CN110672836A - 磁珠包被物及其制备方法和应用、检测试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种磁珠包被物及其制备方法和应用、检测试剂盒。该磁珠包被物包括：蛋白质、聚乙二醇修饰剂和纳米磁珠，聚乙二醇修饰剂与蛋白质共价连接，纳米磁珠与蛋白质连接。上述磁珠包被物的稳定性较好。
Description
技术领域
本发明涉及免疫学检测，特别是涉及一种磁珠包被物及其制备方法和应用、检测试剂盒。
背景技术
磁珠包被物通过将抗原或者抗体结合到磁珠的表面而得到。磁珠包被物能够作为免疫检测试剂的组成部分，以应用于免疫检测和免疫诊断中，例如化学发光平台的免疫检测和免疫诊断。一般地，通过将待测样品与磁珠包被物表面的抗原或者抗体进行免疫反应以捕获待测样品中的待检测物，再利用化学发光技术对捕获到的待检测物进行定量或者定性检测。磁珠包被物作为免疫检测试剂的重要成分，对免疫检测试剂的性能影响巨大。然而，现有的磁珠包被物的稳定性相对较差，不能满足实际需要。
发明内容
基于此，有必要提供一种稳定性较好的磁珠包被物。
此外，还提供一种磁珠包被物的制备方法、应用和检测试剂盒。
一种磁珠包被物，包括：蛋白质、聚乙二醇修饰剂和纳米磁珠，所述聚乙二醇修饰剂与所述蛋白质共价连接，所述纳米磁珠与所述蛋白质连接。
上述磁珠包被物通过将聚乙二醇修饰剂与蛋白质共价连接，使得蛋白质连接有PEG臂，以增加蛋白质的空间结构刚性，提高蛋白质的稳定性，且连接有聚乙二醇修饰剂的蛋白质与纳米磁珠连接后，能够得到稳定性较高的磁珠包被物。
在其中一个实施例中，所述聚乙二醇修饰剂的结构式为
所述聚乙二醇修饰剂与所述蛋白质形成-NH-CO-结构而使所述聚乙二醇修饰剂与所述蛋白质连接；
进一步地，所述聚乙二醇修饰剂的氨基与所述蛋白质的羧基形成所述-NH-CO-结构。
在其中一个实施例中，所述聚乙二醇修饰剂的重均分子量在200以上；
及/或，所述n大于或者等于4；
及/或，所述蛋白质为抗原或者抗体。
在其中一个实施例中，所述纳米磁珠具有活性基团，所述活性基团与所述蛋白质的氨基反应而使所述纳米磁珠与所述蛋白质连接；
进一步地，所述活性基团为羧基，所述活性基团与所述蛋白质的氨基形成-NH-CO-结构而使所述纳米磁珠与所述蛋白质连接。
一种磁珠包被物的制备方法，包括如下步骤：
将聚乙二醇修饰剂和蛋白质偶联反应，以使所述聚乙二醇修饰剂与所述蛋白质共价连接，得到修饰化蛋白；及
将所述修饰化蛋白与纳米磁珠偶联反应，以使所述修饰化蛋白与所述纳米磁珠连接，得到磁珠包被物。
在其中一个实施例中，所述聚乙二醇修饰剂的结构式为
所述将聚乙二醇修饰剂与所述蛋白质偶联反应，以使所述聚乙二醇修饰剂与所述蛋白质共价连接，得到修饰化蛋白的步骤包括：将所述聚乙二醇修饰剂与所述蛋白质混合并反应，以使所述聚乙二醇修饰剂与所述蛋白质形成-NH-CO-结构而使所述聚乙二醇修饰剂与所述蛋白质共价连接，得到所述修饰化蛋白。
在其中一个实施例中，所述将所述聚乙二醇修饰剂与所述蛋白质混合并反应，以使所述聚乙二醇修饰剂与所述蛋白质形成-NH-CO-结构而使所述聚乙二醇修饰剂与所述蛋白质共价连接的步骤包括：将交联剂与所述蛋白质的羧基反应形成中间物；将所述中间物与所述聚乙二醇修饰剂的氨基反应形成所述-NH-CO-结构而使所述聚乙二醇修饰剂与所述蛋白质共价连接，得到所述修饰化蛋白。
在其中一个实施例中，所述将所述修饰化蛋白与纳米磁珠偶联反应的步骤包括：所述纳米磁珠具有活性基团，所述活性基团与所述修饰化蛋白的氨基反应而使所述纳米磁珠与所述修饰化蛋白连接，得到所述磁珠包被物。
上述的磁珠包被物或者上述的磁珠包被物的制备方法制备得到的磁珠包被物在制备检测试剂、检测试剂盒或者检测装置中的应用。
一种检测试剂盒，包括上述的磁珠包被物或者上述的磁珠包被物的制备方法制备得到的磁珠包被物。
附图说明
图1为一实施方式的磁珠包被物的制备方法的流程示意图。
具体实施方式
为了便于理解本发明，下面将参照相关附图对本发明进行更全面的描述。附图中给出了本发明的较佳的实施例。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。
一实施方式的磁珠包被物具有较高的稳定性，能够用于制备检测试剂、检测试剂盒或者检测装置。具体地，该磁珠包被物包括：蛋白质、聚乙二醇修饰剂和纳米磁珠，聚乙二醇修饰剂与蛋白质共价连接，纳米磁珠与蛋白质连接。
上述磁珠包被物通过将聚乙二醇修饰剂与蛋白质共价连接，使得蛋白质连接有PEG臂，以增加蛋白质的空间结构刚性，提高蛋白质的稳定性，且将连接有聚乙二醇修饰剂的蛋白质与纳米磁珠连接后，能够得到稳定性较高的磁珠包被物。
蛋白质能够与待检测物结合，从而对测试样本中的待检测物进行定性或者定量检测。测试样本例如可以为血液。需要说明的是，测试样本不限于为血液，还可以为其他测试样本，例如可以为唾液或者胃液。
在其中一个实施例中，蛋白质为抗原或者抗体。需要说明的是，在抗原和抗体包被过程中，由于抗原结构复杂，相对于抗体包被难度更大。
在其中一个实施例中，蛋白质为EB NA IgG抗原(疱疹病毒科嗜淋巴细胞的DNA病毒核抗原IgG)或者Toxo IgM抗原(弓形虫病毒IgM抗原)。需要说明的是，蛋白质不限于为上述指出的抗原，还可以为其他抗原。
在其中一个实施例中，蛋白质为肌钙蛋白I(cTnI)抗体。需要说明的是，蛋白质不限于为上述指出的抗体，还可以为其他抗体，例如可以为癌抗原15-3(CA15-3)抗体。
聚乙二醇修饰剂能够影响蛋白质的空间结构，引起蛋白质的各种生物化学性质的改变，包括：增加化学稳定性，提高蛋白水解酶的抵抗能力，提高蛋白质的水溶性，在免疫反应过程中减少由于蛋白质的疏水作用而产生的非特异性吸附，降低蛋白质的毒副作用，延长蛋白质的半衰期，提高蛋白质的稳定性。并且聚乙二醇修饰剂在空间上不会阻挡到蛋白质的免疫结合位点，因此，采用聚乙二醇修饰剂修饰蛋白质基本不会影响蛋白质的免疫活性。
在其中一个实施例中，聚乙二醇修饰剂的结构式为
聚乙二醇修饰剂与蛋白质形成-NH-CO-结构而使聚乙二醇修饰剂与蛋白质共价连接。进一步地，聚乙二醇修饰剂的氨基与蛋白质的羧基形成-NH-CO-结构。需要说明的是，不限于为聚乙二醇修饰剂的氨基与蛋白质的羧基形成-NH-CO-结构，也可以为聚乙二醇修饰剂的羧基与蛋白质的氨基形成-NH-CO-结构。
在其中一个实施例中，聚乙二醇修饰剂的重均分子量为200～1200。此种设置，使得聚乙二醇修饰剂在空间上不会阻挡到蛋白质的免疫结合位点，采用聚乙二醇修饰剂修饰后对蛋白质的免疫活性影响较小。需要说明的是，采用分子量过大的聚乙二醇修饰剂修饰容易降低蛋白质的生物活性，而采用分子量过小的聚乙二醇修饰剂对维持修饰化蛋白的稳定性的作用较弱。
在其中一个实施例中，n大于或者等于4。进一步地，n为4～24。需要说明的是，聚乙二醇修饰剂的聚合度越大会导致分子量越大，采用分子量过大的聚乙二醇修饰剂修饰容易降低蛋白质的生物活性。
纳米磁珠具有活性基团，纳米磁珠的活性基团可以与蛋白质发生偶联，使得偶联后的蛋白质与待检测物结合后能够利用外磁场的作用实现待检测物的高效分离和检测。进一步地，纳米磁珠的活性基团与蛋白质的氨基反应而使纳米磁珠与蛋白质连接。更进一步地，纳米磁珠的活性基团为羧基。此时，纳米磁珠的羧基与蛋白质的氨基形成-NH-CO-结构而使纳米磁珠与蛋白质连接。具体地，蛋白质的结合位点为伯胺基。需要说明的是，纳米磁珠的活性基团不限于为羧基，还可以为其他活性基团，例如可以为甲苯磺酰基。
上述磁珠包被物通过将聚乙二醇修饰剂与蛋白质共价连接，使得蛋白质连接有PEG臂，以增加蛋白质的空间结构刚性，提高蛋白质的稳定性，且将连接有聚乙二醇修饰剂的蛋白质与纳米磁珠连接后，能够得到稳定性较高的磁珠包被物。
进一步地，上述磁珠包被物中，聚乙二醇修饰剂的结构式为
聚乙二醇修饰剂的氨基与蛋白质的羧基形成-NH-CO-结构，而聚乙二醇修饰剂的羧基能够弥补修饰过程中蛋白质消耗的羧基以使修饰化蛋白的总羧基数与蛋白质的总羧基数目一致；或者，聚乙二醇修饰剂的羧基与蛋白质的氨基形成-NH-CO-结构，而聚乙二醇修饰剂的氨基能够弥补修饰过程中蛋白质消耗的氨基，以使修饰化蛋白的总氨基数与蛋白质的总氨基数目一致。通过使修饰化蛋白的总羧基数与蛋白质的总羧基数目一致或者使修饰化蛋白的总氨基数与蛋白质的总氨基数目一致，使得蛋白质经聚乙二醇修饰剂修饰后与纳米磁珠的结合位点数量不变，维持蛋白质和纳米磁珠的结合能力，以保证蛋白质和纳米磁珠的偶联效率。
需要说明的是，纳米磁珠不限于通过活性基团直接与修饰化蛋白连接，纳米磁珠也可以通过间接连接的方式与修饰化蛋白连接。例如：纳米磁珠采用生物素-亲和素系统将纳米磁珠与修饰化蛋白连接。即，将亲和素与纳米磁珠连接，再与生物素化的修饰化蛋白连接。由于生物素化的修饰化蛋白和连接有亲和素的纳米磁珠之间的亲和性非常大，可以实现纳米磁珠简便、快捷、有效地与修饰化蛋白紧密结合。需要说明的是，生物素化的修饰化蛋白即为连接有生物素的修饰化蛋白。需要说明的是，间接连接的方式不限于为生物素-亲和素系统，还可以为其他中间连接系统。
如图1所示，上述实施方式的磁珠包被物的制备方法，能够制备稳定性较高的磁珠包被物，以能够用于制备检测试剂、检测试剂盒或者检测装置。具体地，上述制备方法包括以下步骤S110～S120：
S110、将聚乙二醇修饰剂与蛋白质偶联反应，以使聚乙二醇修饰剂与蛋白质共价连接，得到修饰化蛋白。
在其中一个实施例中，S110包括：将交联剂、蛋白质和聚乙二醇修饰剂混合并反应，得到修饰化蛋白。进一步地，S110包括：将聚乙二醇修饰剂、蛋白质和交联剂混合并反应，以使聚乙二醇修饰剂与蛋白质形成-NH-CO-结构而使聚乙二醇修饰剂与蛋白质共价连接，得到修饰化蛋白。其中，聚乙二醇修饰剂的结构式为
在其中一个实施例中，交联剂为能够活化羧基的交联剂。进一步地，交联剂为碳二亚胺。碳二亚胺主要是用于活化羧基，能够促进酰胺键的生成。需要说明的是，交联剂不限于为碳二亚胺，也可以为其他能够活化羧基的交联剂，可以根据需要进行设置。更进一步地，交联剂既能够活化蛋白质的羧基，又能够活化聚乙二醇修饰剂的羧基。
在其中一个实施例中，交联剂活化蛋白质的羧基时，S110包括如下反应过程S111～S112：
S111、交联剂与蛋白质反应，得到第一中间物。
在其中一个实施例中，交联剂为碳二亚胺。交联剂与蛋白质的羧基反应得到第一中间物。具体地，交联剂与蛋白质反应的反应式如下：
S112、第一中间物和聚乙二醇修饰剂反应，以使聚乙二醇修饰剂与蛋白质共价连接，得到修饰化蛋白。
具体地，聚乙二醇修饰剂的结构式为第一中间物和聚乙二醇修饰剂的氨基反应以使聚乙二醇修饰剂与蛋白质形成-NH-CO-结构，得到修饰化蛋白。第一中间物与聚乙二醇修饰剂反应的反应式如下：
在其中一个实施例中，交联剂活化聚乙二醇修饰剂的羧基时，S110包括如下反应过程S111’～S112’：
S111’、交联剂与聚乙二醇修饰剂反应，得到第一中间物。
在其中一个实施例中，交联剂为碳二亚胺。聚乙二醇修饰剂的结构式为交联剂与聚乙二醇修饰剂的羧基反应得到第一中间物。具体地，交联剂与聚乙二醇修饰剂反应的反应式如下：
S112’、第一中间物和蛋白质反应，以使聚乙二醇修饰剂与蛋白质共价连接，得到修饰化蛋白。
具体地，第一中间物和蛋白质的氨基反应，以使聚乙二醇修饰剂与蛋白质形成-NH-CO-结构，得到修饰化蛋白。更具体地，第一中间物和蛋白质反应的反应式如下：
需要说明的是，将交联剂、蛋白质、聚乙二醇修饰剂混合并反应的过程中，交联剂能够同时活化蛋白质的羧基和聚乙二醇修饰剂的羧基。此时，S110能够得到两种修饰化蛋白；其中一种修饰化蛋白中，蛋白质的羧基与聚乙二醇修饰剂的氨基反应形成-NH-CO-结构；另一种修饰化蛋白中，蛋白质的氨基与聚乙二醇修饰剂的羧基反应形成-NH-CO-结构。
在其中一个实施例中，碳二亚胺、蛋白质和聚乙二醇修饰剂的质量比为(0.016～0.024)：(1～2)：(2～4)。反应pH为5.0～7.0。反应温度为20℃～30℃。反应时间为10min～20min。进一步地，碳二亚胺、蛋白质和聚乙二醇修饰剂分别溶解于缓冲液中，再混合并反应。需要说明的是，不限于将碳二亚胺、蛋白质和聚乙二醇修饰剂三者一起混合并反应，还可以将碳二亚胺与蛋白质先混合并反应后再与聚乙二醇修饰剂混合并反应，或者将碳二亚胺与聚乙二醇修饰剂混合并反应后再与蛋白质混合并反应。更进一步地，缓冲液为MES缓冲液(2-morpholino-ethanesulfonic acid，2-(N-吗啡啉)乙磺酸)。具体地，MES缓冲液的浓度为2.13mg/mL～5.33mg/mL，pH为5.0～7.0。更具体地，MES缓冲液的浓度为3.20mg/mL，pH为6.0。其中，溶解有蛋白质的MES缓冲液中蛋白质的浓度为1.67mg/mL，溶解有碳二亚胺的MES缓冲液中碳二亚胺的浓度为1mg/mL，溶解有聚乙二醇修饰剂的MES缓冲液中聚乙二醇修饰剂的浓度为10mg/mL。
在其中一个实施例中，将交联剂、蛋白质和聚乙二醇修饰剂混合并反应，得到修饰化蛋白的步骤之后，还包括如下步骤：将交联剂、蛋白质和聚乙二醇修饰剂混合并反应得到的反应物进行纯化。此种设置，能够除去游离的聚乙二醇修饰剂，得到纯度在99％以上的修饰化蛋白，更有利于接下来与纳米磁珠的结合。进一步地，纯化的方式为超滤。更进一步地，超滤的截留分子量为20KD～40KD。具体地，在超滤的过程中，换液缓冲液为PBS缓冲液。更具体地，PBS缓冲液的浓度为15mmol/L～25mmol/L，pH为7.4～8.4。在一个具体示例中，PBS缓冲液的浓度为15mmol/L，pH为7.4。其中，将交联剂、蛋白质和聚乙二醇修饰剂混合并反应得到的反应物进行多次超滤。在一个具体示例中，超滤的次数为3次。
S120、将修饰化蛋白与纳米磁珠偶联反应，以使修饰化蛋白与纳米磁珠连接，得到磁珠包被物。
在其中一个实施例中，纳米磁珠的活性基团与修饰化蛋白的氨基反应而使纳米磁珠与修饰化蛋白连接，得到磁珠包被物。进一步地，纳米磁珠的活性基团为羧基，将纳米磁珠的羧基与修饰化蛋白的氨基反应形成-NH-CO-结构而使纳米磁珠与修饰化蛋白连接，得到磁珠包被物。
具体地，纳米磁珠具有羧基，S120包括S121～S122：
S121、纳米磁珠和交联剂反应，得到第二中间物。
在其中一个实施例中，纳米磁珠和交联剂的质量比为1:(0.1～0.2)。反应pH为5.0～7.0。反应温度20℃～30℃。反应时间为25min～35min。
在其中一个实施例中，交联剂包括碳二亚胺。碳二亚胺主要是用于活化羧基，能够促进酰胺键的生成。进一步地，交联剂还包括N-羟基丁二酰亚胺。N-羟基丁二酰亚胺主要是用于在酰胺键形成时活化羰基基团，保护合成的氨基酸，提高产率。更进一步地，交联剂的制备过程包括：将碳二亚胺和N-羟基丁二酰亚胺分别溶解于二甲基亚砜中，再混合得到交联剂。具体地，交联剂中碳二亚胺和N-羟基丁二酰亚胺的体积比为1:1。更具体地，溶解有碳二亚胺的二甲基亚砜溶液中碳二亚胺的浓度为10mg/mL。溶解有N-羟基丁二酰亚胺的二甲基亚砜溶液中N-羟基丁二酰亚胺的浓度为10mg/mL。
当交联剂包括碳二亚胺和N-羟基丁二酰亚胺，纳米磁珠具有羧基时，交联剂与纳米磁珠的羧基反应得到第二中间物。具体地，交联剂与纳米磁珠反应的反应式如下：
在其中一个实施例中，将纳米磁珠与交联剂混合并反应的步骤之前，还包括清洗纳米磁珠的步骤。此种设置，能够除去纳米磁珠表面残留的保存液。具体地，清洗液为MES缓冲液。进一步地，MES缓冲液的浓度为2.13mg/mL～5.13mg/mL，pH为5.0～7.0。更进一步地，MES缓冲液的浓度为3.20mg/mL，pH为6.0。具体地，多次清洗。更具体地，清洗的次数为3次。
在其中一个实施例中，将纳米磁珠与交联剂混合并反应的步骤之后，还包括如下步骤：将纳米磁珠与交联剂混合并反应得到的反应物进行清洗。此种设置，能够除去游离的交联剂，得到纯度较高的第二中间物。进一步地，清洗液为MES缓冲液。更进一步地，MES缓冲液的浓度为2.13mg/mL～5.13mg/mL，pH为5.0～7.0，温度为2℃～8℃。具体地，MES缓冲液的浓度为3.20mg/mL，pH为6.0，温度为4℃。更具体地，清洗的次数为1次。
S122、第二中间物与修饰化蛋白反应，以使纳米磁珠的羧基与修饰化蛋白的氨基反应形成-NH-CO-结构，得到磁珠包被物。
进一步地，修饰化蛋白的氨基为伯胺基。具体地，第二中间物与修饰化蛋白反应的反应式如下：
在其中一个实施例中，第二中间物和修饰化蛋白的质量比为(25～50)：1。反应pH为5.0～7.0。反应温度为20℃～30℃。反应时间为2.5h～3.5h。
进一步地，第二中间物与修饰化蛋白混合并反应的步骤包括：采用MES缓冲液将第二中间物重悬后，加入修饰化蛋白混合并反应。更进一步地，MES缓冲液的pH为5～7，温度为2℃～8℃，浓度为2.13mg/mL～5.33mg/mL。具体地，MES缓冲液的pH为6.0，温度为4℃，浓度为3.20mg/mL。
在其中一个实施例中，将第二中间物与修饰化蛋白混合并反应的步骤之后，还包括如下步骤：对第二中间物与修饰化蛋白混合并反应得到的反应物进行封闭处理。此种设置，能够减少纳米磁珠表面未与修饰化蛋白结合的活性位点，降低产品应用过程中的非特异性吸附，提高产品的灵敏度与准确度。进一步地，将第二中间物与修饰化蛋白混合并反应得到的反应物进行封闭处理的步骤包括：将第二中间物与修饰化蛋白混合并反应得到的反应物与封闭液混合并反应，反应温度为20℃～30℃，反应时间为2h～4h，得到封闭处理后的反应物。更进一步地，封闭液为含有质量百分含量为5％的BSA(牛血清白蛋白)的PBS缓冲液(磷酸盐缓冲液)。具体地，PBS缓冲液的浓度为150mmol/L，pH为7.4。
在其中一个实施例中，将第二中间物与修饰化蛋白混合并反应得到的反应物进行封闭的步骤之后，还包括如下步骤：将封闭处理后的反应物进行磁分离。此种设置，能够使封闭处理后的反应物与封闭液迅速分离，得到磁珠包被物。
在其中一个实施例中，将封闭处理后的反应物进行磁分离的步骤之后，还包括如下步骤：将磁分离处理后得到的磁珠包被物进行定容。进一步地，在定容过程中使用到的溶剂为含有质量百分含量为5％的BSA(牛血清白蛋白)的PBS缓冲液(磷酸盐缓冲液)。更进一步地，PBS缓冲液的浓度为15mmol/L，pH为7.4。具体地，定容后得到含有5mg/mL～15mg/mL的磁珠包被物的PBS缓冲液。
上述磁珠包被物的制备方法具有至少如下优点：
(1)上述磁珠包被物的制备方法中，通过将聚乙二醇修饰剂与蛋白质共价连接，使得蛋白质连接有PEG臂，以增加蛋白质的空间结构刚性，提高蛋白质的稳定性，且将连接有聚乙二醇修饰剂的蛋白质与纳米磁珠连接后，能够得到稳定性较高的磁珠包被物。
(2)上述磁珠包被物的制备方法中，蛋白质的修饰过程以及修饰化蛋白与纳米磁珠偶联的过程均采用了碳二亚胺作为交联剂，有利于偶联效率。
(3)通过上述磁珠包被物的制备方法制备得到的磁珠包被物的亲水性增强，非特异性吸附更低，毒副作用较小。
(4)通过上述磁珠包被物的制备方法制备得到的磁珠包被物的半衰期更长，稳定性更高。
一实施方式的检测试剂盒包括上述实施方式的磁珠包被物或者上述磁珠包被物的制备方法制备得到的磁珠包被物。
在其中一个实施例中，检测试剂盒还包括发光物质标记的第二抗体。发光物质标记的第二抗体能够和待检测物与磁珠包被物结合形成的结合物连接，以便于通过发光信号检测待检测物。进一步地，第二抗体为小鼠抗人IgG。需要说明的是，第二抗体不限于为小鼠抗人IgG，也可以为其他第二抗体，例如可以为小鼠抗人IgM。更进一步地，发光物质为吖啶取代物。具体地，发光物质为吖啶酯。需要说明的是，发光物质不限于为吖啶酯，也可以为其他吖啶取代物，例如可以为吖啶磺酰胺。需要说明的是，检测试剂盒不限于包括发光物质标记的第二抗体，还可以包括发光物质标记的抗原。当发光物质标记抗原时，发光物质标记的抗原能够和待检测物与磁珠包被物结合形成的结合物连接，以便于通过发光信号检测待检测物。
上述检测试剂盒至少具有以下优点：
(1)上述检测试剂盒所使用的磁珠包被物的化学稳定性较高，半衰期较长，使得检测试剂盒的使用寿命较长，有利于节省使用成本。
(2)上述检测试剂盒所使用的磁珠包被物的非特异性吸附较低，检测结果的准确度较高。
以下为具体实施例部分：
如未特别说明，以下实施例中：EB NA IgG抗原购于菲鹏生物股份有限公司；ToxoIgM抗原购于MICROBIX公司，货号为EL-18-08；吖啶酯标记的小鼠抗人IgG抗体购于菲鹏生物股份有限公司；聚乙二醇修饰剂均购于Thermo Fisher公司；纳米磁珠(表面具有羧基)购于Merck公司；碳二亚胺(EDC)购于Thermo公司；N-羟基丁二酰亚胺(NHS)购于Thermo公司；发光液购于深圳市亚辉龙生物科技股份有限公司，发光液包括预激发液和激发液，其中，预激发液的货号为C89999，激发液的货号为C89968；购于深圳市亚辉龙生物科技股份有限公司；截留分子量的超滤管购于Millipore公司；超微量紫外分光光度计购于Thermo公司，型号为Nanodrop lite；化学发光测定仪购于深圳市亚辉龙生物科技股份有限公司，型号为iFlash 3000。
实施例1
本实施例的磁珠包被物的制备步骤如下：
(1)制备原料包括：EB NA IgG抗原，碳二亚胺(EDC)，N-羟基丁二酰亚胺(NHS)，纳米磁珠(表面具有羧基)，聚乙二醇修饰剂的结构式为(货号为26120)。
(2)修饰化蛋白的制备：将500μL、5.0mg/mL的EB NA IgG抗原(2.5mg)加入1000μL、pH为6.0的MES缓冲液中混匀，再加入40μL的含有1mg/mL的EDC的MES缓冲液混匀，接着加入500μL的含有10mg/mL的聚乙二醇修饰剂的MES缓冲液混匀，在25℃下反应15min，得到反应物。用15mL、30KD截留分子量的超滤管对反应物进行超滤，得到含有修饰化EB NA IgG抗原的浓缩液。以15nmol/L、pH7.4的PBS缓冲液作为换液缓冲液，将浓缩液超滤3遍，除去游离的聚乙二醇修饰剂。最后经超微量紫外分光光度计测定，浓缩液中修饰化EB NA IgG抗原的浓度为6.05mg/mL，浓缩液的体积为0.35mL，其中含有2.11mg的修饰化EB NA IgG抗原。
(3)磁珠包被物的制备：将100mg的纳米磁珠用10mL、pH为6.0的MES缓冲液清洗3遍后，加入2mL的MES缓冲液进行重悬，得到纳米磁珠重悬液。将含有10mg/mL的EDC的二甲基亚砜溶液和含有10mg/mL的NHS的二甲基亚砜溶液等体积比进行混合，然后移取4mL的上述混合得到的混合溶液加入上述纳米磁珠悬浮液中混匀，在25℃下反应30min，得到反应中间物。用10mL、4℃、pH为6.0的MES缓冲液将反应中间物清洗1遍，再对反应中间物进行重悬，得到含有10mg/mL反应中间物的重悬液。然后将2000μg的修饰化EB NA IgG抗原加入含有反应中间物的重悬液中，混匀，在25℃下反应3h，得到第一产物。将第一产物用10mL、pH为7.4的含有质量百分含量为0.5％的BSA的PBS缓冲液在25℃下封闭2h，得到第二产物。封闭结束后，对第二产物进行磁分离处理，得到磁珠包被物，即修饰化EB NA IgG抗原包被的纳米磁珠。最后用10mL、pH为7.4的含有质量百分含量为0.5％的BSA的PBS缓冲液对磁珠包被物进行定容，得到含有10mg/mL的磁珠包被物的PBS缓冲液。
实施例2
本实施例的磁珠包被物的制备步骤与实施例1大致相同，不同之处在于：本实施例中所用的聚乙二醇修饰剂的结构式为
(货号为26124)。
实施例3
本实施例的磁珠包被物的制备步骤与实施例1大致相同，不同之处在于：本实施例中所用的聚乙二醇修饰剂的结构式为
(货号为26127)。
实施例4
本实施例的磁珠包被物的制备步骤如下：
(1)制备原料包括：EB NA IgG抗原，碳二亚胺(EDC)，N-羟基丁二酰亚胺(NHS)，纳米磁珠(表面具有羧基)。
(2)磁珠包被物的制备：将100mg的纳米磁珠用10mL、pH为6.0的MES缓冲液清洗3遍后，加入2mL的MES缓冲液进行重悬，得到纳米磁珠重悬液。将含有10mg/mL的EDC的二甲基亚砜溶液和含有10mg/mL的NHS的二甲基亚砜溶液等体积比进行混合，然后移取4mL的上述混合得到的混合溶液加入上述纳米磁珠悬浮液中混匀，在25℃下反应30min，得到反应中间物。用10mL、4℃、pH为6.0的MES缓冲液将反应中间物清洗1遍，再对反应中间物进行重悬，得到含有10mg/mL反应中间物的重悬液。然后将2000μg的EB NA IgG抗原加入含有反应中间物的重悬液中，混匀，在25℃下反应3h，得到第一产物。将第一产物用10mL、pH为7.4的含有质量百分含量为0.5％的BSA的PBS缓冲液在25℃下封闭2h，得到第二产物。封闭结束后，对第二产物进行磁分离处理，得到磁珠包被物，即EB NA IgG抗原包被的纳米磁珠。最后用10mL、pH为7.4的含有质量百分含量为0.5％的BSA的PBS缓冲液对磁珠包被物进行定容，得到含有10mg/mL的磁珠包被物的PBS缓冲液。
测试：
测试例1：
测试实施例1和实施例4的磁珠包被物的稳定性。结果详见表1。
其中，具体测试过程如下：
测试样本：10例含有EB NA IgG抗体的体检血作为测试样本，分别命名为测试样本1～10。每个测试样本内的EB NA IgG抗体的浓度已知，测试样本1～10中EB NA IgG抗体的浓度分别为0.05U/mL、0.09U/mL、0.28U/mL、0.55U/mL、2.12U/mL、4.53U/mL、7.48U/mL、14.21U/mL、15.56U/mL、22.38U/mL。
测试过程：
分别取50μL的实施例1和实施例4中制备的含有0.1mg/mL的磁珠包被物的PBS缓冲液(提前进行稀释)，加入10μL的测试样本并于37℃下孵育5min，然后进行磁分离，得到第一反应物。将第一反应物用pH为7.4的PBS缓冲液清洗2次，加入50μL、浓度为200ng/mL的吖啶酯标记的小鼠抗人IgG抗体于37℃下孵育5min，然后进行磁分离，得到第二反应物。将第二反应物用上述PBS缓冲液进行清洗，清洗2次，加入200μL发光液，通过化学发光测定仪测量发光信号值，重复测试2次，并计算发光信号值的平均值及偏差。
同时，将实施例1和实施例4中制备的含有10mg/mL的磁珠包被物的PBS缓冲液置于37℃下放置7天后，按照上述的测试过程对每个测试样本中EB NA IgG抗体的浓度进行检测，得到对应的发光信号值，并计算发光信号值的平均值及偏差。
偏差是指采用同一磁珠包被物在37℃下加速7天前后对同一测试样本进行检测得到的发光信号值的偏差；偏差的绝对值越小，说明磁珠包被物的稳定性越好；偏差的计算公式如下：
偏差＝(第7天检测到的发光信号值的平均值-第0天检测到的发光信号值的平均值)/第0天检测到的发光信号值的平均值*100％。
表1实施例1和实施例4的磁珠包被物的稳定性
从表1中可以看出，采用实施例1的磁珠包被物对测试样本3～10进行检测得到的发光信号值的偏差的绝对值小于采用实施例4的磁珠包被物对测试样本3～10进行检测得到的发光信号值的偏差的绝对值，而采用实施例1的磁珠包被物对测试样本1～2进行检测得到的发光信号值的偏差的绝对值大于采用实施例4的磁珠包被物对测试样本1～2进行检测得到的发光信号值的偏差的绝对值。造成这一结果的原因是由于一般在以阴性样本为测试样本的化学发光分析中，发光信号值越低的测试样本越容易受到化学发光测定仪自身带来的背景干扰，所以分析数据时应通过整体的数据走向来分析。而表1中整体的数据走向说明实施例1的磁珠包被物在37℃下加速7天后的稳定性优于实施例4，进而说明上述实施方式通过将蛋白质经聚乙二醇修饰剂修饰后再包被纳米磁珠，能够得到稳定性较高的磁珠包被物。
测试例2：
测定实施例1～4的磁珠包被物的稳定性。结果详见表2。
其中，具体测试过程如下：
测试样本：选取测试例1中的测试样本4为本测试例的测试样本。
测试过程：
分别取50μL的实施例1～4中制备的含有0.1mg/mL的磁珠包被物的PBS缓冲液(提前进行稀释)，加入10μL的测试样本并于37℃下孵育5min，然后进行磁分离，得到第一反应物。将第一反应物用pH为7.4的PBS缓冲液清洗2次，加入50μL、浓度为200ng/mL的吖啶酯标记的小鼠抗人IgG抗体于37℃下孵育5min，然后进行磁分离，得到第二反应物。将第二反应物用上述PBS缓冲液进行清洗，清洗2次，加入200μL发光液，通过化学发光测定仪测量发光信号值，重复测试2次，并计算发光信号值的平均值及偏差。
同时，将实施例1～4中制备的含有10mg/mL的磁珠包被物的PBS缓冲液置于37℃下放置7天后，按照上述的测试过程对每个测试样本中EB NA IgG抗体的浓度进行检测，得到对应的发光信号值，并计算发光信号值的平均值及偏差。
偏差是指采用同一磁珠包被物在37℃下加速7天前后对同一测试样本进行检测得到的发光信号值的偏差；偏差的绝对值越小，说明磁珠包被物的稳定性越好；偏差的计算公式如下：
偏差＝(第7天检测到的发光信号值的均值-第0天检测到的发光信号值的均值)/第0天检测到的发光信号值的均值*100％。
表2实施例1～4的磁珠包被物的稳定性
从表2中可以看出，采用实施例1～3的磁珠包被物对测试样本进行检测得到的发光信号值的偏差的绝对值小于采用实施例4的磁珠包被物对测试样本进行检测得到的发光信号值的偏差的绝对值，说明实施例1～3的磁珠包被物在37℃下加速7天后的稳定性优于实施例4，进而说明上述实施方式通过将蛋白质经聚乙二醇修饰修饰后再包被纳米磁珠，能够得到稳定性较高的磁珠包被物。
实施例5
本实施例的磁珠包被物的制备步骤如下：
(1)制备原料包括：Toxo IgM抗原，碳二亚胺(EDC)，N-羟基丁二酰亚胺(NHS)，纳米磁珠(表面具有氨基)，聚乙二醇修饰剂的结构式为(货号为26120)。
(2)修饰化蛋白的制备：将500μL、4.0mg/mL的Toxo IgM抗原(2.0mg)加入1000μL、pH为6.0的MES缓冲液中混匀，再加入40μL的含有1mg/mL的EDC的MES缓冲液混匀，接着加入500μL的含有10mg/mL的聚乙二醇修饰剂的MES缓冲液混匀，在25℃下反应15min，得到反应物。用15mL、30KD截留分子量的超滤管对反应物进行超滤，得到含有修饰化Toxo IgM抗原的浓缩液。以15nmol/L、pH7.4的PBS缓冲液作为换液缓冲液，将浓缩液超滤3遍，除去游离的聚乙二醇修饰剂。最后经超微量紫外分光光度计测定，浓缩液中修饰化Toxo IgM抗原的浓度为4.65mg/mL，浓缩液的体积为0.40mL，其中含有1.86mg的修饰化Toxo IgM抗原。
(3)磁珠包被物的制备：将150mg的纳米磁珠用15mL、pH为6.0的MES缓冲液清洗3遍后，加入6mL的MES缓冲液进行重悬，得到纳米磁珠重悬液。接着将含有10mg/mL的EDC的二甲基亚砜溶液和含有10mg/mL的NHS的二甲基亚砜溶液等体积比进行混合，然后移取3mL的上述混合得到的混合溶液加入纳米磁珠悬浮液中混匀，在25℃下反应30min，得到反应中间物。用15mL、4℃、pH为6.0的MES缓冲液将反应中间物清洗1遍，再对反应中间物进行重悬，得到含有10mg/mL反应中间物的重悬液。然后将1500μg的修饰化Toxo IgM抗原加入反应中间物的重悬液中，混匀，在25℃下反应3h，得到第一产物。将第一产物用10mL、pH为7.4的含有质量百分含量为0.5％的BSA的PBS缓冲液在25℃下封闭2h，得到第二产物。封闭结束后，对第二产物进行磁分离处理，得到磁珠包被物，即修饰化Toxo IgM抗原包被的纳米磁珠。最后用10mL、pH为7.4的含有质量百分含量为0.5％的BSA的PBS缓冲液对第二产物进行定容，得到含有10mg/mL的磁珠包被物的PBS缓冲液。
实施例6
本实施例的蛋白包被的纳米磁珠的制备步骤如下：
(1)制备原料包括：Toxo IgM抗原，碳二亚胺(EDC)，N-羟基丁二酰亚胺(NHS)，纳米磁珠(表面具有羧基)。
(2)磁珠包被物的制备：将150mg的纳米磁珠用15mL、pH为6.0的MES缓冲液清洗3遍后，加入6mL的MES缓冲液进行重悬，得到纳米磁珠重悬液。接着将含有10mg/mL的EDC的二甲基亚砜溶液和含有10mg/mL的NHS的二甲基亚砜溶液等体积比进行混合，然后移取3mL的上述混合得到的混合溶液加入纳米磁珠悬浮液中混匀，在25℃下反应30min，得到反应中间物。用15mL、4℃、pH为6.0的MES缓冲液将反应中间物清洗1遍，再对反应中间物进行重悬，得到含有10mg/mL反应中间物的重悬液。然后将1500μg的Toxo IgM抗原加入反应中间物的重悬液中，混匀，在25℃下反应3h，得到第一产物。将第一产物用10mL、pH为7.4的含有质量百分含量为0.5％的BSA的PBS缓冲液在25℃下封闭2h，得到第二产物。封闭结束后，对第二产物进行磁分离处理，得到磁珠包被物，即Toxo IgM抗原包被的纳米磁珠。最后用10mL、pH为7.4的含有质量百分含量为0.5％的BSA的PBS缓冲液对第二产物进行定容，得到含有10mg/mL的磁珠包被物的PBS缓冲液。
测试：
测试例3：
测试实施例5和实施例6的磁珠包被物的非特异性吸附和测试稳定性。结果详见表3。
其中，具体测试过程如下：
测试样本：10例含有Toxo IgM抗体的体检血作为测试样本，分别命名为测试样本1～10，每个测试样本的Toxo IgM抗体的浓度均低于6AU/mL。
测试过程：
分别取50μL的实施例5和实施例6中制备的含有0.1mg/mL的磁珠包被物的PBS缓冲液(提前进行稀释)，加入10μL的测试样本并于37℃下孵育5min，然后进行磁分离，得到第一反应物。将第一反应物用pH为7.4的PBS缓冲液清洗2次，加入50μL、浓度为200ng/mL的吖啶酯标记的小鼠抗人IgG抗体于37℃下孵育5min，然后进行磁分离，得到第二反应物。将第二反应物用上述PBS缓冲液进行清洗，清洗2次，加入200μL发光液，通过化学发光测定仪测量发光信号值，重复测试2次，并计算发光信号值的平均值及偏差。
同时，将实施例5和实施例6中制备的含有10mg/mL的磁珠包被物的PBS缓冲液置于37℃下放置7天后，按照上述的测试过程对每个测试样本中Toxo IgM抗体的浓度进行检测，得到对应的发光信号值，并计算发光信号值的平均值及偏差。
偏差是指分别采用实施例5和实施例6的磁珠包被物对同一测试样本进行检测得到的发光信号值的偏差；变异系数指的是同一磁珠包被物的10次检测结果的变异程度，变异系数越小，说明磁珠包被物的测试稳定性越好；计算公式如下：
偏差＝(采用实施例5的磁珠包被物对测试样本进行检测得到的发光信号值的平均值-采用实施例6的磁珠包被物对同一测试样本进行检测得到的发光信号值的平均值)/采用实施例5的磁珠包被物对测试样本进行检测得到的发光信号值的平均值*100％。
变异系数＝采用同一磁珠包被物对10例测试样本进行检测得到的发光信号值的平均值的标准偏差/采用同一磁珠包被物对10例测试样本进行检测得到测试样本的发光信号值的平均值*100％。
表3实施例5和实施例6的磁珠包被物的非特异性吸附和测试稳定性
从表3中可以看出，偏差均为负值，说明采用实施例5的磁珠包被物对测试样本进行检测得到的发光信号值的平均值均小于实施例6的磁珠包被物对同一测试样本进行检测得到的发光信号值的平均值，进而说明实施例5的磁珠包被物的非特异性吸附低于实施例6。而且，实施例6的变异系数为32.20％，实施例5的变异系数为12.00％，说明实施例5的磁珠包被物的测试稳定性优于实施例6，进而说明蛋白质经聚乙二醇修饰剂修饰后再包被纳米磁珠，得到的磁珠包被物的非特异性吸附更低，测试稳定性更好，有利于提高检测结果的准确性。
实施例7
本实施例的磁珠包被物的制备步骤与实施例1大致相同，不同之处在于：本实施例中将EB NA IgG抗原改换成cTnI抗体。
实施例8
本实施例的磁珠包被物的制备步骤与实施例4大致相同，不同之处在于：本实施例中将EB NA IgG抗原改换成cTnI抗体。
测试：
测试例4：
测试实施例7和实施例8的磁珠包被物的稳定性。结果详见表4。
其中，具体测试过程如下：
测试样本：3例含有cTnI抗原的体检血作为测试样本，分别命名为测试样本1～3。每个测试样本内的cTnI抗原的浓度已知，测试样本1～3中cTnI抗原的浓度分别为0.03ng/mL、0.25ng/mL、3.34ng/mL。
测试过程：
分别取50μL的实施例7和实施例8中制备的含有0.1mg/mL的磁珠包被物的PBS缓冲液(提前进行稀释)，加入10μL的测试样本并于37℃下孵育5min，然后进行磁分离，得到第一反应物。将第一反应物用pH为7.4的PBS缓冲液清洗2次，加入50μL、浓度为200ng/mL的吖啶酯标记的小鼠抗人IgG抗体于37℃下孵育5min，然后进行磁分离，得到第二反应物。将第二反应物用上述PBS缓冲液进行清洗，清洗2次，加入200μL发光液，通过化学发光测定仪测量发光信号值，重复测试2次，并计算发光信号值的平均值及偏差。
同时，将实施例7和实施例8中制备的含有10mg/mL的磁珠包被物的PBS缓冲液置于37℃下放置7天后，按照上述的测试过程对每个测试样本中cTnI抗原的浓度进行检测，得到对应的发光信号值，并计算发光信号值的平均值及偏差。
偏差是指采用同一磁珠包被物在37℃下加速7天前后对同一测试样本进行检测得到的发光信号值的偏差；偏差的绝对值越小，说明磁珠包被物的稳定性越好；偏差的计算公式如下：
偏差＝(第7天检测到的发光信号值的平均值-第0天检测到的发光信号值的平均值)/第0天检测到的发光信号值的平均值*100％。
表4实施例7和实施例8的磁珠包被物的稳定性
从表4可以看出，采用实施例7的磁珠包被物对测试样本进行检测得到的发光信号值的偏差的绝对值均小于采用实施例8的磁珠包被物对测试样本进行检测得到的发光信号值的偏差的绝对值，说明实施例7的磁珠包被物在37℃下加速7天后的稳定性优于实施例8，进而说明上述实施方式通过将蛋白质经聚乙二醇修饰修饰后再包被纳米磁珠，能够得到稳定性较高的磁珠包被物。
综上所述，上述实施方式得到的磁珠包被物具有较高的稳定性，非特异性吸附较低，测试稳定性较好，使用寿命较长，能够用于制备检测试剂、检测试剂盒或者检测装置。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
Claims (10)
1.一种磁珠包被物，其特征在于，包括：蛋白质、聚乙二醇修饰剂和纳米磁珠，所述聚乙二醇修饰剂与所述蛋白质共价连接，所述纳米磁珠与所述蛋白质连接。
2.根据权利要求1所述的磁珠包被物，其特征在于，所述聚乙二醇修饰剂的结构式为所述聚乙二醇修饰剂与所述蛋白质形成-NH-CO-结构而使所述聚乙二醇修饰剂与所述蛋白质连接；
进一步地，所述聚乙二醇修饰剂的氨基与所述蛋白质的羧基形成所述-NH-CO-结构。
3.根据权利要求1～2任一项所述的磁珠包被物，其特征在于，所述聚乙二醇修饰剂的重均分子量在200以上；
及/或，所述n大于或者等于4；
及/或，所述蛋白质为抗原或者抗体。
4.根据权利要求1～2任一项所述的磁珠包被物，其特征在于，所述纳米磁珠具有活性基团，所述活性基团与所述蛋白质的氨基反应而使所述纳米磁珠与所述蛋白质连接；
进一步地，所述活性基团为羧基，所述活性基团与所述蛋白质的氨基形成-NH-CO-结构而使所述纳米磁珠与所述蛋白质连接。
5.一种磁珠包被物的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
将聚乙二醇修饰剂和蛋白质偶联反应，以使所述聚乙二醇修饰剂与所述蛋白质共价连接，得到修饰化蛋白；及
将所述修饰化蛋白与纳米磁珠偶联反应，以使所述修饰化蛋白与所述纳米磁珠连接，得到磁珠包被物。
6.根据权利要求5所述的磁珠包被物的制备方法，其特征在于，所述聚乙二醇修饰剂的结构式为
所述将聚乙二醇修饰剂与所述蛋白质偶联反应，以使所述聚乙二醇修饰剂与所述蛋白质共价连接，得到修饰化蛋白的步骤包括：将所述聚乙二醇修饰剂与所述蛋白质混合并反应，以使所述聚乙二醇修饰剂与所述蛋白质形成-NH-CO-结构而使所述聚乙二醇修饰剂与所述蛋白质共价连接，得到所述修饰化蛋白。
7.根据权利要求6所述的磁珠包被物的制备方法，其特征在于，所述将所述聚乙二醇修饰剂与所述蛋白质混合并反应，以使所述聚乙二醇修饰剂与所述蛋白质形成-NH-CO-结构而使所述聚乙二醇修饰剂与所述蛋白质共价连接的步骤包括：将交联剂与所述蛋白质的羧基反应形成中间物；将所述中间物与所述聚乙二醇修饰剂的氨基反应形成所述-NH-CO-结构而使所述聚乙二醇修饰剂与所述蛋白质共价连接，得到所述修饰化蛋白。
8.根据权利要求5～7任一项所述的磁珠包被物的制备方法，其特征在于，所述将所述修饰化蛋白与纳米磁珠偶联反应的步骤包括：所述纳米磁珠具有活性基团，所述活性基团与所述修饰化蛋白的氨基反应而使所述纳米磁珠与所述修饰化蛋白连接，得到所述磁珠包被物。
9.根据权利要求1～4任一项所述的磁珠包被物或者权利要求5～8任一项所述的磁珠包被物的制备方法制备得到的磁珠包被物在制备检测试剂、检测试剂盒或者检测装置中的应用。
10.一种检测试剂盒，其特征在于，包括权利要求1～4任一项所述的磁珠包被物或者权利要求5～8任一项所述的磁珠包被物的制备方法制备得到的磁珠包被物。
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Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN111983221A (zh) * | 2020-08-19 | 2020-11-24 | 深圳市卓润生物科技有限公司 | 表面修饰磁珠及其制备方法和应用 |
Citations (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4732863A (en) * | 1984-12-31 | 1988-03-22 | University Of New Mexico | PEG-modified antibody with reduced affinity for cell surface Fc receptors |
| US5314830A (en) * | 1992-10-30 | 1994-05-24 | University Of New Mexico | Immobilized hydrophobically-modified antibodies |
| CN1984924A (zh) * | 2004-03-17 | 2007-06-20 | 抗癌公司 | 提高蛋白质与聚乙二醇（peg）结合度的方法 |
| US20080131978A1 (en) * | 2004-02-03 | 2008-06-05 | Asahi Kasei Kabushiki Kaisha | Method of Detecting Analyte Using Magnetic Beads |
| CN102617810A (zh) * | 2012-02-27 | 2012-08-01 | 重庆医科大学 | 用两端带羧基的直链亲水聚合物包被纳米磁芯制备微纳米磁性材料的方法及其应用 |
| US20130337434A1 (en) * | 2012-06-19 | 2013-12-19 | Atomic Energy Council-Institute Of Nuclear Energy Research | Method of Preparing Magnetic Bead Type Nasopharyngeal Enzyme Immunoassay Reagents by Polymerase Chain Reaction |
| US20180264133A1 (en) * | 2017-03-16 | 2018-09-20 | Immunwork Inc. | Linker units and molecular constructs comprising the same |
-
2019
- 2019-09-30 CN CN201910942742.9A patent/CN110672836B/zh active Active
Patent Citations (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4732863A (en) * | 1984-12-31 | 1988-03-22 | University Of New Mexico | PEG-modified antibody with reduced affinity for cell surface Fc receptors |
| US5314830A (en) * | 1992-10-30 | 1994-05-24 | University Of New Mexico | Immobilized hydrophobically-modified antibodies |
| US20080131978A1 (en) * | 2004-02-03 | 2008-06-05 | Asahi Kasei Kabushiki Kaisha | Method of Detecting Analyte Using Magnetic Beads |
| CN1984924A (zh) * | 2004-03-17 | 2007-06-20 | 抗癌公司 | 提高蛋白质与聚乙二醇（peg）结合度的方法 |
| CN102617810A (zh) * | 2012-02-27 | 2012-08-01 | 重庆医科大学 | 用两端带羧基的直链亲水聚合物包被纳米磁芯制备微纳米磁性材料的方法及其应用 |
| US20130337434A1 (en) * | 2012-06-19 | 2013-12-19 | Atomic Energy Council-Institute Of Nuclear Energy Research | Method of Preparing Magnetic Bead Type Nasopharyngeal Enzyme Immunoassay Reagents by Polymerase Chain Reaction |
| US20180264133A1 (en) * | 2017-03-16 | 2018-09-20 | Immunwork Inc. | Linker units and molecular constructs comprising the same |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| 张永国: "蛋白质的PEG修饰", 《海峡药学》 * |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN111983221A (zh) * | 2020-08-19 | 2020-11-24 | 深圳市卓润生物科技有限公司 | 表面修饰磁珠及其制备方法和应用 |
| CN111983221B (zh) * | 2020-08-19 | 2024-04-09 | 深圳市卓润生物科技有限公司 | 表面修饰磁珠及其制备方法和应用 |
Also Published As
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