CN104250663A - 甲基化CpG岛的高通量测序检测方法 - Google Patents

甲基化CpG岛的高通量测序检测方法 Download PDF

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Abstract

甲基化CpG岛的高通量测序检测方法，包括：用修饰剂处理DNA样品，将DNA样品中的胞嘧啶转换为尿嘧啶，而5’甲基胞嘧啶不变；所得片段用引物A和DNA聚合酶扩增，获得一端能够锚定接头引物C的片段；所得片段用引物B和DNA聚合酶扩增，获得富集甲基化CpG岛且两端能够分别锚定接头引物C和D的片段；所得片段用接头引物C、D和DNA聚合酶进行PCR指数扩增，获得扩增产物；扩增产物分离纯化，构成高通量测序文库、上机测序及数据分析。在高CpG频率引物对修饰剂转换的基因组DNA中的甲基化CpG岛进行富集性扩增的同时通过三步PCR反应将接头序列连接到待测目的片段，以富集甲基化CpG岛及构建高通量测序文库。

Description

甲基化CpG岛的高通量测序检测方法
技术领域
本发明涉及利用高通量测序技术检测基因组中的甲基化CpG岛。
背景技术
DNA甲基化是指在DNA上的胞嘧啶(C)的第5个碳原子上被甲基共价修饰成为5’甲基胞嘧啶(5mC)，它具有多种重要的生物学功能，包括转录调控，转座子沉默、基因印记和X染色体失活等，一直是分子生物学领域的一个研究热点。在包括人类在内的脊椎动物中，DNA甲基化修饰绝大多数发生在CpG位点上(CpG表示核苷酸对，其中鸟嘌呤(G)在DNA链上紧随C后)。CpG在脊椎动物基因组中的平均含量低于预期概率，但在基因组某些区段，CpG保持或高于正常概率，这些区段被称作CpG岛。CpG岛主要位于基因启动子，在人类基因组中，约有3万个CpG岛，其中50％以上位于启动子，而60％以上的基因启动子含有CpG岛。启动子CpG岛一旦被甲基化将导致相应基因表达沉默，已有研究表明这种机制参与了多种生理过程的调控，包括X染色体失活、基因印记、胚胎干细胞分化、生殖细胞发育以及肿瘤的发生和发展。基因内和基因间的CpG岛可能是尚未鉴定的启动子。全面理解CpG岛甲基化的生物学功能需要系统和高效的检测技术。
传统检测DNA甲基化的方法，包括限制性酶切、限制性酶切-PCR、甲基化特异性PCR，只能检测单个或少数位点。近年来，随着高通量测序技术的发展，人们开始能够系统地从全基因组水平了解DNA甲基化谱式。目前基于高通量测序技术的DNA甲基化检测方法包括：1)甲基化DNA免疫沉淀；2)甲基化CpG免疫沉淀和3)亚硫酸氢盐测序(Bisulfite Sequencing)。前二者采用抗体或重组甲基化CpG结合蛋白捕获甲基化DNA，随后进行高通量测序，这两种方法只能对DNA甲基化状态进行半定量检测，其分辨率为100bp左右。亚硫酸氢盐测序的原理是亚硫酸氢盐处理能使得DNA上的C转变成为尿嘧啶(U)，而5mC则不受影响，因此随后进行高通量测序就可以得知DNA上的甲基化修饰情况。这种方法的分辨率精确到单个碱基，是DNA甲基化分析的金标准。2009年第一次报道了亚硫酸氢盐测序获得的单碱基分辨率人类全基因组甲基化图谱。但是，由于这种技术是对全基因组进行测序，费用非常高，阻碍其应用于大量样本的检测。随后有研究者提出了简化代表性亚硫酸氢盐测序(Gu H，et al.Preparation of reduced representationbisulfite sequencing libraries for genome-scale DNA methylation profiling.Nat Protoc.20116(4)：468-81.)，这种方法通过Mspl酶切、跑胶、纯化步骤富集启动子及CpG岛区域，随后进行末端修复、加A、接头连接、片段选择纯化和PCR扩增等步骤构建测序文库，虽然比全基因组亚硫酸氢盐测序更加经济和高效，但是文库构建过程繁琐，需要大约5～6天时间，而且富集过程不能区分甲基化和非甲基化CpG岛，增加了测序成本。专利(高通量测序文库的构建方法及其应用，CN103103624A)利用特异性探针捕获包括CpG岛在内的目的片段，然后进行亚硫酸氢盐测序，但序列捕获和文库构建过程同样相当费时。
因此，目前尚缺乏一种高效的甲基化CpG岛高通量测序检测方法。
发明内容
本发明方法通过高CpG频率引物对修饰剂转换的基因组DNA中的甲基化CpG岛进行富集性扩增，同时通过三步PCR反应将接头序列连接到待测目的片段，得以高效地富集甲基化CpG岛及快速地构建高通量测序文库，是一种新颖、高效和经济的甲基化CpG岛高通量测序检测方法。
在第一方面，本发明提供了甲基化CpG岛的高通量测序检测方法，包括下列步骤：
步骤一、用修饰剂处理DNA样品，以便将DNA样品中的胞嘧啶转换为尿嘧啶，而5’甲基胞嘧啶不变，获得经过转换的DNA片段。
DNA可以是任何包含脱氧核苷酸的聚合物。优选地，所述DNA样品为基因组DNA，来源于动物、植物和微生物中至少一种，优选所述动物为人和小鼠中至少一种。
所述DNA样品可以来自人的细胞、组织、血液、体液、尿液、排泄物或其组合；在一个优选的形式中，所述DNA样品来自人的血浆或血清游离DNA；任选地，所述DNA样品来自人的全血基因组DNA；任选地，所述DNA样品来自人的肿瘤细胞株；
处理DNA样品的修饰剂在形成单链DNA的条件下修饰C，但不修饰5mC。可以采用亚硫酸氢盐、乙酸盐或柠檬酸盐，优选地，修饰剂是亚硫酸氢盐。可以采用商品化试剂盒将DNA样品进行亚硫酸氢盐处理，任选地，可以采用MethylCode Bisulfite Conversion Kit(Invitrogen)、EZ DNA methylation-Gold Kit(ZYMO)或EpiTect Bisulfite Kit(Qiagen)。
步骤二、将所述经过转换的DNA片段用引物A和DNA聚合酶进行至少1次线性扩增，以便获得一端能够锚定接头引物C的目的片段；
其中所述引物A由3’端和5’端两部分组成，其中所述3’端部分用于结合和扩增经过转换的DNA片段，其特征为，长度大于或等于4个核苷酸且能结合经过转换的DNA片段；优选地，除了CpG以外，引物A的3’端部分只包含C、A和T，本领域技术人员可以理解，CpG表示核苷酸对，其中鸟嘌呤(G)在DNA链上紧随C后。更优选地，引物A的3’端第二个核苷酸为C。优选地，引物A的3’端部分还可用于初步富集甲基化CpG岛，得以在步骤二中获得初步富集CpG岛且一端能够锚定接头引物C的目的片段，在步骤二中进行初步富集能够提高整体富集效率，但是仍需在步骤三中对甲基化CpG岛进行进一步富集以达到充分富集的目的。初步富集需要引物A的3’端部分具有一定的CpG频率或者C频率。优选地，其特征为中等CpG频率，其所述中等CpG频率是指引物3’端起前7个核苷酸中包含1个CpG；优选地，其特征为高C频率，其所述高C频率是指3’端起前5个核苷酸中至少包含3个C，优选3’端起至少连续3个核苷酸为C；任选地，其特征为高CpG频率，其所述高CpG频率是指3’端起前7个核苷酸中包含2个或3个CpG，此时也可选择不再在步骤三中对甲基化CpG岛进行进一步富集(见后)。
其中所述引物A的5’端部分用于锚定接头引物C，其特征为，反向互补序列能够被接头引物C结合并进行PCR扩增。锚定是指其引物A能够通过其5’端部分将接头引物C通过PCR反应连接到待测目的片段上。优选地，引物A的5’端部分与接头引物C的3’端起前15～40个核苷酸序列相同。
DNA聚合酶可以是任何合适的聚合酶，如Taq聚合酶、ExTaq、LATaq DNA聚合酶、AmpliTaq、AmplitaqGold、Titanium Taq聚合酶、KlenTaq DNA聚合酶、Platinum Taq聚合酶、Accuprime Taq聚合酶、PyrobestDNA聚合酶、Pfu聚合酶、Pfu聚合酶turbo、Phusion聚合酶、Pwo聚合酶、Vent聚合酶、Vent Exo-聚合酶、SequenaseTM聚合酶、9。Nm DNA聚合酶、Therminator DNA聚合酶、Expand DNA聚合酶、rTth DNA聚合酶、DyNazymeTM EXT聚合酶、DNA聚合酶1、T7DNA聚合酶、T4DNA聚合酶、Bst DNA聚合酶、phi-29DNA聚合酶和Klenow片段。
优选地，DNA聚合酶具有链置换能力。可以是具有链置换能力的任何合适的聚合酶，包括但不限于DNA聚合酶I(Klenow)大片段(New England Biolabs(NEB)目录号M0210S)、Klenow片段(exo-)(NEB目录号M0212S)、Bst DNA聚合酶大片段(NEB目录号M0275S)、Vent(exo-)(NEB目录号M0257S)、DeepVent(exo-)(NEB目录号M0259S)、M-MulV逆转录酶(NEB目录号M0253S)、9。Nm DNA聚合酶(NEB目录号M0260S)和Phi-29DNA聚合酶(NEB目录号M0269S)。在一个优选形式中，DNA聚合酶为Klenow片段(exo-)。
优选地，DNA聚合酶是核酸外切酶缺损的。
线性扩增是指扩增产物量随着扩增次数增加呈线性而非指数增加。需要进行至少1次线性扩增，优选地，进行2～30次线性扩增。
步骤三、将所述一端能够锚定接头引物C的目的片段用引物B和DNA聚合酶进行扩增，以便获得富集甲基化CpG岛且两端能够分别锚定接头引物C和接头引物D的目的片段；
其中所述引物B由3’端和5’端两部分组成，其中所述3’端部分用于结合并富集性扩增甲基化CpG岛，其特征为：1)长度大于或等于7个核苷酸；2)高CpG频率，其所述高CpG频率一是指3’端起前7个核苷酸中包含2个或3个CpG。优选地，除了CpG以外，引物只包含G、A和T。
富集性扩增是指引物倾向于结合与扩增基因组中甲基化CpG岛区域，而不倾向于结合与扩增非甲基化CpG岛区域，富集性扩增的原因是引物B的3’端部分的序列具有高CpG频率的特征。我们的生物信息学分析表明，具有所述高CpG频率的引物序列在基因组中并非随机分布，而是以不同程度聚集分布于CpG岛区域，因此使用高CpG频率的引物可起到富集甲基化CpG岛作用。优选地，引物B的3’端部分具有高GC含量的特征，其所述高GC含量是指3’端起前10个核苷酸中C与G之和大于或等于7个，高GC含量特征除了使引物序列进一步聚集分布于CpG岛区域以外，还有助于进一步提高引物的退火温度，本领域技术人员可以理解，GC含量高的引物具有更高的退火温度，具有所述高GC含量特征可以使得引物的退火温度达到约40至约60度之间，这样有助于引物与模板结合，提高扩增效率。优选地，引物B的3’端部分具有极高CpG频率的特征，其所述极高CpG频率是指3’端7个核苷酸中包含3个CpG。
其中所述引物B的5’端部分用于锚定接头引物D，其特征为，其反向互补序列能够被接头引物D结合并进行PCR扩增。锚定是指其引物B能够通过其5’端部分将接头引物D通过PCR反应连接到待测目的片段上。优选地，引物B的5’端部分与接头引物D的3’端起前15～40个核苷酸序列相同。
DNA聚合酶可以是前述任何合适的聚合酶。优选地，DNA聚合酶是热启动的。优选地，扩增反应的退火温度为约40至约60度之间。
当3’端部分具有所述高CpG频率特征的引物A用于步骤二扩增时，由于步骤二已经富集甲基化CpG岛(且一端能够锚定接头引物C)，步骤三中引物B的3’端部分只需能够结合和扩增该目的片段即能获得富集甲基化CpG岛且两端能够分别锚定接头引物C和接头引物D的目的片段，无须再在步骤三中对甲基化CpG岛进行富集。
步骤四、将所述富集甲基化CpG岛且两端能够分别锚定接头引物C和接头引物D的目的片段用接头引物C、接头引物D和DNA聚合酶进行PCR指数扩增，以便获得扩增产物；
接头引物此处是指引物的作用与常规高通量测序文库构建方法(如Illumnia的TruSeq DNA Sample PrepKit和Applied Biosystems(ABI)的The SOLiDTM Fragment Library Construction Kit)中接头(adaptor)的作用一样，即将待测DNA片段结合到测序芯片上并使其能被PCR扩增富集以及测序。与常规高通量测序文库构建过程中利用连接反应加接头序列的方法不同，本发明的方法利用引物A和引物B的5’部分的锚定序列将接头序列通过PCR反应连接到待测DNA片段的两端。本领域技术人员可以理解，接头引物C与接头引物D之一中可以包含标签序列，以便在测序芯片上同时检测多个文库。接头引物C与引物D对应特定高通量测序平台的接头序列，这些高通量测序平台包括，但不局限于Illumina的Genome Analyzer IIx、HiSeq和MiSeq，ABI的SoLiD、5500W Series Genetic Analyzer和Ion Torrent PGM，Roche454的GS Junior和GS FLX+。
步骤五、将所述扩增产物进行分离纯化，所述扩增产物构成高通量测序文库；以及，将所述高通量测序文库上机测序及数据分析。
对扩增产物进行分离纯化的方法可以是任何合适的方法，包括但不局限于磁珠纯化、纯化柱纯化和琼脂糖胶电泳纯化。优选地，纯化方法能够对目的片段的长度进行选择。优选地，目的片段长度为160-400bp。在一个优选形式中，用2％琼脂糖胶电泳的方法选择160-400bp的目的片段并进行胶回收纯化。
用于分析测序文库的高通量测序平台包括，但不局限于Illumina的GenomeAnalyzer IIx、HiSeq和MiSeq测序平台，ABI的SoLiD、5500W Series Genetic Analyzer和Ion Torrent PGM测序平台，Roche454的GS Junior和GS FLX+测序平台。
数据分析的方法不受限制，可以应用任何合适的数据分析和序列比对软件，包括但不局限于Bismark、BSMAP、Bowtie和SOAP等。
在第二方面，本发明提供了用于甲基化CpG岛高通量测序检测的试剂盒，该试剂盒包含：引物A、引物B、接头引物C和接头引物D、DNA聚合酶以及使用该试剂盒的说明书。
附图说明
图1显示本发明甲基化CpG岛高通量测序检测方法的示意图。
图2显示使用本发明方法扩增Hela细胞和人类外周血单核细胞(Human Peripheral Blood MononuclearCell，hPBMC)基因组DNA的琼脂糖凝胶分析结果。
图3显示Hela细胞和hPBMC基因组DNA的甲基化CpG岛高通量测序文库的Bioanalyzer_2100检测分析结果。
图4显示MAEL、ILDR2和CDKN2A基因区使用本发明方法和全基因组亚硫酸氢盐测序方法的高通量测序结果比较。
图5显示含1～3个CpG的短核苷酸序列在人类基因组的CpG岛和非CpG岛区域的分布情况。
图6显示不同的引物A和引物B的3’端部分序列组合对CpG岛的富集程度。
具体实施方式
以下结合具体实施方式和附图，对本发明作进一步说明。本领域技术人员可以对具体实施方案中所示的本发明作出多种变化和修改而不脱离广义描述时的本发明的精神和范围。
根据本发明的甲基化CpG岛的富集性扩增和高通量测序文库的同步构建以如下方式发生(见图1)。
1.步骤一、亚硫酸氢盐处理DNA样品。
采用试剂盒MethylCodeTM Bisulfite Conversion Kit(Invitrogen)，并按照制造商提供的说明书进行操作，具体步骤如下：
1.1制备CT转换试剂(CT Conversion Reagent)溶液：从试剂盒中取出CT转换试剂，加入900μl水、50μl重悬缓冲液和300μl稀释缓冲液，室温短时震荡混匀10分钟待其溶解，室温避光保存；
1.2将500pg至500ng DNA样品共20μl加入PCR管中；
1.3将130μl CT转换试剂溶液加入DNA样品，轻弹或用枪头吹打混匀；
1.4将PCR管在一台热循环仪上进行如下程序：98度----10分钟，64度----2.5小时，4度保存(不超过20小时)备用；
1.5将DNA纯化柱放入收集管中，加入600μl结合缓冲液；
1.6将1.4步骤中的DNA样品加入结合结合缓冲液中，避盖上下颠倒混匀数次；
1.7最大转速(＞10,000g)离心30秒，弃过柱液；
1.8加入100μl洗涤缓冲液(已加乙醇)，最大转速离心30秒，弃过柱液；
1.9加入200μl Desulphonation缓冲液，将纯化柱在室温站立15～20分钟；
1.10最大转速离心30秒，弃过柱液；
1.11加入100μl洗涤缓冲液(已加乙醇)，最大转速离心30秒，弃过柱液；
1.12重复1.11一次，将纯化柱放置到一个新的1.5ml离心管中；
1.13加入10μl溶解缓冲液，最大转速离心30秒以洗脱DNA。
2.步骤二、引物A和DNA聚合酶进行线性扩增。
2.1将步骤1中得到的DNA在一个PCR管中配置如下扩增反应体系：
内容 体积
DNA样品 4μl
NEBuffer2 1.5μl
dNTP(2.5mM) 1.5μl
引物A(5uM)* 1μl
水 6μl
Klenow(exo-)** 0.3μl×5(次，见步骤2.5)＝1.5μl
Total 15μl
*：引物A：TCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT (H＝A/T/C)，其中下划波浪线部分为引物的3’端部分，下划直线部分为引物的5’端部分。
**：在2.3步骤中加入
2.2将PCR管放入PCR热循环仪中进行如下程序：95度----2分钟，4度保存；
2.3加入0.3μl Klenow片段(exo-)(NEB目录号M0212S)，混匀，点离；
2.4在PCR热循环仪中进行如下程序：4度----50秒，10度----50秒，20度----50秒，30度----50秒，37度----5分钟，95度----10秒，4度----暂停；
2.5重复步骤2.3和2.4，共重复4次，最后一次不进行4度暂停；
2.6在PCR热循环仪中进行如下程序以灭活Klenow片段：75度----20分钟，50度----暂停；
3.步骤三、引物B和DNA聚合酶进行扩增。
3.1在一个PCR管中配置如下扩增反应体系：
内容 体积
Ex Taq Buffer 0.5μl
引物B(10uM)* 0.5μl
HS Ex Taq(Takara目录号DRR006B) 0.3μl
水 3.7μl
Total 5μl
*：引物B：TGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT (D＝A/T/G)，其中下划波浪线部分为引物的3’端部分，下划直线部分为引物的5’端部分。
3.2将PCR管在热循环仪上预热到50度；
3.3将预热的混合物加入2.6的第一轮扩增反应产物中，吹打混匀5～6次；
3.4在PCR热循环仪中进行如下程序：95度---3分钟，50度----1分钟，72度----1分钟，50度----暂停；
4.步骤四、接头引物C、接头引物D和DNA聚合酶进行指数扩增。
4.1在一个PCR管中配置如下扩增反应体系：
内容 体积
ExTaq Buffer 12μl
接头引物C(100uM)* 2.4μl
接头引物D(100uM)** 2.4μl
dNTP(2.5mM) 12μl
HS Ex Taq(Takara目录号DRR006B) 1.2μl
水 90.8μl
Total 120μl
*：接头引物C：
AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT，其中下划直线部分与引物A的5’端部分相同；
**：接头引物D：
CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT，其中下划直线部分与引物B的5’端部分相同，下划双线处为标签序列(Illumina index9)；
4.2将PCR管在热循环仪上预热到50度；
4.3将预热的混合物加入3.4的第二轮扩增反应产物中，吹打混匀5～6次；
4.4在PCR热循环仪中进行如下程序：95度----3分钟；
4.5在PCR热循环仪中进行如下程序：95度----30秒，67度----30秒，72度----1分钟，共20个循环，4度保存。
5.步骤五、片段选择、纯化、进行高通量测序和数据分析。
5.1制备2％琼脂糖凝胶，加入1×SYBR Safe(Invitrogen)；
5.2将4.5的扩增产物在2％琼脂糖凝胶中进行电泳分离；
5.3对凝胶中的DNA进行成像分析；
5.4切胶回收160-400bp的目的片段；
5.5将目的片段进行胶回收纯化(Qiagen，QIAquick Gel Extraction Kit)，获得高通量测序文库；
5.6用Bioanalyzer_2100分析系统(Agilent)检测高通量测序文库插入片段的大小，并利用QPCR对文库的浓度进行绝对定量分析；
5.7在Illumina HiSeq2000测序仪上，按照读长为100bp的双末端测序，对文库进行高通量测序分析，获得原始测序数据；
5.8数据分析：首先去除任何接头序列和低质量序列，然后应用Bismark软件将数据与参考人类基因组序列(Hg19)进行比对，并以此为基础进行后续的生物信息学分析。
图2显示采用本发明上述方法对来自Hela细胞和hPBMC基因组DNA进行扩增后的2％琼脂糖凝胶电泳结果。其中泳道1和泳道4为DNA Maker，泳道2为Hela细胞基因组DNA结果，用于亚硫酸氢钠处理的DNA样品起始量为15ng，泳道3为泳道结果表明hPBMC基因组DNA(来自一名成年男性)结果，用于亚硫酸氢钠处理的DNA样品起始量为30ng，泳道5为无DNA样品扩增反应的对照。结果显示Hela细胞基因组和hPBMC基因组DNA样品均有阳性扩增。这一结果表明少至15ng起始的基因组DNA即可以采用本发明所述方法进行甲基化CpG岛高通量测序检测，表明该方法具有高效率和高灵敏度的特点。
图3显示本发明上述方法获得的Hela细胞和hPBMC基因组DNA的高通量测序文库的Bioanalyzer2100检测结果。把上述2％琼脂糖凝胶分离的目的DNA片段进行切胶及回收纯化后所获得的DNA即构成所述高通量测序文库。图3A为Hela细胞基因组DNA测序文库的检测结果，图3B为hPBMC基因组DNA测序文库的检测结果。结果显示片段长度介于160～280bp之间。
将上述两个测序文库进行高通量测序检测，测序原始数据量分别为Hela细胞基因组DNA1.3G，hPBMC基因组DNA1.5G，数据的统计分析结果详见表1。人类基因组中的CpG岛区域约占全基因组的0.7％，而用本发明方法的Hela细胞和hPBMC细胞基因组高通量测序数据中有39％和20％分布于CpG岛，由此对CpG岛的富集程度分别为56和29倍。本发明方法仅用1～2Gb的原始测序数据量即可获得包含甲基化CpG岛在内的基因组区域达平均20～30×的测序深度，而用全基因组亚硫酸氢盐测序要达到同样测序深度需要150～200Gb的原始测序数据量，这表明本发明方法极大地提高了甲基化CpG岛的高通量测序检测效率。
表1使用本发明方法获得的Hela细胞和hPBMC基因组DNA的高通量测序数据分析结果
图4显示MAEL、ILDR2和CDKN2A基因区使用本发明方法和全基因组亚硫酸氢盐测序方法的高通量测序结果比较。图4A显示MAEL和ILDR2基因区域的结果。MAEL(maelstrom spermatogenic transposonsilencer)基因是一个睾丸特异表达基因，其启动子CpG岛在生殖细胞中处于去甲基化状态，但是在体细胞中被高度甲基化，相反，ILDR2(immunoglobulin-like domain containing receptor2)基因在体细胞中处于去甲基化状态，本发明方法结果显示：在Hela和hPBMC基因组中，MAEL的启动子CpG岛均被扩增，且测序结果显示其处于高度甲基化状态，而ILDR2的启动子CpG岛均未被扩增，这一结果表明本发明方法能够选择性扩增甲基化CpG岛而不能扩增非甲基化CpG岛。全基因组亚硫酸氢盐测序结果(来自人脑组织)一方面证实，正常体细胞中MAEL启动子CpG岛被高度甲基化，而ILDR2启动子CpG岛无甲基化，另一方面显示，大多数散在分布的CpG处于高度甲基化状态，而它们均在本发明方法富集甲基化CpG岛和构建文库过程中被选择性丢弃。图4B显示CDKN2A(cyclin-dependent kinase inhibitor2A)基因区域的结果。CDKN2A基因区域有多个CpG岛，在体细胞中处于去甲基化状态，而在肿瘤细胞中部分被甲基化。本发明方法结果显示：该基因区域4个CpG岛中的2个在Hela细胞基因组中被扩增且测序结果显示其处于高度甲基化状态，而在hPBMC基因组中，4个CpG岛均未扩增。该结果进一步表明本发明方法能够准确和高效地富集性扩增甲基化CpG岛并进行高通量测序检测。
图5显示含1～3个CpG的短核苷酸序列在人类基因组的CpG岛和非CpG岛区域分布情况的生物信息学分析结果。结果显示，短核苷酸序列在CpG岛的富集程度与CpG的个数呈正相关。
图6显示用不同的引物A和引物B的3’端部分序列组合通过本发明方法获得的Hela细胞基因组高通量测序文库对CpG岛富集程度的分析结果。结果显示CpG岛富集程度与引物序列的CpG频率呈正相关。其中H＝C/A/T/，D＝G/A/T，R＝G/A，N＝A/T/C/G。
以上所述仅为本发明的一种具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉该技术的人在本发明揭露的技术范围以内，可以轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应该以权利要求书的保护范围为准。

Claims (17)

1.一种甲基化CpG岛的高通量测序检测方法，其特征在于，包括下列步骤：
步骤一、用修饰剂处理DNA样品，以便将DNA样品中的胞嘧啶转换为尿嘧啶，而5’甲基胞嘧啶不变，获得经过转换的DNA片段；
步骤二、将所述经过转换的DNA片段用引物A和DNA聚合酶进行至少1次线性扩增，以便获得一端能够锚定接头引物C的目的片段；
其中所述引物A由3’端和5’端两部分组成，其中所述3’端部分用于结合和扩增所述经过转换的DNA片段，其特征为，长度大于或等于4个核苷酸且能结合所述经过转换的DNA片段；
其中所述引物A的5’端部分用于锚定接头引物C，其特征为，其反向互补序列能够被接头引物C结合并进行聚合酶链式反应(PCR)扩增；
步骤三、将所述一端能够锚定接头引物C的目的片段用引物B和DNA聚合酶进行扩增，以便获得富集甲基化CpG岛且两端能够分别锚定接头引物C和接头引物D的目的片段；
其中所述引物B由3’端和5’端两部分组成，其中所述3’端部分用于结合所述一端能够锚定接头引物C的目的片段并富集性扩增甲基化CpG岛，其特征为：1)长度大于或等于7个核苷酸；2)高CpG频率，其所述高CpG频率一是指3’端起前7个核苷酸中包含2个或3个CpG；
其中所述引物B的5’端部分用于锚定接头引物D，其特征为，其反向互补序列能够被接头引物D结合并进行PCR扩增。
步骤四、将所述富集甲基化CpG岛且两端能够分别锚定接头引物C和接头引物D的目的片段用接头引物C、接头引物D和DNA聚合酶进行PCR指数扩增，以便获得扩增产物；
步骤五、将所述扩增产物进行分离纯化，所述扩增产物构成高通量测序文库；以及，
将所述高通量测序文库上机测序及数据分析。
2.根据权利要求1所述的方法，所述修饰剂为亚硫酸氢盐。
3.根据权利要求1所述的方法，所述引物A的3’端部分特征为，除了CpG以外，引物只包含C、A和T；所述引物B的3’端部分特征为，除了CpG以外，引物只包含G、A和T。
4.根据权利要求1～3任一项所述的方法，所述引物A的3’端第二个核苷酸为C。
5.根据权利要求1～4任一项所述的方法，其中所述引物A的3’端部分用于结合和扩增经过转换的DNA片段并初步富集甲基化CpG岛，其特征为中等CpG频率，其所述中等CpG频率是指引物3’端起前7个核苷酸中包含1个CpG。
6.根据权利要求1～5任一项所述的方法，其中所述引物A的3’端部分用于结合和扩增经过转换的DNA片段并初步富集甲基化CpG岛，其特征为高C频率，其所述高C频率是指3’端起前5个核苷酸中至少包含3个C，优选3’端起至少连续3个核苷酸为C。
7.根据权利要求1～6任一项所述的方法，其中所述引物A的3’端部分用于结合和扩增经过转换的DNA片段并初步富集甲基化CpG岛，其特征为高CpG频率，其所述高CpG频率是指3’端起前7个核苷酸中包含2个或3个CpG。
8.根据权利要求1～7任一项所述的方法，所述引物B的3’端部分特征为高GC含量，其所述高GC含量是指3’端起前10个核苷酸中C与G之和大于或等于7个。
9.根据权利要求1～8任一项所述的方法，所述引物B的3’端部分特征为极高CpG频率，其所述极高CpG频率是指3’端7个核苷酸中包含3个CpG。
10.根据权利要求1～9任一项所述的方法，所述步骤二中的DNA聚合酶具有链置换功能。
11.根据权利要求1～10任一项所述的方法，所述步骤二中的DNA聚合酶是外切核酸酶缺损的。
12.根据权利要求1～11任一项所述的方法，所述步骤二进行2～30次线性扩增。
13.根据权利要求1～12任一项所述的方法，所述步骤三中的DNA聚合酶是热启动的。
14.一种甲基化CpG岛的高通量测序检测方法，其特征在于，包括下列步骤：
步骤一、用修饰剂处理DNA样品，以便将DNA样品中的胞嘧啶转换为尿嘧啶，而5’甲基胞嘧啶不变，获得经过转换的DNA片段；
步骤二、将所述经过转换的DNA片段用引物A和DNA聚合酶进行至少1次线性扩增，以便获得富集甲基化CpG岛且一端能够锚定接头引物C的目的片段；
其中所述引物A由3’端和5’端两部分组成，其中所述3’端部分用于结合所述经过转换的DNA片段并富集性扩增甲基化CpG岛，其特征为：1)长度大于或等于7个核苷酸；2)高CpG频率，其所述高CpG频率一是指3’端起前7个核苷酸中包含2个或3个CpG；
其中所述引物A的5’端部分用于锚定接头引物C，其特征为，其反向互补序列能够被接头引物C结合并进行PCR扩增；
步骤三、将所述富集甲基化CpG岛且一端能够锚定接头引物C的目的片段用引物B和DNA聚合酶进行至少1次扩增，以便获得富集甲基化CpG岛且两端能够分别锚定接头引物C和接头引物D的目的片段；
其中所述引物B由3’端和5’端两部分组成，其中所述引物B的3’端部分用于结合和扩增所述富集甲基化CpG岛且一端能够锚定接头引物C的目的片段，其特征为，长度大于或等于4个核苷酸且能结合所述富集甲基化CpG岛且两端能够分别锚定接头引物C和接头引物D的目的片段；
其中所述引物B的5’端部分用于锚定接头引物D，其特征为，其反向互补序列能够被接头引物D结合并进行PCR扩增；
步骤四、将所述富集甲基化CpG岛且两端能够分别锚定接头引物C和接头引物D的目的片段用接头引物C、接头引物D和DNA聚合酶进行PCR指数扩增，以便获得扩增产物；
步骤五、将所述扩增产物进行分离纯化，所述扩增产物构成高通量测序文库；以及，
将所述高通量测序文库上机测序及数据分析。
15.根据权利要求1～14任一项所述的方法，所述引物A的5’端部分与所述接头引物C的3’端起前15～40个核苷酸序列相同；所述引物B的5’端部分与所述接头引物D的3’端起15～40个核苷酸序列相同。
16.根据权利要求1～15任一项所述的方法，所述DNA样品来自人的细胞、组织、血液、体液、尿液、排泄物或其组合；优选来自人的血浆或血清游离DNA。
17.一种用于甲基化CpG岛高通量测序检测的试剂盒，该试剂盒包含：权利要求1～16任一项所述的引物A、引物B、接头引物C和接头引物D、DNA聚合酶以及使用该试剂盒的说明书。
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