CN112986564A - 一种多菌灵半抗原、人工抗原及其免疫荧光层析检测卡 - Google Patents

一种多菌灵半抗原、人工抗原及其免疫荧光层析检测卡 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种多菌灵半抗原、人工抗原及其免疫荧光层析检测卡与检测方法，其结构式为：
Figure 100004_DEST_PATH_IMAGE001
，该半抗原不仅具有活性基团，同时在一个半抗原分子结构中还具有两个多菌灵分子的特征结构，突出半抗原在载体蛋白上的空间位置和抗原决定簇，有效的增强了识别位点，提高了小分子半抗原的免疫原性；且使用半抗原制得的人工抗原及单克隆抗体，可快速、便捷地实现多菌灵的定量检测，本发明属于免疫化学技术领域。

Description

一种多菌灵半抗原、人工抗原及其免疫荧光层析检测卡
技术领域
本发明属于免疫化学技术领域，具体涉及一种多菌灵半抗原、人工抗原及其免疫荧光层析检测卡。
背景技术
多菌灵又名棉萎灵或苯并咪唑44号，是一种良好的广谱、高效、内吸性杀菌剂，对子囊菌、担子菌以及半知菌类中的大多数病原菌都有效，广泛应用于农作物、中草药、烟草等的病害防治工作中。多菌灵化学性质稳定，能被植物的种子、根和叶吸收，残效期较长，对人、畜等有一定的毒性。多菌灵化学结构式如下：
Figure 166633DEST_PATH_IMAGE001
目前，国内外对多菌灵残留的检测方法主要有高效液相色谱-质谱联用法、高效液相色谱法。仪器方法具备检测灵敏度高、特异性强等优势，但是检测样本前处理繁琐、耗时，样品还需提取和净化处理，同时仪器检测方法需要昂贵的大型仪器和设备，配备专业的检测技术人员进行操作和管理，无法进行现场大规模检测，时效性差，难以推广。
免疫层析技术是一种将免疫检测技术、色谱层析技术和免疫标记技术相结合的固相膜免疫分析方法。这种技术，通常借助选用不同的生物标记物获取不同强度的测量信号来进行结果分析。纳米粒子一般是颗粒尺寸在100-500nm范围的超微粒子。与其他粒子相比，纳米粒子具有大的表面积、其光、热、磁敏感特性和表面的稳定性较高。同时纳米材料用于生物分析，可以大大改善标记物的性能，显著提升现有分析方法的灵敏度和特异性，其在抗原抗体的标记上具有很大的应用潜能。然而得到高亲和力高特异性的单克隆抗体是免疫检测的前提，其中人工抗原的合成是其中重要的一步。
由于多菌灵是小分子物质（分子量MW<1000Dal），本身不具有诱导机体产生抗体的能力，需要和蛋白载体偶联后，才能具有免疫原性。但多菌灵结构中没有可以直接利用的活性基团如-COOH、-NH2、-OH或-SH2等，因此，要实现多菌灵和载体蛋白的偶联，首先要进行多菌灵半抗原的设计和合成。
发明内容
针对上述问题，本发明的第一个目的是提供具有两个多菌灵分子的特征结构，使得半抗原在载体蛋白上的空间位置更加突出，有效的增强了识别位点，提高了小分子半抗原的免疫原性和免疫反应性。
本发明的第二个目的是提供一种用于免疫荧光层析技术的多菌灵人工抗原及其抗体。
本发明的第三个目的是提供灵敏度高，可快速、便捷地实现多菌灵检测的免疫荧光层析检测卡。
本发明的第四个目的是提供多菌灵定量检测试剂卡的检测方法。
为解决上述技术问题为此，本发明提供的第一个技术方案是这样的：
一种多菌灵半抗原，多菌灵半抗原的结构式为：
Figure 333303DEST_PATH_IMAGE002
式Ⅳ。
上述的多菌灵半抗原的制备方法，所述的多菌灵半抗原通过下述步骤制得的：
1）将化合物Ⅰ与化合物Ⅱ按照摩尔比（2~2.5）:1溶于甲苯/水的混合溶液中，采用酸性物质调节pH3~4，60~70℃反应6 h以上，获得化合物Ⅲ；
2）将化合物Ⅲ溶于甲醇中，加入丁二酸酐，所述的丁二酸酐与式Ⅲ所示的化合物的摩尔比为（2~3）：1；在40~50℃反应12 h以上，获得多菌灵半抗原化合物Ⅳ；
所述的式Ⅰ~Ⅳ如下：
Figure 600337DEST_PATH_IMAGE003
。
作为本发明的进一步优选，上述的多菌灵半抗原的制备方法，步骤1）中，所述的酸性物质为浓盐酸。
作为本发明的进一步优选，上述的多菌灵半抗原的的制备方法，步骤1）中，所述的混合溶液为等体积比甲苯和水。
本发明提供的第二个技术方案是这样的：
一种多菌灵人工抗原，是采用上述的多菌灵半抗原与载体蛋白偶联得到，多菌灵人工抗原的结构式为：
Figure 127133DEST_PATH_IMAGE004
；
式V；
所述的载体蛋白为牛血清白蛋白或卵清蛋白或人血清白蛋白或血蓝蛋白等。
本发明提供的第三技术方案是这样的：
一种多菌灵单克隆抗体，是采用上述的多菌灵半抗原与载体血蓝蛋白偶联为免疫原，与等体积弗氏佐剂乳化后，免疫小鼠，取免疫后小鼠脾细胞与SP20细胞融合，融合后的细胞在HAT培养基中筛选，5天后以完全培养基替换HAT培养基进行培养，用ELISA对细胞上清进行检测，将检测结果为强阳性的孔内细胞进行有限稀释法克隆培养，均呈阳性的孔内细胞即为分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞，将杂交瘤细胞放大培养后，接种至小鼠腹腔，产生含抗体的腹水，用辛酸-硫酸铵沉淀法纯化腹水，即可得到高纯度、高特异性的单克隆抗体。
本发明提供的第四个技术方案是这样的：
一种多菌灵免疫荧光层析检测卡，包括PVC底板，所述的PVC底板上从左至右依次衔接有吸水纸垫、反应膜、结合垫、样品垫，所述的反应膜设有横向平行排布的检测T线和质控C线，所述的检测T线上包被有权利要求书5所述的多菌灵人工抗原，所述的质控C线包被有兔IgG；所述的结合垫上喷涂有多菌灵单克隆抗体-荧光微球标记物和羊抗兔IgG-荧光微球标记物的混合物。
所述的反应膜通过下述步骤制得的：将多菌灵人工抗原加到包被缓冲液中混合均匀划膜到反应膜的检测T线，将兔IgG加到包被缓冲液中混合均匀划膜到反应膜的质控C线。
所述的结合垫是将多菌灵单克隆抗体-荧光微球标记物和羊抗兔IgG-荧光微球标记物按照体积比20~80:1混合均匀，按8μl/cm、0.02 MPa喷至剪裁后的玻璃纤维上，37℃16h~18h得到的。
与现有技术相比，本发明提供的技术方案具有如下技术优点：
1、本发明合成了由多菌灵的类似物2-氨基苯并咪唑经两步反应制备得到具有羧基的半抗原，半抗原与载体蛋白偶联制备免疫原；基于异源包被原则，在目标分子和载体之间有一定的连接活性臂；保留了多菌灵的特征结构，对其电子云密度影响较小；保证半抗原和大分子载体蛋白偶联后能够最大限度的被识别，同时连接臂远离半抗原分子的特征性基团，从而突出半抗原的特征性结构，突出其抗原决定簇，从而提高检测的灵敏度。
2、本发明在小分子药物合成前期引入活性手臂，本发明中一个半抗原分子同时具有两个多菌灵分子的特征结构，使得半抗原在载体蛋白上的空间位置更加突出，有效的增强了识别位点，提高了小分子半抗原的免疫原性。
3、将多菌灵人工抗原用于免疫荧光层析技术，可快速、便捷地实现多菌灵的定量检测，本发明中制备的多菌灵免疫荧光层析检测卡对多菌灵的检测灵敏度可达2.0 μg/L，另外该检测卡准确性高、均一性好，线性范围宽，可以满足市场即时检测的要求。
附图说明
图1是本发明提供的多菌灵半抗原ESI-MS谱图；
图2是本发明提供的多菌灵的免疫荧光层析检测卡检测原理示意图。
图中符合代表的组件及其类似组件如下：
PVC底板-1；结合垫-3、样品垫-2；反应膜-4；吸水纸垫-5；检测T线-T；质控C线-C。
具体实施方式
为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合具体实施例对本发明的具体实施方式做详细的说明。
实施例1
本实施例提供的一种多菌灵半抗原，其通过下述方法制得的：
（1）取2.0 g（22.46 mmol）化合物Ⅱ于100 ml圆底烧瓶中，再依次加入20 ml甲苯，20 ml纯化水和6.6 g（49.42 mmol）化合物Ⅰ，搅拌均匀后加热到65℃，并在此温度下滴加质量分数37%浓盐酸至pH为3~4，反应6h以上，反应完毕，冷却至室温，过滤得固体，固体用纯水和乙醇淋洗，烘干得1.2g化合物Ⅲ；
（2）将1.2 g（4.81 mmol）化合物Ⅲ溶于15 ml无水甲醇中，加入丁二酸酐1.0g（9.62 mmol），40~50℃反应12 h，反应完毕，冷却至室温，过滤得固体，固体用甲醇淋洗，烘干得多菌灵半抗原0.6g，半抗原的质谱图如图1所示，ESI-MS：348 [M-1]。
实施例2
本实施例提供的一种多菌灵半抗原，其通过下述方法制得的：
（1）取2.0g（22.46 mmol）化合物Ⅱ于100 ml圆底烧瓶中，再依次加入20 ml甲苯，20 ml纯化水和6.6 g（44.92 mmol）化合物Ⅰ，搅拌均匀后加热到65℃，并在此温度下滴加质量分数37%浓盐酸至pH为3~4，反应6h以上，反应完毕，冷却至室温，过滤得固体，固体用纯水和乙醇淋洗，烘干得0.7g化合物Ⅲ；
（2）将0.7 g（2.81 mmol）化合物Ⅲ溶于10 ml无水甲醇中，加入丁二酸酐0.6g（5.62 mmol），40~50℃反应12 h，反应完毕，冷却至室温，过滤得固体，固体用甲醇淋洗，烘干得多菌灵半抗原0.3g，半抗原的质谱图如下图1所示，ESI-MS：348 [M-1]。
实施例3
本实施例提供的一种多菌灵半抗原，其通过下述方法制得的：
（1）取2.0 g（22.46mmol）化合物Ⅱ于100 ml圆底烧瓶中，再依次加入20 ml甲苯，20 ml纯化水和7.5 g（56.15 mmol）化合物Ⅰ，搅拌均匀后加热到65℃，并在此温度下滴加质量分数37%浓盐酸至pH为3~4，反应6h以上，反应完毕，冷却至室温，过滤得固体，固体用纯水和乙醇淋洗，烘干得2.4g化合物Ⅲ；
（2）将2.2g（8.82 mmol）化合物Ⅲ溶于15 ml无水甲醇中，加入丁二酸酐2.6g（26.47 mmol），40~50℃反应12 h，反应完毕，冷却至室温，过滤得固体，固体用甲醇淋洗，烘干得多菌灵半抗原1.1g，半抗原的质谱图如下图1所示，ESI-MS：348 [M-1]。
实施例4
本实施例提供载体蛋白为牛血清蛋白的多菌灵人工抗原的合成方法如下：
取10 mg实施例1中的半抗原，溶解于0.5 ml二甲基甲酰胺（DMF）中，搅拌充分后，加入5 mg EDC和5 mg N-羟基琥珀酰亚胺（NHS），室温下搅拌4 h，即可得到半抗原活化酯；
称取40 mg牛血清白蛋白（BSA），使其充分溶解在4 ml的浓度为0.01 mol/L的PBS溶液中，形成载体蛋白溶液，在搅拌下将所述半抗原活化酯逐滴缓慢滴加至所述载体蛋白溶液中，并在室温下搅拌16~24 h；
上述步骤制得的溶液用0.01 mol/L的 PBS 室温透析3天，每天换3次透析液，以除去未反应的小分子物质；分装，于4℃保存备用。
实施例5
本实施例提供载体蛋白为血蓝蛋白的多菌灵人工抗原的合成方法如下：
取5 mg实施例1中的半抗原，溶解于0.5 ml二甲基甲酰胺（DMF）中，搅拌充分后，加入5 mg EDC和5 mg N-羟基琥珀酰亚胺（NHS），室温下搅拌4 h，即可得到半抗原活化酯；
称取15 mg血蓝蛋白（KLH），使其充分溶解在4 ml的浓度为0.01 mol/L的PBS溶液中，形成载体蛋白溶液，在搅拌下将所述半抗原活化酯逐滴缓慢滴加至所述载体蛋白溶液中，并在室温下搅拌16~24 h；
上述步骤制得的溶液用0.01 mol/L的 PBS 室温透析3天，每天换3次透析液，以除去未反应的小分子物质；分装，于4℃保存备用。
实施例6
多菌灵单克隆抗体的制备
以上述载体蛋白为血蓝蛋白的多菌灵人工抗原为免疫原，与等体积弗氏佐剂乳化后，免疫BALB/C小鼠。每只鼠免疫剂量为50~100 μg，免疫间隔2周，免疫3次后，采小鼠尾部静脉血检测血清效价。如抗体效价不达要求，需加强免疫，待抗体效价不再升高后，以100 μg人工抗原进行皮下加强免疫，5天后取小鼠脾细胞与SP20细胞融合。融合后的细胞在HAT培养基中筛选，5天后以完全培养基替换HAT培养基进行培养。用ELISA对细胞上清进行检测，将检测结果为强阳性的孔内细胞进行有限稀释法克隆培养，经3次克隆培养检测后，均呈阳性的孔内细胞即为分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞。将杂交瘤细胞放大培养后，接种至小鼠腹腔，产生含抗体的腹水。用辛酸-硫酸铵沉淀法纯化腹水，即可得到高纯度、高特异性的单克隆抗体。
用含0.05%叠氮钠，pH7.4的磷酸盐缓冲液，将单克隆抗体稀释至4.0 mg/ml，4℃保存。
实施例7
多菌灵的免疫荧光层析检测卡的制备
免疫荧光层析检测中使用的多菌灵人工抗原的载体蛋白为牛血清白蛋白。
1、样品垫的制备
样品垫处理液配方：含0.5%酪蛋白、0.15M NaCl、1.5% PVP K30和0.5%Triton X-100的pH7.4 的0.01M的磷酸盐缓冲液；将样品垫处理液以50μl/cm2的浓度均匀涂布于玻璃纤维SB08上，45℃干燥16h。
2、结合垫的制备
微球结合垫喷涂有多菌灵单克隆抗体-荧光微球标记物和羊抗兔IgG-荧光微球标记物。
制备方法为：将多菌灵单克隆抗体或羊抗兔IgG在0.01M pH7.4的PBS中4℃透析过夜，4℃，10000~12000rpm条件下离心1h；取一离心管，加入1ml0.1M MES【2-（N-吗啡啉）乙磺酸）】缓冲液，加入荧光微球1mg，涡旋混匀；在上述离心管中加入200μL~500μL标记活化剂EDC【1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亚胺盐酸盐】和200μL~500μL NHS（N-羟基琥珀酰亚胺），旋转培养器上反应30min；将活化后的荧光微球20000g离心30min，弃上清，留取沉淀，加入5000μL淬灭剂（0.25%甲醇的0.1M的MES缓冲液），超声2s；在超声重悬后的荧光微球中加入50-200μg多菌灵单克隆抗体或羊抗兔IgG，涡旋混匀，置于旋转培养器上反应30min；加入2ml10%酪蛋白进行封闭，超声2s，间歇5s，重复3次，超声完成后置于旋转培养器上反应30min；19000g离心30min，吸去上清，留取沉淀，加入1ml荧光微球稀释液（含0.5%~2%酪蛋白、1%~5%蔗糖的pH9.0 0.1M的甘氨酸缓冲液），超声混匀制得多菌灵单克隆抗体-荧光微球标记物和羊抗兔IgG-荧光微球标记物，即T线标记物和C线标记物。将玻璃纤维裁切为（10±1）mm×（300±10）mm大小，将多菌灵单克隆抗体-荧光微球标记物和羊抗兔IgG-荧光微球标记物按20~80:1（V：V）混合均匀，按8μl/cm、0.02 MPa喷至剪裁后的玻璃纤维上，37℃16h~18h。
3、反应膜的制备
反应膜由包被多菌灵-BSA的检测T线和包被兔IgG的质控C线组成。
用含1%~3%蔗糖的pH 7.4的0.01M的磷酸盐缓冲液将多菌灵-BSA和兔IgG稀释到（0.1~0.5）mg/ml，作为检测T线和质控C线工作液；将硝酸纤维素膜粘贴到PVC底板的指定位置，用喷金划膜仪器在硝酸纤维膜上划线包被，相邻两线间距5mm，划线浓度均为（0.5~1）μl/cm；划完后置在45℃干燥箱中干燥48小时。
4、检测卡的组装和裁切
在粘贴反应膜4的PVC底板1的对应位置粘贴吸水纸垫5、结合垫3、样品垫2，制成大板，然后裁成宽度为0.395cm±0.05cm宽度的检测卡，如图2所示。
5检测卡的组装
将检测卡装入检测卡下盖的检测卡槽内，盖上检测卡上盖就是一条完整的检测卡，（4~30）℃储存，有效期2年。
实施例8
检测多菌灵免疫荧光层析检测卡的应用
1.样品的前处理
称取1.0±0.05g粉碎后待测样本至50ml离心管中，加入10ml70%的甲醇水溶液，涡旋震荡1min，3000rpm离心5min，取100μL上清液，加入500μL样本复溶液，混匀待测。
2.用检测卡检测
用微量移液器吸取100μL待测样本溶液，加入到检测卡加样孔中，室温孵育10分钟，插入免疫层析定量分析仪，进行测试。
3.分析检测结果
免疫层析定量分析仪按内置定标曲线将检测T线和质控C线荧光信号比值（T/C）转换成样本中多菌灵的浓度。
实施例9
检测多菌灵免疫荧光层析检测卡技术参数的确定
1、检测限实验
将空白农产品及烟草样本，重复测试10次，计算T/C均值（
Figure 264853DEST_PATH_IMAGE005
）和标准偏差（SD），然后用
Figure 333916DEST_PATH_IMAGE006
- 2*SD，所得值代入剂量-反应曲线中，计算得出本检测卡对农产品中多菌灵的灵检测限为2.0 μg/kg。
2、回收率测试
将标准品加入到阴性样本中至多菌灵浓度为4μg/kg、8μg/kg、16μg/kg；每浓度重复测试10次，测试浓度除以加标浓度后得出回收率。结果如表1，由此可以看出，低中高三个浓度的回收率都在80%-120%之间，因此本检测方法具有较高的准确度。
表1 回收率测试结果
加标浓度（μg/kg） 测试浓度（μg/kg） 回收率
5 3.32 83%
20 7.20 90%
80 15.68 98%
3、线性范围的测试
将多菌灵标准品用标准品稀释液分别稀释到0 μg/kg、5 μg/kg、10 μg/kg、20 μg/kg、40 μg/kg、80 μg/kg、160μg/kg、320μg/kg、640μg/kg、1280μg/kg。
将以上各浓度样本分别取100μL，加入至制备好的多菌灵免疫荧光层析检测卡中，每浓度重复测试3次。
反应10min后，将试纸放入免疫层析定量分析仪中，读取T/C值，通过内置标准曲线进行曲线拟合和浓度的计算。
测试结果显示：在检测5~80μg/kg浓度的多菌灵线性拟合关系较好，r＞0.9900，当多菌灵浓度增加到160μg/kg时，线性拟合r值小于0.9900，T/C下降减缓，多菌灵在320~640μg/kg时T/C值变化平缓，多菌灵浓度达到640μg/kg时，T/C值反而降低。因此本检测的最大检测范围可以达到80μg/kg。
4、特异性测试
用多菌灵免疫荧光层析检测卡检测1mg/L的甲基硫菌灵、菌苯灵、噻菌灵，结果均小于2.0 μg/kg，说明本检测卡与甲基硫菌灵、菌苯灵、噻菌灵无交叉反应，特异性良好。
5.均一性测试
取多菌灵质控品分别稀释到5 μg/kg、15 μg/kg、45μg/kg；用本方法检测卡每个浓度重复测试10次，计算测试浓度的变异系数。结果见表2，由此可以看出，本试剂盒检测的变异系数均小于15%（三个浓度分别为12.54%、9.87%和8.64%），因此本检测方法具有较高的精密度。
表2 均一性测试结果
浓度（μg/kg） CV
质控Ⅰ 5 12.54%
质控Ⅱ 15 9.87%
质控Ⅲ 45 8.64%
以上所述实施例仅表达了本发明几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (10)

1.一种多菌灵半抗原，其特征在于，多菌灵半抗原的结构式为式Ⅳ：
Figure DEST_PATH_IMAGE001
式Ⅳ。
2.权利要求1所述的多菌灵半抗原的制备方法，其特征在于，所述的多菌灵半抗原通过下述步骤制得的：
（1）将化合物Ⅰ与化合物Ⅱ按照摩尔比（2~2.5）:1溶于甲苯/水的混合溶液中，采用酸性物质调节pH3~4，60~70℃反应6 h以上，获得化合物Ⅲ；
（2）将化合物Ⅲ溶于甲醇中，加入丁二酸酐，所述的丁二酸酐与式Ⅲ所示的化合物的摩尔比为（2~3）：1；在40~50℃反应12 h以上，获得多菌灵半抗原化合物Ⅳ；
所述的式Ⅰ~Ⅳ如下：
Figure 441418DEST_PATH_IMAGE002
。
3.根据权利要求2所述的多菌灵半抗原的制备方法，其特征在于，步骤1）中，所述的酸性物质为浓盐酸。
4.根据权利要求2所述的多菌灵半抗原的制备方法，其特征在于，步骤1）中，所述的混合溶液为等体积比甲苯和水。
5.一种多菌灵人工抗原，其特征在于，是采用权利要求1所述的多菌灵半抗原与载体蛋白偶联得到，多菌灵人工抗原的结构如式V所示：
Figure DEST_PATH_IMAGE003
式V；
所述的载体蛋白为牛血清白蛋白或卵清蛋白或人血清白蛋白或血蓝蛋白。
6.一种多菌灵单克隆抗体，其特征在于，是采用权利要求1项所述的多菌灵半抗原与载体血蓝蛋白偶联为免疫原，与等体积弗氏佐剂乳化后，免疫小鼠，取免疫后小鼠脾细胞与SP20细胞融合，融合后的细胞在HAT培养基中筛选，5天后以完全培养基替换HAT培养基进行培养，用ELISA对细胞上清进行检测，将检测结果为强阳性的孔内细胞进行有限稀释法克隆培养，均呈阳性的孔内细胞即为分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞，将杂交瘤细胞放大培养后，接种至小鼠腹腔，产生含抗体的腹水，用辛酸-硫酸铵沉淀法纯化腹水，即可得到高纯度、高特异性的多菌灵单克隆抗体。
7.一种多菌灵免疫荧光层析检测卡，包括PVC底板，所述的PVC底板上从左至右依次衔接有吸水纸垫、反应膜、结合垫、样品垫，其特征在于，所述的反应膜设有横向平行排布的检测T线和质控C线，所述的检测T线上包被有权利要求书5所述的多菌灵人工抗原，所述的质控C线包被有兔IgG；所述的结合垫上喷涂有多菌灵单克隆抗体-荧光微球标记物和羊抗兔IgG-荧光微球标记物的混合物。
8.据权利要求7所述的多菌灵免疫荧光层析检测卡，其特征在于，所述的多菌灵人工抗原的载体为牛血清白蛋白或卵清蛋白或人血清白蛋白。
9.根据权利要求7所述的多菌灵免疫荧光层析检测卡，其特征在于，所述的反应膜通过下述步骤制得的：将多菌灵人工抗原加到包被缓冲液中混合均匀划膜到反应膜的检测T线，将兔IgG加到包被缓冲液中混合均匀划膜到反应膜的质控C线。
10.根据权利要求7所述的多菌灵免疫荧光层析检测卡，其特征在于，所述的结合垫是将多菌灵单克隆抗体-荧光微球标记物和羊抗兔IgG-荧光微球标记物按照体积比20~80:1混合均匀，按8μl/cm、0.02 MPa喷至剪裁后的玻璃纤维上，37℃16h~18h得到的。
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