CN102337260A

CN102337260A - 基于磁珠提取大豆及其深加工产品核酸的方法

Info

Publication number: CN102337260A
Application number: CN2011102701125A
Authority: CN
Inventors: 赵卫东; 陈磊; 郑文杰; 王爱迪; 冉晓华
Original assignee: Tianjin Entry Exit Inspection and Quarantine Bureau of Animals Plants and Food Inspection Center
Current assignee: Tianjin Entry Exit Inspection and Quarantine Bureau of Animals Plants and Food Inspection Center
Priority date: 2011-09-14
Filing date: 2011-09-14
Publication date: 2012-02-01

Abstract

本发明提供一种应用二氧化硅壳磁珠提取大豆及其深加工产品核酸的方法。样品经过裂解液裂解，释放核酸之后，再与binging buffer和二氧化硅壳磁性微球共同作用，核酸可与磁珠特异性地形成复合物，通过磁分离出去蛋白质、多糖、多酚等杂质，从而实现核酸的分离纯化。该方法不需使用有毒有害的有机溶剂，环境友好，操作简便，比传统提取方法提取的核酸纯度更高，并具有自动化升级的潜力，可与磁珠分离设备配合，实现核酸提取的规模化、集成化。

Description

基于磁珠提取大豆及其深加工产品核酸的方法

技术领域

本发明涉及一种采用磁珠从植物及其植物源加工食品中提取并纯化核酸的领域。磁珠通过修饰之后可以与核酸特异性结合而从复杂的样品中进行分离纯化，通过洗脱使提取的核酸释放到溶液中，实现核酸的快速分离提取，涉及核酸分离方法、试剂盒及在转基因检测中的应用。

背景技术

核酸的提取与纯化技术是生物化学与分子生物学的一项基本技术。随着分子生物学技术广泛应用于生物学，医学，食品检测及其相关领域，核酸的提取与纯化技术也得到了进一步的发展。

核酸在细胞中总是与各种蛋白质结合在一起，核酸提取主要是将核酸与蛋白、多糖、脂肪、酚类等生物分子物质分离。大多数方法一般都包括细胞裂解，去除与核酸结合的物质，沉淀核酸，去除盐类、有机溶剂等杂质，纯化核酸等步骤。传统方法主要是CTAB法，离心柱法，试剂盒法。由于传统方法步骤繁琐，耗时，并且用有机溶剂，污染较大，易导致核酸降解；试剂盒法存在价格昂贵等缺点。

本发明采用磁珠核酸提取方法，在操作过程中不含氯仿，苯酚等毒性大的有机溶剂，提取纯化的核酸质量好，满足核酸后续研究的需求，提取步骤更为简单，不需要多次离心，易于实现自动化，这些优点及其特点使其具有代替其它方法的趋势。

发明内容

本发明目的是利用磁性微球从大豆及其深加工产品中快速提取基因组DNA，以进行后续转基因检测。

本发明以磁性微球为固相载体纯化核酸的方法包括以下步骤：

(1)细胞裂解：使用裂解液将样品细胞裂解，以释放其中的核酸，并离心取其中的上清液。

(2)核酸纯化：将裂解上清液与binding buffer混合，再加入二氧化硅壳磁性微球。通过binding buffer对于DNA的排挤作用，使得磁性微球特异性地与DNA结合。磁分离之后弃去上清液，磁珠-DNA复合物得以保留，其余杂质则除去。之后再用70％乙醇洗涤，除去残留杂质。

(3)核酸洗脱：在磁珠-DNA复合物中加入TE溶液，DNA即可洗脱下来，以供后续生物检测之用。

本发明的优点：

(1)不需使用有毒的有机溶剂，绿色环保，有利于操作人员的健康。

(2)操作简便，大大减少核酸纯化时间，操作时间小于2h，有效防止长时间操作造成的核酸降解。

(3)使用范围广泛，不仅适用于含有多酚、多糖的植物鲜品，还适用于含有较多PCR抑制剂、DNA片段严重断裂的深加工食品。

(4)具有自动化升级的潜力，可与磁珠分离设备配合，实现核酸提取的规模化、集成化。

附图说明

附图1.为2％的琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物。泳道左边为大豆内源Lectin基因产物，中间为外源35S基因产物，右边为外源Nos基因产物。M：2000bp marker，1-7号泳道检测样品依次为：阳性对照、大豆粉、豆腐、豆奶粉、豆腐、豆浆和空白对照。

附图2.为大豆内源Lectin基因的荧光定量PCR的检测

附图3.为大豆外源35S基因的荧光定量PCR的检测

附图4.为大豆外源NOS基因的荧光定量PCR的检测

具体实施方式

实施例1：以磁珠纯化大豆及其深加工产品的核酸。

具体实施方式：

以大豆及其大豆加工食品为例。

1.称取一定量的样品于EP离心管中。

2.加入适量的细胞裂解液，于65℃中30min，中间混匀3-4次。

3.12000rpm离心10min

4.取适量上清液(注意不要吸到杂质颗粒)于已经用binding buffer分散好的二氧化硅-磁球中，形成DNA-二氧化硅-磁球复合物。

5.充分混匀后静置10min。

6.磁分离，弃去混合溶液。

7.重复4-6。

8.用适量的70％乙醇溶液分散，洗去杂质。

9.磁分离，弃去液体。

10.重复8-9。

11.室温下充分晾干。

12.加入一定量的TE洗脱DNA，使DNA从DNA-二氧化硅-磁球复合物脱离下来。

13.磁分离，吸取液体，即得到DNA溶液，存放于4℃冰箱中备用。

实施例2：以磁性微球纯化大豆及其制品的DNA和荧光PCR检测转基因成分。

按照实施例1中的具体实施方式提取DNA，并且用于内源基因检测以及转基因35S，NOS成分的检测，具体结果见附图说明以及表一和表二。

实施例3：本发明的磁珠纯化法与其他DNA提取方法的比较。

将本发明方法与传统CTAB方法以及市售试剂盒做了对比，本发明方法可以达到下游DNA样品的要求，实验结果见表一、二。

表一大豆荧光定量PCR检测Ct值

	Lectin(Ct)	CaMV35S(Ct)	NOS(Ct)
				阳性对照	22.22	23.28	21.78
大豆粉	26.71	-	-
				豆腐	28.10	40.05	38.70
豆奶粉	26.94	-	-
				豆皮	26.92	-	-
豆浆	30.04	-	-
				毛豆油	35.25	41.22	44.35
空白对照	-	-	-

表二试剂盒以及本发明方法的数据比较(大豆及制品)

Claims

1.利用磁珠提取大豆及其深加工产品核酸的方法，其特征在于包括以下步骤：

(1)样品细胞经lysis buffer裂解之后离心取上层清液；(2)清液中加入binging buffer和二氧化硅壳磁珠，核酸在该环境下会与磁珠形成复合物。磁分离保留磁球使得核酸得到纯化，再用70％洗涤出去残留杂质；(3)磁珠-核酸复合物中加入TE溶液，核酸即可洗脱下来。

2.根据权利要求1所述的采用二氧化硅壳的磁珠快速提取纯化核酸的方法，其特征在于以带负电荷且具有磁性的二氧化硅壳磁珠为载体，直接与裂解液相互作用，带负电的二氧化硅壳磁珠与在吸附剂环境下带正电荷的核酸通过静电作用形成复合物，在外磁场作用下与细胞裂解液进行分离，再通过洗脱液的作用将核酸从磁珠上洗脱下来，从而达到了对核酸的快速分离纯化。

3.根据权利要求1所述的采用二氧化硅壳的磁珠快速提取纯化核酸的方法，其特征在于磁珠特异性地与核酸结合，而不与蛋白质、多糖、多酚等杂质结合，有利于样品的转基因成分检测。

4.根据权利要求1所述的采用二氧化硅壳的磁珠快速提取纯化核酸的方法，其特征在于使用范围广泛，不仅适用于含有多酚、多糖、高蛋白的植物鲜品，还适用于DNA片段严重断裂的深加工食品。

5.根据权利要求1所述的采用二氧化硅壳的磁珠快速提取纯化核酸的应用，其特征在于提取的核酸来源于大豆及其多种深加工产品，应用于对其转基因成分的PCR及real-time PCR检测。