CN105759043A

CN105759043A - 一种可同时检测农作物中多菌灵和甲基硫菌灵残留的试纸及其应用、制备方法

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Publication number: CN105759043A
Application number: CN201610126943.8A
Authority: CN
Inventors: 楼小华; 冯才伟; 李明海; 罗贵昆; 朱文静; 扶胜; 高川川; 袁学伟; 孙良政; 谢体波; 巴金莎; 刘红; 李平; 何国书; 令狐克勇
Original assignee: CAREER SERVICE CENTER OF BIT
Current assignee: CAREER SERVICE CENTER OF BIT
Priority date: 2016-03-07
Filing date: 2016-03-07
Publication date: 2016-07-13
Anticipated expiration: 2036-03-07
Also published as: CN105759043B

Abstract

本发明公开了一种可同时检测农作物中多菌灵和甲基硫菌灵残留的试纸及其应用、制备方法，包括样品吸收垫、结合物释放垫、反应膜、吸水垫和底板，所述反应膜上具有包被有多菌灵偶联抗原的检测线和包被有羊抗鼠抗抗体的质控线，所述结合物释放垫包被有多菌灵单克隆?胶体金标记物。本发明所提供的试纸，具有操作简单、灵敏度高、检测速度快、成本低等特点，特别适合大量样本的筛查和现场监控。

Description

一种可同时检测农作物中多菌灵和甲基硫菌灵残留的试纸及其应用、制备方法

技术领域

本发明涉及一种可同时检测农作物中多菌灵和甲基硫菌灵残留的试纸及其应用、制备方法，属于农作物中多菌灵和甲基硫菌灵残留残留检测技术领域。

背景技术

农作物是我国重要的经济作物，在我国大多数地区都有种植，农作物在生产过程中，易受到病原物的为害，在气候条件适宜的前提下，常发生严重的病害，从而给农作物生产带来巨大的经济损失。农作物白粉病、赤星病、萎蔫病、白绢病、蛙眼病等是常见的农作物真菌病害，在实际生产中，常使用多菌灵和甲基硫菌灵对上述病害进行控制和治疗。

多菌灵和甲基硫菌灵同属于苯并咪唑类，是具有保护、治疗、内吸作用的杀菌剂，具有高效、广谱、低毒的特点，甲基硫菌灵在植物体内转化为多菌灵，作用机理均为干扰菌的有丝分裂中纺锤体的形成，影响细胞分裂。由于多菌灵和甲基硫菌灵对健康具有潜在威胁，所以各国对上述物质的残留限量制定了严格的标准，甲基硫菌灵和多菌灵统一以多菌灵来计，我国规定农作物中多菌灵的残留限量为2mg/kg。

从现有技术和相关检测标准看，目前针对多菌灵和甲基硫菌灵残留的最常用的检测方法是HPLC，仪器方法具备检测灵敏度高、特异性强等优势，但是检测样本前处理繁琐、耗时，样品还需提取和净化处理，同时仪器检测方法需要昂贵的大型仪器和设备，配备专业的检测技术人员，所以限制了其应用。因此，寻求更为快速的检测手段，具有重要的现实意义。

发明内容

本发明要解决的技术问题是：提供一种可同时检测农作物中多菌灵和甲基硫菌灵残留的试纸及其应用、制备方法，具有操作简单、灵敏度高、成本低、检测时间短，以及可同时检测多菌灵和甲基硫菌灵残留等优点，可以克服现有技术的不足。

本发明的技术方案是：一种可同时检测农作物中多菌灵和甲基硫菌灵残留的试纸，包括样品吸收垫、结合物释放垫、反应膜、吸水垫和底板，所述反应膜上具有包被有多菌灵偶联抗原的检测线和包被有羊抗鼠抗抗体的质控线，所述结合物释放垫包被有多菌灵单克隆-胶体金标记物。

所述多菌灵偶联抗原是由多菌灵半抗原与载体蛋白偶联得到，所述载体蛋白可为鼠血清蛋白、甲状腺蛋白、牛血清白蛋白、兔血清蛋白、人血清蛋白、卵清蛋白、血蓝蛋白或纤维蛋白原。

所述多菌灵单克隆-胶体金标记物是将多菌灵单克隆抗体加入胶体金中得到，其中所述胶体金是由柠檬酸三钠与氯金酸反应制取得到。

所述多菌灵单克隆抗体是用多菌灵半抗原-载体蛋白偶联物免疫小鼠，将小鼠脾细胞和骨髓瘤细胞通过融合、筛选得到。

所述多菌灵半抗原是由多菌灵与马来酸酐反应得到，其分子结构式为：

。

所述样品吸收垫、结合物释放垫、反应膜、吸水垫依次粘贴在底板上，其中所述结合物释放垫1/3-1/2被覆盖于样品吸收垫下。

本发明还提供一种制备上述试纸的方法，其包括以下步骤：

1）制备包被有多菌灵单克隆抗体-胶体金标记物的结合物释放垫；

2）制备具有包被有多菌灵偶联抗原的检测线和包被有羊抗鼠抗抗体的质控线的反应膜；

3）将1）和2）制备好的结合物释放垫、反应膜与样品吸收垫、吸水垫和底板组装成所述试纸。

具体地说，步骤包括：

1）半抗原制备：称取0.5g-2g多菌灵溶于经干燥后的四氢呋喃中，通氮气保护，加入0.24-1g马来酸酐常温搅拌溶解，加入10-50mgDMAP体进行催化反应，70℃回流反应，用TLC薄层板监测反应进行，直至没有原料或原料点很浅，停止反应，硅胶柱净化，浓缩得多菌灵半抗原产物；

2）将多菌灵半抗原与载体蛋白偶联，得到多菌灵半抗原-载体蛋白偶联物；

3）用多菌灵半抗原-载体蛋白偶联物免疫小鼠，将小鼠脾细胞和骨髓瘤细胞通过融合、筛选，得到多菌灵单克隆抗体；

4）提取小鼠IgG免疫健康山羊，得到羊抗鼠抗抗体；

5）用柠檬酸三钠与氯金酸反应制备胶体金；

6）将步骤3）制备的多菌灵单克隆抗体加入步骤5）制备的胶体金中，得到多菌灵单克隆抗体-胶体金标记物；

7）将多菌灵单克隆抗体-胶体金标记物包被在结合物释放垫上，37℃烘60min后取出，密封并置于干燥环境中保存备用；

8）多菌灵半抗原-载体蛋白偶联物包被在反应膜上构成检测线（T线），并将羊抗鼠抗抗体包被在反应膜上构成质控线（C线）；

9）将样品吸收垫用含0.5%牛血清白蛋白（体积百分含量）、pH为7.2、0.1mol/L磷酸盐缓冲液浸泡2h，37℃下烘干2h；

10）在底板上按顺序粘贴上样品吸收垫、结合物释放垫、反应膜、吸水垫，样品吸收垫盖住结合物释放垫，最后切成3mm宽的小条，加塑料盒，密封包装，4-30℃条件下可保存12个月。

本发明另外还提供一种应用上述试纸同时检测农作物中多菌灵和甲基硫菌灵残留的方法，它包括步骤：

（1）样品前处理；

（2）用所述试纸进行检测；

（3）分析检测结果。

本发明的有益效果是：

本发明的多菌灵和甲基硫菌灵二合一快速检测试纸采用高度特异性的抗体抗原反应及免疫层析分析技术，将多菌灵单克隆抗体-胶体金标记物固定于结合物释放垫上，样品中的多菌灵在流动过程中，先与结合物释放垫上的多菌灵单克隆抗体-胶体金标记物，形成药物-抗体-胶体金标记物。样本中的药物与反应膜检测线上的多菌灵半抗原-载体蛋白偶联物竞争结合多菌灵单克隆抗体-胶体金标记物，根据检测线红色条带有无或颜色深浅来判断待测样品液中多菌灵残留量，新鲜烟叶的检测限为0.6mg/kg，干烟叶的检测限为1mg/kg。

检测时，样品经处理后滴入试纸卡孔内，当多菌灵在样品中的浓度低于检测限或为零时，多菌灵单克隆抗体-胶体金标记物在层析过程中会与固定在反应膜上的多菌灵半抗原-载体蛋白偶联物结合，在检测线（T线）和质控线（C线）内各出现一条红色条带；如果多菌灵在样品中的浓度等于或高于检测限，多菌灵单克隆抗体-胶体金标记物会与多菌灵全部结合，从而在T线处因为竞争反应不会与多菌灵半抗原-载体蛋白偶联物结合而不出现红色条带。如附图3所示。

阴性：当质控线（C线）显示出红色条带，检测线（T线）同时也显示出红色条带，判为阴性。

阳性：当质控线（C线）显示出红色条带，而检测线（T线）不显色，判为阳性。

无效：当质控线（C线）不显示出红色条带，则无论检测线（T线）显示出红色条带与否，该试纸判为无效。

本发明的试纸具有灵敏度高、特异性强、成本低、操作简单、检测时间短、适合各种单位使用、储存简单、保质期长的优点，是理想的快速筛选手段，能够更好地满足现场快速检测的要求。用本发明试纸检测多菌灵和甲基硫菌灵残留的方法简便、快速、直观、准确、适用范围广、成本低、易推广使用。特别适合用于烟草中多菌灵和甲基硫菌灵的定性及半定量检测。

附图说明

图1：多菌灵半抗原合成路线图；

图2：试纸剖面结构示意图；

图3：试纸检测结果判定图。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明作进一步地详细描述。

实施例1多菌灵检测试纸的制备

该试纸的制备方法主要包括以下几个步骤：

2）制备具有包被有多菌灵半抗原-载体蛋白偶联物（即多菌灵偶联抗原）的检测线和包被有羊抗鼠抗抗体的质控线的反应膜；

3）将1）和2）制备好的结合物释放垫、反应膜与样品吸收垫、吸水垫和PVC底板组装成试纸。

下面分步详细叙述：

1、多菌灵半抗原的制备

称取0.5g-2g多菌灵溶于经干燥后的四氢呋喃中，通氮气保护，加入0.24-1g马来酸酐常温搅拌溶解，加入10-50mgDMAP体进行催化反应，70℃回流反应，用TLC薄层板监测反应进行，直至没有原料或原料点很浅，停止反应，硅胶柱净化，浓缩得产物。产率>85%。

2、免疫原制备

称取29.1mg多菌灵半抗原溶解于2mLDMF溶液中，加入各60mgEDC和60mgNHS（溶于2mL水中）进行活化30分钟，加入到132-440mg载体蛋白BSA溶于5mL水溶液中,调溶液PH8-9，室温进行偶联制备出免疫原，用0.01mol/LPB缓冲液透析3天，每天早晚更换透析液，透析完成后用于动物免疫制备出抗体。

3、多菌灵单克隆抗体的制备方法

（1）动物免疫

将步骤2得到的免疫原注入Balb/c小鼠体内，免疫剂量为150ug/只，使其产生抗血清。

（2）细胞融合和克隆化

小鼠血清测定结果较高后，取其脾细胞，按8:1（数量配比）比例与SP2/0骨髓瘤细胞融合，采用间接竞争ELISA测定细胞上清液，筛选阳性孔。利用有限稀释法对阳性孔进行克隆化，直到得到分泌多菌灵单克隆抗体的杂交瘤细胞株。

细胞冻存和复苏：将单克隆杂交瘤细胞株用冻存液制成1×10⁶个/ml的细胞悬液，在液氮中长期保存。复苏时取出冻存管，立即放入37℃水浴中速融，离心去除冻存液后，移入培养瓶内培养。

单克隆抗体的生产与纯化：将Balb/c小鼠腹腔注入灭菌石蜡油0.5ml/只，7天后腹腔注射稳定的单克隆杂交瘤细胞株5×10⁵个/只，7天后采集腹水。用辛酸-饱和硫酸铵法进行腹水纯化，-20℃保存。

（3）细胞冻存和复苏

将杂交瘤细胞用冻存液制成1×10⁶个/ml的细胞悬液，在液氮中长期保存。复苏时取出冻存管，立即放入37℃水浴中速融，离心去除冻存液后，移入培养瓶内培养。

（4）单克隆抗体的制备与纯化

增量培养法：将杂交瘤细胞置于细胞培养基中，在37℃条件下进行培养，用辛酸-饱和硫酸铵法将得到的培养液进行纯化，得到单克隆抗体，-20℃保存。

所述细胞培养基为向RPMI1640培养基中添加小牛血清和碳酸氢钠，使小牛血清在细胞培养基中的终浓度为20%（质量百分含量），使碳酸氢钠在细胞培养基中的终浓度为0.2%（质量百分含量）；所述细胞培养基的pH为7.4。

5、羊抗鼠抗抗体的制备

以羊作为免疫动物，以鼠源抗体为免疫原对无病原体羊进行免疫，得到羊抗鼠抗抗体。

6、单克隆抗体-胶体金标记物的制备

（1）胶体金的制备

用双蒸去离子水将1%氯金酸稀释成0.01%（质量百分含量），取100ml置于锥形瓶中，用恒温电磁搅拌器加热至沸腾，在持续高温、持续搅拌下加入2.5ml1%柠檬酸三钠，继续匀速搅拌加热至溶液呈透亮的红色时停止，冷却至室温后用去离子水恢复到原体积，4℃保存。制备好的胶体金外观纯净、透亮、无沉淀和漂浮物。

（2）金标抗体的制备

在磁力搅拌下，用0.2mol/L碳酸钾溶液调胶体金的pH值至7.0，按每毫升胶体金溶液中加入20-50ug抗体的标准向胶体金溶液中加入多菌灵抗体，继续搅拌混匀30min，加入10%BSA，使其在胶体金溶液中的终浓度为1%（体积百分含量），静置10min。12000r/min、4℃离心40min，弃上清液，沉淀用复溶缓冲液洗涤两次，用体积为初始胶体金体积1/10的复溶缓冲液将沉淀重悬，置4℃备用。

复溶缓冲液：含牛血清白蛋白（BSA）0.1%-0.3%（体积百分含量）、吐温-800.05%-0.2%（质量百分含量）、pH7.2的0.02mol/L磷酸盐缓冲液。

7、结合物释放垫的制备

将结合物释放垫浸泡于含有牛血清白蛋白（牛血清白蛋白在缓冲液中的浓度为0.5%）和pH7.20.5mol/L磷酸盐缓冲液中，均匀浸湿1h，37℃烘3h备用。用百道公司生产ZX1000型喷膜仪，将制备好的多菌灵单克隆抗体-胶体金标记物均匀包被在结合物释放垫上，每1cm结合物释放垫包被0.01ml多菌灵单克隆抗体-胶体金标记物后，置于37℃环境中（湿度＜20%）60min后取出，密封置于干燥环境（湿度＜20%）中保存备用。

8、反应膜的制备

将多菌灵半抗原-牛血清蛋白偶联物包被到反应膜上构成检测线（T线），将羊抗鼠抗抗体包被在反应膜上构成质控线（C线）。

包被过程：用磷酸缓冲液将多菌灵半抗原-牛血清蛋白偶联物稀释到10mg/ml，用百道公司生产ZX1000型点膜仪，将其包被于硝酸纤维素膜上的检测线（T线），包被量为1.0ug/cm²；用0.01mol/L、pH7.4的磷酸盐缓冲液将兔抗羊抗抗体稀释到200ug/ml，用点膜仪将其包被于硝酸纤维素膜上的质控线（C线），包被量为1.0ug/cm²。将包被好的反应膜置于37℃条件下干燥2h，备用。

9、样品吸收垫的制备

将样品吸收垫置于含0.5%牛血清白蛋白（体积百分含量）、pH7.20.1mol/L磷酸盐缓冲液中浸泡2h，37℃烘2h备用。

10、试纸的组装

将样品吸收垫1、结合物释放垫2、反应膜3、吸水垫4依次按顺序粘贴在PVC底板7上；结合物释放垫2从起始端有1/3区域被样品吸收垫1覆盖，结合物释放垫2的末端与反应膜3的始端连接，反应膜3的末端与吸水垫的始端相连，样品吸收垫1的始端与PVC底板7的始端对齐，吸水垫4的末端与PVC底板7的末端对齐；所述反应膜3上有检测线5和质控线6，检测线5（T线）和质控线6（C线）均为与所述试纸的长相垂直的条状带；检测线5位于靠近结合物释放垫的末端的一侧；质控线6位于远离结合物释放垫2的末端的一侧；将试纸用机器切成3mm宽的小条，装在特制的塑料制卡中，形成试纸卡，4-30℃条件下可保存12个月。

在本发明中，底板7可选择PVC底板或其他硬质不吸水的材料；样品吸收垫1可选择玻纤、无纺布、滤血膜等；吸水垫4可选择吸水纸；反应膜3可选择硝酸纤维素膜或醋酸纤维素膜；试纸的保护膜可选择PE材质保护膜。

实施例2样品中多菌灵和甲基硫菌灵残留的检测

1、样品的前处理

新鲜烟叶样本前处理方法：

（1）检测前将样本剪碎成小于1cm的碎片；

（2）称取1.0±0.05g剁碎的样本，放入5ml甲醇至液面全部浸满；

（3）盖上盖子，振荡1min；

（4）静置后移取0.1ml上清液加入到900ul0.1MPBS中混匀。

干烟叶样本前处理方法：

（1）检测前将样本粉碎；

（2）称取0.5±0.05g粉碎的样本，加入5ml甲醇；

（3）盖上盖子，振荡1min；

（4）静置后移取0.1ml上清液加入到900ul0.1MPBS中混匀。

2、用试纸进行检测

用吸管吸取待检样品溶液垂直滴加2-3滴于加样孔，液体流动时开始计时，反应5min，判定结果，其他时间判定无效。

3、分析检测结果

阴性（-）：T线和C线都显色，表示样品中多菌灵和甲基硫菌灵药物浓度低于检测限，如图3（a）。

阳性（+）：T线无显色C线显色，表示样品中多菌灵和甲基硫菌灵药物浓度等于或高于检测限，如图3（b）。

无效：未出现C线，表明不正确的操作过程或试纸已变质失效，如图3（c）。在此情况下，应再次仔细阅读说明书，并用新的试纸卡重新测试。

实施例3样品检测实例

1、检测限试验

取空白干农作物样本，在其中分别添加多菌灵至终浓度为0.5、1、1.5、3、5mg/kg，取试纸进行检测，每个样本重复测定三次。

用试纸检测干农作物样本时，当其中多菌灵添加浓度为0.5、1mg/kg时，试纸上显示出肉眼可见的两条红色线条，成阴性；当其中多菌灵添加浓度为1.5、3、5mg/kg时，试纸质控线显示，但检测线不显示，成阳性；表明本试纸对干农作物样本中，多菌灵的检测线为1.0mg/kg。

取新鲜农作物样本，在其中分别添加多菌灵至终浓度为0.2、0.4、0.6、0.8、1mg/kg，取试纸进行检测，每个样本重复测定三次。

用试纸检测新鲜农作物样本时，当其中多菌灵添加浓度为0.2、0.4mg/kg时，试纸上显示出肉眼可见的两条红色线条，成阴性；当其中多菌灵添加浓度为0.6、0.8、1mg/kg时，试纸质控线显示，但检测线不显示，成阳性；表明本试纸对新鲜农作物中，多菌灵的检测线为0.6mg/kg。

2、假阳性率、假阴性率试验

取已知多菌灵含量大于1.0mg/kg的干农作物阳性样本20份和含量小于1.0mg/kg干农作物阴性样本20份；已知多菌灵含量大于0.6mg/kg的新鲜农作物阳性样本20份和含量小于0.6mg/kg新鲜农作物阴性样本20份用三批试纸进行检测，计算其阴阳性率。结果见表1、表2。

结果表明：用3个批次生产的试纸检测阳性样本时，结果全为阳性，可知阳性样本符合率为100%，假阴性率为0；检测20份阴性样本时，结果全为阴性，可知阴性符合率为100%。说明本发明的检测多菌灵和甲基硫菌灵残留的试纸可以对农作物中多菌灵和甲基硫菌灵残留进行快速检测。

3、特异性试验

特异性常用交叉反应率表示，是指抗体与结构不同的抗原决定簇发生结合的能力。将常检的三唑醇、三唑醇、吡虫啉、甲霜灵100ug/L的样品，用多菌灵胶体金试纸进行检测。结果显示，用该试纸检测三唑醇、三唑醇、吡虫啉、甲霜灵100ug/L时，试纸质控线和检测线均显色，呈现阴性，说明本试纸对这些药物无交叉反应。

Claims

1.一种可同时检测农作物中多菌灵和甲基硫菌灵残留的试纸，包括样品吸收垫（1）、结合物释放垫（2）、反应膜（3）、吸水垫（4）和底板（7），其特征在于：所述反应膜（3）上具有包被有多菌灵偶联抗原的检测线（5）和包被有羊抗鼠抗抗体的质控线（6），所述结合物释放垫（2）包被有多菌灵单克隆-胶体金标记物。

2.如权利要求1所述的试纸，其特征在于：所述多菌灵偶联抗原是由多菌灵半抗原与载体蛋白偶联得到，所述载体蛋白可为鼠血清蛋白、甲状腺蛋白、牛血清白蛋白、兔血清蛋白、人血清蛋白、卵清蛋白、血蓝蛋白或纤维蛋白原。

3.如权利要求1所述的试纸，其特征在于：所述多菌灵单克隆-胶体金标记物是将多菌灵单克隆抗体加入胶体金中得到，其中所述胶体金是由柠檬酸三钠与氯金酸反应制取得到。

4.如权利要求3所述的试纸，其特征在于：所述多菌灵单克隆抗体是用多菌灵半抗原-载体蛋白偶联物免疫小鼠，将小鼠脾细胞和骨髓瘤细胞通过融合、筛选得到。

5.如权利要求2或4所述的试纸，其特征在于：所述多菌灵半抗原是由多菌灵与马来酸酐反应得到，其分子结构式为：

。

6.如权利要求1所述的试纸，其特征在于：所述样品吸收垫（1）、结合物释放垫（2）、反应膜（3）、吸水垫（4）依次粘贴在底板（7）上，其中所述结合物释放垫（2）1/3-1/2被覆盖于样品吸收垫（1）下。

7.一种制备权利要求1-6任一项所述试纸的方法，其包括以下步骤：

1）制备包被有多菌灵单克隆抗体-胶体金标记物的结合物释放垫（2）；

3）将1）和2）制备好的结合物释放垫（2）、反应膜（3）与样品吸收垫（1）、吸水垫（4）和底板（7）组装成所述试纸。

8.如权利要求1-6任一项所述试纸的应用，它包括步骤：

（1）样品前处理；

（2）用所述试纸进行检测；

（3）分析检测结果。