CN106537130A - 用于分析物检测的电化学传感器 - Google Patents

Abstract

用于生物样本中的分析物的检测的传感器包括：衬底；工作电极和对电极，它们形成在衬底的表面上；以及受体，其官能化或化学官能化到工作电极的暴露部分的表面。受体能够选择性地与目标分析物结合，一旦结合，通过测量在工作电极与对电极之间流动的流动能检测分析物。

Description

用于分析物检测的电化学传感器

相关申请

本申请要求于2014年5月27日提交的美国临时申请第62/003,205和2014年11月25日提交的美国临时申请第62/084,188的优先权，上述申请的主题全文通过引用方式并入本文中。

背景技术

典型的一次性电化学传感器包括衬底膜，一层导电材料沉积到该衬底膜上且图案化以形成电极。传统地，电化学电池或生物传感器由三个电极构成，工作电极或传感电极、基准电极以及对电极或辅助电极。工作电极是在相对于基准电极的固定施加电位下发生目标反应的地方。基准电极起到维持工作电极上的稳定的电位的作用。对电极允许电流在工作电极与对电极之间流动从而不干扰基准电极功能。在系统电位本质上稳定或者电位的小的波动不是问题的情况下，基准电极和对电极可以组合成与工作电极配对的单个基准/对电极。在一些实例中，电化学生物传感器使用电流滴定法来量化特定的分析物浓度。工作电极提供了与其所暴露的表面积成比例的响应。在制作期间，制造严密地控制与工作电极面积相关联的过程变化。

正常地，工作电极由两个或更多个元件形成。一个元件是形成有源元件的导电层，利于电子传输到或者传输自当样本施加到传感器上时所产生的电活性粒种。第二元件是介电层，其连同第一元件一起限定了与样本流体相接触的工作电极的实际尺寸。第二元件在导电层的一部分上形成了窗口。任一元件的变化会导致传感器响应的变化。第二元件或介电层因此会直接影响读数的精度。

在现有技术的电极中，表面积可由导电层图案化或介电层图案化和配准来限定。对于更精确地限定传感器的工作电极从而简化形成精确生物传感器的过程的装置存在需求。

发明概述

本文所描述的实施方案涉及能够利用生物识别元件来提供各种分析物或生物分子的分析的电化学生物传感器。该生物传感器能够产生与在诸如生物样本的样本中检测到的分析物的存在或量有关的信号。在一些实施方案中，生物传感器可用于检测存在于生物样本中的蛋白质，多肽，细胞因子，微生物，多核苷酸(mRNA，DNA，cDNA，mRNA等)，所述生物样本例如体液(例如血清，血液，唾液，尿，粘液，呼吸等)。

在一些实施方案中，生物传感器包括衬底、形成在衬底的表面上的工作电极、形成在衬底的表面上的对电极以及覆盖工作电极和对电极的部分且限定暴露工作电极和对电极的其它部分的孔口的介电层。工作电极官能化或化学官能化以包含用于至少一个目标分析物的受体。受体能够与体样本中的目标分析物中的一种或多种选择性地结合。

检测系统还可以包括测量设备，该测量设备用于对工作电极、对电极和/或基准电极施加电压电位且测量在工作电极与对电极之间流动的电流。可以使用电化学分析技术如循环伏安法(CV)，差分脉冲伏安法(DPV)来检测分析物和受体(例如结合的分析物)的相互作用，以确定生物样本中分析物的存在。

附图说明

图1是依照本申请的方面的生物传感器的示意图。

图2是由丝网印刷工艺制造的以行排列的生物传感器阵列的俯视平面图。

发明详述

除非本文特别指出，所使用的所有术语具有与本申请主题领域的技术人员所理解的相同的含义。以下定义将提供关于说明书和权利要求中使用的术语的清楚性。

如本文所使用的，术语“监测”是指使用从数据集产生的结果来提供关于个体或个体的健康或疾病状态的有用信息。“监测”可以包括例如预后，风险分层，药物治疗的选择，正在进行的药物治疗的评估，治疗有效性的确定，结果的预测，对治疗的反应的确定，疾病或随着疾病的进展疾病并发症的诊断，或提供与患者的健康状态随时间的任何信息，选择最可能受益于具有已知分子作用机制的实验性治疗的患者，选择最可能从具有已知分子机制的批准药物中获益的患者(其中该机制对于药物可能不具有标签的疾病的小子集可能是重要的)，筛选患者群体以帮助决定更侵入/昂贵的测试，例如，从非侵入性的血液测试到更例如活检的具侵入性的选择的测试级联，或测试以评估用于治疗另一种适应症的药物的副作用。

如本文所用，术语“定量数据”或“定量水平”或“定量量”是指与可以分配数值的任何数据集组分(例如，标志物，临床标志)相关联的数据、水平或量。

如本文所用，术语“受试者”是指人或另一种哺乳动物。通常，术语“受试者”和“患者”在本文中可互换地用于指人类个体。

如本文所使用的，术语“体样本”是指可以从受试者(例如人类)或从受试者的组分(例如组织)获得的样本。样本可以是任何生物组织或流体，其中利用生物组织或流体可以测定本文所述的分析物。通常，样本将是“临床样本”，即源自患者的样本。这样的样本包括但不限于体液，例如唾液、呼吸、尿、血液、血浆或血清；和具有已知诊断、治疗和/或结果历史的档案样本。术语生物样本还包括通过处理体样本得到的任何材料。体样本的处理可涉及过滤、蒸馏、萃取、浓缩、干扰组分的失活、试剂的添加等中的一种或多种。

如本文所用，术语“正常”和“健康”可互换使用。它们是指未显示待检测的疾病、病症或病状的任何症状，并且未被诊断患有疾病、病症或病状的个体或个体组。优选地，正常个体(或个体组)不服用药物。在某些实施方案中，正常个体与获得待测试样本的个体相比具有相似的性别、年龄、体重指数。术语“正常”在本文中也用于限定从健康个体分离的样本。

如本文所用，术语“对照”或“对照样本”是指从正常(即健康)个体或个体组分离的一个或多个生物样本。术语“对照”、“对照值”或“对照样本”还可以指从归类为正常的一个或多个个体的样本得到的数据的汇编。

本文所述的实施方案涉及能够使用生物识别元件提供对各种分析物或生物分子的分析的电化学生物传感器。该生物传感器可以产生与样本(例如生物样本)中检测到的分析物的存在或量相关的信号。在一些实施方案中，生物传感器可用于检测存在于生物样本中的蛋白质、多肽、细胞因子、微生物、多核苷酸(mRNA，DNA，cDNA，mRNA等)，生物样本例如体液(例如血清、血液、血浆、唾液、尿液、粘液、呼吸等)。本文所述的生物传感器可以提供用于生物样本(例如通过非侵入性或微创手段获得的体液)中的分析物的简单的即时检验、实时评估的单次使用，一次性和成本有效的手段。

图1示出了依照本申请的实施方案的生物传感器10。传感器10是三电极传感器，包括对电极12、工作电极14和基准电极16，它们形成在衬底的表面上。介电层40覆盖工作电极12、对电极14和基准电极16的一部分。介电层40包括限定工作电极12、对电极14和基准电极16的、暴露于包含待检测的一个或多个目标分析物的样本的检测区域的孔口20。用于至少一个目标分析物的受体能够官能化或化学官能化到工作电极。该受体能够将与生物样本中的目标分析物中的一个或多个选择性地结合。

生物传感器还可以包括：电压源22，用于对工作电极、对电极和/或基准电极施加电压定位，以及测量设备或电流监测器24，用于测量工作电极和对电极之间流动的电流。分析物和受体的相互作用可利用可以使用电化学分析技术如循环伏安法(CV)，差分脉冲伏安法(DPV)检测，以确定样本中分析物的存在。

工作电极14平衡在适当的电化学电位使得当受体与样本中的分析物结合时流经电极的电流变化。对电极12的作用是完成电路，允许电荷流经传感器10。工作电极14和对电极12优选地由相同的材料形成，但是这不是要求。可用于工作电极14和对电极12的材料的例子包括但不限于金，铂、钯、银、碳、其合金及其复合物。

被官能化或化学官能化到工作电极的受体是选择性结合目标分析物的分子。与分析物选择性结合的分子是优先结合该分析物的分子(即，其对该分析物的结合亲和力大于其对任何其它分析物的结合亲和力)。其对目标分析物的结合亲和力可以是其对任何其它分析物的结合亲和力的2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、15倍、20倍、25倍、30倍、40倍、50倍、100倍或更多。除了其相对结合亲和力之外，受体还必须具有足够高以有效结合目标分析物的绝对结合亲和力(即，它必须具有足够的灵敏度)。具有皮摩尔至微摩尔范围内的结合亲和力的受体是合适的。这种相互作用可以是可逆的。

受体可以是任何性质(例如，化学，核酸，肽，脂质，其组合等)。分析物也可以是任何性质的，只要存在选择性与其结合并且在一些情况下特异性与其结合的受体即可。在一些实施方案中，分析物可以是带电物质或分子。

本文所用的术语“官能化”或“化学官能化”是指通过化学反应将官能基团加成到材料的表面上。如本领域技术人员容易理解的，官能化可以用于材料的表面改性，以实现所需的表面性质，例如生物相容性，润湿性等。类似地，本文所用的术语“生物官能化”，“生物官能化”等意指对材料表面的改性，使得其具有所需的生物学功能，这将是如生物工程的相关领域的技术人员容易理解的。

受体可以共价或非共价地官能化到工作电极。受体与工作电极的共价附着可以是直接或间接的(例如通过连接子)。受体可以使用连接子固定在工作电极上。连接子可以是能够用于连接多种实体的连接子。

在一些实施方案中，连接子可以是同双功能连接子或异双功能连接子，这取决于待缀合的分子的性质。同双功能连接子具有两个相同的反应基团。异双功能连接子具有两个不同的反应基团。各种类型的市售连接子与一个或多个以下基团反应：伯胺，仲胺，巯基，羧基，羰基和碳水化合物。胺特异性连接子的实例是双(磺基琥珀酰亚胺基)辛二酸酯，双[2-(琥珀酰亚氨基氧基羰基氧基)乙基]砜，辛二酸二琥珀酰亚胺酯，酒石酸二琥珀酰亚胺酯，己二酸二甲酯2HCl，二甲基庚二亚胺2HCl，二甲基辛二酰亚胺HCl，乙二醇双-[琥珀酰亚胺基-[琥珀酸]]，二硫代双(丙酸琥珀酰亚胺酯)和3,3'-二硫代双(磺基琥珀酰亚胺基丙酸酯)。与巯基反应的连接子包括双马来酰亚胺己烷，1,4-二-[3'-(2'-吡啶基二硫代)-丙酰胺基)]丁烷，1-[对叠氮基水杨酰胺基]-4-[碘乙酰氨基]丁烷和N-[4-(对叠氮基水杨酰胺基)丁基]-3'-[2'-吡啶基二硫代]丙酰胺。优先与碳水化合物反应的连接子包括叠氮苯甲酰肼。优先与羧基反应的连接子包括4-[对叠氮基水杨酰胺基]丁胺。

与胺和巯基反应的异双功能连接子包括N-琥珀酰亚胺基-3-[2-吡啶基二硫代]丙酸酯，琥珀酰亚胺基[4-碘乙酰基]氨基苯甲酸酯，琥珀酰亚胺基4-[N-马来酰亚胺甲基]环己烷-1-羧酸酯，m-马来酰亚胺基苯甲酰基-N-羟基琥珀酰亚胺酯，磺基琥珀酰亚胺基6-[3-[2-吡啶基二硫代]丙酰胺基]己酸酯，和磺基琥珀酰亚胺基4-[N-马来酰亚胺基甲基]环己烷-1-羧酸酯。与羧基和胺基反应的异双能够连接子包括1-乙基-3-[3-二甲基氨基丙基]-碳二亚胺盐酸盐。与碳水化合物和巯基反应的异双功能连接子包括4-[N-马来酰亚胺甲基]-环己烷-1-羧基酰肼HCl，4-(4-N-马来酰亚胺基苯基)-丁酸酰肼2HCl，和3-[2-吡啶基二硫代]丙酰肼。

可替代地，受体可以非共价地涂敷到工作电极上。受体到工作电极的非共价沉积会涉及到聚合物基质的使用。聚合物可以是天然存在的或非天然存在的，并且可以是任何类型的，包括但不限于核酸(例如DNA，RNA，PNA，LNA等或其模拟物、衍生物或组合)，氨基酸(例如肽，蛋白质(天然或变性的)等)或其模拟物、衍生物或组合，脂质，多糖和官能化嵌段共聚物。受体可吸附到和/或包埋在聚合物基质内。

可替代地，受体可以与聚合物共价缀合或交联(例如，其可以“接枝”到官能化聚合物上)。

合适的肽聚合物的实例是聚赖氨酸(例如聚-L-赖氨酸)。其它聚合物的实例包括包含聚乙二醇(PEG)，聚酰胺，聚碳酸酯，聚烷撑，聚亚烷基二醇，聚环氧烷，聚对苯二甲酸亚烷基酯，聚乙烯醇，聚乙烯醚，聚乙烯酯，聚乙烯基卤化物，聚乙烯吡咯烷酮，聚乙交酯，聚硅氧烷，聚氨酯，烷基纤维素，羟烷基纤维素，纤维素醚，纤维素酯，硝基纤维素，丙烯酸酯和甲基丙烯酸酯的聚合物，甲基纤维素，乙基纤维素，羟丙基纤维素，羟丙基甲基纤维素，羟丁基甲基纤维素，乙酸纤维素，丙酸纤维素，纤维素乙酸丁酸酯，醋酸纤维素邻苯二甲酸酯，羧乙基纤维素，三乙酸纤维素，硫酸纤维素钠盐，聚(甲基丙烯酸甲酯)，聚(甲基丙烯酸乙酯)，聚(甲基丙烯酸丁酯)，聚(甲基丙烯酸异丁酯)，聚(甲基丙烯酸己酯)，聚(甲基丙烯酸异癸酯)，聚(甲基丙烯酸月桂酯)，聚(甲基丙烯酸苯酯)，聚(丙烯酸甲酯)，聚(丙烯酸异丙酯)，聚(丙烯酸异丁酯)，聚(丙烯酸十八烷基酯)，聚乙烯，聚丙烯，聚(乙二醇)，聚(环氧乙烷)，聚(对苯二甲酸乙二醇酯)，聚(乙烯醇)，聚乙酸乙烯酯，聚氯乙烯，聚苯乙烯，聚透明质酸，酪蛋白，明胶，谷蛋白，聚酸酐，聚丙烯酸，藻酸盐，壳聚糖，聚(甲基丙烯酸甲酯)，聚(甲基丙烯酸乙酯)，聚(甲基丙烯酸丁酯)，聚(甲基丙烯酸异丁酯)，聚(甲基丙烯酸己酯)，聚(甲基丙烯酸异癸酯)，聚(甲基丙烯酸月桂酯)，聚(甲基丙烯酸苯酯)，聚(丙烯酸甲酯)，聚(丙烯酸异丙酯)，聚(丙烯酸异丁酯)，和聚(丙烯酸十八烷基酯)，聚(丙交酯-乙交酯)，共聚草酸酯，聚己内酯，聚酯酰胺，聚原酸酯，聚羟基丁酸，聚酐，聚(苯乙烯-b-异丁烯-b-苯乙烯)(SIBS)嵌段共聚物，乙烯乙酸乙烯酯，聚(甲基)丙烯酸，乳酸和乙醇酸的聚合物，聚酸酐，聚(邻)酯，聚氨酯，聚(丁酸)，聚(戊酸)和聚(丙交酯-共聚己内酯)，以及例如藻酸盐和其它多糖的天然聚合物(包括葡聚糖和纤维素，胶原，白蛋白和其他亲水蛋白，玉米醇溶蛋白和其它醇溶谷蛋白和疏水蛋白)、其共聚物和混合物及其化学衍生物的嵌段共聚物，包括取代和/或添加化学基团，例如烷基，亚烷基，羟基化，氧化和本领域技术人员常规进行的其它改性。

在一个特定的实施方案中，工作电极可以包括化学交联或生物素化的金工作电极，以允许连接抗体或含生物素的分子。金工作电极可以例如用二硫醇双(琥珀酰亚胺基丙酸酯)(DSP)交联，其含有可与蛋白质和抗体的胺基团反应的胺反应性N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)酯。生物素化也可用于连接含生物素的分子，包括含有生物素的适体、蛋白质、核酸或其它分子。

将意识到，化学官能化的灵活性使得生物传感器可用于基本上附着对分析物具有亲和力的任何受体或配体。可以连接到工作电极的具有亲和力的受体或配体的分析物的实例包括但不限于DNA、RNA、寡核苷酸、蛋白质、生物素和链霉亲和素。官能化或化学官能化到工作电极的这些分析物的受体可以包括配体，例如抗体或其抗原结合片段。抗体通常在赖氨酸(K)残基的侧链中具有几个可用于交联的伯胺，例如NHS-酯交联。

化学官能化方法还使具有氨基的DNA适体的生物缀合成为可能。这些适体可潜在地结合小分子和蛋白质。一旦结合，工作电极表面上电荷的变化将使生物传感器能够检测靶生物分子或小分子。

在一些实施方案中，受体可以是特定于目标分析物的抗体。用于本文所述的生物传感器的合适的抗体包括单克隆和多克隆抗体，免疫活性片段(例如Fab或(Fab)2片段)，抗体重链，人源化抗体，抗体轻链和嵌合抗体。可以使用本领域已知的方法制备抗体(包括单克隆和多克隆抗体，片段和嵌合体)(参见例如，R.G.Mage和E.Lamoyi，“MonoclonalAntibody Production Techniques and Applications”，1987，Marcel Dekker，Inc.:纽约，第79-97页；G.Kohler和C.Milstein，Nature，1975,256：495-497；D.Kozbor等人，J.Immunol.Methods，1985,81：31-42；和R.J.Cote等人，Proc.Natl.Acad.Sci.1983,80：2026-203；R.A.Lerner，Nature，1982,299：593-596；A.C.Nairn等人，Nature，1982,299：734-736；A.J.Czernik等人，Methods Enzymol.1991,201：264-283；A.J.Czernik等人，Neuromethods：Regulatory Protein Modification：Techniques&Protocols，1997,30：219-250；A.J.Czemik等人，NeuroNeuroprotocols，1995,6：56-61；H.Zhang等人，J.BioI.Chern.2002,277：39379-39387；S.L.Morrison等人，Proc.Natl.Acad.Sci.，1984,81：6851-6855；M.S.Neuberger等人，Nature，1984,312：604-608；S.Takeda等人，Nature，1985,314：452-454)。用于生物传感器的抗体可以通过本领域公知的方法纯化(参见例如S.A.Minden，“Monoclonal Antibody Purification”，1996，IBC Biomedical LibrarySeries：Southbridge，Mass.)。例如，可以通过在其上结合蛋白质标记或其片段的柱上通过来亲和纯化抗体。然后可以使用具有高盐浓度的缓冲液从柱上洗脱结合的抗体。

代替制备，用于本文所述方法的抗体可以从科学或商业来源获得。

在一些实施方案中，受体可以是特异性结合癌生物标记的抗体或其抗原结合片段。癌症生物标记的实例包括AMACR(前列腺癌)，碳水化合物抗原125(CA125)(卵巢癌)，人附睾蛋白4(HE4)(卵巢癌)，BRAC1/BRAC2(乳腺癌，卵巢癌)，AFP(肝癌)，BCR-ABL(慢性髓性白血病)，BRAF V600E(黑色素瘤/结肠直肠癌)，KIT(胃肠道间质瘤)，PSA(前列腺癌)，S100(黑素瘤)，KRAS(肺癌)，CIZL(肺癌)和EGFR(结肠直肠/肺癌)。

应当理解，受体不限于针对癌生物标记的抗体或抗原结合片段，并且针对与可以在体样本中可检测的其它疾病，紊乱，病症或病理相关的其他生物标记的抗体或抗原结合片段也被官能化或化学官能化到工作电极。

为了最小化工作电极表面上的任何非特异性结合并阻断工作电极的任何开放表面区域，一旦受体已经被官能化或化学官能化到工作电极，则可以将至少一种阻滞剂施加到工作电极的表面上。阻滞剂可以通过最小化工作电极上的非特异性相互作用来增强生物传感器的再现性和灵敏度。在一些实施方案中，阻滞剂可以包括二硫苏糖醇或酪蛋白。阻滞剂可以以有效使得工作电极表面上的蛋白质或其它分子的非特异性结合最小化的量施加于工作电极的表面。

电压源22可以根据传感器10的设计而向工作电极14和基准电极16和/或对电极12施加电压电位。工作电极14和对电极16之间的电流可以用测量设备或计量器24来测得。这种电流取决于分析物与工作电极上的受体的相互作用。

所测得的电流的量或水平与生物样本中的分析物的水平或量成比例。在一些实施方案中，当样本是从受试者获得的体样本时，一旦确定了由用传感器测试的反应溶液所产生的电流水平，就可以将该水平与预定值或对照值进行比较，以提供用于诊断或监测受试者中与分析物的存在或不存在相关的病症，病理或障碍的信息。

从受试者获得的样本所产生的电流水平可以与先前(例如在施用治疗剂之前)从受试者获得的样本的电流水平比较。因此，本文所述的方法可用于通过比较治疗方案之前和之后所获得的电流水平来度量治疗与受试者中分析物的水平相关的病症、病理或障碍的治疗方案的功效。另外，本文所述的方法可用于通过比较在给定时间段内(例如数天，数周，数月或数年)获得的体样本中的电流水平，来度量与受试者中的目标分析物的存在或不存在相关的病症、病理或障碍的进展。

从受试者获得的样本所产生的电流水平也可以与预定值或对照值进行比较，以提供用于确定与受试者中分析物水平相关的病症、病理或障碍的严重性或攻击性的信息。预定值或对照值可以基于从健康或正常受试者或一般群体或从对照受试者的选顶群体获得的可比较样本中的电流水平。

预定值可以采取各种形式。预定值可以是单个截止值，例如中值或平均值。预定值可以基于比较组来建立，诸如其中一个定义的组中的电流电平是另一个定义的组中的电流电平的两倍。预定值可以是这样的范围，例如，其中一般受试者群体被均等地(或不等地)划分成组或划分为象限，最低象限是具有最低电流水平的受试者，最高象限是具有最高电流电平的个体。在示例性的实施方案中，选择两个截止值以最小化假阳性和假阴性结果的比率。

图1和图2中所示的生物传感器可以制造在衬底100上，衬底100由聚酯或其它非导电材料(例如其它聚合物材料、氧化铝(Al₂O₃)、陶瓷基材料、玻璃或半导电衬底，例如硅、氧化硅和其它覆盖的衬底。因此，多个传感器器件102可以形成在公共衬底100(图2)上。如将理解的，可以设想电极的几何形状和尺寸的变化。

生物传感器可以使用薄膜、厚膜和/或喷墨印刷技术制造，特别是用于在衬底上沉积多个电极。薄膜工艺可以包括物理或化学气相沉积。用于其制造的电化学传感器和厚膜技术在C.C.Liu等人的美国专利4,571,292，C.C.Liu的美国专利No.4,655,880，以及共同未决的美国申请序号09/466,865中进行了论述，这些专利或专利申请全部内容通过引用并入本文。

在一些实施方案中，工作电极、对电极和基准电极可利用激光消融来形成，激光消融是一种能够产生具有小于千分之一英寸的特征的元件的工艺。激光消融实现了工作电极、对电极和基准电极的精确限定以及电连接引线和其它特征，这是减少变化系数以及提供精确测量所要求的。可以使用激光烧蚀来照射金属化膜，例如Au，Pd和Pt或具有类似电化学性质的任何金属，其可以溅射或涂覆在塑料衬底(例如PET或聚碳酸酯)或其它介电材料上，以提供这些特征。

在一个实施例中，可以通过溅射技术沉积厚度为约300A至约2000A的金膜，得到非常均匀的层，其可以被激光烧蚀以形成工作电极和对电极。对电极可以使用其它材料。然而，为了制造的简单性，对于工作电极和对电极使用相同的材料将简化制造工艺，从而提供在单个处理步骤中生产两个电极的可行性。然后可以使用厚膜丝网印刷技术来印刷Ag/AgCl基准电极、绝缘层和电连接部件。

然后可以将工作电极表面化学交联或生物素化，以允许连接抗体或含生物素的分子。交联步骤可以通过产生硫醇键来完成。这可以使用例如DSP(二硫醇双[琥珀酰亚胺丙酸酯])化学完成以产生硫醇键。DSP可以溶于DMSO，(二甲基亚砜)。DSP在其碳间隔臂的每个末端含有胺反应性N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)酯。NHS可与伯胺(在pH＝7-9)反应而形成稳定的酰胺键。作为实例，可以使用1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，在DSP改性的金电极表面上形成半稳定的胺反应性酯基团。类似的化学方法可以用于产生半稳定的胺-酯基团以增强抗体和硫醇基团之间的交联。其它交联剂，例如3,3'-二硫代双[磺基琥珀酰亚胺基丙酸酯](DTSSP)也可以用于该工艺中。

生物素化是快速的、特异性的，并且通常由于生物素的相对小的尺寸而对分子的天然功能不受干扰。可以将链霉亲和素和类似的化学品如抗生物素蛋白固定在用于检测抗体和抗原的相互作用的生物传感器的工作电极表面上。

生物传感器的工作电极可以使用上述固定方法与抗体受体或含生物素的蛋白(包括抗体)交联或生物素化。

在将抗体或蛋白质加入工作电极之后，可以使用阻滞剂阻滞工作电极表面，以最小化电极表面上的任何非特异性分子(例如蛋白质)结合。该步骤将增强生物传感器的再现性和灵敏度。在一些实施方案中，可以使用DTT(二硫苏糖醇)、酪蛋白和/或其它阻滞剂来覆盖工作电极的开放表面积并使任何非特异性蛋白质覆盖最小化。

在其他实施方案中，可以在衬底的表面上提供多个生物传感器以提供生物传感器阵列。生物传感器阵列可以被配置为检测在阵列附近发生的化学和/或生物过程(化学反应，细胞培养，神经活性，核酸测序过程等)的宿主中的分析物浓度变化。生物传感器阵列可以包括布置成多行和多列的多个生物传感器。每个生物传感器包括工作电极、对电极和覆盖工作电极和对电极的一部分并且限定暴露工作电极和对电极的其它部分的孔口的介电层。用于至少一种目标分析物的受体可以被官能化或化学官能化到工作电极。对于阵列的每个生物传感器，受体可以是相同的或不同的，并且可以选择性地结合一种或多种目标分析物。阵列的生物传感器可以被配置为提供表示接近阵列表面的分析物的存在和/或浓度的至少一个输出信号。对于所述多个列中的每一列或所述多个行中的每一行，所述阵列进一步包括经配置以向所述列或行中的相应生物传感器提供电压电位的列或行电路。行或列中的每个生物传感器可以潜在地检测不同的分析物和/或偏置以检测不同的分析物。

在一个实施例中，受体可以包括与α-甲基酰基-CoA消旋酶(AMACR)或AMACR的底物或代谢物结合的抗体和/或其抗原结合片段。AMACR是涉及膳食支链脂肪酸的过氧化物酶体β氧化的酶。AMACR在前列腺癌上皮中一直过表达，因此它成为前列腺内癌细胞的理想的特异性生物标记。AMACR的过表达可能增加前列腺癌的风险，因为其表达在癌前病变(前列腺上皮内瘤变)中增加。此外，流行病学、遗传和实验室研究已经指出了AMACR在前列腺癌中的重要性。遗传性前列腺癌家族中基因组范围的连锁扫描已经证明，AMACR(5p 13)的染色体区域是前列腺癌易感基因的位置，并且已经显示AMACR基因序列变体(多态性)在具有遗传性前列腺癌的家族中与前列腺的癌症共分离。

在一些实施方案中，抗体可以是特异性结合AMACR的单克隆抗体。特异性结合AMACR的单克隆抗体的实例是可购自Dako的AMACR Clone13H4，可购自Thermoscientific的AMACR抗体2A10F3和可购自Novus的AMACR抗体2A10F3。

结合AMACR或AMACR的底物或代谢物的抗体或其抗原结合片段可以通过例如交联或生物素化共价或非共价地连接到工作电极上。抗体或其抗原结合片段与在获自患有或怀疑患有前列腺癌的受试者的生物样本中的AMACR或AMACR的底物或AMACR代谢物的相互作用将产生可以电化学、电学或光学方式检测的信号，并且该信号可以用于定量生物样本中的AMACR。

可以使用生物传感器测量从怀疑患有前列腺癌或处于前列腺癌的风险中的受试者获得的生物样本中的AMACR的量或数量，以确定体液中AMACR的水平和量，并因此判定受试者是否患有前列腺癌或患前列腺癌的风险增加。

取决于生物传感器的设计，电压源可以向工作电极和基准电极和/或对电极施加电压电位。工作电极和对电极之间的电流可以用测量设备或计量器来测量。

测得的电流的量或水平可以与生物样本中AMACR或AMACR的底物或代谢物的量以及受试者中前列腺癌的风险或存在成比例。一旦确定了用生物传感器测试的生物样本所产生的电流水平，就可以将该水平与预定值或对照值进行比较，以提供用于诊断或监测受试者中前列腺癌的信息。例如，可以将电流水平与预定值或对照值进行比较，以判定受试者是否患有前列腺癌或有前列腺癌。与预定值或对照值相比增加的电流水平可以指示受试者患有前列腺癌；而与预定值或对照值相比相似或降低的电流水平可指示受试者中前列腺癌的不存在。

由从受试者获得的生物样本所产生的电流水平可以与先前(例如在施用治疗剂之前)从受试者获得的类似生物样本的电流水平比较。因此，本文所述的方法可用于通过比较治疗方案之前和之后获得的电流水平来度量治疗方案用于治疗受试者的前列腺癌的功效。另外，本文所述的方法可用于通过比较在给定时间段(例如数天，数周，数月或数年)内所获得的生物样本中的电流水平来测量受试者中前列腺癌的进展。

由受试者的生物样本所产生的电流水平也可以与预定值或对照值比较，以提供用于确定受试者中前列腺癌的严重性或攻击性的信息。因此，在一些方面，可以将电流水平与从具有与前列腺癌相关的组织病理学的公知临床分类或阶段的受试者获得的对照值(例如，前列腺癌或惰性与攻击性前列腺癌的Gleason评分)进行比较。在一个具体实施方案中，样本中的电流可提供用于确定受试者中前列腺癌的特定Gleason等级或分数的信息。

预定值或对照值可以基于从健康或正常受试者或一般群体或从对照受试者的选顶群体获得的可比较样本中的电流水平。在一些方面，对照受试者的选顶群体可包括诊断为前列腺癌的个体。例如，与对照值相比具有更大电流水平的受试者可以指示具有更晚期的前列腺癌的受试者。

对照受试者的选择群体还可以包括患有前列腺癌的受试者，以便将患有前列腺癌的受试者与具有良性前列腺疾病的受试者区分开。在一些方面，对照受试者的选顶群体可以包括患有前列腺癌的一组个体。

预定值可以采取各种形式。预定值可以是单个截止值，例如中值或平均值。预定值可以基于比较组来建立，诸如其中一个定义的组中的电流电平是另一个定义的组中的电流电平的两倍。预定值可以是这样的范围，例如，其中一般受试者群体被均等地(或不等地)划分成组或划分为象限，最低象限是具有最低电流水平的受试者，最高象限是具有最高电流电平的个体。在示例性的实施方案中，选择两个截止值以最小化假阳性和假阴性结果的比率。

应当理解，AMACR的检测可以使用从受试者获得的任何生物样本或生理流体来完成。已经使用血液样本，并且也可以使用其他生理流体例如尿、唾液等实现AMACR的检测。因此，作为任何类型的生理流体中的前列腺癌的生物标志物的AMACR的检测可以由本文所述的生物传感器提供。

从本发明的上述描述，本领域技术人员将认识到改进、变化和修改。本领域技术内的这些改进、变化和修改旨在由所附权利要求覆盖。本申请中引用的所有参考文献、出版物和专利通过引用整体并入本文。

Claims (20)

1.用于生物样本中的分析物的检测的传感器，包括：

衬底；

形成在所述衬底的表面上的工作电极；

形成在所述衬底的所述表面上的对电极；

介电层，其覆盖所述工作电极和对电极的部分并且限定暴露所述工作电极和对电极的其它部分的孔口；

测量设备，其用于对所述工作电极和对电极施加电压电位以及测量在所述工作电极与对电极之间流动的电流；以及

受体，其官能化或化学官能化到所述工作电极的暴露部分的表面，所述受体与目标分析物选择性地结合并且一旦结合能够通过测量所述工作电极与对电极之间流动的电流来检测所述分析物。

2.如权利要求1所述的传感器，其中所述工作电极和所述对电极包括金属化膜。

3.如权利要求2所述的传感器，其中所述工作电极和对电极独立地包括金、铂、钯、银、碳、其合金及其复合物。

4.如权利要求9所述的传感器，通过将所述膜溅射或涂敷到所述表面上而将所述金属化膜设在所述衬底的表面上，并且其中所述工作电极和对电极利用激光消融来形成以限定所述工作电极和所述对电极的尺寸。

5.如权利要求1所述的传感器，还包括在所述衬底的表面上的基准电极，所述介电物覆盖所述基准电极的部分。

6.如权利要求1所述的传感器，所述受体包括抗体或生物素化抗体。

7.如权利要求1所述的传感器，通过交联或生物素化表面并将受体结合到交联或生物素化的表面来将受体官能化到工作电极的表面。

8.如权利要求7所述的传感器，其中工作电极的表面用二硫醇双(丙酸琥珀酰亚胺酯)(DSP)交联。

9.如权利要求1所述的传感器，还包括覆盖工作电极的暴露部分的开口区域的阻滞剂。

10.如权利要求1所述的传感器，其中所述阻滞剂包括DTT(二硫苏糖醇)或酪蛋白。

11.一种生物样本中的AMACR或其AMACR衬底的检测的传感器，包括：

衬底；

形成在所述衬底的表面上的工作电极；

形成在所述衬底的所述表面上的对电极；

介电层，其覆盖所述工作电极和对电极的部分且限定暴露所述工作电极和对电极的其它部分的孔口；

测量设备，其对所述工作电极和对电极施加电压电位且测量所述工作电极与对电极之间流动的电流；以及

与AMACR或AMACR衬底的抗体或抗原结合片段，其官能化或化学官能化到工作电极的暴露部分的表面，所述抗体或抗原结合片段选择性结合AMACR或AMACR衬底，并且AMACR或AMACR衬底一旦结合，是通过测量工作电极和对电极之间流动的电流而能检测的。

12.如权利要求11所述的传感器，其中所述工作电极和对电极包括金属化膜。

13.如权利要求12所述的传感器，其中所述工作电极和对电极独立地包括金、铂、钯、银、碳、其合金及其复合物。

14.如权利要求11所述的传感器，通过将所述膜溅射或涂敷到所述表面上而将所述金属化膜设在所述衬底的表面上，并且其中所述工作电极和对电极利用激光消融来形成以限定所述工作电极和所述对电极的尺寸。

15.如权利要求11所述的传感器，还包括在衬底的表面上的基准电极，所述介电物覆盖所述基准电极的一部分。

16.如权利要求11所述的传感器，受体包括抗体或生物素化抗体。

17.如权利要求11所述的传感器，通过交联或生物素化表面并将受体结合到交联或生物素化的表面来将受体官能化到工作电极的表面。

18.如权利要求7所述的传感器，其中所述工作电极的表面用二硫醇双(丙酸琥珀酰亚胺酯)(DSP)交联。

19.如权利要求11所述的传感器，还包括覆盖工作电极的暴露部分的开口区域的阻滞剂。

20.如权利要求11所述的传感器，其中所述阻滞剂包括DTT(二硫苏糖醇)或酪蛋白。