CN106754732A - 喹乙醇杂交瘤细胞株和单克隆抗体及复合免疫吸附剂和免疫亲和柱与试剂盒及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种保藏编号为CGMCC NO.11182的杂交瘤细胞株和由该细胞株分泌得到的单克隆抗体及其应用。本发明还提供了一种免疫吸附剂，该免疫吸附剂包括固相载体和与该固相载体偶联的抗体，所述抗体包括上述单克隆抗体和抗氯霉素的抗体。本发明还提供了装载该免疫吸附剂的免疫亲和柱。本发明还提供了含有上述免疫吸附剂或免疫亲和柱的试剂盒，以及上述免疫吸附剂、免疫亲和柱或试剂盒在纯化和/或检测喹乙醇和氯霉素中的应用，并提供了纯化方法和检测方法。通过使用本发明提供的产品和方法实现了对喹乙醇和氯霉素的同时纯化和/或检测。

Description

喹乙醇杂交瘤细胞株和单克隆抗体及复合免疫吸附剂和免疫亲和柱与 试剂盒及其应用

技术领域

本发明涉及一种杂交瘤细胞株、由该杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体及其应用，由该抗体制得的免疫吸附剂，以及装载该免疫吸附剂的免疫亲和柱和试剂盒，及其它们在纯化和/或检测喹乙醇和氯霉素中的应用。

背景技术

喹乙醇和氯霉素均为广谱抗菌药，被广泛应用于畜牧、水产养殖业。喹乙醇属于喹噁啉-1,4-二氧化物类化合物，曾作为促生长剂广泛应用于畜、禽、水产养殖中。由于喹乙醇对人和动物具有致突变、致畸和致癌等毒性，欧盟于1997年禁止使用喹乙醇。我国限用于体重在35kg以上的猪，禁止在家禽、水产养殖中使用。喹乙醇的残留标示物3-甲基喹噁啉-2-羧酸(MGCA)的最大残留限量为50μg/kg猪肝脏，5μg/kg猪肌肉。氯霉素因对造血系统有严重不良反应，需慎重使用。氯霉素曾广泛用于治疗各种敏感菌感染，后因对造血系统有严重不良反应，故对其临床应用现已做出严格控制。虽然氯霉素为广谱抗生素，但由于其对血液系统的毒性较大，故已较少用。使用氯霉素时应该注意：①主要不良反应有粒细胞及血小板减少、再生障碍性贫血等；②久用可致视神经炎、共济失调及二重感染等；③有时有消化道反应；④新生儿可致灰婴综合症，故禁用；⑤精神病人可致严重反应，故禁用；⑥肌注易致严重反应。婴幼儿应用氯霉素应十分谨慎，除非无其他药物替代而必须使用时方考虑，有条件时可进行血药浓度监测。

目前，几乎没有关于同时检测喹乙醇和苯巴比妥的方法，仅有少量关于喹乙醇和氯霉素的单独检测方法的报道，主要为酶联免疫法(ELISA)、液相色谱法、液相色谱串联质谱法等。然而，酶联免疫法具有特异性不强，线性范围小，且很容易出现假阳性和假阴性结果的缺点；而液相色谱法和液相色谱串联质谱法的样品前处理操作繁琐，灵敏度受样品的纯化、浓缩等步骤的影响较大，并且需要使用如丙酮或二氯甲烷等有毒的试剂。因此，有必要寻找一种尽量少使用有毒试剂的喹乙醇和氯霉素的定量检测方法。

发明内容

本发明的目的是为了克服上述用于喹乙醇和氯霉素含量检测的方法所具有的缺陷，提供一种杂交瘤细胞株、由该杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体，由该抗体制得的免疫吸附剂及其在纯化和/或检测喹乙醇和氯霉素中的应用，以及装载该免疫吸附剂的免疫亲和柱(IAC)和试剂盒，及其它们在纯化和/或检测喹乙醇和氯霉素中的应用，以及提供一种纯化喹乙醇和氯霉素的方法和一种检测喹乙醇和氯霉素的方法。

第一方面，本发明提供了一种杂交瘤细胞株，其中，该杂交瘤细胞株的保藏编号为CGMCC NO.11182。

第二方面，本发明提供了由上述杂交瘤细胞株分泌得到的单克隆抗体。

第三方面，本发明提供了上述单克隆抗体在纯化和/或检测喹乙醇中的应用。

第四方面，本发明提供了一种免疫吸附剂，其特征在于，该免疫吸附剂包括固相载体和与该固相载体偶联的抗体，所述抗体包括上述抗喹乙醇的抗体和抗氯霉素的抗体。

第五方面，本发明提供了一种装载有上述免疫吸附剂的免疫亲和柱。

第六方面，本发明提供了一种含有上述免疫吸附剂或上述免疫亲和柱的试剂盒。

第七方面，本发明提供了上述免疫吸附剂、上述免疫亲和柱、或上述试剂盒在纯化和/或检测喹乙醇和氯霉素中的应用。

第八方面，本发明提供了一种纯化喹乙醇和氯霉素的方法，该方法包括，使含有喹乙醇和氯霉素的液体样品通过上述免疫亲和柱，使得所述液体样品中的至少部分喹乙醇和至少部分氯霉素吸附至该免疫亲和柱上，然后用洗脱液将所述至少部分喹乙醇和至少部分氯霉素洗脱下来。

第九方面，本发明提供了一种检测喹乙醇和氯霉素的方法，该方法包括以下步骤：(1)根据上述纯化喹乙醇和氯霉素的方法制备得到待测液，所述待测液为使用洗脱液将所述至少部分喹乙醇和至少部分氯霉素洗脱下来而得到的溶液；(2)使所述待测液进入检测系统，并通过与标准品比较进行定性或定量检测。

本发明建立了免疫亲和层析-液相色谱法检测喹乙醇和氯霉素的方法，当含有喹乙醇和氯霉素的样品通过装载有本发明提供的免疫吸附剂的免疫亲和柱时，免疫吸附剂可以特异性地吸附喹乙醇和氯霉素，其它的杂质则流出免疫亲和柱，然后使用洗脱剂将喹乙醇和氯霉素从免疫亲和柱中洗脱下来，从而使样品得到了很好的纯化；进一步地，将洗脱后得到的溶液进入检测系统，并通过与标准品比较进行定性或定量检测。综上所述，通过使用本发明提供的产品和方法实现了对喹乙醇和氯霉素的同时纯化和/或检测。免疫亲和层析-液相色谱法由于采用了先进的生物技术，不仅可以检测出许多商品中的喹乙醇和氯霉素的含量，而且其具有特异性强且无需使用如丙酮或二氯甲烷等有毒的试剂等优点。进一步地，在免疫亲和层析-液相色谱法中，还可以将抗喹乙醇的抗体和抗氯霉素的抗体装载在同一亲和柱上，这样通过一次提取、纯化和富集过程，即可以完成两种目标物的纯化和富集，大大简化了前处理过程，提高了检测效率。

本发明的其它特征和优点将在随后的具体实施方式部分予以详细说明。

生物保藏

本发明提供的杂交瘤细胞株为抗喹乙醇单克隆抗体细胞，保藏编号为CGMCC NO.11182。该杂交瘤细胞株已于2015年8月21日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(缩写为CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮政编码：100101)。

附图说明

附图是用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与下面的具体实施方式一起用于解释本发明，但并不构成对本发明的限制。在附图中：

图1为在本发明的实施例1中饲料液体样品中氯霉素的液相色谱图；

图2为在本发明的实施例1中饲料液体样品中喹乙醇的液相色谱图。

具体实施方式

以下对本发明的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。

本发明提供一种杂交瘤细胞株，其中，该杂交瘤细胞株的保藏编号为CGMCC NO.11182。

本发明还提供由上述杂交瘤细胞株分泌得到的单克隆抗体。其中，该单克隆抗体可以为抗喹乙醇的抗体。

根据本发明，本发明提供的上述单克隆抗体可以应用于纯化和/或检测喹乙醇。

在本发明中，保藏编号为CGMCC NO.11182的杂交瘤细胞株及其分泌得到的单克隆抗体的制备方法可以为本领域常规的制备方法，例如，首先将喹乙醇半抗原与载体蛋白偶联，制备作为免疫原，然后将该免疫原对小鼠进行免疫，通过将脾细胞和骨髓瘤细胞进行细胞融合和杂交瘤细胞克隆化筛选得到所需的杂交瘤细胞株以及由其分泌的单克隆抗体。其中，所述载体蛋白可以为牛血清蛋白或卵清蛋白；在优选情况下，所述免疫原与载体蛋白的相对用量可以为本领域常规的选择，例如，所述免疫原与载体蛋白的摩尔比为30-40:1，更优选为35:1。

在一种优选的实施方式中，上述保藏编号为CGMCC NO.11182的杂交瘤细胞株和单克隆抗体的制备方法可以包括以下步骤：

(1)制备喹乙醇免疫原

将喹乙醇溶于有机溶剂中，然后除去有机溶剂(如挥发干燥)，以得到喹乙醇半抗原；然后将上述喹乙醇半抗原与载体蛋白偶联，制备得到喹乙醇免疫原。在优选的情况下，所述有机溶剂为吡啶，所述载体蛋白为牛血清白蛋白(BSA)或卵清蛋白。

(2)制备杂交瘤细胞和抗喹乙醇的单克隆抗体

动物免疫：使用喹乙醇免疫原对免疫动物进行免疫，具体为将喹乙醇免疫原加入弗氏完全佐剂，制成乳化剂进行免疫，之后佐剂改用不完全佐剂，免疫动物数次，免疫结束后处死动物，取脾细胞。

细胞融合：将被免疫小鼠的脾细胞和骨髓瘤细胞进行细胞融合试验，优选情况下，被免疫小鼠的脾细胞与骨髓瘤细胞的比例为8-12:1，更优选为9-11:1。

杂交瘤细胞克隆化：采用有限稀释法筛选杂交瘤细胞，直到得到对喹乙醇有很好的特异性反应的细胞。最后，筛选出分泌喹乙醇抗体的杂交瘤细胞CGMCC NO.11182，培养该杂交瘤细胞即可制备出抗喹乙醇的单克隆抗体。

本发明还提供了一种免疫吸附剂，其特征在于，该免疫吸附剂包括固相载体和与该固相载体偶联的抗体，所述抗体包括由上述保藏编号为CGMCCNO.11182的杂交瘤细胞株分泌得到的单克隆抗体(抗体A)和抗氯霉素的抗体(抗体B)。

在本发明中，对所述抗体B没有特别的限定，可以为本领域的常规选择，例如，可以为市售的各种抗氯霉素的抗体或者杂交瘤细胞株CGMCCNo.1605(参见CN 100338030C)分泌的单克隆抗体。优选地，由抗氯霉素的抗体制备的免疫亲和柱的回收率大于80％。

进一步优选地，抗体B可以为通过以下方法制得的单克隆抗体：

(1)制备氯霉素免疫原

将氯霉素溶于有机溶剂中，然后除去有机溶剂(如挥发干燥)，以得到氯霉素半抗原；然后将上述氯霉素半抗原与载体蛋白偶联，制备得到氯霉素免疫原。在优选的情况下，所述有机溶剂为吡啶，所述载体蛋白为牛血清白蛋白(BSA)或卵清蛋白。

(2)制备杂交瘤细胞和抗氯霉素的单克隆抗体

动物免疫：使用氯霉素免疫原对免疫动物进行免疫，具体为将氯霉素免疫原加入弗氏完全佐剂，制成乳化剂进行免疫，之后佐剂改用不完全佐剂，免疫动物数次，免疫结束后处死动物，取脾细胞。

细胞融合：被免疫小鼠的脾细胞和骨髓瘤细胞进行细胞融合试验，优选情况下，被免疫小鼠的脾细胞与骨髓瘤细胞的比例为8-12:1，更优选为9-11:1。

杂交瘤细胞克隆化：采用有限稀释法筛选杂交瘤细胞，直到得到对氯霉素有很好的特异性反应的细胞。最后，筛选出分泌氯霉素抗体的杂交瘤细胞，培养该杂交瘤细胞即可制备出抗氯霉素的单克隆抗体。

在本发明的一种优选的实施方式中，从CN 100338030C中公开的保藏编号为CGMCC NO.1605的杂交瘤细胞的培养液中提取和纯化单克隆抗体，获得抗体B。

在本发明中，所述固相载体可以为本领域常规的各种适用于与抗体进行偶联的固相载体，例如为纤维素、葡聚糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶、多孔玻璃、琼脂糖凝胶和聚丙烯酰胺-琼脂糖凝胶中的至少一种，优选为溴化氰(CNBr)活化的琼脂糖凝胶；所述琼脂糖凝胶的浓度可以为常规的各种选择，如4％。该CNBr活化的琼脂糖凝胶可以以干粉形式商购获得，如购自美国GE公司，使用时，加入酸溶液进行溶胀即可，该酸处理方法已为本领域技术人员公知，在此不再赘述。当使用冻干形式并含有添加剂的CNBr活化的琼脂糖凝胶时，优选在低pH值(如pH值为2-3)的条件下洗去添加剂，然后再与抗体进行偶联。

在本发明中，所述将抗体A和抗体B与固相载体偶联的方法可以为本领域常规的方法，在优选的情况下，该方法可以包括以下步骤：

(1)使用偶联缓冲液溶解抗体，所述抗体为抗体A和抗体B，得到第一抗体溶液；

(2)将所述第一抗体溶液与活化的固相载体接触进行偶联，得到偶联液；

(3)将偶联液中偶联后的固相载体转移至偶联缓冲液中静置，以封闭偶联液中偶联后的固相载体上的残留活性位点；

(4)用洗涤液洗涤静置后的固相载体，以去除未偶联的抗体，得到洗涤后的固相载体；

(5)用含有0.001-0.1重量％的NaN₃的PBS缓冲液清洗洗涤后的固相载体。

在本发明中，对所述抗体和固相载体的用量比没有特别的限定，一般地，使所述抗体与固相载体尽可能饱和偶联，因此，所述抗体一般过量于固相载体。但是，本领域技术人员也可以根据需要选择抗体与固相载体的用量比。本发明中，所述抗体与固相载体的重量比优选为1：30-60，优选为1：35-55。

在优选情况下，在所述免疫吸附剂中，抗体A与抗体B的重量比为1:0.8-2，优选为1:1-2。

在本发明中，在步骤(1)中，所述偶联缓冲液可以为本领域常规的各种选择，如0.1-0.3M的NaHCO₃溶液，pH值可以为8-8.5。

在本发明中，在步骤(2)中，所述偶联的条件和偶联方法可以为常规的选择，例如，可以在20-25℃条件下，采用翻转式(end-over-end)的方法将抗体与固相载体充分均匀混合1-24小时。

在本发明中，在步骤(3)中，所述封闭偶联液中偶联后的固相载体上的残留活性位点的方法也可以为本领域的常规方法，例如，可以将固相载体转移至0.05-1M的Tris-HCl缓冲液(pH 8)或者0.8-1.2M的乙醇胺(pH 8-8.5)中静置，其中，所述静置的条件可以为，在4-25℃下静置2-20h，优选为在20-25℃下静置2-6h或者在4-6℃下静置16-20h。

在本发明中，在步骤(4)中，所述用洗涤液洗涤静置后的固相载体中的洗涤液可以为低、高两种pH值的缓冲液，在优选情况下，可以为pH 4-4.5的醋酸盐缓冲液和pH 8-8.5的Tris-HCl缓冲液；所述洗涤的条件只要使得未偶联的抗体基本被除去即可，在优选情况下，按照依次用低、高pH的缓冲液洗涤的顺序至少洗涤3个循环。

在本发明中，可以通过测量未偶联的抗体的量来计算两种抗体总的偶联率，偶联率计算公式为：

公式I

所述测量未偶联的抗体的量的方法可以为本领域常规的方法，例如，可以通过紫外测定偶联后的上清液中的蛋白浓度。

本发明还提供了装载有上述免疫吸附剂的免疫亲和柱。其中，将免疫吸附剂制备成免疫亲和柱的方法为本领域技术人员公知。例如，将经上述步骤(5)清洗后的固相载体装柱。所述含有0.001-0.1重量％的NaN₃的PBS缓冲液(PBS缓冲液的组成为1L溶液中含有磷酸二氢钾0.27g、12水合磷酸氢二钠2.86g、氯化钾0.2g、氯化钠8.8g)可以作为该免疫亲和柱的保存液。

在本发明中，装柱的方法可以为本领域的常规选择，例如可以为：将凝胶和保存液进行混合以制成浆液，以连续性的操作向柱内倾入浆液进行填柱。填柱后，插入顶端筛板至亲和柱中，并使用经无菌过滤的保存液过柱。

本发明还提供了含有上述免疫吸附剂或含有上述免疫亲和柱的试剂盒。优选地，所述试剂盒中还包括洗脱液和/或保存液。所述洗脱液优选为甲醇、乙腈和丙酮中的至少一种，最优选为色谱级甲醇。所述保存液优选为含有0.001-0.1重量％的NaN₃的PBS缓冲液。

在本发明中，上述试剂盒还可以包括盒体、喹乙醇和氯霉素的标准品、洗涤液、海绵托架中的至少一种。其中，所述洗涤液可以为常规使用的磷酸盐缓冲液(即1L水中含有0.2g磷酸二氢钾、0.2g氯化钾、2.9g十二水合磷酸氢二钠和8.8g氯化钠的溶液)或水；所述海绵托架上设有孔和凹槽，所述凹槽中装有上述标准品溶液、装有上述各种溶液的试剂瓶，以及装有上述免疫吸附剂的免疫亲和柱。

本发明还提供了上述免疫吸附剂、上述免疫亲和柱、或上述试剂盒在纯化和/或检测喹乙醇和氯霉素中的应用。

本发明还提供了一种纯化喹乙醇和氯霉素的方法，该方法包括，使含有喹乙醇和氯霉素的液体样品通过上述免疫亲和柱，使得所述液体样品中的至少部分(或全部)喹乙醇和至少部分(或全部)氯霉素吸附至该免疫亲和柱上，然后用洗脱液将所述至少部分喹乙醇和至少部分氯霉素洗脱下来，所述洗脱液优选为甲醇、乙腈和丙酮中的至少一种，优选为色谱纯甲醇。

在本发明中，上述纯化喹乙醇和氯霉素的方法还可以包括在洗脱液洗脱之前，用洗涤液对免疫亲和柱进行洗涤，以除去免疫亲和柱上非特异性吸附的残余的液体样品。所述洗涤液可以为水、磷酸盐缓冲液(PBS缓冲液)和甲醇中的至少一种。

根据本发明，所述含有喹乙醇和氯霉素的液体样品为饲料的液体提取物、食品的液体提取物、生物样品的液体提取物和中药的液体提取物中的至少一种，优选为饲料的液体提取物。

在本发明中，将所述饲料、食品、生物制品和中药制成液体提取物的方法可以为本领域常规的方法，例如，可以包括以下步骤：将乙腈/水(6.5-7.5:3，体积比)与样品(饲料、食品、生物制品或中药)混合进行萃取，将萃取液进行固液分离即得到液体提取物。优选地，所述固液分离的方式包括：使用槽纹滤纸进行过滤，将得到的滤液稀释(如使用磷酸盐缓冲液稀释5倍)后再用玻璃纤维滤纸进行二次过滤。

根据本发明，在优选的情况下，在所述含有喹乙醇和氯霉素的液体样品中，喹乙醇的浓度为0.5-50μg/L，优选为0.8-20μg/L，更优选为1-5μg/L。氯霉素的浓度为1-100μg/L，优选为1.5-50μg/L，更优选为2.5-10μg/L。

本发明还提供了一种检测喹乙醇和氯霉素的方法，该方法包括以下步骤：

(1)根据上述方法制备得到待测液，所述待测液为使用洗脱液将所述至少部分喹乙醇和至少部分氯霉素洗脱下来而得到的溶液；

(2)使所述待测液进入检测系统，并通过与标准品比较进行定性或定量检测。

在本发明中，对于检测的具体方式没有特别的限定，例如，可以是先收集得到待测液，然后再手动使待测液进入检测系统，也可以为连用系统，使待测液自动进入检测系统进行检测。其中，所述检测系统可以为本领域常规的各种用于分析检测的仪器，优选使用液相色谱仪。

在本发明中，在步骤(2)中，所述“与标准品比较”的方法可以为本领域的常规方法，例如，首先通过液相色谱对准确配置成一定浓度的标准品进行检测，确定该标准品的特征峰位置以及峰面积(或峰高)与浓度之间的关系；然后，在同样条件下对待测液进行检测，通过与标准品出峰位置的比较，确认待测液中是否存在与标准品相同的物质，通过与标准品的峰面积(或峰高)的比较，确定待测液中与标准品相同的物质和/或其含量。

以下将通过实施例对本发明进行详细描述。以下实施例中，室温指25℃。

制备例1

本制备例用于制备喹乙醇免疫原

准确称量喹乙醇15mg，溶于1000uL吡啶中，加入97mg丁基硼酸。混合物在室温下搅拌20h。然后在搅拌的情况下加入1.7mol/L琥珀酐吡啶溶液2000μL，反应管密闭，混合物在沸水浴中搅拌反应3h，然后将溶剂吡啶在100℃氮气下挥发干燥，以得到半抗原。

分别称取N,N-二环己碳二亚胺7.8mg、N-羟基琥珀酰亚胺13.8mg，和上步制备的半抗原溶于1000μL的二甲基甲酰胺(DMF)中，室温搅拌2h，以得到半抗原溶液；并称取5mg BSA溶于2mL pH7.0PBS缓冲液中，然后在搅拌的同时缓慢滴加400μL半抗原溶液。4℃下缓慢搅拌反应24h。用pH7.0PBS溶液透析3d，每天换透析液3次，以得到喹乙醇免疫原。

制备例2

本制备例用于制备抗喹乙醇的单克隆抗体(抗体A)以及抗氯霉素的单克隆抗体(抗体B)。

(1)抗喹乙醇的单克隆抗体的制备

动物免疫：免疫动物为6-8周龄左右的雌性BALB/c小鼠。使用喹乙醇免疫原免疫5只小鼠。取适量喹乙醇免疫原(100mg/只)加等量弗氏完全佐剂，制成乳化剂进行免疫，之后佐剂改为不完全佐剂，共免疫6次，每次间隔2周。除第一次为颈背部皮下多点注射外，其余均为腹腔注射。免疫结束后处死小鼠，取脾细胞。

细胞融合：被免疫小鼠的脾细胞和骨髓瘤细胞按照10:1的比例进行细胞融合试验。

杂交瘤细胞克隆化：采用有限稀释法筛选杂交瘤细胞，直到得到对喹乙醇有很好的特异性反应的细胞。最后，筛选出分泌喹乙醇抗体的杂交瘤细胞CGMCC NO.11182，并参照《精编蛋白质科学实验指南》(科利根等人，科学出版社，2007)第8章从细胞CGMCC NO.11182的培养液中提取和纯化单克隆抗体，获得纯化的抗体A(或参照CN 101560255A中权利要求2记载的方法获得)。

(2)抗氯霉素的单克隆抗体的制备

按照上述步骤(1)中描述的杂交瘤细胞克隆化的方法，从CN100338030C中公开的保藏编号为CGMCC NO.1605的杂交瘤细胞的培养液中提取和纯化单克隆抗体，获得纯化的抗体B。

制备例3

本制备例用于制备免疫亲和柱

(1)抗体偶联

a、用0.1mol/L NaHCO₃pH 8.3偶联缓冲液4℃透析抗体A和抗体B 24h，抗体A与抗体B的重量比为1:1.5，然后用偶联缓冲液控制抗体总浓度，约2mg/mL，以备偶联使用。使用10mL偶联缓冲液洗涤溶涨后的经CNBr活化的琼脂糖凝胶(Sepharose 4B)，洗涤后，迅速将CNBr活化的Sepharose4B转移到抗体溶液中。2g基质Sepharose 4B与10mg单克隆抗体偶联。

b、室温条件(25℃)下采用end-over-end的方式充分混匀上述的混合物2h。

c、2000rpm离心1min，将Sepharose 4B离心至管底，将上清液转移至新的离心管中，冰浴保存，测定上清液中蛋白质的含量。通过公式I计算出抗体A和抗体B的总偶联率为99.5％，说明偶联很成功。

d、取离心管底的Sepharose 4B，使用至少5倍基质体积的偶联缓冲液进行洗涤，除去未偶联的抗体。

e、封闭所有残留的活性基团。转移基质至0.1mol/L的Tris-HCl缓冲液(pH 8)。4℃条件下静置16h。

f、为除去未偶联的抗体，依次用低、高两种pH的缓冲液对基质进行洗涤，至少洗涤3个循环，每种缓冲液的使用量至少5倍基质体积。

每个洗涤循环步骤：先用0.1mol/L醋酸-醋酸钠，含0.5mol/L NaCl的缓冲液(pH 4)洗涤，接着再用0.1mol/L Tris-HCl，含0.5mol/L NaCl的缓冲液(pH 8)进行洗涤。

(2)装柱

使用保存液制备浆液，以75％琼脂糖凝胶和25％保存液的比例进行混合。以连续性的操作向柱内倾入浆液。使用一个斜靠在柱内壁上的玻璃棒进行填柱操作，将有助于减少气泡的产生。填柱后，关闭亲和柱下端的开口，并取下亲和柱的顶端部件。仔细操作，加入保存液充填亲和柱的余下部分，以在亲和柱的顶端形成一个向上的弯液面。将顶端筛板以一定的角度插入到亲和柱中，确保在筛板的下方没有空气。将筛板锁定在基质表面适当的位置上，打开亲和柱下方的开口，用5倍柱床体积的无菌过滤的保存液过柱，并使用保存液保存，至此，亲和柱已装填并平衡完毕，可供直接使用。

实施例1

本实施例用于检测饲料样品中的喹乙醇和氯霉素

(1)饲料样品的前处理

同时添加质量含量为20μg/kg喹乙醇和50μg/kg氯霉素、50μg/kg喹乙醇和100μg/kg氯霉素、或100μg/kg喹乙醇和200μg/kg氯霉素至饲料样品中，磨细添加后的饲料样品(粒度小于1mm)并准确称取25g于250mL具塞锥形瓶中，加入100mL乙腈/水(7:3，v/v)溶液，以均质器高速搅拌提取2min。槽纹滤纸过滤，准确移取5mL滤液于25mL容量瓶中，用pH7.4的PBS定容至25mL，用玻璃纤维滤纸过滤，至滤液澄清，以制得液体样品。

(2)加标回收实验

将复合免疫亲和柱连接于10mL玻璃注射器下。准确移取8mL液体样品提取液注入玻璃注射器中，将空气压力泵与玻璃注射器连接，调节压力使溶液以约2mL/min(1滴/秒)流速缓慢通过复合免疫亲和柱，直至2mL空气通过柱体。以2mL/min(1滴/秒)流速用10mL水淋洗柱子1次，弃去全部流出液，并使2mL空气通过柱体。准确加入2mL色谱级甲醇洗脱，流速为2mL/min(1滴/秒)，收集全部洗脱液于玻璃试管中，50℃下氮气浓缩吹干后，用流动相定容至0.5mL，供高效液相色谱(HPLC)分析。

(3)高效液相色谱检测

HPLC条件：

喹乙醇的色谱条件可以为：

色谱柱：Cloversil-C18，4.6×250mm

流动相：甲醇:水＝30:70(v/v)

流速：0.8mL/min

检测器：紫外检测器，波长260nm

进样体积：50μL

氯霉素的色谱条件可以为：

色谱柱：Cloversil-C18，4.6×150mm(5um)

流动相：甲醇:水＝50:50(v/v)

流速：0.8mL/min

检测器：紫外检测器，波长278nm

进样体积：50μL

用进样器吸取50μL饲料液体样品注入高效液相色谱仪，在上述色谱条件下测定饲料液体样品的响应值(峰高或峰面积)。

图1为饲料样品(添加50μg/kg喹乙醇和100μg/kg氯霉素)中氯霉素添加回收实验的液相色谱图；

图2为饲料样品(添加50μg/kg喹乙醇和100μg/kg氯霉素)中喹乙醇添加回收实验的液相色谱图。

根据公式II计算添加回收率。

公式II

检测结果如表1和表2所示。其中，表1中示出的是饲料样品中氯霉素的添加回收率和相对标准偏差(RSD)；表2中示出的是饲料样品中喹乙醇的添加回收率和相对标准偏差(RSD)。

表1

表2

由表1和表2的检测结果可以看出，饲料样品中的喹乙醇和氯霉素的添加回收率都在79.5-99.6％之间，RSD均小于8％，这表明本发明提供的方法完全满足饲料中喹乙醇和氯霉素检测的分析要求。

以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。

另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合。为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。

此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。

Claims (10)

1.一种杂交瘤细胞株，其特征在于，该杂交瘤细胞株的保藏编号为CGMCC NO.11182。

2.由权利要求1所述的杂交瘤细胞株分泌得到的单克隆抗体。

3.权利要求2所述的单克隆抗体在纯化和/或检测喹乙醇中的应用。

4.一种免疫吸附剂，其特征在于，该免疫吸附剂包括固相载体和与该固相载体偶联的抗体，所述抗体包括权利要求2所述的单克隆抗体和抗氯霉素的抗体；

优选地，在所述免疫吸附剂中，权利要求2所述的单克隆抗体与抗氯霉素的抗体的重量比为1:0.8-2，优选为1:1-2。

5.装载有权利要求4所述的免疫吸附剂的免疫亲和柱。

6.含有权利要求4所述的免疫吸附剂或含有权利要求5所述的免疫亲和柱的试剂盒；优选地，所述试剂盒中还包括洗脱液和/或保存液，所述洗脱液优选为甲醇、乙腈和丙酮中的至少一种，所述保存液优选为含有0.001-0.1重量％的NaN₃的PBS缓冲液。

7.权利要求4所述的免疫吸附剂、权利要求5所述的免疫亲和柱、或权利要求6所述的试剂盒在纯化和/或检测喹乙醇和氯霉素中的应用。

8.一种纯化喹乙醇和氯霉素的方法，该方法包括：使含有喹乙醇和氯霉素的液体样品通过权利要求5所述的免疫亲和柱，使得所述液体样品中的至少部分喹乙醇和至少部分氯霉素吸附至该免疫亲和柱上，然后用洗脱液将所述至少部分喹乙醇和至少部分氯霉素洗脱下来，所述洗脱液优选为甲醇、乙腈和丙酮中的至少一种。

9.根据权利要求8所述的方法，其中，所述含有喹乙醇和氯霉素的液体样品为饲料的液体提取物、食品的液体提取物、生物样品的液体提取物和中药的液体提取物中的至少一种；

优选地，在所述含有喹乙醇和氯霉素的液体样品中，喹乙醇的浓度为0.5-50μg/L，优选为0.8-20μg/L，更优选为1-5μg/L；氯霉素的浓度为1-100μg/L，优选为1.5-50μg/L，更优选为2.5-10μg/L。

10.一种检测喹乙醇和氯霉素的方法，该方法包括以下步骤：

(1)根据权利要求8或9所述的方法制备得到待测液，所述待测液为使用洗脱液将所述至少部分喹乙醇和至少部分氯霉素洗脱下来而得到的溶液；

(2)使所述待测液进入检测系统，并通过与标准品比较进行定性或定量检测。