CN108640850A - 一种孔雀石绿半抗原、人工抗原及其在荧光定量免疫层析中的应用 - Google Patents

一种孔雀石绿半抗原、人工抗原及其在荧光定量免疫层析中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种孔雀石绿半抗原、人工抗原及其在荧光定量免疫层析中的应用，半抗原结构中同时具有两个孔雀石绿分子的结构，使得半抗原在载体蛋白中的空间位置更加突出，增加了识别位点，有效的提高了小分子半抗原的免疫原性，也提高了人工抗原的效价，将孔雀石绿人工抗原结合ELISA检测技术，对孔雀石绿的最低检测限为0.04μg/L；使用本发明中的人工抗原制备的荧光定量免疫层析试纸条配合本发明中的检测方法，可快速、便捷地实现孔雀石绿的检测，检测灵敏度可达0.2μg/L。

Description

一种孔雀石绿半抗原、人工抗原及其在荧光定量免疫层析中 的应用
技术领域
本发明属于免疫化学技术领域，具体涉及一种孔雀石绿半抗原、人工抗原及其在荧光定量免疫层析中的应用。
背景技术
孔雀石绿(Malachite Green，MG)又名碱性绿、盐基块绿、孔雀绿和中国绿，为带有金属光泽的绿色结晶体，化学名称为四甲基代二氨基三苯甲烷，分子式为C23H25N2Cl，分子量为364.92，易溶于水、甲醇和乙醇，溶液呈蓝绿色。孔雀石绿是一种人工合成的三苯基甲烷类工业染料，主要用于制陶、纺织、皮革和食品等产业上的颜色剂和细胞化学上的染色剂等。孔雀石绿具有抗菌、杀虫等功效，是药用染料中抗菌效力较强的一类，被广泛用作驱虫剂和杀虫剂，以杀灭水产动物体外的寄生虫，原生动物和鱼卵中的霉菌等。从1933年起其作为驱虫剂、杀菌剂、防腐剂广泛用于预防与治疗各类水产动物的水霉病、鳃霉病和小瓜虫病等，特别在治疗水霉病上具有非常有效的作用。但近年来国内外的研究表明，孔雀石绿为潜在的致癌、致畸、致突变物质，而其代谢物无色孔雀石绿被确证具有高毒、高残留和三致作用，因此，孔雀石绿的使用污染水环境，其代谢物无色孔雀石绿对水生物及人体健康造成极大危害。美国、加拿大、日本、欧盟等许多国家都将孔雀石绿列为水产养殖禁用药物，欧盟规定水产品中孔雀石绿和无色孔雀石绿总量不得超过2μg/kg，我国于2002年5月也将孔雀石绿列入《食品动物禁用的兽药及其化合物清单》中。但由于孔雀石绿低廉的价格及在水霉病防治方面较好的效果，因此仍有不法商贩在使用，孔雀石绿事件时有发生。孔雀石绿的非法使用给我们国家经济和人民健康造成了极其严重的后果，其残留检测问题一直备受关注。
目前对孔雀石绿及隐孔雀石绿残留检测主要是用气相色谱法和高效液相色谱法，但设备昂贵且操作繁琐，不适用于现场快速检测。现有的酶联免疫分析方法虽然灵敏度高、通量大，但也需专业人员操作，且检测时间较长，同样也无法满足现场快速筛查的需求；而胶体金法虽然具备高通量、操作简单、检测时间短和无需专业技术人员操作等优点，但其较差的灵敏度，也使得胶体金法无法满足国家检测标准的要求。而荧光免疫层析技术作为一种新的快速检测的定量方法，是基于免疫学原理和胶体金免疫层析技术发展起来的，该技术结合了ELISA法的高灵敏度和胶体金法的快速的特点，检测时间只需10～15min，但检测灵敏度是胶体金法的3～5倍，具有操作简便、高灵敏度、高通量和快速的特点。
发明内容
本发明的目的在于提供一种孔雀石绿半抗原、人工抗原及其在荧光定量免疫层析中的应用。
本发明所采取的技术方案是：
一种孔雀石绿半抗原，其特征在于，孔雀石绿半抗原的结构式为：
进一步地，孔雀石绿半抗原的制备方法包括以下步骤：
1)将化合物Ⅰ与化合物Ⅱ溶于丙酮，加入缚酸剂，在60～65℃反应2～5h，获得化合物Ⅲ；
2)将化合物Ⅲ溶于无水乙醇，加入N,N-二甲基苯胺和缩合剂，在80～85℃反应15～26h，获得化合物Ⅳ；
3)采用的是6M的LiOH水溶液水解化合物Ⅳ，水解体系的pH值为10～12，水解反应时间为15～26h，反应完成后加入1M稀盐酸调节pH值至4～5，过滤即可得孔雀石绿半抗原Ⅴ；
式Ⅰ～Ⅴ如下：
进一步地，步骤1)中，缚酸剂为K2CO3，化合物Ⅰ与化合物Ⅱ的摩尔比为(2～2.5):1，缚酸剂与化合物Ⅱ的摩尔比为(1.5～2):1。
进一步地，步骤2)中，缩合剂为ZnCl2，N,N-二甲基苯胺、缩合剂的摩尔比为1:1，缩合剂与式Ⅲ所示的化合物的摩尔比为(5～6)：1。
一种孔雀石绿人工抗原，为上述的孔雀石绿半抗原与载体蛋白偶联得到，孔雀石绿人工抗原的结构式为：
载体蛋白为牛血清白蛋白、卵清蛋白、人血清白蛋白或血蓝蛋白中的任意一种。
上述孔雀石绿人工抗原制备的孔雀石绿单克隆抗体，孔雀石绿人工抗原的载体蛋白为血蓝蛋白。
上述孔雀石绿人工抗原和上述孔雀石绿单克隆抗体在ELISA检测方法中的应用。
上述孔雀石绿人工抗原和上述孔雀石绿单克隆抗体在荧光定量免疫层析中的应用。
一种孔雀石绿荧光定量免疫层析试纸条，试纸条中包括包被有上述孔雀石绿人工抗原的反应膜，孔雀石绿人工抗原的载体蛋白为牛血清蛋白，其制备方法包括以下步骤：
1)制备包被有人工抗原和兔IGg的反应膜：将载体蛋白为牛血清蛋白的孔雀石绿人工抗原加到包被缓冲液中混合均匀喷到反应膜的检测区，将兔IGg加到包被缓冲液中混合均匀喷到反应膜的控制区，检测区和控制区相互分离，干燥处理后保存备用；
2)样品垫的制备：将裁剪好的空白样品垫浸泡在样品垫处理液中浸泡，取出样品垫干燥处理后保存备用；
3)荧光定量免疫层析试纸条的组装：在背衬中部叠置反应膜，两端分别叠置样品垫和吸水垫，反应膜和吸水垫、样品垫相搭连，检测区靠近样品垫，控制区靠近吸水垫，得到试纸板，将试纸板切割成试纸条，将试纸条装载于试纸卡内，得荧光定量免疫层析试纸条。
一种使用上述孔雀石绿荧光定量免疫层析试纸条检测孔雀石绿的方法：
1)荧光微球标记的孔雀石绿单克隆抗体的制备：将荧光微球活化后与孔雀石绿单克隆抗体偶联，离心除杂，加入荧光缓冲液重悬荧光微球，得到荧光微球标记的孔雀石绿单克隆抗体；
2)荧光微球标记的孔雀石绿单克隆抗体检测液的制备：用荧光缓冲液将荧光微球标记的孔雀石绿单克隆抗体稀释，得到荧光微球标记的孔雀石绿单克隆抗体检测液；
3)用PBS缓冲液配备系列浓度的孔雀石绿标准溶液，取荧光微球标记的孔雀石绿单克隆抗体检测液和标准溶液混匀后滴加到荧光定量免疫层析试纸条的样品区，用荧光定量检测仪读取T/C值，通过标准溶液浓度对应的T/C值建立标准曲线，测定待测样品的T/C值，根据标准曲线即可实现孔雀石绿的快速定量检测。
本发明的有益效果是：
1、本发明在小分子药物合成前期引入活性手臂，保留孔雀石绿的结构特征，对其电子云密度无影响；
2、本发明中一个半抗原分子同时具有两个孔雀石绿分子的结构，使得半抗原在载体蛋白中的空间位置更加突出，增加了识别位点，有效的提高了小分子半抗原的免疫原性，也提高了人工抗原的效价；
3、将孔雀石绿人工抗原结合ELISA检测技术，对孔雀石绿的最低检测限为0.04μg/L；
4、将孔雀石绿人工抗原用于荧光定量免疫层析技术，可快速、便捷地实现孔雀石绿的检测，本发明中制备的孔雀石绿荧光定量免疫层析试纸条对孔雀石绿的检测灵敏度可达0.2μg/L，另外该试纸条精密度高，且可在室温下稳定保存一年以上，可以满足市场在保存和运输过程中的要求。
附图说明
图1为孔雀石绿半抗原的质谱图；
图2为孔雀石绿ELISA检测结果标准曲线；
图3为荧光定量免疫层析定量检测标准曲线。
具体实施方式
下面将结合实施例进一步阐述本发明，应理解，以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的保护范围。
半抗原合成
实施例1～3中孔雀石绿半抗原的合成线路图如下：
实施例1
一种孔雀石绿半抗原，其制备方法如下：
(1)取2.0g(7.7mmol)化合物Ⅱ于50ml圆底烧瓶中，再依次加入20ml丙酮，2.6g(19.3mmol)化合物Ⅰ和2.1g(15.4mmol)碳酸钾，于65℃反应5h，反应完毕，减压去溶剂，加入40ml纯化水，用乙酸乙酯萃取两次，再减压去溶剂，柱层析纯化得2.2g化合物Ⅲ(乙酸乙酯/石油醚，1/7，v/v)；
(2)将1.2g(3.3mmol)化合物Ⅲ溶于15ml无水乙醇中，加入N,N-二甲基苯胺2.0g(16.5mmol)和氯化锌2.2g(16.5mmol)，80℃回流26h，反应完毕，减压去溶剂，加入40ml纯化水，用乙酸乙酯萃取，再减压去溶剂，柱层析纯化得0.8g化合物Ⅳ(乙酸乙酯/石油醚，1/4，v/v)；
(3)将0.8g(1.0mmol)的化合物Ⅳ溶于5ml乙醇中，加入6M的氢氧化锂溶液将化合物Ⅳ的乙醇溶液的pH值调至10，室温反应15h，然后加入20ml纯化水，所得溶液通过1M的稀盐酸将pH值调至4，过滤，烘干得孔雀石绿半抗原0.4g，孔雀石绿半抗原的质谱图如图1所示，ESI-MS：790[M+1]。
实施例2
一种孔雀石绿半抗原，其制备方法如下：
(1)取2.0g(7.7mmol)化合物Ⅱ于50ml圆底烧瓶中，再依次加入20ml丙酮，2.1g(15.4mmol)化合物Ⅰ和1.7g(11.6mmol)碳酸钾，于60℃反应2h，反应完毕，减压去溶剂，加入40ml纯化水，用乙酸乙酯萃取两次，再减压去溶剂，柱层析纯化得1.9g化合物Ⅲ(乙酸乙酯/石油醚，1/7，v/v)；
(2)将1.2g(3.3mmol)化合物Ⅲ溶于13ml无水乙醇中，加入N,N-二甲基苯胺2.4g(19.8mmol)和氯化锌2.6g(19.8mmol)，85℃回流15h，反应完毕，减压去溶剂，加入40ml纯化水，用乙酸乙酯萃取，再减压去溶剂，柱层析纯化得1.1g化合物Ⅳ(乙酸乙酯/石油醚，1/4，v/v)；
(3)将1.1g(1.4mmol)的化合物Ⅳ溶于10ml乙醇中，加入6M的氢氧化锂溶液将化合物Ⅳ的乙醇溶液的pH值调至12，室温反应26h，然后加入40ml纯化水，所得溶液通过1M的稀盐酸将PH值调至5，过滤，烘干得孔雀石绿半抗原0.5g。
实施例3
一种孔雀石绿半抗原，其制备方法如下：
(1)取2.0g(7.7mmol)化合物Ⅱ于50ml圆底烧瓶中，再依次加入20ml丙酮，2.6g(19.3mmol)化合物Ⅰ和2.1g(15.4mmol)碳酸钾，于65℃反应3h，反应完毕，减压去溶剂，加入40ml纯化水，用乙酸乙酯萃取两次，再减压去溶剂，柱层析纯化得2.1g化合物Ⅲ(乙酸乙酯/石油醚，1/7，v/v)；
(2)将1.2g化合物Ⅲ溶于13ml无水乙醇中，加入N,N-二甲基苯胺2.0g(16.5mmol)和氯化锌2.2g(16.5mmol)，83℃回流20h，反应完毕，减压去溶剂，加入40ml纯化水，用乙酸乙酯萃取，再减压去溶剂，柱层析纯化得0.9g化合物Ⅳ(乙酸乙酯/石油醚，1/4，v/v)；
(3)将0.9g化合物Ⅳ溶于10ml乙醇中，加入6M的氢氧化锂溶液将化合物Ⅳ的乙醇溶液的pH值调至11，室温反应20h，然后加入40ml纯化水，所得溶液通过1M的稀盐酸将pH值调至4.5，过滤，烘干得孔雀石绿半抗原0.5g。
孔雀石绿人工抗原的合成
载体蛋白为牛血清蛋白的孔雀石绿人工抗原的合成方法如下：
(1)取10mg实施例1中的半抗原，溶解于0.5ml二甲基甲酰胺(DMF)中，搅拌充分后，加入5mg EDC和5mg N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，室温下搅拌4h，即可得到半抗原活化酯；
(2)称取30mg牛血清白蛋白(BSA)，使其充分溶解在4ml的浓度为0.01mol/L的PBS溶液中，形成载体蛋白溶液，在搅拌下将所述半抗原活化酯逐滴缓慢滴加至所述载体蛋白溶液中，并在室温下搅拌16～24h；
(3)步骤(2)制得的溶液用0.01mol/L的PBS室温透析3天，每天换3次透析液，以除去未反应的小分子物质；
(4)分装，于4℃保存备用。
载体蛋白为血蓝蛋白的孔雀石绿人工抗原的合成方法如下：
(1)取10mg实施例1中的半抗原，溶解于0.5ml二甲基甲酰胺(DMF)中，搅拌充分后，加入5mg EDC和5mg N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，室温下搅拌4h，即可得到半抗原活化酯；
(2)称取30mg血蓝蛋白(KLH)，使其充分溶解在4ml的浓度为0.01mol/L的PBS溶液中，形成载体蛋白溶液，在搅拌下将所述半抗原活化酯逐滴缓慢滴加至所述载体蛋白溶液中，并在室温下搅拌16～24h；
(3)步骤(2)制得的溶液用0.01mol/L的PBS室温透析3天，每天换3次透析液，以除去未反应的小分子物质；
(4)分装，于4℃保存备用。
孔雀石绿单克隆抗体的制备
以上述载体蛋白为血蓝蛋白的孔雀石绿人工抗原为免疫原，与等体积弗氏佐剂乳化后，免疫BALB/C小鼠。每只鼠免疫剂量为50～100ug，免疫间隔3周，免疫3次后，采小鼠尾部静脉血检测血清效价。如抗体效价不达要求，需加强免疫，待抗体效价不再升高后，以100ug全抗原进行皮下加强免疫，5天后取小鼠脾细胞与SP20细胞融合。融合后的细胞在HAT培养基中筛选，5天后以完全培养基替换成HAT培养基进行培养。用ELISA对细胞上清进行检测，将检测结果为强阳性的孔内细胞进行有限稀释法克隆培养，经3次克隆培养检测后，均呈阳性的孔内细胞即为分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞。将杂交瘤细胞放大培养后，接种至小鼠腹腔，产生含抗体的腹水。用辛酸-硫酸铵沉淀法纯化腹水，即可得到高纯度、高特异性的单克隆抗体。
用含0.05％叠氮钠，pH7.4的磷酸盐缓冲液，将单克隆抗体稀释至0.05μg/ml，4℃保存。
孔雀石绿人工抗原在ELISA中的应用与效果评价
ELISA检测中使用的孔雀石绿人工抗原的载体蛋白为牛血清白蛋白。
用pH9.6的碳酸盐缓冲液作包被稀释液，将孔雀石绿人工抗原稀释至0.5μg/ml，按100μL/孔加入聚苯乙烯微孔板中，4℃包被过夜，甩干，按250μL/孔加入1％BSA，磷酸盐缓冲液中37℃封闭1h，甩干，干燥后真空包装保存。
向包被有孔雀石绿人工抗原的微孔酶标板中加入孔雀石绿系列标准溶液50μL/孔，再加入最适浓度的孔雀石绿单克隆抗体溶液50μL/孔，37℃反应0.5h；甩干后，加入洗液300μL/孔，洗涤3次后拍干；再加入酶标二抗100μL/孔，37℃反应0.5h；再次洗涤3次后拍干，分别加入50μL/孔的显色液A和显色液B，37℃反应15min；加入2M硫酸50μL/孔终止，设定酶标仪于450nm波长测定每孔的OD值。结果如下表。
ELISA测试不同浓度的孔雀石绿标准品溶液的OD值
通过表1数据，采用ELISA Calc软件进行四参数Logistic曲线拟合绘制标准曲线(如图2所示)，孔雀石绿的线性方程为：y＝(A-D)/[1+(x/C)^B]+D，r2＝0.996，A＝1.84331，B＝1.31411，C＝0.09734，D＝0.12361，x表示待测物浓度，y表示OD值，通过计算得到IC50值为0.21μg/L，在0.05～0.8μg/L呈线性关系。通过测定20个0μg/L的标准液，按公式Z＝平均值-3标准差，计算出Z值为1.456，把Z值做为Y值代入标准曲线即可算出最低检测限为0.04μg/L。
荧光定量免疫层析试纸条的制备
荧光定量免疫层析试纸条的制备方法如下：
(1)制备包被有人工抗原和兔IGg的反应膜：
以硝酸纤维素膜(NC膜)为反应膜，将载体蛋白为牛血清白蛋白的孔雀石绿人工抗原用包被缓冲液调节浓度至0.1～0.5mg/mL，并将兔IGg用包被缓冲液也调节浓度至0.1～1mg/mL，按照0.8～1.2uL/cm的膜液量，将抗原和兔IGg喷到反应膜对应的检测区和控制区，检测区和控制区之间间隔为5mm，放置40～45℃烘箱处理3～35小时，置于恒温恒湿保藏箱里备用，所用包被缓冲液为含有0.5％PEG20000、1％蔗糖、0.5％BSA、0.05％叠氮化钠的0.01M PBS缓冲液。
(2)样品垫的制备：
将裁剪好的空白样品垫浸泡在样品本处理液中，浸泡5min后，取出在37℃干燥16h，置于恒温恒湿保藏箱里备用，所用样品垫处理液为含有0.3％吐温20、1％蔗糖、0.5％BSA、0.05％叠氮化钠的0.01M PBS缓冲液。
(3)荧光定量免疫层析试纸条的组装：
在PVC板背衬中部叠置步骤(1)制得的反应膜，两端分别叠置步骤(2)制得的样品垫和吸水垫，反应膜和吸水垫、样品垫相搭连，检测区靠近样品垫，控制区靠近吸水垫，得到试纸板，将试纸板切割成试纸条，将试纸条装载于试纸卡内，得荧光定量免疫层析试纸条。
荧光定量免疫层析试纸条的性能评价
(1)荧光微球标记的孔雀石绿单克隆抗体的制备：取500μL荧光微球溶液(荧光微球固含量1％，即含荧光微球5mg)，并用超声波处理；搅拌下分别加入5mg NHS和4mg DEC，控制荧光微球溶液的温度为4～10℃，并在此温度下活化20min；活化完后，用0.1M碳酸钾溶液调pH为8～9，控制荧光微球溶液的温度为4～10℃；加入0.25mg孔雀石绿单克隆抗体，搅拌均匀后，移去冰浴，让其自然升至室温，并在室温下搅拌4～6h；偶联完成后，反应液在10000rpm下离心10min，除去上清，加入1mL荧光缓冲液，超声重悬后，离心、除去上清，该操作重复3次，最后一次离心，除上清后，加入0.5mL荧光缓冲液超声重悬荧光微球，2～8℃冰箱保存备用，所用荧光缓冲液为含有0.5％PEG20000、2％蔗糖、0.1％吐温20，0.5％BSA、0.05％叠氮化钠的0.01M PBS缓冲液。
(2)荧光微球标记的孔雀石绿单克隆抗体检测液的制备：将上述荧光微球标记的孔雀石绿单克隆抗体取出放置至室温，用荧光缓冲液稀释100～1000倍成荧光微球标记的孔雀石绿单克隆抗体检测液，荧光缓冲液为含有0.5％PEG20000、2％蔗糖、0.1％吐温20，0.5％BSA、0.05％叠氮化钠的0.01M PBS缓冲液，然后置于2～8℃冰箱保存备用。
(3)用0.01M磷酸盐缓冲液PBS配备一系列不同浓度的孔雀石绿的标准溶液，然后取上述制备的荧光微球标记的孔雀石绿单克隆抗体检测液20μL和100μL配制好的系列标准品溶液混合1min后，取80μL滴加到荧光定量免疫层析试纸条的样品区，15min后，用荧光定量检测仪读取T/C的荧光信号值比值，检测试验设置3组重复。再通过系列标品浓度对应的T/C值建立四参数Logistic曲线，曲线所得的四个参数值录入荧光定量检测仪的标定软件，即可实现荧光定量免疫层析试纸条在荧光免疫层析分析仪上的快速定量检测。
测定结果如下：
通过对不同孔雀石绿浓度的T/C值进行了测定，并计算了B/B0(不同浓度的标准品测试卡T/C值与含量为0的标准品测试卡T/C值的比值)，结果如上表所示。从表中可看出，当孔雀石绿的含量为0.2μg/L时，其B/B0值为78.51％，说明此浓度下检测的T/C值与含0μg/L浓度的孔雀石绿的荧光定量免疫层析试纸条的T/C值有明显差异，故荧光定量免疫层析试纸条对孔雀石绿的检测灵敏度可达0.2μg/L。
通过上表数据，采用ELISA Calc软件进行四参数Logistic曲线拟合绘制标准曲线(如图3所示)，所得曲线的线性方程为：y＝(A-D)/[1+(x/C)^B]+D，r2＝0.999，A＝3.73363，B＝1.08750，C＝0.66863，D＝-0.20193，线性方程中x表示待测物浓度，y表示T/C值。在荧光免疫层析分析仪的定量曲线设置界面当中，分别将A，B，C，D的值录入荧光免疫层析分析仪的标定软件，即可实现荧光定量免疫层析试纸条在荧光免疫层析分析仪上的快速定量检测。
荧光定量免疫层析试纸条的稳定性研究
荧光定量免疫层析试纸条保存的条件为室温，为了确保试纸条的稳定性，对试纸条进行了加速破坏性实验，分别在室温、50℃条件下连续放置60天，并在第3天，第6天，第15天，第30天和第60天分别检测荧光信号值，T值为检测区荧光信号值，C值为控制区荧光信号值，试验设置3组重复；
由上表可知，在常温和50℃下密封保存的荧光定量免疫层析试纸条60天后，T线、C线和T/C值均无明显变化，说明荧光定量免疫层析试纸条在加速实验50℃下最少可稳定保存60天。因此，荧光定量免疫层析试纸条可在室温下稳定保存一年以上，完全可以满足市场在保存和运输过程中的要求。
荧光定量免疫层析试纸条的精密度测试
以试纸条的检测区、控制区和T/C值的批内误差和批间误差来表示该方法的精密度，并分别以批内变异系数和批间变异系数来体现批内误差和批间误差。批内变异系数的测定是对同一批次的10条荧光定量免疫层析试纸条的检测区和控制区信号值，以及T/C值的数据，并对这些数据进行离散程度分析。批间变异系数的测定是对不同批次的10条荧光定量免疫层析试纸条的检测区和控制区信号值，以及T/C值的数据，并对这些数据进行离散程度分析。按变异系数公式CV％＝[标准偏差SD值/平均值]×100％即可分别计算出荧光定量免疫层析试纸条的批内变异系数和批间变异系数。
由上表可知，通过同一批次内的10张荧光定量免疫层析试纸条的测试，检测区和控制区位置的荧光信号数值以及T/C值的范围分别为12997～14461，3544～3862和3.61～3.75。通过变异系数计算公式得出这10张荧光定量免疫层析试纸条的T值，C值和T/C值的批内变异系数分别为3.16％，2.65％和1.56％，说明试纸条的批内变异系数小，精密度高，可满足试纸条的定量的要求。
由上表可知，通过对不同批次的10张荧光定量免疫层析试纸条的测试，检测区和控制区位置的荧光信号数值以及T/C值的范围分别为12564～14456，3458～3778和3.63～3.92。通过变异系数计算公式得出这10张试纸条的T值，C值和T/C值的批间变异系数分别为4.44％，2.48％和2.77％，说明试纸条的批间变异系数小，精密度高，可满足试纸条的定量的要求。

Claims (10)

1.一种孔雀石绿半抗原，其特征在于，孔雀石绿半抗原的结构式为：
2.根据权利要求1所述的孔雀石绿半抗原，其特征在于：其制备方法包括以下步骤：
1)将化合物Ⅰ与化合物Ⅱ溶于丙酮，加入缚酸剂，在60～65℃反应2～5h，获得化合物Ⅲ；
2)将化合物Ⅲ溶于无水乙醇，加入N,N-二甲基苯胺和缩合剂，在80～85℃反应15～26h，获得化合物Ⅳ；
3)采用的是6M的LiOH水溶液水解化合物Ⅳ，水解体系的pH值为10～12，水解反应时间为15～26h，反应完成后加入1M稀盐酸调节pH值至4～5，过滤即可得孔雀石绿半抗原Ⅴ；
式Ⅰ～Ⅴ如下：
3.根据权利要求2所述的孔雀石绿半抗原，其特征在于：步骤1)中，缚酸剂为K2CO3，化合物Ⅰ与化合物Ⅱ的摩尔比为(2～2.5):1，缚酸剂与化合物Ⅱ的摩尔比为(1.5～2):1。
4.根据权利要求2所述的孔雀石绿半抗原，其特征在于：步骤2)中，缩合剂为ZnCl2，N,N-二甲基苯胺、缩合剂的摩尔比为1:1，缩合剂与式Ⅲ所示的化合物的摩尔比为(5～6)：1。
5.一种孔雀石绿人工抗原，为权利要求1～4任一项所述的孔雀石绿半抗原与载体蛋白偶联得到，孔雀石绿人工抗原的结构式为：
载体蛋白为牛血清白蛋白、卵清蛋白、人血清白蛋白或血蓝蛋白中的任意一种。
6.根据权利要求5所述的孔雀石绿人工抗原制备的孔雀石绿单克隆抗体，孔雀石绿人工抗原的载体蛋白为血蓝蛋白。
7.根据权利要求5所述的孔雀石绿人工抗原和权利要求6所述的孔雀石绿单克隆抗体在ELISA检测方法中的应用。
8.根据权利要求5所述的孔雀石绿人工抗原和权利要求6所述的孔雀石绿单克隆抗体在荧光定量免疫层析中的应用。
9.一种孔雀石绿荧光定量免疫层析试纸条，试纸条中包括包被有权利要求5所述的孔雀石绿人工抗原的反应膜，孔雀石绿人工抗原的载体蛋白为牛血清蛋白，其制备方法包括以下步骤：
1)制备包被有人工抗原和兔IGg的反应膜：将载体蛋白为牛血清蛋白的孔雀石绿人工抗原加到包被缓冲液中混合均匀喷到反应膜的检测区，将兔IGg加到包被缓冲液中混合均匀喷到反应膜的控制区，检测区和控制区相互分离，干燥处理后保存备用；
2)样品垫的制备：将裁剪好的空白样品垫浸泡在样品垫处理液中浸泡，取出样品垫干燥处理后保存备用；
3)荧光定量免疫层析试纸条的组装：在背衬中部叠置反应膜，两端分别叠置样品垫和吸水垫，反应膜和吸水垫、样品垫相搭连，检测区靠近样品垫，控制区靠近吸水垫，得到试纸板，将试纸板切割成试纸条，将试纸条装载于试纸卡内，得荧光定量免疫层析试纸条。
10.一种使用权利要求9所述的孔雀石绿荧光定量免疫层析试纸条检测孔雀石绿的方法：
1)荧光微球标记的孔雀石绿单克隆抗体的制备：将荧光微球活化后与权利要求6所述的孔雀石绿单克隆抗体偶联，离心除杂，加入荧光缓冲液重悬荧光微球，得到荧光微球标记的孔雀石绿单克隆抗体；
2)荧光微球标记的孔雀石绿单克隆抗体检测液的制备：用荧光缓冲液将荧光微球标记的孔雀石绿单克隆抗体稀释，得到荧光微球标记的孔雀石绿单克隆抗体检测液；
3)用PBS缓冲液配备系列浓度的孔雀石绿标准溶液，取荧光微球标记的孔雀石绿单克隆抗体检测液和标准溶液混匀后滴加到荧光定量免疫层析试纸条的样品区，用荧光定量检测仪读取T/C值，通过标准溶液浓度对应的T/C值建立标准曲线，测定待测样品的T/C值，根据标准曲线即可实现孔雀石绿的快速定量检测。
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