CN104569372A - 一种隐性孔雀石绿半抗原的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种隐性孔雀石绿半抗原的制备方法，采用了Heck反应进行活性手臂的延长，反应条件温和，有机溶剂用量少，反应副产物少，操作步骤简单；而且通过对产物的纯化方法进行优化，避免了纯化过程中有机溶剂的大量使用，有效的减少了环境污染物的排放。

Description

一种隐性孔雀石绿半抗原的制备方法

技术领域

本发明涉及免疫化学技术领域，具体地，涉及一种隐性孔雀石绿半抗原的制备方法。

背景技术

孔雀石绿(Malachite Green，MG)是绿色有金属光泽的晶体，极易溶于水形成蓝绿色溶液，可溶于甲醇、乙醇或戊醇。MG是一种既可以用作丝绸、皮革和纸张的染料，也可以作生物染色剂的合成的三苯甲烷类化学物，它同时也是杀菌剂，曾广泛用于预防和治疗各类水产动物的鳃霉病、水霉病以及小瓜虫病等。我国于2002年5月将孔雀石绿列入《食品动物禁用的兽药及其化合物清单》中，于2005年制定了孔雀石绿的使用标准，规定在水产品中，MG的检出率不得超过1μg/kg，但违规使用孔雀石绿的事件时有发生。

目前，对于孔雀石绿和隐性孔雀石绿的残留检测主要方法是采用气相色谱或者液相色谱及其连用技术，以上方法虽然可以精确定量，但必需体积庞大而又昂贵的仪器设备，且成本高、周期长，不适用于现场快速检测。免疫分析检测技术是近年来在环境及食品检测等领域开发出的一种新型的快速准确检测方法，美国化学协会已将免疫分析方法与气相色谱和液相色谱并列为化学兽药残留分析的三大支柱技术，这也为孔雀石绿及隐性孔雀石绿的残留检测提供了一种新的检测途径。

孔雀石绿和无色孔雀石绿是小分子物质，没有免疫原性，必须与载体蛋白偶联后才可制备免疫抗原。在合成化学允许的前提下，免疫半抗原设计的基本原则是：免疫半抗原与载体连接后再结合抗原中能最大程度保持和突出待测物的特征结构，特别是立体结构。所以，免疫半抗原主要由下列结构部分组成：待测物特征结构，用于连接特征结构和载体的间隔分子(间隔臂)和末端的活性基团。而孔雀石绿或隐性孔雀石绿分子本身没有可与载体蛋白结合的可供活化的功能基团，因此无法直接制备人工抗原，需要先通过化学方法设计出其半抗原，再进一步与载体蛋白结合获得具有免疫性的完全抗原。隐性孔雀石绿半抗原合成的关键步骤是活性手臂的延长，现有的合成方法中多采用借助N,O或者双键等方式延长活性手臂，该方法的缺陷在于引入了杂原子或其它极性基团，而理论上，间隔臂一般应为非极性，除供偶联的活性基团外，不应该含有其它高免疫活性的结构，如苯环，杂原子，羟基等，以降低抗体对间隔臂的识别和间隔臂对待测特征结构的影响。现在已报道的间隔臂为饱和碳链的隐性孔雀石绿半抗原的合成步骤繁琐，终产率较低。本方法提供了一种反应条件温和，有机溶剂使用量少，副产物少，操作步骤简单，且间隔臂为饱和链烃的隐性孔雀石绿半抗原的制备方法。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术中存在的上述缺陷，提供一种条件温和，有机溶剂使用量少，副产物少，操作步骤简单的隐性孔雀石绿半抗原的制备方法。

为达到以上目的，本发明提供了一种隐性孔雀石绿半抗原的制备方法，包括以下步骤：

步骤一：将4-溴苯甲醛或4-碘苯甲醛与丙烯醛缩二乙醇或通式(Ⅰ)所示的化合物在存在Heck反应配体、醋酸钯和缚酸剂的条件下进行Heck反应获得化合物1；

步骤二：将化合物1与N,N-二甲基苯胺进行缩合反应获得化合物2；

步骤三：将化合物2溶解于1,4-二氧六环中，加饱和氢氧化钠溶液至pH值为9-10，反应获得通式(Ⅱ)所示的隐性孔雀石绿半抗原；

其中，在通式(Ⅰ)中，n为1-3的整数，m为0或1；在通式(Ⅱ)中，n为2-4的整数。

可选的，相对于1mol的4-溴苯甲醛或4-碘苯甲醛，丙烯醛缩二乙醇或通式(Ⅰ)所示的化合物的用量为2.5-4mol；N,N-二甲基苯胺的用量为1.5-2.5mol，饱和氢氧化钠溶液的用量为2.5-4mol。

可选的，步骤一包括：将4-溴苯甲醛或4-碘苯甲醛、Heck反应配体与醋酸钯的混合物在保护气下与Heck反应溶剂接触获得反应混合物1，将所述反应混合物1依次与丙烯醛缩二乙醇或通式(Ⅰ)所示的化合物、三乙胺接触混匀，在80-130℃的温度下搅拌反应24-48h获得反应混合物2；将反应混合物2与冰水混合后用有机溶剂萃取分离有机相，用展开剂对有机相进行过柱分离，收集洗脱液后干燥获得化合物1。

可选的，步骤二包括：将化合物1与无水氯化锌的混合物在保护气存在下与无水乙醇接触获得反应混合物3，将所述反应混合物3与N,N-二甲基苯胺接触混匀，在80-130℃的温度下搅拌反应12-48h获得反应混合物4，将所述反应混合物4干燥后用甲醇溶解，水洗后获得化合物2；

可选的，步骤三包括：将化合物2溶解于1,4-二氧六环中，加饱和氢氧化钠溶液至pH值为9-10，15-30℃的温度下搅拌反应6-12h获得混合物5，用1M稀盐酸调整pH至5后与冰水接触搅拌至沉淀析出，过滤干燥后获得通式(Ⅱ)所示的隐性孔雀石绿半抗原。

可选的，相对于1mol的4-溴苯甲醛或4-碘苯甲醛，Heck反应配体的用量为0.8-1.2mol，缚酸剂的用量为1.8-3mol，醋酸钯的用量为0.025-0.035mol，无水氯化锌的用量为3-4mol。

可选的，利用丙烯醛缩二乙醇制备隐性孔雀石绿半抗原。

可选的，所述缚酸剂为三乙胺或K₂CO₃。

可选的，所述Heck反应溶剂为N,N-二甲基甲酰胺或无水乙腈。

可选的，所述Heck反应配体为四丁基氯化铵或三苯基膦。

可选的，在步骤一中，所述有机溶剂为乙酸乙酯，所述展开剂由石油醚和乙酸乙酯组成，石油醚和乙酸乙酯的体积比为4:1。

本发明中所提供的隐性孔雀石绿半抗原的合成方法，采用了Heck反应进行活性手臂的延长，反应条件温和，有机溶剂用量少，反应副产物少，操作步骤简单；而且通过对产物的纯化方法进行优化，避免了纯化过程中有机溶剂的大量使用，有效的减少了环境污染物的排放。

附图说明

图1为利用丙烯缩醛二乙醇制备隐性孔雀石绿半抗原的合成路线示意图。

图2为利用通式(Ⅰ)所示的化合物制备隐性孔雀石绿半抗原的合成路线示意图。

图3为利用通式(Ⅰ)所示的化合物制备隐性孔雀石绿半抗原的合成路线示意图。

具体实施方式

本发明提供了一种隐性孔雀石绿半抗原的制备方法，该方法包括以下步骤：

步骤一：将4-溴苯甲醛或4-碘苯甲醛与丙烯醛缩二乙醇或通式(Ⅰ)所示的化合物在存在Heck反应配体、醋酸钯和缚酸剂的条件下进行Heck反应获得化合物1；

步骤二：将化合物1与N,N-二甲基苯胺进行缩合反应获得化合物2；

步骤三：将化合物2溶解于1,4-二氧六环中，加饱和氢氧化钠溶液至pH值为9-10，反应获得通式(Ⅱ)所示的隐性孔雀石绿半抗原；

其中，在通式(Ⅰ)中，n为1-3的整数，m为0或1；在通式(Ⅱ)中，n为2-4的整数。

在本发明的一种优选的实施方式中，利用丙烯醛缩二乙醇制备隐性孔雀石绿半抗原，制备获得的隐性孔雀石绿半抗原为式(Ⅲ)所示的化合物，合成隐性孔雀石绿半抗原的路线如图1所示。

其中，步骤一包括：首先将4-溴苯甲醛或4-碘苯甲醛、Heck反应配体与醋酸钯按比例进行混合，再将混合物在保护气下与Heck反应溶剂接触获得反应混合物1，所述保护气可以为氩气，本发明对于将混合物与Heck反应溶剂进行接触的方法没有特别的限制只要能够获得均一的反应混合物1即可。

将所述反应混合物1依次与丙烯醛缩二乙醇或通式(Ⅰ)所示的化合物、三乙胺接触混匀，在80-130℃的温度下搅拌反应24-48h获得反应混合物2；其中，在搅拌反应的过程中搅拌的速度为400-600rpm，可以每隔一段时间取少量反应物进行稀释，利用TLC判断反应进展。

本发明所提供的方法还包括对反应混合物2的萃取纯化，具体的萃取纯化步骤为：首先将反应混合物2与冰水混合，然后用有机溶剂萃取并分离有机相，用展开剂对有机相进行过柱分离，收集洗脱液后干燥获得化合物1。相对于1mol的反应混合物2，冰水的用量为30000-40000ml，有机溶剂的用量为50000-60000ml，展开剂的用量为60000-80000ml。

所述有机溶剂为乙酸乙酯，所述展开剂优选由石油醚和乙酸乙酯组成，石油醚和乙酸乙酯的体积比为4:1。

在本发明所提供的方法中，步骤二包括：将化合物1与无水氯化锌的混合物在保护气存在下与反应溶剂无水乙醇接触获得反应混合物3，所述保护气优选为氮气，相对于1mol的化合物1，无水乙醇的用量为1500-2500ml。将所述反应混合物3与N,N-二甲基苯胺接触混匀，在90-130℃的温度下搅拌反应12-48h获得反应混合物4，其中，在搅拌反应的过程中搅拌的速度为400-600rpm，可以每隔一段时间取少量反应物进行稀释，利用TLC判断反应进展。

本发明所提供的方法还包括将所述反应混合物4干燥后用甲醇溶解，水洗后获得化合物2。优选采用尽量少的甲醇对反应混合物4进行干燥，只要能够使反应混合物4溶解即可，可选的，相对于1mol的反应混合物4，甲醇的用量可以为1500-2500ml。为了获得纯度较高的化合物2，水洗的次数可以为2-4次。

在本发明所提供的方法中，步骤三包括：将化合物2溶解于1,4-二氧六环中，加饱和氢氧化钠溶液至pH值为9-10，15-30℃的温度下搅拌反应6-12h获得混合物5。

其中，当利用通式(Ⅰ)所示的化合物制备隐性孔雀石绿半抗原时，还包括在获得混合物5后进行烯烃加氢步骤，具体的，所述烯烃加氢可以按照以下步骤进行：

在混合物5中加入钯质量百分数为3.0％的钯碳催化剂，催化剂用量可以为3％，氢气保护下常温搅拌反应进行烯烃加氢，每隔一段时间取少量稀释，利用TLC判断反应进展。

其中，在步骤三中，相对于1mol的化合物2，1,4-二氧六环的添加量为100-120mol，在搅拌反应的过程中搅拌的速度为400-600rpm，可以每隔一段时间取少量反应物进行稀释，利用TLC判断反应进展。

反应结束后用1M稀盐酸调整混合物5的pH至5后与冰水接触搅拌至沉淀析出，过滤干燥后获得通式(Ⅱ)所示的隐性孔雀石绿半抗原。

在本发明所提供的方法中，对于干燥的方式没有特别的要求，例如可以为真空干燥。

在本发明的一种实施方式中，相对于1mol的4-溴苯甲醛或4-碘苯甲醛，丙烯醛缩二乙醇或通式(Ⅰ)所示的化合物的用量为2.5-4mol；N,N-二甲基苯胺的用量为1.5-2.5mol，饱和氢氧化钠溶液的用量为2.5-4mol。优选的情况下，相对于1mol的4-溴苯甲醛或4-碘苯甲醛，丙烯醛缩二乙醇或通式(Ⅰ)所示的化合物的用量为3mol；N,N-二甲基苯胺的用量为2mol，饱和氢氧化钠溶液的用量为3mol。

在本发明的一种实施方式中，相对于1mol的4-溴苯甲醛或4-碘苯甲醛，Heck反应配体的用量为0.8-1.2mol，缚酸剂的用量为1.8-3mol，醋酸钯的用量为0.025-0.035mol，无水氯化锌的用量为3-4mol。优选的情况下，相对于1mol的4-溴苯甲醛或4-碘苯甲醛，Heck反应配体的用量为1mol，缚酸剂的用量为2mol，醋酸钯的用量为0.03mol，无水氯化锌的用量为3mol。

在本发明中，步骤一所使用的缚酸剂的种类可以为三乙胺或K₂CO₃，优选的，所述缚酸剂为三乙胺。所述Heck反应溶剂为N,N-二甲基甲酰胺或无水乙腈，优选的为N,N-二甲基甲酰胺。

在本发明中，所述Heck反应配体为四丁基氯化铵或三苯基膦。

下面通过实施例对本发明的优选实施方式进行详细说明。需要理解的是以下实施例的给出仅是为了起到说明的目的，并不是用于对本发明的范围进行限制。本领域的技术人员在不背离本发明的宗旨和精神的情况下，可以对本发明进行各种修改和替换。

本发明所使用的各种仪器及试剂均可以通过购买市售产品的方式获得。

以下实施例中，丙烯醛缩二乙醇购自天津希恩思生化科技有限公司。

TLC购自德国Merck公司，型号为Silica gel 60F254

产率＝隐性孔雀石绿半抗原的实际产量/隐性孔雀石绿的理论产量×100％

实施例1

本实施例用于说明本发明所提供的隐性孔雀石绿半抗原的制备方法。

将4-对溴苯甲醛1.85g、四丁基氯化铵2.78g与醋酸钯0.067g加入到两口瓶中混合均匀，在氩气保护下再加入N,N-二甲基甲酰胺(DMF)40mL作为反应溶剂，而后依次加入丙烯醛缩二乙醇4.56mL和三乙胺2.79mL，90℃下搅拌(500rpm)反应，每6小时取少量利用TLC判断反应进展。反应48h后结束。将反应液倒入到400mL冰水中，搅拌均匀后用乙酸乙酯萃取4次，每次所使用的乙酸乙酯的用量为150mL。将有机相旋转蒸发干燥后用石油醚∶乙酸乙酯＝4∶1为展开剂过柱分离，收集洗脱溶剂旋转蒸发干燥后得到对醛基苯丙酸乙酯。

将醛基苯丙酸乙酯1.03g与无水氯化锌2.8g加入到两口瓶中，在氮气保护下再加入无水乙醇50mL作为反应溶剂，最后加入N,N-二甲基苯胺2.5mL，加热到90℃，搅拌反应，每隔6小时取少量稀释，利用TLC判断反应进展。24h后反应结束，将反应混合物旋转蒸发干燥后加约20mL甲醇进行超声溶解(超声的频率为40KHz)，搅拌状态下加水析出沉淀，用水洗沉淀3次后得到4-丙酸乙酯隐性孔雀石绿。合成路线如图1所示。

取4-丙酸乙酯隐性孔雀石绿1g溶解于1,4-二氧六环20mL中，添加饱和氢氧化钠溶液10mL至混合物的pH为10，25℃下搅拌反应，每隔2小时取少量稀释利用TLC判断反应进展，12h后反应结束，加入1M的稀盐酸调整反应混合物的pH为5，倒入200mL冰水中25℃下搅拌直至沉淀析出，过滤干燥后得到如式(Ⅲ)所示的目标产物0.55g，分装后于4℃避光保存，计算产率约为80％。合成路线见图1。

用质谱确定其结构：

MS(ESI source,positive):403.5(M+1)

MS(ESI source,negative):401.4(M-1)

产物的分子量为402.2，与上述质谱结果符合，初步说明隐性孔雀石绿半抗原合成成功。

进一步对产物进行核磁确认：

¹H NMR(400MHz,d₆-MeOD,TMS):δ2.43(t,2H),2.75(t,2H),2.83(s,12H),5.26(s,1H),6.64(d,J＝8.0Hz,4H),6.88(d,J＝8.0Hz,4H),6.96(d,J＝8.0Hz,2H),7.11(d,J＝8.0Hz,2H)

实施例2本实施例用于说明本发明所提供的隐性孔雀石绿半抗原的制备方法。

将4-对溴苯甲醛1.85g、三苯基膦2.68g与醋酸钯0.067g加入到两口瓶中混合均匀，在氩气保护下再加入N,N-二甲基甲酰胺(DMF)40mL作为反应溶剂，而后依次加入3-丁烯酸甲酯3.20mL和三乙胺2.79mL，130℃下搅拌(500rpm)反应，每6小时取少量利用TLC判断反应进展。反应约30h后结束。将反应液倒入到400mL冰水中，搅拌均匀后用乙酸乙酯萃取4次，每次所使用的乙酸乙酯的用量为150mL。将有机相旋转蒸发干燥后用石油醚∶乙酸乙酯＝4∶1为展开剂过柱分离，收集洗脱溶剂旋转蒸发干燥后得到对醛基苯丁烯酸甲酯。

将醛基苯丁烯酸甲酯1.16g与无水氯化锌2.8g加入到两口瓶中，在氮气保护下再加入无水乙醇50mL作为反应溶剂，最后加入N,N-二甲基苯胺2.5mL，加热到90℃，搅拌反应，每隔6小时取少量稀释，利用TLC判断反应进展。24h后反应结束，将反应混合物旋转蒸发干燥后加约20mL甲醇进行超声溶解(超声的频率为40KHz)，搅拌状态下加水析出沉淀，用水洗沉淀3次后得到3-丁烯酸甲酯隐性孔雀石绿。合成路线如图2所示。

取约3-丁烯酸甲酯隐性孔雀石绿1g溶解于1,4-二氧六环20mL中，添加饱和氢氧化钠溶液10mL至混合物的pH为10，25℃下搅拌反应，每隔2小时取少量稀释利用TLC判断反应进展，12h后反应结束，加入钯质量百分数为3.0的钯碳催化剂，催化剂用量为3％，氢气保护下常温搅拌反应进行烯烃加氢，每隔2小时取少量稀释利用TLC判断反应进展，约10h后反应结束。加入1M的稀盐酸调整反应混合物的pH为5，倒入200mL冰水中25℃下搅拌直至沉淀析出，过滤干燥后得到如式(IV)所示的目标产物0.53g，分装后于4℃避光保存，计算产率约为75％。合成路线见图2。

用质谱确定其结构：

MS(ESI source,positive):417.3(M+1)

MS(ESI source,negative):415.2(M-1)

产物的分子量为416.1，与上述质谱结果符合，初步说明隐性孔雀石绿半抗原合成成功。

进一步对产物进行核磁确认：

¹H NMR(400MHz,d₆-MeOD,TMS):δ1.87(m,2H),δ2.25(t,2H),2.57(t,2H),2.85(s,12H),5.43(s,1H),6.63(d,J＝8.0Hz,4H),6.85(d,J＝8.0Hz,4H),6.93(d,J＝8.0Hz,2H),7.07(d,J＝8.0Hz,2H)

实施例3本实施例用于说明本发明所提供的隐性孔雀石绿半抗原的制备方法。

将4-对溴苯甲醛1.85g、三苯基膦2.68g与醋酸钯0.067g加入到两口瓶中混合均匀，在氩气保护下再加入N,N-二甲基甲酰胺(DMF)40mL作为反应溶剂，而后依次加入4-戊烯酸乙酯4.28mL和三乙胺2.79mL，130℃下搅拌(500rpm)反应，每6小时取少量利用TLC判断反应进展。反应约30h后结束。将反应液倒入到400mL冰水中，搅拌均匀后用乙酸乙酯萃取4次，每次所使用的乙酸乙酯的用量为150mL。将有机相旋转蒸发干燥后用石油醚∶乙酸乙酯＝4∶1为展开剂过柱分离，收集洗脱溶剂旋转蒸发干燥后得到对醛基苯戊烯酸乙酯。

将醛基苯戊烯酸乙酯1.16g与无水氯化锌2.8g加入到两口瓶中，在氮气保护下再加入无水乙醇50mL作为反应溶剂，最后加入N,N-二甲基苯胺2.5mL，加热到90℃，搅拌反应，每隔6小时取少量稀释，利用TLC判断反应进展。24h后反应结束，将反应混合物旋转蒸发干燥后加约20mL甲醇进行超声溶解(超声的频率为40KHz)，搅拌状态下加水析出沉淀，用水洗沉淀3次后得到4-戊烯酸乙酯隐性孔雀石绿。合成路线如图3所示。

取4-戊烯酸乙酯隐性孔雀石绿1g溶解于1,4-二氧六环20mL中，添加饱和氢氧化钠溶液10mL至混合物的pH为10，25℃下搅拌反应，每隔2小时取少量稀释利用TLC判断反应进展，12h后反应结束，加入钯质量百分数为3.0的钯碳催化剂，催化剂用量为3％，氢气保护下常温搅拌反应进行烯烃加氢，每隔2小时取少量稀释利用TLC判断反应进展，约10h后反应结束。加入1M的稀盐酸调整反应混合物的pH为5，倒入200mL冰水中25℃下搅拌直至沉淀析出，过滤干燥后得到如式(V)所示的目标产物0.47g，分装后于4℃避光保存，计算产率约为66％。合成路线见图3。

用质谱确定其结构：

MS(ESI source,positive):431.3(M+1)

MS(ESI source,negative):429.4(M-1)

产物的分子量为430.2，与上述质谱结果符合，初步说明隐性孔雀石绿半抗原合成成功。

进一步对产物进行核磁确认：

¹H NMR(400MHz,d₆-MeOD,TMS):δ1.57(m,2H),1.64(m,2H)，δ2.33(t,2H),2.65(t,2H),2.85(s,12H),5.46(s,1H),6.62(d,J＝8.0Hz,4H),6.86(d,J＝8.0Hz,4H),6.94(d,J＝8.0Hz,2H),7.08(d,J＝8.0Hz,2H)

通过将实施例1、2和3的制备过程与中国专利申请CN103524362A(孔雀石绿人工抗原和抗体及其制备方法和应用)相比可以看出，CN 103524362A所介绍的制备方法步骤较多(6步)，过程繁琐，且终产率低，只有25％。而在获得相同产物的前提下利用本发明所提供的方法，反应的过程缩减为3步(如实施例3)，且会有效地提高终产率(可以达到80％)，避免过柱等使用大量有机试剂的步骤，操作简单。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (10)

1.一种隐性孔雀石绿半抗原的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤一：将4-溴苯甲醛或4-碘苯甲醛与丙烯醛缩二乙醇或通式(Ⅰ)所示的化合物在存在Heck反应配体、醋酸钯和缚酸剂的条件下进行Heck反应获得化合物1；

步骤二：将化合物1与N,N-二甲基苯胺进行缩合反应获得化合物2；

步骤三：将化合物2溶解于1,4-二氧六环中，加饱和氢氧化钠溶液至pH值为9-10，反应获得通式(Ⅱ)所示的隐性孔雀石绿半抗原；

其中，在通式(Ⅰ)中，n为1-3的整数，m为0或1；在通式(Ⅱ)中，n为2-4的整数。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，相对于1mol的4-溴苯甲醛或4-碘苯甲醛，丙烯醛缩二乙醇或通式(Ⅰ)所示的化合物的用量为2.5-4mol；N,N-二甲基苯胺的用量为1.5-2.5mol，饱和氢氧化钠溶液的用量为2.5-4mol。

3.根据权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于，步骤一包括：将4-溴苯甲醛或4-碘苯甲醛、Heck反应配体与醋酸钯的混合物在保护气下与Heck反应溶剂接触获得反应混合物1，将所述反应混合物1依次与丙烯醛缩二乙醇或通式(Ⅰ)所示的化合物、三乙胺接触混匀，在80-130℃的温度下搅拌反应24-48h获得反应混合物2；将反应混合物2与冰水混合后用有机溶剂萃取分离有机相，用展开剂对有机相进行过柱分离，收集洗脱液后干燥获得化合物1。

4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤二包括：将化合物1与无水氯化锌的混合物在保护气存在下与无水乙醇接触获得反应混合物3，将所述反应混合物3与N,N-二甲基苯胺接触混匀，在80-130℃的温度下搅拌反应12-48h获得反应混合物4，将所述反应混合物4干燥后用甲醇溶解，水洗后获得化合物2。

5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，步骤三包括：将化合物2溶解于1,4-二氧六环中，加饱和氢氧化钠溶液至pH值为9-10，15-30℃的温度下搅拌反应6-12h获得混合物5，用1M稀盐酸调整pH至5后与冰水接触搅拌至沉淀析出，过滤干燥后获得通式(Ⅱ)所示的隐性孔雀石绿半抗原。

6.根据权利要求4或5所述的制备方法，其特征在于，相对于1mol的4-溴苯甲醛或4-碘苯甲醛，Heck反应配体的用量为0.8-1.2mol，缚酸剂的用量为1.8-3mol，醋酸钯的用量为0.025-0.035mol，无水氯化锌的用量为3-4mol。

7.根据权利要求4-6中任意一项所述的制备方法，其特征在于，利用丙烯醛缩二乙醇制备隐性孔雀石绿半抗原。

8.根据权利要求1、2、4或5所述的制备方法，其特征在于，所述缚酸剂为三乙胺或K₂CO₃。

9.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述Heck反应溶剂为N,N-二甲基甲酰胺或无水乙腈。

10.根据权利要求9所述的制备方法，其特征在于，所述有机溶剂为乙酸乙酯，所述展开剂由石油醚和乙酸乙酯组成，石油醚和乙酸乙酯的体积比为4:1，所述Heck反应配体为四丁基氯化铵或三苯基膦。