CN117368464A - 一种纳米金微球复合物及其制备方法和用途 - Google Patents
一种纳米金微球复合物及其制备方法和用途 Download PDFInfo
- Publication number
- CN117368464A CN117368464A CN202311320941.9A CN202311320941A CN117368464A CN 117368464 A CN117368464 A CN 117368464A CN 202311320941 A CN202311320941 A CN 202311320941A CN 117368464 A CN117368464 A CN 117368464A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- nano gold
- avidin
- microsphere
- pcr
- polypeptide
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 239000010931 gold Substances 0.000 title claims abstract description 132
- 229910052737 gold Inorganic materials 0.000 title claims abstract description 84
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 title claims abstract description 77
- 239000004005 microsphere Substances 0.000 title claims abstract description 39
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title claims abstract description 39
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 title claims abstract description 25
- 108090001008 Avidin Proteins 0.000 claims abstract description 36
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims abstract description 31
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 claims abstract description 29
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims abstract description 26
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims abstract description 26
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims abstract description 26
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 23
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 claims abstract description 21
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 claims abstract description 17
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 claims abstract description 15
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 claims abstract description 15
- 239000011616 biotin Substances 0.000 claims abstract description 15
- 239000011324 bead Substances 0.000 claims description 48
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 32
- 238000002156 mixing Methods 0.000 claims description 25
- 239000002105 nanoparticle Substances 0.000 claims description 16
- 230000003321 amplification Effects 0.000 claims description 14
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 claims description 14
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 12
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 12
- BMTZEAOGFDXDAD-UHFFFAOYSA-M 4-(4,6-dimethoxy-1,3,5-triazin-2-yl)-4-methylmorpholin-4-ium;chloride Chemical compound [Cl-].COC1=NC(OC)=NC([N+]2(C)CCOCC2)=N1 BMTZEAOGFDXDAD-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 11
- 239000003431 cross linking reagent Substances 0.000 claims description 11
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims description 10
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims description 10
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims description 10
- 239000002131 composite material Substances 0.000 claims description 10
- 238000007789 sealing Methods 0.000 claims description 7
- 108010090804 Streptavidin Proteins 0.000 claims description 6
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 6
- 239000002245 particle Substances 0.000 claims description 6
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 claims description 5
- 108010058846 Ovalbumin Proteins 0.000 claims description 2
- 229940092253 ovalbumin Drugs 0.000 claims description 2
- 239000012295 chemical reaction liquid Substances 0.000 claims 5
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 claims 2
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 claims 2
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 claims 2
- 238000002944 PCR assay Methods 0.000 claims 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 abstract description 11
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 abstract description 7
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 abstract description 7
- 230000008105 immune reaction Effects 0.000 abstract description 3
- 238000003759 clinical diagnosis Methods 0.000 abstract description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 abstract description 2
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 41
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 41
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 41
- 239000007987 MES buffer Substances 0.000 description 36
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 35
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 25
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 21
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 15
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 14
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 12
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 12
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 11
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 11
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 11
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 11
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 9
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- PFKFTWBEEFSNDU-UHFFFAOYSA-N carbonyldiimidazole Chemical compound C1=CN=CN1C(=O)N1C=CN=C1 PFKFTWBEEFSNDU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 8
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 8
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 7
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N citric acid Chemical compound OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- UQLDLKMNUJERMK-UHFFFAOYSA-L di(octadecanoyloxy)lead Chemical compound [Pb+2].CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O.CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O UQLDLKMNUJERMK-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 6
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 6
- 239000011534 wash buffer Substances 0.000 description 6
- LMDZBCPBFSXMTL-UHFFFAOYSA-N 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide Chemical compound CCN=C=NCCCN(C)C LMDZBCPBFSXMTL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 5
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 5
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108091061980 Spherical nucleic acid Proteins 0.000 description 4
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 4
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 4
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 4
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 4
- 239000000463 material Substances 0.000 description 4
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 4
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 4
- 238000012257 pre-denaturation Methods 0.000 description 4
- 230000008569 process Effects 0.000 description 4
- 239000000047 product Substances 0.000 description 4
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 4
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 4
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 3
- 206010029719 Nonspecific reaction Diseases 0.000 description 3
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 3
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 3
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 3
- 238000007885 magnetic separation Methods 0.000 description 3
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 3
- 125000002467 phosphate group Chemical group [H]OP(=O)(O[H])O[*] 0.000 description 3
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 3
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 description 3
- 125000003396 thiol group Chemical group [H]S* 0.000 description 3
- SXGZJKUKBWWHRA-UHFFFAOYSA-N 2-(N-morpholiniumyl)ethanesulfonate Chemical compound [O-]S(=O)(=O)CC[NH+]1CCOCC1 SXGZJKUKBWWHRA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- ASJSAQIRZKANQN-CRCLSJGQSA-N 2-deoxy-D-ribose Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)CC=O ASJSAQIRZKANQN-CRCLSJGQSA-N 0.000 description 2
- 239000004971 Cross linker Substances 0.000 description 2
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 2
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 2
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 description 2
- WZELXJBMMZFDDU-UHFFFAOYSA-N Imidazol-2-one Chemical group O=C1N=CC=N1 WZELXJBMMZFDDU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010048233 Procalcitonin Proteins 0.000 description 2
- PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N Sodium azide Chemical compound [Na+].[N-]=[N+]=[N-] PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 2
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 2
- KGBXLFKZBHKPEV-UHFFFAOYSA-N boric acid Chemical compound OB(O)O KGBXLFKZBHKPEV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004327 boric acid Substances 0.000 description 2
- BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-N carbonic acid Chemical compound OC(O)=O BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 2
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 2
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 2
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 2
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 2
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 2
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 2
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 2
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 2
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 2
- 238000004020 luminiscence type Methods 0.000 description 2
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 2
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 2
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 2
- 230000002335 preservative effect Effects 0.000 description 2
- -1 proClin300 Chemical compound 0.000 description 2
- CWCXERYKLSEGEZ-KDKHKZEGSA-N procalcitonin Chemical compound C([C@@H](C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](C)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)NCC(O)=O)[C@@H](C)O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=1NC=NC=1)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC=CC=1)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC=CC=1)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CCSC)NC(=O)[C@H]1NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](N)CSSC1)[C@@H](C)O)[C@@H](C)O)[C@@H](C)O)C1=CC=CC=C1 CWCXERYKLSEGEZ-KDKHKZEGSA-N 0.000 description 2
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 2
- HDTRYLNUVZCQOY-UHFFFAOYSA-N α-D-glucopyranosyl-α-D-glucopyranoside Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OC1C(O)C(O)C(O)C(CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KHWCHTKSEGGWEX-RRKCRQDMSA-N 2'-deoxyadenosine 5'-monophosphate Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(O)=O)O1 KHWCHTKSEGGWEX-RRKCRQDMSA-N 0.000 description 1
- NCMVOABPESMRCP-SHYZEUOFSA-N 2'-deoxycytosine 5'-monophosphate Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(O)=O)[C@@H](O)C1 NCMVOABPESMRCP-SHYZEUOFSA-N 0.000 description 1
- LTFMZDNNPPEQNG-KVQBGUIXSA-N 2'-deoxyguanosine 5'-monophosphate Chemical compound C1=2NC(N)=NC(=O)C=2N=CN1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(O)=O)O1 LTFMZDNNPPEQNG-KVQBGUIXSA-N 0.000 description 1
- CHHHXKFHOYLYRE-UHFFFAOYSA-M 2,4-Hexadienoic acid, potassium salt (1:1), (2E,4E)- Chemical compound [K+].CC=CC=CC([O-])=O CHHHXKFHOYLYRE-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- PBVAJRFEEOIAGW-UHFFFAOYSA-N 3-[bis(2-carboxyethyl)phosphanyl]propanoic acid;hydrochloride Chemical compound Cl.OC(=O)CCP(CCC(O)=O)CCC(O)=O PBVAJRFEEOIAGW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000251468 Actinopterygii Species 0.000 description 1
- 241000972773 Aulopiformes Species 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N D-Mannitol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N 0.000 description 1
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 1
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 229930195725 Mannitol Natural products 0.000 description 1
- WHNWPMSKXPGLAX-UHFFFAOYSA-N N-Vinyl-2-pyrrolidone Chemical compound C=CN1CCCC1=O WHNWPMSKXPGLAX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 1
- 229920003081 Povidone K 30 Polymers 0.000 description 1
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108020004682 Single-Stranded DNA Proteins 0.000 description 1
- PZBFGYYEXUXCOF-UHFFFAOYSA-N TCEP Chemical compound OC(=O)CCP(CCC(O)=O)CCC(O)=O PZBFGYYEXUXCOF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HDTRYLNUVZCQOY-WSWWMNSNSA-N Trehalose Natural products O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-WSWWMNSNSA-N 0.000 description 1
- 108010017596 Vitellins Proteins 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 description 1
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 description 1
- HDTRYLNUVZCQOY-LIZSDCNHSA-N alpha,alpha-trehalose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-LIZSDCNHSA-N 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 1
- 239000012888 bovine serum Substances 0.000 description 1
- 239000005018 casein Substances 0.000 description 1
- BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N casein, tech. Chemical compound NCCCCC(C(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CC(C)C)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(C(C)O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(COP(O)(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(N)CC1=CC=CC=C1 BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000021240 caseins Nutrition 0.000 description 1
- 238000006555 catalytic reaction Methods 0.000 description 1
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 1
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 1
- GYOZYWVXFNDGLU-XLPZGREQSA-N dTMP Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(O)=O)[C@@H](O)C1 GYOZYWVXFNDGLU-XLPZGREQSA-N 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 235000019688 fish Nutrition 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 1
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 1
- 230000002427 irreversible effect Effects 0.000 description 1
- 239000000594 mannitol Substances 0.000 description 1
- 235000010355 mannitol Nutrition 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- 238000006116 polymerization reaction Methods 0.000 description 1
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 1
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 1
- 235000010482 polyoxyethylene sorbitan monooleate Nutrition 0.000 description 1
- 229920000053 polysorbate 80 Polymers 0.000 description 1
- 229920006316 polyvinylpyrrolidine Polymers 0.000 description 1
- 239000004302 potassium sorbate Substances 0.000 description 1
- 229940069338 potassium sorbate Drugs 0.000 description 1
- 235000010241 potassium sorbate Nutrition 0.000 description 1
- 235000019515 salmon Nutrition 0.000 description 1
- 239000012266 salt solution Substances 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 238000011895 specific detection Methods 0.000 description 1
- QXKXDIKCIPXUPL-UHFFFAOYSA-N sulfanylidenemercury Chemical compound [Hg]=S QXKXDIKCIPXUPL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
- G01N33/54313—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals the carrier being characterised by its particulate form
- G01N33/54346—Nanoparticles
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Immunology (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Hematology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Nanotechnology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明涉及免疫诊断领域，特别是涉及一种纳米金微球复合物及其制备方法和用途。本发明提供的纳米金微球复合物为表面直接或间接附着有亲和素、生物素、多肽和寡核苷酸的纳米金。本发明提供的纳米金微球复合物上的DNA数量更高，通过纳米金微球复合物进行免疫反应，再通过荧光定量PCR法扩增DNA并检测荧光信号来间接检测待测蛋白的含量，因此可实现更高灵敏度的免疫PCR检测方法；本发明可使样品的检测灵敏度达到飞克级别(fg/ml)，为临床诊断提供更好的技术支持；可以为其他试剂盒的开发提供一种高灵敏度、高特异性的检测方法。
Description
技术领域
本发明涉及分子诊断领域，特别是涉及一种纳米金微球复合物及其制备方法和用途。
背景技术
免疫PCR(Immuno PCR,Im-PCR)是利用抗原抗体反应的特异性和PCR(聚合酶链式反应)扩增反应的极高灵敏性而建立的一种微量抗原的检测技术。免疫PCR主要由两个部分组成，第一部分的免疫反应类似于普通的酶联免疫吸附试验(ELISA)的测定过程；第二部分即通常的PCR扩增系统，其与一般PCR一样，主要包括引物、缓冲液和耐热DNA聚合酶，而抗原分子的量则最终由PCR扩增产物的多少来反映。比如，第一步中，首先用待测抗原(如牛血清白蛋白(BSA))包被微孔板，再加入能和其反应的特异性抗体，于是抗体就与固相上的抗原结合形成抗原抗体复合物，其中的抗体IgG再与蛋白A-链霉亲合素(Protein A-Streptavidin)嵌合体(重组融合蛋白)中的蛋白A部分结合，而链霉亲合素部分则与生物素化的DNA中的生物素特异性反应，从而将特定的DNA(脱氧核糖核酸)间接吸附于固相；第二步中的PCR过程，第一步中吸附于固相的DNA可在相应的特异性引物存在下，经PCR扩增在短时间内放大数百万倍，由于PCR产物的多少与固相上抗原的量成正比，因此可以通过定量PCR来定量检测抗原量。PCR检测技术理论上只要有一条目标DNA，就可以通过扩增检测出来，所以将其与免疫检测方法相结合，可以实现更高的检测灵敏度。
纳米金(Au)，指的是金的微小颗粒，是迄今为止应用最广泛的颗粒，它的直径在1-100nm，外表有高电子密度、具有介电特性与催化的作用，可将Au与DNA或蛋白质等分子结合，从而可应用在生化检测、生物传感器及疾病诊断、细菌检测等方面。1996年Mirkin发现了一种将Au与DNA偶联的方式，组合物叫球形核酸，其核酸外壳在高离子强度的溶液中具有较好的稳定性，根据沃森·克里克提出的碱基配对机制核酸外壳还具有较好的分子识别能力，因此后又有人将球形核酸应用于免疫PCR检测技术，来提高该技术的检测灵敏度。
目前球形核酸的制备方法有很多缺点，(1)使用巯基修饰的DNA通过金硫键特异性吸附于Au表面，但没有巯基的DNA链其实也可通过氢键非特异性吸附到Au表面，而趴于Au表面的DNA链会降低Au表面的DNA的标记量(见图2)；(2)两者混合产生的静电排斥作用会使这个吸附过程非常缓慢，有文献报道通过添加氯化钠盐，屏蔽两者间的负电荷，从而促进吸附过程，可是当Au表面电荷被屏蔽后则易发生Au的不可逆聚集，因此必须小心地控制盐的添加量，确保DNA吸附动力学速度比Au的聚合动力学快，时间也大概需要1-3天。
发明内容
鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种纳米金微球复合物及其制备方法和用途，用于提高免疫PCR检测技术的灵敏度。
为实现上述目的及其他相关目的，本发明提供一种纳米金微球复合物，所述纳米金微球复合物为表面直接或间接附着有亲和素、生物素、多肽和寡核苷酸的纳米金。
优选地，所述多肽和所述亲和素附着于所述纳米金表面，所述亲和素连接所述生物素，所述生物素连接所述寡核苷酸。
本发明还提供前述纳米金微球复合物的制备方法，所述制备方法包含如下步骤：
1)将交联剂和纳米金混合，活化纳米金；
2)将亲和素和步骤1)中活化后的纳米金混合，获得负载亲和素的纳米金；
3)将多肽和步骤2)中清洗后负载亲和素的纳米金混合，获得负载亲和素和多肽的纳米金；
4)将生物素修饰的寡核苷酸和步骤3)中负载亲和素和多肽的纳米金混合，与封闭液混合封闭，获得所述纳米金微球复合物。
本发明还提供前述纳米金微球复合物在制备免疫PCR产品中的用途。
本发明还提供一种检测试剂盒，所述检测试剂盒包含前述纳米金微球复合物。
本发明还提供一种免疫PCR检测方法，所述免疫PCR检测方法包含如下步骤：
I)将样品与偶联有和样品特异性结合的抗体的磁珠混合，分离磁珠；
II)将前述纳米金微球复合物与步骤I)中清洗后分离的磁珠混合，分离磁珠；
III)将步骤II)中清洗后分离的磁珠，进行荧光定量PCR反应，通过荧光信号检测样品的含量。
如上所述，本发明的一种纳米金微球复合物及其制备方法和用途，具有以下有益效果：
本发明提供的纳米金微球复合物上的DNA数量更高，通过纳米金微球复合物进行免疫反应，再通过荧光定量PCR法扩增DNA并检测荧光信号来间接检测待测蛋白的含量，因此可实现更高灵敏度的免疫PCR检测方法；本发明可使样品的检测灵敏度达到飞克级别(fg/ml)，为临床诊断提供更好的技术支持；可以为其他试剂盒的开发提供一种高灵敏度、高特异性的检测方法。
附图说明
图1显示为本发明的纳米金微球复合物的结构及与偶联抗体的磁珠结合示意图。
图2显示为本发明的对比例采用的球形核酸结构示意图。
图3显示为本发明的纳米金微球复合物在免疫PCR中应用的结果图。
具体实施方式
本发明提供一种纳米金微球复合物，所述纳米金微球复合物为表面直接或间接附着有亲和素、生物素、多肽和寡核苷酸的纳米金。
在一些具体实施方式中，所述亲和素选自卵白亲和素、链霉亲和素、卵黄亲和素及类亲和素。更具体地，所述亲和素为链霉亲和素。
在一些具体实施方式中，所述生物素为包含咪唑酮环的化学分子。所述咪唑酮环为与亲和素结合的部位。
在一些具体实施方式中，所述多肽为氨基酸以肽键连接在一起而形成的化合物。更具体地，所述多肽为抗体或抗原。优选地，所述多肽为抗体。更优选地，所述抗体为降钙素原抗体。
在一些具体实施方式中，所述寡核苷酸可以理解为核酸分子，通常为人工核酸分子，例如天然不存在的DNA或RNA。换句话说，人工核酸分子可以理解为非天然核酸分子。此类核酸分子由于其单独的序列(其不是天然存在的)和/或由于不是天然存在的其他修饰例如核苷酸的结构修饰而可能是非天然的。人工核酸分子可以是DNA分子、RNA分子或包含DNA和RNA部分的杂合分子。通常，可以通过基因工程方法设计和/或产生人工核酸分子以对应于所需的人工核苷酸序列(异源序列)。在这种情况下，人工序列通常是可能天然不存在的序列，即，其与野生型序列相差至少一个核苷酸。术语“野生型”可以理解为天然存在的序列。此外，术语“人工核酸分子”不限于表示“一个单一分子”，而是通常被理解为包括相同分子的整体。因此，它可以涉及包含在试样中的多个相同分子。
在一些具体实施方式中，所述多肽和所述亲和素附着于所述纳米金表面，所述亲和素连接所述生物素，所述生物素连接所述寡核苷酸即生物素修饰的寡核苷酸。
在一些具体实施方式中，所述纳米金的粒径为5-50nm。更具体地，所述纳米金的粒径为5-10、10-15、15-20、20-30、30-40或40-50nm。优选地，所述纳米金的粒径为10-40nm。
在一些具体实施方式中，所述寡核苷酸的长度为50-70bp。更具体地，所述寡核苷酸的长度为50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69或70bp。优选地，所述寡核苷酸的长度为55-65bp。
在一些具体实施方式中，所述寡核苷酸的核苷酸序列如SEQ ID NO.1：CATCTTACGACGCAACTCTTCCACTTCATCTGCATGCGCTTGTAATTCCGCTTCATC所示。
本发明还提供前述纳米金微球复合物的制备方法，所述制备方法包含如下步骤：
1)将交联剂和纳米金混合，活化纳米金，清洗去除多余的交联剂；
2)将亲和素和步骤1)中活化后的纳米金混合，获得负载亲和素的纳米金，清洗未负载的多余亲和素；
3)将多肽和步骤2)中清洗后负载亲和素的纳米金混合，获得负载亲和素和多肽的纳米金，清洗未负载的多余多肽；
4)将生物素修饰的寡核苷酸和步骤3)中负载亲和素和多肽的纳米金混合，加入封闭液封闭，获得前述纳米金微球复合物。
在一些具体实施方式中，所述制备方法还包含如下步骤：
5)将储存液和步骤4)中所述的纳米金微球复合物混合。
在一些具体实施方式中，步骤1)中所述交联剂选自EDC(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺)、DMTMM(4-(4,6-二甲氧基-1,3,5,-三嗪-2-基)-4-甲基吗啉盐酸盐水合物)、MMTM(4-(4,6-二甲氧基-1,3,5,-三嗪-2-基)-4-甲基吗啉盐酸盐水合物)或CDI(N,N'-羰基二咪唑)。
在一些具体实施方式中，以步骤1)中反应液的总体积为基准，所述交联剂的浓度为5-15mg/ml。更具体地，所述交联剂的浓度为5-7mg/ml、7-9mg/ml、9-10mg/ml、10-11mg/ml、11-13mg/ml或13-15mg/ml。优选地，所述交联剂的浓度9-11mg/ml。
在一些具体实施方式中，以步骤1)中反应液的总体积为基准，所述纳米金的浓度为40-60μg/ml。更具体地，所述纳米金的浓度为40-45μg/ml、45-50μg/ml、50-55μg/ml或55-60μg/ml。优选地，所述纳米金的浓度为45-55μg/ml。
在一些具体实施方式中，以步骤2)中反应液的总体积为基准，所述亲和素的浓度为25-45μg/ml。更具体地，所述亲和素的浓度为25-30μg/ml、30-35μg/ml、35-40μg/ml或40-45μg/ml。优选地，所述亲和素的浓度为30-40μg/ml。
在一些具体实施方式中，以步骤3)中反应液的总体积为基准，所述多肽的浓度为60-80μg/ml。更具体地，所述多肽的浓度为60-65μg/ml、65-70μg/ml、70-75μg/ml或75-80μg/ml。优选地，所述多肽的浓度为65-75μg/ml。
在一些具体实施方式中，以步骤4)中反应液的总体积为基准，所述生物素修饰的寡核苷酸的浓度为0.0001-0.01pmol/ml。更具体地，所述生物素修饰的寡核苷酸的浓度为0.0001-0.0005pmol/ml、0.0005-0.001pmol/ml、0.001-0.005pmol/ml、0.005-0.01pmol/ml。优选地，所述生物素修饰的寡核苷酸的浓度为0.0005-0.005pmol/ml。
在一些具体实施方式中，步骤1)、步骤2)、步骤3)中所述清洗采用清洗缓冲液。更具体地，所述清洗缓冲液选自磷酸缓冲液(PBS)、Tris-HCl(三(羟甲基)氨基甲烷盐酸盐)缓冲液、柠檬酸缓冲液、MES(吗啉乙磺酸)缓冲液、HEPES(N-2-羟乙基哌嗪-N'-2-乙磺酸)缓冲液、硼酸缓冲液或碳酸缓冲液。优选地，所述清洗缓冲液为MES缓冲液。
在一些具体实施方式中，步骤4)中所述封闭液或步骤5)中所述储存液包含BSA、牛血清、山羊血清、酪蛋白、明胶、鱼胶蛋白、鲑鱼精中的一种或多种。
在一些具体实施方式中，前述储存液还包含表面活性剂、蛋白保护剂和/或防腐剂。更具体地，所述表面活性剂选自Tw-20(吐温-20)、Tw-80(吐温-80)、Triton X-100(曲拉通X-100)、SDS(十二烷基硫酸钠)、PVP K30(聚乙烯吡咯烷酮K30)中的一种或多种；所述防腐剂选自叠氮钠、ProClin300、硫化汞、山梨酸钾中的一种或多种；所述蛋白保护剂选自海藻糖、葡萄糖或甘露醇中的一种或多种。
本发明还提供前述纳米金微球复合物在制备免疫PCR产品中的用途。
本发明还提供一种检测试剂盒，所述检测试剂盒包含前述纳米金微球复合物。
本发明还提供一种免疫PCR检测方法，所述免疫PCR检测方法包含如下步骤：
I)将样品与偶联有和样品特异性结合的抗体的磁珠混合，清洗后分离磁珠；
II)将前述纳米金微球复合物与步骤I)中清洗后分离的磁珠混合，清洗后分离磁珠；
III)对步骤II)中分离的磁珠，进行荧光定量PCR扩增，通过荧光信号检测样品的含量。
在一些具体实施方式中，步骤I)中所述偶联有和样品特异性结合的抗体的磁珠通过如下方式制备：
1)将交联剂和磁珠混合，活化磁珠，清洗去除多余的交联剂；
2)将和样品特异性结合的抗体和步骤1)中活化的磁珠混合，获得负载抗体的磁珠，清洗未负载的多余抗体；
3)步骤2)中负载抗体的磁珠，加入封闭液封闭，获得所述偶联有和样品特异性结合的抗体的磁珠。
在一些具体实施方式中，步骤1)中所述交联剂选自EDC(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺)、DMTMM(4-(4,6-二甲氧基-1,3,5,-三嗪-2-基)-4-甲基吗啉盐酸盐水合物)、MMTM(4-(4,6-二甲氧基-1,3,5,-三嗪-2-基)-4-甲基吗啉盐酸盐水合物)或CDI(N,N'-羰基二咪唑)。
在一些具体实施方式中，步骤1)、步骤2)中所述清洗采用清洗缓冲液。更具体地，所述清洗缓冲液选自磷酸缓冲液、Tris-HCl(三(羟甲基)氨基甲烷盐酸盐)缓冲液、柠檬酸缓冲液，MES(吗啉乙磺酸)缓冲液、HEPES(N-2-羟乙基哌嗪-N'-2-乙磺酸)缓冲液、硼酸缓冲液或碳酸缓冲液。优选地，所述清洗缓冲液为MES缓冲液。
在一些具体实施方式中，以步骤II)中反应液的总体积为基准，步骤II)中所述纳米金微球复合物与所述步骤I)中清洗后分离的磁珠的质量比1：60-1：100。更具体地，所述质量比为1：60-1：70、1：70-1：80、1：80-1：90、或1：90-1：100。优选地，所述质量为1：70-1：90。
在一些具体实施方式中，步骤III)中荧光定量PCR中引物对的核苷酸序列如SEQID No.2：CGATGAAGCGGAATTACAAGC或SEQ ID No.3：CATCTTACGACGCAACTCTTCC所示。
在一些具体实施方式中，步骤III)中所述荧光定量PCR反应包含如下特征中的一种或多种：
a)预变性的温度为90-105℃；更具体地，所述预变性的温度为90-95℃、95-100℃或100-105℃；和/或，预变性的时间为1-5min；更具体地，所述预变性的时间为1-2min、2-3min、3-4min或4-5min；
b)变性的温度为90-100℃；更具体地，所述变性的温度为90-92℃、92-94℃、94-96℃、96-98℃或98-100℃；和/或，变性的时间为5-15s；更具体地，所述变性的时间为5-7s、7-9s、9-10s、10-11s、11-13s或13-15s；
c)退火、延伸的温度为50-70℃；更具体地，所述退火、延伸的温度为50-55℃、55-60℃、60-65℃或65-70℃；和/或，退火、延伸的时间为10-30s；更具体地，所述退火、延伸的时间为10-15s、15-20s、20-25s或25-30s；
4)扩增的循环数为30-50；更具体地，所述扩增的循环数为30-35、35-40、40-45或45-50。
本申请中，术语“DNA”是脱氧核糖核酸的常用缩写。它是核酸分子，即由核苷酸组成的聚合物。这些核苷酸通常是脱氧腺苷单磷酸、脱氧胸苷单磷酸、脱氧鸟苷单磷酸和脱氧胞苷单磷酸单体，它们本身由糖部分(脱氧核糖)、碱基部分和磷酸部分组成，并通过特征性的骨架结构聚合。通常，骨架结构由第一核苷酸的糖部分即脱氧核糖和第二相邻单体的磷酸部分之间的磷酸二酯键形成。单体的特定顺序，即与糖/磷酸骨架相连的碱基的顺序，被称为DNA序列。DNA可以是单链或双链的。在双链形式中，第一链的核苷酸通常与第二链的核苷酸杂交，例如通过A/T碱基配对和G/C碱基配对杂交。
以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。
在进一步描述本发明具体实施方式之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围；在本发明说明书和权利要求书中，除非文中另外明确指出，单数形式“一个”、“一”和“这个”包括复数形式。
当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。
实施例1 纳米金微球复合物在免疫PCR中的应用
一种使用纳米金微球复合物试剂盒的制备：
偶联有抗体的磁珠(FB-PCT Ab A)制备：
洗涤FB(即磁珠)：于2ml无菌离心管中，加入10ul 100mg/ml的FB，再加入100ulpH5.0MES缓冲液，振荡混匀，并磁分离(磁力架上静置2min，移除全部液体)，如此重复洗涤2次；
活化FB：于上述离心管中，加入100ul 1mg/ml EDC(MES溶解)，37度孵育30min后，用MES洗涤2次，并磁分离；
包被Ab：于上述离心管中，加入100ul 600ug/ml PCT Ab A(MES稀释)，37度孵育5h后，用MES洗涤2次，并磁分离；
封闭FB：于上述离心管中，加入200ul封闭液(pH7.0 PBS+1％BSA)，37度孵育1h后，用清洗液(即PBST，pH7.0 PBS+0.05％Tw20)洗涤2次，并磁分离；
储存FB：于上述离心管中，加入1ml储存液(PBST+1％BSA+0.02％NaN3)，FB-PCT AbA的终浓度为1mg/ml，于2-8度存放。
纳米金微球复合物(PCT Ab B-Au-SA-Bio-ssDNA)的制备：
制备Au-SA(纳米金偶联链霉亲和素)：于2ml无菌离心管中，加入100ul 50ug/mlAu(20nm)，加入10ul 10mg/ml DMTMM(MES溶解)，加入100ul 70ug/ml SA(MES稀释)，37度孵育30min后，12000g离心10min，去上清，加100ul MES洗涤Au，离心去上清；
制备Ab-Au-SA(纳米金偶联链霉亲和素和抗体)：于上述离心管中，加入100ul70ug/ml PCT Ab B(MES稀释)，37度孵育1h后，12000g离心10min，去上清，加100ul MES洗涤Au，离心去上清；
制备Ab-Au-SA-Bio-ssDNA(纳米金微球复合物)：于上述离心管中，加入100ul0.01pmol/ml Bio-ssDNA(生物素修饰的寡核苷酸)(PBS稀释)，37度孵育30min后，12000g离心10min，去上清，加100ul清洗液洗涤Au，离心去上清，重复洗涤3次；
封闭：于上述离心管中，加入100ul封闭液，37度孵育1h后，加100ul清洗液洗涤Au，离心去上清，重复洗涤2次；
储存：于上述离心管中，加入100ul储存液，PCT Ab B-Au-SA-Bio-ssDNA(纳米金微球复合物)的终浓度为50ug/ml，于2-8度存放。
应用本免疫PCR技术检测PCT Ag(降钙素原抗原)：
偶联抗体的磁珠与纳米金微球复合物的结合方式如图1所示。使用偶联抗体的磁珠与纳米金微球复合物的免疫PCR技术检测具体方法如下：
步骤1：于5个1.5ml离心管中，分别加入2ul FB-PCT Ab A(1mg/ml)，加入100ul不同浓度的PCT Ag(0pg/ml，0.024pg/ml，2.4pg/ml，240pg/ml，2400pg/ml)，37度孵育30min后，磁分离，加入200ul清洗液，振荡混匀5s，磁分离，如此重复洗涤磁珠2次；
步骤2：于上述离心管中，分别加入100ul PCT Ab B-Au-SA-Bio-ssDNA(1:200，PBST稀释)，37度孵育30min后，用清洗液洗涤磁珠3次，磁分离，加入10ul无酶水重悬；
步骤3：于PCR管中，加入PCR反应预混液和引物对共15ul，再加入上述重悬液10ul，放入实时荧光定量PCR分析仪中，进行扩增检测，扩增条件是：95度3分钟；95度10秒，60度15秒，共40个循环；
结果如图3所示，图3数据整理如表1：上述结果表明使用偶联抗体的磁珠与纳米金微球复合物的免疫PCR技术检测的检测灵敏度可至0.024pg/ml，即24fg/ml。
表1
| PCT浓度 | Ct |
| 24000pg/ml | 18.66 |
| 240pg/ml | 23.64 |
| 2.4pg/ml | 29.31 |
| 0.024pg/ml | 35.5 |
| 0 | N/A |
实施例2 不同DNA连接方式的纳米金微球复合物的检测对比
采用两种方法制备DNA-Au，并检测比较其DNA的标记量和其与磁珠的非特异性反应情况：
制备Au-SA-Bio-ssDNA步骤：
制备Au-SA：于2ml无菌离心管中，加入100ul 50ug/ml Au(20nm)，加入10ul 10mg/ml DMTMM(MES溶解)，加入100ul 70ug/ml SA(MES稀释)，37度孵育30min后，12000g离心10min，去上清，加100ul MES洗涤Au，离心去上清；
制备Au-SA-Bio-ssDNA：于上述离心管中，加入100ul 0.01pmol/ml Bio-ssDNA(PBS稀释)，37度孵育30min后，12000g离心10min，去上清，加100ul PBS洗涤Au，离心去上清，重复洗涤3次；加100ul TBS(Tris-HCl盐溶液)重悬后于4度保存；
制备Au-S-ssDNA(纳米金偶联巯基单链DNA，结构如图2所示)步骤：
活化SH-ssDNA：于2ml无菌离心管中，取10ul 10uM DNA，加入90ul无酶水，加入1ul20mM TCEP(三(2-羧乙基)膦盐酸盐)，室温反应2h；
制备Au-S-ssDNA：于2ml无菌离心管中，加入100ul 50ug/ml Au(20nm)，用3ul10mM NaOH调节pH至pH9.0，加入加入1ul 1pmol/ml活化的SH-ssDNA，37度孵育1h后，加入无酶水300ul，加入20ul 0.2M pH7.1的PB，放置于4度，24h内分6次加入2M NaCl，每次4ul；12000g离心10min，去上清，加100ul PBS洗涤Au，离心去上清，重复洗涤3次；加100ul TBS重悬后于4度保存；
用PCR法检测DNA-Au的DNA标记量：
步骤：于PCR管中，加入PCR反应预混液和引物对共18ul，再加入重悬液2ul，放入实时荧光定量PCR分析仪中，进行扩增检测，扩增条件是：95度3分钟；95度10秒，60度15秒，共40个循环，结果如表2所示；
用PCR法检测DNA-Au与磁珠的非特异性反应：
步骤1：于1.5ml离心管中，分别加入5ul磁珠(1mg/ml)，加入100ul DNA-Au(1:100，无酶水稀释)，37度孵育30min后，用无酶水洗涤磁珠3次，磁分离；加入10ul无酶水重悬磁珠；
步骤2：于PCR管中，加入PCR反应预混液和引物对共15ul，再加入上述重重悬液10ul，放入实时荧光定量PCR分析仪中，进行扩增检测，扩增条件是：95度3分钟；95度10秒，60度15秒，共40个循环，结果如表3所示；
表2
表3
| 反应浓度(1:100) | Au-S-ssDNA | Au-SA-Bio-ssDNA |
| 检测样本量(5ug) | 磁珠 | 磁珠 |
| 编号 | Ct | Ct |
| 1 | 24.58 | 29.62 |
| 2 | 25.01 | 29.15 |
| AVE CT | 24.795 | 29.385 |
从表2的结果可以看出，Au-SA-Bio-ssDNA的DNA标记量比直连法制备的Au-S-ssDNA的要高即Au-SA-Bio-ssDNA组的ct值比Au-S-ssDNA的ct值小，而表3的结果表明，就磁珠-Ab的非特异性反应，Au-SA-Bio-ssDNA也比Au-S-ssDNA的低，说明前者的DNA标记效果明显优于后者，所以选择Au-SA-Bio-ssDNA的制备方法。
实施例3 纳米金微球复合物中金微球粒径的筛选
别选择10nm，20nm，40nm三种规格的纳米金制备Au-SA-Bio-DNA，并检测比较DNA标记量：
制备10nm Au-SA-Bio-ssDNA步骤：
制备Au-SA：于2ml无菌离心管中，分别加入100ul 50ug/ml Au(10nm)，加入10ul10mg/ml DMTMM(MES溶解)，再分别加入100ul 70ug/ml SA(MES稀释)，37度孵育30min后，10000g离心8min，去上清，加100ul MES洗涤Au，离心去上清；
制备Au-SA-Bio-ssDNA：于上述离心管中，加入100ul 0.01pmol/ml Bio-DNA(PBS稀释)，37度孵育30min后，10000g离心8min，去上清，加100ul PBS洗涤Au，离心去上清，重复洗涤3次；加100ul TBS重悬后于4度保存；
制备20nm Au-SA-Bio-ssDNA步骤：
制备Au-SA：于2ml无菌离心管中，分别加入100ul 50ug/ml Au(20nm)，加入10ul10mg/ml DMTMM(MES溶解)，再分别加入100ul 70ug/ml SA(MES稀释)，37度孵育30min后，12000g离心10min，去上清，加100ul MES洗涤Au，离心去上清；
制备Au-SA-Bio-ssDNA：于上述离心管中，加入100ul 0.01pmol/ml Bio-DNA(PBS稀释)，37度孵育30min后，12000g离心10min，去上清，加100ul PBS洗涤Au，离心去上清，重复洗涤3次；加100ul TBS重悬后于4度保存；
制备40nm Au-SA-Bio-ssDNA步骤：
制备Au-SA：于2ml无菌离心管中，分别加入100ul 50ug/ml Au(40nm)，加入10ul10mg/ml DMTMM(MES溶解)，再分别加入100ul 70ug/ml SA(MES稀释)，37度孵育30min后，15000g离心20min，去上清，加100ul MES洗涤Au，离心去上清；
制备Au-SA-Bio-ssDNA：于上述离心管中，加入100ul 0.01pmol/ml Bio-DNA(PBS稀释)，37度孵育30min后，15000g离心20min，去上清，加100ul PBS洗涤Au，离心去上清，重复洗涤3次；加100ul TBS重悬后于4度保存；
不同大小的纳米金离心时间需不同，离心时间不够其沉淀易分散，离心时间过长易出现死金；
用PCR法检测DNA-Au的DNA标记量：
步骤：于PCR管中，加入PCR反应预混液和引物对共18ul，再加入重悬液2ul，放入实时荧光定量PCR分析仪中，进行扩增检测，扩增条件是：95度3分钟；95度10秒，60度15秒，共40个循环，结果如表4所示；
表4
| Au大小 | 10nm | 20nm | 40nm |
| 检测样本量(2ul) | Au-SA-Bio-ssDNA | Au-SA-Bio-ssDNA | Au-SA-Bio-ssDNA |
| 编号 | Ct | Ct | Ct |
| 1 | 11.78 | 12.24 | 13.52 |
| 2 | 11.53 | 12.06 | 13.27 |
| AVE CT | 11.655 | 12.15 | 13.395 |
从表4的结果可见，纳米金越小，DNA的标记量越高一些，考虑是纳米金越小，其比表面积越大，结合的DNA量会相对越多，但纳米金越小，离心沉淀需要的离心力越高，离心时间越长，增加了制备时间和难度，综合考虑选择20nm的Au会比较适用
实施例4 纳米金微球复合物中亲和素条件的筛选
分别选择用3.5ug，7ug，10.5ug三种量的SA制备Au-SA-Bio-DNA，并检测比较DNA标记量：
制备Au-SA：于3个2ml无菌离心管中，分别加入100ul 50ug/ml Au(20nm)，加入10ul 10mg/ml DMTMM(MES溶解)，再分别加入70ug/ml SA(MES稀释)50ul、100ul、150ul，37度孵育30min后，12000g离心10min，去上清，加100ul MES洗涤Au，离心去上清；
制备Au-SA-Bio-ssDNA：于上述离心管中，加入100ul 0.01pmol/ml Bio-DNA(PBS稀释)，37度孵育30min后，12000g离心10min，去上清，加100ul PBS洗涤Au，离心去上清，重复洗涤3次；加100ul TBS重悬后于4度保存；
用PCR法检测DNA-Au的DNA标记量：
步骤：于PCR管中，加入PCR反应预混液和引物对共18ul，再加入重悬液2ul，放入实时荧光定量PCR分析仪中，进行扩增检测，扩增条件是：95度3分钟；95度10秒，60度15秒，共40个循环，其结果表5所示；
表5
| SA标记量 | 3.5ug | 7ug | 10.5ug |
| 检测样本量(2ul) | Au-SA-Bio-ssDNA | Au-SA-Bio-ssDNA | Au-SA-Bio-ssDNA |
| 编号 | Ct | Ct | Ct |
| 1 | 14.43 | 12.24 | 11.82 |
| 2 | 14.96 | 12.18 | 12.12 |
| AVE CT | 14.695 | 12.15 | 11.97 |
从表5的结果可见，7ug SA的DNA标记量比3.5ug的有明显提高，但是再提高SA的标记量至10.5ug时，Ct值提高就不明显了，所以综合考虑选择SA的标记量为7ug。
实施例5 纳米金微球复合物中多肽条件的筛选
分别选择用3.5ug，7ug，10.5ug三种量的PCT Ab B制备Ab-Au-SA-Bio-DNA，并检测比较DNA标记量和Ab标记量：
制备Ab-Au-SA-Bio-ssDNA步骤：
制备Au-SA：于3个2ml无菌离心管中，加入100ul 50ug/ml Au(20nm)，加入10ul10mg/ml DMTMM(MES溶解)，加入100ul 70ug/ml SA(MES稀释)，37度孵育30min后，12000g离心10min，去上清，加100ul MES洗涤Au，离心去上清；
制备Ab-Au-SA：于上述离心管中，分别加入70ug/ml PCT Ab B(MES稀释)50ul、100ul、150ul，37度孵育1h后，12000g离心10min，去上清，加100ul MES洗涤Au，离心去上清；
制备Ab-Au-SA-Bio-ssDNA：于上述离心管中，加入100ul 0.01pmol/ml Bio-ssDNA(PBS稀释)，37度孵育30min后，12000g离心10min，去上清，加100ul PBS洗涤Au，离心去上清，重复洗涤3次，加100ul PBS重悬；
用PCR法检测DNA-Au的DNA标记量：
步骤：于PCR管中，加入PCR反应预混液和引物对共18ul，再加入重悬液2ul，放入实时荧光定量PCR分析仪中，进行扩增检测，扩增条件是：95度3分钟；95度10秒，60度15秒，共40个循环，结果如表6所示；
表6
将制备好的Ab-Au-SA-Bio-ssDNA与羊抗鼠-吖啶酯反应，用化学发光法检测Ab标记量：
步骤：于1.5ml离心管中，分别加入2ul Ab-Au-SA-Bio-ssDNA(50ug/ml)，加入100ul羊抗鼠-吖啶酯(1:1000，0.5mg/ml，PBST稀释)，37度孵育30min后，12000g离心10min，去上清，用PBST洗涤3次，离心去上清；加入100ul PBST重悬，上化学发光仪检测信号，结果如表7所示；
表7
| Ab标记量 | 3.5ug | 7ug | 10.5ug |
| 检测样本量(2ul) | Ab-Au-SA-Bio-ssDNA | Ab-Au-SA-Bio-ssDNA | Ab-Au-SA-Bio-ssDNA |
| 编号 | 发光信号 | 发光信号 | 发光信号 |
| 1 | 612543 | 1028664 | 1112573 |
| 2 | 633259 | 1035463 | 1145218 |
| AVE CT | 622901 | 1032063 | 1128895 |
从表6结果可见，抗体的标记量多少并不影响SA与Bio-ssDNA的反应，因此DNA的CT值基本一致。
从表7结果可见，7ug Ab的发光信号比3.5ug的有明显提高，但是再提高Ab的标记量至10.5ug时，发光信号提高就不明显了，所以综合考虑选择Ab的标记量为7ug。
实施例6 纳米金微球复合物中生物素修饰的寡核苷酸条件的筛选
分别选择用0.01pmol，0.001pmol，0.0001pmol三种量的Bio-ssDNA制备Au-SA-Bio-DNA，并检测比较DNA标记量和与磁珠的非特异性反应情况：
制备Au-SA-Bio-ssDNA步骤：
制备Au-SA：于3个2ml无菌离心管中，加入100ul 50ug/ml Au(20nm)，加入10ul10mg/ml DMTMM(MES溶解)，加入100ul 70ug/ml SA(MES稀释)，37度孵育30min后，12000g离心10min，去上清，加100ul MES洗涤Au，离心去上清；
制备Au-SA-Bio-ssDNA：于上述离心管中，分别加入0.1pmol/ml、0.01pmol/ml、0.001pmol/ml Bio-ssDNA(PBS稀释)各100ul，37度孵育30min后，12000g离心10min，去上清，加100ul PBS洗涤Au，离心去上清，重复洗涤3次；加100ul TBS重悬后于4度保存；
用PCR法检测DNA-Au的DNA标记量：
步骤：于PCR管中，加入PCR反应预混液和引物对共18ul，再加入重悬液2ul，放入实时荧光定量PCR分析仪中，进行扩增检测，扩增条件是：95度3分钟；95度10秒，60度15秒，共40个循环，结果如表8所示。
用PCR法检测DNA-Au与磁珠的非特异性反应：
步骤1：于1.5ml离心管中，分别加入5ul磁珠(1mg/ml)，加入100ul DNA-Au(1:100，无酶水稀释)，37度孵育30min后，用无酶水洗涤磁珠3次，磁分离；加入10ul无酶水重悬磁珠；
步骤2：于PCR管中，加入PCR反应预混液和引物对共15ul，再加入上述重重悬液10ul，放入实时荧光定量PCR分析仪中，进行扩增检测，扩增条件是：95度3分钟；95度10秒，60度15秒，共40个循环，结果如表9所示。
表8
| Bio-ssDNA反应量 | 0.01pmol | 0.001pmol | 0.0001pmol |
| 检测样本量(2ul) | Au-SA-Bio-ssDNA | Au-SA-Bio-ssDNA | Au-SA-Bio-ssDNA |
| 编号 | Ct | Ct | Ct |
| 1 | 10.90 | 11.84 | 15.65 |
| 2 | 10.93 | 11.99 | 15.15 |
| AVE CT | 10.915 | 11.915 | 15.4 |
表9
| Bio-ssDNA反应量 | 0.01pmol | 0.001pmol | 0.0001pmol |
| 反应浓度(1:100) | Au-SA-Bio-ssDNA | Au-SA-Bio-ssDNA | Au-SA-Bio-ssDNA |
| 检测样本量(5ug) | 磁珠 | 磁珠 | 磁珠 |
| 编号 | Ct | Ct | Ct |
| 1 | 25.66 | 29.39 | 30.11 |
| 2 | 25.89 | 29.15 | 30.00 |
| AVE | 25.775 | 29.27 | 30.055 |
从表8、表9可见，表9显示的是Au-SA-Bio-ssDNA与磁珠的非特异性反应结果，从结果看Bio-ssDNA的反应量过高会导致非特异性结果的升高即高反应量Bio-ssDNA的ct值相较真实值(可理解为相较于0.01pmol、0.001pmol、0.0001pmol Bio-ssDNA反应量的平均值)偏小；表8是Au-SA-Bio-ssDNA上DNA量的测试结果，从结果看Bio-ssDNA的反应量过低会导致DNA的标记量显著下降即低反应量Bio-ssDNA的ct值相较真实值偏大，所以综合考虑两者的情况，Bio-ssDNA的反应量选择0.001pmol。
以上的实施例是为了说明本发明公开的实施方案，并不能理解为对本发明的限制。此外，本文所列出的各种修改以及发明中方法的变化，在不脱离本发明的范围和精神的前提下对本领域内的技术人员来说是显而易见的。虽然已结合本发明的多种具体优选实施例对本发明进行了具体的描述，但应当理解，本发明不应仅限于这些具体实施例。事实上，各种如上所述的对本领域内的技术人员来说显而易见的修改来获取发明都应包括在本发明的范围内。
Claims (10)
1.一种纳米金微球复合物，其特征在于，所述纳米金微球复合物为表面直接或间接附着有亲和素、生物素、多肽和寡核苷酸的纳米金。
2.根据权利要求1所述的纳米金微球复合物，其特征在于，所述多肽和所述亲和素附着于所述纳米金表面，所述亲和素连接所述生物素，所述生物素连接所述寡核苷酸。
3.根据权利要求1所述的纳米金微球复合物，其特征在于，所述纳米金微球还包含如下特征中的一项或多项：
1)所述亲和素选自卵白亲和素、链霉亲和素、卵黄亲和素及类亲和素；
2)所述多肽为抗体或抗原；
3)所述寡核苷酸的长度为50-70bp；
4)所述纳米金的粒径为5-50nm。
4.根据权利要求3所述的纳米金微球复合物，其特征在于，所述寡核苷酸的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。
5.如权利要求1-4任一所述纳米金微球复合物的制备方法，其特征在于，所述制备方法包含如下步骤：
1)将交联剂和纳米金混合，活化纳米金；
2)将亲和素和步骤1)中活化后的纳米金混合，获得负载亲和素的纳米金；
3)将多肽和步骤2)中清洗后负载亲和素的纳米金混合，获得负载亲和素和多肽的纳米金；
4)将连有连有多核苷酸的生物素和步骤3)中负载亲和素和多肽的纳米金混合，与封闭液混合封闭，获得所述纳米金微球复合物。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，还包含如下特征中一项或多项：
a)步骤1)中所述交联剂选自EDC、DMTMM、MMTM或CDI；
b)以步骤1)中反应液的总体积为基准，所述交联剂的浓度为5-15mg/ml；
c)以步骤1)中反应液的总体积为基准，所述纳米金的浓度为40-60μg/ml；
d)以步骤2)中反应液的总体积为基准，所述亲和素的浓度为25-45μg/ml；
e)以步骤3)中反应液的总体积为基准，所述多肽的浓度为60-80μg/ml；
f)以步骤4)中反应液的总体积为基准，所述连有多核苷酸的生物素的浓度为0.001-0.01pmol/ml。
7.如权利要求1-4任一所述的纳米金微球复合物在制备免疫PCR产品中的用途。
8.一种检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒包含如权利要求1-4任一所述的纳米金微球复合物。
9.一种免疫PCR检测方法，其特征在于，所述免疫PCR检测方法包含如下步骤：
I)将样品与偶联有和样品特异性结合的抗体的磁珠混合，分离磁珠；
II)将如权利要求1-4任一所述的纳米金微球复合物与步骤I)中分离的磁珠混合，分离磁珠；
III)对步骤II)中分离的磁珠，进行荧光定量PCR扩增，通过荧光信号检测样品的含量。
10.根据权利要求9所述的免疫PCR检测方法，其特征在于，免疫PCR检测方法还包含如下特征中的一种或多种：
1)以步骤II)中反应液的总体积为基准，步骤II)中所述纳米金微球复合物与所述步骤I)中分离的磁珠的质量比1：60-1：100；
2)步骤III)中荧光定量PCR中引物对的核苷酸序列如SEQ ID No.2或SEQ ID No.3所示。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202311320941.9A CN117368464B (zh) | 2023-10-12 | 2023-10-12 | 一种纳米金微球复合物及其制备方法和用途 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202311320941.9A CN117368464B (zh) | 2023-10-12 | 2023-10-12 | 一种纳米金微球复合物及其制备方法和用途 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN117368464A true CN117368464A (zh) | 2024-01-09 |
| CN117368464B CN117368464B (zh) | 2024-09-17 |
Family
ID=89395771
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202311320941.9A Active CN117368464B (zh) | 2023-10-12 | 2023-10-12 | 一种纳米金微球复合物及其制备方法和用途 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN117368464B (zh) |
Citations (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1415759A (zh) * | 2002-10-14 | 2003-05-07 | 上海华冠生物芯片有限公司 | 纳米微粒与亲和素标记探针及其制备方法和应用 |
| CN101241126A (zh) * | 2008-03-14 | 2008-08-13 | 东华大学 | 一种生物条形码探针的制备方法 |
| CN101256191A (zh) * | 2008-03-07 | 2008-09-03 | 中国科学院上海微系统与信息技术研究所 | 基于磁珠和纳米金探针的微量蛋白质的测定方法 |
| CN101545007A (zh) * | 2009-04-30 | 2009-09-30 | 中国科学院上海微系统与信息技术研究所 | 一种纳米金生物复合探针、检测方法及其应用 |
| CN101566626A (zh) * | 2008-07-22 | 2009-10-28 | 深圳市人民医院 | 一种抗原检测方法及其应用 |
| CN101942386A (zh) * | 2009-07-08 | 2011-01-12 | 中国科学院广州生物医药与健康研究院 | 核酸纳米金生物传感器及其制备方法 |
| WO2017181339A1 (zh) * | 2016-04-19 | 2017-10-26 | 廖世奇 | 蛋白配体和基因同时检测方法及试剂盒 |
| WO2023025281A1 (zh) * | 2021-08-26 | 2023-03-02 | 深圳市亚辉龙生物科技股份有限公司 | 胶体金层析试剂条、制备方法以及新冠抗原检测试剂盒 |
-
2023
- 2023-10-12 CN CN202311320941.9A patent/CN117368464B/zh active Active
Patent Citations (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1415759A (zh) * | 2002-10-14 | 2003-05-07 | 上海华冠生物芯片有限公司 | 纳米微粒与亲和素标记探针及其制备方法和应用 |
| CN101256191A (zh) * | 2008-03-07 | 2008-09-03 | 中国科学院上海微系统与信息技术研究所 | 基于磁珠和纳米金探针的微量蛋白质的测定方法 |
| CN101241126A (zh) * | 2008-03-14 | 2008-08-13 | 东华大学 | 一种生物条形码探针的制备方法 |
| CN101566626A (zh) * | 2008-07-22 | 2009-10-28 | 深圳市人民医院 | 一种抗原检测方法及其应用 |
| CN101545007A (zh) * | 2009-04-30 | 2009-09-30 | 中国科学院上海微系统与信息技术研究所 | 一种纳米金生物复合探针、检测方法及其应用 |
| CN101942386A (zh) * | 2009-07-08 | 2011-01-12 | 中国科学院广州生物医药与健康研究院 | 核酸纳米金生物传感器及其制备方法 |
| WO2017181339A1 (zh) * | 2016-04-19 | 2017-10-26 | 廖世奇 | 蛋白配体和基因同时检测方法及试剂盒 |
| WO2023025281A1 (zh) * | 2021-08-26 | 2023-03-02 | 深圳市亚辉龙生物科技股份有限公司 | 胶体金层析试剂条、制备方法以及新冠抗原检测试剂盒 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| EDWARD A. BAYER AND HAYA BEN-HUR AND MEIR WILCHEK: "A sensitive enzyme assay for biotin, avidin, and streptavidin", ANALYTICAL BIOCHEMISTRY, vol. 154, no. 1, 31 December 1986 (1986-12-31) * |
| JONAS W. PEREZ: "Detection of respiratory syncytial virus using nanoparticle amplified immuno-polymerase chain reaction", ANALYTICAL BIOCHEMISTRY, 25 November 2010 (2010-11-25), pages 141 - 148 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN117368464B (zh) | 2024-09-17 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| EP1563100B1 (en) | Displacement sandwich immuno-pcr | |
| WO2017181339A1 (zh) | 蛋白配体和基因同时检测方法及试剂盒 | |
| CN111381025A (zh) | 用于多重检测的免疫检测试剂盒、应用以及多重检测方法 | |
| CN112285353A (zh) | 一种提高链霉亲和素-生物素反应体系的化学发光试剂盒抗生物素干扰能力和灵敏度的方法 | |
| CN112175225A (zh) | 一种聚乙二醇修饰的固相表面及其制备方法和应用 | |
| CN117368464B (zh) | 一种纳米金微球复合物及其制备方法和用途 | |
| US20130224770A1 (en) | Antibody Diluent Buffer | |
| Gong et al. | Combination of functionalized nanoparticles and polymerase chain reaction-based method for SARS-CoV gene detection | |
| CA3161636A1 (en) | A library of prefabricated microparticles and precursors thereof | |
| CN112924666A (zh) | 固体支持物包被产物及其制备方法、应用和产品 | |
| CN117405878B (zh) | 一种二氧化硅微球复合物及其制备方法和用途 | |
| CN112946266B (zh) | 一种具有荧光信号放大功能的三维dna微球及其制备方法与应用 | |
| CN116448995A (zh) | 一种单分子免疫分析检测方法 | |
| JPH05219994A (ja) | シグナル産生部分およびその使用法 | |
| CN110672836A (zh) | 磁珠包被物及其制备方法和应用、检测试剂盒 | |
| CN116338168A (zh) | 一种用于检测黄曲霉毒素b1的磁分离检测试剂盒和方法 | |
| KR101273453B1 (ko) | 효소가 집적된 미세튜브를 이용한 정량분석법 | |
| CN113866157A (zh) | 聚乙烯亚胺类化合物在发光法体外诊断试剂中的应用 | |
| JP4437193B2 (ja) | 核酸ライブラリー及びタンパク質ライブラリー | |
| CN116970611B (zh) | 一种结合猴痘病毒表面包膜蛋白的核酸适体及其应用 | |
| CN117384998A (zh) | 一种基于噬菌体复合物的免疫pcr检测蛋白的方法 | |
| US7332352B2 (en) | Separation particles | |
| CN115838728B (zh) | 新冠病毒全长核衣壳蛋白dna核酸适体的体外筛选方法 | |
| WO2023243694A1 (ja) | ポリヌクレオチドを用いた被検物質の検出方法 | |
| KR101395398B1 (ko) | 바이러스-마이크로비드 복합체 및 이의 용도 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| TA01 | Transfer of patent application right | ||
| TA01 | Transfer of patent application right |
Effective date of registration: 20240528 Address after: 214122 Xiuxi Road 58-7, Binhu District, Wuxi City, Jiangsu Province (Business premises: Xiuxi Road 59-8, Binhu District, Wuxi City) Applicant after: KENIGEWOSI (WUXI) MEDICAL TECHNOLOGY Co.,Ltd. Country or region after: China Applicant after: SHANGHAI ADVANCED CLINICAL LABORATORY SCIENCE Co.,Ltd. Address before: 201102 room 288, floor 2, building 8, No. 320, Donglan Road, Minhang District, Shanghai Applicant before: SHANGHAI ADVANCED CLINICAL LABORATORY SCIENCE Co.,Ltd. Country or region before: China |
|
| GR01 | Patent grant |