CN112725427A - 一种基于荧光pcr鉴定鲟鱼性别的引物、荧光探针及试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种基于荧光PCR技术鉴定鲟鱼性别的引物、荧光探针及试剂盒，所述引物和荧光探针包括基于鲟鱼W染色体特异DNA序列设计的引物WF、引物WR和荧光探针W以及基于鲟鱼Z染色体特异DNA序列设计的引物ZF、引物ZR和荧光探针Z，所述试剂盒包括荧光PCR反应液、Taq DNA聚合酶、阴性对照和阳性对照，所述荧光PCR反应液包括上述引物和荧光探针；鲟鱼基因组样品在进行荧光PCR扩增后，进行Ct值分析；若两组引物的荧光PCR结果均为阳性，则待测样品为雌性；若W染色体特异DNA序列引物的荧光PCR结果为阴性而Z染色体特异DNA序列引物的荧光PCR结果为阳性时待测样品为雄性；本发明的鉴定方法实现在鲟鱼生命早期阶段进行性别鉴定，操作简便、结果准确、适用于生产实践。

Description

一种基于荧光PCR鉴定鲟鱼性别的引物、荧光探针及试剂盒

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域，涉及生物的分子检测，具体地涉及一种基于荧光PCR鉴定鲟鱼性别的引物、荧光探针及试剂盒。

背景技术

鲟鱼包括鲟属Acipenser和鳇属Huso，是软骨硬鳞下纲中现存唯一的目，素有“活化石”之称，鲟鱼籽酱被誉为“黑色黄金”。我国是最大的鲟鱼养殖国和主要的鲟鱼籽酱出口国，2019年中国鲟鱼子酱出口数量为139.8吨，出口金额为3253.5万美元。然而，鲟鱼生长周期长，性成熟慢，且无明显副性征，在发育早期很难从外观上区分雌雄，通常要在养殖3～4年后才能辨出雌雄，之后将雄鱼淘汰作为商品鱼上市；雌鱼养殖需要持续养殖至7～8年用于鱼籽酱生产，在目前鲟鱼养殖的市场上，不能够依照雌雄性别分别进行集约化养殖或一定性别比例进行饲养，会造成饲养过多雄性个体的资源浪费，增加了养殖成本，阻碍了鲟鱼养殖产业化的快速发展，因此，及早准确的判断鲟鱼的性别，可以减少对雄鱼的饲料投入，节约养殖成本，在生产中就显得十分重要。

在生产实践中，关于鲟鱼性别鉴定的主要方法有：(1)超声波法，(2)腹腔外侧手术法，(3)腹腔穿刺法，上述方法都需要鲟鱼性腺发育到一定阶段(3～4年鱼龄)才能鉴定，且在鉴定过程中存在鱼体脱水时间久、操作复杂、鉴定时间长等问题，容易对鱼体造成伤害。近年来，随着分子生物学的高速发展，利用分子鉴定性别的技术日趋流行，相较于传统的鉴定方法，分子鉴定方法采样方便、对生物损伤小、操作简便、结果更准确。已有研究表明鲟鱼为雌雄异体，遗传性别决定系统为ZZ/ZW型，雄性鲟鱼为ZZ，雌性鲟鱼为ZW，因此，利用分子检测方法可以实现在鲟鱼生命早期阶段进行雌雄性别鉴定。现有技术中，专利号为CN201910066586.4的中国专利公开了用于鲟鱼性别鉴定的雌性特异性DNA片段SSM2及应用，专利号为CN201910066600.0的中国专利公开了用于鲟鱼性别鉴定的雌性特异性DNA片段SSM1及应用，专利号CN201910066534.7的中国专利公开了用于雌性施氏鲟特异DNA片段及应用，上述专利提供了一些关于鲟鱼的特异性分子标记片段和引物，可用于鉴定鲟鱼的性别，但是上述专利中公开的片段仅为雌性W染色体上的特异DNA片段，设计的引物仅能扩增出一条带，一旦提取的DNA质量不好、PCR或凝胶电泳操作失误就会导致电泳图不出现条带，而将样本错判为雄性，出现假阴性的情况；此外，现有鲟鱼性别的分子鉴定方法均基于普通PCR扩增并将产物进行凝胶电泳的方式，这种方法检测的样品量受限于凝胶试样格(一般为二三十个梳孔)，在成本和效率上并不适用于生产上大规模的鲟鱼雌雄鉴别工作。

在鲟鱼性别分子鉴定方法中，性别特异性DNA标记是进行性别判断的重要工具；如果可以根据W染色体上的特异DNA片段和Z染色体上的特异DNA片段设计两对特异性引物对鲟鱼基因组进行PCR扩增，雌性(ZW)会出现两个阳性结果，而雄性(ZZ)鲟出现一个阳性结果，这样通过双阳性的结果来判断雌雄，就可以排除假阴性的可能，使结果更加可靠准确。

另外，荧光PCR技术相对普通PCR技术先进，其特点包括：1、准确性高，荧光PCR技术使用专门针对靶序列设计的特异性来识别定量分子，准确度很高，由靶序列和探针双方面控制，大大提升了普通PCR技术的特异性，降低了检测的假阳性率；2、操作简便、环保型高，使用实时荧光PCR技术进行检测是在一个管内完成的，不需要再进行凝胶电泳，可减少相关污染物的排放；3、速度快、效率高，使用荧光PCR技术不需要跑电泳，可在2～3小时完成96个样品孔或384孔的定量分析，有效地减少工作者的劳动量；因此，荧光PCR技术更适用实际生产中的鲟鱼雌雄鉴定。

发明内容

为了解决现有技术中存在的鲟鱼性别样本错判、出现假阴性、效率低下、操作繁琐等技术问题，本发明提供一种基于荧光PCR鉴定鲟鱼性别的引物、荧光探针及试剂盒，通过在鲟鱼是否呈现双阳性结果来判断雌雄，在实际生产中实现高通量、准确、快速、简便的鉴别鲟鱼生命早期阶段的性别，从而促进鲟鱼养殖产业的快速发展。

本发明的技术方案如下：

本发明公开一种基于荧光PCR鉴定鲟鱼性别的引物和荧光探针；所述引物和荧光探针包括基于鲟鱼W染色体特异DNA序列设计的引物和荧光探针W以及基于鲟鱼Z染色体特异DNA序列设计的引物和荧光探针Z；

所述基于鲟鱼W染色体特异DNA序列设计的引物分别为引物WF和引物WR；

所述引物WF如序列表中SEQ ID NO:1；

所述引物WR如序列表中SEQ ID NO:2；

所述基于鲟鱼W染色体特异DNA序列设计的荧光探针W如序列表中SEQ ID NO:3；所述荧光探针W的5'端和3'端分别连接有荧光报告基团和淬灭基团修饰，修饰所述5'端的荧光报告基团为FAM；修饰所述3'端的淬灭基团为MGB；

所述基于鲟鱼Z染色体特异DNA序列设计的引物分别为上游引物ZF和下游引物ZR；

所述上游引物ZF如序列表中SEQ ID NO:4；

所述下游引物ZR如序列表中SEQ ID NO:5；

所述基于鲟鱼Z染色体特异DNA序列设计的荧光探针Z如序列表中SEQ ID NO:6；所述荧光探针Z的5'端和3'端分别连接有荧光报告基团和淬灭基团修饰，修饰所述5'端的荧光报告基团为VIC；修饰所述3'端的淬灭基团为MGB。

本发明还公开一种基于荧光PCR技术鉴定鲟鱼性别的试剂盒，包括荧光PCR反应液、Taq DNA聚合酶、阳性对照和阴性对照；所述荧光PCR反应液包括上述引物WF和引物WR、荧光探针W、上游引物ZF和下游引物ZR以及荧光探针Z。

进一步地，所述荧光PCR反应液还包括dNTP、Mg2+、Taq缓冲液和RNase-Freewater。

进一步地，所述阳性对照为含鲟鱼W染色体特异DNA序列的StuW质粒和含鲟鱼Z染色体特异DNA序列的StuZ质粒。

进一步地，所述鲟鱼W染色体特异DNA序列为西杂W染色体特异DNA序列SEQ ID NO:7，鲟鱼Z染色体特异DNA序列为西杂Z染色体特异DNA序列SEQ ID NO:8；所述西杂为雌性为西伯利亚鲟、雄性为施氏鲟的杂交品种。

进一步地，所述阴性对照包括0.1×TE溶液。

本发明的有益效果在于：

1、本发明首次提供了鉴定鲟鱼性别的荧光PCR引物、探针及试剂盒，提供的鉴定方法避免了普通PCR鉴定需要的电泳过程，操作过程大为简化，耗时短且通量更高，大大提高了鉴定效率，更适合用于生产实践。

2、本发明提供一种快速准确鉴定鲟鱼性别的方法，在鲟鱼W染色体与Z染色体中找到外显子序列相同而内含子序列不同的基因序列，针对特异基因序列设计出特异性引物，进行PCR扩增，如果是雌性(ZW)，会出现两个阳性结果，而雄性(ZZ)则出现一个阳性结果，通过双阳性结果进行雌雄的判断，能够排除假阴性的错误，提高鉴定结果准确率；在试剂盒中设置阳性对照和阴性对照且由靶序列和探针双方面控制PCR准确性，显著降低假阳性结果；检测结果更可靠。

3、本发明提供的鲟鱼性别鉴定方法所需的鲟鱼的样品可以是鲟鱼的尾鳍、背鳍、血液、穿刺液以及口腔分泌物、肠道分泌物等拭子，对于活体鲟鱼基本无伤害。

4、本发明提供的鲟鱼性别鉴定方法操作简单、时间短、通用性高，将鲟鱼性别鉴定时间大大提前，即使刚孵化的小鲟鱼也可以做性别鉴定，有利于雌雄鲟鱼分开选育和养殖，提早销售雄鲟鱼，降低鲟鱼的养殖成本，大大推动鲟鱼养殖业的发展。

附图说明

图1为本发明实施例3中雌性鲟鱼与雄性鲟鱼的解剖图；

图2为本发明实施例1中鲟鱼样品W染色体特异DNA序列荧光PCR图；

图3为本发明实施例1中鲟鱼样品Z染色体特异DNA序列荧光PCR图；

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明进行进一步的的说明，下述实施例和附图仅用于示例性说明，不能理解为对本发明的限制；除非特别说明，下述实施例中使用的试剂原料为常规市购或商业途径获得的生化试剂原料，使用的实验仪器均为实验室常规仪器，除非特别说明，下述实施例中使用的方法和设备为本领域常规使用的方法和设备。

实施例1引物的设计与合成

收集公布的鲟鱼基因组序列，通过多重比对和分析，筛选出鲟鱼W染色体特异DNA序列和鲟鱼Z染色体特异DNA序列，根据上述序列设计出两组基于荧光PCR技术的原创引物和荧光探针。

其中，基于鲟鱼W染色体特异DNA序列设计的引物WF(核苷酸序列为SEQ ID NO:1)、引物WR(核苷酸序列为SEQ ID NO:2)和荧光探针W(SEQ ID NO:3)；所述荧光探针W的5'端和3'端分别连接有荧光报告基团和淬灭基团修饰，修饰所述5'端的荧光报告基团为FAM；修饰所述3'端的淬灭基团为MGB；

所述引物WF：5’-CTGACATTGCTGAAGAGGTTGA-3’；

所述引物WR：5’-TGGAATCTCAGAGCCAAGTTAA-3’；

所述荧光探针W：FAM-5’-TCCGTCACATATTC-3’-MGB；

其中，基于鲟鱼Z染色体特异DNA序列设计的上游引物ZF(核苷酸序列为SEQ IDNO:4)、下游引物ZR(SEQ ID NO:5)和荧光探针Z(核苷酸序列为SEQ ID NO:6)；所述荧光探针Z的5'端和3'端分别连接有荧光报告基团和淬灭基团修饰，修饰所述5'端的荧光报告基团为VIC；修饰所述3'端的淬灭基团为MGB；

所述上游引物ZF：5’-TGTGTCATAGCAAAGGGGGT-3’；

所述下游引物ZR：5’-AAGTGGGGGAAAAAATCTACATA-3’；

所述荧光探针Z：VIC-5’-ACTTTTCAGTTTTTTATTTG-3’-MGB；

经检索比对确定上述两组引物与已有报道的鲟鱼性别鉴定的引物完全不同。

实施例2试剂盒以及制备方法

本发明提供一种基于荧光PCR技术鉴定鲟鱼性别的试剂盒，包括荧光PCR反应液、Taq DNA聚合酶、阳性对照和阴性对照；

所述荧光PCR反应液包括：10μM引物WF，10μM引物WR，10μM荧光探针W，10μM引物ZF，10μM引物ZR，10μM荧光探针Z，25mM Mg²⁺，100mM dNTP，10×Taq缓冲液，RNase-Free water；

所述Taq DNA聚合酶的浓度为5U/μL；

所述阳性对照为20ng/mL含鲟鱼W染色体特异DNA序列的StuW质粒和20ng/mL含鲟鱼Z染色体特异DNA序列的StuZ质粒；具体的，鲟鱼W染色体特异DNA序列为西杂W染色体特异DNA序列SEQ ID NO:7，鲟鱼Z染色体特异DNA序列为西杂Z染色体特异DNA序列SEQ ID NO:8；其中，西杂为雌性为西伯利亚鲟、雄性为施氏鲟的杂交品种；

所述阳性对照的制备过程如下所示：

提取西杂的基因组DNA，以该基因组DNA为模板，首先，采用上游引物SEQ ID NO:9、下游引物SEQ ID NO:10进行PCR扩增，扩增得到西杂W染色体特异DNA序列SEQ ID NO:7，回收并纯化PCR产物，将其连入质粒PUC-T载体中，转化大肠杆菌DH5α，重组转化子测序验证，重组转化子培养后提取质粒，得到含西杂W染色体特异DNA序列SEQ ID NO:7的StuW质粒；然后，采用上游引物SEQ ID NO:11、下游引物SEQ ID NO:12进行PCR扩增，扩增得到西杂Z染色体特异DNA序列SEQ ID NO:8，回收并纯化PCR产物，将其连入质粒PUC-T载体中，转化大肠杆菌DH5α，重组转化子测序验证，重组转化子培养后提取质粒，得到含西杂W染色体特异DNA序列SEQ ID NO:8的StuZ质粒；

上游引物SEQ ID NO:9：5’-TTATTTTCTGTTTTATATTTG-3’；

下游引物SEQ ID NO:10：5’-TTAATTTGCTTTGTTGGAGATAG-3’；

上游引物SEQ ID NO:11：5’-GGATCGCCCTTGTGTCAT-3’；

下游引物SEQ ID NO:12：5’-GGATCGCCCTTTCACAGGGCC-3’；

所述阴性对照包括0.1×TE溶液。

实施例3利用本发明试剂盒鉴定鲟鱼性别的方法

(1)提取待检测鲟鱼样品的DNA

30条4个品种的3龄鲟鱼由福建龙鳇鲟业有限公司提供，样品信息具体情况见表1；分别取待检鲟鱼尾鳍组织样本1cm×1cm，保存于无水乙醇，同时采用解剖法鉴定鲟鱼性别，参见附图1为一例雌鲟鱼和一例雄鲟鱼的性腺图；之后，利用DNA提取试剂盒提取鲟鱼尾鳍基因组DNA，稀释至50ng/μL保存于-20℃备用；

(2)加样

向PCR反应管中，分别加入2μL待测样本或阴性对照样本或阳性对照样本、17.8μL荧光PCR反应液，0.2μL Taq DNA，盖紧管盖后瞬时离心，用于扩增；

(3)PCR扩增及荧光检测

将准备好的PCR反应管放置在荧光PCR仪中，依照已编辑的样本信息按下列条件进行扩增反应及检测，PCR检测的反应条件为：94℃-3min；94℃-5s，57℃-15s，72℃-30s；循环次数为40次；其中，反应条件的设置对扩增效率、荧光值等对检测结果的判读的影响很大，本试剂盒的最佳反应条件如上所述，循环可以进行40次，也可根据实践需求，设置不同的循环次数；

(4)检测结果分析

利用本试剂盒对样品进行检测时，阴、阳性对照应同时满足以下条件，否则本次实验视为无效，需要重做；

阳性质控：阳性对照Ct值≤36；

阴性质控：阴性对照Ct值＞36，或“Undetermined”；

然后，观察每个样品扩增曲线的Ct值，对阳性结果和阴性结果进行判定

Ct值判定标准：

样本Ct值≤36，阳性结果；样品Ct值>36或“undetermined”，阴性结果。

(5)雌雄性别判定

当W染色体特异DNA序列荧光PCR反应结果为阳性，同时Z染色体特异DNA序列的荧光PCR反应结果也为阳性时，待测样品为雌性；

当W染色体特异DNA序列荧光PCR反应结果为阴性，同时Z染色体特异DNA序列的荧光PCR反应结果也为阳性时，待测样品为雄性；

若Z染色体特异DNA序列的荧光PCR反应结果为阴性时，试验失败；

综上所述，30条4个品种的3龄鲟鱼利用本发明提供的试剂盒检测结果如表1所示：

表1本性别判定结果

从表1的样品性别判定结果可以看出，利用本发明提供的试剂盒检测的阳性对照显示有扩增曲线，阴性对照未显示有扩增曲线；根据4种鲟鱼品种的鲟鱼个体样品荧光PCR所得Ct值结果判定的鲟鱼性别与解剖法鉴定结果基本一致(样品23荧光PCR结果均为undetermined，试验失败)，进而说明本发明提供的试剂盒具有非常好的特异性。

以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。

Claims (6)

1.一种基于荧光PCR鉴定鲟鱼性别的引物和荧光探针，其特征在于：所述引物和荧光探针包括基于鲟鱼W染色体特异DNA序列设计的引物和荧光探针W以及基于鲟鱼Z染色体特异DNA序列设计的引物和荧光探针Z；

所述基于鲟鱼W染色体特异DNA序列设计的引物分别为引物WF和引物WR；

所述引物WF如序列表中SEQ ID NO:1；

所述引物WR如序列表中SEQ ID NO:2；

所述基于鲟鱼W染色体特异DNA序列设计的荧光探针W如序列表中SEQ ID NO:3；所述荧光探针W的5'端和3'端分别连接有荧光报告基团和淬灭基团修饰，修饰所述5'端的荧光报告基团为FAM；修饰所述3'端的淬灭基团为MGB；

所述基于鲟鱼Z染色体特异DNA序列设计的引物分别为上游引物ZF和下游引物ZR；

所述上游引物ZF如序列表中SEQ ID NO:4；

所述下游引物ZR如序列表中SEQ ID NO:5；

所述基于鲟鱼Z染色体特异DNA序列设计的荧光探针Z如序列表中SEQ ID NO:6；所述荧光探针Z的5'端和3'端分别连接有荧光报告基团和淬灭基团修饰，修饰所述5'端的荧光报告基团为VIC；修饰所述3'端的淬灭基团为MGB。

2.一种基于荧光PCR鉴定鲟鱼性别的试剂盒，其特征在于：包括荧光PCR反应液、TaqDNA聚合酶、阳性对照和阴性对照；所述荧光PCR反应液包括如权利要求1所述的引物WF和引物WR、荧光探针W、上游引物ZF和下游引物ZR以及荧光探针Z。

3.如权利要求2所述的一种基于荧光PCR鉴定鲟鱼性别的试剂盒，其特征在于：所述荧光PCR反应液还包括dNTP、Mg²⁺、Taq缓冲液和RNase-Free water。

4.如权利要求2所述的一种基于荧光PCR鉴定鲟鱼性别的试剂盒，其特征在于：所述阳性对照为含鲟鱼W染色体特异DNA序列的StuW质粒和含鲟鱼Z染色体特异DNA序列的StuZ质粒。

5.如权利要求2所述的一种基于荧光PCR鉴定鲟鱼性别的试剂盒，其特征在于：所述鲟鱼W染色体特异DNA序列为西杂W染色体特异DNA序列SEQ ID NO:7，鲟鱼Z染色体特异DNA序列为西杂Z染色体特异DNA序列SEQ ID NO:8；所述西杂为雌性为西伯利亚鲟、雄性为施氏鲟的杂交品种。

6.如权利要求2所述的一种基于荧光PCR鉴定鲟鱼性别的试剂盒，其特征在于：所述阴性对照包括0.1×TE溶液。

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