CN102786594A - 一种菝葜皂苷元单克隆抗体及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种菝葜皂苷元(Sarsasapogenin，SAR)单克隆抗体的制备及其应用。本发明在制备菝葜皂苷元人工抗原的基础上，通过杂交瘤技术制备抗菝葜皂苷元的单克隆抗体，测得此单克隆抗体与短亭山麦冬皂苷C，薯蓣皂苷元，鲁斯可皂苷元的交叉反应率分别为为29％，5.7％，33％，而与甘草酸二铵、三七皂苷R1、齐墩果酸无明显交叉反应。本发明建立了基于菝葜皂苷元单克隆抗体的ELISA分析方法，该ELISA方法与HPLC法检测结果相关性良好，且ELISA分析方法较HPLC法具有快速、微量检测的特点。适用于含菝葜皂苷元的中药材及血浆等生物样品中菝葜皂苷元微量检测，可用于含有该类活性成分的药物质量控制及药物代谢动力学研究。

Description

一种菝葜皂苷元单克隆抗体及其应用

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，涉及菝葜皂苷元单克隆抗体及其应用。 

背景技术

菝葜皂苷元(sarsasapogenin)是中药知母主要活性成分甾体皂苷的主要甾体母核，是知母等中药的主要有效成分之一，广泛用于烦热消渴，热性病高烧，肺热咳嗽，结核病发热，糖尿病，大便干燥等的治疗，能增强老年动物大脑胆碱能系统功能，改善脑内自由基代谢，提高学习记忆能力，老年性痴呆症及脑功能减退等症状，因此菝葜皂苷元具有广泛的应用前景。菝葜皂苷元结构上不具有共轭的多烯或π键体系，使得其光谱吸收只有弱的紫外末端吸收，分析困难，现有的分析方法如TLC，HPLC-ELSD法和LC-MS，其中薄层色谱法虽然要求不高，但是检测的灵敏度太低，高效液相色谱法，质谱法虽然灵敏度高，能进行大规模检测，但是其检测时间长，分析样品制备复杂，且由于菝葜皂苷元没有紫外吸收、质谱响应低，难以进行药物代谢研究的生物样品中菝葜皂苷元的痕量检测。酶联免疫法(ELISA)具有灵敏度，操作简单，成本低，检测速度快等特点，之前已有专利叙述了以多抗为基础的酶联免疫法来检测菝葜皂苷元，相比多抗来说，单克隆抗体单纯针对某一抗原上的某一抗原决定簇的抗体，相对特异性更高，灵敏度高并且可大量制备，所以建立以单克隆抗体的酶联免疫法不仅灵敏度高，操作简单，成本低而且特异强，稳定性高，并且来源简单，能快速检测知母药材中菝葜皂苷元将有十分广泛的应用前景。为了制备检测试剂盒，得到菝葜皂苷元细胞株，及针对菝葜皂苷元的单克隆抗体是关键。 

发明内容

本发明的目的是获得一种特异性识别菝葜皂苷元单克隆抗体，单克隆抗体的产生过程，由骨髓瘤细胞与产生抗菝葜皂苷元的脾细胞融合制备而成的杂交瘤分泌得到的。 

所述的脾细胞得自以菝葜皂苷元衍生物与牛血清白蛋白偶联物(SAR-HS-BSA)免疫的动物 

所述的偶联物制备过程：将菝葜皂苷元琥珀酰酯衍生物(SAR-HS)9.8mg、NHS 13mg、 DCC19mg混合于1mLDMF中，置磁力搅拌器上室温搅拌反应4小时后加30mg BSA溶液，4℃搅拌反应过夜后将产物装入透析袋中，双蒸水透析72小时，冻干得白色粉末，-20℃保存。同方法制备包被原——菝葜皂苷元衍生物与鸡卵清白蛋白(21mg)偶联物(SAR-HS-OVA)。 

所述的融合制备过程：采用SAR-HS-BSA免疫Balb/c小鼠后，将抗血清效价高特异性强的Balb/c小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞按5∶1的比例混合，45秒内加入聚乙二醇，然后加入DMEM培养基水浴中静置10min，离心，弃去上清，细胞加入含有HAT的DMEM培养液，混合均匀后每孔100μl滴加到96孔板内，培养于CO₂浓度为5％和37℃恒温箱中。 

所述的筛选阳性杂交瘤细胞过程如下：用SAR-HS-OVA包被酶标板，用酶联免疫间接法对细胞上清液进行鉴定；将阳性值大于阴性值2倍，且阳性值大于0.5以上的细胞孔内细胞及时进行克隆。 

6.本发明的又一目的是利用菝葜皂苷元单克隆抗体检测知母和大鼠血清中菝葜皂苷元的含量 

本发明提供的菝葜皂苷元单克隆抗体及其应用，具有如下优点： 

1.利用本发明提供的单克隆抗体对菝葜皂苷元的IC₅₀为330.79ng/mL，灵敏度较高。 

2.利用本发明提供的单克隆抗体的特异性强，仅与鲁斯可皂苷元，薯蓣皂苷元，短亨山麦冬皂苷C的交叉反应分别为33％，5.7％，29％，而与三七皂苷R1，甘草酸二铵，齐墩果酸无交叉反应。 

3.利用本发明提供的单克隆抗体建立了酶联免疫吸附法(ELISA)，线性范围为5ng/ml-5μg/ml，检测不同产地知母药材中菝葜皂苷元的含量，与HPLC法结果相关性良好；且ELISA分析方法较HPLC法具有快速、微量检测的特点，可用于药物代谢等研究中的痕量检测。 

综上所述，本发明提供的单克隆具有灵敏度高，特异性强的特性。本发明成功制备了单克隆抗体，为菝葜皂苷元在知母提取物中和血浆中的快速检测提供了关键技术。 

附图说明

图1为免疫原(SAR-HS-BSA)的红外光谱图 

图2为及包被原(SAR-HS-OVA)的红外光谱图 

图3为单克隆抗体亚型结构图 

图4为SAR抗体的竞争抑制曲线测定 

图5为SAR抗体检测血浆中SAR浓度随时间变化的曲线 

具体实施方式

(1)本发明所用试剂：菝葜皂苷元是本实验室从知母中分离纯化得到，纯度大于99％；N，N’-二环乙基碳化亚胺(DCC)，N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，弗氏完全佐剂和弗氏不完全佐剂，TMB，单抗亚型试剂盒均购自美国Sigma公司；牛血清白蛋白(BSA)和卵清白蛋白OVA购自美国Roche公司；其他化学试剂均符合分析标准 

(2)Balb/c小鼠，购自扬州大学实验动物中心； 

(3)酶标仪(奥地利Tecan公司)；Shimadzu LC-10A型高效液相色谱仪；Alltech 2000ES型蒸发光检测器。 

实施例1 

单克隆抗体的制备和纯化 

1.免疫原-菝葜皂苷元衍生物与牛血清白蛋白偶联物(SAR-HS-BSA)的制备 

(1)称取50mg的菝葜皂苷元，1g琥珀酸酐，1ml吡啶沸水浴回流反应9小时。反应后产物用氯仿萃取3次后，收集氯仿层浓缩，以氯仿∶甲醇(1∶1)为流动相，采用Sephadex LH-20凝胶柱分离纯化，即得到菝葜皂苷元琥珀酰酯衍生物(SAR-HS)。 

(2)称取SAR-HS 9.8mg、NHS 13mg、DCC 19mg混合于1mL DMF中，置磁力搅拌器上室温搅拌反应4小时后加入10mL含30mg BSA的PBS，4℃搅拌反应过夜。 

(3)反应产物装入透析袋中，双蒸水透析72小时，冷冻干燥得白色粉末，-20℃保存。 

(4)同方法制备SAR-HS与卵清蛋白(21mg)偶联物(SAR-HS-OVA) 

2.免疫动物：将免疫原SAR-HS-BSA溶解于生理盐水中(2mg/mL)，加入等体积的弗氏完全佐剂，充分混合均匀，采用Balb/c雌性小鼠(4-6周)进行皮下免疫。加强免疫时，药物配置方法同上，只是采用弗氏不完全佐剂与溶解于生理盐水的药物混合均匀。通常首次免疫与加强免疫，以及加强免疫之间的时间间隔为14-21天。最后一次免疫时不加弗氏佐剂，直接免疫原溶解于生理盐水中腹腔注射。 

3.细胞融合 

(1)骨髓瘤细胞的培养：用含有10％胎牛血清的DMEM培养基培养sp2/0-Ag14细胞。在10⁴-10⁵个/mL时，一般呈对数生长，只有当细胞处于对数生长期时，生长旺盛，形态良好的细胞才可供融合用。 

(2)准备饲养细胞：融合前一天准备饲养细胞，将Balb/c小鼠脱颈椎处死，采用无菌剪刀剪开腹部皮肤；用注射器将含有HAT的完全培养基打入小鼠腹腔，吸出冲洗液用HAT完全培养基稀释，将饲养细胞加到96孔细胞培养板中，每孔100μL，置37℃培养箱中培养。 

(3)细胞融合：采用间接ELISA方法和间接竞争ELISA法测检测血清抗体效价和特异性，选出效价高，特异性强的Balb/c小鼠，在Balb/c小鼠最后一次免疫的第三天，无菌取其脾脏过100目网筛，用DMEM吹下形成单细胞悬液，用于细胞融合；将处于生长对数期的骨髓瘤细胞sp2/0-Ag14和脾细胞进行充分混合1000rpm离心10min，弃去上清。在45秒内加入预热至40℃的PEG，先慢后快，边加边在水浴中轻摇融合管。加入不完全DMEM培养基20-30mL，水浴中静置5min后1000rpm离心10min，弃去上清；加入HAT培养基后将细胞加入预先铺好饲养细胞的96孔板中，每孔100μL，37℃培养箱中培养。 

(4)阳性细胞株的筛选与克隆 

阳性细胞株的筛选：当克隆团长到孔底面积的1/4-1/5时就可用间接ELISA方法检测阳性细胞株，同时用间接竞争ELISA对阳性细胞进一步筛选。采用间接ELISA方法初筛： 

1)将浓度为5μg/ml的包被抗原(SAR-HS-OVA)包被酶标板，4℃过夜； 

2)采用洗液(含有5％吐温-20的0.01mol/L PBS)洗板后用封闭液(含0.5％明胶的PBS-T)进行封闭，150μL/孔，37℃孵育1h； 

3)洗液洗板后，加入克隆细胞的细胞上清液，另用空白培养基作阴性对照，阳性血清稀释1000倍作阳性对照，各100μL，37℃温箱孵育2h； 

4)洗液洗板，每孔加入稀释10000的HRP标记山羊抗鼠酶标二抗100μL，37℃孵育1h； 

5)洗液洗板，每孔加入显色液100μL，37℃温箱孵育20min后每孔加入50μL终止液后在酶标仪上测定各孔OD_450nm值。 

以OD_450nm值大于阴性对照2倍以上且OD值大于0.5以上为阳性，选阳性孔进行二次筛选。将初次筛选出的阳性杂交瘤进行间接竞争ELISA实验，一方面除去假阳性杂交瘤，另一方面选择特异性强的杂交瘤。具体步骤为： 

1)将浓度为5μg/ml的包被抗原(SAR-HS-OVA)包被酶标板，4℃过夜； 

2)洗液洗板后用封闭液进行封闭，150μL/孔，37℃孵育1h； 

3)洗液洗板后，初次筛选出的阳性孔细胞培养上清与等体积的菝葜皂苷元溶液混合，同 时做标准品(0μg/mL)的空白对照孔，37℃温箱孵育2h，并且做阴性和阳性对照； 

4)同上洗板，加入稀释10000倍的HRP标记山羊抗鼠酶标二抗，100μL/孔，37℃孵育1h； 

5)同上洗板，加入显色底物液100μL/孔，37℃温箱孵育20min；每孔加入50μL终止液后酶标仪测定各孔OD_450nm值； 

选择标准品空白对照OD_450nm值高、阻断抑制后OD_450nm值低的融合细胞孔的细胞进行克隆化。 

4.克隆：采用有限稀释法对检测出的阳性杂交瘤细胞进行亚克隆 

(1)将待克隆化的杂交瘤细胞用血球计数板计数，调整细胞数是1x10⁵，在离心管中加入1mL DMEM完全培养基，取100μL细胞悬液至离心管中补加DMEM到4ml，吹匀，留100μL在管底； 

(2)在离心管中加含有HT的完全培养基至5mL，混匀后滴加至96孔板的前三行，100μL/孔，管底留1.8-2mL左右； 

(3)补加含有HT的完全培养基至5mL，吹匀后滴加至96孔板的D、E、F三行，每孔一滴，管底留1.5-1.8mL左右； 

(4)补加含有HT的完全培养基至2.8-3mL左右，吹匀后滴加至96孔板的G、H行； 

(5)当多克隆细胞孔和单克隆细胞孔都为阳性时，尽可能取单克隆细胞进行再次克隆化，即亚克隆，同时转入24孔板，继而转入培养瓶中进行扩大培养，直至所有细胞孔的培养上清液抗体检测均为阳性； 

(6)通过几轮亚克隆，检测至100％阳性后，挑出单克隆孔定株。 

5.单克隆抗体的产生与纯化 

单克隆抗体的大量制备采用常规动物体内诱生腹水的方法，具体步骤为：经产的Balb/c小鼠腹腔注射降植烷0.5mL；注射后的第10天接种无血清培养基稀释处于对数生长期的杂交瘤细胞。每只小鼠按0.5-1×10⁶个细胞的量注射；观察小鼠的腹部，当发现小鼠异常烦躁、腹腔明显胀大时取腹水，离心管收集腹水；3000r/min离心10min，弃脂肪层和细胞层，收集中间澄清层，-20℃分装保存。用硫酸铵沉淀法进行纯化，得到菝葜皂苷元单克隆抗体。 

实施例2 

菝葜皂苷元单克隆抗体特性鉴定 

为了验证本发明的有效性，进行了以下测定。 

1.免疫原，包被原的偶联鉴定 

通过红外光谱法对免疫原(SAR-HS-BSA)见图1及包被原(SAR-HS-OVA)见图2进行鉴定。其红外光谱除了在985.91，926.51，898.14，866.29cm^-1具有螺甾烷型甾体皂苷的特征 吸收峰外，在3600-3200cm^-1和1700-1600cm^-1区域增加了氨基酸特征吸收峰 

2.阳性克隆细胞株及其产生抗体的鉴定 

经过三次的亚克隆，获得了能识别SAR的单克隆抗体 

(1)单克隆抗体亚型结构鉴定：采用单克隆抗体亚型检测试剂盒鉴定抗体的亚型结构为IgG_2a，见图3 

(2)SAR抗体的特异性鉴定：系列稀释鲁斯可皂苷元，薯蓣皂苷元，短亭山麦冬皂苷C，三七皂苷R1，甘草酸二铵，用间接竞争ELISA方法检测SAR抗体与其的交叉反应：取出5μg/ml的包被抗原包被好的酶标板，洗液洗板后，加入封闭剂37℃封闭1小时；洗液洗板后，每孔加入50μL的竞争药物和50μL稀释到最适浓度的抗体溶液进行竞争反应，37℃孵育2小时；洗液洗板后，加入HRP标记羊抗鼠酶标二抗，100μL/孔，37℃孵育；洗液洗板后，加底物显色，100μL/孔，37℃显色后直接加入2M H₂SO₄，50μl/孔；用酶标仪测定终止反应后的酶标板在450nm处的吸光值。交叉反应计算公式如下： 

Cross-reactivity(％)＝[IC₅₀(半抗原)/IC₅₀(竞争药物)]×100％ 

结果表明：菝葜皂苷元与鲁斯可皂苷元，薯蓣皂苷元，短亭山麦冬皂苷C的交叉反应分别为33％，5.7％，29％，而与三七皂苷R1，甘草酸二铵，齐墩果酸无交叉反应 

表1菝葜皂苷元单克隆抗体与其他药物的交叉反应 

(3)菝葜皂苷元单克隆抗体的竞争抑制曲线测定 

取5μg/ml的包被抗原SAR-HS-OVA包被酶标板，4℃过夜，加入5％明胶的PBS-T，37℃封闭1小时。同时加入倍比稀释的菝葜皂苷元标准品(5ng/ml，10ng/ml，50ng/ml，100ng/ml，500ng/ml，1000ng/ml，5000ng/ml，10000ng/ml)和SAR抗体(稀释1∶10000)各50μL，37℃，2小时，洗板三次。加入酶标二抗100μL，37℃孵育1小时，洗板三次。加入显色液TMB，显色20分钟，酶标仪OD_450mm. 

结果见图4，为IC₅₀的测定曲线，表明：IC₅₀的测定曲线，表明：IC₅₀为330.79ng/ml；线性方程为Y＝-0.9512X 2.3966，R²＝0.9904，为下一步试剂盒组装奠定了良好的基础。 

实施例3 

菝葜皂苷元单克隆抗体的应用 

1.样品制备方法： 

(1)对照品溶液制备 

精密称取SAR对照品1mg，用甲醇配成1mg/mL的溶液。 

(2)供试品溶液制备 

取知母药材，粉碎，过60目筛，精密称取药材粉末0.5g，置具塞锥形瓶中，加入甲醇25mL，称重，静置过夜，超声处理40min，补重，过滤，精密量取续滤液10mL，蒸干，加入10％盐酸11mL沸水浴加热回流2小时，提取液加入40％NaOH中和。氯仿萃取两次，每次30mL。合并氯仿层，回收溶剂，残渣用甲醇溶解定容至2mL。HPLC检测上样前，SAR提取液用0.45μm的滤膜过滤 

(3)HPLC标准曲溶液的配制：用甲醇配置SAR溶液，浓度为1mg/mL。再分别稀释成100μg/mL，150μg/mL，200μg/mL，250μg/mL，300μg/mL，350μg/mL的溶液，用于HPLC-ELSD标曲建立。 

2.方法学考察 

2.1重复性试验 

精密称取知母药材粉末0.5g，平行6份，按样品制备方法制备供试品溶液，间接竞争ELISA法测得SAR含量为0.598％，RSD值为8.7％。 

2.2加样回收率 

精密称取知母药材粉末0.25g，平行9份，置具塞锥形瓶中，添加3.6mg·g^-1、6mg·g^-1、8.4mg mg·g^-1菝葜皂苷元标准品，间接竞争ELISA测得样品的加样回收率分别为92.8％，96.3％，97.4％。此分析方法在添加菝葜皂苷元标准品3.6mg·g^-1、6mg·g^-1、8.4mg·g^-1时的RSD为8.6％，9.3％，3.4％。具体数据见Table2 

表2.ELISA法检测菝葜皂苷元的加样回收率(n＝3) 

3.HPLC-ELSD测定不同产地知母药材SAR的含量 

3.1ELISA测定不同产地知母药材SAR含量 

取5个产地的知母药材，粉碎过筛，按1方法制备供试品溶液，间接竞争ELISA法测定SAR含量所用的标准曲线为图4示的曲线。标准曲线的线性相关系数为R²＝0.9904，，回归方程为线性方程为y＝-0.9512x+2.3966，测出5个不同产地知母提取液与包板SAR竞争抗体后的450nm，代入线性回归方程得出的SAR浓度，再换算成SAR在知母中(干重)的含量。 

3.2HPLC测定不同产地知母药材SAR的含量 

3.2.1HPLC-ELSD色谱条件：色谱柱：Diamonsil柱(250×4.6mm，5μ)；Alltech 2000ES检测器漂移管温度：63℃；载气流速：1.7L/min；流速：1.0mL/min，进样量20ml；流动相∶甲醇-水(95∶5)。 

3.2.2HPLC-ELSD测定不同产地知母药材SAR的含量 

HPLC测定SAR标准品，线性回归方程为y＝1.60082X+3.2593，R²＝0.9976，SAR的出峰时间在19-20min之间，将峰面积带入线性回归方程，求出提取液中SAR的浓度后换算成SAR在知母中(干重)的含量结果。 

3.3ELISA和HPLC-ELSD测定不同产地知母中SAR含量相关性考察 

不同产地知母中SAR含量的ELISA和HPLC-ELSD的测定结果如表3，其相关性曲线Y＝1.1475X-0.5372，R²＝0.9921，HPLC测得的结果与ELISA相当。说明用ELISA测定SAR的方法可行。 

表3.不同产地知母中菝葜皂苷元含量的HPLC-ELSD和ELISA分析 

实施例4 

大鼠灌胃菝葜皂苷元后血浆中菝葜皂苷元含量测定： 

SD大鼠6只，提前12小时禁食，口服灌胃SAR 25mg/kg，分别于给药后0.5，1，2，4，6，8，10，12，24，48h取血。血浆样本8000rpm离心10分钟，上层血清-20℃保存。采用上述间接竞争ELISA方法测定血药浓度，计算的药代动力学参数如表2所示，血药浓度随时间变化见图4。 

表4大鼠灌胃SAR 25mg/kg后药代动力学参数 

Claims (5)

1.一种菝葜皂苷元单克隆抗体制备方法及基于单克隆抗体的分析方法，其单克隆抗体由按常规杂交瘤技术进行骨髓瘤细胞与产生抗菝葜皂苷元抗体的脾细胞融合制备而成的杂交瘤分泌而来。

2.如权利要求1所述的单克隆抗体，特征在于其制备方法采用的脾细胞得自以菝葜皂苷元与牛血清白蛋白偶联物免疫的动物。

3.如权利要求2所述的单克隆抗体，其特征在于，所述的偶联物制备过程如下：

(1)先将菝葜皂苷元琥珀酰酯衍生物(SAR-HS)9.8mg、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)13mg、N，N′-二环乙基碳化亚胺(DCC)19mg混合于1mL DMF中，置磁力搅拌器上室温搅拌反应4小时后加入30mg牛血清白蛋白(BSA)溶液，4℃搅拌反应过夜。反应产物装入透析袋中，双蒸水透析72小时，冷冻干燥得白色粉末，-20℃保存。

(2)用相同方法制备菝葜皂苷元琥珀酰酯衍生物与卵清蛋白(OVA，21mg)的偶联物(SAR-HS-OVA)。

4.如权利要求1所述的单克隆抗体，其特征在于，所述的融合制备过程如下：

(1)菝葜皂苷元琥珀酯衍生物与牛血清白蛋，白偶联物免疫Balb/c小鼠。

(2)将脾细胞与骨髓瘤细胞按5∶1的比例混合，45秒内加入聚乙二醇促进细胞融合，然后加入DMEM培养基水浴中静置10min，离心，弃去上清，细胞加入含有HAT的DMEM培养液，混合均匀后滴加到96孔板内，于CO₂浓度为5％和37℃恒温箱中进行融合细胞培养。

(3)SAR-HS-OVA包被酶标板，筛选阳性杂交瘤细胞。用酶联免疫间接法对细胞上清液进行鉴定：阳性值大于阴性值2倍，且阳性值大于0.5以上的细胞孔内为阳性细胞，纯化、培养并冻存阳性细胞。

(4)阳性克隆的杂交瘤细胞注入石蜡处理的Balb/c小鼠腹腔，进行单克隆抗体的制备。

5.一种菝葜皂苷元单克隆抗体，其特征在于，所述的抗体对菝葜皂苷元具有特异性，与鲁斯可皂苷元，薯蓣皂苷元，短亭山麦冬皂苷C的交叉反应分别为33％，5.7％，29％，而与三七 皂苷R1，甘草酸二铵，齐墩果酸无交叉反应，适用于药材及生物样品中菝葜皂苷元快速痕量检测。 

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