第一反应性分子和第二反应性分子相互作用的条件下将样品与第七报告分子一起孵育。去除未掺入的分子。可以将第八聚糖特异性转移酶和第八标志分子与样品一起孵育。孵育后，洗涤样品，并在允许第八反应对的第一反应性分子和第二反应性分子相互作用的条件下将样品与第八报告分子一起孵育。去除未掺入的分子。可以将第九聚糖特异性转移酶和第九标志分子与样品一起孵育。孵育后，洗涤样品，并在允许第九反应对的第一反应性分子和第二反应性分子相互作用的条件下将样品与第九报告分子一起孵育。去除未掺入的分子。可以将第十聚糖特异性转移酶和第十标志分子与样品一起孵育。孵育后，洗涤样品，并在允许第十反应对的第一反应性分子和第二反应性分子相互作用的条件下将样品与第十报告分子一起孵育。去除未掺入的分子。更多轮的顺序标记是类似的。顺序标记可以涉及2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、14、16、18、20、30、40轮或更多轮的标记。
在一些实施方案中，该方法还包括(a)将样品与(i)包含第二核苷酸糖和第二反应对的第一反应性分子的第二标志分子及(ii)第二聚糖特异性转移酶一起孵育；以及(b)将样品与第二报告分子混合，该第二报告分子包含(i)第二反应对的第二反应性分子，和(ii)具有鉴定第二聚糖基序的报告条形码序列的第二报告寡核苷酸。在一些实施方案中，第二标志分子被掺入到样品中的聚糖修饰的糖蛋白上。在一个实施方案中，第二反应性分子能够偶联到第二反应对的第一反应性分子。在一些实施方案中，第二报告分子经由第二标志分子缀合在聚糖修饰的糖蛋白上。
在一些实施方案中，该方法还包括(a)将样品与(i)包含第三核苷酸糖和第三反应对的第一反应性分子的第三标志分子及(ii)第三聚糖特异性转移酶一起孵育；以及(b)将样品与第三报告分子混合，该第三报告分子包含(i)第三反应对的第二反应性分子，其中第二反应性分子能够偶联到第三反应对的第一反应性分子，和(ii)具有鉴定第三聚糖基序的报告条形码序列的第三报告寡核苷酸。在一个实施方案中，第三标志分子被掺入到样品中的聚糖修饰的糖蛋白上。在另一个实施方案中，第三报告分子经由第三标志分子缀合在聚糖修饰的糖蛋白上。
在一些实施方案中，该方法还包括：(a)将样品与(i)包含第四核苷酸糖和第四反应对的第一反应性分子的第四标志分子及(ii)第四聚糖特异性转移酶一起孵育；以及(b)将样品与第四报告分子混合，该第四报告分子包含(i)第四反应对的第二反应性分子；和(iii)具有鉴定第四聚糖基序的报告条形码序列的第四报告寡核苷酸，其中第四报告分子经由第四标志分子缀合在聚糖修饰的糖蛋白上。在一个实施方案中，第四标志分子被掺入到样品中的聚糖修饰的糖蛋白上。在另一个实施方案中，第二反应性分子能够偶联到所述第四反应对的第一反应性分子。
在涉及顺序标记的方法中，标志分子可以包含在不同轮的顺序标记中用于标志分子的核苷酸糖。在顺序标记的一个方面，可以向样品提供转移相同糖的多种不同聚糖特异性转移酶。在各个方面，当多种不同聚糖特异性转移酶转移相同糖时，每种不同聚糖特异性转移酶将糖转移到不同聚糖基序中。在顺序标记的一个方面，每种不同聚糖特异性转移酶转移不同核苷酸糖。
在一些实施方案中，本文所述的第一聚糖特异性转移酶、第二聚糖特异性转移酶、第三聚糖特异性转移酶或第四聚糖特异性转移酶选自由以下物质组成的组：β1-4半乳糖基转移酶、糖基转移酶、唾液酸转移酶、α1-3-岩藻糖基转移酶；人血型A抗原糖基转移酶(BgtA)；WbwK岩藻糖基转移酶；α1-2-岩藻糖基转移酶；β1-4N-乙酰氨基半乳糖转移酶；β-半乳糖苷α2-6唾液酸转移酶1；以及β-半乳糖苷α2-3唾液酸转移酶1；ST3Gal1；ST6Gal1；和CgtA。在一些实施方案中，第一标志分子、第二标志分子、第三标志分子或第四标志分子选自由以下物质组成的组：UDP-GalNAc；GDP-岩藻糖；UDP-GalNAc；和CMP-Sia。在一些实施方案中，聚糖修饰的糖蛋白包含选自由以下物质组成的组的聚糖：GlcNAc-O-R；LacNAc；Fucα1-2Gal；Galβ1-3GalNAc；Neu5Acα2-3Gal；N-聚糖；和O-聚糖。
在一个实施方案中，第一聚糖特异性转移酶、第二聚糖特异性转移酶、第三聚糖特异性转移酶或第四聚糖特异性转移酶是β1-4半乳糖基转移酶，第一标志分子、第二标志分子、第三标志分子或第四标志分子是UDP-GalNAc；并且聚糖修饰的糖蛋白上的聚糖包含GlcNAc-O-R。在一个实施方案中，第一聚糖特异性转移酶、第二聚糖特异性转移酶、第三聚糖特异性转移酶或第四聚糖特异性转移酶是α1-3-岩藻糖基转移酶，第一标志分子、第二标志分子、第三标志分子或第四标志分子是GDP-岩藻糖；并且聚糖修饰的糖蛋白上的聚糖包含LacNAc。在一个实施方案中，第一聚糖特异性转移酶、第二聚糖特异性转移酶、第三聚糖特异性转移酶或第四聚糖特异性转移酶是人血型A抗原糖基转移酶(BgtA)，第一标志分子、第二标志分子、第三标志分子或第四标志分子是UDP-GalNAc；并且聚糖修饰的糖蛋白上的聚糖包含Fucα1-2Gal。在一个实施方案中，第一聚糖特异性转移酶、第二聚糖特异性转移酶、第三聚糖特异性转移酶或第四聚糖特异性转移酶是α1-2-岩藻糖基转移酶，第一标志分子、第二标志分子、第三标志分子或第四标志分子是GDP-岩藻糖；并且聚糖修饰的糖蛋白上的聚糖包含Galβ1-3GalNAc。在另一个实施方案中，第一聚糖特异性转移酶、第二聚糖特异性转移酶、第三聚糖特异性转移酶或第四聚糖特异性转移酶是β1-4N-乙酰氨基半乳糖转移酶，第一标志分子、第二标志分子、第三标志分子或第四标志分子是UDP-GalNAc；并且聚糖修饰的糖蛋白上的聚糖包含Neu5Acα2-3Gal。在又一个实施方案中，第一聚糖特异性转移酶、第二聚糖特异性转移酶、第三聚糖特异性转移酶或第四聚糖特异性转移酶是β-半乳糖苷α2-6唾液酸转移酶1，第一标志分子、第二标志分子、第三标志分子或第四标志分子是CMP-Sia；并且聚糖修饰的糖蛋白上的聚糖是N-聚糖。在另一个实施方案中，第一聚糖特异性转移酶、第二聚糖特异性转移酶、第三聚糖特异性转移酶或第四聚糖特异性转移酶是β-半乳糖苷α2-3唾液酸转移酶1，第二标志分子、第三标志分子或第四标志分子是CMP-Sia；并且聚糖修饰的糖蛋白上的聚糖是O-聚糖。在一个实施方案中，第一聚糖特异性转移酶是β1-4半乳糖基转移酶；第二聚糖特异性转移酶是α1-3-岩藻糖基转移酶；并且第三聚糖特异性转移酶是β-半乳糖苷α2-3唾液酸转移酶1。在另一个实施方案中，第一聚糖特异性转移酶对UDP-GalNAc具有特异性；第二聚糖特异性转移酶对GDP-岩藻糖具有特异性；并且第三聚糖特异性转移酶对CMP-Sia具有特异性。在又一个实施方案中，第一聚糖特异性转移酶、第二聚糖特异性转移酶、第三聚糖特异性转移酶或第四聚糖特异性转移酶对以下物质具有特异性：GlcNAc-O-R；LacNAc；Fucα1-2Gal；Galβ1-3GalNAc；Neu5Acα2-3Gal；N-聚糖；或O-聚糖。
报告分子可以是不可裂解的或可裂解的。“可裂解的”是指报告寡核苷酸可以从报告分子的剩余部分裂解、分离或去除。已经认识到，从报告分子裂解报告寡核苷酸可以发生在样品分隔之后。已经认识到，裂解报告分子可以发生在连接之后。已经认识到，裂解报告分子可以发生在进行夹板反应之后。报告寡核苷酸和报告分子的剩余部分之间的可裂解键可以是二硫化物接头。在各个方面，可裂解接头可以是与包含分区特异性序列的多个核酸分子一起使用、与凝胶珠粒一起使用或典型单细胞工作流程方面中使用的相同类型的可裂解接头。在各个方面，可裂解接头可以是与典型单细胞工作流程中使用的接头不同类型的可裂解接头。在各个方面，可裂解接头可以选自由DTT可裂解接头和还原剂可裂解接头组成的组。
样品选自包含组织、细胞、固定细胞、活细胞和细胞裂解物的样品的组。在各个方面，多个分区接收来自样品的单细胞或单细胞的裂解物。细胞或来自单细胞的裂解物可以被包封在细胞珠粒中，包被细胞珠粒的表面，包埋在细胞珠粒中，或它们的任何组合。还已经认识到，细胞裂解可以发生在将细胞分隔到多个分区中之后。所述方法可以包括使多个细胞珠粒经受足以裂解细胞的条件的步骤。足以裂解细胞的条件可以涉及使细胞珠粒与裂解剂接触。
所述方法还可以包括以下步骤：确定多个加条形码的核酸分子或其衍生物的序列以鉴定分区特异性条形码序列或其互补序列和聚糖基序特异性报告条形码序列，以及使用鉴定的分区特异性条形码序列和鉴定的聚糖基序特异性报告条形码序列的序列来确定共用分区中一个或多个聚糖基序的存在和/或丰度。当一个分区仅包含一个细胞或来自单细胞的裂解物时，则所有具有相同分区鉴定序列的鉴定的聚糖基序都来自相同细胞。还可以确定每个鉴定的聚糖基序的量、普遍性或丰度。在一些情况下，报告条形码序列包含UMI部分，该UMI部分允许鉴定聚糖基序的每个独特实例。不同报告UMI的数量指示原始样品中标记的不同聚糖基序的数量。
本文其他地方讨论了分区。在所述方法中可以使用任何合适的分区类型。分区包括但不限于液滴、孔、珠粒和细胞珠粒。可以在珠粒上提供任何多个核酸条形码分子或多个核酸条形码分子的任何子集。这种珠粒可以是凝胶珠粒。多个核酸条形码分子的至少一个子集可释放地连接到凝胶珠粒。一个分区中的多个核酸条形码分子还可以包含UMI序列。一个分区中的核酸条形码分子的UMI序列可以不同于该分区中的另一个核酸条形码分子的UMI序列。一个分区中的核酸条形码分子的UMI序列可以不同于该分区中的多个核酸条形码分子的UMI序列。一个分区中的核酸条形码分子的UMI序列可以不同于该分区中的大部分核酸条形码分子的UMI序列。
一个分区中的多个核酸分子还可以包含功能序列。一个分区中的多个核酸分子还可以包含捕获序列。在各个方面，捕获序列包含模板转换寡核苷酸(TSO)序列、多聚T序列或两者。报告寡核苷酸还可以包含捕获柄，该捕获柄包含与捕获序列互补的序列。捕获柄可以包含与TSO序列、多聚T序列或两者互补的序列。
在一个方面，本发明提供了一种用于确定样品中一种或多种聚糖的存在的组合物，该组合物包含：(a)多个标志分子，每个标志分子包含核苷酸糖和反应对的第一反应性分子，(b)多种聚糖特异性转移酶，和(c)多个报告分子，每个报告分子包含反应对的第二反应性分子和具有聚糖基序特异性报告条形码序列的报告寡核苷酸。
在一些实施方案中，多种聚糖特异性转移酶中的每一者选自由以下物质组成的组：β1-4半乳糖基转移酶、糖基转移酶、唾液酸转移酶、α1-3-岩藻糖基转移酶；人血型A抗原糖基转移酶(BgtA)；WbwK岩藻糖基转移酶；α1-2-岩藻糖基转移酶；β1-4N-乙酰氨基半乳糖转移酶；β-半乳糖苷α2-6唾液酸转移酶1；β-半乳糖苷α2-3唾液酸转移酶1；ST3Gal1；ST6Gal1；和CgtA。在一些实施方案中，多种聚糖特异性转移酶中的每一者对以下物质具有特异性：GlcNAc-O-R；LacNAc；Fucα1-2Gal；Galβ1-3GalNAc；Neu5Acα2-3Gal；N-聚糖；或O-聚糖。在一些实施方案中，多个标志分子中的每一者选自由以下物质组成的组：UDP-GalNAc；GDP-岩藻糖；UDP-GalNAc；和CMP-Sia。在一些实施方案中，聚糖或聚糖基序选自由O-GlcNAc残基、含LacNac的聚糖、含Fuc-α1,2-Gal的聚糖、含Galβ1-3GalNAc的聚糖、GlcNAc-O-R、Neu5Acα2-3Gal和GalT1Y289L组成的组。
在一些实施方案中，反应对选自由以下物质组成的反应对的组：叠氮化物和炔烃、叠氮化物和膦、醛和氨氧基、醛和肼、醛和酰肼、酮和氨氧基、肼和酮、环丙烯和四嗪、降冰片烯和四嗪、反式环辛烯和四嗪、炔烃和四嗪、硝酮和烯烃、硝酮和炔烃、重氮基和炔烃以及异腈和四嗪。在一些实施方案中，反应对的第二反应性分子能够偶联到反应对的第一反应性分子。
在一些实施方案中，该组合物还包含多个细胞珠粒，该多个细胞珠粒包含细胞和报告寡核苷酸序列，该报告寡核苷酸序列包含鉴定聚糖基序的报告条形码序列。细胞珠粒还可以包含选自引物、逆转录酶、聚合酶、核苷酸、蛋白酶、转座子、核酸内切酶、转换寡核苷酸或它们的任何组合的附加试剂。
在另一方面，本公开提供了一种包含多个核酸条形码分子的组合物。多个核酸条形码分子中的每一者包含：分区特异性条形码序列；独特分子标识符(UMI)序列；和捕获序列。在一个实施方案中，UMI是功能序列。
B.使用代谢标记的聚糖谱分析
本发明的一个方面公开了一种确定包含一个或多个活细胞的样品中一种或多种聚糖的存在的方法，该方法包括以下步骤：(a)将样品与标志分子一起孵育，该标志分子包含合成糖和反应对的第一反应性分子；(b)将样品与报告分子混合，该报告分子包含(i)反应对的第二反应性分子和(ii)具有聚糖基序特异性报告条形码序列的报告寡核苷酸；(c)去除未掺入的报告分子；(d)将样品和多个核酸条形码分子分隔到多个分区中，使得多个分区中的一个分区包含来自样品的一个细胞和具有分区特异性条形码序列的多个核酸条形码分子；以及(e)使用报告寡核苷酸和核酸条形码分子来产生加聚糖条形码的核酸分子，该加聚糖条形码的核酸分子包含分区特异性条形码序列或其互补序列和聚糖基序特异性报告条形码序列或其互补序列。在一个实施方案中，标志分子是一个或多个活细胞的一种或多种糖基转移酶的标志底物。在另一个实施方案中，标志分子在样品的一个或多个活细胞中掺入和加工，以产生一个或多个活细胞的一种或多种糖基转移酶的一种或多种标志底物。在又一个实施方案中，标志底物包含第一反应性分子。在一个实施方案中，报告分子经由标志分子缀合在聚糖修饰的糖蛋白上。
在一些实施方案中，反应对选自由以下物质组成的反应对的组：叠氮化物和炔烃、叠氮化物和膦、醛和氨氧基、醛和肼、醛和酰肼、酮和氨氧基、肼和酮、环丙烯和四嗪、降冰片烯和四嗪、反式环辛烯和四嗪、炔烃和四嗪、硝酮和烯烃、硝酮和炔烃、重氮基和炔烃以及异腈和四嗪。在某个实施方案中，本文所述的反应对的第二反应性分子能够偶联到反应对的第一反应性分子。
糖组谱分析的代谢标记方法可以用于确定活细胞中或活细胞的细胞表面上一种或多种聚糖的存在。所述方法涉及将包含一个或多个活细胞的样品与标志分子一起孵育，该标志分子包含合成糖和反应对的第一反应性分子，其中该标志分子是一个或多个活细胞的一种或多种糖基转移酶的标志底物。应当理解，标志分子可以在被糖基转移酶使用之前被细胞加工。例如，包含N-乙酰葡糖胺的标志分子可以被加工成包含N-乙酰半乳糖胺的标志底物。然后，细胞可以将N-乙酰半乳糖胺掺入到粘蛋白型O连接的聚糖中。在另一个非限制性实例中，N-乙酰甘露糖胺可以被加工成唾液酸。
还已经认识到，一种或多种内源糖基转移酶可以将标志底物转移到聚糖或聚糖结构中。由于该方法依赖于内源糖基转移酶，代谢标记方法的特异性由标志底物、特别是合成糖决定。因此，该方法可以涉及将目标底物转移到一个或多个不同的受体，或者目标底物可以通过不同的键连接到受体。应当理解，包含合成糖的标志底物可以是一种内源糖基转移酶的特异性底物或多于一种内源糖基转移酶的底物。在一些实施方案中，可能优选的是选择作为有限数量的内源糖基转移酶的特异性底物的合成糖。
在一些实施方案中，可能优选的是选择作为大量内源糖基转移酶的底物的合成糖。在一个实施方案中，合成糖选自由半乳糖、唾液酸、岩藻糖、甘露糖、N-乙酰甘露糖胺和N-乙酰半乳糖胺组成的组。在一个实施方案中，合成糖被掺入到选自由以下物质组成的组的聚糖中：唾液酸化聚糖；岩藻糖基化聚糖；胞质O-GlcNAc糖基化；和粘蛋白型O连接的聚糖。在另一个实施方案中，合成糖是聚糖类别特异性的和/或是聚糖基序特异性的。
本文其他地方讨论了合成糖。在各个方面，合成糖被掺入到聚糖中，该聚糖选自由唾液酸和粘蛋白型O连接的聚糖组成的组。合成糖可以是聚糖基序特异性的或聚糖类别特异性的。在所述方法的各方面，合成糖可以被乙酰化。合成糖可以选自由N-乙酰甘露糖胺和N-乙酰半乳糖胺组成的组。
已经认识到，与涉及外源糖基转移酶的方法的孵育时间相比，利用内源糖基转移酶的方法的孵育时间可能增加。如果需要，可以选择孵育时间，以使标志分子有足够的时间进入细胞并被加工成标志底物。孵育持续时间可以是选自包括1秒至30秒、30秒至1分钟、1分钟至10分钟、5分钟至60分钟以及1小时至12小时的范围的组的持续时间。
所述方法涉及将样品与报告分子一起孵育，该报告分子包含反应对的第二反应性分子和具有聚糖基序特异性报告条形码序列的报告寡核苷酸。与报告分子孵育的持续时间可以不同于与标志分子孵育的持续时间。报告分子上的反应对的第二反应性分子与反应对的第一反应性分子偶联。
如本文其他地方所述，去除未掺入的报告分子。如本文其他地方所述，将样品分隔到多个分区中。多个分区中的一个分区包含来自样品的一个细胞和具有分区特异性条形码序列的多个核酸条形码分子。使用报告分子上的报告寡核苷酸和核酸条形码分子来产生加条形码的核酸分子，该加条形码的核酸分子包含分区特异性条形码序列或其互补序列和聚糖基序特异性报告条形码序列或其互补序列。
所述方法还可以包括确定加条形码的核酸分子或其衍生物的序列，以鉴定分区特异性条形码序列或其互补序列和聚糖基序特异性报告条形码序列或其互补序列。所述方法可以涉及使用鉴定的分区特异性条形码序列或其互补序列和鉴定的聚糖基序特异性报告条形码序列或其互补序列来确定样品中至少一种聚糖基序的存在和/或丰度。在一些实施方案中，本文所公开的方法还包括(a)确定加聚糖条形码的核酸分子或其衍生物的序列，以鉴定(i)分区特异性条形码序列或其互补序列和(ii)聚糖基序特异性报告条形码序列或其互补序列。在一些实施方案中，该方法还包括使用鉴定的分区特异性条形码序列或其互补序列和鉴定的聚糖基序特异性报告条形码序列或其互补序列来确定所述样品中至少一种聚糖的存在和/或丰度。
本公开的另一方面提供了一种用于确定样品中一种或多种聚糖的存在的组合物，该组合物包含：(a)多个标志分子，每个标志分子包含合成糖和反应对的第一反应性分子；和(b)报告分子，该报告分子包含反应对的第二反应性分子和具有聚糖基序特异性报告条形码序列的报告寡核苷酸。在一些实施方案中，每个标志分子是一个或多个活细胞的一种或多种糖基转移酶的标志底物。
在一些实施方案中，多种聚糖特异性转移酶中的每一者选自由以下物质组成的组：β1-4半乳糖基转移酶、糖基转移酶、唾液酸转移酶、α1-3-岩藻糖基转移酶；人血型A抗原糖基转移酶(BgtA)；WbwK岩藻糖基转移酶；α1-2-岩藻糖基转移酶；β1-4N-乙酰氨基半乳糖转移酶；β-半乳糖苷α2-6唾液酸转移酶1；β-半乳糖苷α2-3唾液酸转移酶1；ST3Gal1；ST6Gal1；和CgtA。在一些实施方案中，多种聚糖特异性转移酶中的每一者对以下物质具有特异性：GlcNAc-O-R；LacNAc；Fucα1-2Gal；Galβ1-3GalNAc；Neu5Acα2-3Gal；N-聚糖；或O-聚糖。在一些实施方案中，多个标志分子中的每一者选自由以下物质组成的组：UDP-GalNAc；GDP-岩藻糖；UDP-GalNAc；和CMP-Sia。在一些实施方案中，聚糖或聚糖基序选自由O-GlcNAc残基、含LacNac的聚糖、含Fuc-α1,2-Gal的聚糖、含Galβ1-3GalNAc的聚糖、GlcNAc-O-R、Neu5Acα2-3Gal和GalT1Y289L组成的组。
在一些实施方案中，反应对选自由以下物质组成的反应对的组：叠氮化物和炔烃、叠氮化物和膦、醛和氨氧基、醛和肼、醛和酰肼、酮和氨氧基、肼和酮、环丙烯和四嗪、降冰片烯和四嗪、反式环辛烯和四嗪、炔烃和四嗪、硝酮和烯烃、硝酮和炔烃、重氮基和炔烃以及异腈和四嗪。在一些实施方案中，反应对的第二反应性分子能够偶联到反应对的第一反应性分子。
在一些实施方案中，该组合物还包含多个细胞珠粒，该多个细胞珠粒包含细胞和报告寡核苷酸序列，该报告寡核苷酸序列包含鉴定聚糖基序的报告条形码序列。细胞珠粒还可以包含选自引物、逆转录酶、聚合酶、核苷酸、蛋白酶、转座子、核酸内切酶、转换寡核苷酸或它们的任何组合的附加试剂。
在另一方面，本公开提供了一种包含多个核酸条形码分子的组合物。多个核酸条形码分子中的每一者包含：分区特异性条形码序列；独特分子标识符(UMI)序列；和捕获序列。在一个实施方案中，UMI是功能序列。
C.使用邻位连接的聚糖谱分析
本公开的一个方面提供了一种检测单细胞中的蛋白质特异性糖基化模式的方法，该方法包括：(a)将多个细胞与聚糖基序特异性分子一起孵育，该聚糖基序特异性分子包含缀合到聚糖基序特异性报告条形码序列的报告寡核苷酸；(b)提供组分特异性分子，该组分特异性分子包含缀合到组分特异性条形码序列的寡核苷酸；(c)去除未掺入的聚糖特异性分子和未掺入的组分特异性分子；(d)执行连接反应；(e)将多个细胞分隔到多个分区中，使得一个分区包含(i)来自样品的单细胞、单细胞裂解物、两个相邻细胞或两个相邻细胞的裂解物和(ii)具有分区特异性条形码序列的多个核酸条形码分子；以及(f)扩增聚糖组分报告序列及多个核酸条形码分子之一以产生第一加条形码的核酸分子，该第一加条形码的核酸分子包含聚糖组分报告序列或其互补序列和分区特异性条形码序列或其互补序列或其衍生物。在一个实施方案中，聚糖基序特异性分子结合于糖蛋白上的聚糖。在一个实施方案中，组分特异性分子结合于糖蛋白。在一个实施方案中，聚糖特异性报告条形码序列的寡核苷酸连接到组分特异性条形码序列的寡核苷酸以产生连接的聚糖组分报告序列。在另一个实施方案中，糖蛋白、聚糖基序特异性分子和组分特异性分子形成复合物。
可以使用糖组谱分析的邻位连接方法来鉴定与感兴趣的组分接近的聚糖结构。感兴趣的组分可以位于细胞表面、细胞外组分或细胞内组分上。感兴趣的组分可以位于相同细胞上或中，或者位于相邻细胞上。本文其他地方描述了感兴趣的组分。所述方法涉及将样品与聚糖基序特异性分子一起孵育，该聚糖基序特异性分子包含具有聚糖基序特异性报告条形码序列的报告寡核苷酸，以及提供组分特异性分子，该组分特异性分子包含具有组分特异性条形码序列的寡核苷酸。作为实例而非限制，组分特异性分子可以是感兴趣的蛋白质的抗体。聚糖基序特异性分子与感兴趣的蛋白质上的目标聚糖基序相互作用。在一些实施方案中，聚糖基序特异性分子可以包含凝集素。在一些实施方案中，聚糖基序特异性分子可以包含聚糖基序特异性抗体。所述方法可以用于鉴定感兴趣的蛋白质上的翻译后修饰。在另一个非限制性实例中，组分特异性分子可以是对感兴趣的组分具有特异性的凝集素。聚糖基序特异性分子与目标聚糖基序相互作用，并且凝集素结合紧密接近的碳水化合物。所述方法可以用于鉴定彼此紧密接近的聚糖。所述方法也可以用于评估蛋白质特异性糖基化。不受机理的限制，聚糖基序特异性分子与目标聚糖基序相互作用，并且组分特异性分子与感兴趣的组分相互作用。
去除未结合的聚糖特异性分子和未结合的组分特异性分子的方法在本领域中是已知的。本文其他地方讨论了洗涤或去除未结合或未掺入的分子的方法。任何洗涤或去除未结合的材料的方法都可以用于所述方法中。
在一些实施方案中，提供夹板，并且用包含聚糖特异性报告条形码的寡核苷酸和包含组分特异性条形码序列的寡核苷酸进行连接反应，同时使寡核苷酸与夹板杂交以产生聚糖组分报告序列。在一些情况下，包含聚糖特异性报告条形码序列的寡核苷酸和包含组分特异性条形码序列的寡核苷酸可以各自与夹板分子的相应第一部分和第二部分杂交，使得在一种寡核苷酸的核酸序列的3’末端和另一种寡核苷酸的5’末端之间产生长度为约0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个核苷酸的间隙。
在操作中，例如，与(i)偶联到聚糖的聚糖特异性分子和(ii)偶联到组分的组分特异性分子流体接触的夹板分子可以依次或同时与聚糖特异性分子的寡核苷酸和组分特异性分子的寡核苷酸杂交。顺序杂交包括将包含聚糖特异性条形码的寡核苷酸与夹板分子的第一部分杂交，然后将包含组分条形码分子的核酸序列的寡核苷酸与相同夹板分子的第二部分杂交，或反之亦然。在各种情况下，夹板分子可以是能够与(i)包含聚糖特异性条形码序列的寡核苷酸和(ii)包含组分特异性条形码序列的寡核苷酸杂交(顺序或同时)的任何分子。
在各个方面，夹板分子(在本文中也称为桥接序列或桥接寡核苷酸)可以包含DNA和/或RNA。在一些情况下，夹板序列是夹板DNA序列。夹板序列可以包含1、2、3、4个或更多个部分。这些部分可以具有不同的核酸序列，因此能够与不同的互补核酸序列杂交。在本文的各种情况下，夹板序列包含具有相同或不同核酸序列的2个部分或由这2个部分组成，并且其中夹板序列是夹板DNA序列。在这样的情况下，夹板DNA序列包含2个部分，第一部分能够与包含聚糖特异性条形码序列的寡核苷酸序列杂交，而第二部分能够与包含组分特异性条形码序列的寡核苷酸杂交。
在一些情况下，本文的桥接分子可以包含氨基酸序列或由氨基酸序列组成，例如肽核酸(PNA)。夹板序列可以包含至少约2、5、10、13、15、16、18、20、25、30、35、40、45、50、100个或更多个核苷酸。在一些情况下，夹板序列可以包含至多约100、50、45、40、35、30、25、20、18、16、15、13、10或5个核苷酸。在各种情况下，本文的夹板序列包含约15、16、18或20个核苷酸或由这些核苷酸组成。因此，夹板分子(例如夹板DNA或RNA序列)的长度可以为约16至20个核苷酸。
可以设计和/或改变夹板分子，以对捕获分子的第一核酸序列和核酸条形码分子的功能性核酸序列提供高结合亲和力，例如杂交亲和力。此类方法可以包括用于夹板分子的合理设计以增强结合的计算机模拟方法。在一些情况下，夹板寡核苷酸对它们的相应第一柄序列和第二柄序列的杂交亲和力<100nM。邻位连接使包含具有聚糖基序特异性报告条形码序列的寡核苷酸的聚糖特异性组分能够与夹板的第一部分杂交，该第一部分经由第二部分进一步与核酸序列杂交，该核酸序列是连接到组分特异性分子的组分特异性条形码序列的一部分。进行连接反应，从而产生聚糖组分条形码序列。在包括连接反应的方法中，样品的分隔可以发生在进行连接反应之前或进行连接反应之后。所得的聚糖组分条形码序列可以进一步连接到分区特异性条形码序列。在下面的步骤中，可以扩增所得的连接产物。此外，可以使用片段化、末端修复、加A尾和衔接子连接步骤为序列文库制备扩增产物，然后进行样品索引PCR和文库QC。可以分析所得的测序数据，以确定细胞样品的单细胞的糖组。可以分析所得的测序数据，以确定与感兴趣的组分接近的聚糖。聚糖和感兴趣的组分可以位于相同细胞或相邻细胞上。
连接反应可以在将样品分隔到多个分区中之前或之后进行。将样品分隔到多个分区中，使得一个分区包含单细胞、来自单细胞的裂解物、来自样品的两个相邻细胞或来自两个相邻细胞的裂解物以及具有分区特异性条形码序列的多个核酸条形码分子。在一些实施方案中，分区是液滴或孔。在一些实施方案中，多个核酸条形码分子的至少一个子集可释放地连接到凝胶珠粒。在另一个实施方案中，多个核酸条形码分子的至少一个子集可释放地连接到凝胶珠粒，并且还包括在产生加条形码的核酸分子之前从凝胶珠粒释放核酸条形码分子。在另一个实施方案中，一个分区中的多个核酸条形码分子还包含独特分子标识符(UMI)序列。在一个实施方案中，一个分区中的一个核酸条形码分子的UMI序列不同于该分区中的另一个核酸条形码分子的UMI序列。在一个实施方案中，一个分区中的多个核酸条形码分子还包含功能序列；和/或捕获序列。在一个实施方案中，捕获序列包含模板转换寡核苷酸(TSO)序列；或多聚T序列。在一个实施方案中，捕获序列包含多聚T序列；并且第二组分选自由DNA分析物、RNA分析物、蛋白质分析物、细胞特征、细胞表面特征和代谢物组成的组。
所述方法涉及使用聚糖组分报告序列和核酸条形码分子来产生加条形码的分子，该加条形码的分子包含聚糖组分报告序列或其互补序列和分区特异性条形码序列或其互补序列。该方法可以涉及确定加条形码的分子或其衍生物的序列，以鉴定分区特异性条形码序列或其互补序列和聚糖组分报告条形码序列或其互补序列。
该方法还可以包括使用鉴定的分区特异性条形码序列或其互补序列和鉴定的聚糖组分报告条形码序列或其互补序列来确定与感兴趣的化合物紧密接近的聚糖的存在和/或丰度。可以确定聚糖组分报告条形码序列，并使用该聚糖组分报告条形码序列来反向确定彼此接近的聚糖和组分。可以确定聚糖组分报告序列，并使用该聚糖组分报告序列来反向确定彼此接近的聚糖或聚糖基序和组分。聚糖组分特异性报告条形码序列可以用于确定与感兴趣的组分接近的感兴趣的聚糖或聚糖基序的存在。
聚糖特异性分子可以以优先方式与聚糖相互作用、偶联到聚糖、结合或连接到聚糖；所述方法不受相互作用机制的限制。已经认识到，聚糖特异性分子可以优先结合聚糖或聚糖基序。聚糖特异性分子包括但不限于聚糖特异性凝集素、聚糖特异性抗体、合成核苷酸糖、核苷酸糖、合成糖和失活的聚糖特异性转移酶。已经认识到，聚糖特异性分子应该保持与聚糖的相互作用。因此，失活的聚糖特异性转移酶比激活的聚糖特异性转移酶更好，激活的聚糖特异性转移酶会释放感兴趣的聚糖。在各个方面，所述方法可以涉及提供聚糖特异性转移酶，该聚糖特异性转移酶可以将聚糖特异性分子连接到聚糖。所述方法可以与任何感兴趣的聚糖或聚糖基序一起使用。
在一些实施方案中，组分特异性分子选自由抗体、凝集素、合成核苷酸糖、核苷酸糖和合成糖组成的组。在一个实施方案中，感兴趣的组分是蛋白质、聚糖、糖、核苷酸糖或合成核苷酸糖。在某个实施方案中，聚糖或聚糖基序选自由O-GlcNAc残基、含LacNac的聚糖、含Fuc-α1,2-Gal的聚糖、含Galβ1-3GalNAc的聚糖、GlcNAc-O-R、Neu5Acα2-3Gal和GalT1Y289L组成的组。在一些实施方案中，本文所述的方法还包括确定第一加条形码的核酸分子或其衍生物的序列，以鉴定(i)分区特异性条形码序列或其互补序列和(ii)聚糖组分报告条形码序列或其互补序列。在另一个实施方案中，该方法包括使用鉴定的分区特异性条形码序列或其互补序列和鉴定的聚糖组分报告条形码序列或其互补序列来鉴定蛋白质的聚糖和糖基化模式。
本文其他地方描述了感兴趣的组分。感兴趣的组分可以选自由以下物质组成的组但不限于以下物质：蛋白质、聚糖、糖、核苷酸糖、合成糖、合成核苷酸糖和糖脂。本领域已知的适于与感兴趣的组分一起使用的任何组分特异性分子都可以用于所述方法中。组分特异性分子可以选自包括但不限于抗体、凝集素、合成核苷酸糖、核苷酸糖和合成糖的组。
本公开的另一方面提供了一种用于检测单细胞中的蛋白质特异性糖基化模式的组合物，该组合物包含：(a)多个聚糖基序特异性分子，每个聚糖基序特异性分子包含缀合到聚糖基序特异性报告条形码序列的报告寡核苷酸；(b)多个组分特异性分子，每个组分特异性分子包含缀合到组分特异性条形码序列的寡核苷酸；以及(c)夹板寡核苷酸。在一些实施方案中，聚糖基序特异性分子结合于糖蛋白上的聚糖。在一些实施方案中，组分特异性分子结合于糖蛋白。
在一个实施方案中，组分特异性分子选自由抗体、凝集素、合成核苷酸糖、核苷酸糖和合成糖组成的组。在一个实施方案中，感兴趣的组分是蛋白质、聚糖、糖、核苷酸糖或合成核苷酸糖。在一些实施方案中，夹板寡核苷酸选自由三唑或核苷酸条形码夹板组成的组。在一个实施方案中，聚糖特异性分子选自由以下物质组成的组：(a)聚糖特异性凝集素；(b)聚糖特异性抗体；(c)合成核苷酸糖；(d)合成糖；以及(e)失活的聚糖特异性转移酶。在一个实施方案中，组分特异性分子选自由抗体、凝集素、合成核苷酸糖、核苷酸糖和合成糖组成的组。
在一些实施方案中，多种聚糖特异性转移酶中的每一者选自由以下物质组成的组：β1-4半乳糖基转移酶、糖基转移酶、唾液酸转移酶、α1-3-岩藻糖基转移酶；人血型A抗原糖基转移酶(BgtA)；WbwK岩藻糖基转移酶；α1-2-岩藻糖基转移酶；β1-4N-乙酰氨基半乳糖转移酶；β-半乳糖苷α2-6唾液酸转移酶1；β-半乳糖苷α2-3唾液酸转移酶1；ST3Gal1；ST6Gal1；和CgtA。在一些实施方案中，多种聚糖特异性转移酶中的每一者对以下物质具有特异性：GlcNAc-O-R；LacNAc；Fucα1-2Gal；Galβ1-3GalNAc；Neu5Acα2-3Gal；N-聚糖；或O-聚糖。在一些实施方案中，多个标志分子中的每一者选自由以下物质组成的组：UDP-GalNAc；GDP-岩藻糖；UDP-GalNAc；和CMP-Sia。在一些实施方案中，聚糖或聚糖基序选自由O-GlcNAc残基、含LacNac的聚糖、含Fuc-α1,2-Gal的聚糖、含Galβ1-3GalNAc的聚糖、GlcNAc-O-R、Neu5Acα2-3Gal和GalT1Y289L组成的组。
在一些实施方案中，反应对选自由以下物质组成的反应对的组：叠氮化物和炔烃、叠氮化物和膦、醛和氨氧基、醛和肼、醛和酰肼、酮和氨氧基、肼和酮、环丙烯和四嗪、降冰片烯和四嗪、反式环辛烯和四嗪、炔烃和四嗪、硝酮和烯烃、硝酮和炔烃、重氮基和炔烃以及异腈和四嗪。在一些实施方案中，反应对的第二反应性分子能够偶联到反应对的第一反应性分子。
在一些实施方案中，该组合物还包含多个细胞珠粒，该多个细胞珠粒包含细胞和报告寡核苷酸序列，该报告寡核苷酸序列包含鉴定聚糖基序的报告条形码序列。细胞珠粒还可以包含选自引物、逆转录酶、聚合酶、核苷酸、蛋白酶、转座子、核酸内切酶、转换寡核苷酸或它们的任何组合的附加试剂。
在另一方面，本公开提供了一种包含多个核酸条形码分子的组合物。多个核酸条形码分子中的每一者包含：分区特异性条形码序列；独特分子标识符(UMI)序列；和捕获序列。在一个实施方案中，UMI是功能序列。
D.聚糖谱分析的替代方法
本文还提供了一种确定样品中一种或多种聚糖的存在的方法，该方法包括(a)将样品与包含聚糖特异性结合部分的聚糖特异性报告分子和包含报告条形码序列的报告寡核苷酸一起孵育，(b)将样品分隔到多个分区中，使得一个分区包含(i)来自样品的单细胞或单细胞裂解物和(ii)具有分区特异性条形码序列的多个核酸条形码分子，以及(c)使用报告寡核苷酸和多个核酸条形码分子中的一个核酸条形码分子来产生第一加条形码的核酸分子，该第一加条形码的核酸分子包含分区特异性条形码序列或其互补序列和报告条形码序列或其互补序列。
在一些实施方案中，聚糖特异性结合部分选择性地结合目标聚糖。在一些实施方案中，报告条形码序列或其反向互补序列用于鉴定目标聚糖。在一些实施方案中，聚糖特异性结合部分选择性地结合目标聚糖基序。在一些实施方案中，报告条形码序列或其反向互补序列用于鉴定目标聚糖基序。在一些实施方案中，聚糖特异性结合部分选择性地结合目标聚糖类别。在一些实施方案中，报告条形码序列或其反向互补序列用于鉴定目标聚糖类别。
在一些实施方案中，聚糖特异性结合部分包含特异性地结合于目标聚糖、聚糖基序或聚糖类别或其抗原结合片段的抗体。在一些实施方案中，抗体是单克隆抗体。抗原结合片段的非限制性实例包括：(i)Fab片段；(ii)F(ab′)2片段；(iii)Fd片段；(iv)Fv片段；(v)单链Fv(scFv)分子；(vi)dAb片段；以及(vii)由模拟抗体高变区的氨基酸残基组成的最小识别单元(例如，分离的互补决定区(CDR)，诸如CDR3肽)，或受限制的FR3-CDR3-FR4肽。其他工程分子，诸如结构域特异性抗体、单结构域抗体、嵌合抗体、CDR移植抗体、双抗体、三抗体、四抗体、微型抗体、纳米抗体(例如单价纳米抗体、二价纳米抗体等)、小模块免疫药物(SMIP)和鲨鱼可变IgNAR结构域也涵盖在如本文所用的表述“抗原结合片段”内。
在一些实施方案中，聚糖特异性结合部分是聚糖结合蛋白。在一些实施方案中，聚糖结合蛋白选自由以下物质组成的组：ConA、GNA、MAL、SSA、MAH、WGA、LTL、PHA-E、GSL-II、LCA、UEA-I、AOL、AAL、LEL、DSA、ECA、PSA、TJA-I、MAL-I、SNA、PHAL、RCA120、NPA、HHL、ACG、TxLCI、BPL、TJA-II、EEL、ABA、STL、UDA、PWM、木菠萝素、PNA、WFA、ACA、MPA、HPA、VVA、DBA、SBA、Calsepa、PTL-I、GSL-IA4和GSL-IB4或它们的聚糖结合片段。
在一些实施方案中，聚糖特异性结合部分可以是凝集素或酶。例如，凝集素是识别碳水化合物结构域并主要结合于碳水化合物糖基的蛋白质。与聚糖结合蛋白不同，作为一个组的凝集素不包括抗体。凝集素结合可溶性碳水化合物和与糖蛋白或糖脂复合的其他碳水化合物部分。因此，凝集素可以引起哺乳动物中的糖缀合物和多糖的凝集或沉淀。凝集素还可以介导细菌、病毒和真菌对其预期靶标的附着和结合。凝集素具有许多功能，诸如细胞粘附调控、糖蛋白合成调控、血液蛋白水平调控、糖蛋白结合、用作肝细胞受体从血流中去除某些糖蛋白。此外，凝集素在免疫应答中起着重要作用，诸如它们介导免疫系统防御微生物的能力，它们在调节炎性和其他免疫应答中的潜在重要性。此外，伴刀豆球蛋白A(一种来自豆类植物的凝集素)已被广泛用于了解蛋白质如何识别碳水化合物及其分子间相互作用。因此，它们用作聚糖特异性结合部分将是有利的。
E.采用多重测定的聚糖谱分析
在多分析物分析中，本文所公开的聚糖谱分析方法可以与一种或多种附加测定或分析一起实施。其他分析可以包括但不限于转录物分析、细胞表面特征分析、细胞蛋白质分析以及细胞基因编辑过程和相关核酸分子的分析。用于在一个分区中进行多分析物分析的合适方法在美国专利申请号15/720,085、美国专利号10,480,029和PCT/US2017/068320中有所描述，以上文献中的每一者均全文以引用方式并入。
本申请的聚糖或聚糖基序检测方法与一种或多种附加测定或分析的组合可以用于评估聚糖和基因表达、与基因表达相关的糖组的变化以及糖组和基因表达之间的关系。应当理解，基因表达旨在涵盖任何水平的基因表达，包括但不限于转录物水平(mRNA)、蛋白质水平和代谢物水平。所述方法允许同时分析糖组和转录组，分析聚糖或聚糖基序和转录组，以及聚糖或聚糖基序和靶向转录物。该分析可以用于评估整个组织或细胞集合中糖组的变化以及转录组的变化。所述方法允许分析糖组和蛋白质组，分析聚糖或聚糖基序和蛋白质组，以及聚糖或聚糖基序和至少一种感兴趣的蛋白质或多肽。该分析可以用于评估整个组织或细胞集合中糖组的变化以及蛋白质组的变化。感兴趣的蛋白质包括但不限于细胞表面蛋白质、细胞外膜蛋白和细胞内蛋白质。所述方法允许同时分析糖组和代谢组，分析聚糖或聚糖基序和代谢组，以及聚糖或聚糖基序和至少一种代谢物。该分析可以用于评估整个组织或细胞集合中糖组的变化以及代谢组的变化。
一个分区可以包含多个附加核酸条形码分子，该多个附加核酸条形码分子包含分区特异性条形码序列和捕获序列，该捕获序列能够结合于细胞或细胞裂解物的第二分析物。第二分析物可以是细胞的任何组分，包括但不限于DNA分析物、RNA分析物、蛋白质分析物、本文所公开的细胞特征、本文所公开的细胞表面特征和代谢物。在一些情况下，第二分析物不是聚糖或聚糖基序。例如，在第二分析物是RNA分析物(例如mRNA分析物)的情况下，附加核酸条形码分子可以包含结合于mRNA的多聚A序列的多聚T序列。
在一些实施方案中，一个分区包含多个附加核酸条形码分子，该多个附加核酸条形码分子包含分区特异性条形码序列和捕获序列，该捕获序列能够结合于与第二分析物特异性地结合的附加报告分子的序列。例如，如果第二分析物是核酸分析物，例如靶向RNA分析物，则附加报告分子可以是特异性地结合于靶RNA分析物的靶向探针分子。参见例如PCT/US2019/019309，该专利据此全文以引用方式并入。附加报告分子可以被配置为偶联到靶蛋白。例如，附加报告分子可以包含特异性地结合于靶蛋白的标记剂。附加报告分子可以被配置为偶联到代谢物。例如，附加报告分子可以包含标记剂，例如特异性地结合于目标代谢物的核糖开关。
附加报告分子可以包含附加报告寡核苷酸，该附加报告寡核苷酸包含鉴定第二分析物的不同报告条形码序列。本文描述了报告寡核苷酸。
在多分析物分析中，可以利用一组报告分子，每个报告分子包含分析物特异性条形码序列。在多分析物分析中，用于分析的组可以包含一个或多个报告分子，包括本文所公开的聚糖特异性报告分子和附加的分析物特异性报告分子；一个或多个报告分子和一个分析物特异性分子，或者两个或更多个分析物特异性分子。例如，用于多分析物分析的组可以包含第一报告分子，该第一报告分子包含具有第一聚糖基序特异性报告条形码序列的报告寡核苷酸；第二报告分子，该第二报告分子包含具有第二聚糖基序特异性报告条形码序列的报告寡核苷酸；第三报告分子，该第三报告分子包含具有第三聚糖基序特异性报告条形码序列的报告寡核苷酸；第四报告分子，该第四报告分子包含具有第四聚糖基序特异性报告条形码序列的报告寡核苷酸；第五报告分子，该第五报告分子包含具有第五聚糖基序特异性报告条形码序列的报告寡核苷酸；第六报告分子，该第六报告分子包含具有第六聚糖基序特异性报告条形码序列的报告寡核苷酸；以及第七报告分子，该第七报告分子包含具有第七聚糖基序特异性报告条形码序列的报告寡核苷酸。报告分子可以包含反应对的第二反应性分子。在具有两个或更多个分析物特异性分子的情况下，两个或更多个分析物特异性分子可以包括但不限于聚糖特异性分子和组分特异性分子。
用于鉴定第二分析物的报告分子可以包含报告寡核苷酸，该报告寡核苷酸包含分析物特异性条形码报告序列。因此，报告寡核苷酸可以包含蛋白质鉴定序列或代谢物鉴定序列。报告寡核苷酸还可以包含捕获柄。“捕获柄”意指与核酸条形码分子的捕获序列互补的序列。
核糖开关提供了一种评估与代谢物的相互作用的方法。核糖开关可以指核酸分子(例如核糖核酸分子(RNA)或信使RNA等)的调节片段，其可以结合一种物类(包括小分子、代谢物等)，导致细胞中核酸分子所编码的蛋白质的产量变化。有关核糖开关的更多细节提供于以下文献中：Ruff和Strobel,RNA,2014年11月；20(11):1775-88和Butler等人Chem.Biol.2011年3月25日；18(3):293-298，这两篇文献均全文以引用方式并入本文以用于所有目的。特定核糖开关可以连接到报告寡核苷酸。可以确定这种核糖开关标识符序列并将其用于检测代谢物。此外，当该物类结合于其相应核糖开关时，核糖开关可以改变其二级结构和/或三级结构，使得在无物类状态下不可接近的核糖开关的一个或多个序列在物类结合状态下变得可接近。这种序列可以用作捕获序列，其可以结合核酸条形码分子，并经由一个或多个反应，将对应于核糖开关(包括核糖开关标识符序列)的互补序列添加到核酸条形码分子。PCT/US2019/043782中描述了使用核糖开关进行代谢物分析的方法，该专利据此全文以引用方式并入。
任何核酸条形码分子都可以包含捕获序列。捕获序列可以包含模板转换寡核苷酸(TSO)序列。捕获序列可以包含多聚T序列。捕获序列可以包含与报告寡核苷酸的捕获柄序列互补的序列。
本公开的另一方面提供了一种用于表征多种分析物的组合物。该组合物包含一个分区，该分区包含多个条形码分子和多种分析物。多个条形码分子可以包括至少1,000个条形码分子。此外，(i)多个条形码分子中的第一单独条形码分子可以包含能够与多种分析物中的第一分析物偶联的第一核酸条形码序列；以及(ii)多个加条形码的分子中的第二单独条形码分子可以包含能够与多种分析物中的第二分析物偶联的第二核酸条形码序列，其中第一分析物和第二分析物是不同类型的分析物。
在一些实施方案中，第一分析物是核酸分子，诸如基因组脱氧核糖核酸(gDNA)或者是信使RNA(mRNA)。在一些实施方案中，第一分析物是能够与细胞的细胞表面特征偶联的标记剂。在一些实施方案中，第一单独条形码分子或第二单独条形码分子能够经由与标记剂偶联的第三核酸分子来与标记剂偶联。在一些实施方案中，细胞表面特征是受体、抗原或蛋白质。在一些实施方案中，标记剂是抗体或其表位结合片段。在一些实施方案中，分区包含细胞或细胞的一种或多种组分。在一些实施方案中，分区包含单细胞。在一些实施方案中，第一核酸分子或第二核酸分子包含第三条形码序列。在一些实施方案中，第三条形码序列源自第三核酸分子。在一些实施方案中，第三核酸分子偶联到标记剂，该标记剂能够结合于细胞的细胞表面特征。
在一些实施方案中，第一分析物和第二分析物是不同类型的核酸分子。在一些实施方案中，第一分析物是核糖核酸分子，并且第二分析物是脱氧核糖核酸分子。在一些实施方案中，(i)第一单独条形码分子包含能够与第一分析物杂交的第一引物序列；或(ii)第二单独条形码分子包含能够与第二分析物杂交的第二引物序列。在一些实施方案中，第一条形码分子或第二条形码分子包含独特分子标识(UMI)序列。
在一些实施方案中，第一分析物是核酸分子，并且第二分析物是能够与细胞表面特征偶联的标记剂。在一些实施方案中，第一分析物是核糖核酸分子。在一些实施方案中，(i)第一单独条形码分子包含能够与第一分析物杂交的第一引物序列；或(ii)第二单独条形码分子包含能够与偶联到标记剂的第三核酸分子杂交的第二引物序列。在一些实施方案中，标记剂是抗体或其表位结合片段。在一些实施方案中，细胞表面特征是受体、抗原或蛋白质。
本公开的另一方面提供了本文所公开的任何方法用于对处于与异常糖基化模式或基序相关的疾病或病症风险中或患有该疾病或病症的受试者进行筛查、诊断或分期的用途。在一些实施方案中，该疾病或病症选自由神经退行性疾病或病症、癌症、先天性糖基化障碍和炎性病症组成的组。
F.试剂盒
本公开的另一方面提供了用于确定样品中一种或多种聚糖的存在或用于检测单细胞中的蛋白质特异性糖基化模式的试剂盒。在一些实施方案中，试剂盒包含如本文所述的用于确定样品中一种或多种聚糖的存在的任何组合物，和/或如本文所述的用于检测单细胞中的蛋白质特异性糖基化模式的任何组合物；和/或用于执行如本文所述的确定样品中一种或多种聚糖的存在或检测单细胞中的蛋白质特异性糖基化模式的任何方法的说明书。
在另一方面，本公开提供了一种试剂盒，该试剂盒包含(i)多个标志分子，每个标志分子包含核苷酸糖和反应对的第一反应性分子；(ii)多种聚糖特异性转移酶；(iii)多个报告分子，每个报告分子包含反应对的第二反应性分子和具有聚糖基序特异性报告条形码序列的报告寡核苷酸，以及(iv)用于执行如本文所述的确定样品中一种或多种聚糖的存在的任何方法的说明书。
在另一方面，本公开提供了(i)多个标志分子，每个标志分子包含合成糖和反应对的第一反应性分子，其中标志分子是一个或多个活细胞的一种或多种糖基转移酶的标志底物，(ii)多个报告分子，每个报告分子包含反应对的第二反应性分子和具有聚糖基序特异性报告条形码序列的报告寡核苷酸，以及(iv)用于执行如本文所述的确定样品中一种或多种聚糖的存在的任何方法的说明书。
在又一方面，本公开提供了(i)多个聚糖基序特异性分子，每个聚糖基序特异性分子包含缀合到聚糖基序特异性报告条形码序列的报告寡核苷酸，其中聚糖基序特异性分子结合于糖蛋白上的聚糖，(ii)多个组分特异性分子，每个组分特异性分子包含缀合到组分特异性条形码序列的寡核苷酸，其中组分特异性分子结合于糖蛋白；以及任选地(iii)夹板寡核苷酸，以及(iv)用于执行如本文所述的检测单细胞中的蛋白质特异性糖基化模式的任何方法的说明书。
本公开的另一方面提供了使用本文所公开的方法和组合物对处于与异常糖基化模式或基序相关的疾病或病症的风险中或患有该疾病或病症的受试者进行筛查、诊断或分期的方法。在一些实施方案中，该疾病或病症选自由神经退行性疾病或病症、癌症、先天性糖基化障碍和炎性病症组成的组。
III.单细胞和单生物颗粒分析
A.用于样品隔室化的系统和方法
在一个方面，本公开提供了一种用于确定样品中一种或多种聚糖的存在或用于检测单细胞中的蛋白质特异性糖基化模式的系统，该系统包括：(a)与第一源流体连通的第一通道，该第一源包含使用本文所公开的方法标记有聚糖或聚糖特异性分子的多个细胞；(b)与第二源流体连通的第二通道，该第二源包含具有分区特异性条形码序列的多个核酸条形码分子；以及(c)连接部，该连接部使包含来自所述第一通道的所述多个细胞和来自所述第二通道的所述多个核酸条形码分子的第一相与不和所述第一相混溶的第二相接触，以产生包含所述多个细胞和所述多个核酸条形码分子的多个液滴。在一些实施方案中，所述多个液滴中的一个液滴包含所述细胞和所述条形码珠粒。在一些实施方案中，细胞被包封在细胞珠粒中，包被在珠粒细胞上，包埋在珠粒细胞中，或它们的任何组合。
在一些实施方案中，该系统还包括与包含附加试剂的第三源流体连通的第三通道，其中所述第一相包含所述附加试剂。在一个实施方案中，该系统还包括与包含附加试剂的第四源流体连通的第四通道。在一个实施方案中，所述第一相包含所述附加试剂。在一些实施方案中，所述附加试剂是用于核酸扩增的试剂、可以降解或溶解细胞、细胞珠粒和/或条形码珠粒的试剂。在另一个实施方案中，所述附加试剂是用于核酸扩增的试剂、降解条形码和条形码珠粒之间的键的试剂或它们的任何组合。
本公开的另一方面提供了一种系统，该系统包含：(i)多个标志分子，每个标志分子包含核苷酸糖和反应对的第一反应性分子，(ii)多种聚糖特异性转移酶，和(iii)多个报告分子，每个报告分子包含反应对的第二反应性分子和具有聚糖基序特异性报告条形码序列的报告寡核苷酸；以及(iv)多个核酸条形码分子。在一些实施方案中，多个核酸条形码分子中的第一核酸条形码分子包含分区条形码序列。在某个实施方案中，多个核酸条形码分子连接到珠粒。在一个实施方案中，分区条形码序列鉴定珠粒。在一些实施方案中，该系统还包括多个分区。在一个实施方案中，多个分区包括多个液滴和/或多个孔。在一些实施方案中，该系统还包括具有微流体通道结构的设备，该微流体通道结构被配置为产生多个分区。在一个实施方案中，该系统包括(i)与第一源流体连通的第一通道，该第一源包含使用如本文所述的确定样品中一种或多种聚糖的存在的方法标记有聚糖或聚糖特异性分子的多个细胞；(ii)与包含多个核酸条形码分子的第二源流体连通的第二通道，和(iii)连接部，该连接部使包含来自第一通道的所述多个细胞和来自所述第二通道的多个核酸条形码分子的第一相与不和所述第一相混溶的第二相接触，以产生包含所述多个细胞和所述多个核酸条形码分子的多个液滴。在一些实施方案中，所述多个液滴中的一个液滴包含所述细胞和所述条形码珠粒。
在另一方面，本公开提供了一种系统，该系统包括：(i)多个标志分子，每个标志分子包含合成糖和反应对的第一反应性分子，其中标志分子是一个或多个活细胞的一种或多种糖基转移酶的标志底物；(ii)多个报告分子，每个报告分子包含反应对的第二反应性分子和具有聚糖基序特异性报告条形码序列的报告寡核苷酸；(iii)多个核酸条形码分子，其中多个核酸条形码分子中的第一核酸条形码分子包含分区条形码序列。在一些实施方案中，多个核酸条形码分子连接到珠粒，并且其中分区条形码序列鉴定珠粒。在一些实施方案中，该系统还包括多个分区。在一个实施方案中，多个分区包括多个液滴和/或多个孔，和/或该系统还包括具有微流体通道结构的设备，该微流体通道结构被配置为产生多个分区。在一个实施方案中，该设备包括(i)与第一源流体连通的第一通道，该第一源包含使用如本文所述的用于确定样品中一种或多种聚糖的存在的方法标记有聚糖或聚糖特异性分子的多个细胞，(ii)与包含多个核酸条形码分子的第二源流体连通的第二通道，和(iii)连接部，该连接部使包含来自第一通道的所述多个细胞和来自所述第二通道的多个核酸条形码分子的第一相与不和所述第一相混溶的第二相接触，以产生包含所述多个细胞和所述多个核酸条形码分子的多个液滴。在一些实施方案中，所述多个液滴中的一个液滴包含所述细胞和所述条形码珠粒。
在另一方面，本公开提供了一种系统，该系统包含：(i)多个聚糖基序特异性分子，每个聚糖基序特异性分子包含缀合到聚糖基序特异性报告条形码序列的报告寡核苷酸，(ii)多个组分特异性分子，每个组分特异性分子包含缀合到组分特异性条形码序列的寡核苷酸；以及(iii)多个核酸条形码分子。在一些实施方案中，该系统还包含夹板寡核苷酸。在一些实施方案中，聚糖基序特异性分子结合于糖蛋白上的聚糖。在一些实施方案中，组分特异性分子结合于糖蛋白。在一些实施方案中，多个核酸条形码分子中的第一核酸条形码分子包含分区条形码序列。
在一个实施方案中，多个核酸条形码分子连接到珠粒。在一个实施方案中，分区条形码序列鉴定珠粒，和/或该系统还包括多个分区。在一些实施方案中，多个分区包括多个液滴和/或多个孔，和/或该系统还包括具有微流体通道结构的设备，该微流体通道结构被配置为产生多个分区。在一个实施方案中，该设备包括(i)与第一源流体连通的第一通道，该第一源包含使用如本文所述的用于检测单细胞中的蛋白质特异性糖基化模式的方法标记有聚糖或聚糖特异性分子的多个细胞，(ii)与包含多个核酸条形码分子的第二源流体连通的第二通道，和(iii)连接部，该连接部使包含来自第一通道的所述多个细胞和来自所述第二通道的多个核酸条形码分子的第一相与不和所述第一相混溶的第二相接触，以产生包含所述多个细胞和所述多个核酸条形码分子的多个液滴。在一些实施方案中，所述多个液滴中的一个液滴包含所述细胞和所述条形码珠粒。
在一个方面，本文所述的系统和方法提供了将一个或多个颗粒(例如，生物颗粒、生物颗粒的大分子成分、珠粒、试剂等)隔室化、沉积或分隔到离散的隔室或分区(本文可互换地称为分区)中，其中每个分区保持其自身内容物与其他分区的内容物分开。分区可以是乳液或孔中的液滴。分区可以包括一个或多个其他分区。
分区可以包括一个或多个颗粒。分区可以包括一种或多种类型的颗粒。例如，本公开的分区可以包括一个或多个生物颗粒和/或其大分子成分。分区可以包括一个或多个珠粒。分区可以包括一个或多个凝胶珠粒。分区可以包括一个或多个细胞珠粒。分区可以包括单个凝胶珠粒、单个细胞珠粒或单个细胞珠粒和单个凝胶珠粒两者。分区可以包括一种或多种试剂。另选地，分区可以是未被占据的。例如，分区可以不包括珠粒。
可以在液滴生成之前、之后或同时，将诸如条形码之类的独特标识符诸如经由珠粒注入液滴中，如本文其他地方所述。
本公开的方法和系统可以包括用于产生一个或多个分区(诸如液滴)的方法和系统。液滴可以包括乳液中的多个液滴。在一些实例中，液滴可以包括胶体中的液滴。在一些情况下，乳液可以包括微乳液或纳米乳液。在一些实例中，液滴可以借助于微流体装置和/或通过使不混溶相的混合物经受搅拌(例如，在容器中)来产生。在一些情况下，所提及方法的组合可以用于形成液滴和/或乳液。
本文所述的分区可以具有小体积，例如，小于约10微升(mL)、5mL、1mL、900皮升(pL)、800pL、700pL、600pL、500pL、400pL、300pL、200pL、100pL、50pL、20pL、10pL、1pL、500纳升(nL)、100nL、50nL或更小的体积。
例如，在基于液滴的分区的情况下，液滴的总体积可以小于约1000pL、900pL、800pL、700pL、600pL、500pL、400pL、300pL、200pL、100pL、50pL、20pL、10pL、1pL或更少。在与珠粒共同分隔的情况下，应当理解，分区内的样品流体体积(例如，包括共同分隔的生物颗粒和/或珠粒)可以小于上述体积的约90％、小于上述体积的约80％、小于上述体积的约70％、小于上述体积的约60％、小于上述体积的约50％、小于上述体积的约40％、小于上述体积的约30％、小于上述体积的约20％，或小于上述体积的约10％。
如本文其他地方所描述的，分隔的物类可以生成群体或多个分区。在此类情况下，可以生成或以其他方式提供任何合适数量的分区。例如，可以生成或以其他方式提供至少约1,000个分区、至少约5,000个分区、至少约10,000个分区、至少约50,000个分区、至少约100,000个分区、至少约500,000个分区、至少约1,000,000个分区、至少约5,000,000个分区、至少约10,000,000个分区、至少约50,000,000个分区、至少约100,000,000个分区、至少约500,000,000个分区、至少约1,000,000,000个分区或更多个分区。此外，所述多个分区可以包括未被占据的分区(例如，空的分区)和被占据的分区。
可以通过混合和/或搅拌不混溶相产生乳液来形成液滴。混合或搅拌可以包括各种搅拌技术，诸如涡旋、移液、轻轻弹管，或其他搅拌技术。在一些情况下，混合或搅拌可以在不使用微流体装置的情况下进行。在一些实例中，液滴可以通过将混合物暴露于超声波或超声处理来形成。在国际申请号PCT/US20/17785中描述了通过搅拌产生液滴和/或乳液的系统和方法，该国际申请全文以引用方式并入本文以用于所有目的。
B.微流体系统
包括微流体通道网络(例如，在芯片上)的微流体装置或平台可以用于产生如本文所述的分区(诸如液滴和/或乳液)。在美国专利公开号2019/0367997和2019/0064173中描述了用于产生分区(诸如液滴)的方法和系统、将生物颗粒和/或珠粒包封在分区中的方法、增加液滴产生通量的方法，以及微流体装置和通道的各种几何形状、架构和构造，这些专利公开中的每一者均全文以引用方式并入本文以用于所有目的。
在一些实例中，通过将水性流体中的颗粒的流动料流引入非水性流体的流动料流或储器中，使得可以在两个料流/储器的连接部处(诸如在本文其他地方所提供的微流体装置的连接部处)产生液滴，可以将单独的颗粒分隔到离散分区。
本公开的方法可以包括产生分区和/或包封颗粒，诸如生物颗粒，在一些情况下为单独的生物颗粒，诸如单个细胞。在一些实例中，试剂可以被包封和/或分隔(例如，与生物颗粒共同分隔)在分区中。在分隔单独的颗粒时可以采用各种机制。一个实例可以包括多孔膜，细胞的水性混合物可以穿过该多孔膜被挤压到流体(例如，非水性流体)中。
分区在流体流中可以是可流动的。分区可以包括例如具有围绕内部流体中心或核心的外部屏障的微囊。在一些情况下，分区可以包括能够将材料夹带和/或保持在其基质内的多孔基质。分区可以是第二相内的第一相的液滴，其中第一相和第二相是不混溶的。例如，分区可以是非水性连续相(例如，油相)内的水性流体的液滴。在另一个实例中，分区可以是水相内的非水性流体的液滴。在一些实例中，分区可以以油包水乳液或水包油乳液的形式提供。在例如美国专利申请公开号2014/0155295中描述了多种不同的容器，该美国专利申请公开全文以引用方式并入本文以用于所有目的。在例如美国专利申请公开号2010/0105112中描述了用于在非水性或油连续相中产生稳定的液滴的乳液体系，该美国专利申请公开全文以引用方式并入本文以用于所有目的。
可以调节流体特性(例如，流体流速、流体粘度等)、颗粒特性(例如，体积分数、粒度、颗粒浓度等)、微流体体系结构(例如，通道几何形状等)以及其他参数以控制所得分区的占据率(例如，每个分区的生物颗粒的数量、每个分区的珠粒的数量等)。例如，可以通过以颗粒的一定浓度和/或流速提供水流来控制分区占据率。为了生成单生物颗粒分区，可以选择不混溶流体的相对流速，使得分区中的每个分区平均可以包含少于一个生物颗粒，以确保被占据的那些分区主要是单占据的。在一些情况下，多个分区中的分区可以包含最多一个生物颗粒(例如，细胞)。在一些实施方案中，可以选择或调节各种参数(例如，流体特性、颗粒特性、微流体体系结构等)，使得占据大部分区，例如仅允许小百分比的未被占据的分区。可以控制流动和通道体系结构，以确保给定数量的单占据分区小于一定水平的未被占据的分区和/或小于一定水平的多重占据的分区。
图1示出了用于分隔单独生物颗粒的微流体通道结构100的实例。通道结构100可以包括在通道连接部110处连通的通道段102、104、106和108。在操作中，可以将包括悬浮的生物颗粒(例如，细胞)114的第一水性流体112沿着通道段102运输到连接部110中，而将与水性流体112不混溶的第二流体116从通道段104和106中的每个通道段递送至连接部110，以产生第一水性流体112的离散液滴118、120，所述离散液滴流入通道段108，并远离连接部110流动。通道段108可以流体联接至出口储库，在该出口储库中可以储存和/或收获离散液滴。所生成的离散液滴可以包括单独生物颗粒114(诸如液滴118)。所生成的离散液滴可以包括超过一个单独生物颗粒114(图1中未示出)。离散液滴可以不含有生物颗粒114(诸如液滴120)。每个离散分区可以保持其自身内容物(例如，单独生物颗粒114)与其他分区的内容物分开。
第二流体116可以包含油，诸如氟化油，其包括用于稳定所得液滴(例如，抑制所得液滴118、120的后续聚结)的氟表面活性剂。在例如美国专利申请公开号2010/0105112中描述了特别有用的分隔流体和含氟表面活性剂的实例，该美国专利申请公开全文以引用方式并入本文以用于所有目的。
应当理解，本文所述的通道段可以联接至多种不同流体源或接收部件中的任何一者，包括储库、管道、歧管或其他系统的流体部件。应当理解，微流体通道结构100可以具有其他几何形状。例如，微流体通道结构可以具有超过一个通道连接部。例如，微流体通道结构可以具有各自携带颗粒(例如，生物颗粒、细胞珠粒和/或凝胶珠粒)的2、3、4或5个通道段，这些通道段在通道连接部处相遇。流体可以经由一个或多个流体流动单元被引导沿着一个或多个通道或储库流动。流体流动单元可以包括压缩机(例如，提供正压)、泵(例如，提供负压)、致动器等以控制流体的流动。也可以或另行经由施加的压力差、离心力、电动泵送、真空、毛细管或重力流等来控制流体。
所生成的液滴可以包括液滴的两个子组：(1)包含一个或多个生物颗粒114的被占据的液滴118，以及(2)不包含任何生物颗粒114的未被占据的液滴120。被占据的液滴118可以包括单占据的液滴(具有一个生物颗粒)和多重占据的液滴(具有超过一个生物颗粒)。如本文其他地方所述，在一些情况下，大部分被占据的分区的每个被占据分区可以包括不超过一个生物颗粒，并且一些所生成的分区可以是未被(任何生物颗粒)占据的。但是，在一些情况下，一些被占据的分区可以包括超过一个生物颗粒。在一些情况下，可以控制分隔过程，使得少于约25％的被占据的分区包含超过一个生物颗粒，并且在许多情况下，少于约20％的被占据的分区具有超过一个生物颗粒，而在一些情况下，少于约10％或甚至少于约5％的被占据的分区的每个分区包括超过一个生物颗粒。
在一些情况下，可能期望使过多数量的空分区的生成最小化，以便降低成本和/或提高效率。虽然可以通过在分隔连接部110处提供足够数量的生物颗粒(例如，生物颗粒114)来实现这种最小化，以便确保至少一个生物颗粒被包封在分区中，但泊松分布可能预期会增加包括多个生物颗粒的分区的数量。因此，在将要获得单占据分区的情况下，最多约95％、90％、85％、80％、75％、70％、65％、60％、55％、50％、45％、40％、35％、30％、25％、20％、15％、10％、5％或更少的所生成的分区可以是未被占据的。
在一些情况下，可以控制流，以便呈现单占据的分区的非泊松分布，同时提供较低水平的未被占据的分区(例如，不超过约50％、约25％或约10％未被占据)。可以实现未被占据的分区的上述范围，同时仍然提供上述任何一个单占据率。应当理解，上述占据率也适用于同时包括生物颗粒和附加试剂的分区，诸如携带核酸条形码分子(例如，寡核苷酸)的珠粒(例如，凝胶珠粒)。
在一些实例中，多个分区中的一个分区可以包含单个生物颗粒或生物颗粒(例如，单个细胞或单个细胞核)。在一些实例中，多个分区中的一个分区可以包含多个生物颗粒或生物颗粒。此类分区可以被称为多重占据的分区，并且可以在单个分区内包含例如两个、三个、四个或更多个具有核酸条形码分子(例如，寡核苷酸)的细胞和/或珠粒。因此，如上所述，可以控制含有生物颗粒和/或珠粒的流体和分隔流体的流动特性，以提供此类多重占据的分区。特别地，可以控制流动参数以提供分区的大于约50％、大于约75％并且在一些情况下大于约80％、90％、95％或更高的给定占据率。用于分隔的微流体系统在美国专利申请公开号US2015/0376609中进一步描述，该美国专利申请公开据此全文以引用方式并入。
C.受控分隔
在一些方面，提供了用于受控分隔的系统和方法。可以通过调节通道体系结构(例如，微流体通道体系结构)中的某些几何特征来控制液滴尺寸。例如，可以调节通道的扩展角、宽度和/或长度来控制液滴尺寸。
在一些方面，提供了用于受控分隔的系统和方法。可以通过调节通道体系结构(例如，微流体通道体系结构)中的某些几何特征来控制液滴尺寸。例如，可以调节通道的扩展角、宽度和/或长度来控制液滴尺寸。
图2示出了用于将珠粒受控分隔到离散液滴中的微流体通道结构的实例。通道结构200可以包括通道段202，该通道段在通道连接部206(或相交处)处与储库204连通。储库204可以是室。如本文所用，对“储库”的任何引用也可以指“室”。在操作中，包含悬浮珠粒212的水性流体208可以沿着通道段202运输到连接部206中，以遇到与储库204中的水性流体208不混溶的第二流体210，从而产生流入储库204中的水性流体208的液滴216、218。在水性流体208和第二流体210相遇的连接部206，可以基于诸如在连接部206的流体动力、两种流体208、210的流速、流体特性和通道结构200的某些几何参数(例如，w、h0、α等)来形成液滴。通过从通道段202经连接部206连续地注入水性流体208，可以在储库204中收集多个液滴。
在一些情况下，水性流体208可以具有基本上一致的浓度或频率的珠粒212。珠粒212可以从单独的通道(图2中未示出)引入到通道段202中。可以通过控制将珠粒212引入到通道段202中的频率和/或通道段202和单独的通道中的流体的相对流速来控制通道段202中的珠粒212的频率。在一些情况下，可以将珠粒从多个不同的通道引入到通道段202中，并且相应地控制频率。在一些情况下，通道段202中的水性流体208可以包含生物颗粒。在一些情况下，水性流体208可以具有基本上一致的浓度或频率的生物颗粒。与珠粒一样，可以将生物颗粒从单独的通道引入到通道段202中。可以通过控制将生物颗粒引入到通道段202中的频率和/或通道段202和单独的通道中的流体的相对流速来控制通道段202中的水性流体208中的生物颗粒的频率或浓度。在一些情况下，可以将生物颗粒从多个不同的通道引入到通道段202中，并且相应地控制频率。在一些情况下，第一单独通道可以将珠粒引入到通道段202中，并且第二单独通道可以将生物颗粒引入到该通道段中。引入珠粒的第一单独通道可以在引入生物颗粒的第二单独通道的上游或下游。第二流体210可以包含油，诸如氟化油，其包括用于稳定所得液滴(例如，抑制所得液滴的后续聚结)的氟表面活性剂。
在一些情况下，第二流体210可以不经受和/或不被引导至流入或流出储库204的任何流动。例如，第二流体210可以在储库204中基本上静止。在一些情况下，第二流体210可以诸如通过向储库204施加压力和/或受连接部206处的水性流体208的来流影响而经受在储库204内流动，但不流入或流出储库204。另选地，第二流体210可以经受和/或被引导至流入或流出储库204。例如，储库204可以是将第二流体210从上游引导到下游的通道，从而运输所生成的液滴。用于受控分隔的系统和方法在PCT/US2018/047551中进一步描述，该专利据此全文以引用方式并入。
D.细胞珠粒
在另一方面，作为基于液滴的分隔的补充或替代，生物颗粒(例如，细胞，或者来源于细胞的组分或大分子成分)可以被包封在微粒材料内以形成细胞珠粒。
细胞珠粒可以包含生物颗粒(例如，细胞)或生物颗粒的大分子成分(例如，RNA、DNA、蛋白质等)。细胞珠粒可以包括单个细胞或多个细胞，或单个细胞或多个细胞的衍生物。例如，在裂解和洗涤细胞之后，可以将细胞裂解物中的抑制组分洗掉，并且大分子成分可以结合为细胞珠粒。本文所公开的系统和方法可以适用于包含生物颗粒的细胞珠粒(和/或液滴或其他分区)和包含生物颗粒的大分子成分的细胞珠粒(和/或液滴或其他分区)。细胞珠粒可以是或包括在基质(诸如聚合物基质)中、在基质内或包裹在基质中的细胞、细胞衍生物、细胞材料和/或来源于细胞的材料。在一些情况下，细胞珠粒可以包含活细胞。在一些情况下，活细胞当被包封在凝胶或聚合物基质中时可以能够进行培养，或者当包含凝胶或聚合物基质时可以能够进行培养。在一些情况下，聚合物或凝胶对某些组分可以是可扩散渗透的，而对其他组分(例如，大分子成分)可以是不可扩散渗透的。参见例如美国专利号10428325，该专利全文以引用方式并入本文。
细胞珠粒可以提供比基于液滴的分隔生物颗粒更易于存储和更便携的某些潜在的优势。此外，在一些情况下，可能期望在分析之前将生物颗粒孵育一段选定的时间，诸如以便在存在或不存在不同刺激(或试剂)的情况下表征此类生物颗粒随时间的变化。合适的聚合物或凝胶可以包括二硫化物交联的聚丙烯酰胺、琼脂糖、藻酸盐、聚乙烯醇、聚乙二醇(PEG)-二丙烯酸酯、PEG-丙烯酸酯、PEG-巯基、PEG-叠氮化物、PEG-炔烃、其他丙烯酸酯、壳聚糖、透明质酸、胶原蛋白、纤维蛋白、明胶或弹性蛋白中的一种或多种。聚合物或凝胶可以包括任何其他聚合物或凝胶。
可以通过多种过程执行生物颗粒的包封。此类过程可以将含有生物颗粒的水性流体与聚合物前体材料组合，在向聚合物前体施加特定的刺激时该聚合物前体材料可能能够形成为凝胶或其他固体或半固体基质。足以使前体聚合或胶凝的条件可以包括足以使前体聚合或胶凝的任何条件。此类刺激可以包括例如热刺激(例如，加热或冷却)、光刺激(例如，通过光固化)、化学刺激(例如，通过交联、前体的聚合引发(例如，通过添加的引发剂))、电磁辐射、机械刺激或它们的任何组合。
在一些情况下，气刀液滴或气溶胶发生器可以用于将前体流体的液滴分散到胶凝溶液中，以形成包括单独生物颗粒或小群生物颗粒的微胶囊。同样，基于膜的包封系统可以用于生成包含如本文所述的包封的生物颗粒的微胶囊。诸如图1所示的本公开的微流体系统可以容易地用于包封如本文所述的生物颗粒(例如，细胞)。用于包封生物颗粒(例如，细胞)的示例性方法也进一步描述于美国专利申请公开号US2015/0376609和PCT/US2018/016019中，以上申请据此全文以引用方式并入。具体地讲，并且参考图1，包含(i)生物颗粒114和(ii)聚合物前体材料(未示出)的水性流体112流入通道连接部110，水性流体在该通道连接部通过非水性流体116的流动而被分隔成液滴118、120。在包封方法的情况下，非水性流体116还可以包括引发剂(未示出)，以引起聚合物前体的聚合和/或交联，从而形成包括所夹带的生物颗粒的微胶囊。聚合物前体/引发剂对的实例包括在美国专利申请公开号2014/0378345中描述的那些，该美国专利申请公开全文以引用方式并入本文以用于所有目的。
在一些情况下，包封的生物颗粒可以选择性地从微胶囊中释放出来，诸如通过时间的流逝或在施加特定刺激时，这使微胶囊充分地降解以允许生物颗粒(例如，细胞)或它的其他内容物从微胶囊中释放出来，诸如释放到分区(例如，液滴)中。适用于降解微胶囊的示例性刺激在美国专利申请公开号2014/0378345中有所描述，该美国专利申请公开全文以引用方式并入本文以用于所有目的。
聚合物或凝胶对于化学试剂或生化试剂而言可以是扩散渗透性的。聚合物或凝胶对于生物颗粒的大分子成分而言可以是扩散不可渗透性的。这样，聚合物或凝胶可以起到让生物颗粒经受化学或生化操作的作用，同时将大分子成分在空间上限制于由聚合物或凝胶限定的液滴的区域。
可以将聚合物或凝胶功能化以结合于靶向的分析物，诸如核酸、蛋白质、碳水化合物、脂质或其他分析物。聚合物或凝胶可以经由被动机理聚合或胶凝。聚合物或凝胶在碱性条件或升高的温度下可以是稳定的。聚合物或凝胶可以具有与珠粒的机械特性类似的机械特性。例如，聚合物或凝胶可以具有与珠粒类似的尺寸。聚合物或凝胶可以具有与珠粒类似的机械强度(例如，拉伸强度)。聚合物或凝胶的密度可以低于油。聚合物或凝胶的密度可以大致类似于缓冲液的密度。聚合物或凝胶可以具有可调的孔径。可以选择孔径以例如保留变性的核酸。可以选择孔径以维持对外源化学品(诸如氢氧化钠(NaOH))和/或内源化学品(诸如抑制剂)的扩散渗透性。聚合物或凝胶可以是生物相容的。聚合物或凝胶可以维持或增强细胞活力。聚合物或凝胶可以是生物化学相容的。聚合物或凝胶可以通过热、化学、酶和/或光学方式聚合和/或解聚。
生物颗粒的包封可以构成其他试剂被共同分隔到其中的生物颗粒的分隔。另选地或此外，包封的生物颗粒可以容易地沉积到如上所述的其他分区(例如，液滴)中。
E.珠粒
核酸条形码分子可以经由固体支持物或载体(例如，珠粒)递送到分区(例如，液滴或孔)。在一些情况下，核酸条形码分子最初与固体支持物缔合，然后在施加刺激时从固体支持物释放，该刺激允许核酸条形码分子解离或从固体支持物释放。在具体实例中，核酸条形码分子最初与固体支持物(例如珠粒)缔合，然后在施加生物刺激、化学刺激、热刺激、电刺激、磁刺激和/或光刺激时从固体支持物释放。
固体支持物可以是珠粒。固体支持物(例如珠粒)可以是多孔的、无孔的、中空的(例如微胶囊)、固体的、半固体的和/或前述性质的组合。珠粒可以是固体的、半固体的、半流体的、流体的和/或前述性质的组合。在一些情况下，固体支持物(例如珠粒)可以是至少部分可溶解的、可破裂的和/或可降解的。在一些情况下，固体支持物(例如珠粒)可以不是可降解的。在一些情况下，固体支持物(例如珠粒)可以是凝胶珠粒。凝胶珠粒可以是水凝胶珠粒。凝胶珠粒可以由分子前体(诸如聚合物或单体物类)形成。半固体支持物(例如珠粒)可以是脂质体珠粒。固体支持物(例如珠粒)可以包含金属，包括氧化铁、金和银。在一些情况下，固体支持物(例如珠粒)可以是二氧化硅珠粒。在一些情况下，固体支持物(例如珠粒)可以是刚性的。在其他情况下，固体支持物(例如珠粒)可以是柔性的和/或可压缩的。
分区可以包括一个或多个独特标识符，诸如条形码。条形码可以被预先、随后或同时递送到容纳隔室化的或分隔的生物颗粒的分区中。例如，可以分别在液滴产生或在微孔中提供试剂之前、之后或同时，将条形码注入到液滴中或沉积在微孔中。条形码到特定分区的递送允许稍后将单独生物颗粒的特性归属于特定分区。条形码可以经由任何合适的机制例如在核酸分子(例如，寡核苷酸)上递送至分区。核酸条形码分子可以经由微胶囊递送到分区。在一些情况下，微胶囊可以包括珠粒。下文进一步详细描述珠粒。
在一些情况下，核酸条形码分子最初可以与微胶囊缔合，然后从微胶囊中释放。核酸条形码分子的释放可以是被动的(例如，通过扩散出微胶囊)。此外或另选地，从微胶囊中释放可以是在施加刺激后发生的，该刺激允许加条形码的核酸分子解离或从微胶囊中释放。这种刺激可以破坏微胶囊，即，将核酸条形码分子偶联到微胶囊或偶联在微胶囊内或两者兼有的相互作用。这种刺激可以包括例如热刺激、光刺激、化学刺激(例如，pH变化或使用还原剂)、机械刺激、辐射刺激；生物刺激(例如，酶)或它们的任何组合。
在本文以及以下专利中提供了用于将携带条形码的珠粒分隔到液滴中的方法和系统：美国专利公开号2019/0367997和2019/0064173，以及国际申请号PCT/US20/17785，这些专利中的每一者均全文以引用方式并入本文以用于所有目的。
珠粒可以是多孔的、无孔的、固体的、半固体的、半流体的、流体的和/或它们的任何组合。在一些情况下，珠粒可以是可溶解的、可破坏的或可降解的。PCT/US2014/044398中描述了可降解珠粒以及用于降解珠粒的方法，该专利据此全文以引用方式并入。在一些情况下，刺激的任何组合(例如，PCT/US2014/044398和美国专利申请公开号2015/0376609中描述的刺激，这些专利据此全文以引用方式并入)可以触发珠粒的降解。例如，pH的改变可以使化学剂(例如，DTT)能够成为有效的还原剂。
在一些情况下，珠粒可以不是可降解的。在一些情况下，珠粒可以是凝胶珠粒。凝胶珠粒可以是水凝胶珠粒。凝胶珠粒可以由分子前体(诸如聚合物或单体物类)形成。半固体珠粒可以是脂质体珠粒。固体珠粒可以包含金属，包括氧化铁、金和银。在一些情况下，珠粒可以是二氧化硅珠粒。在一些情况下，珠粒可以是刚性的。在其他情况下，珠粒可以是柔性的和/或可压缩的。珠粒可以具有任何合适的形状。珠粒形状的实例包括但不限于球形、非球形、椭圆形、长方形、无定形的、圆形、圆柱形以及它们的变型。
珠粒可以具有一致的尺寸或非均一的尺寸。在一些情况下，珠粒的直径可以为至少约10纳米(nm)、100nm、500nm、1微米(μm)、5μm、10μm、20μm、30μm、40μm、50μm、60μm、70μm、80μm、90μm、100μm、250μm、500μm、1mm或更大。在一些情况下，珠粒可以具有小于约10nm、100nm、500nm、1μm、5μm、10μm、20μm、30μm、40μm、50μm、60μm、70μm、80μm、90μm、100μm、250μm、500μm、1mm或更小的直径。在一些情况下，珠粒可以具有约40-75μm、30-75μm、20-75μm、40-85μm、40-95μm、20-100μm、10-100μm、1-100μm、20-250μm或20-500μm的范围内的直径。
在某些方面，珠粒可以以具有相对单分散的尺寸分布的珠粒群体或多个珠粒的形式提供。在可能期望在分区内提供相对一致的量的试剂的情况下，维持相对一致的珠粒特性(诸如尺寸)可以有助于总体的一致性。具体地讲，本文所述的珠粒可以具有这样的尺寸分布，所述尺寸分布具有小于50％、小于40％、小于30％、小于20％并且在一些情况下小于15％、小于10％、小于5％或更小的珠粒横截面尺寸的变异系数。
珠粒可以包含天然的和/或合成的材料。例如，珠粒可以包含天然聚合物、合成聚合物或天然聚合物和合成聚合物两者。参见例如PCT/US2014/044398，该专利据此全文以引用方式并入。珠粒也可以由除聚合物之外的材料形成，所述材料包括脂质、胶束、陶瓷、玻璃陶瓷、材料复合物、金属、其他无机材料等。
在一些情况下，珠粒可以在聚合物前体(例如，单体、寡聚物、线性聚合物)、核酸分子(例如，寡核苷酸)、引物和其他实体之间包含共价键或离子键。在一些情况下，共价键可为碳-碳键、硫醚键或碳-杂原子键。
可以控制珠粒内的二硫键的活化，使得只有少量的二硫键被活化。PCT/US2014/044398中描述了控制珠粒内二硫键活化的方法，该专利据此全文以引用方式并入。
在一些情况下，珠粒可以包含acrydite部分，其在某些方面可以用于将一个或多个核酸分子(例如，条形码序列、核酸条形码分子、加条形码的寡核苷酸、引物或其他寡核苷酸)连接至珠粒。PCT/US2014/044398中描述了acrydite部分，以及它们在将核酸分子连接到珠粒方面的用途，该专利据此全文以引用方式并入。
例如，聚合以形成珠粒的前体(例如，单体、交联剂)可以包含acrydite部分，使得当生成珠粒时，该珠粒还包含acrydite部分。acrydite部分可以连接到本文所述的核酸分子。
在一些情况下，可以使包含反应性的或能够被活化使得其变得反应性的官能团的前体与其他前体聚合以生成包含活化的或可活化的官能团的凝胶珠。然后，该官能团可以用于将附加物类(例如，二硫化物接头、引物、其他寡核苷酸等)连接至凝胶珠粒。PCT/US2014/044398中描述了包含官能团的示例性前体，该专利据此全文以引用方式并入。PCT/US2014/044398中描述了可偶联到前体或珠粒的不稳定键的其他非限制性实例，该专利据此全文以引用方式并入。可以经由其他核酸分子靶向酶诸如限制性酶(例如，限制性核酸内切酶)来裂解键，如下文进一步描述。
可以在珠粒生成期间(例如，在前体聚合期间)将物类包封在珠粒中。此类物类可以参与或可以不参与聚合。参见例如PCT/US2014/044398，该专利据此全文以引用方式并入。此类物类可以包括例如核酸分子(例如，寡核苷酸)、用于核酸扩增反应的试剂(例如，引物、聚合酶、dNTP、辅因子(例如，离子辅因子)、缓冲液)(包括本文所述的那些)、用于酶促反应的试剂(例如，酶、辅因子、底物、缓冲液)、用于核酸修饰反应(诸如聚合、连接或消化)的试剂和/或用于一种或多种测序平台(例如，的/>)的模板制备(例如，标签片段化(tagmentation))的试剂。此类物类可以包括本文所述的一种或多种酶，包括但不限于聚合酶、逆转录酶、限制性酶(例如，核酸内切酶)、转座酶、连接酶、蛋白酶K、DNA酶等。此类物类可以包括本文其他地方所述的一种或多种试剂(例如，裂解剂、抑制剂、灭活剂、螯合剂、刺激物)。另选地或此外，可以在分区形成期间或之后将物类分隔在分区(例如，液滴)中。此类物类可以包括但不限于也可以包封在珠粒中的上述物类。
在一些情况下，珠粒可以非共价地负载有一种或多种试剂。可以通过例如以下方式非共价地负载珠粒：使珠粒经受足以溶胀珠粒的条件，使试剂有足够的时间扩散到珠粒内部中，以及使珠粒经受足以去溶胀珠粒的条件。珠粒的溶胀可以例如通过以下方式完成：将珠粒置于热力学上有利的溶剂中，使珠粒经受较高或较低的温度，使珠粒经受较高或较低的离子浓度，和/或使珠粒经受电场。珠粒的溶胀可以通过各种溶胀方法完成。珠粒的去溶胀可以例如通过以下方式完成：将珠粒转移到热力学上不利的溶剂中，使珠粒经受较低或较高的温度，使珠粒经受较低或较高的离子浓度，和/或去除电场。珠粒的去溶胀可以通过各种去溶胀方法完成。转移珠粒可能会导致珠粒中的孔收缩。然后，收缩可能会阻碍珠粒内的试剂扩散出珠粒的内部。该阻碍可能是由于试剂与珠粒内部之间的空间相互作用。转移可以通过微流体完成。例如，转移可以通过将珠粒从一种协流溶剂流移动至不同协流溶剂流来实现。珠粒的可溶胀性和/或孔径可以通过改变珠粒的聚合物组成来调节。
任何合适数量的分子标签分子(例如，引物、加条形码的寡核苷酸)都可以与珠粒缔合，使得从珠粒释放后，分子标签分子(例如，引物，例如加条形码的寡核苷酸)以预定义的浓度存在于分区中。可以选择这种预定义的浓度以促进用于在分区内生成测序文库的某些反应，例如扩增。在一些情况下，引物的预定义的浓度可以通过产生带有寡核苷酸的珠粒的过程来限制。
F.核酸条形码分子
核酸条形码分子可以包含一个或多个条形码序列。多个核酸条形码分子可以偶联到珠粒。一个或多个条形码序列可以包括对于偶联至给定珠粒的所有核酸分子而言相同的序列和/或在偶联至给定珠粒的所有核酸分子中不同的序列。可以将核酸分子掺入到珠粒中。
核酸条形码分子可以包含一个或多个功能序列，以用于偶联到分析物或分析物标签，诸如报告寡核苷酸。此类功能序列可以包括例如模板转换寡核苷酸(TSO)序列、引物序列(例如，多聚T序列，或与靶核酸序列互补和/或用于扩增靶核酸序列的核酸引物序列，随机引物，和信使RNA的引物序列)。
在一些情况下，核酸分子还可以包含独特分子标识符(UMI)。在一些情况下，核酸条形码分子可以包含一个或多个功能序列(例如用于连接到测序流通池)，例如用于测序的P5序列(或其部分)。在一些情况下，核酸条形码分子或其衍生物(例如，从核酸分子生成的寡核苷酸或多核苷酸)可以包含另一个功能序列，例如，用于连接到用于Illumina测序的测序流通池的P7序列(或其部分)。在一些情况下，核酸分子可以包含用于Illumina测序的R1引物序列。在一些情况下，核酸分子可以包含用于Illumina测序的R2引物序列。在一些情况下，功能序列可以包含部分序列，诸如部分条形码序列、部分锚定序列、部分测序引物序列(例如，部分R1序列、部分R2序列等)、被配置为连接到测序仪的流通池的部分序列(例如，部分P5序列、部分P7序列等)，或本文其他地方描述的任何其他类型序列的部分序列。例如，部分序列可以含有完整序列的邻接或连续部分或区段，但不是全部。在一些情况下，下游程序可以延伸该部分序列或其衍生物，以获得该部分序列或其衍生物的完整序列。
可以与本公开的组合物、装置、方法和系统一起使用的此类核酸分子(例如，寡核苷酸、多核苷酸等)及其用途的实例提供于美国专利公开号2014/0378345和2015/0376609中，这些美国专利公开中的每一篇全文以引用方式并入本文。
图3示出了携带条形码的珠粒的实例。核酸分子302(诸如寡核苷酸)可以通过可释放的键合306(诸如二硫化物接头)与珠粒304偶联。相同的珠粒304可以(例如，经由可释放的键)偶联至一个或多个其他核酸分子318、320。核酸分子302可以是或包含条形码。如本文其他地方所述，条形码的结构可以包含多个序列元件。核酸分子302可以包含可以在后续加工中使用的功能序列308。例如，功能序列308可以包括测序仪特异性流通池连接序列(例如，用于测序系统的P5序列)和测序引物序列(例如，用于/>测序系统的R1引物)或其部分序列中的一者或多者。核酸分子302可以包含用于为样品(例如，DNA、RNA、蛋白质等)加条形码的条形码序列310。在一些情况下，条形码序列310可以是珠粒特异性的，使得条形码序列310对于偶联至相同珠粒304的所有核酸分子(例如，包括核酸分子302)是共有的。另选地或此外，条形码序列310可以是分区特异性的，使得条形码序列310对于与一个或多个被分隔到相同分区中的珠粒偶联的所有核酸分子是共有的。核酸分子302可以包含与感兴趣的分析物互补的序列312，例如引物序列。序列312可以是与mRNA分析物的多聚A尾互补的多聚T序列、靶向引物序列和/或随机引物序列。核酸分子302可以包含锚定序列314，以确保特异性引物序列312在(例如，mRNA的)序列末端杂交。例如，锚定序列314可以包括核苷酸的随机短序列，诸如1-mer、2-mer、3-mer或更长的序列，其可以确保多聚T片段更可能在mRNA的多聚A尾的序列末端杂交。
核酸分子302可以包含独特分子鉴定序列316(例如，独特分子标识符(UMI))。在一些情况下，独特分子鉴定序列316可以包含约5至约8个核苷酸。另选地，独特分子鉴定序列316可以压缩少于约5个或多于约8个核苷酸。独特分子鉴定序列316可以是在偶联至单个珠粒(例如，珠粒304)的单独核酸条形码分子(例如，302、318、320等)之间变化的独特序列。在一些情况下，独特分子鉴定序列316可以是随机序列(例如，诸如随机N-mer序列)。例如，UMI可以提供被捕获的起始分析物(例如，mRNA)分子的独特标识符，以便允许定量初始表达的RNA分子的数量。应当理解，尽管图3示出了偶联至珠粒304的表面的三个核酸分子302、318、320，但是单独珠粒可以偶联至任何数量的单独核酸分子，例如，从一个到数十个到数十万个、数百万个或甚至十亿个单独核酸分子。单独核酸分子的相应条形码可以包含在偶联至相同珠粒的不同单独核酸分子之间的共同序列片段或相对共同的序列片段(例如308、310、312等)和可变或独特的序列片段(例如316)。
在操作中，可以将生物颗粒(例如，细胞、DNA、RNA等)连同带有条形码的珠粒304一起共同分隔。可以从分区中的珠粒304释放核酸条形码分子302、318、320。举例来说，在分析样品RNA的上下文中，释放的核酸分子之一(例如，302)的多聚T片段(例如，312)可以与mRNA分子的多聚A尾杂交。逆转录可以产生mRNA的cDNA转录物，但是该转录物包括核酸分子302的每个序列片段308、310、316。由于核酸分子302包含锚定序列314，因此其更可能与mRNA的多聚A尾的序列末端杂交并引发逆转录。在任何给定的分区内，单独mRNA分子的所有cDNA转录物都可以包含一个共同的条形码序列片段310。然而，由给定分区内的不同mRNA分子制备的转录物可能会在独特分子鉴定序列312片段(例如，UMI片段)处发生变化。有利的是，即使在给定分区的内容物的任何后续扩增之后，不同UMI的数量也可以指示源自给定分区的mRNA的量，并因此指示源自生物颗粒(例如，细胞)的mRNA的量。如上所述，可以对转录物进行扩增、净化和测序以鉴别mRNA的cDNA转录物的序列，以及对条形码片段和UMI片段进行测序。虽然描述了多聚T引物序列，但其他靶向或随机引物序列也可以用于引发逆转录反应。同样，尽管描述为将加条形码的寡核苷酸释放到分区中，但是在一些情况下，结合于珠粒(例如，凝胶珠粒)的核酸分子可以用于杂交和捕获珠粒固相上的mRNA，例如，以促进RNA与其他细胞内容物的分离。在此类情况下，可以在分区中或在分区外(例如，批量地)进行进一步的加工。例如，珠粒上的RNA分子可以经受逆转录或其他核酸加工，可以将附加的衔接子序列添加到加条形码的核酸分子，或者可以进行其他核酸反应(例如，扩增、核酸延伸)。珠粒或其产物(例如，加条形码的核酸分子)可以从分区收集，以及/或者合并在一起，随后经受清理和进一步表征(例如，测序)。
本文所述的操作可以在任何有用或方便的步骤中执行。例如，包含核酸条形码分子的珠粒可以在将样品引入分区(例如，孔或液滴)之前、期间或之后引入该分区中。可以为样品的核酸分子加条形码，这可以发生在珠粒上(在核酸分子保持与珠粒偶联的情况下)或者发生在核酸条形码分子释放到分区中之后。在来自样品的分析物被分区中的核酸条形码分子捕获(例如，通过杂交)的情况下，可以收集、合并来自不同分区的被捕获的分析物，并对其进行进一步加工(例如，逆转录、衔接子连接、扩增、清理、测序)。例如，在来自样品的核酸分子保持连接到珠粒的情况下，可以收集、合并来自不同分区的珠粒，并对其进行进一步加工(例如，逆转录、衔接子连接、扩增、清理、测序)。在其他情况下，该加工可以发生在分区中。例如，可以在分区中提供足以进行加条形码、衔接子连接、逆转录或其他核酸加工操作的条件，并且在清理和测序之前进行这些操作。
在一些情况下，珠粒可以包含捕获序列或结合序列，其配置为结合于对应捕获序列或结合序列。在一些情况下，珠可以包含多个不同的捕获序列或结合序列，这些不同的捕获序列或结合序列配置为与不同的各自的相应捕获序列或结合序列结合。例如，珠可以包含一个或多个各自配置为与第一相应捕获序列结合的捕获序列的第一子集、一个或多个各自配置为与第二相应捕获序列结合的捕获序列的第二子集、一个或多个各自配置为与第三相应捕获序列结合的捕获序列的第三子集等。珠可以包含任何数量的不同捕获序列。在一些情况下，珠粒可以包含至少2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个不同的捕获序列或结合序列，其配置为分别结合于不同的相应捕获序列或结合序列。另选地或此外，珠粒可以包含至多约10、9、8、7、6、5、4、3或2个不同的捕获序列或结合序列，其配置为结合于不同的相应捕获序列或结合序列。在一些情况下，不同的捕获序列或结合序列可以被配置为促进相同类型的分析物的分析。在一些情况下，不同的捕获序列或结合序列可以被配置为便于不同类型的分析物(具有相同的珠粒)的分析。捕获序列可以被设计为连接至对应捕获序列。有利地，这种对应捕获序列可以被引入或以其他方式被诱导到生物颗粒(例如，细胞、细胞珠粒等)中以便以各种形式(例如，包含对应捕获序列的加条形码的抗体、包含对应捕获序列的加条形码的MHC dextramer、包含对应捕获序列的加条形码的指导RNA分子等)进行不同的测定，使得对应捕获序列可以在稍后与和珠粒缔合的捕获序列相互作用。在一些情况下，偶联至珠粒(或其他支持物)的捕获序列可以被配置为连接至接头分子，诸如夹板分子，其中接头分子配置为通过接头分子将珠粒(或其他支持物)偶联至其他分子，诸如偶联至一种或多种分析物或一种或多种其他接头分子。
图4展示了携带条形码的珠粒的另一个实例。核酸分子405(诸如寡核苷酸)可以通过可释放的键合406(诸如二硫化物接头)与珠粒404偶联。核酸分子405可以包含第一捕获序列460。相同的珠粒404可以偶联(例如，经由可释放的键)到一个或多个包含其他捕获序列的其他核酸分子403、407。核酸分子405可以是或包含条形码。如本文其他地方所指出的，条形码的结构可以包括许多序列元件，诸如功能序列408(例如，流通池连接序列、测序引物序列等)、条形码序列410(例如，珠粒共有的珠粒特异性序列、分区共有的分区特异性序列等)，以及独特分子标识符412(例如，连接到珠粒的不同分子内的独特序列)，或者它们的部分序列。捕获序列460可以被配置为连接到相应的捕获序列465。在一些情况下，相应的捕获序列465可以与另一个分子偶联，该另一个分子可以是分析物或中间载体。例如，如图4所示，相应的捕获序列465与包含靶序列464的向导RNA分子462偶联，其中该靶序列464被配置为连接到分析物。连接到珠粒404的另一个寡核苷酸分子407包含第二捕获序列480，该第二捕获序列被配置为连接到第二相应的捕获序列485。如图4所展示，第二相应的捕获序列485与抗体482偶联。在一些情况下，抗体482可以对分析物(例如，表面蛋白)具有结合特异性。另选地，抗体482可以不具有结合特异性。连接到珠粒404的另一个寡核苷酸分子403包含第三捕获序列470，该第三捕获序列被配置为连接到第二相应的捕获序列475。如图4所展示，第三相应的捕获序列475与分子472偶联。分子472可以被配置为或可以不被配置为靶向分析物。其他寡核苷酸分子403、407可以包含关于寡核苷酸分子405描述的其他序列(例如，功能序列、条形码序列、UMI等)。虽然图4展示了包含每个捕获序列的单个寡核苷酸分子，但是应当理解，对于每个捕获序列，珠粒可以包含一组一个或多个寡核苷酸分子，其中每个寡核苷酸分子均包含捕获序列。例如，珠粒可以包含任何数量的具有一个或多个不同的捕获序列的集合。另选地或此外，珠粒404可以包含其他捕获序列。另选地或此外，珠粒404可以包含更少类型的捕获序列(例如，两种捕获序列)。另选地或此外，珠粒404可以包含寡核苷酸分子，该寡核苷酸分子包含启动序列，诸如特异性启动序列，诸如mRNA特异性启动序列(例如，多聚T序列)，靶向启动序列，和/或随机启动序列，例如以便于对基因表达进行测定。
在操作中，加条形码的寡核苷酸可以被释放(例如，在分区中)，如本文其他地方所述。另选地，结合于珠粒(例如，凝胶珠粒)的核酸分子可以用于杂交和捕获珠粒固相上的分析物(例如，一种或多种类型的分析物)。注入或以其他方式引入到分区中的珠粒可以包含可释放地、可裂解地或可逆地连接的条形码。注入或以其他方式引入到分区中的珠粒可以包含可活化的条形码。注入或以其他方式引入到分区中的珠粒可以是可降解的、可破坏的或可溶解的珠粒。
条形码可以可释放地、可裂解地或可逆地连接到珠粒，使得条形码可通过条形码分子与珠粒之间的键的裂解而释放或可释放，或通过下面的珠粒本身的降解而释放，从而允许条形码被其他试剂接近或可被其他试剂接近或两者。在非限制性实例中，可以通过二硫键的还原、限制性酶的使用、光活化裂解或经由其他类型的刺激(例如，化学、热、pH、酶促等)裂解和/或反应来实现裂解，如本文其他地方所述。可释放条形码有时可被称为可活化的，因为它们一旦被释放就可用于反应。因此，例如，可以通过将条形码从珠粒(或本文所述的其他合适类型的分区)释放来活化可活化的条形码。在所描述的方法和系统的上下文中也设想了其他可活化的构型。
从上述公开内容将会理解，珠粒的降解可以指结合的或夹带的物类从珠粒上的离解，伴随和不伴随物理珠粒自身的结构降解。例如，珠粒的降解可以涉及经由本文其他地方描述的一种或多种物类和/或方法使可裂解的键的裂解。在另一个实例中，夹带的物类可以通过例如由于化学环境改变导致的渗透压差而从珠粒释放。参见例如PCT/US2014/044398，该专利据此全文以引用方式并入。
可以将可降解的珠粒引入到分区(诸如乳液的液滴或孔)中，使得当施加适当的刺激时，珠粒在分区内降解并且任何缔合的物类(例如，寡核苷酸)均被释放到液滴内。游离物类(例如，寡核苷酸、核酸分子)可以与分区中包含的其他试剂相互作用。参见例如PCT/US2014/044398，该专利据此全文以引用方式并入。
如应理解，可释放地、可裂解地或可逆地连接到本文描述的珠粒的条形码包括通过条形码分子与珠粒之间的键的裂解而释放或可释放、或通过下面的珠粒本身的降解而释放的条形码，从而允许条形码被其他试剂接近或可被其他试剂接近或两者。
在一些情况下，连接到固体支持物(例如，珠粒)的物类(例如，包含条形码的寡核苷酸分子)可以包含允许物类从珠粒释放的U-切除元件。在一些情况下，U-切除元件可以包含含有至少一个尿嘧啶的单链DNA(ssDNA)序列。所述物类可以经由含有至少一个尿嘧啶的ssDNA序列连接到固体支持物。所述物类可以通过尿嘧啶-DNA糖基化酶(例如，以去除尿嘧啶)和内切酶(例如，以诱导ssDNA断裂)的组合来释放。如果内切酶从裂解生成5’磷酸基团，则可以在下游加工中包括另外的酶处理以消除磷酸基团，例如在连接另外的测序柄元件例如Illumina完整P5序列、部分P5序列、完整R1序列和/或部分R1序列之前。
如本文所述可释放的条形码有时可被称为可活化的，因为它们一旦被释放就可用于反应。因此，例如，可以通过将条形码从珠粒(或本文所述的其他合适类型的分区)释放来活化可活化的条形码。在所描述的方法和系统的上下文中也设想了其他可活化的构型。
核酸条形码序列可以在核酸分子(例如，寡核苷酸)的序列内包含约6至约20个或更多个核苷酸。核酸条形码序列可以包含约6至约20、30、40、50、60、70、80、90、100个或更多个核苷酸。在一些情况下，条形码序列的长度可以为约6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20个核苷酸或更长。在一些情况下，条形码序列的长度可以为至少约6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20个核苷酸或更长。在一些情况下，条形码序列的长度可以为至多约6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20个核苷酸或更短。这些核苷酸可以是完全连续的，即在相邻核苷酸的单段中，或者它们可以被分成两个或更多个被1个或更多个核苷酸分开的单独子序列。在一些情况下，分开的条形码子序列的长度可以为约4至约16个核苷酸。在一些情况下，条形码子序列可以为约4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16个核苷酸或更长。在一些情况下，条形码子序列可以为至少约4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16个核苷酸或更长。在一些情况下，条形码子序列可以为至多约4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16个核苷酸或更短。
共分隔的核酸分子还可包含可用于来自共分隔的生物颗粒的核酸的加工中的其他功能序列。这些序列包括例如靶向或随机/通用扩增引物序列(用于扩增分区内来自各个生物颗粒的核酸(例如，mRNA、基因组DNA)，同时使相关联的条形码序列连接)、测序引物或引物识别位点、杂交或探测序列(例如，用于鉴定序列的存在或用于拉下加条形码的核酸)或许多其他潜在功能序列中的任何一个。还可以采用共分隔寡核苷酸的其他机制，包括例如两个或更多个液滴的聚结，其中一个液滴含有寡核苷酸，或将寡核苷酸(例如，连接到珠粒)微分配到分区中，例如微流体系统内的液滴。
在一个实例中，提供了微胶囊(诸如珠粒)，其各自包括大量可释放地连接到珠粒的上述核酸条形码分子，其中连接到特定珠粒的所有核酸条形码分子将包括共同的核酸条形码序列，但是在所使用的珠粒群体中代表了大量不同的条形码序列。在一些实施方案中，使用例如包含聚丙烯酰胺聚合物基质的水凝胶珠粒作为核酸条形码分子进入分区的固体支持和递送媒介物，因为它们能够携带大量核酸条形码分子，并且可以被配置为在暴露于特定刺激后释放这些核酸分子，如本文其他地方所述。在一些情况下，珠粒群体提供包括至少约1,000个不同条形码序列、至少约5,000个不同条形码序列、至少约10,000个不同条形码序列、至少约50,000个不同条形码序列、至少约100,000个不同条形码序列、至少约1,000,000个不同条形码序列、至少约5,000,000个不同条形码序列、或至少约10,000,000个不同条形码序列或更多的多样化条形码序列文库。在一些情况下，珠粒群体提供了多样的条形码序列文库，该文库包括约1,000至约10,000个不同的条形码序列、约5,000至约50,000个不同的条形码序列、约10,000至约100,000个不同的条形码序列、约50,000至约1,000,000个不同的条形码序列或约100,000至约10,000,000个不同的条形码序列。
此外，可以为每个珠粒提供连接的大量核酸(例如，寡核苷酸)分子。特别地，单独珠粒上包含条形码序列的核酸分子的分子数量可为至少约1,000个核酸分子、至少约5,000个核酸分子、至少约10,000个核酸分子、至少约50,000个核酸分子、至少约100,000个核酸分子、至少约500,000个核酸分子、至少约1,000,000个核酸分子、至少约5,000,000个核酸分子、至少约10,000,000个核酸分子、至少约50,000,000个核酸分子、至少约100,000,000个核酸分子、至少约250,000,000个核酸分子并且在一些情况下至少约10亿个核酸分子或更多。给定珠粒的核酸分子可包括相同(或共有)条形码序列、不同条形码序列或两者的组合。给定珠粒的核酸分子可以包括多组核酸分子。给定组的核酸分子可以包括相同的条形码序列。相同的条形码序列可以不同于另一组核酸分子的条形码序列。
此外，当对珠粒群体进行分隔时，所得的分区群体也可以包括多样的条形码文库，该文库包括至少约1,000个不同的条形码序列、至少约5,000个不同的条形码序列、至少约10,000个不同的条形码序列、至少约50,000个不同的条形码序列、至少约100,000个不同的条形码序列、至少约1,000,000个不同的条形码序列、至少约5,000,000不同的条形码序列或至少约10,000,000个不同的条形码序列。此外，该群体的每个分区可以包括至少约1,000个核酸分子、至少约5,000个核酸分子、至少约10,000个核酸分子、至少约50,000个核酸分子、至少约100,000个核酸分子、至少约500,000个核酸、至少约1,000,000个核酸分子、至少约5,000,000个核酸分子、至少约10,000,000个核酸分子、至少约50,000,000个核酸分子、至少约100,000,000个核酸分子、至少约250,000,000个核酸分子，并且在一些情况下，至少约10亿个核酸分子。
在一些情况下，可能期望将多个不同的条形码掺入到给定分区中，这些条形码连接至分区内的单个或多个珠粒。例如，在一些情况下，混合但已知的条形码序列组可以在后续加工中提供更大的鉴别保证，例如，通过提供条形码至给定分区的更强地址或归属，作为给定分区的输出的重复确认或独立确认。
在向珠粒施加特定刺激时，核酸分子(例如，寡核苷酸)可从珠粒释放。在一些情况下，该刺激可以是光刺激，例如通过光不稳定键的裂解，由此释放核酸分子。在其他情况下，可以使用热刺激，其中珠粒环境的温度升高将使得核酸分子从珠粒发生键的裂解或其他释放。在其他情况下，可以使用化学刺激，该化学刺激裂解核酸分子与珠粒的键，或以其他方式使得核酸分子从珠粒释放。在一种情况下，此类组合物包括上述用于包封生物颗粒的聚丙烯酰胺基质，并且可以通过暴露于还原剂(诸如DTT)而降解以释放连接的核酸分子。
G.试剂
根据某些方面，可以将生物颗粒和/或生物颗粒连同裂解试剂一起分隔，以释放该分区内的生物颗粒的内容物。在此类情况下，裂解剂可以在诸如通过通道连接部上游的一个或多个附加通道将生物颗粒引入到分隔连接部/液滴生成区(例如，连接部210)中的同时或紧接在其之前与生物颗粒悬浮液接触。根据其他方面，附加地或另选地，生物颗粒可以连同其他试剂一起分隔，如将在下文进一步描述。
本公开的方法和系统可以包括微流体装置及其使用方法，其可以用于将生物颗粒与试剂共同分隔。此类系统和方法在美国专利公开号US/20190367997中有所描述，该美国专利公开全文以引用方式并入本文以用于所有目的。有利的是，当裂解试剂和生物颗粒被共同分隔时，裂解试剂可以促进在分区内释放生物颗粒的内容物。分区中释放的内容物可以与其他分区的内容物保持离散。
应当理解，本文其他地方所述的微流体装置的通道段可以联接到多种不同流体源或接收部件中的任何一者，包括储库、管道、歧管，或者其他系统的流体部件。应当理解，微流体通道结构可以具有多种几何形状和/或构造。例如，微流体通道结构可以具有超过两个通道连接部。例如，微流体通道结构可以具有各自携带相同或不同类型的珠粒、试剂和/或生物颗粒的2、3、4、5个或更多个通道段，这些通道段在通道连接部处相遇。可以控制每个通道段中的流体流动，以控制将不同元素分隔到液滴中。流体可以经由一个或多个流体流动单元被引导沿着一个或多个通道或储库流动。流体流动单元可以包括压缩机(例如，提供正压)、泵(例如，提供负压)、致动器等以控制流体的流动。也可以或另行经由施加的压力差、离心力、电动泵送、真空、毛细管或重力流等来控制流体。
裂解剂的实例包括生物活性试剂，例如用于裂解不同细胞类型(例如革兰氏阳性或阴性细菌、植物、酵母、哺乳动物等)的裂解酶，诸如溶菌酶、无色肽酶、溶葡萄球菌素、labiase、立枯丝核菌裂解酶(kitalase)、溶壁酶和可从例如Sigma-Aldrich,Inc.(StLouis,MO)获得的多种其他裂解酶，以及其他可商购获得的裂解酶。其他裂解剂可以附加地或另选地与生物颗粒共同分隔，以引起生物颗粒的内容物释放到分区中。例如，在一些情况下，可以使用基于表面活性剂的裂解溶液裂解细胞，但是对于其中表面活性剂可能干扰稳定乳液的基于乳液的体系而言，这些溶液可能不太理想。在某些情况下，裂解溶液可以包含非离子表面活性剂，诸如TritonX-100和Tween 20。在一些情况下，裂解溶液可以包含离子型表面活性剂，诸如十二烷基肌氨酸钠和十二烷基硫酸钠(SDS)。电穿孔、热、声或机械细胞破坏也可以用于某些情况，例如基于非乳液的分隔，诸如生物颗粒的包封，其可以作为液滴分隔的补充或替代，其中在细胞破坏后包封物的任何孔径足够小到保留给定大小的核酸片段。
作为与上述生物颗粒或生物颗粒共同分隔的裂解剂的替代或补充，其他试剂也可以与生物颗粒共同分隔，包括例如DNA酶和RNA酶失活剂或抑制剂，例如蛋白酶K、螯合剂诸如EDTA，以及用于去除或以其他方式减少不同细胞裂解物组分对后续核酸加工的负活性或影响的其他试剂。此外，就包封的生物颗粒(例如，聚合物基质中的细胞或细胞核)而言，可以将生物颗粒暴露于适当的刺激，以从其包封材料中释放生物颗粒或其内容物。例如，在一些情况下，化学刺激可以与包封的生物颗粒(例如，细胞珠粒)一起被共同分隔以允许细胞珠粒降解以及细胞或其内容物释放到更大的分区中。在一些情况下，该刺激可以与本文其他地方所述的用于从其相应珠粒释放核酸分子(例如，寡核苷酸)的刺激相同。在另选实例，这可以是不同且不重叠的刺激，以便允许包封的生物颗粒在与将核酸分子释放到相同分区中的不同时间释放到分区中。关于用于包封细胞(也称为“细胞珠粒”)的方法、组合物和系统的描述，参见例如美国专利10,428,326和美国专利公开20190100632，这些专利均全文以引用方式并入。
附加试剂诸如核酸内切酶也可以与生物颗粒共同分隔，以使生物颗粒的DNA、DNA聚合酶和用于扩增生物颗粒的核酸片段的dNTP片段化，并将条形码分子标签连接到扩增的片段。可以共同分隔其他酶，包括但不限于聚合酶、转座酶、连接酶、蛋白酶K、DNA酶等。附加试剂还可以包括逆转录酶(包括具有末端转移酶活性的酶)、引物和寡核苷酸以及可用于模板转换的转换寡核苷酸(本文也称为“转换寡核苷酸”或“模板转换寡核苷酸”)。
在一些情况下，模板转换可以用于增加cDNA的长度。在一些情况下，模板转换可以用于将预定义的核酸序列补加至cDNA。模板转换在PCT/US2017/068320中进一步描述，该专利据此全文以引用方式并入。模板转换寡核苷酸可以包含杂交区和模板区。模板转换寡核苷酸在PCT/US2017/068320中进一步描述，该专利据此全文以引用方式并入。
本公开中所述的任何试剂可以与任何化学物质、颗粒和适用于涉及生物分子的样品加工反应的元素一起包封在液滴或珠粒中或者以其他方式与微胶囊、液滴或珠粒偶联，其中生物分子诸如但不限于核酸分子和蛋白质。例如，在用于DNA测序的样品制备反应中使用的珠粒或液滴可以包含一种或多种以下试剂：酶、限制性酶(例如，多重切割酶)、连接酶、聚合酶、荧光团、寡核苷酸条形码、衔接子、缓冲剂、核苷酸(例如，dNTP、ddNTP)等等。试剂的附加实例包括但不限于：缓冲液、酸性溶液、碱性溶液、温度敏感酶、pH敏感酶、光敏酶、金属、金属离子、氯化镁、氯化钠、锰、水性缓冲液、温和缓冲液、离子缓冲液、抑制剂、酶、蛋白质、多核苷酸、抗体、糖类、脂质、油、盐、离子、去污剂、离子去污剂、非离子去污剂和寡核苷酸。
一旦将细胞的内容物释放到它们的相应分区中，就可以在分区内进一步加工其中包含的大分子组分(例如，生物颗粒的大分子成分，诸如RNA、DNA或蛋白质)。根据本文所述的方法和系统，可以为单独生物颗粒的大分子组分内容物提供独特标识符，使得在表征那些大分子组分时，它们可以被归属为已衍生自一个或多个相同的生物颗粒。通过将独特标识符特异性地分配给单独生物颗粒或生物颗粒组来提供将特征归属于单独生物颗粒或生物颗粒组的能力。可以为单独生物颗粒或生物颗粒群分配或关联例如核酸条形码形式的独特标识符，以便用独特标识符加标签于或标记生物颗粒的大分子组分(及因此其特征)。然后，这些独特标识符可以用于将生物颗粒的组分和特征归属于单独生物颗粒或生物颗粒组。在一些方面，这是通过将单独生物颗粒或生物颗粒组与独特标识符共同分隔来执行的，诸如上文所述(参考图1或2)。
在一些情况下，可以使用附加珠粒将附加试剂递送到分区。在此类情况下，可能有利的是从不同的珠粒来源(例如，含有不同的相关试剂)通过进入共同通道或液滴产生连接部的不同通道入口，将不同的珠粒引入这种共同通道或液滴产生连接部中。在此类情况下，可以控制不同珠粒进入该通道或连接部中的流动和频率，以提供特定比率的来自每个来源的珠粒，同时确保此类珠粒的给定配对和组合与给定数量的生物颗粒一起进入分区(例如，每个分区有一个生物颗粒和一个珠粒)。
H.孔
如本文所述，一个或多个过程可以在分区中执行，该分区可以是孔。孔可以是基底的多个孔中的孔，例如微孔阵列或板的微孔，或者孔可以是包含基底的装置(例如，微流体装置)的微孔或微腔室。孔可以是孔阵列或板的孔，或者孔可以是装置(例如，流体装置)的孔或腔室。相应地，孔或微孔可以采取“开放”配置，其中孔或微孔暴露于环境(例如，含有开放表面)，并且在基底的一个平面表面上是可接近的，或者孔或微孔可以采取“关闭”或“密封”配置，其中微孔在基底的平面表面上是不可接近的。在一些情况下，孔或微孔可以被配置为在“开放”和“关闭”配置之间切换。例如，一个“开放”微孔或一组微孔可以使用膜(例如，半透膜)、油(例如，覆盖水溶液的氟化油)或盖子进行“关闭”或“密封”，如本文其它地方所述。
该孔可以具有小于1毫升(mL)的体积。例如，孔可以被配置为容纳最多1000微升(μL)、最多100μL、最多10μL、最多1μL、最多100纳升(μL)、最多10nL、最多1nL、最多100皮升(pL)、最多10(pL)或更少的体积。孔可以被配置为容纳约1000μL、约100μL、约10μL、约1μL、约100nL、约10nL、约1nL、约100pL、约10pL等的体积。孔可以被配置为容纳至少10pL、至少100pL、至少1nL、至少10nL、至少100nL、至少1μL、至少10μL、至少100μL、至少1000μL或更多的体积。孔可以被配置为容纳在本文中列出的体积范围内的体积，例如，约5nL至约20nL、约1nL至约100nL、约500pL至约100μL等。孔可以是具有不同体积的多个孔，并且可以被配置为容纳适合容纳本文所述的任何分区体积的体积。
在一些情况下，微孔阵列或板包括单一种类的微孔。在一些情况下，微孔阵列或板包括各种各样的微孔。例如，微孔阵列或板可以包括在单个微孔阵列或板内的一种或多种类型的微孔。微孔的类型可以具有不同的尺寸(例如，长度、宽度、直径、深度、横截面积等)、形状(例如，圆形、三角形、正方形、矩形、五边形、六边形、七边形、八边形、九边形、十边形等)、长宽比或其它物理特性。微孔阵列或板可以包括任何数量的不同类型的微孔。例如，微孔阵列或板可以包括1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000种或更多种不同类型的微孔。孔可以具有任何尺寸(例如，长度、宽度、直径、深度、横截面积、体积等)、形状(例如，圆形、三角形、正方形、矩形、五边形、六边形、七边形、八边形、九边形、十边形、其它多边形等)、长宽比或本文关于任何孔描述的其它物理特性。
在某些情况下，微孔阵列或板包括在阵列或板内彼此相邻定位的不同类型的微孔。例如，具有一组尺寸的微孔可以与具有一组不同尺寸的另一个微孔相邻并接触定位。类似地，不同几何形状的微孔可以彼此相邻或接触放置。相邻的微孔可以被配置为容纳不同的物品；例如，一个微孔可以用于容纳细胞、细胞珠粒或其他样品(例如，细胞组分、核酸分子等)，而相邻微孔可以用于容纳液滴、珠粒或其他试剂。在一些情况下，相邻的微孔可以被配置为例如在施加刺激时或自发地在接触每个微孔中的物品时将保持在其中的内容物融合。
如本文其他地方所述，在本文描述的系统、组合物和方法中可使用多个分区。例如，可以生成或以其它方式提供任何合适数目的分隔(例如，孔或液滴)。例如，在使用孔时的情况下，可以生成或以其他方式提供至少约1,000个孔、至少约5,000个孔、至少约10,000个孔、至少约50,000个孔、至少约100,000个孔、至少约500,000个孔、至少约1,000,000个孔、至少约5,000,000个孔至少约10,000,000个孔、至少约50,000,000个孔、至少约100,000,000个孔、至少约500,000,000个孔、至少约1,000,000,000个孔或更多个孔。此外，多个孔可以包括未被占据的孔(例如，空孔)和占据的孔两者。
孔可以包括本文所述的任何试剂或其组合。这些试剂可以包括例如条形码分子、酶、衔接子，以及它们的组合。试剂可以与置于孔中的样品(例如细胞、细胞珠粒或细胞组分，例如蛋白质、核酸分子等)物理分离。这种物理分离可以通过将试剂包含在置于孔中的珠粒内或与珠粒偶联来实现。这种物理分离也可以通过在孔中分配试剂并且在将多核苷酸样品引入孔中之前用例如可溶解、可融化或可渗透的层覆盖试剂来实现。该层可以是例如油、蜡、膜(例如，半透膜)等。可以在任何点(例如，在添加珠粒之后，在添加试剂之后，或者在添加这些组分中的任何一种之后)密封该孔。孔的密封可以用于多种目的，包括防止珠粒或装载的试剂从孔中逸出、允许选择性递送某些试剂(例如，经由使用半透膜)、在进一步加工之前或之后将孔储存好，等等。孔一旦被密封，就可以经受进一步加工孔中的一个细胞(或多个细胞)的条件。例如，孔中的试剂可以允许对细胞进行进一步的加工，例如细胞裂解，如本文进一步描述的。另选地，包含细胞(或多个细胞)的孔(或多个孔，诸如基于孔的阵列中的那些孔)可以经受冷冻-解冻循环以加工细胞(或多个细胞)，例如细胞裂解。含有细胞的孔可以经受冷冻温度(例如，0℃、低于0℃、-5℃、-10℃、-15℃、-20℃、-25℃、-30℃、-35℃、-40℃、-45℃、-50℃、-55℃、-60℃、-65℃、-70℃、-80℃，或者-85℃)。冷冻能够以合适的方式进行，例如零度以下的冷冻器或干冰/乙醇浴。在初始冷冻后，包含细胞(或多个细胞)的孔(或多个孔)可以经受冷冻-解冻循环以裂解细胞(或多个细胞)。在一个实施方案中，将最初冷冻的孔(或多个孔)解冻至高于冰点的温度(例如，4℃或以上、8℃或以上、12℃或以上、16℃或以上、20℃或以上、室温或25℃或以上)。在另一个实施方案中，冷冻时间少于10分钟(例如，5分钟或7分钟)，之后在室温下的解冻时间少于10分钟(例如，5分钟或7分钟)。该冷冻-解冻循环可以重复多次，例如2、3、4次或更多次，以在孔(或多个孔)中获得细胞(或多个细胞)的裂解。在一个实施方案中，冷冻、解冻和/或冷冻/解冻循环在没有裂解缓冲液的情况下进行。WO2019165181A1中提供了与冷冻-解冻循环有关的附加公开内容，该专利全文以引用方式并入本文。
孔可以包含游离试剂，以及/或者包封在微胶囊、珠粒或液滴中，或以其他方式与珠粒或液滴偶联或缔合的试剂。
孔可以作为试剂盒的一部分提供。例如，试剂盒可以包括使用说明、微孔阵列或装置，以及试剂(例如，珠粒)。该试剂盒可以包括用于进行本文所述过程的任何有用的试剂，这些过程例如核酸反应、为核酸分子加条形码、样品加工(例如，用于细胞裂解、固定和/或透化)。
在一些情况下，孔包括珠粒或液滴，该微胶囊、珠粒或液滴包含具有相似属性的一组试剂(例如，一组酶、一组矿物质、一组寡核苷酸、不同条形码分子的混合物、相同条形码分子的混合物)。在其他情况下，珠粒或液滴包含试剂的非均质混合物。在一些情况下，试剂的非均质混合物可以包含进行反应所必需的所有组分。在一些情况下，这样的混合物可以包含进行反应所必需的所有组分，但进行反应所必需的1、2、3、4、5种或更多种组分除外。在一些情况下，此类附加组分包含在不同的液滴或珠粒中或以其他方式偶联至不同的液滴或珠粒，或者包含在系统的分区(例如，微孔)内的溶液中。
图5示意性地展示了微孔阵列的一个实例。该阵列可以容纳在基板500内。基板500包括多个孔502。孔502可以具有任何尺寸或形状，并且孔之间的间距、每个基板中孔的数量以及基板500上的孔密度可以根据具体应用而改变。在一个这样的示例应用中，可以包含细胞或细胞组分(例如，核酸分子)的样品分子506与珠粒504共同分隔，该珠粒可以包括与其偶联的核酸条形码分子。孔502可以使用重力或其他装载技术(例如，离心、液体处理器、声学装载、光电子器件等)来装载。在一些情况下，至少一个孔502包含单个样品分子506(例如，细胞)和单个珠粒504。
试剂可以依次或同时装载到孔中。在一些情况下，在特定操作之前或之后将试剂引入装置中。在一些情况下，试剂(在某些情况下，能够以液滴或珠粒的形式提供)被依次引入，使得不同的反应或操作在不同的步骤发生。试剂(或者液滴或珠粒)也可以在穿插有反应或操作步骤的操作中装载。例如，可以将包含用于使多核苷酸片段化的试剂(例如，限制性酶)和/或其他酶(例如，转座酶、连接酶、聚合酶等)的液滴或珠粒装载到一个或多个孔中，随后装载包含用于将核酸条形码分子连接到样品核酸分子的试剂的液滴或珠粒。试剂可以与样品例如细胞或细胞组分(例如，细胞器、蛋白质、核酸分子、碳水化合物、脂质等)同时或依次提供。因此，在进行多步操作或反应时，使用孔可能是有用的。
如本文其他地方所述，核酸条形码分子和其他试剂可以包含在珠粒或液滴内。这些珠粒或液滴可以在装载细胞之前、之后或装载细胞的同时装载到分区(例如，微孔)中，使得每个细胞与不同的珠粒或液滴接触。该技术可以用于将独特的核酸条形码分子连接到从每个细胞获得的核酸分子上。另选地或此外，样品核酸分子可以连接到支持物。例如，分区(例如微孔)可以包括珠粒，其具有与之偶联的多个核酸条形码分子。样品核酸分子或其衍生物可以偶联或连接到支持物上的核酸条形码分子。然后可以将所得加条形码的核酸分子从分区取出，并且在一些情况下，合并并测序。在此类情况下，核酸条形码序列可以用于追踪样品核酸分子的来源。例如，具有相同条形码的多核苷酸可以被确定来源于相同的细胞或分区，而具有不同条形码的多核苷酸可以被确定来源于不同的细胞或分区。
可以使用多种方法将样品或试剂装载到孔或微孔中。样品(例如，细胞、细胞珠粒或细胞组分)或试剂(如本文所述)可以使用外力(例如，重力、电力、磁力)或使用驱动样品或试剂进入孔中的机构(例如，经由压力驱动流动、离心、光电子器件、声学装载、动电泵送、真空、毛细流动等)装载到孔或微孔中。在某些情况下，可以使用流体处理系统将样品或试剂装载到孔中。样品或试剂的装载可以遵循泊松分布或非泊松分布，例如超泊松或亚泊松的。可以修改微孔的几何形状、孔之间的间距、密度和大小以适应有用的样品或试剂分布；例如，可以调节微孔的大小和间距，使得样品或试剂能够以超泊松方式分布。
在一个特定的非限制性实例中，微孔阵列或微孔板包括成对的微孔，其中每对微孔被配置为容纳液滴(例如，包含单个细胞)和单个珠粒(诸如本文所述的那些，其在一些情况下也可以被包封在液滴中)。液滴和珠粒(或包含珠粒的液滴)可以同时或依次装载，并且液滴和珠粒可以融合，例如，在液滴与珠粒接触时，或者在施加刺激(例如，外力、搅拌、热、光、磁力或电力等)时。在一些情况下，液滴和珠粒的装载是超泊松的。在微孔对的其他实例中，孔被配置为容纳包含不同试剂和/或样品的两个液滴，其在接触时或在施加刺激时融合。在这样的情况下，该对中的一个微孔的液滴可包含可以与该对中的另一个微孔的液滴中的剂反应的试剂。例如，一个液滴可包含配置为释放位于相邻微孔中的另一个液滴中包含的珠的核酸条形码分子的试剂。在液滴融合时，核酸条形码分子可以从珠粒释放到分区(例如，微孔或接触的微孔对)中，并且可以进行进一步的加工(例如，加条形码、核酸反应等)。在完整细胞或活细胞被装载于微孔中的情况下，其中一个液滴可以包含用于在液滴融合时将细胞裂解的裂解试剂。
液滴或珠粒可以被分隔到一个孔中。液滴可以在装载到孔中之前进行选择或经受预加工。例如，液滴可以包含细胞，并且只有某些液滴(诸如包含单个细胞(或至少一个细胞)的那些液滴)可以被选择用于装载孔。这种预选过程可以用于有效装载单个细胞，诸如以获得非泊松分布，或者在孔中进一步分隔之前预过滤具有选定特征的细胞。此外，该技术可以用于在装载微孔之前或期间获得细胞双联体或多重体，或者防止形成细胞双联体或多重体。
在一些情况下，孔可以包含连接到其上的核酸条形码分子。核酸条形码分子可以连接到孔的表面(例如，孔的壁)。核酸条形码分子可以连接到已经被分隔到孔中的液滴或珠粒。一个孔的核酸条形码分子(例如，分区条形码序列)可以不同于另一个孔的核酸条形码分子，这可允许单个分区或孔内所含内容物的鉴定。在一些情况下，核酸条形码分子可包含空间条形码序列，其可鉴定孔例如在孔阵列或孔板内的空间坐标。在一些情况下，核酸条形码分子可以包括用于识别个体分子的独特分子标识符。在一些情况下，核酸条形码分子可以被配置为连接到或捕获分布在孔中的样品或细胞内的核酸分子。例如，核酸条形码分子可以包含捕获序列，该捕获序列可以用于捕获样品内的核酸分子(例如，RNA、DNA)或者与该核酸分子杂交。在一些情况下，核酸条形码分子可以从微孔释放。在一些情况下，核酸条形码分子可以从珠粒或液滴释放。例如，核酸条形码分子可以包含化学交联剂，其可以在施加刺激(例如，光刺激、磁刺激、化学刺激、生物刺激)时被裂解。可以收集和合并释放的核酸条形码分子(其可以与样品核酸分子杂交或被配置为与样品核酸分子杂交)以用于进一步的加工，该进一步的加工可以包括核酸加工(例如，扩增、延伸、逆转录等)和/或表征(例如，测序)。在一些情况下，连接到孔中的珠粒或液滴上的核酸条形码分子可以与样品核酸分子杂交，并且可以收集和合并具有与其杂交的样品核酸分子的珠粒以用于进一步的加工，该进一步的加工可以包括核酸加工(例如，扩增、延伸、逆转录等)和/或表征(例如，测序)。在此类情况下，独特的分区条形码序列可以用于识别核酸分子来源的细胞或分区。
可以对孔内的样品进行表征。在非限制性实例中，这种表征可以包括对样品(例如，细胞、细胞珠粒或细胞组分)或其衍生物成像。表征技术(诸如显微镜法或成像)可以用于测量固定空间位置中的样品剖面。例如，当细胞被分隔时，任选地与珠粒一起分隔时，对每个微孔和其中容纳的内容物成像可以提供关于以下各项的有用信息：细胞双联体形成(例如，频率、空间位置等)、细胞-珠粒对效率、细胞活力、细胞大小、细胞形态、生物标志物(例如，表面标志物、其中的荧光标记分子等)的表达水平、细胞或珠粒装载速率、细胞-珠粒对的数量，等等。在一些情况下，成像可以用于表征孔中的活细胞，包括但不限于：动态活细胞追踪、细胞-细胞相互作用(当两个或更多个细胞被共同分隔时)、细胞增殖，等等。另选地或此外，成像可以用于表征孔中的扩增产物的数量。
在操作中，孔可以同时或依次装载样品和试剂。在装载细胞或细胞珠粒时，可以对孔进行清洗，例如以从孔、微孔阵列或微孔板中去除过量的细胞。类似地，可以进行清洗以从孔、微孔阵列或微孔板中去除多余的珠粒或其他试剂。在使用活细胞的情况下，这些细胞可以在各个分区中裂解，以释放细胞内组分或细胞分析物。另选地，细胞可以在各个分区中固定或透化。细胞内组分或细胞分析物可以与支持物偶联，例如在微孔的表面上、在固体支持物(例如，珠粒)上，或者它们可以被收集用于进一步的下游加工。例如，在细胞裂解后，可以将细胞内组分或细胞分析物转移到各个液滴或其他分区以便加条形码。另选地或此外，细胞内组分或细胞分析物(例如，核酸分子)可以与包含核酸条形码分子的珠粒偶联；随后，可以收集珠粒并进一步加工，例如经受核酸反应如逆转录、扩增或延伸，并且可以例如经由测序来进一步表征其上的核酸分子。另选地或此外，可以在孔中对细胞内组分或细胞分析物加条形码(例如，使用包含可释放的核酸条形码分子的珠粒或在包含核酸条形码分子的微孔的表面上)。加条形码的核酸分子或分析物可以在孔中进一步加工，或者加条形码的核酸分子或分析物可以从各个分区收集并在分区外经受进一步加工。进一步加工可以包括核酸加工(例如，执行扩增、延伸)或表征(例如，扩增分子的荧光监测、测序)。在任何方便或有用的步骤中，可以将孔(或者微孔阵列或微孔板)密封(例如，使用油、膜、蜡等)，这使得能够储存测定或选择性地引入附加试剂。
图6示意性地示出了用于加工样品内的核酸分子的示例工作流程。可以提供包括多个微孔602的基板600。可以包含细胞、细胞珠粒、细胞组分或分析物(例如，蛋白质和/或核酸分子)的样品606可以在多个微孔602中与包含核酸条形码分子的多个珠粒604一起被共同分隔。在过程610期间，样品606可以在分区内加工。例如，就活细胞而言，细胞可以经受足以使细胞裂解并释放其中所包含的分析物的条件。在过程620中，珠粒604可以被进一步加工。举例来说，过程620a和620b示意性地展示了不同的工作流程，具体取决于珠粒604的特性。
在620a中，珠粒包括连接到其上的核酸条形码分子，并且样品核酸分子(例如，RNA、DNA)可以例如经由连接杂交而连接到核酸条形码分子。这种连接可以发生在珠粒上。在过程630中，可以从多个孔602收集珠粒604加以合并。可以在过程640中执行进一步加工。例如，可以进行一种或多种核酸反应，如逆转录、核酸延伸、扩增、连接、转座等。在一些情况下，衔接子序列与核酸分子或其衍生物连接，如本文其他地方所述。例如，测序引物序列可以补加到核酸分子的每一端。在过程650中，可以进行进一步的表征(诸如测序)，以产生测序读段。这些测序读段可以产生关于单独的细胞或细胞群体的信息，该信息可以例如在图655中以视觉或图形方式呈现。
在620b中，珠粒包含可释放地连接到其上的核酸条形码分子，如下文所述。珠粒可以降解或以其他方式将核酸条形码分子释放到孔602中；然后，核酸条形码分子可以用于对孔602内的核酸分子加条形码。进一步的加工可以在分区内部或分区外部执行。例如，可以进行一种或多种核酸反应，如逆转录、核酸延伸、扩增、连接、转座等。在一些情况下，衔接子序列与核酸分子或其衍生物连接，如本文其他地方所述。例如，测序引物序列可以补加到核酸分子的每一端。在过程650中，可以进行进一步的表征(诸如测序)，以产生测序读段。这些测序读段可以产生关于单独的细胞或细胞群体的信息，该信息可以例如在图655中以视觉或图形方式呈现。
I.多重测定和5’条形码
本公开提供了用于多重分析以及用其他方式增加分析中的通量的方法和系统。例如，单个或集成的过程工作流程可以允许加工、鉴定和/或分析更多或多种分析物、更多或多种类型的分析物，以及/或者更多或多种类型的分析物表征。例如，在本文所述的方法和系统中，能够结合于或以其他方式偶联到一个或多个细胞特征的一种或多种标记剂(本文也称为报告分子)可以用于表征生物颗粒和/或细胞特征。在一些情况下，细胞特征包括细胞表面特征。细胞表面特征可以包括但不限于受体、抗原、表面蛋白、跨膜蛋白、分化蛋白簇、蛋白通道、蛋白泵、载体蛋白、磷脂、糖蛋白、糖脂、细胞-细胞相互作用、蛋白复合物、抗原呈递复合物、主要组织相容性复合物、工程化的T细胞受体、T细胞受体、B细胞受体、嵌合抗原受体、间隙连接和粘附连接或它们的任何组合。在一些情况下，细胞特征可以包括细胞内分析物，诸如蛋白质、蛋白质修饰(例如，磷酸化状态或其他翻译后修饰)、核蛋白、核膜蛋白或它们的任何组合。标记剂可以包括但不限于蛋白质、肽、抗体(或其表位结合片段)、亲脂部分(诸如胆固醇)、细胞表面受体结合分子、受体配体、小分子、双特异性抗体、双特异性T细胞衔接体、T细胞受体衔接体、B细胞受体衔接体、抗体前药、适体、单抗体、affimer、darpin和蛋白质支架或它们的任何组合。标记剂可以包括(例如，连接至)报告寡核苷酸，该报告寡核苷酸指示结合基团所结合的细胞特征。例如，报告寡核苷酸可以包含允许鉴定标记剂的条形码序列。例如，对一种类型的细胞特征(例如，第一细胞表面特征)具有特异性的标记剂可以具有与之偶联的第一报告寡核苷酸，而对不同的细胞特征(例如，第二细胞表面特征)具有特异性的标记剂可以具有与之偶联的不同的报告寡核苷酸。关于示例性标记剂、报告寡核苷酸和使用方法的描述，参见例如美国专利10,550,429；美国专利公开20190177800；以及美国专利公开20190367969，这些专利中的每一者均全文以引用方式并入本文用于所有目的。
在一个具体的实例中，可以提供潜在的细胞特征标记剂的文库，其中相应的细胞特征标记剂与核酸报告分子相关联，使得不同的报告寡核苷酸序列与能够结合到特定细胞特征的每个标记剂相关联。在一些方面，该文库的不同成员可以通过不同寡核苷酸序列标签的存在来表征。例如，能够结合到第一蛋白质的抗体可能具有与之相关联的第一报告寡核苷酸序列，而能够结合到第二蛋白质的抗体可能具有与之相关联的不同的报告寡核苷酸序列。特定寡核苷酸序列的存在可以指示特定抗体或可以被特定抗体识别或结合的细胞特征的存在。
能够与一个或多个生物颗粒结合或以其他方式偶联的标记剂可以用于将生物颗粒表征为属于特定的生物颗粒组。例如，标记剂可以用于对细胞样品或一组细胞进行标记。以此方式，一组细胞可以被标记为不同于另一组细胞。在一个实例中，第一组细胞可以来源于第一样品，第二组细胞可以来源于第二样品。标记剂可以允许第一组和第二组具有不同的标记剂(或与标记剂相关联的报告寡核苷酸)。这可以例如促进多路使用，其中第一组的细胞和第二组的细胞可以分别标记，然后合并到一起用于下游分析。标签的下游检测可以指示分析物属于特定的组。
例如，报告寡核苷酸可以连接至抗体或其表位结合片段，并且标记生物颗粒可以包括使抗体连接的条形码分子或表位结合片段连接的条形码分子经受适用于将抗体结合于生物颗粒表面上存在的分子的条件。抗体或其表位结合片段与表面上存在的分子之间的结合亲和力可以在期望的范围内，以确保抗体或其表位结合片段保持与分子结合。例如，结合亲和力可以在所需范围内，以确保抗体或其表位结合片段在各种样品加工步骤(例如分隔和/或核酸扩增或延伸)期间保持与分子结合。抗体或其表位结合片段和它与之结合的分子之间的解离常数(Kd)可以小于约100μM、90μM、80μM、70μM、60μM、50μM、40μM、30μM、20μM、10μM、9μM、8μM、7μM、6μM、5μM、4μM、3μM、2μM、1μM、900nM、800nM、700nM、600nM、500nM、400nM、300nM、200nM、100nM、90nM、80nM、70nM、60nM、50nM、40nM、30nM、20nM、10nM、9nM、8nM、7nM、6nM、5nM、4nM、3nM、2nM、1nM、900pM、800pM、700pM、600pM、500pM、400pM、300pM、200pM、100pM、90pM、80pM、70pM、60pM、50pM、40pM、30pM、20pM、10pM、9pM、8pM、7pM、6pM、5pM、4pM、3pM、2pM或1pM。例如，该解离常数可以小于约10μM。
在另一个实例中，报告寡核苷酸可以偶联至细胞穿透肽(CPP)，并且标记细胞可以包括将CPP偶联的报告寡核苷酸递送到分析物载体中。标记生物颗粒可以包括由细胞穿透肽将CPP缀合的寡核苷酸递送到细胞和/或细胞珠粒中。可以用于本文所提供的方法中的细胞穿透肽可以包含至少一个非官能半胱氨酸残基，其可以是游离的或衍生的，用于与寡核苷酸形成二硫键，该寡核苷酸已针对这种键合进行过修饰。可以用于本文实施方案中的细胞穿透肽的非限制性实例包括渗透素、转运素、plsl、TAT(48-60)、pVEC、MTS和MAP。可用于本文提供的方法中的细胞穿透肽可以具有诱导细胞群体的至少约30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％细胞的细胞穿透的能力。细胞穿透肽可以是富含精氨酸的肽转运载体。细胞穿透肽可以是渗透素或Tat肽。
在另一个实例中，报告寡核苷酸可以偶联至荧光团或染料，并且标记细胞可以包括使荧光团连接的条形码分子经受适用于将荧光团结合于生物颗粒的表面的条件。在一些情况下，荧光团可以与脂质双层强烈地相互作用，并且标记生物颗粒可以包括使荧光团连接的条形码分子经受一定条件，使得荧光团结合于生物颗粒的膜或插入生物颗粒的膜中。在一些情况下，荧光团是水溶性的有机荧光团。在一些情况下，荧光团是Alexa 532马来酰亚胺、四甲基罗丹明-5-马来酰亚胺(TMR马来酰亚胺)、BODIPY-TMR马来酰亚胺、磺基-Cy3马来酰亚胺、Alexa 546羧酸/琥珀酰亚胺酯、Atto 550马来酰亚胺、Cy3羧酸/琥珀酰亚胺酯、Cy3B羧酸/琥珀酰亚胺酯、Atto 565生物素、磺基罗丹明B、Alexa 594马来酰亚胺、TexasRed马来酰亚胺、Alexa 633马来酰亚胺、Abberior STAR 635P叠氮化物、Atto 647N马来酰亚胺、Atto 647SE，或者磺基-Cy5马来酰亚胺。参见例如，Hughes L D等人，PLoS One.2014年2月4日；9(2):e87649，该文献据此全文以引用方式并入本文用于所有目的，旨在说明有机荧光团。
报告寡核苷酸可以偶联到亲脂分子，并且标记生物颗粒可以包括由亲脂分子将核酸条形码分子递送到生物颗粒的膜或核膜。亲脂性分子可以与脂质膜(诸如细胞膜和细胞核膜)缔合并且/或者插入脂质膜中。在一些情况下，插入可以是可逆的。在一些情况下，亲脂性分子与生物颗粒之间的结合可以是这样的，使得生物颗粒在后续加工(例如，分隔、细胞渗透化、扩增、合并等)期间保留亲脂性分子(例如，以及其结合的组分，例如核酸条形码分子)。报告核苷酸可以进入细胞内空间和/或细胞核中。
报告寡核苷酸可以是核酸分子的一部分，该核酸分子包含任何数目的如本文其他地方所述的功能序列，诸如靶标捕获序列、随机引物序列等，并且与另一个核酸分子偶联，该另一个核酸分子是分析物或源自分析物。
在分隔之前，可以将细胞与标记剂的文库一起孵育，这些标记剂可以是用于一组广泛的不同细胞特征(例如，受体、蛋白质等)的标记剂，并且包括其相关联的报告寡核苷酸。可以将未结合的标记剂从细胞洗去，然后可以如本文其他地方所述将这些细胞连同具有分区特异性条形码序列的核酸条形码分子(例如，连接到支持物，诸如珠粒或凝胶珠粒)一起共同分隔(例如，共同分隔到液滴或孔中)。因此，分区可以包括一个或多个细胞以及结合的标记剂及其已知的相关联的报告寡核苷酸。
在其他情况下，例如为了促进样品复用，对特定细胞特征具有特异性的标记剂可以具有偶联至第一报告寡核苷酸的第一多种标记剂(例如，抗体或亲脂部分)和偶联至第二报告寡核苷酸的第二多种标记剂。例如，第一组多种标记剂和第二组多种标记剂可以与不同的细胞、细胞群体或样品相互作用，从而允许特定的报告寡核苷酸指示特定的细胞群体(或者细胞或样品)和细胞特征。这样，可以对不同样品或群组进行独立加工并且随后组合在一起以进行合并分析(例如，如本文其他地方所述的基于分区的加条形码)。参见例如美国专利公开20190323088，该专利据此全文以引用方式并入本文用于所有目的。
如本文其他地方所述，标记剂文库可以与特定的细胞特征相关联，也可以用于鉴定分析物源自特定的生物颗粒、群体或样品。生物颗粒可以与多个文库一起孵育，并且给定生物颗粒可以包含多种标记剂。例如，细胞可以包含与之偶联的亲脂性标记剂和抗体。该亲脂性标记剂可以指示细胞是特定细胞样品的成员，而该抗体可以指示细胞含有特定的分析物。这样，报告寡核苷酸和标记剂可以允许对多分析物进行多重分析。
在一些情况下，这些报告寡核苷酸可以包含这样的核酸条形码序列：这些核酸条形码序列允许鉴定报告寡核苷酸与之偶联的标记剂。使用寡核苷酸作为报告子可以提供以下优点：能够在序列方面产生显著多样性，同时还可易于连接至大多数生物分子(例如，抗体等)，而且易于进行检测(例如，使用测序或阵列技术)。
报告寡核苷酸连接(偶联)至标记剂可以通过多种直接或间接、共价或非共价缔合或连接中的任何一种来实现。例如，寡核苷酸可以使用化学缀合技术(例如，可从InnovaBiosciences获得的抗体标记试剂盒)共价连接至标记剂(诸如蛋白质，例如抗体或抗体片段)的一部分，以及使用其他非共价连接机制进行连接，例如使用生物素酰化抗体和带有亲和素或链霉亲和素接头的寡核苷酸(或包括偶联至寡核苷酸的一个或多个生物素酰化接头的珠粒)。抗体和寡核苷酸生物素酰化技术是可用的。参见例如Fang等人,“Fluoride-Cleavable Biotinylation Phosphoramidite for 5′-end-Labelling andAffinity Purification of Synthetic Oligonucleotides,”Nucleic Acids Res.2003年1月15日；31(2):708-715，其出于所有目的全文以引用方式并入本文。同样，蛋白质和肽生物素酰化技术已经被开发并且是现成的。参见例如美国专利号6,265,552，该专利全文以引用方式并入本文以用于所有目的。
此外，点击反应化学诸如甲基四嗪-PEG5-NHS酯反应、TCO-PEG4-NHS酯反应等可以用于将报告寡核苷酸偶联至标记剂。可商购获得的试剂盒(诸如来自Thunderlink和Abcam的那些)以及本领域中常见的技术可以在适当时用于将报告寡核苷酸偶联至标记剂。在另一个实例中，标记剂间接(例如，经由杂交)偶联至报告寡核苷酸，该报告寡核苷酸包含鉴别该标记剂的条形码序列。例如，标记剂可以直接偶联(例如，共价结合)至杂交寡核苷酸，该杂交寡核苷酸包含与报告寡核苷酸的序列杂交的序列。杂交寡核苷酸与报告寡核苷酸的杂交将标记剂偶联至报告寡核苷酸。在一些实施方案中，诸如在施加刺激时，报告寡核苷酸可从标记剂释放。例如，报告寡核苷酸可以通过不稳定键(例如，化学不稳定、光不稳定、热不稳定等)连接至标记剂，如本文其他地方针对从支持物释放分子大体描述的。在一些情况下，本文所述的报告寡核苷酸可以包括可用于后续加工的一个或多个功能序列，诸如衔接子序列、独特分子标识符(UMI)序列、测序仪特异性流通池连接序列(诸如P5、P7或者部分P5或P7序列)、引物或引物结合序列、测序引物或引物结合序列(诸如R1、R2或者部分R1或R2序列)。
在一些情况下，标记剂可以包含报告寡核苷酸和标签。标签可以是荧光团、放射性同位素、能够发生比色反应的分子、磁性颗粒或者能够检测的任何其他合适的分子或化合物。标签可以直接或间接缀合至标记剂(或报告寡核苷酸)(或，标签可以缀合至可结合于标记剂或报告寡核苷酸的分子)。在一些情况下，标签缀合到与报告寡核苷酸的序列互补的寡核苷酸，并且可以允许该寡核苷酸与报告寡核苷酸杂交。
图7描述了包含与之连接的报告寡核苷酸(1140)的示例性标记剂(1110、1120和1130)。标记剂1110(例如，本文所述的任何标记剂)连接(要么直接连接(例如，共价连接)，要么间接连接)至报告寡核苷酸1140。报告寡核苷酸1140可以包含鉴别标记剂1110的条形码序列1142。报告寡核苷酸1140还可以包含可用于后续加工的一个或多个功能序列，诸如衔接子序列、独特分子标识符(UMI)序列、测序仪特异性流通池连接序列(诸如P5、P7或者部分P5或P7序列)、引物或引物结合序列、测序引物或引物结合序列(诸如R1、R2或者部分R1或R2序列)。
参见图7，在一些情况下，缀合至标记剂(例如，1110、1120、1130)的报告寡核苷酸1140包含功能序列1141(例如，引物序列)、鉴定标记剂(例如，1110、1120、1130)的条形码序列和功能序列1143。功能序列1143可以是报告捕获柄序列，其被配置为杂交于互补序列，诸如存在于核酸条形码分子1190上的互补序列(未示出)，诸如本文其他地方所述的那些。在一些情况下，核酸条形码分子1190连接至支持物(例如，珠粒，诸如凝胶珠粒)，诸如本文其他地方所述的那些。例如，核酸条形码分子1190可以经由可释放键(例如，包括不稳定键)(诸如本文其他地方所述的那些)连接至支持物。在一些情况下，报告寡核苷酸1140包含一个或多个附加功能序列，诸如上文所述的那些。
在一些情况下，标记剂1110是包含报告寡核苷酸1140的蛋白质或多肽(例如，抗原或预期抗原)。报告寡核苷酸1140包含条形码序列1142，该条形码序列鉴定多肽1110并且可以用于推断分析物(例如，多肽1110的结合伴侣(即，多肽1110可以与之结合的分子或化合物)的存在。在一些情况下，标记剂1110是包含报告寡核苷酸1140的亲脂部分(例如，胆固醇)，其中选择该亲脂部分，使得标记剂1110整合到细胞膜或细胞核中。报告寡核苷酸1140包含鉴定亲脂部分1110的条形码序列1142，该亲脂部分在一些情况下用于为细胞(例如，成群的细胞、细胞样品等)加标签并且可以如本文其他地方所述用于进行多重分析。在一些情况下，标记剂是包含报告寡核苷酸1140的抗体1120(或其表位结合片段)。报告寡核苷酸1140包含条形码序列1142，该条形码序列鉴别抗体1120并且可以用于推断例如抗体1120的靶标(即，抗体1120结合的分子或化合物)的存在。在其他实施方案中，标记剂1130包含具有肽1132的MHC分子1131和鉴别肽1132的报告寡核苷酸1140。在一些情况下，MHC分子偶联至支持物1133。在一些情况下，支持物1133可以是多肽(诸如链霉亲和素)，或多糖(诸如葡聚糖)。在一些情况下，报告寡核苷酸1140能够以任何合适的方式直接或间接地偶联到MHC标记剂1130。例如，报告寡核苷酸1140可以与MHC分子1131、支持物1133或肽1132偶联。在一些实施方案中，标记剂1130包含多个MHC分子(例如是MHC多聚体，其可以偶联到支持物(例如，1133))。可以与本文所公开的组合物、方法和系统一起使用的I类和/或II类MHC多聚体有许多可能构型，例如MHC四聚体、MHC五聚体(经由卷曲螺旋结构域组装的MHC，例如MHCI类五聚体(ProImmune,Ltd.))、MHC八聚体、MHC十二聚体、MHC装饰的葡聚糖分子(例如，MHC(Immudex))等。关于示例性标记剂(包括基于抗体和MHC的标记剂)、报告寡核苷酸和使用方法的描述，参见例如美国专利10,550,429以及美国专利公开20190367969，这些专利中的每一者均全文以引用方式并入本文用于所有目的。
图9展示了携带条形码的珠粒的另一个实例。在一些实施方案中，对多种分析物(例如，RNA和一种或多种分析物，使用本文所述的标记剂)的分析可以包括核酸条形码分子，如图9中所大致描绘的。在一些实施方案中，核酸条形码分子1310和1320经由如本文其他地方所述的可释放键1340(例如，包括不稳定键)连接至支持物1330。核酸条形码分子1310可以包含衔接子序列1311、条形码序列1312和捕获序列1313。核酸条形码分子1320可以包含衔接子序列1321、条形码序列1312和捕获序列1323，其中捕获序列1323包含与捕获序列1313不同的序列。在一些情况下，衔接子1311和衔接子1321包含相同序列。在一些情况下，衔接子1311和衔接子1321包含不同序列。尽管支持物1330被示出为包含核酸条形码分子1310和1320，但是本文设想了包含共同条形码序列1312的任何合适数量的条形码分子。例如，在一些实施方案中，支持物1330还包含核酸条形码分子1350。核酸条形码分子1350可以包含衔接子序列1351、条形码序列1312和捕获序列1353，其中捕获序列1353包含与捕获序列1313和1323不同的序列。在一些情况下，核酸条形码分子(例如，1310、1320和1350)包含一个或多个附加功能序列，诸如本文所述的UMI或其他序列。核酸条形码分子1310、1320或1350可以与如本文其他地方所述的分析物相互作用，例如，如图8A至图8C中所描绘。
参见图8A，在用标记剂对细胞进行标记的情况下，“捕获序列”或“报告捕获序列”1223可以与报告寡核苷酸的衔接子序列互补。细胞可以与一种或多种报告寡核苷酸1220缀合的标记剂1210(例如，凝集素、糖、核苷酸糖、合成糖、多肽、抗体或本文其他地方所述的其他标记剂)接触。在一些情况下，细胞可以在加条形码之前被进一步加工。例如，此类加工步骤可以包括一个或多个清洗步骤和/或细胞分选步骤。在一些情况下，将与缀合到寡核苷酸1220的标记剂1210结合的细胞和包含核酸条形码分子1290的支持物1230(例如珠粒，诸如凝胶珠粒)分隔到多个分区之中的一个分区(例如，液滴乳液的液滴或微孔阵列的孔)中。在一些情况下，该分区至多包含结合于标记剂1210的单个细胞。在一些情况下，缀合至标记剂1210(例如，抗体、凝集素、多肽、合成糖和核苷酸糖)的报告寡核苷酸1220包含第一功能序列1211(诸如但不限于衔接子序列或引物序列)、鉴定标记剂1210(例如，多肽、抗体或者pMHC分子或复合物的肽)的报告条形码序列1212和捕获柄序列1213。捕获柄序列1213可以被配置为杂交于互补序列，诸如存在于核酸条形码分子1290(例如，分区特异性条形码分子)上的捕获序列1223在一些情况下，寡核苷酸1220包含一个或多个附加功能序列，诸如本文其他地方所述的那些。
加条形码的核酸可以从图8A至图8C中描述的构建体产生(例如，经由核酸反应，诸如核酸延伸或连接)。例如，然后可以将捕获柄序列1213与互补序列诸如捕获序列1223杂交，以产生(例如，经由核酸反应，诸如核酸延伸或连接)包含细胞(例如，分区特异性)条形码序列1222(或其反向互补序列)和报告条形码序列1212(或其反向互补序列)的加条形码的核酸分子。在一些实施方案中，捕获柄序列1213包含与捕获序列1223上的模板转换寡核苷酸互补的序列。在一些实施方案中，核酸条形码分子1290(例如，分区特异性条形码分子)还包含UMI(未示出)。然后可以任选地如本文其他地方所述的那样加工加条形码的核酸分子，例如以扩增所述分子和/或将测序平台特异性序列补加至所述片段。参见例如美国专利公开2018/0105808，该专利据此全文以引用方式并入本文用于所有目的。然后可以在合适的测序平台上对加条形码的核酸分子或由其生成的衍生物进行测序。
在一些实施方案中，可以对多种分析物(例如，核酸和一种或多种分析物，使用本文所述的标记剂)进行分析。例如，工作流程可以包括在图8A至图8C的任一者中大致描绘的工作流程，或者如本文其他地方所述的针对单独分析物的工作流程的组合。例如，通过使用在图8A至图8C中大致描绘的工作流程的组合，可以对多种分析物进行分析。
在一些情况下，对分析物(例如，核酸、多肽、碳水化合物、脂质、聚糖、聚糖基序、代谢物、蛋白质等)的分析包括在图8A中大致描绘的工作流程。核酸条形码分子1290(例如，分区特异性条形码分子)可以与一种或多种分析物共同分隔。在一些情况下，核酸条形码分子1290连接至支持物1230(例如，珠粒，诸如凝胶珠粒)，诸如本文其他地方所述的那些。例如，核酸条形码分子1290可以经由可释放键1240(例如，包括不稳定键)(诸如本文其他地方所述的那些)连接至支持物1230。核酸条形码分子1290可以包含功能序列1221并且任选地包含其他附加序列，例如条形码序列1222(例如，共同条形码、分区特异性条形码或本文其他地方所述的其他功能序列)和/或UMI序列(未示出)。核酸条形码分子1290可以包含捕获序列1223，该捕获序列可以与另一核酸序列互补，使得其可以杂交于特定序列，例如捕获柄序列1213。
例如，捕获序列1223可以包含多聚T序列，并且可以用于与mRNA杂交。参见图8C，在一些实施方案中，核酸条形码分子1290包含与来自细胞的RNA分子1260的序列互补的捕获序列1223。在一些情况下，捕获序列1223包含对RNA分子具有特异性的序列。捕获序列1223可以包含已知序列或靶向序列，或者随机序列。在一些情况下，可以进行核酸延伸反应，从而产生包含捕获序列1223、功能序列1221、条形码序列1222、任何其他功能序列和对应于RNA分子1260的序列的加条形码的核酸产物。
在另一个实例中，捕获序列1223可以与已经补加至分析物的悬垂序列或衔接子序列互补。例如，参见图8B的分图1201，在一些实施方案中，引物1250包含与来自生物颗粒的核酸分子1260(诸如编码BCR序列的RNA)的序列互补的序列。在一些情况下，引物1250包含不与RNA分子1260互补的一个或多个序列1251。序列1251可以是如本文其他地方所述的功能序列，例如，衔接子序列、测序引物序列，或者便于与测序仪的流通池偶联的序列。在一些情况下，引物1250包含多聚T序列。在一些情况下，引物1250包含与RNA分子中的靶序列互补的序列。在一些情况下，引物1250包含与免疫分子的区域(诸如TCR或BCR序列的恒定区)互补的序列。引物1250与核酸分子1260杂交，并产生互补分子1270(参见分图1202)。例如，互补分子1270可以是在逆转录反应中产生的cDNA。在一些情况下，可以将附加序列补加到互补分子1270上。例如，可以选择逆转录酶，使得几个非模板碱基1280(例如，多聚C序列)补加到cDNA上。在另一个实例中，末端转移酶也可以用于补加该附加序列。核酸条形码分子1290包含与非模板碱基互补的序列1224，并且逆转录酶对核酸条形码分子1290执行模板转换反应，以产生包含细胞(例如，分区特异性)条形码序列1222(或其反向互补序列)和互补分子1270序列(或其一部分)的加条形码的核酸分子。在一些情况下，序列1223包含与免疫分子的区域(诸如TCR或BCR序列的恒定区)互补的序列。序列1223与核酸分子1260杂交，产生互补分子1270。例如，互补分子1270可以在逆转录反应中产生，该逆转录反应产生包含细胞(例如，分区特异性)条形码序列1222(或其反向互补序列)和互补分子1270序列(或其一部分)的加条形码的核酸分子。适用于为由mRNA转录物(包括编码免疫细胞受体的V(D)J区的那些)产生的cDNA加条形码的附加方法和组合物以及/或者包括模板转换寡核苷酸的加条形码方法和组合物在以下专利中有所描述：国际专利申请WO2018/075693、美国专利公开号2018/0105808、2015年6月26日提交的美国专利公开号2015/0376609，以及美国专利公开号2019/0367969，这些专利申请中的每一者均全文以引用方式并入本文用于所有目的。序列1223可以包含模板转换寡核苷酸。
任何合适的试剂都可以降解珠粒。合适的试剂可以包括但不限于温度变化、pH变化、还原、氧化和暴露于水或其他水溶液。
J.组合加条形码
在一些情况下，核酸分子的加条形码可以使用组合方法来完成。在此类情况下，可以将一个或多个核酸分子(其可以包含在细胞中，例如固定细胞或细胞珠粒中)与一个或多个第一核酸条形码分子(任选地偶联到珠粒)一起分隔(例如在第一组分区中，例如孔或液滴中)。然后，例如使用本文所述的过程，可以将第一核酸条形码分子或其衍生物(例如，互补序列、反向互补序列)连接到一个或多个核酸分子，从而产生第一加条形码的核酸分子。可以将第一核酸条形码分子分隔到第一组分区，使得第一核酸条形码分子中在一个分区中的核酸条形码分子包含对于第一组分区中的该分区独特的条形码序列。每个分区可以包含独特的条形码序列。例如，被分隔到第一组分区中的第一分区的一组第一核酸条形码分子可以各自包含对第一组分区中的第一分区独特的共同条形码序列，并且被分隔到第一组分区中的第二分区的第二组第一核酸条形码分子可以各自包含对第一组分区中的第二分区独特的另一共同条形码序列。这种条形码序列(对该分区是独特的)可用于确定一个或多个核酸分子(或其衍生物)源自的细胞或分区。
可以合并来自第一组分区中的多个分区的第一加条形码的核酸分子并将其与一个或多个第二核酸条形码分子一起重新分隔(例如，在第二组分区中，例如，一个或多个孔或液滴中)。然后，可以将第二核酸条形码分子或其衍生物连接到第一加条形码的核酸分子，从而产生第二加条形码的核酸分子。与第一轮分隔期间的第一核酸条形码分子一样，可以将第二核酸条形码分子分隔到第二组分区，使得第二核酸条形码分子中在一个分区中的核酸条形码分子包含对于第二组分区中的该分区独特的条形码序列。这种条形码序列也可用于确定一个或多个核酸分子或第一加条形码的核酸分子源自的细胞或分区。因此，第二加条形码的核酸分子可以包含两个条形码序列(例如，来自第一核酸条形码分子和第二核酸条形码分子)。
通过重复这些过程任何次(例如，在拆分-合并方法中)，可以将附加条形码序列连接到第二加条形码的核酸分子，从而组合合成独特的条形码序列，以对一个或多个核酸分子加条形码。例如，组合加条形码可以包括至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个拆分(例如，分隔)和/或合并(例如，来自分区)的操作。在国际专利公开号WO2019/165318中也可以找到组合加条形码的附加实例，这些专利中的每一者均全文以引用方式并入本文以用于所有目的。
有利的是，组合条形码方法可用于产生更大的条形码多样性，并在源自一个细胞或分区的核酸分子上合成独特的条形码序列。例如，组合加条形码(其包括三个操作，每个操作具有100个分区)可以产生多达106个独特的条形码组合。在一些情况下，组合条形码方法可有助于确定一个分区是仅包含一个细胞还是多于一个细胞。例如，第一核酸条形码分子和第二核酸条形码分子的序列可以用于确定一个分区是否包含多于一个细胞。例如，如果两个核酸分子包含不同的第一条形码序列但相同的第二条形码序列，则可以推断第二组分区包含两个或更多个细胞。
在一些情况下，组合加条形码可以在相同隔室中实现。例如，可以在一个分区(例如，液滴或孔)内的连续操作中将包含一个或多个核酸碱基的独特核酸分子连接到核酸分子(例如，样品或靶核酸分子)，以产生第一加条形码的核酸分子。可以将包含一个或多个核酸碱基的第二独特核酸分子连接到第一加条形码的核酸分子，从而产生第二加条形码的核酸分子。在一些情况下，可以在单一反应混合物中提供所有用于加条形码和产生组合加条形码的分子的试剂，或者可以顺序提供这些试剂。
在一些情况下，可以为包含核酸分子的细胞珠粒加条形码。用于为细胞珠粒加条形码的方法和系统在PCT/US2018/067356和美国专利公开号2019/0330694中进一步描述，这些专利据此全文以引用方式并入。
应当理解，对以下实施例的引用仅仅是为了说明的目的，并不限制权利要求的范围。
IV.定义
除非另有定义，否则本文中使用的所有技术和科学术语具有本发明所属领域的技术人员通常理解的含义。
除非另有定义，否则本文中使用的技术和科学术语具有本领域普通技术人员通常理解的含义。本领域普通技术人员已知的任何合适的材料和/或方法都可以用于实施本文所述的方法。
本文所用的“一个”、“一种”和“该”可以包括复数指代物，除非明确且毫不含糊地限于一个指代物。
如本文所用，术语“包括”旨在表示化合物、组合物和方法包括所列举的元素，但不排除其他元素。当用于定义化合物、组合物和方法时，“基本上由...组成”应指排除对该组合具有任何重要意义的其他元素。因此，基本上由本文定义的元素组成的组合物将不排除痕量污染物(例如来自分离和纯化方法)以及药学上可接受的载体、防腐剂等。“由...组成”应指排除其他成分的不止痕量元素。由这些过渡术语中的每一个过渡术语定义的实施方案都在本技术的范围内。
所有数字标号(例如质量、温度、时间和浓度，包括范围)都是近似值，以1％、5％或10％的增量(+)或(-)变化。应当理解，尽管并不总是明确阐明所有数字标号前面都有术语“约”，
但是本文给出的某些范围的数值前面带有术语“约”。本文使用术语“约”，是为了从字面上支持以该术语开始的确切数字，以及接近或近似以该术语开始的数字。在确定一个数字是否接近或近似一个具体列举的数字时，接近或近似的未列举的数字可以是这样的数字，在其出现的上下文中，该数字提供了该具体列举的数字的实质等同物。如果近似程度在上下文中不清楚，则“约”是指所提供的值的正或负10％以内，或者四舍五入到最接近的有效数字，在所有情况下都包括所提供的值。在一些实施方案中，术语“约”表示指定值±多达10％、多达±5％或多达±1％。
在权利要求书中使用诸如“第一”、“第二”、“第三”等序数词来修饰权利要求要素本身并不意味着一个权利要求要素优于另一个权利要求要素的任何优先级、先后次序或顺序，也不意味着执行方法的多个动作的时间顺序，而是仅用作将具有某一名称的一个权利要求要素与具有用于区分权利要求要素的相同名称(但使用的序数词不同)的另一个要素区分开的标签。类似地，在说明书中使用这些术语本身并不意味着任何要求的优先级、先后次序或顺序。
“聚糖”是指连接到生物分子诸如蛋白质、脂质或核酸上的任何糖或糖链。
术语“聚糖类别”是指根据其结构定义的聚糖的广泛子集，诸如N连接的、O连接的或C连接的聚糖。聚糖类别可以进一步分类为子集。聚糖和聚糖基序包括但不限于O-GlcNAc残基、含LacNac的聚糖、含Fuc-α1,2-Gal的聚糖、含Galβ1-3GalNAc的聚糖、GlcNAc-OR、Neu5Acα2-3Gal和GalT1Y289L。
“聚糖基序”是指较大聚糖分子内的特定聚糖亚结构(尽管一些聚糖可以是单糖)。聚糖基序由糖单体的类型(诸如但不限于，葡萄糖或半乳糖)和糖苷键的连接性来表征。参见例如Galβ1-3GalNAc。Galβ1-3GalNAc是指通过β1-3键连接的2种独特糖单体，即半乳糖和N-乙酰半乳糖胺。β是指构象(α或β)，而1-3是指氧原子桥接在每个糖上的特定碳原子。
确定聚糖基序的存在可以允许确定出现该聚糖基序的聚糖类别或聚糖。Ser或Thr残基上的β连接的GlcNAc基序由O-GlcNAc转移酶(OGT)合成。β连接的GlcNAc基序可以在亚化学计量反应中被快速去除。糖组状态可以随着例如O-GlcNAc糖基化而快速改变。
聚糖类别在本领域中是已知的。聚糖类别包括但不限于O连接的聚糖、N连接的聚糖、粘蛋白型O连接的聚糖、O连接的聚糖核心I和O连接的聚糖核心2类别。
不同类别的蛋白质糖基化包括N连接的、O连接的和C连接的修饰。N连接的聚糖连接到天冬酰胺(Asn，N)残基的侧链氮原子上，天冬酰胺残基主要存在于N-X-S/T共有序列中，其中X是除脯氨酸以外的任何氨基酸。许多N连接的聚糖存在于被翻译到内质网中的蛋白质上，在内质网中有一个通用的聚糖核心结构，从转移到新生蛋白质上的β连接的N-乙酰葡糖胺开始。N连接的聚糖子集包括但不限于高甘露糖、杂合和复杂结构。O连接的聚糖不需要通用的核心结构。O连接的聚糖连接到丝氨酸(Ser)、苏氨酸(Thr)、酪氨酸(Tyr)或羟赖氨酸残基的侧链氧原子。O-糖基化的每种类型或子集都由肽近端聚糖结构的同一性来定义。最常见的O连接的子集是粘蛋白型聚糖，它是由连接到Ser或Thr残基上的α连接的N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)残基起始的。其他O连接的聚糖子集也可以用Ser或Thr结合的葡萄糖、木糖、甘露糖或岩藻糖残基起始。另一O连接的子集是O-GlcNAc。糖基转移酶添加的附加聚糖可以进一步增加O连接的聚糖的复杂性，从而产生诸如四糖唾液酸化路易斯X的结构。另选地，O连接的聚糖可以保持相对简单，诸如Ser或Thr残基上的β连接的GlcNAc基序。
如本文所用，术语“样品”一般是指生物样品。生物样品可以包含任何数量的大分子，例如细胞大分子。样品可以是细胞样品。样品可以是细胞系或细胞培养样品。样品可以包含一个或多个细胞。一个或多个细胞可以是固定的或活的。样品可以包含一种或多种细胞裂解物。样品可以获自受试者。样品可以包括一种或多种微生物。样品可以包含核酸、蛋白质、碳水化合物、脂质或它们的组合。生物样品可以源自另一种样品。样品可以是组织样品，诸如活检样品、芯针活检样品、针抽吸物或细针抽吸物。样品可以是流体样品，诸如但不限于血液样品、尿液样品、唾液样品、血浆样品或血清样品。样品可以是皮肤样品。样品可以是颊拭子。样品可以是无细胞样品或无细胞的。可以从身体样品获得细胞外样品，该身体样品选自由血液、血浆、血清、尿液、唾液、粘膜分泌物、痰、汗液、粪便和泪液组成的组。样品可以选自由组织、细胞、固定细胞、活细胞和细胞裂解物组成的组。
“孵育”旨在涵盖维持或提供有利于或有助于所需反应的条件，诸如但不限于提供反应组分或试剂。已经认识到，有利于或有助于一个反应的条件可能不同于有利于另一个反应的条件。不同反应和反应类型的合适条件在本领域中是已知的。“标志分子”是指包含核苷酸糖和反应对的第一反应性分子的分子。第一反应性分子附着、偶联、联接或连接到核苷酸糖。核苷酸糖包含单糖部分和核苷二磷酸或核苷一磷酸；核苷酸糖在糖基化反应中充当糖基供体。核苷酸糖可以包括但不限于尿苷二磷酸糖、鸟嘌呤二磷酸糖、胞嘧啶二磷酸糖、胞嘧啶一磷酸糖、腺苷二磷酸糖和胸苷二磷酸糖。尿苷二磷酸糖包括但不限于UDP-α-D-Glc、UDPα-D-Gal、UDPα-D-GalNAc、UDPα-D-GlcNAc、UDPα-D-GlcA、UDPα-D-GlcUA和UDPα-D-Xyl。鸟嘌呤二磷酸糖包括但不限于GDP-α-D-Man和GDP-β-L-Fuc。胞嘧啶单磷酸糖包括但不限于CMP-β-D-Neu5Ac。胞嘧啶二磷酸糖包括但不限于CDP-D-核糖醇和CDP-Glu。腺苷二磷酸糖包括但不限于ADP-核糖和ADP-glu。
“合成核苷酸糖”是指在细胞或生物体外部产生的任何合成的核苷酸糖和任何非天然的核苷酸糖。非天然核苷酸糖是从细胞或生物体中分离的核苷酸糖，并供应给或提供给正常情况下不产生或不含该核苷酸糖的细胞或生物体。已经认识到，合成的核苷酸糖涵盖从细胞或生物体中分离并进一步化学改变的核苷酸糖。合成核苷酸糖可以包括但不限于GDP-Glc、N-乙酰甘露糖胺和N-乙酰半乳糖胺。合成核苷酸糖可以被乙酰化。可以将合成糖掺入到聚糖中，该聚糖选自由唾液酸和粘蛋白型O连接的聚糖组成的组。合成糖可以是聚糖类别特异性的。合成糖可以是聚糖基序特异性的。
“反应对”包括能够彼此偶联的第一反应性分子和第二反应性分子。在各个方面，第二反应性分子选择性地与反应对的第一反应性分子偶联。合适的反应对可以包括但不限于叠氮化物和炔烃、叠氮化物和膦、醛和氨氧基、醛和肼、醛和酰肼、酮和氨氧基、肼和酮、环丙烯和四嗪、降冰片烯和四嗪、反式环辛烯和四嗪、炔烃和四嗪、硝酮和烯烃、硝酮和炔烃、重氮基和炔烃以及异腈和四嗪。已经认识到，反应对的组分可以充当反应对的第一反应性分子或第二反应性分子。例如但不限于此，第一标志分子可以包含核苷酸糖和作为反应对的第一反应性分子的叠氮化物，其中炔烃作为反应对的第二反应性分子。另选地，第一标志分子可以包含核苷酸糖和作为反应对的第一反应性分子的炔烃，其中叠氮化物作为反应对的第二反应性分子。方法可以利用多个反应对来鉴定多种聚糖、聚糖基序或聚糖类别或它们的任何组合。还已经认识到，第一反应对的第一反应性分子可以是第二反应对、第三反应对、第四反应对或附加反应对的第二反应性分子；类似地，第一反应对的第二反应性分子可以是不同反应对的第一反应性分子。例如，第一标志分子可以包含核苷酸糖和作为第一反应对的第一反应性分子的叠氮化物，其中炔烃作为报告分子中反应对的第二反应性分子，并且第二标志分子可以包含核苷酸糖和作为第二反应对的第一反应性分子的炔烃，其中叠氮化物作为第二反应对的第二反应性分子。还已经认识到，一些反应对可能优选与其他反应对一起使用，而一些反应对可能优选不与其他反应对一起使用。本领域技术人员将选择适合彼此一起使用的反应对。
如本文所用，术语“能够偶联”旨在涵盖“能够相互作用”、“能够结合”、“能够连接”、“能够形成连接”、“能够联接”和“能够反应”。“能够偶联”不旨在受机制的限制。在一些实施方案中，反应对的第一反应性分子和第二反应性分子选择性地相互反应。在一个实施方案中，反应对的第一反应性分子和第二反应性分子的偶联或结合是共价相互作用。在各种实施方案中，反应对的第一反应性分子和第二反应性分子的相互作用是稳定的。
如本文所用，术语“稳定的”是指维持相互作用或连接，直到提供刺激来破坏相互作用。可以使用任何合适的刺激来破坏相互作用，包括但不限于化学暴露和物理变化。化学刺激可以包括但不限于TCEP。通常，在标准的单细胞工作流程条件下维持这种相互作用。在各个方面，可以在样品分隔后提供破坏性刺激。
在涉及活细胞的方法中，反应对分子之间的反应优选地是无毒的或双正交的。“双正交反应”是指既不与生物系统相互作用也不干扰生物系统的化学反应。参与的官能团或反应性分子对生物部分是惰性的，在生物相容性条件下彼此选择性反应，并且对于体内应用而言，对细胞和生物体是无毒的。在各个方面，一个反应性分子或基团较小，因此对通过化学方法或生物合成方法引入其中的生物分子的干扰最小。参见Sletten和Bertozzi,Accts Chem Res.44(9):666-676(2011)，该文献全文以引用方式并入本文。
“糖基转移酶”是催化糖基残基以限定的连接性从供体转移到受体底物的酶。受体底物可以选自包括但不限于肽、肽序列、聚糖和聚糖基序的组。糖基转移酶包括但不限于使用酶的核苷酸磷酸、使用酶的多萜醇磷酸、使用酶和核苷磷酸化酶的寡糖或多糖。糖基转移酶包括但不限于“聚糖特异性转移酶”。“聚糖特异性转移酶”是指一种糖基转移酶，其优先催化特定糖在已知位置以限定的连接性添加到底物上。
聚糖特异性转移酶可以包括但不限于糖基转移酶、唾液酸转移酶、α1,3-岩藻糖基转移酶；BGTA；WbwK岩藻糖基转移酶；α1,2-岩藻糖基转移酶；β1-4N-乙酰氨基半乳糖转移酶；β-半乳糖苷α2,6唾液酸转移酶1；以及β-半乳糖苷α2,3唾液酸转移酶1。
在所述方法的各个方面，可以使用多种糖基转移酶。在这种情况下，不同的糖基转移酶将被称为第一糖基转移酶、第二糖基转移酶、第三糖基转移酶、第四糖基转移酶、第五糖基转移酶或附加糖基转移酶。各种方法可以涉及使用第一聚糖特异性转移酶、第二聚糖特异性转移酶、第三聚糖特异性转移酶、第四聚糖特异性转移酶、第五聚糖特异性转移酶或附加聚糖特异性转移酶。已经认识到，聚糖特异性转移酶和核苷酸糖应按优先使用情况来配对。已经认识到，本领域技术人员可以选择糖基转移酶和优选的核苷糖底物。
如本文所用，术语“条形码”一般是指传达或能够传达关于感兴趣的组分、分析物、报告分子或分区的信息的标签或标识符。条形码可以直接或间接连接到反应性分子。条形码可以是分析物的一部分。条形码可以独立于分析物。条形码可以是连接到分析物(例如，核酸分子)的标签或标签加上反应性分子的组合。条形码可以是独特的。条形码可以共用相关分子的鉴定序列区域，诸如共用的起点、共用的分区或其他相似性。条形码可以具有多种不同的形式。例如，条形码可以包括多核苷酸条形码、随机核酸和/或氨基酸序列以及合成核酸和/或氨基酸序列。条形码能够以可逆或不可逆方式连接到分析物。条形码可以在样品测序之前、期间和/或之后加入到例如样品中的脱氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)的片段中。条形码可以允许鉴定单独序列读段。
如本文所用，术语“受试者”通常指生物体，诸如动物、植物、微生物体、微生物、细菌、真菌、古菌、病毒、无脊椎动物、哺乳动物、鸟类、脊椎动物、啮齿动物、灵长类动物、猿猴、人类、家畜、运动动物或宠物。受试者可以是健康的或无症状的，有患病风险或疑似患病的个体，或需要治疗或疑似需要治疗的个体。
通常，报告分子包含直接或间接与靶标相互作用的靶标特异性部分和具有靶标鉴定序列的报告寡核苷酸。因此，聚糖特异性报告分子可以包含聚糖特异性结合部分和具有聚糖鉴定序列的报告寡核苷酸。在一些实施方案中，聚糖特异性报告分子经由掺入到聚糖基序中的标志分子来间接与目标聚糖相互作用。在特定实施方案中，标志分子包含反应对的第一反应性分子，并且聚糖特异性报告分子包含反应对的第二反应性分子和具有聚糖鉴定序列的报告分子。“组分特异性报告分子”包含直接与感兴趣的组分相互作用的靶标特异性部分和具有组分鉴定序列的报告寡核苷酸。
“未掺入的报告分子”是不与其相应分析物结合(例如不直接与目标分析物结合)、不与反应对的第一反应性分子结合或者与未掺入到聚糖中的反应对的第一反应性分子结合的报告分子。术语“未掺入的报告分子”和“未结合的报告分子”可以互换使用。去除未掺入的报告分子涉及去除至少一个报告分子，其中第二反应性分子尚未偶联到第一反应性分子，或者其中第二反应性分子已偶联到第一反应性分子，但第一反应性分子未掺入到聚糖中。去除至少一种未掺入的报告分子的方法可以包括但不限于用反应缓冲液洗涤和用水性缓冲液洗涤。水性缓冲液可包括但不限于包含牛血清白蛋白(BSA)的PBS缓冲液和PBS加0.1％-1％BSA。洗涤可以进行一次或多次，例如三次洗涤循环。细胞外或被细胞吸收的未掺入的报告分子可以通过本领域已知的任何方法去除。已经认识到，去除被细胞吸收的未掺入的报告分子的洗涤循环可能涉及更长的洗涤循环、附加的洗涤循环或用不同的缓冲液洗涤。
“未掺入的标志分子”是尚未进入细胞、已经进入细胞但没有被加工成标志底物、或者已经进入细胞但尚未成为活细胞中糖基转移酶的底物的标志分子。
如本文所用，术语“分区”一般是指可以适合于包含一种或多种物类或进行一种或多种反应的空间或体积。分区可以是物理组分，诸如液滴或孔。分区可以将空间或体积与另一个空间或体积隔离。分区的内容物可以与其他分区的内容物保持离散。液滴可以是与第一相不混溶的第二相(例如油)中的第一相(例如水相)。液滴可以是不与第一相相分离的第二相中的第一相，例如水相中的胶囊或脂质体。分区可以包括一个或多个其他(内部)分区。在一些情况下，分区可以是虚拟组分，其可以由跨越多个和/或远程物理隔室的索引定义且鉴定。例如，物理隔室可以包括多个虚拟组分。已经认识到，可能导致一个或多个内部分区被破坏，从而将内部分区的内容物释放到较大的分区。可以根据需要调整破坏或释放的时间。
如本文所用，术语“分隔”旨在涵盖分开、划分、沉积、分离或隔室化成一个或多个分区。用于将一个或多个颗粒(诸如但不限于生物颗粒、生物颗粒的大分子成分、珠粒、试剂等)分隔到离散的隔室或分区(这里可互换地称为分区)中的系统和方法(其中每个分区保持其自己的内容物与其他分区的内容物的分离)在本领域中是已知的。参见例如US2020/0032335，该专利全文以引用方式并入本文。分区可以是乳液中的液滴。分区可以包括一个或多个其他分区。
“多个核酸条形码分子”可以包括至少约500个核酸条形码分子、至少约1,000个核酸条形码分子、至少约5,000个核酸条形码分子、至少约10,000个核酸条形码分子、至少约50,000个核酸条形码分子、至少约100,000个核酸条形码分子、至少约500,000个核酸条形码分子、至少约1,000,000个条形码分子、至少约5,000,000个核酸条形码分子、至少约10,000,000个核酸条形码分子、至少约100,000,000个核酸条形码分子、至少约1,000,000,000个核酸条形码分子。在一些情况下，多个核酸条形码分子包含分区特异性条形码序列。
多个核酸条形码分子中的每个核酸条形码分子可以包含与分区特异性条形码序列分开的标识符序列，其中标识符序列对于多个核酸分区特异性条形码分子中的每个核酸分区特异性条形码分子是不同的。在一些情况下，这种标识符序列是独特分子标识符(UMI)，如本文其他地方所述。如本文其他地方所述，UMI序列可以独特地鉴定被加条形码的特定核酸分子，这可以鉴定被分析的特定核酸分子，对被分析的特定核酸分子进行计数等。此外，在一些情况下，多个核酸条形码分子中的每个核酸条形码分子可以包含分区特异性条形码序列，并且珠粒可以来自多个珠粒，诸如一群加条形码的珠粒。每个分区特异性条形码序列可以不同于多个珠粒中的其他珠粒的核酸条形码分子的分区特异性条形码序列。在这种情况下，可以分析一群加条形码的珠粒，其中每个珠粒包含不同的分区特异性条形码序列。
多个核酸分子的核酸条形码分子可以用于产生“加条形码的核酸分子”。第一“加条形码的核酸分子”包含分区特异性条形码序列，并且还可以包含一个或多个附加条形码序列。在一些情况下，第一加条形码的核酸分子包含报告条形码序列。报告条形码序列可以鉴定第一聚糖基序、第二聚糖基序、第三聚糖基序、第四聚糖基序、第五聚糖基序、第六聚糖基序、第七聚糖基序、第八聚糖基序、第九聚糖基序或第十聚糖基序。在一些情况下，加条形码的分子包含聚糖组分报告序列。聚糖组分报告序列包含聚糖特异性或聚糖基序特异性报告条形码序列、组分特异性条形码序列，并且还可以包含夹板寡核苷酸序列。在一些情况下，加条形码的分子包含鉴定第二分析物的不同报告条形码序列。不同的报告条形码序列或分析物特异性条形码序列可以鉴定蛋白质、脂质、代谢物或其他第二分析物。
“聚糖基序特异性报告条形码序列”是分配给聚糖基序的条形码序列。第一聚糖基序特异性报告条形码序列是分配给第一聚糖基序的条形码序列；它可以用于鉴定第一聚糖基序的一个或多个实例。第二聚糖基序特异性报告条形码序列是分配给第二聚糖基序的条形码序列；它可以用于鉴定第二聚糖基序的一个或多个实例。第三聚糖基序特异性报告条形码序列是分配给第三聚糖基序的条形码序列；它可以用于鉴定第三聚糖基序的一个或多个实例。第四聚糖基序特异性报告条形码序列是分配给第四聚糖基序的条形码序列；它可以用于鉴定第四聚糖基序的一个或多个实例。第五聚糖基序特异性报告条形码序列是分配给第五聚糖基序的条形码序列；它可以用于鉴定第五聚糖基序的一个或多个实例。第六聚糖基序特异性报告条形码序列是分配给第六聚糖基序的条形码序列；它可以用于鉴定第六聚糖基序的一个或多个实例。第七聚糖基序特异性报告条形码序列是分配给第七聚糖基序的条形码序列；它可以用于鉴定第七聚糖基序的一个或多个实例。第八聚糖基序特异性报告条形码序列是分配给第八聚糖基序的条形码序列；它可以用于鉴定第八聚糖基序的一个或多个实例。第九聚糖基序特异性报告条形码序列是分配给第九聚糖基序的条形码序列；它可以用于鉴定第九聚糖基序的一个或多个实例。第十聚糖基序特异性报告条形码序列是分配给第十聚糖基序的条形码序列；它可以用于鉴定第十聚糖基序的一个或多个实例。应当理解，聚糖基序特异性报告条形码序列还可以包含附加的独特分子鉴定序列，其区分聚糖基序特异性报告条形码序列的每个原始实例。
加条形码的核酸分子的“衍生物”是指加条形码的核酸分子的扩增产物、逆转录产物和互补序列。
确定核酸分子的序列的方法可以包括测序。在一些实施方案中，测序是高通量测序。测序方法包括但不限于由系统进行的测序，该系统诸如为IlluminaTM、PacificBiosciences(PacBioTM)、Oxford NanoporeTM或Life Technologies(Ion TorrentTM)的测序系统。另选地或此外，测序可以使用核酸扩增、聚合酶链反应(PCR)(例如数字PCR、定量PCR或实时PCR)或等温扩增来执行。一些测序系统提供测序读段(本文也称为“读段”)。
如本文所用，术语“珠粒”一般是指颗粒。珠可以是固体或半固体颗粒。珠粒可以是凝胶珠粒。凝胶珠粒可以包括聚合物基质(例如，通过聚合或交联形成的基质)。聚合物基质可以包括一种或多种聚合物(例如，具有不同官能团或重复单元的聚合物)。聚合物基质中的聚合物可以随机排列，诸如在无规共聚物中。交联可以经由共价、离子或诱导相互作用或者物理缠结实现。珠粒可以是大分子。珠粒可以由结合在一起的核酸分子形成。珠粒可以经由分子(例如，大分子)诸如单体或聚合物的共价或非共价组装形成。此类聚合物或单体可以是天然的或合成的。此类聚合物或单体可以是或包括例如核酸分子(例如，DNA或RNA)。珠可以由聚合材料形成。珠粒可以是磁性的或非磁性的。珠粒可以是刚性的。珠粒可以是柔性的和/或可压缩的。珠粒可以是可破坏的或可溶解的。半固体珠粒可以是脂质体珠粒。珠粒可以是覆盖有包含一种或多种聚合物的涂层的固体颗粒(例如，基于金属的颗粒，包括但不限于氧化铁、金或银)。此类涂层可以是可破坏的或可溶解的。
“分析加工步骤”是指由人有意执行或直接或间接引起由人执行的加工步骤。分析加工步骤包括但不限于过程、反应、实验步骤、孵育、暴露于感兴趣的试剂、分区裂解、细胞裂解、过滤、分离和其他实验或分析过程。“代谢加工步骤”是指发生在细胞、细胞外基质或病毒内的反应。
“感兴趣的组分”是指任何类型的生物或生物反应性分子。感兴趣的组分可以选自由以下物质组成的组但不限于以下物质：蛋白质、聚糖、糖、核苷酸糖或合成核苷酸糖。感兴趣的组分可以位于与感兴趣的聚糖相同的细胞上、不同的细胞上或细胞外环境中。感兴趣的组分可以是瞬时可用的或组成性可用的。如果感兴趣的组分是瞬时可用的，则它的存在可能是由已知的刺激或未定的刺激引起的。应当理解，包括代谢、通讯和疾病或障碍过程在内的细胞过程可以改变感兴趣的组分的可用性。
“分析物”是指生物分子。分析物包括但不限于DNA分析物、RNA分析物、寡核苷酸、报告分子、被配置为直接偶联到蛋白质的报告分子、被配置为间接偶联到蛋白质的报告分子、被配置为直接偶联到代谢物的报告分子以及被配置为间接偶联到代谢物的报告分子。
“结合序列”是指能够结合于分析物的核酸序列。
“接近”是指感兴趣的分子现在或曾经在物理上彼此足够接近，使得当包含报告条形码序列的第一报告分子连接到第一感兴趣的分子，并且包含报告条形码序列的第二报告分子连接到第二感兴趣的分子时，在存在夹板的情况下，第一报告分子上的报告条形码序列和第二报告分子上的报告条形码序列可以连接在一起。在一个方面，第一感兴趣的分子是聚糖，并且第二感兴趣的分子是感兴趣的组分。例如，所述方法可以涉及聚糖特异性分子和组分特异性分子，该聚糖特异性分子包含具有聚糖特异性报告条形码序列的报告寡核苷酸，并且该组分特异性分子包含具有组分特异性条形码序列的寡核苷酸。所述方法可以涉及提供夹板，并且用包含聚糖特异性报告条形码序列的寡核苷酸和包含组分特异性条形码的寡核苷酸进行连接反应，以产生聚糖组分报告序列。已经认识到，任一报告分子的大小、任一条形码序列的长度、任何接头区域(如果存在)的大小和柔性以及夹板的长度都可能影响被认为彼此“接近”的两个分子之间的实际距离。应当理解，感兴趣的分子可以存在于相同的细胞上、相邻的细胞上、细胞周围和细胞上的细胞外环境中、相同的细胞器或细胞组分上或中、以及相同细胞内单独的细胞器或细胞组分上或中。
每个聚糖特异性分子能够以优先方式偶联、连接、结合或联接到感兴趣的聚糖或感兴趣的聚糖基序。如本文所用，“以优先方式”意指与感兴趣的分子的偶联、连接、结合或联接比与另一分子的偶联、连接、结合或联接多至少2％、至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少100％或更多。聚糖特异性分子与感兴趣的聚糖或聚糖基序的偶联、连接、结合或联接可以比与不同聚糖或聚糖基序的偶联、连接、结合或联接多至少2％、至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少100％或更多。聚糖特异性分子可以包括但不限于聚糖特异性凝集素、聚糖特异性抗体、合成核苷酸糖、合成糖和失活的聚糖特异性转移酶。感兴趣的聚糖和聚糖基序包括但不限于O-GlcNAc残基、含LacNac的聚糖、含Fuc-α1,2-Gal的聚糖、含Galβ1-3GalNAc的聚糖、GlcNAc-O-R、Neu5Acα2-3Gal和GalTIY289L。
组分特异性分子能够以优先方式偶联、连接、结合或联接到感兴趣的组分。感兴趣的组分可以是但不限于蛋白质、聚糖、聚糖基序、糖、核苷酸糖和合成核苷酸糖。组分特异性分子可以包括但不限于抗体、凝集素、合成核苷酸糖、核苷酸糖和合成糖。
夹板是能够结合两个寡核苷酸的连接分子。夹板分子可以包括但不限于核酸分子、寡核苷酸、三唑和具有核苷酸条形码序列的寡核苷酸。
术语“独特分子标识符”、“独特分子鉴定序列”、“UMI”和“UMI序列”同义使用。在任何给定的分区内，单独的加条形码的分子可以包含共同条形码序列，诸如分区特异性序列。加条形码的分子可以在独特分子鉴定序列段中进一步变化。
通过评估特定于单独聚糖、聚糖类别或聚糖基序或一组聚糖、聚糖类别或聚糖基序的独特标识符，提供了将特征归属于单独聚糖、聚糖类别或聚糖基序的能力。可以将核酸条形码形式的独特标识符分配给聚糖、聚糖基序或聚糖类别或聚糖、聚糖基序或聚糖类别的群体或与之相关联。然后，这些独特标识符可以用于将聚糖、聚糖基序归属于单独生物颗粒或生物颗粒组。核酸分子被分隔，使得在给定分区中的核酸分子之间时，包含在其中的分区特异性条形码序列是相同的，但是在不同分区之间时，核酸分子可以并且确实具有不同的条形码序列，或者至少代表在给定分析中所有分区中的大量不同的条形码序列。在一些方面，仅一个分区特异性条形码序列与给定分区相关联，但在一些方面，可以存在两个或更多个不同的条形码序列。
实施例
实施例1.使用化学酶法聚糖标记的糖组的单细胞谱分析
本实施例说明了用于单细胞谱分析的聚糖化学酶法标记过程，以用于检测在细胞信号传导和疾病状态中起着重要作用的外周高阶聚糖。
化学酶法标记用于检测用特定连接的单糖构件标记的独特类别的高阶聚糖。化学酶法标记在与多模态单细胞谱分析技术结合时允许检测高阶聚糖，诸如粘蛋白O连接的聚糖、唾液酸化聚糖、岩藻糖基化聚糖和胞质O-GlcNAc糖基化蛋白。化学酶法标记需要带有化学反应标签的单糖构件。当被细胞吸收和代谢时，修饰的单糖被掺入到细胞表面的糖缀合物中。可以使用的修饰的单糖的实例是UDP-GalNAc；GDP-岩藻糖；或CMP-唾液酸。然后，生物正交化学标签允许与荧光探针共价缀合以用于可视化，与亲和探针共价缀合以用于富集和糖组学分析，或与寡核苷酸条形码共价缀合以用于单细胞谱分析。
本文所公开的方法使用小分子探针检测细胞表面多糖，诸如II型N-乙酰乳糖胺(LacNAc,Gal(pi,4)GlcNAc)以产生活化的和化学标记的糖；并且依赖于聚糖转移酶(例如，1,3岩藻糖基转移酶；GalT1(β1-4半乳糖基转移酶)；α1-3 FucT(α1-3岩藻糖基转移酶3)；BgtA(人血型A抗原糖基转移酶)；WbwK(α1-2岩藻糖基转移酶)；BgtA；CgtA(β1-4N-乙酰半乳糖氨基转移酶)；ST6Gal1(β半乳糖苷α2-6唾液酸转移酶1)；ST3Gal1(β半乳糖苷α2-3唾液酸转移酶1))将活化的和化学标记的糖(例如岩藻糖)转移到多糖(例如LacNAc残基)。附加的目标多糖是GlcNAc-O-R；LacNAc；Fucα1-2Gal；Galβ1-3GalNAc；Neu5Acα2-3Gal；N-聚糖(例如，LacNAc)；或O-聚糖(例如，主要是核心1和2聚糖)。聚糖转移酶可以是内源酶或对特定类型的聚糖具有更高特异性的基因工程酶。
随后在活细胞中使用双正交化学反应将新标记的糖缀合物(例如糖蛋白)连接到寡核苷酸条形码。双正交化学反应包括与生物相容的铜催化叠氮化物-炔烃环加成(CuAAC)或无铜点击化学偶联的叠氮化物官能化的或环辛炔官能化的寡核苷酸条形码。双正交化学反应是本领域技术人员已知的。参见例如Soriano del Amo等人,J Am Chem Soc.132:16893–16899(2010)；Jewett JC等人,Chem Soc Rev.39:1272–1279(2010)；以及Zheng等人,Angew Chem Int Ed Engl.50(18):4113–4118(2011)。然后，使用本文所公开的方法和本领域已知的方法，制备包含标记的糖缀合物的细胞以用于单细胞谱分析。细胞可以是野生型细胞或经工程改造以表达工程糖基转移酶的细胞。
制备标志分子，该标志分子包含核苷酸糖和反应对的第一反应性分子。将标志分子和第一聚糖特异性转移酶与样品一起孵育。聚糖特异性转移酶使用包含核苷酸糖和第一反应性分子的标志分子作为底物，并将核苷酸糖掺入到聚糖中。反应对的第一反应性分子在掺入到聚糖中后仍连接到核苷酸糖。将样品与报告分子一起孵育，该报告分子包含反应对的第二反应性分子和聚糖基序特异性报告条形码序列。反应对的第二反应性分子与反应对的第一反应性分子偶联，该第一反应性分子连接到聚糖中的核苷酸糖。通过用缓冲液洗涤三次来去除未结合的报告分子。
将样品分隔到多个珠粒中，使得每个珠粒包含单细胞和具有分区特异性条形码序列的多个核酸条形码分子。报告分子上的报告寡核苷酸和多个核酸条形码分子中的一个核酸条形码分子产生第一加条形码的核酸分子。第一加条形码的核酸分子包含分区特异性条形码序列或其互补序列和报告条形码序列或其互补序列。确定加条形码的核酸分子的序列，并鉴定分区特异性条形码序列和报告条形码序列。鉴定的分区特异性条形码序列和报告条形码序列用于反向确定细胞中至少一种聚糖的存在。还确定了至少一种聚糖或聚糖基序的丰度。
该实验的结果将提供关于许多聚糖的单细胞谱分析的信息，这些聚糖包括但不限于含O-GlcNAc的聚糖、含II型LacNAc的聚糖；含Fucα1-2Gal的聚糖；含末端Galβ1-3GalNAc的聚糖；含Neu5Acα2-3Gal的聚糖。各种肼/酮和炔烃/叠氮化物对与不同特征寡核苷酸条形码的生物正交连接将允许使用本文所公开的多模态单细胞测序技术同时鉴定各种聚糖。为了检测含GlcNAc-O-R的聚糖，将使用过表达β1-4半乳糖基转移酶(GalT1)的细胞和非天然UDP-GalNAc。为了检测含LacNAc的聚糖，将使用α1-3岩藻糖基转移酶3(α1-3 FucT)和非天然GDP-岩藻糖。为了检测含Fucα1-2Gal的聚糖，将使用人血型A抗原糖基转移酶(BgtA)和非天然UDP-GalNAc。为了检测含Galβ1-3GalNAc的聚糖，将使用α1-2岩藻糖基转移酶(WbwK或BgtA)和非天然GDP-岩藻糖或UDP-GalNAc。为了检测含Neu5Acα2-3Gal的聚糖，将使用β1-4N-乙酰氨基半乳糖转移酶(CgtA)和非天然UDP-GalNAc。为了检测N-聚糖，将使用β半乳糖苷α2-6唾液酸转移酶1(ST6Gal1)和非天然CMP-唾液酸(CMP-Sia)。为了检测O-聚糖，将使用β半乳糖苷α2-3唾液酸转移酶1(ST3Gal1)和非天然CMP-Sia。该结果将提供在生理条件下单细胞糖基化模式的全面概况，具有比本领域已知的传统方法更高的特异性和灵敏度。
实施例2.用于单细胞谱分析的聚糖代谢标记
该实施例说明了寡糖的代谢标记，以检测各种糖基化蛋白质或脂质，包括但不限于活细胞中唾液酸化的、岩藻糖基化的和/或粘蛋白型O连接的聚糖。
在允许包含合成糖和叠氮化物的标志分子被细胞吸收的条件下，将活细胞样品与标志分子一起孵育。标志分子是活细胞的糖基转移酶的标志底物。标志分子可以是唾液酸前体全乙酰化N-α-叠氮乙酰甘露糖胺(Ac4ManNAz)；全乙酰化N-叠氮乙酰半乳糖胺(Ac4GalNAz)；GalNAc的叠氮类似物(Ac4GalNAz)；N-丙酰基甘露糖胺(ManNProp)、N-丁酰基甘露糖胺(ManNBut)；N-戊酰基甘露糖胺(ManNPent)N-乙酰甘露糖胺(ManNAc)类似物；岩藻糖类似物；唾液酸类似物、GlcNAc类似物；非天然唾液酸类似物；非天然甘露糖类似物；非天然半乳糖类似物；非天然N-乙酰葡糖胺类似物；或N-乙酰半乳糖胺类似物。附加的非天然类似物是本领域技术人员已知的，例如，Mbua等人,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.110:10207-10212(2013)。每种类似物可以按约25μM使用，并且细胞最多孵育2天。孵育期后，用缓冲液洗涤细胞三次。糖基转移酶将合成糖和叠氮化物(标志底物或非天然类似物)掺入到聚糖中。将细胞与报告分子一起孵育，该报告分子包含炔烃和具有聚糖基序特异性报告条形码序列的报告寡核苷酸。用缓冲液洗涤细胞三次，以去除未结合的报告分子。在细胞中，叠氮化物和炔烃偶联，从而间接用报告寡核苷酸标记聚糖。将样品分隔到多个细胞珠粒中，使得多个细胞珠粒包含来自样品的一个细胞和具有分区特异性条形码序列的多个核酸条形码分子。每种标记的聚糖将被编码有一个独特的聚糖基序特异性报告条形码序列。细胞珠粒被包封到包含连接酶的液滴中。将报告寡核苷酸和具有分区特异性条形码的核酸条形码分子连接在一起。对加条形码的核酸分子进行测序，以鉴定分区特异性条形码序列和聚糖基序特异性报告条形码序列。鉴定的分区特异性条形码序列和报告条形码序列用于反向确定细胞中至少一种聚糖的存在。还确定了至少一种聚糖或聚糖基序的丰度。
预期用这些非天然单糖前体处理细胞将导致含有该非天然单糖的细胞表面聚糖的普遍标记。单细胞谱分析将提供每个细胞的糖组谱。此外，单细胞谱分析将基于单细胞水平的可测序读出来提供细胞表面上的每种聚糖的丰度。此外，预期结果将鉴定和区分具有独特糖基化谱的细胞亚群。
实施例3.蛋白质特异性糖基化分析
该实施例说明了使用多模态单细胞谱分析方法对蛋白质特异性糖基化模式的分析。
蛋白质糖基化是真核蛋白质的最普遍的修饰之一，因为据估计超过50％的所有真核蛋白质被糖基化。存在两种主要形式的蛋白质糖基化模式：N连接的和O连接的糖基化。蛋白质的糖基化模式依赖于该蛋白质来源的组织，并反映细胞的状态。此外，异常糖基化与包括癌症发展和进展在内的几种疾病相关。糖基化也影响许多蛋白质的生物活性。例如，许多抗体的活性依赖于抗体的糖基化模式。O-聚糖改变，诸如截短的O-聚糖表位唾液酸Tn(STn)的表达，参与癌症发展和进展。此外，细胞粘附分子(诸如E-钙粘蛋白)的活性受到糖基化的影响。改变E-钙粘蛋白中的分支N-聚糖结构，或在E-钙粘蛋白上添加β1,6GlcNAc分支聚糖，会扰乱蛋白质的正常功能并促进肿瘤细胞发展和进展。相反，E-钙粘蛋白中平分型N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)N-聚糖的存在会抑制E-钙粘蛋白介导的癌症进展并防止上皮-间质转化过程。
将样品与聚糖基序特异性分子一起孵育，该聚糖基序特异性分子包含具有聚糖基序特异性报告条形码序列的报告寡核苷酸。提供了感兴趣的组分的抗体；抗体偶联到具有组分特异性条形码序列的寡核苷酸。将样品洗涤三次，以去除未掺入的聚糖基序特异性分子和未掺入的组分特异性分子。向样品提供夹板。进行连接反应。将聚糖基序特异性报告条形码序列和组分特异性条形码序列连接在一起，产生聚糖组分报告序列。将样品分隔到多个珠粒中。聚糖组分报告序列和具有分区特异性条形码序列的核酸条形码分子形成加条形码的分子。
单细胞谱分析通过提供单细胞中蛋白质特异性糖基化状态的全面概况，提供了对该单细胞中糖基化蛋白质的灵敏和特异性检测。本文所公开的方法优于本领域已知的方法，因为它提供了三重识别系统，用于检测生理条件下的单细胞中的蛋白质及其翻译后修饰。本文所公开的方法是邻位连接测定(PLA)的优化版本，PLA是一种开发用于通过DNA连接和信号放大来检测蛋白质分子的免疫测定。当与单细胞谱分析结合时，与单独的PLA相比，这种优化的PLA测定具有高度特异性和灵敏度。如本文所公开的蛋白质特异性糖基化的检测可以用于鉴定疾病生物标志物，并将提供与健康和患病的特定细胞类型相关的翻译后修饰及蛋白质糖基化模式相关变化的前所未有的知识。
等同物
本技术不受本申请中描述的特定实施方案的限制，这些实施方案旨在作为本技术的单独方面的单一说明。对于本领域技术人员来说显而易见的是，在不脱离本技术的精神和范围的情况下，可以对本技术进行许多修改和变化。根据前面的描述，除了本文列举的那些之外，本技术的范围内的功能等同的方法和设备对于本领域技术人员来说将是显而易见的。此类修改和变化旨在落入本技术的范围内。应当理解，本技术不限于特定的方法、试剂、化合物组合物或生物系统，它们当然可以变化。还应当理解，本文使用的术语仅用于描述特定实施方案的目的，而不旨在是限制性的。
此外，在根据马库什组描述本公开的特征或方面的情况下，本领域技术人员将认识到，本公开也因此根据马库什组的任何单独成员或成员的亚组来描述。
如本领域技术人员将理解的，对于任何和所有目的，特别是在提供书面描述方面，本文所公开的所有范围也涵盖任何和所有可能的子范围及其子范围的组合。任何列出的范围都可以容易地被识别为充分地描述了相同的范围并且使得相同的范围能够被分成至少相等的二份、三份、四份、五份、十份等。作为一个非限制性实例，本文所讨论的每个范围可以容易地被分成下三分之一、中间三分之一和上三分之一等。本领域技术人员还将理解，诸如“多达”、“至少”、“大于”、“小于”等所有用语都包括所列举的数字，并且是指可以随后被分成如上所述的子范围的范围。最后，如本领域技术人员将理解的，范围包括每个单独的成员。因此，例如，具有1至3个细胞的组是指具有1、2或3个细胞的组。类似地，具有1至5个细胞的组是指具有1、2、3、4或5个细胞的组，等等。
以引用方式并入
本说明书中提到的所有出版物、专利和专利申请都全文以引用的方式并入本文，其程度与具体地且单独地指示每个单独出版物、专利或专利申请以引用的方式并入相同。

Claims (102)

1.一种确定样品中一种或多种聚糖的存在的方法，包括以下步骤：
(a)将所述样品与(i)包含核苷酸糖和反应对的第一反应性分子的第一标志分子及(ii)第一聚糖特异性转移酶一起孵育，其中所述第一标志分子被掺入到所述样品中的聚糖修饰的糖蛋白上；
(b)将所述样品与第一报告分子混合，所述第一报告分子包含(i)反应对的第二反应性分子和(ii)具有第一聚糖基序特异性报告条形码序列的第一报告寡核苷酸，其中所述第一报告分子经由所述第一标志分子缀合在所述聚糖修饰的糖蛋白上；
(c)从所述样品中去除未掺入的报告分子；
(d)将所述样品分隔到多个分区中，使得一个分区包含(i)来自所述样品的单细胞或单细胞裂解物和(ii)具有分区特异性条形码序列的多个核酸条形码分子；以及
(e)使用所述第一报告寡核苷酸和所述多个核酸条形码分子中的一个核酸条形码分子来产生第一加聚糖条形码的核酸分子，所述第一加聚糖条形码的核酸分子包含所述分区特异性条形码序列或其互补序列和所述第一聚糖基序特异性报告条形码序列或其互补序列。
2.根据权利要求1所述的方法，还包括：
(a)确定所述第一加聚糖条形码的核酸分子或其衍生物的所述序列，以鉴定(i)所述分区特异性条形码序列或其互补序列和(ii)所述第一聚糖基序特异性报告条形码序列或其互补序列；和/或
(b)使用所述鉴定的分区特异性条形码序列或其互补序列和所述鉴定的第一聚糖基序特异性报告条形码序列或其互补序列来确定所述样品中至少一种聚糖的存在和/或丰度。
3.根据权利要求1或2所述的方法，还包括：
(a)将所述样品与(i)包含第二核苷酸糖和第二反应对的第一反应性分子的第二标志分子及(ii)第二聚糖特异性转移酶一起孵育，其中所述第二标志分子被掺入到所述样品中的聚糖修饰的糖蛋白上；以及
(b)将所述样品与第二报告分子混合，所述第二报告分子包含(i)第二反应对的第二反应性分子，其中所述第二反应性分子能够偶联到所述第二反应对的所述第一反应性分子，和(ii)具有鉴定第二聚糖基序的报告条形码序列的第二报告寡核苷酸，其中所述第二报告分子经由所述第二标志分子缀合在所述聚糖修饰的糖蛋白上。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，还包括：
(a)将所述样品与(i)包含第三核苷酸糖和第三反应对的第一反应性分子的第三标志分子及(ii)第三聚糖特异性转移酶一起孵育，其中所述第三标志分子被掺入到所述样品中的聚糖修饰的糖蛋白上；以及
(b)将所述样品与第三报告分子混合，所述第三报告分子包含(i)第三反应对的第二反应性分子，其中所述第二反应性分子能够偶联到所述第三反应对的所述第一反应性分子，和(ii)具有鉴定第三聚糖基序的报告条形码序列的第三报告寡核苷酸，其中所述第三报告分子经由所述第三标志分子缀合在所述聚糖修饰的糖蛋白上。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，还包括：
(a)将所述样品与(i)包含第四核苷酸糖和第四反应对的第一反应性分子的第四标志分子及(ii)第四聚糖特异性转移酶一起孵育，其中所述第四标志分子被掺入到所述样品中的聚糖修饰的糖蛋白上；以及
(b)将所述样品与第四报告分子混合，所述第四报告分子包含(i)第四反应对的第二反应性分子，其中所述第二反应性分子能够偶联到所述第四反应对的所述第一反应性分子，和(iii)具有鉴定第四聚糖基序的报告条形码序列的第四报告寡核苷酸，其中所述第四报告分子经由所述第四标志分子缀合在所述聚糖修饰的糖蛋白上。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其中所述样品选自由组织、细胞、固定细胞、活细胞和细胞裂解物组成的组。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其中多个分区接收来自所述样品的单细胞。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其中来自单细胞的裂解物被包封在细胞珠粒中，包被在细胞珠粒上，包埋在细胞珠粒中，或它们的任何组合。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的方法，还包括以下步骤：
(a)提供多个细胞珠粒，所述多个细胞珠粒包含细胞和报告寡核苷酸序列，所述报告寡核苷酸序列包含鉴定聚糖基序的报告条形码序列；以及
(b)使所述多个细胞珠粒经受足以裂解所述细胞的条件。
10.根据权利要求10所述的方法，其中所述足以裂解所述细胞的条件包括使所述细胞珠粒与裂解剂接触。
11.根据权利要求1至10中任一项所述的方法，其中：
(a)所述第一聚糖特异性转移酶、所述第二聚糖特异性转移酶、所述第三聚糖特异性转移酶或所述第四聚糖特异性转移酶选自由以下物质组成的组：β1-4半乳糖基转移酶、糖基转移酶、唾液酸转移酶、α1-3-岩藻糖基转移酶；人血型A抗原糖基转移酶(BgtA)；WbwK岩藻糖基转移酶；α1-2-岩藻糖基转移酶；β1-4N-乙酰氨基半乳糖转移酶；β-半乳糖苷α2-6唾液酸转移酶1；以及β-半乳糖苷α2-3唾液酸转移酶1；ST3Gal1；ST6Gal1；和CgtA；和/或
(b)所述第一标志分子、所述第二标志分子、所述第三标志分子或所述第四标志分子选自由以下物质组成的组：UDP-GalNAc；GDP-岩藻糖；UDP-GalNAc；和CMP-Sia；和/或
(c)所述聚糖修饰的糖蛋白包含选自由以下物质组成的组的聚糖：GlcNAc-O-R；LacNAc；Fucα1-2Gal；Galβ1-3GalNAc；Neu5Acα2-3Gal；N-聚糖；和O-聚糖。
12.根据权利要求3所述的方法，还包括以下步骤：
(a)使用所述第二报告寡核苷酸和所述多个核酸条形码分子中的所述核酸条形码分子来产生第二加聚糖条形码的核酸分子，所述第二加聚糖条形码的核酸分子包含所述分区特异性条形码序列或其互补序列和所述第二聚糖基序特异性报告条形码序列或其互补序列；
(b)确定所述第二加聚糖条形码的核酸分子或其衍生物的所述序列，以鉴定(i)所述分区特异性条形码序列或其互补序列和(ii)所述第二聚糖基序特异性报告条形码序列或其互补序列；以及
(c)使用所述鉴定的分区特异性条形码序列或其互补序列和所述鉴定的第二聚糖基序特异性报告条形码序列或其互补序列来确定所述样品中第一聚糖和第二聚糖的存在和/或丰度。
13.根据权利要求4所述的方法，还包括以下步骤：
(a)使用所述第三报告寡核苷酸和所述多个核酸条形码分子中的所述核酸条形码分子来产生第三加聚糖条形码的核酸分子，所述第三加聚糖条形码的核酸分子包含所述分区特异性条形码序列或其互补序列和所述第三聚糖基序特异性报告条形码序列或其互补序列；
(b)确定所述第三加聚糖条形码的核酸分子或其衍生物的所述序列，以鉴定(i)所述分区特异性条形码序列或其互补序列和(ii)所述第三聚糖基序特异性报告条形码序列或其互补序列；以及
(c)使用所述鉴定的分区特异性条形码序列或其互补序列和所述鉴定的第三聚糖基序特异性报告条形码序列或其互补序列来确定所述样品中第一聚糖、第二聚糖基序和第三聚糖的存在和/或丰度。
14.根据权利要求5所述的方法，还包括以下步骤：
(a)使用所述第四报告寡核苷酸和所述多个核酸条形码分子中的所述核酸条形码分子来产生第四加聚糖条形码的核酸分子，所述第四加聚糖条形码的核酸分子包含所述分区特异性条形码序列或其互补序列和所述第四聚糖基序特异性报告条形码序列或其互补序列；
(b)确定所述第四加条形码的核酸分子或其衍生物的所述序列，以鉴定(i)所述分区特异性条形码序列或其互补序列和(ii)所述第四聚糖基序特异性报告条形码序列或其互补序列；以及
(c)使用所述鉴定的分区特异性条形码序列或其互补序列和所述鉴定的第四聚糖基序特异性报告条形码序列或其互补序列来确定所述样品中所述第一聚糖、所述第二聚糖、所述第三聚糖和所述第四聚糖的存在和/或丰度。
15.根据权利要求1至14中任一项所述的方法，其中：
(a)所述第一聚糖特异性转移酶、所述第二聚糖特异性转移酶、所述第三聚糖特异性转移酶或所述第四聚糖特异性转移酶是所述β1-4半乳糖基转移酶，所述第一标志分子、所述第二标志分子、所述第三标志分子或所述第四标志分子是UDP-GalNAc；并且所述聚糖修饰的糖蛋白上的所述聚糖包含GlcNAc-O-R；
(b)所述第一聚糖特异性转移酶、所述第二聚糖特异性转移酶、所述第三聚糖特异性转移酶或所述第四聚糖特异性转移酶是所述α1-3-岩藻糖基转移酶，所述第一标志分子、所述第二标志分子、所述第三标志分子或所述第四标志分子是GDP-岩藻糖；并且所述聚糖修饰的糖蛋白上的所述聚糖包含LacNAc；
(c)所述第一聚糖特异性转移酶、所述第二聚糖特异性转移酶、所述第三聚糖特异性转移酶或所述第四聚糖特异性转移酶是所述人血型A抗原糖基转移酶(BgtA)，所述第一标志分子、所述第二标志分子、所述第三标志分子或所述第四标志分子是UDP-GalNAc；并且所述聚糖修饰的糖蛋白上的所述聚糖包含Fucα1-2Gal；
(d)所述第一聚糖特异性转移酶、所述第二聚糖特异性转移酶、所述第三聚糖特异性转移酶或所述第四聚糖特异性转移酶是所述α1-2-岩藻糖基转移酶，所述第一标志分子、所述第二标志分子、所述第三标志分子或所述第四标志分子是GDP-岩藻糖；并且所述聚糖修饰的糖蛋白上的所述聚糖包含Galβ1-3GalNAc；
(e)所述第一聚糖特异性转移酶、所述第二聚糖特异性转移酶、所述第三聚糖特异性转移酶或所述第四聚糖特异性转移酶是β1-4N-乙酰氨基半乳糖转移酶，所述第一标志分子、所述第二标志分子、所述第三标志分子或所述第四标志分子是UDP-GalNAc；并且所述聚糖修饰的糖蛋白上的所述聚糖包含Neu5Acα2-3Gal；
(f)所述第一聚糖特异性转移酶、所述第二聚糖特异性转移酶、所述第三聚糖特异性转移酶或所述第四聚糖特异性转移酶是β-半乳糖苷α2-6唾液酸转移酶1，所述第一标志分子、所述第二标志分子、所述第三标志分子或所述第四标志分子是CMP-Sia；并且所述聚糖修饰的糖蛋白上的所述聚糖是所述N-聚糖；
(g)所述第一聚糖特异性转移酶、所述第二聚糖特异性转移酶、所述第三聚糖特异性转移酶或所述第四聚糖特异性转移酶是β-半乳糖苷α2-3唾液酸转移酶1，所述第二标志分子、所述第三标志分子或所述第四标志分子是CMP-Sia；并且所述聚糖修饰的糖蛋白上的所述聚糖是所述O-聚糖；
(h)所述第一聚糖特异性转移酶是β1-4半乳糖基转移酶；所述第二聚糖特异性转移酶是α1-3-岩藻糖基转移酶；并且所述第三聚糖特异性转移酶是β-半乳糖苷α2-3唾液酸转移酶1；
(i)所述第一聚糖特异性转移酶对UDP-GalNAc具有特异性；所述第二聚糖特异性转移酶对GDP-岩藻糖具有特异性；并且所述第三聚糖特异性转移酶对CMP-Sia具有特异性；或
(j)所述第一聚糖特异性转移酶、所述第二聚糖特异性转移酶、所述第三聚糖特异性转移酶或所述第四聚糖特异性转移酶对以下物质具有特异性：GlcNAc-O-R；LacNAc；Fucα1-2Gal；Galβ1-3GalNAc；Neu5Acα2-3Gal；N-聚糖；或O-聚糖。
16.一种确定包含一个或多个活细胞的样品中一种或多种聚糖的存在的方法，包括以下步骤：
(a)将所述样品与标志分子一起孵育，所述标志分子包含合成糖和反应对的第一反应性分子，其中(i)所述标志分子是所述一个或多个活细胞的一种或多种糖基转移酶的标志底物，(ii)所述标志分子在所述样品的一个或多个活细胞中掺入并加工以产生所述一个或多个活细胞的一种或多种糖基转移酶的一种或多种标志底物，以及(iii)所述标志底物包含所述第一反应性分子；
(b)将所述样品与报告分子混合，所述报告分子包含(i)所述反应对的第二反应性分子和(ii)具有聚糖基序特异性报告条形码序列的报告寡核苷酸，其中所述报告分子经由所述标志分子缀合在所述聚糖修饰的糖蛋白上；
(c)去除未掺入的报告分子；
(d)将所述样品和多个核酸条形码分子分隔到多个分区中，使得所述多个分区中的一个分区包含来自所述样品的一个细胞和具有分区特异性条形码序列的多个核酸条形码分子；以及
(e)使用所述报告寡核苷酸和所述核酸条形码分子来产生加聚糖条形码的核酸分子，所述加聚糖条形码的核酸分子包含所述分区特异性条形码序列或其互补序列和所述聚糖基序特异性报告条形码序列或其互补序列。
17.根据权利要求16所述的方法，还包括：
(a)确定所述加聚糖条形码的核酸分子或其衍生物的序列，以鉴定(i)所述分区特异性条形码序列或其互补序列和(ii)所述聚糖基序特异性报告条形码序列或其互补序列；以及任选地
(b)还包括使用所述鉴定的分区特异性条形码序列或其互补序列和所述鉴定的聚糖基序特异性报告条形码序列或其互补序列来确定所述样品中至少一种聚糖的存在和/或丰度。
18.根据权利要求16至17中任一项所述的方法：
(a)还包括在将所述样品与包含所述反应对的第二反应性分子的报告分子一起孵育之前去除未掺入的标志分子的步骤；和/或
(b)其中所述一种或多种糖基转移酶对于所述一个或多个活细胞是内源的或异源的；和/或
(c)其中所述合成糖被乙酰化；和/或
(d)其中将所述样品与所述标志分子一起孵育的持续时间选自包括约1秒至约30秒、约30秒至约1分钟、约1分钟至约10分钟、约5分钟至约60分钟以及约1小时至约12小时的范围的组。
19.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中：
(a)所述反应对选自由以下物质组成的反应对的组：叠氮化物和炔烃、叠氮化物和膦、醛和氨氧基、醛和肼、醛和酰肼、酮和氨氧基、肼和酮、环丙烯和四嗪、降冰片烯和四嗪、反式环辛烯和四嗪、炔烃和四嗪、硝酮和烯烃、硝酮和炔烃、重氮基和炔烃以及异腈和四嗪；和/或
(b)反应对的所述第二反应性分子能够偶联到所述反应对的所述第一反应性分子。
20.根据权利要求16至19中任一项所述的方法，其中所述合成糖：
(a)选自由以下物质组成的组：半乳糖、唾液酸、岩藻糖、甘露糖、N-乙酰甘露糖胺和N-乙酰半乳糖胺；和/或
(b)被掺入到选自由以下物质组成的组的聚糖中：唾液酸化聚糖；岩藻糖基化聚糖；胞质O-GlcNAc糖基化；和粘蛋白型O连接的聚糖；和/或
(c)是聚糖类别特异性的；和/或
(d)是聚糖基序特异性。
21.一种检测单细胞中的蛋白质特异性糖基化模式的方法，所述方法包括：
(a)将多个细胞与聚糖基序特异性分子一起孵育，所述聚糖基序特异性分子包含缀合到聚糖基序特异性报告条形码序列的报告寡核苷酸，其中所述聚糖基序特异性分子结合于糖蛋白上的聚糖；
(b)提供组分特异性分子，所述组分特异性分子包含缀合到组分特异性条形码序列的寡核苷酸，其中所述组分特异性分子结合于糖蛋白；
(c)去除未掺入的聚糖特异性分子和未掺入的组分特异性分子；
(d)执行连接反应，其中所述聚糖特异性报告条形码序列的所述寡核苷酸连接到所述组分特异性条形码序列的所述寡核苷酸以产生连接的聚糖组分报告序列，并且其中所述糖蛋白、所述聚糖基序特异性分子和所述组分特异性分子形成复合物；
(e)将所述多个细胞分隔到多个分区中，使得一个分区包含(i)来自所述样品的单细胞、单细胞裂解物、两个相邻细胞或两个相邻细胞的裂解物和(ii)具有分区特异性条形码序列的多个核酸条形码分子；以及
(f)扩增所述聚糖组分报告序列及所述多个核酸条形码分子之一以产生第一加条形码的核酸分子，所述第一加条形码的核酸分子包含所述聚糖组分报告序列或其互补序列和所述分区特异性条形码序列或其互补序列或其衍生物。
22.根据权利要求21所述的方法，其中：
(a)将所述多个细胞分隔在所述多个分区中发生在进行所述连接反应之前或之后；和/或
(b)当发生以下情形时产生所述连接的聚糖组分报告序列：
(i)所述聚糖基序特异性分子和所述组分特异性分子结合于相同的糖蛋白；或
(ii)所述聚糖基序特异性分子和所述组分特异性分子结合不同的糖蛋白，并且所述糖蛋白紧密接近。
23.根据权利要求22所述的方法，还包括：
(a)确定所述第一加条形码的核酸分子或其衍生物的所述序列，以鉴定(i)所述分区特异性条形码序列或其互补序列和(ii)所述聚糖组分报告条形码序列或其互补序列；和/或
(b)使用所述鉴定的分区特异性条形码序列或其互补序列和所述鉴定的聚糖组分报告条形码序列或其互补序列来鉴定所述蛋白质的所述聚糖和所述糖基化模式
24.根据权利要求21至23中任一项所述的方法，其中：
(a)在存在夹板寡核苷酸的情况下进行所述连接；和/或
(b)在存在夹板寡核苷酸的情况下进行所述连接，并且进一步其中所述夹板选自由三唑和核苷酸条形码夹板组成的组；和/或
(c)所述聚糖特异性分子选自由以下物质组成的组：(a)聚糖特异性凝集素；(b)聚糖特异性抗体；(c)合成核苷酸糖；(d)合成糖；以及(e)失活的聚糖特异性转移酶。
25.根据权利要求24所述的方法，还包括提供聚糖特异性转移酶。
26.根据权利要求21至25中任一项所述的方法，其中：
(a)所述组分特异性分子选自由抗体、凝集素、合成核苷酸糖、核苷酸糖和合成糖组成的组；和/或
(b)所述感兴趣的组分是蛋白质、聚糖、糖、核苷酸糖或合成核苷酸糖。
27.根据权利要求1至26中任一项所述的方法，其中：
(a)所述聚糖或所述聚糖基序选自由O-GlcNAc残基、含LacNac的聚糖、含Fuc-α1,2-Gal的聚糖、含Galβ1-3GalNAc的聚糖、GlcNAc-O-R、Neu5Acα2-3Gal和GalT1Y289L组成的组；和/或
(b)所述分区是液滴；和/或
(c)所述分区是孔；和/或
(d)所述多个核酸条形码分子的至少一个子集可释放地连接到凝胶珠粒；和/或
(e)所述多个核酸条形码分子的至少一个子集可释放地连接到凝胶珠粒，并且还包括在产生所述加条形码的核酸分子之前从所述凝胶珠粒释放所述核酸条形码分子。
28.根据权利要求1至27中任一项所述的方法，其中：
(a)一个分区中的所述多个核酸条形码分子还包含独特分子标识符(UMI)序列；和/或
(b)一个分区中的核酸条形码分子的所述UMI序列不同于所述分区中的另一个核酸条形码分子的所述UMI序列。
29.根据权利要求1至28中任一项所述的方法，其中：
(a)一个分区中的所述多个核酸条形码分子还包含功能序列；和/或
(b)一个分区中的所述多个核酸条形码分子还包含捕获序列；和/或
(c)一个分区中的所述多个核酸条形码分子还包含捕获序列，并且进一步其中所述捕获序列包含：
(i)模板转换寡核苷酸(TSO)序列；或
(ii)多聚T序列；和/或
(d)一个分区中的所述多个核酸条形码分子还包含捕获序列，并且进一步其中：
(i)所述捕获序列包含多聚T序列；以及
(ii)所述第二组分选自由DNA分析物、RNA分析物、蛋白质分析物、细胞特征、细胞表面特征和代谢物组成的组。
30.根据权利要求1至29中任一项所述的方法，其中所述分区还包含多个附加核酸条形码分子，所述多个附加核酸条形码分子包含所述分区特异性条形码序列和捕获序列，所述捕获序列能够结合于所述单细胞或单细胞裂解物的第二组分或与所述第二组分结合的附加报告分子的序列。
31.根据权利要求30所述的方法，其中：
(a)所述第二组分不是聚糖或聚糖基序；和/或
(b)所述附加报告分子被配置为偶联到蛋白质或代谢物；和/或
(c)所述附加报告分子被配置为偶联到蛋白质或代谢物，并且进一步其中所述附加报告分子包含附加报告寡核苷酸，所述附加报告寡核苷酸包含鉴定所述糖蛋白的不同报告条形码序列；和/或
(d)所述附加报告分子被配置为偶联到蛋白质或代谢物，并且进一步其中所述附加报告分子包含附加报告寡核苷酸，所述附加报告寡核苷酸包含鉴定所述聚糖的不同报告条形码序列。
32.根据权利要求29至31中任一项所述的方法，其中所述报告寡核苷酸还包含捕获柄，所述捕获柄包含与所述捕获序列互补的序列。
33.根据权利要求32所述的方法，其中：
(a)所述捕获柄包含与模板转换寡核苷酸(TSO)序列互补的序列；或
(b)所述捕获柄包含与多聚T序列互补的序列。
34.根据权利要求1至33中任一项所述的方法，其中所述聚糖选自由O连接的聚糖、N连接的聚糖、粘蛋白型O连接的聚糖、O连接的聚糖核心1和O连接的聚糖核心2组成的组。
35.一种确定样品中一种或多种聚糖的存在的方法，包括以下步骤：
(a)将所述样品与(i)包含核苷酸糖和反应对的第一反应性分子的标志分子及(ii)第一聚糖特异性转移酶一起孵育；
(b)将所述样品与报告分子一起孵育，所述报告分子包含(i)反应对的第二反应性分子和(ii)具有聚糖基序特异性报告条形码序列的报告寡核苷酸；
(c)从所述样品中去除未掺入的报告分子；
(d)将所述样品分隔到多个分区中，使得一个分区包含(i)来自所述样品的单细胞或单细胞裂解物和(ii)具有分区特异性条形码序列的多个核酸条形码分子；
(e)使用所述报告寡核苷酸和所述多个核酸条形码分子中的一个核酸条形码分子来产生第一加条形码的核酸分子，所述第一加条形码的核酸分子包含所述分区特异性条形码序列或其互补序列和所述报告条形码序列或其互补序列。
36.根据权利要求35所述的方法，还包括确定所述第一加条形码的核酸分子或其衍生物的所述序列，以鉴定(i)所述分区特异性条形码序列或其互补序列和(ii)所述报告条形码序列或其互补序列。
37.根据前述权利要求中任一项所述的方法，还包括使用所述鉴定的分区特异性条形码序列或其互补序列和所述鉴定的报告条形码序列或其互补序列来确定所述细胞中至少一种聚糖基序的存在和/或丰度。
38.根据前述权利要求中任一项所述的方法，还包括
(a)将所述样品与(i)包含第二核苷酸糖和第二反应对的第一反应性分子的第二标志分子及(ii)第二聚糖特异性转移酶一起孵育，以及
(b)将所述样品与第二报告分子一起孵育，所述第二报告分子包含(i)第二反应对的第二反应性分子，其中所述第二反应性分子能够偶联到所述第二反应对的所述第一反应性分子，和(ii)具有鉴定第二聚糖基序的报告条形码序列的第二报告寡核苷酸。
39.根据前述权利要求中任一项所述的方法，还包括
(a)将所述样品与(i)包含第三核苷酸糖和第三反应对的第一反应性分子的第三标志分子及(ii)第三聚糖特异性转移酶一起孵育，以及
(b)将所述样品与第三报告分子一起孵育，所述第三报告分子包含(i)第三反应对的第二反应性分子，其中所述第二反应性分子能够偶联到所述第三反应对的所述第一反应性分子，和
(ii)具有鉴定第三聚糖基序的报告条形码序列的第三报告寡核苷酸。
40.根据前述权利要求中任一项所述的方法，还包括
(a)将所述样品与(i)包含第四核苷酸糖和第四反应对的第一反应性分子的第四标志分子及(ii)第四聚糖特异性转移酶一起孵育，以及
(b)将所述样品与第四报告分子一起孵育，所述第四报告分子包含(i)第四反应对的第二反应性分子，其中所述第二反应性分子能够偶联到所述第四反应对的所述第一反应性分子，和(iii)具有鉴定第四聚糖基序的报告条形码序列的第四报告寡核苷酸。
41.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述样品选自包括组织、细胞、固定细胞、活细胞和细胞裂解物的组。
42.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中多个分区接收来自所述样品的单细胞。
43.根据权利要求35至41中任一项所述的方法，其中来自单细胞的裂解物被包封在细胞珠粒中。
44.根据权利要求35至41中任一项所述的方法，还包括以下步骤：
(a)提供多个细胞珠粒，所述多个细胞珠粒包含细胞和报告寡核苷酸序列，所述报告寡核苷酸序列包含鉴定聚糖基序的报告条形码序列，以及
(b)使所述多个细胞珠粒经受足以裂解所述细胞的条件。
45.根据权利要求44所述的方法，其中所述足以裂解所述细胞的条件包括使所述细胞珠粒与裂解剂接触。
46.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中聚糖特异性转移酶选自包括以下物质的组：糖基转移酶、唾液酸转移酶、α1,3-岩藻糖基转移酶；BGTA；WbwK岩藻糖基转移酶；α1,2-岩藻糖基转移酶；β1-4N-乙酰氨基半乳糖转移酶；β-半乳糖苷α2,6唾液酸转移酶1；以及β-半乳糖苷α2,3唾液酸转移酶1。
47.根据权利要求38所述的方法，还包括以下步骤：
(a)确定多个加条形码的核酸分子或其衍生物的所述序列以鉴定(i)所述分区特异性条形码序列或其互补序列和(ii)所述报告条形码序列或其互补序列；以及
(b)使用所述鉴定的分区特异性条形码序列或其互补序列和所述鉴定的报告条形码序列或其互补序列来确定所述细胞中第一聚糖基序和第二聚糖基序的存在和/或丰度。
48.根据权利要求39所述的方法，还包括以下步骤：
(a)确定多个加条形码的核酸分子或其衍生物的所述序列，以鉴定(i)所述分区特异性条形码序列或其互补序列和(ii)所述报告条形码序列或其互补序列；以及
(b)使用所述鉴定的分区特异性条形码序列或其互补序列和所述鉴定的报告条形码序列或其互补序列来确定所述细胞中第一聚糖基序、第二聚糖基序和第三聚糖基序的存在和/或丰度。
49.根据权利要求40所述的方法，还包括以下步骤：
(a)确定多个加条形码的核酸分子或其衍生物的所述序列，以鉴定(i)所述分区特异性条形码序列或其互补序列和(ii)所述报告条形码序列或其互补序列；以及
(b)使用所述鉴定的分区特异性条形码序列或其互补序列和所述鉴定的报告条形码序列或其互补序列来确定所述细胞中第一聚糖基序、第二聚糖基序、第三聚糖基序和第四聚糖基序的存在和/或丰度。
50.一种确定包含一个或多个活细胞的样品中一种或多种聚糖的存在的方法，包括以下步骤：
(a)将所述样品与标志分子一起孵育，所述标志分子包含合成糖和反应对的第一反应性分子，其中所述标志分子是所述一个或多个活细胞的一种或多种糖基转移酶的标志底物；
(b)将所述样品与报告分子一起孵育，所述报告分子包含(i)所述反应对的第二反应性分子和(ii)具有聚糖基序特异性报告条形码序列的报告寡核苷酸；
(c)去除未掺入的报告分子；
(d)将所述样品和多个核酸条形码分子分隔到多个分区中，使得所述多个分区中的一个分区包含来自所述样品的一个细胞和具有分区特异性条形码序列的多个核酸条形码分子；以及
(e)使用所述报告寡核苷酸和所述核酸条形码分子来产生加条形码的核酸分子，所述加条形码的核酸分子包含所述分区特异性条形码序列或其互补序列和所述聚糖基序特异性报告条形码序列或其互补序列。
51.根据权利要求50所述的方法，其中所述标志分子在所述样品的一个或多个活细胞中掺入和加工，以产生所述一个或多个活细胞的一种或多种糖基转移酶的一种或多种标志底物，并且其中所述标志底物包含所述第一反应性分子。
52.根据权利要求50至51中任一项所述的方法，还包括确定加条形码的核酸分子或其衍生物的序列，以鉴定(i)所述分区特异性条形码序列或其互补序列和(ii)所述聚糖基序特异性报告条形码序列或其互补序列。
53.根据权利要求52所述的方法，还包括使用所述鉴定的分区特异性条形码序列或其互补序列和所述鉴定的聚糖基序特异性报告条形码序列或其互补序列来确定所述样品中至少一种聚糖基序的存在和/或丰度。
54.根据权利要求50至53中任一项所述的方法，还包括在将所述样品与包含所述反应对的第二反应性分子的报告分子一起孵育之前去除未掺入的标志分子的步骤。
55.根据权利要求50至54中任一项所述的方法，其中所述一种或多种糖基转移酶对于所述一个或多个活细胞是内源的。
56.根据权利要求50至55中任一项所述的方法，其中所述合成糖被乙酰化。
57.根据权利要求50至56中任一项所述的方法，其中将所述样品与所述标志分子一起孵育发生的持续时间选自包括1秒至30秒、30秒至1分钟、1分钟至10分钟、5分钟至60分钟以及1小时至12小时的范围的组。
58.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述反应对选自包含以下物质的反应对的组：叠氮化物和炔烃、叠氮化物和膦、醛和氨氧基、醛和肼、醛和酰肼、酮和氨氧基、肼和酮、环丙烯和四嗪、降冰片烯和四嗪、反式环辛烯和四嗪、炔烃和四嗪、硝酮和烯烃、硝酮和炔烃、重氮基和炔烃以及异腈和四嗪。
59.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中反应对的所述第二反应性分子能够偶联到所述反应对的所述第一反应性分子。
60.根据权利要求51至59中任一项所述的方法，其中所述合成糖选自包括N-乙酰甘露糖胺和N-乙酰半乳糖胺的组。
61.根据权利要求51至60中任一项所述的方法，其中所述合成糖被掺入到聚糖中，所述聚糖选自包括唾液酸和粘蛋白型O连接的聚糖的组。
62.根据权利要求51至61中任一项所述的方法，其中所述合成糖是聚糖类别特异性的。
63.根据权利要求51至62中任一项所述的方法，其中所述合成糖是聚糖基序特异性的。
64.一种检测聚糖与感兴趣的组分的接近度的方法，所述方法包括：
(a)将样品与聚糖基序特异性分子一起孵育，所述聚糖基序特异性分子包含具有聚糖基序特异性报告条形码序列的报告寡核苷酸；
(b)提供组分特异性分子，所述组分特异性分子包含具有组分特异性条形码序列的寡核苷酸；
(c)去除未掺入的聚糖特异性分子和未掺入的组分特异性分子；
(d)用包含聚糖特异性报告条形码序列的所述寡核苷酸和包含组分特异性条形码序列的所述寡核苷酸进行连接反应，以产生聚糖组分报告序列；
(e)将所述样品分隔到多个分区中，使得一个分区包含(i)来自所述样品的单细胞、单细胞裂解物、两个相邻细胞或两个相邻细胞的裂解物和(ii)具有分区特异性条形码序列的多个核酸条形码分子；以及
(f)使用所述聚糖组分报告序列和核酸条形码分子来产生加条形码的分子，所述加条形码的分子包含聚糖组分报告序列或其互补序列和所述分区特异性条形码序列或其互补序列。
65.根据权利要求64所述的方法，其中将所述样品分隔在多个分区中发生在进行所述连接反应之前。
66.根据权利要求64所述的方法，其中将所述样品分隔在多个分区中发生在进行所述连接反应之后。
67.根据权利要求64至66中任一项所述的方法，还包括确定所述第一加条形码的核酸分子或其衍生物的所述序列，以鉴定(i)所述分区特异性条形码序列或其互补序列和(ii)所述聚糖组分报告条形码序列或其互补序列。
68.根据权利要求64所述的方法，其中在存在夹板寡核苷酸的情况下进行所述连接。
69.根据权利要求64至68中任一项所述的方法，还包括使用所述鉴定的分区特异性条形码序列或其互补序列和所述鉴定的聚糖组分报告条形码序列或其互补序列来确定与所述感兴趣的组分紧密接近的聚糖的存在和/或丰度。
70.根据权利要求64至69中任一项所述的方法，其中所述聚糖特异性分子选自包括以下物质的组：(a)聚糖特异性凝集素；(b)聚糖特异性抗体；(c)合成核苷酸糖；(e)合成糖；以及(f)失活的聚糖特异性转移酶。
71.根据权利要求70所述的方法，还包括提供聚糖特异性转移酶。
72.根据权利要求64至71中任一项所述的方法，其中所述组分特异性分子选自包括抗体、凝集素、合成核苷酸糖、核苷酸糖和合成糖的组。
73.根据权利要求64至72中任一项所述的方法，其中所述感兴趣的组分是蛋白质、聚糖、糖、核苷酸糖或合成核苷酸糖。
74.根据权利要求64至73中任一项所述的方法，其中所述夹板选自包括三唑或核苷酸条形码夹板的组。
75.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中聚糖或聚糖基序选自包括O-GlcNAc残基、含LacNac的聚糖、含Fuc-α1,2-Gal的聚糖、含Galβ1-3GalNAc的聚糖、GlcNAc-O-R、Neu5Acα2-3Gal和GalT1Y289L的组。
76.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述分区是液滴。
77.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述分区是孔。
78.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述多个核酸条形码分子的至少一个子集可释放地连接到凝胶珠粒。
79.根据权利要求78所述的方法，包括在产生所述加条形码的核酸分子之前从所述凝胶珠粒释放所述核酸条形码分子。
80.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中一个分区中的所述多个核酸条形码分子还包含独特分子标识符(UMI)序列。
81.根据权利要求80所述的方法，其中一个分区中的核酸条形码分子的所述UMI序列不同于所述分区中的另一个核酸条形码分子的所述UMI序列。
82.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中一个分区中的所述多个核酸条形码分子还包含功能序列。
83.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中一个分区中的所述多个核酸条形码分子还包含捕获序列。
84.根据权利要求83所述的方法，其中所述捕获序列包含模板转换寡核苷酸(TSO)序列。
85.根据权利要求84所述的方法，其中所述捕获序列包含多聚T序列。
86.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述分区还包含多个附加核酸条形码分子，所述多个附加核酸条形码分子包含所述分区特异性条形码序列和捕获序列，所述捕获序列能够结合于所述单细胞或单细胞裂解物的第二分析物或与所述第二分析物结合的附加报告分子的序列。
87.根据权利要求86所述的方法，其中所述第二分析物不是聚糖或聚糖基序。
88.根据权利要求87所述的方法，其中所述第二分析物选自包括DNA分析物、RNA分析物、蛋白质分析物、细胞特征、细胞表面特征和代谢物的组。
89.根据权利要求86至88中任一项所述的方法，其中所述附加报告分子被配置为偶联到蛋白质或代谢物。
90.根据权利要求89所述的方法，其中所述附加报告分子包含附加报告寡核苷酸，所述附加报告寡核苷酸包含鉴定感兴趣的蛋白质的不同报告条形码序列。
91.根据权利要求89所述的方法，其中所述附加报告分子包含附加报告寡核苷酸，所述附加报告寡核苷酸包含鉴定感兴趣的代谢物的不同报告条形码序列。
92.根据权利要求83至85中任一项所述的方法，其中所述报告寡核苷酸还包含捕获柄，所述捕获柄包含与所述捕获序列互补的序列。
93.根据权利要求92所述的方法，其中所述捕获柄包含与模板转换寡核苷酸(TSO)序列互补的序列。
94.根据权利要求98所述的方法，其中所述捕获柄包含与多聚T序列互补的序列。
95.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述聚糖类别选自包括O连接的聚糖、N连接的聚糖、粘蛋白型O连接的聚糖、O连接的聚糖核心I和O连接的聚糖核心2的组。
96.根据权利要求1至95中任一项所述的方法用于对处于与异常糖基化模式或基序相关的疾病或病症风险中或患有所述疾病或病症的受试者进行筛查、诊断或分期的用途。
97.根据权利要求96所述的用途，其中所述疾病或病症选自由神经退行性疾病或病症、癌症、先天性糖基化障碍和炎性病症组成的组。
98.一种用于确定样品中一种或多种聚糖的存在的组合物，包含：
(a)(i)多个标志分子，每个标志分子包含核苷酸糖和反应对的第一反应性分子，(ii)多种聚糖特异性转移酶，和(iii)多个报告分子，每个报告分子包含反应对的第二反应性分子和具有聚糖基序特异性报告条形码序列的报告寡核苷酸；或
(b)(i)多个标志分子，每个标志分子包含合成糖和反应对的第一反应性分子，其中所述标志分子是所述一个或多个活细胞的一种或多种糖基转移酶的标志底物，(ii)多个报告分子，每个报告分子包含所述反应对的第二反应性分子和具有聚糖基序特异性报告条形码序列的报告寡核苷酸；或
(c)(i)多个聚糖基序特异性分子，每个聚糖基序特异性分子包含缀合到聚糖基序特异性报告条形码序列的报告寡核苷酸，其中所述聚糖基序特异性分子结合于糖蛋白上的聚糖，(ii)多个组分特异性分子，每个组分特异性分子包含缀合到组分特异性条形码序列的寡核苷酸，其中所述组分特异性分子结合于糖蛋白；以及任选地(iii)夹板寡核苷酸。
99.一种试剂盒，包含：
(a)(i)多个标志分子，每个标志分子包含核苷酸糖和反应对的第一反应性分子，(ii)多种聚糖特异性转移酶，(iii)多个报告分子，每个报告分子包含反应对的第二反应性分子和具有聚糖基序特异性报告条形码序列的报告寡核苷酸，以及(iv)用于执行根据权利要求1至15、27至49和75至95中任一项所述的方法的说明书；或
(b)(i)多个标志分子，每个标志分子包含合成糖和反应对的第一反应性分子，其中所述标志分子是所述一个或多个活细胞的一种或多种糖基转移酶的标志底物，(ii)多个报告分子，每个报告分子包含所述反应对的第二反应性分子和具有聚糖基序特异性报告条形码序列的报告寡核苷酸，以及(iv)用于执行根据权利要求16至20、27至34、50至63和75至95中任一项所述的方法的说明书；或
(c)(i)多个聚糖基序特异性分子，每个聚糖基序特异性分子包含缀合到聚糖基序特异性报告条形码序列的报告寡核苷酸，其中所述聚糖基序特异性分子结合于糖蛋白上的聚糖，(ii)多个组分特异性分子，每个组分特异性分子包含缀合到组分特异性条形码序列的寡核苷酸，其中所述组分特异性分子结合于糖蛋白；以及任选地(iii)夹板寡核苷酸，以及(iv)用于执行根据权利要求21至26和64至95中任一项所述的方法的说明书。
100.一种系统，包括：
(a)(i)多个标志分子，每个标志分子包含核苷酸糖和反应对的第一反应性分子，(ii)多种聚糖特异性转移酶，和(iii)多个报告分子，每个报告分子包含反应对的第二反应性分子和具有聚糖基序特异性报告条形码序列的报告寡核苷酸；以及
(b)多个核酸条形码分子，其中所述多个核酸条形码分子中的第一核酸条形码分子包含分区条形码序列，
任选地其中：
所述多个核酸条形码分子连接到珠粒，并且其中所述分区条形码序列鉴定所述珠粒，和/或
所述系统还包括多个分区，任选地，其中所述多个分区包括多个液滴和/或多个孔，和/或
所述系统还包括具有微流体通道结构的设备，所述微流体通道结构被配置为产生多个分区，任选地，其中所述设备包括(i)与第一源流体连通的第一通道，所述第一源包含使用根据权利要求1(a)至(b)、3至5、35(a)至(b)和37至39中任一项所述的方法标记有聚糖或聚糖特异性分子的多个细胞，(ii)与包含所述多个核酸条形码分子的第二源流体连通的第二通道，和(iii)连接部，所述连接部使包含来自所述第一通道的所述多个细胞和来自所述第二通道的所述多个核酸条形码分子的第一相与不和所述第一相混溶的第二相接触，以产生包含所述多个细胞和所述多个核酸条形码分子的多个液滴，其中所述多个液滴中的一个液滴包含所述细胞和所述条形码珠粒。
101.一种系统，包括：
(a)(i)多个标志分子，每个标志分子包含合成糖和反应对的第一反应性分子，其中所述标志分子是所述一个或多个活细胞的一种或多种糖基转移酶的标志底物，(ii)多个报告分子，每个报告分子包含所述反应对的第二反应性分子和具有聚糖基序特异性报告条形码序列的报告寡核苷酸；以及
(b)多个核酸条形码分子，其中所述多个核酸条形码分子中的第一核酸条形码分子包含分区条形码序列，
任选地其中
所述多个核酸条形码分子连接到珠粒，并且其中所述分区条形码序列鉴定所述珠粒，和/或
所述系统还包括多个分区，任选地，其中所述多个分区包括多个液滴和/或多个孔，和/或
所述系统还包括具有微流体通道结构的设备，所述微流体通道结构被配置为产生多个分区，任选地，其中所述设备包括(i)与第一源流体连通的第一通道，所述第一源包含使用根据权利要求16(a)至(b)和50(a)至(b)中任一项所述的方法标记有聚糖或聚糖特异性分子的多个细胞，(ii)与包含所述多个核酸条形码分子的第二源流体连通的第二通道，和(iii)连接部，所述连接部使包含来自所述第一通道的所述多个细胞和来自所述第二通道的所述多个核酸条形码分子的第一相与不和所述第一相混溶的第二相接触，以产生包含所述多个细胞和所述多个核酸条形码分子的多个液滴，其中所述多个液滴中的一个液滴包含所述细胞和所述条形码珠粒。
102.一种系统，包括：
(a)(i)多个聚糖基序特异性分子，每个聚糖基序特异性分子包含缀合到聚糖基序特异性报告条形码序列的报告寡核苷酸，其中所述聚糖基序特异性分子结合于糖蛋白上的聚糖，(ii)多个组分特异性分子，每个组分特异性分子包含缀合到组分特异性条形码序列的寡核苷酸，其中所述组分特异性分子结合于糖蛋白；以及任选地(iii)夹板寡核苷酸；以及
(b)多个核酸条形码分子，其中所述多个核酸条形码分子中的第一核酸条形码分子包含分区条形码序列，
任选地其中
所述多个核酸条形码分子连接到珠粒，并且其中所述分区条形码序列鉴定所述珠粒，和/或
所述系统还包括多个分区，任选地，其中所述多个分区包括多个液滴和/或多个孔，和/或
所述系统还包括具有微流体通道结构的设备，所述微流体通道结构被配置为产生多个分区，任选地，其中所述设备包括(i)与第一源流体连通的第一通道，所述第一源包含使用根据权利要求21(a)至(d)和64(a)至(b)中任一项所述的方法标记有聚糖或聚糖特异性分子的多个细胞，(ii)与包含所述多个核酸条形码分子的第二源流体连通的第二通道，和(iii)连接部，所述连接部使包含来自所述第一通道的所述多个细胞和来自所述第二通道的所述多个核酸条形码分子的第一相与不和所述第一相混溶的第二相接触，以产生包含所述多个细胞和所述多个核酸条形码分子的多个液滴，其中所述多个液滴中的一个液滴包含所述细胞和所述条形码珠粒。
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