CN105203522A - 一种量子点结核分枝杆菌定量检测试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种量子点结核分枝杆菌定量检测试剂盒，其包括：弱荧光层析膜、弱荧光吸水纸、弱荧光盒体、弱荧光上样垫、弱荧光支撑垫板、弱荧光标记垫以及缓冲液；其中，所述弱荧光标记垫上设有量子点标记的MPT32、38KD、MPT？63以及CFP10-ESAT？6蛋白；所述弱荧光吸盒体分为上盖体和底座，所述上盖体上设置有第一加样孔、第二加样孔以及检测窗口；所述量子点标记的MPT32、38KD、MPT？63以及CFP10-ESAT？6蛋白以质量比为4:3:5:5比例混合后，与批弱荧光标记垫结合。本发明的量子点结核分枝杆菌定量检测试剂盒，由于采用了本发明的缓冲液的配方，使得减少了试剂盒检测的非特异性结合，提高了灵敏度和准确度，并且通过量子点标记蛋白，可以对抗体检测进行相对定量，提高了检测的精确度。

Description

一种量子点结核分枝杆菌定量检测试剂盒

技术领域

本发明涉及一种医疗检验检测方法，尤其是涉及一种量子点结核分枝杆菌定量检测试剂盒及其制备方法。

背景技术

结核病以呼吸道传播为主，也可以通过消化道、破损皮肤粘膜等多种途径进入机体，侵犯多种组织器官，以肺结核最为常见，其致病性可能与细菌在组细胞内大量繁殖引起的炎症、菌体成分及代谢物质的毒性以及机体对菌体成分生的免疫损伤有关。

MTB致病菌体成分包括脂类(抗吞噬、抗消毁)、蛋白质(与蜡质、磷脂结引起机体迟发型过敏反应)、多糖质(与脂质结合成脂多糖，能引起机体发生速发型过敏反应，又能引起局部病灶内细胞浸润和抑制抗原与抗体的反应)。

结核病患者的抗体反应是针对结核抗原的，任何一种抗原都无法检测结核病患者血清中所有的结核抗体，因此联合多种抗原进行检测，在保证特异性的基础上有助于提高诊断的敏感性。目前检测方法中，主要是通过ELISA等免疫学检测，检测结果不够准确，检测不够迅速，存在漏检的风险，检测过程用时间久，极为不方便。

尤其是现有的检测没有对血液中存在相应的抗体，作相对定量的检测，且现有的检测方法也无法对抗体的进行相对定量，不能很好的对结核病进行诊断和治疗，不能很好的对结核病感染进行分期，更准确的判断结核的感染、发生以及发展，为临床用药提供更加准确的指导。

筛选多个纯化特异性抗原组成的联合抗原来检测结核病患者体内抗体，增加血清学诊断的敏感性，是目前结核病血清学诊断研究中的主要方向。本检测是通过联合多个纯化结核特异性抗原，利用双抗原夹心法检测血清中的相应抗原的特异性抗体（IgG,IgM等），已达到检测的灵敏度和特异性。

发明内容

本发明的目的是提供一种量子点结核分枝杆菌定量检测试剂盒，其具有检测结果准确，特异性好，灵敏度高，可以对检测的抗体相对定量避免结核的漏检，测量的结果稳定可靠。

为解决上述技术问题，本发明提供一种量子点结核分枝杆菌定量检测试剂盒，其包括：弱荧光层析膜、弱荧光吸水纸、弱荧光盒体、弱荧光上样垫、弱荧光支撑垫板、弱荧光标记垫以及缓冲液；

其中，所述弱荧光标记垫上设有量子点标记的MPT32、38KD、MPT63以及CFP10-ESAT6蛋白；

所述弱荧光吸盒体分为上盖体和底座，所述上盖体上设置有第一加样孔、第二加样孔以及检测窗口；

所述量子点标记的MPT32、38KD、MPT63以及CFP10-ESAT6蛋白以质量比为4:3:5:5比例混合后，与弱荧光标记垫结合；

弱荧光上样垫部分与所述弱荧光标记垫叠合，所述弱荧光标记垫部分与弱荧光层析膜2的一端叠合，所述弱荧光吸水纸与所述弱荧光层析膜2的另一端叠合，所述弱荧光层析膜2、所述弱荧光标记垫以及所述弱荧光上样垫与所述弱荧光支撑垫板结合；

所述缓冲液中含有荧光猝灭剂，该荧光猝灭剂可使弱荧光吸水纸上的弱荧光进一步消失，但不影响量子点标记的蛋白；

所述弱荧光层析膜上依次包被有第一检测带MPT32蛋白、第二检测带38KD蛋白、第三检测带MPT63蛋白以及第四检测带CFP10-ESAT6蛋白以及质控带；

所述缓冲液中叠氮钠的质量浓度为0.001%，PVC的质量浓度为0.01%以及质量分数为10%的海藻糖，PEG的质量浓度为0.005%；

所述弱荧光盒体的一侧设置有空隙，利于液体在层析垫上虹吸作用的发生。

所述量子点是ZnS、CdSe、MgSe、CdTe的量子点的之一或者至少其中两者的组合，且其中掺杂有Cu、Mn、Fe和Hg中的至少一种。

所述量子点为CdSe/ZnS。

所述缓冲液的pH值为7.8-8.6之间，且所述缓冲液的pH值是通过碳酸钠溶液或者氨水溶液进行调整的。

所述量子点标记的MPT32、38KD、MPT63以及CFP10-ESAT6蛋白，通过质量浓度为1%至2%的BSA对其进行封闭。

所述量子点标记的MPT32、38KD、MPT63以及CFP10-ESAT6蛋白的荧光发射波长为580-630nm。

所述质控带上包被有多克隆抗体。

MPT32蛋白的最佳标记量为0.5ug/pmol量子点；

38KD蛋白的最佳标记量为0.6ug/pmol量子点；

MPT63蛋白的最佳标记量为0.7ug/pmol量子点；

CFP10-ESAT6的最佳标记量为0.5ug/pmol量子点。

还包括荧光定量检测仪，用于判读检测条带和质控条带的荧光检测强度。

所述荧光定量检测仪包含激发光源模块、滤光模块、光电转换模块、控制分析模块和软件系统。

本发明的量子点结核分枝杆菌定量检测试剂盒，由于采用了本发明的缓冲液的配方，使得减少了试剂盒检测的非特异性结合，提高了灵敏度和准确度，并且通过量子点标记蛋白，可以对抗体检测进行相对定量，提高了检测的精确度，多个蛋白的联合运用进行检测，避免了对结核感病者的漏检，本发明采用了弱荧光性的试剂盒、层析膜、吸水纸以及本发明的缓冲液，尤其是缓冲液中加入了荧光淬灭剂降低了背景信号信噪比，提高了检测结果的准确度。

附图说明

图1本发明的量子点结核分枝杆菌定量检测试剂盒的正面结构示意图；

图2为本发明的量子点结核分枝杆菌定量检测试剂盒的内部试纸条的结构示意图；

图3为本发明的量子点结核分枝杆菌定量检测试剂盒的试纸条的纵截面结构示意图。

具体实施方式

下面通过具体的实施例进一步对本发明的技术方案进行说明，但不是对本发明的限制，任何人根据本发明的技术方案，而对本发明作出的简单的修改、等同替换皆属于本发明的技术方案。

结核分枝杆菌的多个抗原可用于结核的体外检测，每个抗原具体应用到体外检测的过程中，其实际操作过程存在一定的难度，例如会存在交叉反应，不同蛋白之间，在检测标记过程中，存在着相互之间的影响，例如，将38KD蛋白与TB-SA蛋白通过量子点标记时，共同检测时，两者相互影响，影响检测的结果。

经过无数次的检测实验，选择所需要的结核检测蛋白，并进行量子点标记，通过样本进行检测，通过与质控品比较，得到适合混合一起检测的结核分枝杆菌蛋白。通过分析以及实验筛选，选择检测蛋白之间无相互影响，检测结果准确，特异性高，灵敏度高的抗原联合对结核分支杆菌进行检测。

本发明选择的结核分支杆菌蛋白为：MPT32、38kDa、MPT63以及CFP10-ESAT6。具体的，本发明的MPT32抗原是一种糖基化纤连蛋白，属于早期分泌蛋白，对结核病的早期诊断具有较高的阳性检出率，可以很好的提高结核病的早期诊断率。38kDa蛋白是一定位在质膜上的磷酸盐转运蛋白，只在分枝杆菌复合体中表达，是结核分枝杆菌的一种分泌性脂蛋白,含有特异的B淋巴细胞和T淋巴细胞抗原决定簇,对小鼠、豚鼠和人类B细胞具有最强免疫学活性,能诱导早期反应。38kDa抗原参与磷酸盐代谢的细胞外脂蛋白,对结核分枝杆菌抗体包括复杂菌种型均敏感特异。

MPT63蛋白基因的RvNO.为Rv1926c，其能以可溶性蛋白表达，ELISA方法应用MPT63检测血清抗体的敏感性和特异性分别为15%和98.7%,提示联合抗原。阳性率8.41%；并以其为抗原ELISA法检测涂阴和涂阳病人及对照组血清中IgG、IgA和IgM水平。

血清结核抗原的阳性检出率均不高，但特异度很好。重组蛋白能与结核患者血清发生特异性免疫结合反应，与健康者血清不发生反应。再以此蛋白免疫动物可产生高效价的抗体。抗CFP10-ESAT6多克隆抗体的效价在1：16000稀释后OD450值基本上都达到1.0左右。在纯化和酶标记后，分别以1：1000为包被工作浓度，1：3000为酶标工作浓度时，CFP10-ESAT6的最低检出浓度为25ng／ml，CFP10-ESAT6检测17种分枝杆菌培养上清只有结核分枝杆菌和牛结核分枝杆菌结果为阳性。在与血清反应时的敏感性和特异性分别为40.1％，99.2％。

本发明采用的抗原含有4种特异性抗原,故能测出IgG、IgM、IgA等不同抗体,提高了检测敏感性,弥补了宿主体液免疫反应的差异，应用这种方法对结核病的诊断价值进行探讨,提示其具有较高特异性,能快速检测结核抗体，对结核病的诊断及鉴别诊断具有较好临床价值,且操作简单、快速,适用于各级医院,尤其适用于对门诊患者做出快速诊断,该蛋白有两个特意的B细胞表位。本发明利用四种抗原联合检测的灵敏度,特异度各自为93％、98％。

此外，本发明，通过标定某种抗原对应的抗体的量，进一步与病人的病程相对应，以进一步将抗体的检测定量化，进一步提高疾病诊断的准确性。

本发明一种量子点结核分枝杆菌定量检测试剂盒，其包括：弱荧光层析膜2、弱荧光吸水纸23、弱荧光盒体1、弱荧光上样垫21、弱荧光支撑垫板10、弱荧光标记垫22以及缓冲液；其中，弱荧光标记垫22上设有量子点标记的MPT32、38KD、MPT63以及CFP10-ESAT6蛋白；弱荧光吸盒体1分为上盖体和底座，上盖体上设置有第一加样孔11、第二加样孔12以及检测窗口13；量子点标记的MPT32、38KD、MPT63以及CFP10-ESAT6蛋白以质量比为4:3:5:5比例混合后，与弱荧光标记垫22结合；弱荧光上样垫21部分与弱荧光标记垫22叠合，弱荧光标记垫22部分与弱荧光层析膜2的一端叠合，弱荧光吸水纸23与弱荧光层析膜2的另一端叠合，弱荧光层析膜2、弱荧光标记垫22以及弱荧光上样垫21与弱荧光支撑垫板10结合；缓冲液中含有荧光猝灭剂，该荧光猝灭剂可使弱荧光吸水纸上的弱荧光进一步消失，但不影响量子点标记的蛋白；

弱荧光层析膜2上依次包被有第一检测带3MPT32蛋白、第二检测带438KD蛋白、第三检测带5MPT63蛋白以及第四检测带6CFP10-ESAT6蛋白以及质控带7；缓冲液中叠氮钠的质量浓度为0.001%，PVC的质量浓度为0.01%以及质量分数为10%的海藻糖，PEG的质量浓度为0.005%。本发明采用弱荧光渗滤膜、弱荧光吸水纸和弱荧光盒体，从而保证获得高荧光信噪比，能良好区分信号与背景，提高了检测灵敏度。

量子点是ZnS、CdSe、MgSe、CdTe的量子点的之一或者至少其中两者的组合，且其中掺杂有Cu、Mn、Fe和Hg中的至少一种，较佳的，量子点为CdSe/ZnS量子点。

缓冲液的pH值为7.8-8.6之间，且缓冲液的pH值是通过碳酸钠溶液或者氨水溶液进行调整的。

量子点标记的MPT32、38KD、MPT63以及CFP10-ESAT6蛋白，通过质量浓度为1%至2%的BSA对其进行封闭。

量子点标记的MPT32、38KD、MPT63以及CFP10-ESAT6蛋白中均由一部分的荧光发射波长为580-630nm。

MPT32蛋白的最佳标记量为0.5ug/pmol量子点；38KD蛋白的最佳标记量为0.6ug/pmol量子点；MPT63蛋白的最佳标记量为0.7ug/pmol量子点；CFP10-ESAT6的最佳标记量为0.5ug/pmol量子点。

实施例1制备CdSe/ZnS量子点

本发明的CdSe/ZnS量子点的制备，取0.2843g硒粉、2.80mL十八烯和1.49mL三正辛基膦，依次加入25ml容器中，加热容器中混合液体并反复振荡直至硒粉全部溶解，即得硒前体。

取0.0298g氧化镉、0.342g硬脂酸和4.2ml十八烯，依次加入三颈烧瓶中，氮气保护下加热至氧化镉全部溶解。降温使溶液冷却至凝固。取3.2g十八胺和0.88g三辛基氧化膦，加入三颈烧瓶，并加热使固体融解，继续加热至295℃，注入4.5mL硒前体，升温至255℃，使CdSe量子点荧光发射波长增加到所需波长。并以甲醇纯化量子点。

取8mL十八烯、0.118g硫粉，依次加入三颈烧瓶中，在氮气保护下加热至硫粉溶解，即得硫前体。另取0.9256g氧化锌、10mL油酸和3mL十八烯，依次加入三颈烧瓶中，在氮气保护下加热至锌粉溶解，即得锌前体。取2.5mlCdSe量子点溶液，加入三颈烧瓶中，抽真空去除氯仿，取以上合成的硫前体和锌前体，以及6mL十八烯和1.33g十八胺，依次加入三颈烧瓶中，加热使固体融解，在氮气保护下加热使量子点生长至所需波长，并以甲醇纯化。表征量子点荧光特征，CdSe/ZnS量子点荧光发射波长为630nm，量子产率大于50％。

取0.5-1.0g四甲基氢氧化铵五水合物，加入0.1-1ml巯基丙酸和10ml氯仿，摇均，静置30分钟后，去除上层液体，然后加入100μlCdSe/ZnS量子点溶液。溶液中有红色沉淀析出，48小时后取出红色悬浮物，以氯仿纯化后，溶于水溶液中，得到表面官能团为羧基的量子点。量子点相转移前后荧光特性无明显变化。

通过调整各个添加物的物质的量的不同，以及控制量子点的反应时间，分别可以制备得到荧光发射波长不同的量子点，制备得到荧光发射波长范围为580nm-900nm的量子点。

实施例2量子点标记的MPT32蛋白

通过正交实验，确定MPT32蛋白的最佳标记量为0.4ug/pmol至0.8ug/pmol量子点。

1、取一定的磷酸缓冲液，并在磷酸缓冲液中加入一定量的BSA，然后加入60pmol，荧光发射波长为580nm的量子点、8μgEDC和12μgNHS溶液和25μg纯化的MPT32蛋白溶液，混合均匀并于室温下反应5h，加入0.8mg甘氨酸封闭。用色谱柱或层析柱分离纯化，得到荧光发射波长为580nm的量子点标记的MPT32蛋白。

2、取一定的磷酸缓冲液，并在磷酸缓冲液中加入一定量的BSA，然后加入60pmol，荧光发射波长为600nm的量子点、10μgEDC和16μgNHS溶液和28μg纯化的MPT32蛋白溶液，混合均匀并于室温下反应5h，加入0.9mg甘氨酸封闭。用色谱柱或层析柱分离纯化，得到荧光发射波长为630nm的量子点标记的MPT32蛋白。

3、取一定的磷酸缓冲液，并在磷酸缓冲液中加入一定量的BSA，然后加入80pmol，荧光发射波长为850nm的量子点、10μgEDC和16μgNHS溶液和30μg纯化的MPT32蛋白溶液，混合均匀并于室温下反应6h，加入1.0mg甘氨酸封闭。用色谱柱或层析柱分离纯化，得到荧光发射波长为850nm的量子点标记的MPT32蛋白。

实施例3量子点标记38KD蛋白

通过正交实验，确定38KD蛋白的最佳标记量为0.5ug/pmol至0.8ug/pmol量子点。

1、取一定的磷酸缓冲液，并在磷酸缓冲液中加入一定量的BSA，然后加入60pmol，荧光发射波长为580nm的量子点、8μgEDC和12μgNHS溶液和42μg纯化的38KD蛋白溶液，混合均匀并于室温下反应5h，加入0.8mg甘氨酸封闭。用色谱柱或层析柱分离纯化，得到荧光发射波长为580nm的量子点标记的38KD蛋白。

2、取一定的磷酸缓冲液，并在磷酸缓冲液中加入一定量的BSA，然后加入60pmol，荧光发射波长为600nm的量子点、10μgEDC和16μgNHS溶液和45μg纯化的38KD蛋白溶液，混合均匀并于室温下反应5h，加入1.0mg甘氨酸封闭。用色谱柱或层析柱分离纯化，得到荧光发射波长为630nm的量子点标记的38KD蛋白。

3、取一定的磷酸缓冲液，并在磷酸缓冲液中加入一定量的BSA，然后加入60pmol，荧光发射波长为850nm的量子点、10μgEDC和16μgNHS溶液和36μg纯化的38KD蛋白溶液，混合均匀并于室温下反应6h，加入0.8mg甘氨酸封闭。用色谱柱或层析柱分离纯化，得到荧光发射波长为850nm的量子点标记的38KD蛋白。

实施例4量子点标记MPT63蛋白

通过正交实验，确定MPT63蛋白的最佳标记量为0.65ug/pmol至0.8ug/pmol量子点。

1、取一定的磷酸缓冲液，并在磷酸缓冲液中加入一定量的BSA，然后加入60pmol，荧光发射波长为580nm的量子点、8μgEDC和12μgNHS溶液和43μg纯化的MPT63蛋白溶液，混合均匀并于室温下反应5h，加入0.9mg甘氨酸封闭。用色谱柱或层析柱分离纯化，得到荧光发射波长为580nm的量子点标记的MPT63蛋白。

2、取一定的磷酸缓冲液，并在磷酸缓冲液中加入一定量的BSA，然后加入60pmol，荧光发射波长为600nm的量子点、10μgEDC和16μgNHS溶液和54μg纯化的MPT63蛋白溶液，混合均匀并于室温下反应5h，加入1.0mg甘氨酸封闭。用色谱柱或层析柱分离纯化，得到荧光发射波长为630nm的量子点标记的MPT63蛋白。

3、取一定的磷酸缓冲液，并在磷酸缓冲液中加入一定量的BSA，然后加入60pmol，荧光发射波长为850nm的量子点、10μgEDC和16μgNHS溶液和42μg纯化的MPT63蛋白溶液，混合均匀并于室温下反应6h，加入1.0mg甘氨酸封闭。用色谱柱或层析柱分离纯化，得到荧光发射波长为850nm的量子点标记的MPT63蛋白。

实施例5量子点标记的CFP10-ESAT6蛋白

通过正交实验，确定CFP10-ESAT6蛋白的最佳标记量为0.3ug/pmol至0.6ug/pmol量子点。

1、取一定的磷酸缓冲液，并在磷酸缓冲液中加入一定量的BSA，然后加入60pmol，荧光发射波长为580nm的量子点、8μgEDC和12μgNHS溶液和18μg纯化的CFP10-ESAT6蛋白溶液，混合均匀并于室温下反应5h，加入1.0mg甘氨酸封闭。用色谱柱或层析柱分离纯化，得到荧光发射波长为580nm的量子点标记的CFP10-ESAT6蛋白。

2、取一定的磷酸缓冲液，并在磷酸缓冲液中加入一定量的BSA，然后加入60pmol，荧光发射波长为600nm的量子点、10μgEDC和16μgNHS溶液和20μg纯化的CFP10-ESAT6蛋白溶液，混合均匀并于室温下反应5h，加入1.0mg甘氨酸封闭。用色谱柱或层析柱分离纯化，得到荧光发射波长为630nm的量子点标记的CFP10-ESAT6蛋白。

3、取一定的磷酸缓冲液，并在磷酸缓冲液中加入一定量的BSA，然后加入60pmol，荧光发射波长为850nm的量子点、10μgEDC和16μgNHS溶液和30μg纯化的CFP10-ESAT6蛋白溶液，混合均匀并于室温下反应6h，加入1.0mg甘氨酸封闭。用色谱柱或层析柱分离纯化，得到荧光发射波长为850nm的量子点标记的CFP10-ESAT6蛋白。

实施例6量子点结核分枝杆菌定量检测试剂盒的制备

选择弱荧光层析膜、弱荧光吸水纸、弱荧光盒体、弱荧光上样垫、弱荧光支撑垫板、弱荧光标记垫。

580nm量子点标记的MPT32、38KD、MPT63以及CFP10-ESAT6蛋白以质量比为4:3:5:5比例混合，并将混合后的量子点喷涂到弱荧光标记垫上，37℃干燥。

分别在弱荧光层析膜上，将MPT32、38KD、MPT63以及CFP10-ESAT6依次划线包被为第一检测带、第二检测带、第三检测带以及第四检测带，MPT32、38KD、MPT63以及CFP10-ESAT6划线溶液的浓度依次为0.83mg/ml,0.65mg/ml,0.36mg/ml,0.9mg/ml。质控线为多克隆抗体。

将弱荧光层析膜2固定在弱荧光支撑垫板10上，在该弱荧光层析膜2的远离质控线的一端，弱荧光上样垫21与弱荧光层析膜2部分固定贴合，在该弱荧光层析膜2的另一侧靠近质控线7的位置上还固定贴合有缓冲液垫24，靠近缓冲液垫24的层析膜2上贴合固定弱荧光吸水纸23。

将上述组合完成的弱荧光层析膜2固定到弱荧光盒体1内部形成量子点结核分枝杆菌定量检测试剂盒。从检测窗口可以看到第一检测带3、第二检测带4、第三检测带5、第四检测带6以及质控线7。第一加样孔11与弱荧光上样垫21对应，第二加样孔12与缓冲液垫24对应。弱荧光盒体的一侧设置有空隙9，利于液体在层析膜上虹吸作用的发生，使得加在弱荧光上样垫21上的液体可以很好的向另一侧层析。

实施例8缓冲液的制备

缓冲液中，叠氮钠的质量浓度为0.001%，PVC的质量浓度为0.01%以及质量分数为10%的海藻糖，PEG的质量浓度为0.005%，缓冲液为0.1mol磷酸缓冲。当缓冲液中加入10%的海藻糖，PEG的质量浓度为0.005%，PVC的质量浓度为0.01%时，保证了整个试纸条检测过程中的液体的流动时间恰到好处，使得检测物与标记物以及包被物的充分结合。叠氮钠的添加，大大降低了整个反应体系的非特异性结合，提高了整个检测试剂盒检测的准确度和灵敏度。

此外，本发明的荧光定量仪包含激发光源模块、滤光模块、光电转换模块、控制分析模块和软件系统。其中激发光源模块包含光源和聚光装置，该光源为发光二极管或激光二极管，波长选择300～400nm之间或500～600nm之间。滤光模块包含滤光片轮，该滤光片轮包含不同种滤光片，以获取相应量子点的荧光信号。光电转换模块包含图像传感器或光电倍增管。

层析结束后，在光源激发下，试纸条产生的荧光信号，经过滤光模块滤除杂散光及背景荧光，到达光电转换模块，转换为数字信号。

具体的，本发明在具体检测时，在第一加样孔内加入要检测样本，同时在第二加样孔内加入本发明的缓冲液，溶液在层析试纸条上层析结束后3分钟内读数，通过荧光定量仪度数。荧光定量检测仪将记录荧光信号强度，将测得的荧光信号强度与标准品的荧光信号强度进行比较，就可相对定量的得到抗体相对量浓度，根据抗体的相对量浓度，临床诊断其结核分枝杆菌发展的阶段和进程，本发明通过不同的抗原蛋白，提高了检测的灵敏度和特异性，进一步通过对抗体相对定量检测，可准确的预测病程的发展阶段，为结核病的临床用药提供了更准确的指导作用。

本发明通过双向测流系统，使得检测时，本发明的层析试纸条浸泡在本发明的缓冲液中，该缓冲液起到了保持整个检测环境一致性的作用，从而保证层析试纸条中的量子点标记物与包被的蛋白抗原反应条件的一致性。本发明通过自制的缓冲液以及整个系统，消除了温度、湿度和基质等对检测结果的不利影响。然后检测样本，依据标准曲线获得样本中分析物浓度。

本发明的量子点结核分枝杆菌定量检测试剂盒，由于采用了本发明的缓冲液的配方，使得减少了试剂盒检测的非特异性结合，提高了灵敏度和准确度，并且通过量子点标记蛋白，可以对抗体检测进行相对定量，提高了检测的精确度，多个蛋白的联合运用进行检测，避免了对结核感病者的漏检，本发明采用了弱荧光性的试剂盒、层析膜、吸水纸以及本发明的缓冲液，尤其是缓冲液中加入了荧光淬灭剂降低了背景信号信噪比，提高了检测结果的准确度。

以上仅为本发明的较佳实施例，不得以此限定本发明实施的保护范围，因此凡参考本发明的说明书内容所作的简单等效变化与修饰，仍属本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种量子点结核分枝杆菌定量检测试剂盒，其特征在于包括：弱荧光层析膜、弱荧光吸水纸、弱荧光盒体、弱荧光上样垫、弱荧光支撑垫板、弱荧光标记垫以及缓冲液；

其中，所述弱荧光标记垫上设有量子点标记的MPT32、38KD、MPT63以及CFP10-ESAT6蛋白；

所述弱荧光吸盒体分为上盖体和底座，所述上盖体上设置有第一加样孔、第二加样孔以及检测窗口；

所述量子点标记的MPT32、38KD、MPT63以及CFP10-ESAT6蛋白以质量比为4:3:5:5比例混合后，与弱荧光标记垫结合；

弱荧光上样垫部分与所述弱荧光标记垫叠合，所述弱荧光标记垫部分与弱荧光层析膜2的一端叠合，所述弱荧光吸水纸与所述弱荧光层析膜2的另一端叠合，所述弱荧光层析膜2、所述弱荧光标记垫以及所述弱荧光上样垫与所述弱荧光支撑垫板结合；

所述缓冲液中含有荧光猝灭剂，该荧光猝灭剂可使弱荧光吸水纸上的弱荧光进一步消失，但不影响量子点标记的蛋白；

所述弱荧光层析膜上依次包被有第一检测带MPT32蛋白、第二检测带38KD蛋白、第三检测带MPT63蛋白以及第四检测带CFP10-ESAT6蛋白以及质控带；

所述缓冲液中叠氮钠的质量浓度为0.001%，PVC的质量浓度为0.01%以及质量分数为10%的海藻糖，PEG的质量浓度为0.005%；

所述弱荧光盒体的一侧设置有空隙，利于液体在层析垫上虹吸作用的发生。

2.根据权利要求1所述的量子点结核分枝杆菌定量检测试剂盒，其特征在于，

所述量子点是ZnS、CdSe、MgSe、CdTe的量子点的之一或者至少其中两者的组合，且其中掺杂有Cu、Mn、Fe和Hg中的至少一种。

3.根据权利要求1所述的量子点结核分枝杆菌定量检测试剂盒，其特征在于，

所述量子点为CdSe/ZnS。

4.根据权利要求1所述的量子点结核分枝杆菌定量检测试剂盒，其特征在于，

所述缓冲液的pH值为7.8-8.6之间，且所述缓冲液的pH值是通过碳酸钠溶液或者氨水溶液进行调整的。

5.根据权利要求1所述的量子点结核分枝杆菌定量检测试剂盒，其特征在于，

所述量子点标记的MPT32、38KD、MPT63以及CFP10-ESAT6蛋白，通过质量浓度为1%至2%的BSA对其进行封闭。

6.根据权利要求1所述的量子点结核分枝杆菌定量检测试剂盒，其特征在于，

所述量子点标记的MPT32、38KD、MPT63以及CFP10-ESAT6蛋白的荧光发射波长为580-630nm。

7.根据权利要求6所述的量子点结核分枝杆菌定量检测试剂盒，其特征在于，

所述质控带上包被有多克隆抗体。

8.根据权利要求6所述的量子点结核分枝杆菌定量检测试剂盒，其特征在于，

MPT32蛋白的最佳标记量为0.5ug/pmol量子点；

38KD蛋白的最佳标记量为0.6ug/pmol量子点；

MPT63蛋白的最佳标记量为0.7ug/pmol量子点；

CFP10-ESAT6的最佳标记量为0.5ug/pmol量子点。

9.根据权利要求1所述的量子点结核分枝杆菌定量检测试剂盒，其特征在于还包括荧光定量检测仪，用于判读检测条带和质控条带的荧光检测强度。

10.根据权利要求9所述的量子点结核分枝杆菌定量检测试剂盒，其特征在于，

所述荧光定量检测仪包含激发光源模块、滤光模块、光电转换模块、控制分析模块和软件系统。