WO2015186870A1 - 신호전달경로의 활성화 상태 분석방법 및 이를 이용한 개인 맞춤형 치료제의 선정방법 - Google Patents

신호전달경로의 활성화 상태 분석방법 및 이를 이용한 개인 맞춤형 치료제의 선정방법 Download PDF

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이홍원
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Definitions

  • the present invention provides a method for analyzing the activation state of a singal ing pathway in a cell or tissue isolated from a subj ect through real-time monomolecular protein-protein interaction analysis, and a personalized therapeutic agent using the same. To select or predict therapeutic responsiveness to a therapeutic agent.
  • the fluorescence resonance energy transfer (FRET) method uses fluorescence transfer as an adjacent part.
  • FRET fluorescence resonance energy transfer
  • the present inventors have provided a method for analyzing the activation state of a signal transduction pathway in a cell or tissue based on an analytical method capable of simultaneously analyzing protein-protein interactions between a target protein and another protein on a signal transduction pathway in real time.
  • an object of the present invention is to provide a method for analyzing the activation state of a signaling pathway in a cell or tissue isolated from an individual.
  • Another object of the present invention is to provide a method for selecting a personalized therapeutic agent.
  • Another object of the present invention is to provide a method for predicting the therapeutic responsiveness to a therapeutic agent.
  • the present invention provides a method for analyzing the activation state of a s ignal ing pathway in a cell or tissue isolated from a subject (subj ect) comprising the following steps:
  • the inventors of the present invention provide a method for analyzing the activation state of a signal transduction pathway in a cell or tissue based on an analysis method capable of simultaneously analyzing protein-protein interactions between a target protein and another protein on a signal transduction pathway in real time and a personalized therapeutic agent using the same Developed a selection method.
  • step (a) a lysate of cells or tissues containing a first protein, which is a protein on a signal transduction pathway to be analyzed, is treated on a substrate to fix the first protein to the substrate.
  • the immobilization of the first protein can be achieved by immobilizing the first protein on an anti-first protein antibody previously immobilized on a substrate.
  • the epitope of the first protein which is the site to which the antibody binds, is preferably separated by a predetermined distance from the binding site of the first protein and the second protein.
  • the substrate is a quartz slide coated with a polyethylene glycol (Quartz Sl ide).
  • the cells or tissues comprising the first protein may be normal cells or normal tissues, or cells or tissues in which a specific disease develops.
  • the lysate of the cells or tissue is a lysate of cancer cells or cancer tissue.
  • the present invention provides an analysis using a cell or tissue lysate obtained by lysing cancer cells or cancer tissues isolated from an individual (eg, a cancer patient) without a complicated pretreatment process. Can reduce the cost.
  • the cell lysate may mean not only the cell stock, but also the diluted cytoplasm stock or the diluted stock.
  • physical, chemical and enzymatic methods can be used without limitation.
  • a washing procedure is performed before the step (b) to remove the first protein that is not immobilized on the substrate. Washing can be performed using conventional wash buffers (eg, PBS).
  • wash buffers eg, PBS
  • the first protein is a membrane protein.
  • the membrane protein is a receptor.
  • the present invention can determine which signaling pathway is activated by analyzing the interaction between the receptor, which is the starting point of the signaling pathway, and various types of proteins interacting with the receptor.
  • receptors examples include receptor tyrosine kinases, toll-like receptors and G protein-coupled receptors.
  • the tyrosine kinase receptor is EGFR (Epidermal growth factor receptor, HERD, HER2 (Human epidermal growth factor receptor 2), HER3 (Human e idermal growth factor receptor 3), HER4 (Human e idermal) growth factor receptor 4) and HGFR (Hepatocyte growth factor receptor, c-MET).
  • EGFR Epidermal growth factor receptor
  • HER2 Human epidermal growth factor receptor 2
  • HER3 Human e idermal growth factor receptor 3
  • HER4 Human e idermal growth factor receptor 4
  • HGFR Hepatocyte growth factor receptor, c-MET
  • the second protein to be described later may be selected from the group consisting of p85a, STAT3, Grb2 and PLCy.
  • the first protein is EGFR
  • the second protein may be selected from the group consisting of p85a, STAT3, Grb2 and PLCy
  • the first protein is HER2 or HGFR
  • the second protein may be p85a, Grb2 and It may be selected from the group consisting of PLCy
  • the second protein may be ⁇ 85 ⁇ when the first protein is HER3.
  • step (b) inducing complex formation between the first protein and the fluorescently labeled second protein in step (b), by supplying a fluorescently labeled second protein to the substrate as a protein interacting with the first protein, Induces complex formation between labeled second proteins.
  • the second protein is a protein located downstream of the first protein.
  • the second protein may be supplied to the substrate in the form of lysate of cells.
  • a cell lysate obtained by lysing a cell expressing a second protein, which is a protein located below the first protein in a fluorescently labeled form can be supplied to the substrate.
  • the cells may be genetically engineered to express the fluorescently labeled second protein in the cells.
  • a recombinant vector is prepared by inserting a full length 0RF of a second protein or a polynucleotide encoding a partial domain into a vector encoding a fluorescent gene, and then transfecting a suitable host cell (eg, a mammalian cell) with the recombinant vector. Conversion is made to express the fluorescently labeled second protein.
  • a suitable host cell eg, a mammalian cell
  • Transformation methods include electroporation, plasma fusion, calcium phosphate (CaP0 4 ) precipitation, calcium chloride (CaCl 2 ) precipitation, agitation with silicon carbide fibers, agro bacterial mediated transformation, PEG, textlan sulfate, Lipofectamine and a dry / inhibitory mediated transformation method and the like.
  • the second protein may be fluorescently labeled by physicochemical methods.
  • Fluorescent labels usable in the present invention include, for example, green fluorescent protein (GFP), yellow fluorescent protein (YFP), blue fluorescent protein (BFP) and green fluorescent protein. and cyan fluorescent protein.
  • GFP green fluorescent protein
  • YFP yellow fluorescent protein
  • BFP blue fluorescent protein
  • cyan fluorescent protein cyan fluorescent protein.
  • the interaction between the first protein and the second protein can be analyzed in the same environment as the cellular environment by detecting the fluorescence signal in a specific wavelength band labeled with the second protein. Since the first protein and the second protein are proteins that interact with each other and are adjacent to each other on the signaling pathway, It is possible to analyze the activation state of the signal transduction pathways in the body.
  • step (c) the fluorescent signal of the fluorescent label of the second protein is analyzed and the
  • the interaction between the first protein and the second protein is analyzed, and the activation state of the signaling pathway is analyzed through the analysis results.
  • Analysis of the interaction between the first protein and the second protein can be carried out by measuring the fluorescence signal of a specific wavelength generated by the fluorescent label provided in the second protein using an optical device for generating a near field.
  • an optical device for generating a near field such as a total reflection microscope, and the interaction between the first protein and the fluorescently labeled second protein on the surface of the substrate is analyzed at a single molecule level. As a result, the interaction between the first protein and the second protein can be confirmed.
  • the analysis of the interaction between the first protein and the second protein is carried out using a total reflection microscope (Tot al Interna l Ref l ec i on F l uorescence Mi croscope).
  • the analysis of can be performed in real time at the step of forming a complex between the first protein and the second protein.
  • a method for analyzing real-time monomolecular protein-protein interactions used in the present invention, which combines immunoprecipitation and fluorescence imaging
  • the monomolecular imaging of cells or tissue lysates that are not purified as such is differentiated from conventional immunoprecipitation in that it is performed in a reaction chamber in real time, and binding can be confirmed in real time at the monomolecular level.
  • the analysis of the fluorescence signal may measure the fluorescence signal of a specific wavelength indicated by the fluorescent label for a specific time. That is, when measuring the wavelength change on the surface of the substrate through a total reflection microscope, the wavelength change may be integrally measured for a predetermined time.
  • the present invention may use not only one kind of protein interacting with the first protein but also various kinds of proteins interacting with the first protein as in Experimental Example 3 below.
  • various types of second proteins may be supplied to the substrate simultaneously or sequentially.
  • the second protein is sequentially supplied to the substrate, first, after the analysis of the interaction between the supplied second protein and the first protein is completed, the second protein that has been analyzed is removed through a washing process, and then the other protein is removed. 2 can be carried out through the process of supplying the protein to the substrate.
  • the method of the present invention in the case of sequentially supplying a plurality of second proteins to the substrate, after step (c), through step (b) and (c) (D) repeating steps (b) and (c) using the second protein analyzed for the interaction and another type of protein (interacting with the first protein) as the second protein.
  • the washing process is performed to remove the first second protein, and then another type of second protein is supplied to the substrate to You can further analyze the interaction of.
  • the process of immobilizing the first protein on the substrate is performed only once, and then the interaction with various types of second proteins can be analyzed. Analysis is possible, which is not much available for human tissue,
  • the present invention can perform steps (a) to (c) using various kinds of first proteins and various kinds of second proteins.
  • the present invention is directed to a plurality of types of second proteins (candidate proteins) that are immobilized on a substrate and then interact with them (e.g., beneath the first protein).
  • the treatment can analyze the interaction between the first protein and the second protein. For example, after immobilizing various types of first proteins on a substrate on which various kinds of antibodies are attached to the substrate, the interaction between the proteins is fluoresced by using the first proteins as the X axis and the second proteins as the Y axis. Analyze by signal.
  • the microfluidic channel is formed by aligning the number of the first proteins with parallel lines so that the number of the first proteins is fixed to the substrate using antibodies.
  • the vertical lines try to form channels by the number of second proteins.
  • a dilution structure can be used, and a second microfluidic channel can be stacked on top of the first channel to be used as cross reactions. Alternatively, it may be applied after mounting of the second channel to enable attachment and detachment of the first channel.
  • FIG. 9 is a schematic diagram of the interaction analysis method
  • FIG. 10 is a fluorescence signal analyzing the interaction between the first protein and the second protein, and the red signal shows the binding between the most activated proteins.
  • the invention provides a method of selecting a personalized therapeutic agent comprising the following steps:
  • step (b) searching for a therapeutic agent that targets the activated signaling pathway identified in step (a), and selecting the personalized therapeutic agent for the searched therapeutic agent.
  • Step (a) is omitted because it is duplicated by using a method of analyzing the activation state of a signaling pathway in a cell or tissue isolated from the above-described individual.
  • step (b) the therapeutic agent that targets the activated signaling pathway is searched based on the analysis result of step (a). For example, a method of analyzing the activation state of a signaling pathway in a cell or tissue isolated from the above-described individual is performed using various first proteins and various second proteins, and then separated from the individual. Specific signaling pathways activated in cells or tissues, after confirming the binding between specific proteins, can search for a therapeutic agent that targets it and select it as a personalized therapeutic agent.
  • a personalized therapeutic agent is selected from known therapeutic agents known to target the activated signaling pathway identified in step ( a ), or After treating the test substance to the cell line or tissue in which the signaling pathway identified in step (a) is activated, whether the test substance inhibits the activation of the signaling pathway, and the candidate drug is grown in the cell line or tissue. Through the screening process to determine whether or not to inhibit the personalized treatment can be selected.
  • the test substance low molecular weight compounds, high molecular weight compounds, nucleic acid molecules (eg, DNA, RNA, PNA and aptamers), proteins, sugars, lipids and natural substances can be used.
  • the therapeutic agent is an anticancer agent.
  • the present invention provides a method for predicting treatment response to a therapeutic agent comprising the following steps:
  • step (b) predicting treatment response to a therapeutic agent targeted to the signaling pathway, based on the analysis of the activation state of the signaling pathway identified in step (a).
  • step (a) the cells or tissues are separated from the predicted human, and then the activation state of the signaling pathway in the isolated cells or tissues is analyzed. Since the method of analyzing the activation state of the signal transmission path in step (a) has been described above, it will be omitted.
  • treatment with an anticancer agent targeting a specific signaling pathway eg, the EGFR pathway, the HER2 pathway, etc.
  • a specific signaling pathway eg, the EGFR pathway, the HER2 pathway, etc.
  • the signaling pathway targeted by the anticancer agent is inactivated or the activation degree is low, there is a problem that it is difficult to obtain a therapeutic effect on the anticancer agent. Therefore, it is important to predict the treatment response to the anticancer agent before administration of the anticancer agent, and to select an appropriate treatment and drug according to the anticancer agent.
  • the method of the present invention can predict the treatment response to the anticancer agent in advance.
  • step (b) based on the analysis of the activation state of the signaling pathway, the treatment response to the therapeutic agent targeting the signaling pathway is predicted.
  • Experimental Example 6 there was a difference in the degree of activation of the signaling pathways for each cancer cell line, it was confirmed that there is also a difference in sensitivity to the anticancer agent targeting the signaling pathway.
  • the therapeutic response of the individual to the target anticancer agent targeting the signaling pathway can be predicted in advance based on the activation information of the signaling pathway analyzed according to the method of the present invention.
  • the therapeutic agent is an anticancer agent, and for the purposes of the present invention, the anticancer agent is a target anticancer agent that targets a specific signaling pathway.
  • the present invention provides a method for analyzing the activation state of the ignal ing pathway in a cell or tissue isolated from a subject, and selects a personalized therapeutic agent or predicts treatment response to the therapeutic agent. It is about how to.
  • the method of the present invention is a novel method for personalized diagnosis and medical treatment, which enables analysis of what changes the targeted therapeutic agent will make in the signaling pathway and how it will respond to the patient.
  • the present invention not only helps to understand the signaling pathway as a whole by analyzing how the signaling of a specific disease diverges and converges, but also develops a customized therapeutic agent by confirming which signal transmission of the entire signaling network is distorted. Available as a flat for the.
  • the resistance of cancer tissue to a target anticancer agent is a problem, but according to this platform, it is expected that the recurrence of cancer can be greatly reduced by detecting the resistance in advance and designing a second therapeutic agent accordingly.
  • FIG. 1 shows a schematic diagram of an experiment used in the following experimental example.
  • FIG. 2 shows a structural diagram of an observation system used in the following example.
  • Figure 3 shows the results for the observation and quantification of single molecule fluorescent molecules.
  • Figure 4 shows the fluorescence signal intensity according to the exchange of EGFR and its sub-proteins and detection proteins.
  • 5 shows the fluorescence signal intensity of activated and inactivated EGFR.
  • FIG. 6 shows the degree of interaction between EGFR and ⁇ 85 ⁇ in 12 lung cancer cell lines.
  • Figure 7 shows the interaction between EGFR and its subproteins in each cell line Show the relative strength of the degree.
  • FIG. 10 shows a fluorescence signal of a signal transmission path measured by the method of FIG. 9. '
  • 11 shows the relative intensity of HER2 and its subproteins, and the degree of interaction between HER3 and its subproteins in each breast cancer cell line.
  • 12 shows the relative intensity of the degree of interaction between HGFR (c-MET) and its subproteins in each lung cancer cell line.
  • 13A shows the relative intensity of the degree of interaction between EGFR and its subproteins, HGFR and its subproteins, and HER2 and its subproteins in each cell line.
  • Figure 13b shows the response to Gef i t ini b, an EGFR target anticancer agent of each cell line.
  • FIG. 13C shows the degree of interaction of EGFR with Grb2 shown in FIG. 13A and the sensitivity of the target anticancer agent of each cell line measured in FIG. 13B.
  • Cell lysis buffer (Lys is buf fer) was prepared by dissolving 150 mM NaCl, 1 mM EDTA and l% (vo l / vol) Triton X-100 in distilled water. A 2-fold concentrated thrust buffer was prepared and stored in 4 ° C. storage. Cel l extract The cell lysis buffer was ammonia at the final concentration described previously using a two-fold concentrated buffer. At this time, protease inhibitors (Sigma P8340, Sigma) and dephosphorase inhibitors (P5726, Sigma) are added to inhibit the function of protease and dephosphorylation enzyme present in the cell lysate. It was.
  • Each inhibitor per 5 mg / ml of cell lysate was diluted to a concentration of 1: 100.
  • the amount of lysate was determined so that the final concentration of cell line lysate or tissue lysate was 5-10 mg / i.
  • Usually 5 x 10 6 cells . 6-10 when dissolved in 200 ⁇ cell lysis buffer When a total amount of protein is made and 20 mg of human lung tissue is dissolved in 1 cell lysis buffer, a total protein concentration of 10—13 mg / m ⁇ is formed.
  • Example 2 Preparation of Target Protein (First Protein)
  • the target protein means a protein that is a target for analyzing (identifying) properties through the present invention.
  • one of the oncoproteins (EGFR, HER2, HER3 or HGFR) was used as the target protein.
  • the cell line black was directly extracted from the patient's tissue sample.
  • the appropriate amount of the lysis buffer prepared in Example 1 was added to the cell line, and the process of homogeneously releasing the aggregated cell lines was repeated using a 100-200 ⁇ pipette. All reactions were carried out in cold blocks on ice. Thereafter, the prepared sample was dissolved in ice for 30 minutes.
  • the tissue was cut finely using surgical scissors to increase the cross-sectional area between the tissue and the lysis buffer so that cell lysis can easily occur.
  • An appropriate amount of lysis buffer was added thereto and homogenized using 1 pipette.
  • the tissue was then finely chopped using a homogenizer (mechanical homogenizer; IKA, cat. No. 3737000). After 30 minutes of reaction, centrifugation was performed at 10,000 g X 10 minutes at 4 ° C. The pellet was removed and only the solution portion (supernatant) was taken. This solution portion contains the target protein and other proteins to be observed. Afterwards, the solution is kept on ice for all the experiments, It could be stored in a stable state.
  • DC protein assay kit Bio-Rad, # 500-0111
  • the total protein content of lysates of cells or tissues prepared using the black protein quantification kit was measured.
  • the detection protein was a partner protein that interacts with the target protein as a fluorescent protein labeled protein. Plasmids were prepared in the form of eGFP-detecting proteins by placing the entire detection protein (full length 0RF) or a specific domain in an eGFP vector (pEGFP-Cl vector, Clontech) with good fluorescence properties. It was injected into HEK293 cells by the electroporation method to express the detection protein, and the cells were obtained and then stored at -80 ° C. Preparation of the detection protein was performed in the same manner as the preparation of the target protein of Example 2.
  • the amount of the detected protein was measured by measuring the amount of the fluorescent protein expressed using a fluorescence intensity meter (FlLiorotneter; Perkin Elmer Ens ire 2300) to measure the amount of the detected protein.
  • Fluorescence intensity meter Fluorescence intensity meter
  • Example 4 Target Protein I (obi 1 ization) Observation was performed using a Total Internal Reflection Fluorescence Microscope (TIRFM).
  • TIRFM Total Internal Reflection Fluorescence Microscope
  • a polymer (PolyEthylene Glycol (PEG)) coating and a biotin-PEG coating for capturing were applied onto a substrate made of quartz slide.
  • the chambers made on the substrates were washed twice consecutively with 200 ⁇ PBS for washing, and neutravidin was injected into the chambers at 50 ⁇ for each chamber.
  • This neutravidin protein binds to and adheres to biotin on the substrate surface.
  • the washing was performed in the same manner as described above.
  • Antibodies to the target protein EGFR Ab-10, clone 111.6 biotin-labeled mouse monoclonal antibody for EGFP; Thermo Scientific, # MS-378—B
  • the lysate (cell or tissue lysate) containing the target protein was then injected into the substrate (concentration range: 0.1 mg / m £ -10 mg / mi; reaction time: at least 10 to 30 minutes). Then, two consecutive times using 200 id PBS Washed (FIG. 1).
  • Example 5 Probe protein inject ion & detect ion
  • the cell lysate containing the fluorescently labeled detection protein was injected into the substrate to which the target protein of Example 4 was fixed at an appropriate concentration.
  • 50 nM eGFP is the limit value for normal observation. This may change depending on the observation optics and substrate type (last step in FIG. 1).
  • the substrate was observed using a total reflection fluorescence microscope.
  • a signal occurring in a short time was measured using an exposure time of 50 ms.
  • 2 is a structural diagram of an observation system including a substrate, a microscope, and an analysis program.
  • the substrate to which the detection protein was injected was recorded in real time for about 5 seconds (100 frames wi th 0.05 sec exposure t ime) using a fluorescence microscope.
  • the monomolecular fluorescence protein observation algorithm was used to observe how many detection proteins bound to the target protein on the surface in a particular frame. Usually one to three images are averaged to produce an image, and the image is analyzed to measure the number of monomolecular signals.
  • the process of determining the number of frames first analyzes how the kinetic constant (kinet i cs) of the two protein interactions is analyzed through real-time monomolecular protein interaction analysis (first panel of FIG. 3). By weighing how long the two proteins are bound together and then dropping, you determine the frame number to average.
  • 5 frames 250 ms was measured as the most suitable average number of frames (second panel of FIG. 3), and frames were skipped in units of 25 frames.
  • 1-5 frame average, 25-29 frame average, 50-54 frame average, 75-79 frame average, and a total of four data points were formed.
  • the present invention has the advantage of being able to simply apply various detection proteins (second proteins) on one prepared substrate. Since proteins such as EGFR have a variety of downstream signaling pathways, measuring multiple signaling pathways will play an important role in identifying biological information. Furthermore, since the preparation of the target protein only needs to be performed once, a small amount of cell or tissue lysate can be used.
  • the detection protein exchange process is described as follows. After the detection of one detection protein, the remaining protein was removed from the chamber through a washing process, and then the previous measurement was repeated by injecting another detection protein.
  • EGFR epidermal growth factor receptor
  • EGFR Epidermal Growth Factor Receptor
  • the prepared sample is known as a lung cancer cell line expressing normal EGFR with a cell line called NCI-H1666.
  • EGFR activates EGFR by a ligand called EGF, which interacts with downstream signaling proteins.
  • EGF a ligand
  • eGFP-p85 a form with eGFP attached to ⁇ 85 ⁇ , a subunit of Phosphoinos iti de 3-kinase (PI3K), a representative subsignal protein of EGFR, was used as a detection protein.
  • PI3K Phosphoinos iti de 3-kinase
  • the cells stop the growth activity, and EGFR is known to exist in an unphosphorylated state. Thereafter, one group of cells was treated with EGF 100 ng / mi for 3 minutes. It is an external factor that gives EGFR and an activation signal, making EGFR phosphorylated. After collecting two groups of cell lines, the state of EGFR was observed.
  • NSCUXNon Small Cell Lung Cancer cell lines H1975, H1650, HCC827, H4006, H358, H1666, H2291 and A549 were obtained from American Type Culture Collection; HCC827-GR, H4006-ER, PC9 and PC9-GR are Yonsei University EGFR status (obtained from school hospital) was quantified using eGFP-p85a detection protein.
  • EGFR is known to be present in always activated form through axon 19 deletion mutation or exon 21 point mutation (L858R), causing cancer.
  • H1975, H1650, HCC827, HCC827-GR, H4006, H4006-ER, PC9 and PC9-GR are cancer cell lines with EGFR mutations, and the remaining four cell lines are cancer cell lines with normal EGFR. .
  • the reactivity between EGFR and p85a was measured as described above to quantify the state of EGFR in each cell line. Representatively, the reactivity of the H4006 (exxon 19 deletion) and H1975 (exon 21 mutants) and H229K normal EGFR) cell lines was measured and graphed. As a result, as shown in the top panel of Figure 6, it was confirmed that the activation degree of EGFR is higher in the other two cell lines with mutated EGFR than the H2291 cell line with normal EGFR. In addition, the difference was found between H4006 and H1975. A total of 12 NSCLC cancer cell lines measured the degree of activation of EGFR and expressed it as a heatmap. As a result, as shown in the lower panel of Figure 6, the signal generated in the H1975 cell line was quantified by 1 to obtain a graph showing the signal strength of the remaining cell lines as a relative value.
  • the present invention can measure the intensity of the interaction between EGFR, a kind of RTK, and ⁇ 85 ⁇ , a sub-protein thereof.
  • the present invention can be applied to various RTKs in addition to EGFR to measure the signal of the target protein occurring in each cell line and the degree of interaction between the target protein and the detection protein.
  • Experimental Example 3 Analysis of EGFR activation level of non-small cell lung cancer cell lines using four EGFR subproteins
  • Experimental Example 2 The signal strength quantified in Experimental Example 2 was extended to analyze the relative signal strength of EGFR using a plurality of detection proteins. As a result, as shown in Figure 7, through this it was confirmed how the various signaling pathways started in EGFR changes in each cell line and what the difference between each cell line. These results show that the present invention can be used to help select anticancer agents that target specific signaling pathways. Similarly, the relative signal values of each cell line were measured based on the H1975 cell line. Experimental Example 4. Characterization of Human Tumor Tissue
  • HER2 / HER3 a total of 10 breast cancer cell lines (S BR3, T47D, MDAMB231, MDAMB453, H1419, H1954, and MCF7 were obtained from the American Type Culture Collection; SKBR3 LR9, SKBR3 HR30 and SNU21 were obtained from Seoul University Hospital) The degree of HER2 and HER3 activation was measured and expressed as a heatmap (FIG. 11). 11 is a result of measuring the signal strength of the remaining cell lines as a relative value after quantifying the signal measured in the SKBR3 cell line with 1.
  • HGFR a total of 15 NSCLC cancer cell lines (HCC827, H4006, H1650,
  • H1975, H358, H1666, H2291 and A549 are obtained from the American Type Culture Collection; PC9, HCC827-GR # 13, H4006-ER, YU-01, YU— 06, HCC827-GR # 5 and PC9-GR were obtained from Yonsei University Hospital) and the HCC827 cell line was set to 1 as well. After quantification, the signal intensities of the remaining cell lines are shown as relative values (FIG. 12).
  • FIGS. 11 and 12 show that the present invention is not limited to a specific RTK, and can be applied to all receptors including RTK.
  • Experimental Example 6 Analysis of Protein-Protein Interaction (PPI) and Drug Responses A total of 15 NSCLC cancer cell lines were applied to this technique.
  • FIG. 13C Correlation between protein-protein interacting ion (PPI) and Gef itinib, an EGFR target anticancer drug, was analyzed.
  • the interaction degree (signal strength) of EGFR with Grb2 shown in FIG. 13A and the sensitivity of the target anticancer agent of each cell line measured in FIG. 13B are summarized in FIG. 13C.
  • the horizontal axis of Figure 13c means that the signal transmission of EGFR increases toward the right side, the vertical axis means that the sensitivity to the target anticancer agent increases toward the top. 13C shows that the measured signal transduction intensity of EGFR has a positive correlation with susceptibility to the target anticancer agent (pos it ive corre l at i on).

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Abstract

본 발명은 실시간 단분자 단백질-단백질 상호작용 분석을 통하여 개체(subject)로부터 분리된 세포 또는 조직 내의 신호전달경로(signaling pathway)의 활성화 상태를 분석하는 방법 및 이를 이용하여 개인 맞춤형 치료제를 선정하거나 치료제에 대한 치료 반응성을 예측하는 방법에 관한 것이다.

Description

【명세서】
【발명의 명칭】
신호전달경로의 활성화 상태 분석방법 및 이를 이용한 개인 맞춤형 치료제의 선정방법
【기술 분야】
본 발명은 실시간 단분자 단백질-단백질 상호작용 분석을 통하여 개체 ( subj ect )로부터 분리된 세포 또는 조직 내의 신호전달경로 (s ignal ing pathway)의 활성화 상태를 분석하는 방법 및 이를 이용하여 개인 맞춤형 치료제를 선정하거나 치료제에 대한 치료 반응성을 예측하는 방법에 관한 것이다.
【배경 기술】
최근까지는 질병의 개인에 따른 맞춤형 진단, 예후 예측 및 치료는 주로 유전자 분석 (genomi c prof i l ing)에 집중되어 왔다. 하지만， 암을 비롯한 특정 질병의 발병원인은 신체를 구성하는 세포의 비정상적인 활동， 더욱 자세하게는 세포를 구성하고 조절하는 다양한 단백질간의 비정상적인 상호작용에 의한 것이므로， 유전자 분석을 통한 단백질만의 개별적인 관찰만으로는 이해하기 어려운 문제가 있다. 실제로 이러한 유전자 돌연변이의 프로파일링을 통해 동일한 유전적 성질을 지닌 환자들에 대해서도 표적 항암제에 대한 감수성이 다르고, 예후 역시 다양하게 나타나는 것으로 나타난다. 단백질ᅳ단백질 상호작용의 정확한 분석은 세포 내 신호전달 네트워크 (s ignal ing network)가 어떻게 변화하는 지를 이해할 수 있도특 할 뿐 아니라， 특정 암의 진행과 특성 및 그 치료방법에 대한 정보까지도 제공할 수 있을 것이다.
최근 개인별 유전자 프로파일링을 도입하여 개개 환자의 특성을 고려한 맞춤형 진단 및 치료제 연구 (personal i zed medi c ine)가 이루어지고 있다. 하지만 앞서 기술한 바와 같이 질병의 형질을 결정하는 것은 단백질의 상호작용에 의한 세포의 활동이므로 단백질간 반웅으로 인한 네트워킹을 관찰하는 것이 필요하다. 단지 유전자 수준에서 관찰하는 것은 개개의 단백질을 분석하는 단편적인 접근에서 이루어지는 것으로， 생명현상의 이해를 위해서는 분자 및 상호작용 네트워크 수준에서의 신호전달을 폭넓게 이해하는 것이 요구된다. 예를 들어, 동일한 유전적 돌연변이 (genet i c mutat i on)를 가지고 있는 환자라고 하더라도 동일 표적 치료제에 대하여 다른 반웅을 보여줄 수 있다. 이것은 세포 신호전달이 단백질 상호작용의 복합적인 읽힘으로 나타나기에 , 같은 종양 단백질이 발현하더라도 다른 신호전달을 유도할 수 있기 때문이다.
결국 정확한 단백질-단백질 상호작용의 분석은 질병의 이해를 통한 질병의 진단， 예후 평가 및 치료제 개발을 위한 증요한 기초가 될 것이다. 종래에 단백질의 상호작용을 확인할 수 있는 방법으로는 X-ray 결정법 (crystal lography) 등을 이용하여 원자 수준에서 상호작용에 관련된 아미노산 잔기 또는 원자를 규명하는 방법， Yeast two-hybr id 시스템 등을 이용하여 두 단백질간의 이성분 상호작용 (binary interact ion)을 확인하는 방법, 면역침전 및 질량 분석을 통한 복합체 상호작용 (compl ex interact ion)을 파악하는 방법을 통하여 활성올 측정하고 상호작용을 이해하는 방법이 사용되어 왔으며, 이러한 인 비트로 방법 외에도 세포 내 ( in cel l ) 분석방법인 형광공명에너지전이 (FRET, Fl uorescence Resonance Energy Transfer ) 방법과 이분자형광 상보법 (BiFC , Bimo lecul ar Fluorescence Comp lementat ion) °l 사용되고 있다.
하지만, 크로마토그래프의 경우 단백질을 정제한 후 분석하기 때문에 다른 단백질 등이 흔재되어 있는 실제 세포 환경 내에서 단백질 간의 상호작용을 단일분자 수준에서 확인하기 어려우며， Yeast two-hybr id 시스템의 경우에는 세포의 하이브리드 단백질의 발현에 따른 전사활성의 영향에 따라 분석의 정확도가 달라질 수 있다는 점， 형광공명에너지전이 (FRET) 방법은 인접한 부분으로 형광전이를 이용하는 방법으로 형광전이가 일어난 경우에만 단백질간의 결합이 신뢰성을 가진다는 점에서 성공률이 낮다는 단점이 있다. 특히， 단백질의 결합이 짧은 시간에 약한 결합으로 일어난 경우 상기의 방법들만으로는 정확하게 측정할 수 없다는 단점이 지속적으로 제기되고 있다.
따라서, 단백질간의 상호작용을 정확히 분석하고， 나아가 복잡한 환경에서 질병의 경로를 예측함으로써 맞춤형 표적 치료제를 찾아내고 스크리닝 할 수 있는 새로운 방법이 요구되고 있다. 본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.
【발명의 내용】
【해결하려는 과제】
이러한 배경 하에서， 본 발명자들은 신호전달경로 상의 표적 단백질과 다른 단백질간의 단백질-단백질 상호작용올 동시에 실시간으로 분석할 수 있는 분석방법을 기반으로 하는 세포 또는 조직 내의 신호전달경로의 활성화 상태 분석방법 및 이를 이용한 개인 맞춤형 치료제의 선정 방법을 개발하였다.
따라서， 본 발명의 목적은 개체로부터 분리된 세포 또는 조직 내의 신호전달경로의 활성화 상태 분석방법을 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목작은 개인 맞춤형 치료제의 선정 방법을 제공하는 데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 치료제에 대한 치료 반응성을 예측하는 방법을 제공하는 데 있다. 본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명， 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다 .
【과제의 해결 수단】
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 다음의 단계를 포함하는 개체 (subj ect )로부터 분리된 세포 또는 조직 내의 신호전달경로 ( s ignal ing pathway)의 활성화 상태 분석방법을 제공한다:
(a) 상기 개체로부터 분리된 것으로서， 상기 신호전달경로 상의 단백질인 제 1 단백질을 포함하는 세포 또는 조직의 용해액 (extract )을 기판에 처리하여 상기 제 1 단백질을 기판에 고정시키는 단계;
(b) 상기 제 1 단백질과 상호작용하는 단백질로서 형광 표지 처리된 제 2 단백질을 상기 기판에 공급하여 제 1 단백질과 형광 표지된 제 2 단백질간의 복합체 형성을 유도하는 단계; 및 一
(c) 상기 제 2 단백질의 형광 표지의 형광신호를 분석하여 제 1 단백질과 제 2 단백질간의 상호작용을 분석하고， 분석 결과를 통하여 상기 신호전달경로의 활성화 상태를 분석하는 단계. 본 발명자들은 신호전달경로 상의 표적 단백질과 다른 단백질간의 단백질-단백질 상호작용을 동시에 실시간으로 분석할 수 있는 분석방법을 기반으로 하는 세포 또는 조직 내의 신호전달경로의 활성화 상태 분석방법 및 이를 이용한 개인 맞춤형 치료제의 선정 방법을 개발하였다.
이하， 본 발명을 상세히 설명한다.
(a) 제 1 단백질을 기판에 고정
단계 (a)에서는 분석하고자 하는 신호전달경로 상의 단백질인 제 1 단백질을 포함하는 세포 또는 조직의 용해액 (ext ract )을 기판에 처리하여 상기 게 1 단백질을 기판에 고정시킨다.
본 발명의 일구현예에 따르면， 상기 제 1 단백질의 고정은 기판에 미리 고정되어 있는 항―제 1 단백질 항체에 제 1 단백질을 고정시킴으로써 달성될 수 있다. 이때， 본 발명의 목적상 상기 항체가 결합하는 부위인 제 1 단백질의 에피토프는 제 1 단백질과 제 2 단백질의 결합 부위와 소정 거리만큼 떨어지는 것이 바람직하다.
본 발명의 일구현예에 따르면， 상기 기판은 폴리에틸렌 글리콜 (polyethyl eneglycol ) 코팅 처리된 쿼츠 슬라이드 (Quartz Sl ide)이다. 상기 제 1 단백질을 포함하는 세포 또는 조직은 정상세포 또는 정상조직이거나, 특정 질병이 발병한 세포 또는 조직일 수 있다.
본 발명의 일구현예에 따르면, 상기 세포 또는 조직의 용해액은 암세포 또는 암 조직의 용해액이다. 본 발명은 복잡한 전처리 과정 없이 개체 (예컨대, 암환자)로부터 분리된 암세포 또는 암 조직을 용해 ( lys i s )하여 얻은 세포 또는 조직 용해액을 사용하여 분석을 실시함으로써， 복잡한 전처리 과정으로 인한 시간과 노력을 절감할 수 있다. 상기 세포 용해액은 세포 원액뿐만 아니라, 희석된 세포질 원액 또는 희석된 세포 원액을 의미할 수 있다. 세포 용해를 위해서는 물리적 방법， 화학적 방법 및 효소적 방법 등을 제한 없이 사용할 수 있다.
본 발명의 일구현예에 따르면， 기판 상에 고정되지 않은 제 1 단백질을 제거하기 위하여 단계 (b)의 실시 전에 세척과정을 실시한다. 세척은 통상의 세척 버퍼 (예컨대 , PBS)를 이용하여 실시할 수 있다.
본 발명의 일구현예에 따르면, 상기 제 1 단백질은 막 단백질이다. 본 발명의 일구현예에 따르면， 상기 막 단백질은 수용체 (receptor)이다. 이때， 본 발명은 신호전달경로의 시작점인 수용체와 이 수용체와 상호작용하는 여러 종류의 단백질간의 상호작용을 각각 분석함으로써 어떤 신호전달경로가 활성화되었는지를 파악할 수 있다.
상기 수용체의 예로는， 티로신 인산화효소 수용체 (Receptor tyrosine kinases), 를 -유사 수용체 (Tol 1-1 ike receptor) 및 G 단백질 연결 수용체 (G protein-coupled receptor)가 있다.
본 발명의 일구현예에 따르면, 상기 티로신 인산화효소 수용체는 EGFR (Epidermal growth factor receptor , HERD , HER2 (Human epidermal growth factor receptor 2)， HER3 (Human e idermal growth factor receptor 3)， HER4 (Human e idermal growth factor receptor 4) 및 HGFR (Hepatocyte growth factor receptor , c— MET)으로 구성된 군으로부터 선택된다.
본 발명의 일구현예에 따르면， 상기 제 1 단백질이 티로신 인산화효소 수용체인 경우， 후술할 제 2 단백질은 p85a , STAT3, Grb2 및 PLCy로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다. 예를 들어， 제 1 단백질이 EGFR인 경우， 제 2 단백질은 p85a , STAT3, Grb2 및 PLCy로 구성된 군으로부터 선택될 수 있으며, 제 1 단백질이 HER2 또는 HGFR인 경우， 제 2 단백질은 p85a , Grb2 및 PLCy로 구성된 군으로부터 선택될 수 있고, 제 1 단백질이 HER3인 경우 제 2 단백질은 ρ85α일 수 있다.
(b) 제 1 단백질과 형광 표지된 제 2 단백질간의 복합체 형성 유도 단계 (b)에서는 상기 제 1 단백질과 상호작용하는 단백질로서 형광 표지 처리된 제 2 단백질을 상기 기판에 공급하여 제 1 단백질과 형광 표지된 제 2 단백질간의 복합체 형성을 유도한다. 본 발명의 일구현예에 따르면, 상기 제 2 단백질은 제 1 단백질의 하위 (downstream)에 위치하는 단백질아다ᅳ
본 발명의 일구현예에 따르면， 상기 제 2 단백질은 세포의 용해액에 담긴 형태로 기판에 공급될 수 있다. 예를 들어， 제 1 단백질의 하위에 위치하는 단백질인 제 2 단백질을 형광 표지된 형태로 발현하는 세포를 용해하여 얻은 세포 용해액을 상기 기판에 공급할 수 있다. 형광 표지된 제 2 단백질을 포함하는 세포 용해액을 얻기 위하여 세포를 유전자 조작하여 형광 표지된 제 2 단백질을 세포에서 발현시킬 수 있다. 예를 들어， 형광 유전자를 코딩하는 백터에 제 2 단백질의 전장 0RF 혹은 일부 도메인을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 넣어 재조합 백터를 제작한 후， 이 재조합 백터로 적당한 숙주세포 (예컨대， 포유동물세포)를 형질전환 하여 형광 표지된 제 2 단백질을 발현시킨다. 형질전환 방법으로는 전기천공법법 (electroporation), 원형질 융합， 인산 칼슴 (CaP04) 침전， 염화 칼슘 (CaCl2) 침전, 실리콘 카바이드 섬유 이용한 교반, 아그로 박테리아 매개된 형질전환， PEG, 텍스트란 설페이트， 리포펙타민 및 건조 /억제 매개된 형질전환 방법 등을 이용할 수 있다. 다른 예에서， 물리 화학적인 방법을 통하여 상기 제 2 단백질을 형광 표지할 수 있다.
본 발명에서 이용 가능한 형광 표지로는， 예를 들어， 녹색 형광 단백질 (green fluorescent protein, GFP) , 노랑 형광 단백질 (yelloe fluorescent protein, YFP) , 파랑 형광 단백질 (Blue fluorescent protein, BFP) 및 녹색 형광 단백질 (cyan fluorescent protein) 등을 들 수 있다. 본 발명에 따르면， 게 1 단백질이 부착된 기판의 표면에 제 2 단백질이 포함되어 있는 세포 용해액이 공급되면， 기판 표면의 제 1 단백질은 제 2 단백질 및 세포 내의 다른 단백질들이 함께 공존하는 세포 내 환경과 동일한 환경에서 제 2 단백질과 상호작용을 하게 된다. 이는 본 발명에 따른 분석방법이 세포 내 환경과 동일한 조건에서 단백질 상호작용을 관찰할 수 있음을 의미한다. 즉， 제 2 단백질에 표지된 특정 파장 대역에서의 형광 신호의 검출을 통하여 제 1 단백질과 제 2 단백질간의 상호작용을 세포 환경과 동일한 환경에서 분석할 수 있는 것이다. 상기 제 1 단백질과 제 2 단백질은 서로 상호작용하는 단백질로서 신호전달경로 상의 인접한 단백질이기 때문에 본 발명을 통하여 실제 세포 내의 신호전달경로의 활성화 상태를 분석할 수 있게 된다.
(c) 제 1 단백질과 제 2 단백질간의 상호작용을 분석하여 신호전달경로의 활성화 상태를 분석
단계 (c )에서는 제 2 단백질의 형광 표지의 형광신호를 분석하여 제
1 단백질과 제 2 단백질간의 상호작용을 분석하고， 분석 결과를 통하여 상기 신호전달경로의 활성화 상태를 분석한다.
상기 제 1 단백질과 제 2 단백질간의 상호작용의 분석은 제 2 단백질에 구비된 형광 표지에 의해 발생하는 특정 파장의 형광 신호를 근접장을 발생시키는 광학장치를 이용하여 측정하여 실시할 수 있다. 즉， 전반사 현미경 등의 근접장을 발생시키는 광학 장치를 통해 기판의 표면을 관찰하여， 기판 표면의 제 1 단백질과 형광 표지된 제 2 단백질간의 결합과 분리의 빈도 등의 상호작용을 단분자 수준에서 분석함으로써 제 1 단백질과 제 2 단백질간의 상호작용을 확인할 수 있다.
본 발명의 일구현예에 따르면， 상기 제 1 단백질과 제 2 단백질간의 상호작용의 분석은 전반사 현미경 (Tot a l Interna l Ref l ec i on F l uorescence Mi croscope을 이용하여 실시한다. 이때， 형광신호의 분석은 제 1 단백질과 제 2 단백질 사이의 복합체가 형성되는 단계에서 실시간으로 분석할 수 있다. 본 발명에서 사용하는 실시간 단분자 단백질ᅳ단백질 상호작용의 분석방법은， 면역침강법과 형광이미징을 결합한 것으로 정제되지 않는 세포 또는 조직 용해액의 단분자 이미징이 반웅 챔버 내에서 실시간으로 이루어진다는 점에서 통상의 면역침강법과는 차별화되며, 실시간으로 단분자 수준에서 결합을 확인할 수 있다.
본 발명의 일구현예에 따르면, 상기 형광신호의 분석은 상기 형광 표지가 나타내는 특정 파장의 형광신호를 특정 시간 동안 적분 측정할 수 있다. 즉, 전반사 현미경을 통해 기판 표면에서의 파장 변화를 측정하는 경우 파장 변화를 소정의 시간 동안 적분 측정할 수 있다.
본 발명의 방법을 이용하면, 인간을 포함한 개체 ( subj ect )로부터 분리된 세포 또는 조직 내의 신호전달경로 중 어느 경로가 활성화되었는지를 확인 (분석)할 수 있다. 하기 실시예에서는， 암과 밀접한 연관성이 있는 것으로 알려진 EGFR과 이의 하위 단백질인 ρ85 α STAT3 , Grb2 및 PLC Y간의 상호작용을 다양한 암세포주 및 암 환자 유래의 조직을 사용하여 분석하였다. 분석 결과， 세포주마다， 혹은 암 조직과 정상 조직간에 EGFR의 활성화 정도에 차이가 있음이 확인되었다 (실험예 3 및 4 참조) . 나아가， 하기 실시예에서는 EGFR 외의 다른 RTK와 이의 하위 단백질 간의 상호작용을 다양한 암세포주를 대상으로 분석하였다 (실험예 5 및 6 참조) . 이러한 결과는 본 발명의 방법을 적용하여 각 개체로부터 분리된 세포 또는 조직에서 특별히 활성화되어 있는 신호전달경로를 찾을 수 있음을 보여주며, 분석된 신호전달경로의 활성화 상태 정보를 토대로 각 개체의 질환의 예후를 예측하고， 각 개체의 특성에 맞는 치료제 (예컨대, 활성화된 신호전달경로를 타켓으로 하는 항암제)를 선정하는 등, 개인 맞춤형 예후 예측과 치료가 가능함을 보여준다.
본 발명에 따르면, 본 발명은 상기 제 2 단백질로서， 제 1 단백질과 상호작용하는 한 종류의 단백질뿐만 아니라, 하기 실험예 3에서와 같이 제 1 단백질과 상호작용하는 다양한 종류의 단백질을 이용할 수도 있다. 예를 들어， 제 1 단백질과 이의 하위에 위치하는 여러 종류의 단백질 (복수 종류의 제 2 단백질)간의 상호작용을 분석하는 경우에는， 여러 종류의 제 2 단백질을 동시에 또는 순차적으로 기판에 공급할 수 있다. 예를 들어， 제 2 단백질이 순차적으로 기판에 공급되는 경우에는， 먼저 공급된 제 2 단백질과 제 1 단백질간의 상호작용 분석이 끝난 뒤에 세척과정을 통해 분석이 완료된 제 2 단백질올 제거한 다음， 다른 제 2 단백질을 기판에 공급하는 과정을 통하여 실시될 수 있다.
구체적으로, 본 발명의 일구현예에 따르면， 여러 종류의 제 2 단백질을 순차적으로 기판에 공급하는 경우에 본 발명의 방법은， 단계 (c ) 이후에, 단계 (b)와 (c )를 통하여 상호작용을 분석한 제 2 단백질과 다른 종류의 단백질 (제 1 단백질과 상호작용하는)을 제 2 단백질로 사용하여 단계 (b)와 (c)를 반복 실시하는 단계 (d)를 더 포함한다. 이 경우， 먼저의 제 2 단백질과 제 1 단백질간의 상호작용을 분석한 후에는， 세척 과정을 실시하여 먼저의 제 2 단백질을 제거한 후에， 다른 종류의 제 2 단백질을 기판에 공급하여 제 1 단백질과의 상호작용을 추가 분석할 수 있다. 이럴 경우， 제 1 단백질을 기판에 고정하는 과정을 한 번만 수행한 후, 여러 종류의 제 2 단백질과의 상호작용을 분석할 수 있어 소량의 시료를 이용한 분석이 가능하며， 이는 인체 조직의 경우 이용할 수 있는 양이 많지 않고，
PCR과 같은 증폭과정이 단백질에는 존재하지 않음을 고려할 때 매우 유리한 이점이다ᅳ
본 발명은 다양한 종류의 제 1 단백질들과 다양한 종류의 제 2 단백질들을 사용하여 단계 (a) 내지 (c )를 실시할 수 있다. 즉, 본 발명은 다양한 종류의 제 1 단백질들 (표적 단백질)을 기판에 고정한 후 이들과 상호작용하는 (예컨대, 제 1 단백질의 하위에 위치하는) 여러 종류의 제 2 단백질들 (후보 단백질)을 처리하여 제 1 단백질과 제 2 단백질간의 상호작용을 분석할 수 있다. 예를 들어， 기판에 여러 가지 종류의 항체가 부착된 기판에 다양한 종류의 제 1 단백질을 고정시킨 후, 제 1 단백질들을 X축으로 하고 제 2 단백질들을 Y 축으로 하여 단백질들간의 상호작용을 형광신호로 분석한다. 제 1 단백질의 수를 평행선에 맞추어 미세유체 채널을 형성하도록 함으로써 제 1 단백질의 수만큼 기판에 항체를 이용하여 고정시킨다. 수직선은 제 2 단백질의 수만큼 채널을 형성하도톡 한다. 이증층 구조가 사용될 수 있으며, 두 번째 미세유체 채널은 교차 반웅점들로 사용되기 위한 첫 번째 채널의 윗부분에 적층될 수 있다. 또는， 첫 번째 채널의 부착 및 탈착이 가능하도록 두 번째 채널의 장착 후에 적용될 수도 있다. 본 방법에 따르면 독립된 챔버 내에서 독립된 반웅으로 인한 상호작용의 패턴을 분석하는 것이 가능하다. 도 9는 이러한 상호작용 분석방법의 모식도이며, 도 10은 제 1 단백질-제 2 단백질간의 상호반웅을 형광신호로 분석한 것으로서， 붉은색의 신호는 가장 활성화된 단백질들간의 결합을 보여준다. 이러한 본 발명을 통하여 각 환자로부터 채취한 세포 또는 조직 내에서 활성화되어 있는 특정 신호전달경로 (특정 단백질간의 결합)를 확인할 수 있으며， 이를 통하여 환자 개인별 약에 대한 내성을 미리 예측할 수 있으몌 최적의 치료효과를 얻을 수 있는 표적 치료제를 선정함으로써 개인 맞춤형 치료가 가능하다.
또한， 유전자 프로파일링은 세포 신호전달에서 교점 (node)에 초점을 맞추는 반면， 본 발명은 교점을 연결하는 선들에 맞추어져 있다. 하나의 절은 수많은 교점들을 가지게 되고 하나의 상위 단백질은 많은 하위 단백질들과 연결되어 있으며， 하나의 하위 단백질은 수많은 상위 단백질들과 연결되어 있는 것이다. 본 발명은 하나의 상위 단백질이 세포 신호전달경로에서 어떻게 수렴하고 분지하는 지를 전반적으로 관찰할 수 있도록 해준다. 본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 다음의 단계를 포함하는 개인 맞춤형 치료제의 선정 방법을 제공한다:
(a) 상술한 방법을 이용하여 상기 개인으로부터 분리된 세포 또는 조직 내의 신호전달경로의 활성화 상태를 분석하는 단계; 및
(b) 단계 (a)에서 확인된 활성화된 신호전달경로를 타겟으로 하는 치료제를 탐색하고， 탐색된 치료제를 상기 개인의 맞춤형 치료제를 선정하는 단계 .
상기 단계 (a)는 상술한 개체로부터 분리된 세포 또는 조직 내의 신호전달경로의 활성화 상태를 분석하는 방법을 이용하는 것으로서 중복된 내용이므로 생략한다.
단계 (b)에서는 단계 (a)의 분석 결과를 토대로 활성화된 신호전달경로를 타겟으로 하는 치료제를 탐색한다. 예를 들어, 상술한 개체로부터 분리된 세포 또는 조직 내의 신호전달경로의 활성화 상태를 분석하는 방법을 다양한 종류의 제 1 단백질들과 다양한 종류의 제 2 단백질들을 사용하여 실시한 후, 상기 개체로부터 분리한 세포 또는 조직 내에서 활성화되어 있는 특정의 신호전달경로 흑은 특정 단백질간의 결합을 확인한 후， 이를 표적으로 하는 치료제를 탐색하고， 이를 개인 맞춤형 치료제로 선정할 수 있다.
단계 (b)에서 개인 맞춤형 치료제를 선정하는 방법으로는, 예를 들어， 단계 (a)에서 확인된 활성화된 신호전달경로를 타겟으로 하는 것으로 알려져 있는 공지의 치료제 중에서 개인 맞춤형 치료제를 선정하거나, 또는 단계 (a)에서 확인된 신호전달경로가 활성화되어 있는 세포주 혹은 조직에 시험물질을 처리한 후， 상기 시험물질이 상기 신호전달경로의 활성화를 억제하는지 여부， 상기 후보약물이 상기 세포주 혹은 조직의 성장을 억제하는지 여부 등을 확인하는 스크리닝 과정을 통하여 개인 맞춤형 치료제를 선정할 수 있다. 상기 시험물질로는 저분자량 화합물, 고분자량 화합물， 핵산분자 (예컨대， DNA , RNA, PNA 및 앱타머)， 단백질， 당， 지질 및 천연물질 등을 사용할 수 있다. 본 발명의 일구현예에 따르면, 상기 치료제는 항암제이다. 본 발명의 다른 양태에 따르면ᅳ 본 발명은 다음의 단계를 포함하는 치료제에 대한 치료 반웅성을 예측하는 방법을 제공한다:
(a) 상술한 방법을 이용하여 치료제에 대한 치료 반웅성을 예측하고자 하는 인간으로부터 분리된 세포 또는 조직 내의 신호전달경로의 활성화 상태를 분석하는 단계; 및
(b) 단계 (a)에서 확인된 신호전달경로의 활성화 상태 분석정보를 토대로， 상기 신호전달경로를 타겟으로 하는 치료제에 대한 치료 반웅성을 예측하는 단계 .
단계 (a)에서는 예측 대상 인간으로부터 세포 또는 조직을 분리한 후, 분리된 세포 또는 조직 내의 신호전달경로의 활성화 상태를 분석한다. 단계 (a)에서의 신호전달경로의 활성화 상태를 분석하는 방법은 상술하였으므로 생략한다.
예를 들어， 암 치료의 경우에는 특정 신호전달경로 (예컨대， EGFR 경로, HER2 경로 등)를 타겟으로 하는 항암제를 사용한 치료가 빈번히 이루어지고 있는데， 항암제가 타겟하는 신호전달경로의 활성화 정도는 각 개인마다 차이가 있고, 특히 항암제가 타겟하는 신호전달경로가 비활성화되었다거나, 활성화 정도가 낮은 경우에는 상기 항암제에 대한 치료효과를 얻기 어려운 문제가 있다. 이에， .항암제 투여 전에 항암제에 대한 치료 반웅성을 미리 예측하고， 이에 따른 적절한 치료법과 약물을 선정하는 것이 중요한데, 본 발명의 방법을 이용하면 이러한 항암제에 대한 치료 반웅성을 미리 예측할 수 있다.
단계 (b)에서는 신호전달경로의 활성화 상태 분석정보를 토대로, 상기 신호전달경로를 타겟으로 하는 치료제에 대한 치료 반웅성을 예측한다. 하기 실험예 6에서는， 각 암세포주마다 신호전달경로의 활성화 정도에 있어 차이가 있으며, 상기 신호전달경로를 타겟으로 하는 항암제에 대한 감수성 역시 차이가 있음을 확인하였다. 이러한 결과를 통하여， 본 발명의 방법에 따라 분석한 신호전달경로의 활성화 정보를 토대로 상기 신호전달경로를 타겟팅하는 표적항암제에 대한 개체의 치료반응성을 미리 예측할 수 있음을 확인하였다. 본 발명의 일구현예에 따르면， 상기 치료제는 항암제이며, 본 발명의 목적상 상기 항암제는 특정 신호전달경로를 타겟팅하는 표적항암제이다.
【발명의 효과】
본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:
( i ) 본 발명은 개체 (subj ect )로부터 분리된 세포 또는 조직 내의 신호전달경로 (s ignal ing pathway)의 활성화 상태 분석방법 및 이를 이용하여 개인 맞춤형 치료제를 선정하거나 치료제에 대한 치료 반웅성을 예측하는 방법에 관한 것이다.
( ii ) 본 발명의 방법은 개인 맞춤형 진단 및 의료를 위한 새로운 방법으로서， 표적 치료제가 신호전달경로에 어떠한 변화를 가져오고 환자에 어떠한 반응을 나타낼지에 대한 분석이 가능토록 한다.
( iii ) 본 발명은 특정 질환의 신호전달이 어떻게 분기하고 어떻게 수렴하는지를 분석함으로써 신호전달경로를 전체적으로 이해할 수 있도록 할 뿐 아니라， 전체신호전달 네트워크 중 어느 신호전달이 왜곡되었는지 확인하도톡 함으로써 맞춤형 치료제 개발을 위한 플랫품으로서 이용가능하다. 최근의 표적 항암제에 대한 암조직의 내성이 문제되고 있으나 본 플랫품에 의하면 내성을 미리 감지하고 그에 맞는 2차 치료제를 설계하도록 함으로써 암의 재발을 크게 줄일 수 있을 것으로 기대된다.
【도면의 간단한 설명】 - 도 1은 하기 실험예에서 사용한 실험의 모식도를 보여준다.
도 2는 하기 실시예에서 사용한 관측 시스템의 구조도를 보여준다. 도 3은 단분자 형광분자 관측 및 정량화에 대한 결과를 보여준다. 도 4는 EGFR과 이의 하위 단백질 및 탐지 단백질 교환에 따른 형광 신호세기를 보여준다.
도 5는 활성화된 EGFR과 불활성화된 EGFR의 형광 신호 세기를 보여준다.
도 6은 12종류의 폐암 세포주에서의 EGFR과 ρ85 α간의 상호작용 정도를 보여준다.
도 7은 각 세포주에서의 EGFR과 이의 하위 단백질간의 상호작용 정도의 상대적인 세기를 보여준다.
도 8은 동일한 환자 유래의 종양 조직과 정상 조직에서의 EGFR의 활성화 정도를 보여준다.
도 9는 표적 단백질들 (제 1 단백질들)—후보군 단백질 (제 2 단백질들)간의 결합을 도식화한 것이다.
도 10은 도 9의 방법으로 측정한 신호전달경로의 형광신호로 보여준다. '
도 11은 각 유방암 세포주에서의 HER2와 이의 하위 단백질, 및 HER3와 이의 하위 단백질간의 상호작용 정도의 상대적인 세기를 보여준다. 도 12는 각 폐암 세포주에서의 HGFR (c-MET)과 이의 하위 단백질간의 상호작용 정도의 상대적인 세기를 보여준다.
도 13a는 각 세포주에서의 EGFR과 이의 하위 단백질， HGFR과 이의 하위 단백질, 그리고 HER2와 이의 하위 단백질 간의 상호작용 정도의 상대적인 세기를 보여준다.
도 13b는 각 세포주들의 EGFR 표적항암제인 Gef i t ini b에 대한 반웅성을 보여준다.
도 13c는 도 13a에 나타난 EGFR의 Grb2와의 상호작용 정도와 도 13b에서 측정된 각 세포주들의 표적항암제에 대한 감수성을 종합하여 보여준다.
【발명을 실시하기 위한 구체적인 내용】
이하， 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다. 실시예
실시예 1. 세포 용해 버퍼의 제조
150 mM NaCl , 1 mM EDTA 및 l%(vo l /vol ) 트리톤 X-100을 증류수에 용해하여 세포 용해 버퍼 (Lys i s buf fer )를 제조하였다. 2배 농축된 스록 버퍼를 제조하고， 4°C 넁장고에 보관하였다. 세포 용해액 (cel l extract )을 만들기 직전에 2배 농축된 스특 버퍼를 이용하여 앞서 기술된 최종 농도로 세포 용해 버퍼를 회석시켰다. 이때, 단백질 분해효소 억제제 (protease inhibitor; Sigma P8340 , Sigma)와 탈인산화 효소 억제제 (phosphatease inhibitor; P5726, Sigma)를 각각 첨가하여 세포 용해액 내부에 존재하는 단백질 분해효소와 탈인산화 효소의 기능을 억제하였다. 세포 용해액 5 mg/ml 당 각 억제제들을 1:100의 농도로 희석시켰다. 세포주 용해액이나 조직 용해액의 최종 농도가 5-10 mg/i 가 되도록 용해액의 양을 결정하였다. 보통 5 X 106 세포를 .200 μί 세포 용해 버퍼에 녹였을 때 6-10
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정도의 총 단백질 양을 만들고， 20 mg 인간 폐 조직을 1 세포 용해 버퍼에 녹였을 때 10—13 mg/m^ 정도의 총 단백질 농도가 형성된다. 실시예 2. 표적 단백질 (target protein; 제 1 단백질)의 제조
표적 단백질은 본 발명을 통하여 특성을 분석 (파악)하고자 하는 목표가 되는 단백질을 의미한다. 하기 실험예에서는 발암 단백질 (oncoprotein) 중 하나인 EGFR, HER2, HER3 또는 HGFR을 표적 단백질로 사용하였다. 형광 표지나 Tag을 이용한 정제 과정 등이 포함되지 않은 native 형태의 단백질로 세포주 흑은 실제 환자의 조직 샘플에서 바로 채취하여 사용하였다. 세포주로부터 표적 단백질을 제조하기 위하여 세포주에 상기 실시예 1에서 제조한 용해 버퍼를 적당량 넣어주고， 100-200 ί 파이펫을 이용하여 뭉쳐있는 세포주를 균질하게 풀어주는 과정을 반복하였다. 모든 반웅은 얼음 위의 콜드 블록 (cold block)에서 진행하였다. 이후， 만들어진 시료를 얼음에서 30분간 용해하였다. 조직으로부터 표적 단백질을 제조하기 위하여， 조직과 용해 버퍼가 닿는 단면적을 넓혀 세포 용해가 쉽게 일어날 수 있도록 조직을 수술용 가위를 이용하여 잘게 잘라주었다. 여기에 적당량의 용해 버퍼를 넣어 1 파이펫을 이용하여 균질하게 풀어주었다. 이후 균질기 (mechanical homogenizer； IKA, cat . No. 3737000)를 이용하여 조직을 잘게 갈아주었다. 30분 반웅 후， 10,000g X 10 분 동안 4°C를 유지한 상태에서 원심분리를 진행하였다. 가라앉은 부분 (pellet)을 제거하고， 용액 부분 (상청액)만을 취하였다. 이 용액 부분에는 관측하고자 하는 표적 단백질과 기타 단백질이 포함되어 있다. 이후， 모든 실험 과정 동안 이 용해액을 얼음에 보관하여 단백질이 최대한 안정한 상태로 보관될 수 있게 하였다. DC protein assay 키트 (Bio-Rad, #500-0111) 흑은 단백질 정량 키트를 이용하여 만들어진 세포 또는 조직의 용해액의 총 단백질량을 측정하였다. 실시예 3. 탐지 단백질 (probe protein; 제 2 단백질)의 제조
탐지 단백질은 형광 단백질이 표지된 단백질로서 표적 단백질과 상호작용하는 파트너 단백질을 사용하였다. 형광특성이 좋은 eGFP 백터 (pEGFP-Cl vector, Clontech)에 탐지 단백질 전체 (full length 0RF)나 혹은 특정 부분 (domain)을 넣어서 eGFP-탐지 단백질의 형태로 플라스미드를 제작하였다. 이를 전기천공 방법으로 HEK293 세포에 주입하여 탐지 단백질을 발현시킨 뒤 세포를 수득한 다음 -80°C에서 보관하였다. 탐지단백질의 준비과정은 실시예 2의 표적 단백질의 준비과정과 동일하게 진행하였다. 단， 탐지 단백질은 eGFP가 부착되어 있으므로 발현된 탐지 단백질의 양을 측정하기 위해서 형광 강도 측정기 (FlLiorotneter; Perkin Elmer Ens ire 2300)를 이용하여 발현된 형광 단백질의 양을 측정하여， 탐지 단백질이 얼마나 포함되어 있는지를 정량하였다. 실시예 4, 표적 단백질의 고정 (Target protein i隱 obi 1 ization) 전반사 형광현미경 (Total Internal Reflection Fluorescence Microscope, TIRFM)을 이용하여 관측을 실시하였다. 이를 위해 쿼츠 (Quartz slide)로 만들어진 기판 위에 폴리머 (PolyEthylene Glycol , PEG) 코팅과 포획 (capturing)을 위한 비오틴 -PEG 코팅을 입혔다. 세척을 위하여 기판 상에 만들어진 챔버를 200 ≠ PBS를 이용하여 두 번 연속적으로 세척하고， 뉴트라비딘 (Neutravidin)을 각 챔버 당 50 ^씩 챔버에 주입하였다. 이 뉴트라비딘 단백질은 기판 표면의 비오틴에 결합하여 표면에 부착된다. 5분 여간 상온에서 반웅시킨 후 상기와 같은 방법으로 세척하였다. 표적 단백질에 대한 항체 (EGFP의 경우 EGFR Ab-10, clone 111.6 비오틴 표지 마우스 단일클론항체; Thermo Scientific, #MS-378— B)를 기판에 주입하여 항체를 고정시켰다. 이후， 표적 단백질이 포함된 용해액 (세포 또는 조직 용해액)을 기판에 주입하였다 (농도 범위: 0.1 mg/m£-10 mg/mi； 반웅 시간: 최소 10분에서 30분). 이후, 200 id PBS를 이용하여 두 번 연속적으로 세척하였다 (도 1) . 실시예 5. 탐지 단백질 주입 및 관측 (Probe protein inject ion & detect ion)
실시예 4의 표적 단백질이 고정된 기판에 형광표지된 탐지 단백질이 포함된 세포 용해액을 적당한 농도로 주입하였다. 전반사 형광 현미경을 이용할 경우 50 nM eGFP가 정상적인 관측을 할 수 있는 한계 농도치이다. 이는 관측 광학 장비 및 기판 형태에 따라 변경될 수 있다 (도 1의 마지막 단계) . 이후， 기판을 전반사 형광현미경을 이용하여 관찰하였다. 단백질 상호작용 관측을 위해서 50 ms의 노출 시간 (exposure t ime)을 이용하여 짧은 시간에 발생하는 신호를 측정하였다. 도 2는 기판과 현미경 및 분석 프로그램을 포함하는 관측 시스템의 구조도이다.
탐지 단백질이 주입된 기판을 형광 현미경을 이용하여 약 5초 ( 100 frames wi th 0.05 sec exposure t ime) 정도 실시간으로 기록하였다. 단분자 형광 단백질 관측 알고리즘을 이용하여 특정 프레임에서 몇 개의 탐지 단백질이 표면에 있는 표적 단백질과 결합되어 있는지 관측하였다. 보통 3- 10개의 프레임을 평균하여 하나의 이미지를 생성하고， 이 이미지를 분석하여 단분자 신호의 개수를 측정한다. 프레임 수를 결정하는 과정은 실시간 단분자 단백질 상호작용 분석을 통해 두 단백질 상호작용의 운동 상수 (kinet i cs )가 어떻게 되는지 우선 분석한다 (도 3의 첫 번째 패널) . 두 단백질이 얼마나 오랫동안 결합되어 있다가 떨어지는지를 계량하면， 이를 통해 평균을 취하는 프레임 넘버를 결정하게 된다. 본 실험에서는 5 프레임 (250 ms )이 가장 적합한 평균 프레임 개수로 측정되었으며 (도 3의 두 번째 패널)， 25 프레임 단위로 프레임을 건너뛰었다. 예를 들어 1-5 프레임 평균， 이후 25-29 프레임 평균, 50-54 프레임 평균, 75-79 프레임 평균하여 총 4개의 데이터 포인트를 형성하였다.
가장 적합한 평균 프레임 시작점을 찾았다. 이는 양성 대조군 (표적 단백질이 고정된 표면)과 음성 대조군 (오직 1차 항체만이 고정된 표면) 사이에서 가장 큰 차이를 나타내는 점을 기준으로 삼아 실시하였다. 75번째 프레임이 가장 적합한 시점으로 측정되었다 (도 3의 세 번째 패널) . 한 챔버에서 위치를 옮겨가며 5개의 데이터를 수집하여 전체 평균값과 표준편차를 구하여 하나의 데이터로 만들었다. 표적 단백질 용해액의 농도를 바꾸어가면서 앞의 과정을 반복하였으며, 이를 통해 다양한 시료에서 표적 단백질의 활성화된 정도를 비교할 수 있다. 실시예 6. 탐지 단백질의 교환 (probe exchange)
본 발명은 하나의 준비된 기판에서 다양한 탐지 단백질 (제 2 단백질)을 간단하게 적용할 수 있는 장점을 지니고 있다. EGFR과 같은 단백질의 경우 다양한 하위 신호전달경로를 지니고 있으므로, 다수의 신호전달경로를 측정하는 것은 생물학적 정보 전달 규명에 중요한 역할을 할 것이다. 나아가， 표적 단백질 준비를 한 번만 하면 되기 때문에 소량의 세포 또는 조직 용해액을 사용할 수 있다는 장점을 지니고 있다. 탐지 단백질 교환 과정을 설명하면 다음과 같다. 하나의 탐지 단백질의 측정이 끝난 뒤 세척과정을 통해 챔버에 남아있는 단백질을 제거한 다음， 다른 탐지 단백질을 주입하여 앞선 측정과정을 반복하였다.
한편， 앞선 탐지 단백질로 인하여 다음 탐지 단백질의 관측에 방해가 되는지 여부를 조사한 결과， 다음 탐지 단백질이 도입되면 남아있던 처음의 탐지 단백질 역시 경쟁 결합에 의해 분리되는 것으로 나타났다 (도 4의 마지막 패널) . 이러한 결과는， 탐지 단백질 교환만을 통해서도 하나의 표적 단백질과 다수의 탐지 단백질을 단시간에 측정할 수 있음을 보여준다. 실험예 1. EGFR의 활성화 상태 분석
본 연구를 위해 가장 유명한 발암 막단백질의 분류에서 티로신 인산화효소 수용체 (Receptor Tyros ine Kinase , RTK) 증 EGFR( Epidermal Growth Factor Receptor )을 가지고 실험의 적합성 여부와 실제 데이터를 수집하였다. 실험과정은 상기에서 설명한 방법에 따라 실시하였다.
준비된 샘플은 NCI-H1666이라는 세포주로 정상적인 EGFR을 발현시키는 폐암 세포주로 알려져 있다. EGFR은 EGF라고 불리는 리간드에 의해서 EGFR이 활성화 (phosphoryl at i on)되고, 이를 통해 하위 신호 단백질과 상호작용한다. 본 실험에서는 EGFR의 대표적인 하위 신호 단백질인 PI3K(Phosphoinos i t i de 3-kinase)의 서브유닛인 ρ85 α에 eGFP를 부착한 eGFP-p85 a 형태를 탐지 단백질로 사용하였다. 우선 H1666 세포주를 두 그룹으로 나누어 배양하였다. 여기에 무혈청 배지 (serum— free media)를 이용하여 24시간 동안 H1666 세포주를 결핍 (starvation) 시켰다. 이때는 영양분이 없으므로 세포는 성장 활동을 멈추게 되고, EGFR은 불활성화 상태 (unphosphorylated)로 존재한다고 알려져 있다. 이후， 한 그룹의 세포에 EGF 100 ng/mi를 3분 동안 처리하였다. 이는 EGFR와 활성화 신호를 주는 외부 요인으로 EGFR을 활성화 상태 (phosphorylated)로 만들어준다. 두 그룹의 세포주를 모은 후 두 세포주의 EGFR의 상태를 관찰하였다.
그 결과, 도 5에 나타난 바와 같이, EGFR이 활성화된 세포주는 그래프의 기울기가 가파르게 나타났으나， 비활성화된 세포주는 그래프의 기울기가 완만하였다 (도 5). 이러한 결과는， 본 발명을 통하여 측정된 기울기 값을 세포 내 존재하는 표적 단백질이 어느 정도 활성화되어 있는지를 나타내는 척도로서 사용할 수 있음을 보여준다. 실험예 2. ρ85α를 이용한 다양한 비소세포성 폐암 세포주의 EGFR 활성화 정도 분석
총 12개의 NSCUXNon Small Cell Lung Cancer) 세포주 (H1975, H1650, HCC827, H4006, H358, H1666, H2291 및 A549은 American Type Culture Col lection으로부터 입수; HCC827-GR, H4006-ER, PC9 및 PC9-GR은 연세대학교 병원으로부터 입수)의 EGFR 상태를 eGFP-p85a 탐지 단백질을 이용하여 정량화하였다. 보통 EGFR은 액손 19 결실 돌연변이이나 엑손 21 점돌연변이 (L858R)를 통해 항상 활성화된 형태로 존재하여 암을 유발한다고 알려져 있다. 본 실험에서 사용한 12개의 세포주 중 H1975, H1650, HCC827, HCC827-GR, H4006 , H4006-ER, PC9 및 PC9-GR은 EGFR 돌연변이를 갖는 암세포주이고, 나머지 4개의 세포주는 정상 EGFR을 지닌 암세포주이다.
앞서 기술한 방법대로 EGFR과 p85a 사이의 반응성을 측정하여 각 세포주의 EGFR의 상태를 정량화하였다. 대표적으로 H4006(액손 19 결실)과 H1975(엑손 21 돌연변이) 및 H229K정상 EGFR) 세포주의 반응성을 측정하여 그래프로 나타내었다. 그 결과, 도 6의 상단패널에 나타난 바와 같이， 정상 EGFR을 지닌 H2291 세포주 보다 변이된 EGFR을 지닌 다른 두 세포주에서 EGFR의 활성화 정도가 더 높음을 확언하였다. 또한, H4006과 H1975 사이에서도 그 정도의 차이가 있는 것을 볼 수 있었다. 총 12개의 NSCLC 암세포주에 대해서 EGFR의 활성화 정도를 측정하여 히트맵 (heatmap)으로 나타내었다. 그 결과, 도 6의 하단 패널에 나타난 바와 같이， H1975 세포주에서 발생하는 신호를 1로 계량하여 나머지 세포주의 신호 세기를 상대적인 값으로 나타낸 그래프가 얻어졌다.
본 발명은 이와 같은 방법을 통해 RTK의 일종인 EGFR과 그 하위 단백질인 ρ85 α 사이의 상호작용의 세기를 측정할 수 있다. 또한， 적절한 항체를 선별한다면 EGFR 이외에 다양한 RTK에 대해서 본 발명을 적용하여 각 세포주에서 발생하는 표적 단백질의 신호와 표적 단백질과 탐지 단백질간의 상호작용의 정도를 측정할 수 있다. 실험예 3. 4종의 EGFR 하위 단백질을 이용한 비소세포성 폐암 세포주의 EGFR 활성화 정도 분석
실험예 2에서 정량한 신호 세기를 확장하여 다수의 탐지 단백질을 이용하여 EGFR의 상대적인 신호세기를 분석하였다. 그 결과， 도 7에 나타난 바와 같이， 이를 통해 EGFR에서 시작된 다양한 신호전달경로가 각 세포주에서 어떻게 변화하는지와 세포주마다 어떤 차이가 있는지를 확인할 수 있었다. 이러한 결과는, 본 발명을 이용하여 특정 신호전달경로를 표적으로 하는 항암제 선택에 도움을 즐 수 있음을 보여준다. 마찬가지로 H1975 세포주를 기준으로 하여 각 세포주의 상대적인 신호값을 계량한 결과를 도 7에 나타내었다. 실험예 4. 인간 종양조직의 특성 분석
앞서 기술한 방법을 모두 사용하여 인체 종양 조직 (폐암)과 정상 조직 사이의 차이점을 확인하였다. 상기 폐임- 조직은 을지대학교 병원으로부터 입수하였다. 10 mg의 조직 용해액을 사용하여 실험을 진행하였다. 종양 조직과 정상 조직에서 EGFR의 활성화 정도가 얼마나 차이나는 지를 본 발명을 이용하여 측정하고 H1975를 기준으로 비교하였다. 그 결과， 도 8의 하단에 나타난 바와 같이， 종양 조직과 정상 조직에서 EGFR의 활성화된 정도에 큰 차이가 있음을 확인할 수 있었다. 이러한 결과는， 본 발명을 통하여 미지의 각 환자로부터 채취한 조직을 검사하여 특히 활성화되어 있는 신호전달경로를 확인함으로써, 각 환자에게 맞는 적절한 처방 (치료)을 할 수 있음을 보여준다. 실험예 5. 다양한 RTK 활성화 상태 분석
앞선 실험예들의 EGFR 외의 다른 RTK 에도 본 발명이 적용 가능함을 보여주기 위하여, HER2, HER3 및 HGFR (c_MET)에 대한 실험을 수행하였다. 표적 단백질인 HER2 와 HGFR 의 탐침 단백질로는 Grb2, PLCy 및 ρ85 α 를 사용하였고, 표적 단백질인 HER3의 탐침 단백질로는 ρ85α를 사용하였다.
HER2/HER3 의 경우에는 총 10 개의 유방암 세포주 (S BR3, T47D, MDAMB231, MDAMB453, H1419, H1954 및 MCF7 은 American Type Culture Collection 으로부터 입수; SKBR3 LR9, SKBR3 HR30 및 SNU21 은 서을대학교 병원으로부터 입수)에서의 HER2 와 HER3 활성화 정도를 측정하여 히트맵 (heatmap)으로 표현하였다 (도 11). 도 11 은 SKBR3 세포주에서 측정된 신호를 1 로 계량한 후 나머지 세포주들의 신호세기를 상대적인 값으로 나타낸 결과이다.
HGFR 의 경우에는 총 15 개의 NSCLC 암세포주 (HCC827, H4006, H1650,
H1975, H358, H1666, H2291 및 A549 는 American Type Culture Collection 으로부터 입수; PC9, HCC827-GR#13, H4006-ER, YU-01, YU— 06, HCC827-GR#5 및 PC9-GR 은 연세대학교 병원으로부터 입수)에서의 활성화 정도를 측정하였고， 마찬가지로 HCC827 세포주를 1 로 계량한 후 나머지 세포주들의 신호 세기를 상대적인 값으로 나타내었다 (도 12).
도 11과 12의 결과는， 본 발명이 특정 RTK에 국한되는 것이 아니며， 나아가 RTK를 포함한 모든 수용체에 대하여 적용이 가능함을 보여준다. 실험예 6. 단백질-단백질 상호작용 (PPI)과 약물 반웅 상관관계 분석 본 기법을 적용하여 총 15 개의 NSCLC 암세포주를 대상으로
PPI (protein-protein interact ion)와 EGFR 표적항암제인 Gef itinib 에 대한 반웅성 사이의 상관관계를 분석하였다. 도 13a 에 나타난 EGFR 의 Grb2 와의 상호작용 정도 (신호전달 세기)와 도 13b 에서 측정된 각 세포주들의 표적항암제에 대한 감수성을 종합하여 도 13c 에 나타내었다. 도 13c 의 가로축은 오른쪽으로 갈수록 EGFR 의 신호전달이 증가함을 의미하며, 세로축은 위쪽으로 갈수록 표적항암제에 대한 감수성이 높아짐을 의미한다. 도 13c 는 측정된 EGFR 의 신호전달 세기가 표적항암제에 대한 감수성과 정적 상관관계 (pos i t ive corre l at i on)가 있음을 보여준다. 이러한 결과는， 본 발명을 이용하여 미지의 검사 시료를 대상으로 표적항암제가 타겟팅하는 신호전달경로의 활성화 정도를 측정함으로써， 표적항암제에 대한 감수성을 미리 예측할 수 있음을 보여준다. 이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바， 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며， 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims

【특허청구범위】
【청구항 1】
다음의 단계를 포함하는 개체 (subj ect )로부터 분리된 세포 또는 조직 내의 신호전달경로 (s igna l ing pathway)의 활성화 상태 분석방법:
(a) 상기 개체로부터 분리된 것으로서， 상기 신호전달경로 상의 단백질인 제 1 단백질을 포함하는 세포 또는 조직의 용해액 (extract )을 기판에 처리하여 상기 제 1 단백질을 기판에 고정시키는 단계 ;
(b) 상기 제 1 단백질과 상호작용하는 단백질로서 형광 표지 처리된 제 2 단백질을 상기 기판에 공급하여 제 1 단백질과 형광 표지된 제 2 단백질간의 복합체 형성을 유도하는 단계; 및
(c) 상기 제 2 단백질의 형광 표지의 형광신호를 분석하여 제 1 단백질과 제 2 단백질간의 상호작용을 분석하고， 분석 결과를 통하여 상기 신호전달경로의 활성화 상태를 분석하는 단계.
【청구항 2】
제 1 항에 있어서， 상기 제 2 단백질은 게 1 단백질의 하위 (downstream)에 위치하는 단백질인 것을 특징으로 하는 분석방법 .
[청구항 3】
제 1 항에 있어서, 상기 제 1 단백질은 막 단백질인 것을 특징으로 하는 분석방법. '
【청구항 4】
제 3 항에 있어서， 상기 막 단백질은 수용체 (receptor )인 것을 특징으로 하는 분석방법 .
【청구항 5]
제 4 항에 있어서， 상기 수용체는 티로신 인산화효소 수용체 (Receptor tyrosine kinases) , 를—유사 수용체 (Tol 1— 1 ike receptor ) 또는 G 단백질 연결 수용체 (G protein-coup led receptor )인 것을 특징으로 하는 분석방법.
【청구항 6】
제 1 항에 있어서, 상기 세포 또는 조직은 암세포 또는 암 조직인 것을 특징으로 하는 분석방법.
【청구항 7】
제 1 항에 있어서， 상기 단계 (c)에서는 전반사 현미경 (Total Internal Reflection Fluorescence Microscope)을 이용하여 제 1 단백질과 제 2 단백질간의 상호작용을 분석하는 것을 특징으로 하는 분석방법.
【청구항 8】
제 1 항에 있어서, 상기 단계 (c)에서의 형광신호 분석은 실시간으로 형광 신호를 측정하는 것을 특징으로 하는 분석방법.
【청구항 91
제 1 항에 있어서， 상기 단계 (c)에서의 형광신호 분석은 상기 형광 표지가 나타내는 특정 파장의 형광신호를 특정 시간 동안 적분 측정하는 것을 특징으로 하는 분석방법 .
【청구항 10】
제 1 항에 있어서, 상기 방법은 단계 (b)와 (c)를 통하여 상호작용을 분석한 제 2 단백질과 다른 종류의 단백질로서, 제 1 단백질과 상호작용하는 단백질로서 형광 표지 처리된 단백질을 제 2 단백질로 사용하여 단계 (b)와 (c)를 실시하는 단계 (d)를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 분석방법 .
.
【청구항 11】
다음의 단계를 포함하는 개인 맞춤형 치료제의 선정 방법:
(a) 제 1 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항의 방법을 이용하여 상기 개인으로부터 분리된 세포 또는 조직 내의 신호전달경로의 활성화 상태를 분석하는 단계; 및
(b) 단계 (a)에서 확인된 활성화된 신호전달경로를 타겟으로 하는 치료제를 탐색하고, 탐색된 치료제를 상기 개인의 맞춤형 치료제로 선정하는 단계 .
【청구항 12]
제 11 항에 있어서， 상기 치료제는 항암제인 것을 특징으로 하는 방법.
【청구항 13]
다음의 단계를 포함하는 치료제에 대한 치료 반응성을 예측하는 방법：
(a) 제 1 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항의 방법을 이용하여 치료제에 대한 치료 반응성을 예측하고자 하는 인간으로부터 분리된 세포 또는 조직 내의 신호전달경로의 활성화 상태를 분석하는 단계; 및
(b) 단계 (a)에서 확인된 신호전달경로의 활성화 상태 분석정보를 토대로， 상기 신호전달경로를 타겟으로 하는 치료제에 대한 치료 반웅성을 예측하는 단계.
【청구항 14]
제 13 항에 있어서， 상기 치료제는 항암제인 것을 특징으로 하는 방법 .
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