KR101058290B1 - 면역글로불린 단편을 이용한 인슐린분비 펩타이드 약물결합체 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 인슐린분비 펩타이드(insulinotropic peptide), 비펩타이드성 중합체 및 면역글로불린 Fc 영역이 상호 공유결합에 의해 연결되어 있어 생체 내 지속성 및 안정성이 향상된 인슐린분비 펩타이드 결합체 및 그 이용에 관한 것이다. 본 발명의 인슐린분비 펩타이드 결합체는 생리활성을 나타내는 펩타이드의 생체 내 활성이 비교적 높게 유지되고, 혈중 반감기가 현저히 증가되어 다양한 펩타이드 약물의 지속형 제형 개발에 유용하게 이용될 수 있다.
면역글로불린 Fc, 인슐린분비 펩타이드 결합체, 부위 특이적, 비펩타이드성 중합체

Description

면역글로불린 단편을 이용한 인슐린분비 펩타이드 약물 결합체{An insulinotropic complex using an immunoglobulin fragment}
본 발명은 인슐린분비 펩타이드의 지속형 제형을 위한 인슐린분비 펩타이드 결합체에 관한 발명으로서, 구체적으로 인슐린분비 펩타이드, 비펩타이드성 중합체 및 면역글로불린 Fc 영역이 공유 결합에 의해 상호 연결되어 특정 아미노산 잔기에 대한 부위 선택적 결합방법과 특정 아미노산 잔기의 변형에 의해 생체 내 효력지속효과를 보다 획기적으로 증가시킨 변형된 인슐린분비 펩타이드 결합체 및 이의 제조방법에 관한 것이다.
펩타이드는 일반적으로 안정성이 낮아 쉽게 변성되고 체내 단백질 가수 분해 효소에 의해 분해되어 그 활성을 잃으며, 또한 상대적으로 크기가 작아 신장을 통해 쉽게 제거 되기 때문에 약리 성분으로 펩타이드를 포함하는 의약품의 혈중 농도 및 역가를 유지하기 위해서는 펩타이드 약물을 환자에게 자주 투여할 필요가 있다. 그러나 펩타이드 약물은 대부분 주사제 형태로 환자에게 투여되며, 따라서 생리활성 펩타이드의 혈중 농도를 유지하기 위해 자주 주사하게 되는데, 이는 환자의 엄청난 고통을 야기하게 된다. 이러한 문제점을 극복하기 위해 다양한 시도가 있어왔 으며, 그 중 하나로 펩타이드의 약물의 생체막 투과도를 증가시켜 구강 또는 비강을 통한 흡입으로 펩타이드의 약물을 체내로 전달하는 시도가 있었다. 그러나 이러한 방법은 주사제에 비해 펩타이드의 체내 전달 효율이 현저히 낮으며 따라서 펩타이드 약물의 체내 활성을, 요구되는 조건으로 유지하는데 아직까지는 어려움이 많다.
한편, 펩타이드 약물의 혈중 안정성을 증가시키고 혈중 약물 농도를 오랫동안 높게 지속시켜 약효를 극대화하려는 노력이 계속되어 왔는데, 이러한 펩타이드 약물의 지속형 제제는 펩타이드 약물의 안정성을 높이는 동시에 약물 자체의 역가가 충분히 높게 유지되어야 하고 환자에게 면역반응을 유발하지 않아야 한다.
펩타이드를 안정화시키고 단백질 가수분해 효소에 의한 분해를 억제하기 위한 방법으로, 단백질 가수분해효소에 민감한 특정 아미노산 서열을 변경하는 시도가 있어왔다. 예를 들어 혈중 글루코스 농도를 감소시키는 작용을 하여 제2형 당뇨병 치료 효능을 가지고 있는 GLP-1(7-37 또는 7-36 amide) 의 경우 생리 활성 반감기가 4분 이하로(Kreymann et al., 1987) 매우 짧은데, 이는 디펩티딜 펩티데이즈(Dipeptidyl pepdidase IV, DPP IV) 에 의한 GLP-1 의 아미노산 8번(Ala) 와 9번(Asp) 사이의 절단에 의한 GLP-1의 역가 상실에 기인하며, 따라서 DPP IV 에 저항성을 갖는 GLP-1 유사체에 대한 여러 연구가 수행되었는데, Ala8 를 Gly로 치환하 거나(Deacon et al., 1998; Burcelin et al., 1999) 또는 Leu, D-Ala로 치환하여(Xiao et al., 2001) DPP IV 에 대한 저항성을 증가시키면서 활성을 유지하는 시도가 있었다. 또한 GLP-1의 N 말단 아미노산 His7은 GLP-1 의 활성에 매우 중요함과 동시에 DPP IV의 타겟이며, 따라서 US 5,545,618에서는 N 말단을 alkyl 또는 acyl group 변형하였으며, Gallwitz등은 7번 His를 N-메틸화(N-methylation), 알파-메틸화(alpha-metylaltion) 시키거나 His 전체를 이미다졸로 치환하여 DPP IV 저항성을 증가시키고 생리활성을 유지하였다.
이러한 변형체 이외에 글리아 몬스터 도마뱀(glia monster)의 침샘으로부터 정제된 GLP-1 유사체인 엑센딘(엑센딘)-4 (US 5,424,686)는 DPP IV 에 대한 저항성과 함께 GLP-1 보다 높은 생리 활성을 가지며 따라서 체내 반감기가 2-4시간으로 GLP-1에 비해 길어졌다. 그러나 DPP IV의 저항성을 증가시키는 방법만으로는 충분한 생리 활성의 지속시간을 기대할 수 없는데, 예를 들어 현재 시판되고 있는 엑센딘-4(엑세나티드, exenatide)의 경우 환자에게 하루 2회 주사를 통해 투여되어야 하며 이는 여전히 환자에게 큰 부담이 아닐 수 없다.
이러한 인슐린분비 펩타이드의 문제점은 펩타이드의 크기가 작아 신장에서 회수되지 못하고 체외로 소실되는 것에서 기인하는 바가 크며 따라서 신장 소실을 억제하기 위해 폴리에틸렌글리콜(PEG) 과 같은 용해도가 높은 고분자 물질을 펩타 이드 표면에 화학적으로 부가시키는 방법이 사용되어왔다.
PEG는 목적 펩타이드의 특정 부위 또는 다양한 부위에 비특이적으로 결합하여 펩타이드의 분자량을 증가시켜 신장에 의한 소실을 억제하고 가수분해를 방지하는데 효과가 있으며 특별한 부작용도 일으키지 않는다. 예를 들어, WO2006/076471은 NPR-A에 결합하여 cGMP의 생산을 활성화하여 동맥 내 혈압을 감소시키며 따라서 울혈성 심부전증(Congestive heart failure) 치료제로 사용되는 B형 나트륨배설증가펩타이드(B-type natriuretic 펩타이드, BNP)에 PEG를 결합하여 생리 활성을 지속시키는 것에 대해 기술하고 있으며, US 6,924,264에서는 엑센딘-4의 라이신 잔기에 PEG를 결합시켜 생체 내 지속 시간을 증가시키는 방법을 기술하고 있다. 그러나 이러한 방법은 PEG 분자량을 증가시켜 펩타이드 약물의 생체 내 지속시간을 연장할 수 있는 반면, 분자량이 증가할수록 펩타이드 약물의 역가가 현저히 낮아지고, 또한 펩타이드와의 반응성이 낮아져 수율이 감소하는 문제가 있다.
WO 02/46227는 재조합 유전자 기술을 이용한 GLP-1 및 엑센딘-4 또는 그 유사체와 인간 혈청 알부민 또는 면역 글로불린 단편(Fc) 과의 융합단백질에 대해 기술하고 있으며, US 6,756,480는 부갑상선 호르몬(PTH) 및 그 유사체와 Fc 융합단백질에 대해 기술하고 있다. 이러한 방법은 낮은 페길화(pegylation) 수율 문제와 비특이성을 극복할 수 있는 반면에, 혈중반감기 증가효과가 예상보다 획기적이지 못하고 경우에 따라서는 역가가 낮은 문제점을 지니고 있다. 혈중반감기 증가효과 를 극대화하기 위하여 다양한 종류의 펩타이드 링커가 사용되기도 하지만 면역 반응을 유발할 수 있는 가능성이 있다. 또한 BNP와 같이 디설파이드 결합(disulfide bond)을 가지고 있는 펩타이드를 이용할 경우 미스폴딩(misfolding)의 확률이 높아 적용이 어렵다는 문제점이 있다.
이밖에 GLP-1 유도체인 NN2211은 GLP-1의 아미노산을 치환하고 아실 측쇄(acyl side chain)를 결합시켜 알부민과 비공유 결합을 이루게 함으로써 체내 지속 시간을 증가시켰으나 반감기가 11-15시간으로 엑센딘-4에 비해 현저한 증가가 없어 여전히 1일 1회 주사를 통한 투여가 필요하다(Nauck et al., 2004). 또한 CJC-1131 의 경우 GLP-1 과 알부민이 혈액 내에서 공유결합 되도록 말레이미드(Maleimide) 반응기가 연결된 GLP-1 유도체로서 생체내 반감기 증가를 목적으로 개발을 시도하였지만 최근에 개발이 중단된 상태이다. 후속물질인 CJC-1134는 재조합 알부민과 공유결합으로 연결된 엑센딘-4로서 혈중반감기가 약 17시간(Rat)으로 현저한 혈중안정성 증가 효과를 보이지 않았다(Thibauoleau et.al., 2006).
이에, 본 발명자들은 인슐린분비 펩타이드의 혈중반감기 증가 및 생체 내 활성유지를 동시에 극대화할 수 있는 방법으로 면역글로불린 Fc 영역, 비펩타이드성 중합체 및 인슐린 분비 펩타이드를 공유결합에 의해 N-말단 이외의 아미노산 잔기에 부위 선택적으로 상호 연결시키는 제조방법을 사용하여 결합체의 생체 내 효력 지속효과가 획기적으로 증가됨을 확인하였으며, 특히 인슐린 분비 펩타이드 중 엑센딘-4 및 엑센딘-4의 N-말단의 아민 그룹을 제거한 데스-아미노-히스티딜 엑센딘- 4, 엑센딘-4의 N-말단 아민 그룹을 하이드록실 그룹으로 치환한 베타-히드록시-이미다조-프로피오닐 엑센딘-4, 엑센딘-4의 N-말단 아민 그룹을 두 개의 메틸 그룹으로 수식한 디메틸-히스티딜 엑센딘-4, 및 엑센딘-4의 첫 번째 아미노산인 히스티딘의 알파 탄소 및 알파 탄소에 결합된 N-말단 아민 그룹을 제거한 이미다조-아세틸-엑센딘-4등의 결합체의 생체 내 효력 지속효과가 획기적으로 증가되는 것을 확인하고 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 인슐린분비 펩타이드 의 생체 내 활성을 유지하면서 혈중 반감기를 연장시켜 월등히 우수한 인슐린분비 펩타이드 지속형 제제를 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위한 하나의 양태로서, 본 발명은 인슐린분비 펩타이드 및 면역글로불린 Fc 영역이 양 말단에 반응기를 갖는 비펩타이드성 중합체를 통하여 상호 공유결합에 의해 연결되어 있는 지속형 인슐린분비 펩타이드 결합체에 관한 것이다.
본 발명에서 사용되는 인슐린분비 펩타이드는, 인슐린 분비기능을 보유한 펩타이드로서 췌장 베타세포의 인슐린의 합성 및 발현을 자극한다. 이러한 펩타이드는, 전구물질(precursors), 아고니스트 (agonist), 유도체(derivatives), 단편(fragments) 및 변이체(variants) 등을 포함하며 바람직하게는 GLP(Glucagon like 펩타이드)-1, 엑센딘 3(exendin 3) 및 엑센딘 4(exendin 4) 등이다.
GLP-1 은 소장에서 분비되는 호르몬으로서 일반적으로 인슐린 생합성 및 분비를 촉진하고 글루카곤 분비를 억제하며 세포 내 글루코스 흡수를 촉진한다. 소장에서 글루카곤 전구체는 3개의 펩타이드로 분해되는데, 글루카곤, GLP-1, GLP-2이다. 여기서 GLP-1 은 GLP-1(1-37) 을 의미하며 인슐린 분비기능이 없는 형태이고 GLP-1(7-37) 형태로 프로세싱되어 활성형 GLP-1(7-37) 이 된다. GLP-1(7-37) 아미노산 서열은 아래와 같다 :
GLP-1(7-37)
HAEGT FTSDV SSYLE GQAAK EFIAW LVKGR G
GLP-1 유도체는, GLP-1과 비교 시 최소한 80% 이상 아미노산 서열에서 상동성을 보이며, 화학적으로 수식된 형태일 수도 있고, 인슐린 분비기능도 최소한 동등 또는 그 이상을 나타내는 펩타이드를 의미한다.
GLP-1 단편은, 천연형 GLP-1 의 N-말단 또는 C-말단에 하나 또는 그 이상 아미노산이 추가 또는 삭제된 형태를 의미하며 추가된 아미노산은 천연에 존재하지 않는 아미노산(예; D형 아미노산) 도 가능하다.
GLP-1 변이체는, 천연형 GLP-1 과 아미노산서열이 하나 이상 다른 펩타이드로 인슐린 분비기능을 보유한 펩타이드를 의미한다.
엑센딘 3 와 엑센딘 4는, GLP-1 과 53%의 아미노산 서열 유사성을 보이는 39개 아미노산으로 이루어진 인슐린분비 펩타이드이며, 엑센딘-3와 엑센딘-4의 아미노산서열은 아래와 같다.
엑센딘-3
HSDGT FTSDL SKQME EEAVR LFIEW LKNGG PSSGA PPPS
엑센딘-4
HGEGT FTSDL SKQME EEAVR LFIEW LKNGG PSSGA PPPS
엑센딘 아고니스트는 엑센딘의 구조와 상관없이 엑센딘의 생체 내 수용체에 결합하여 엑센딘과 동일한 생물학적 활성을 나타내는 물질을 의미하며, 엑센딘 유도체는, 천연형 엑센딘과 비교시 최소한 80% 이상 아미노산 서열에서 상동성을 보이며, 아미노산 잔기의 일부 그룹이 화학적으로 치환(예; alpha-methylation, alpha-hydroxylation), 제거(예; deamination) 또는 수식(예; N-methylation)된 형태일수 있고, 인슐린 분비기능을 보유한 펩타이드를 의미한다.
엑센딘 단편은, 천연형 엑센딘의 N-말단 또는 C-말단에 하나 또는 그 이상 아미노산이 추가 또는 삭제된 형태를 의미하며 천연에 존재하지 않는 아미노산(예 : D-형 아미노산)의 추가도 가능할 수 있고, 이러한 엑센딘 단편은 인슐린 분비기능을 보유한다.
엑센딘 변이체는, 천연형 엑센딘과 아미노산서열이 하나 이상 다른 펩타이드로서, 인슐린 분비기능을 보유한 펩타이드를 의미한다.
엑센딘 아고니스트, 유도체, 단편 및 변이체에서 각각 사용된 제조방법은 독립적으로 사용될 수 있고 조합도 가능하다. 예를 들어 아미노산 서열이 하나 이상 다르고 N-말단 아미노산 잔기에 탈아미노화(deamination) 된 인슐린분비 펩타이드도 포함된다.
구체적인 일 양태로서 본 발명에서 사용한 천연형 인슐린 분비 펩타이드와 변형된 인슐린 분비 펩타이드는 Solid phase 합성법을 통하여 합성될 수 있으며, 천연형 인슐린분비 펩타이드를 포함한 대부분의 천연형 펩타이드는 재조합 방법으로도 생산 가능하다.
또한, 본 발명에서 사용된 인슐린 분비 펩타이드는 다양한 부위에서 비펩타이드성 중합체와 결합될 수 있다.
본 발명에서 제조한 결합체는 인슐린 분비 펩타이드의 결합 부위에 따라 활성 차이가 있을 수 있다.
예를 들어, N-말단과 C-말단을 포함한 N-말단 이외 부위들에 각각 커플링 하여 인 비트로(in vitro) 활성의 차이를 확인할 수 있다. 알데히드 반응기는 낮은 pH에서 N-말단에 선택적으로 반응하며, 높은 pH, 예를 들어 pH 9.0 조건에서는 라이신 잔기와도 공유결합을 형성할 수 있다. 반응 pH를 달리하며 페길화(pegylation) 반응을 진행한 후, 이온교환컬럼을 사용하여 반응 혼합물로부터 위치이성질체를 분리할 수 있다.
생체 내 활성에 중요한 부위인 N-말단 이외의 위치에 커플링 할 경우, 천연형 아미노산 서열에서 수식하고자 하는 아미노산 잔기 위치에 반응성 티올 그룹을 도입하여 비펩타이드성 중합체의 말레이미드 링커를 사용하여 공유결합을 형성할 수 있다.
생체 내 활성에 중요한 부위인 N-말단 이외의 위치에 커플링 할 경우, 천연형 아미노산 서열에서 수식하고자 하는 아미노산 잔기 위치에 반응성 있는 아민 그룹을 도입하여 비펩타이드성 중합체의 알데히드 링커를 사용하여 공유결합을 형성할 수 있다.
비펩타이드성 중합체에 알데히드 링커를 사용하면 N-말단과 라이신 잔기에 있는 아민 그룹과 반응하며, 선택적으로 반응 수율을 향상시키기 위해 변형된 형태의 인슐린분비 펩타이드를 사용할 수 있다. 예를 들어, N-말단을 블러킹하는 방법, 라이신 잔기 치환 방법, 카르복시 말단에 아민 그룹을 도입방법 등을 사용하여 반응할 수 있는 아민 그룹을 원하는 위치에 하나만 유지할 수 있고, 페길화 및 커플링 수율을 향상시킬 수 있다. N-말단의 보호방법은 디메틸화(dimethylation) 외에 메틸화(methylation), 탈아미노화(deamination) 또는 아세틸화(acetylation) 방법으로도 가능하며, 이러한 알킬화(alkylation) 방법에 한정되지 않는다.
본 발명의 바람직한 양태로서, 본 발명의 인슐린 분비 펩타이드 결합체는 인슐린 분비 펩타이드의 N-말단 이외의 아민 그룹에 특이적으로 면역글로블린 Fc 영역이 결합 된 인슐린 분비 펩타이드 결합체이다.
구체적인 일 실시예로서, 본 발명자는 인슐린 분비 펩타이드의 라이신 잔기에 선택적으로 커플링하기 위한 방법으로, 천연형 엑센딘-4에 PEG를 결합시킬 때 pH 9.0로 반응시켜 라이신 잔기로의 페길화 반응을 유도하였으며, 다른 방법으로는 N-말단의 제거 또는 보호된 형태의 엑센딘-4 유도체에 PEG를 결합시킬 때 pH7.5로 반응시켜 라이신 잔기로의 페길화 반응을 유도하였다. N-말단 히스티딘의 알파 아민기를 제거하는 방법, 하이드록실 그룹으로 치환하여 합성하는 방법, N-말단 히스티딘의 알파 아민기에 메틸기를 두 개 붙이는 방법, 첫 번째 아미노산(히스티딘)의 알파 탄소 및 알파 탄소에 결합된 N-말단 아민 그룹을 제거하여 이미다조-아세틸(imidazo-acetyl) 그룹만을 남겨두는 방법 등을 사용하여 링커 PEG의 N-말단 결합을 미연에 방지하였으며, 이러한 유도체를 하기 화학식 1에 나타내었다.
Figure 112008000895497-pat00001
N-말단 커플링의 경우와는 다르게, 라이신 잔기에 커플링되면 인 비트로 활성이 약 8.5 % 정도 유지됨을 확인할 수 있었다(표 1). 또한 엑센딘-4의 N-말단의 아민그룹을 제거한 데스-아미노-히스티딜 엑센딘-4 (des-amino-histidyl exendin-4, 이하, DA-엑센딘-4 라고도 칭함), 엑센딘-4의 N-말단 아민 그룹을 하이드록실 그룹으로 치환한 베타-히드록시-이미다조프로피오닐 엑센딘-4(beta-hydroxy-imidazopropionyl exendin-4, 이하, HY-엑센딘-4 라고도 칭함), 엑센딘-4의 아미노 말단 아민 그룹을 두 개의 메틸 그룹으로 수식한 디메틸히스티딜-엑센딘-4(dimethyl histidyl-exendin-4, 이하, DM-엑센딘-4 라고도 칭함), 그리고 엑센딘-4의 첫 번째 아미노산인 히스티딘의 알파 탄소를 제거한 이미다조아세틸-엑센딘-4(imidazooacetyl-엑센딘-4, 이하, CA-엑센딘-4 라고도 칭함)의 면역글로불린 Fc 결합체가, 천연형 엑센딘-4 결합체와 비교적 유사한 인 비트로 활성 및 혈중반감기를 보였지만 (표 1) 인 비보 효력시험에서는 예측하지 못한 월등한 지속성 효과를 보여주었다(도 14). 따라서, 본 발명에서 제조한 엑센딘-4-면역글로불린 Fc 결합체를 비롯하여 DM-엑센딘-4-면역글로불린 Fc 결합체, DA-엑센딘-4-면역글로블린 Fc 결합체, CA 엑센딘-4-면역글로블린 Fc 결합체, HY-엑센딘-4-면역글로불린 Fc 결합체의 혈중반감기는 50시간 이상 획기적으로 증가하였고, 활성에 영향을 주지 않는 라이신 잔기에 커플링시켜 역가감소도 최소화하였으며, 또한 N-말단의 아민 그룹 및 알파 카본의 제거로 기존에 예측하지 못한 향상된 혈중 글루코스 농도 감소 활성을 나타냄을 확인하였다.
면역글로불린 Fc 영역은 생체 내에서 대사되는 생분해성의 폴리펩타이드이기 때문에, 약물의 캐리어로 사용하기에 안전하다. 또한, 면역글로불린 Fc 영역은 면역글로불린 전체 분자에 비해 상대적으로 분자량이 적기 때문에 결합체의 제조, 정제 및 수율 면에서 유리할 뿐만 아니라, 아미노산 서열이 항체마다 다르기 때문에 높은 비균질성을 나타내는 Fab 부분이 제거되기 때문에 물질의 동질성이 크게 증가되고 혈중 항원성의 유발 가능성도 낮아지게 되는 효과도 기대할 수 있다.
본 발명에서 사용되는 인슐린분비 펩타이드는 캐리어 물질과 비펩타이드성 중합체로 연결된다.
본 발명에 사용가능한 캐리어 물질은 면역글로불린 Fc 영역, 알부민, 트랜스페린 및 PEG로 구성된 군에서 선택될 수 있으며, 바람직하게는 면역글로불린 Fc 영역이다.
본 발명에서, "면역글로불린 Fc 영역"은, 면역글로불린의 중쇄와 경쇄 가변영역, 중쇄 불변영역 1(CH1)과 경쇄 불변영역(CL1)을 제외한, 중쇄 불변영역 2(CH2) 및 중쇄 불변영역 3(CH3)부분을 의미하며, 중쇄 불변영역에 힌지(hinge) 부분을 포함하기도 한다. 또한 본 발명의 면역글로불린 Fc 영역은 천연형과 실질적으로 동등하거나 향상된 효과를 갖는 한, 면역 글로불린의 중쇄와 경쇄 가변영역만을 제외하고, 일부 또는 전체 중쇄 불변영역 1(CH1) 및/또는 경쇄불변영역 1(CL1)을 포함하 는 확장된 Fc영역일 수 있다. 또한, CH2및/또는 CH3에 해당하는 상당히 긴 일부 아미노산 서열이 제거된 영역일 수도 있다. 즉, 본 발명의 면역글로불린 Fc 영역은 1)CH1 도메인, CH2 도메인, CH3 도메인 및 CH4 도메인, 2)CH1 도메인 및 CH2 도메인, 3)CH1 도메인 및 CH3 도메인, 4)CH2 도메인 및 CH3 도메인, 5)1개 또는 2개의 이상의 도메인과 면역글로불린 힌지 영역(또는 힌지 영역의 일부)와의 조합, 6)중쇄 불변영역 각 도메인과 경쇄 불변영역의 이량체일 수 있다.
또한, 본 발명의 면역글로불린 Fc 영역은 천연형 아미노산 서열뿐만 아니라 이의 서열유도체(mutant)를 포함한다. 아미노산 서열 유도체란 천연 아미노산 서열중의 하나 이상의 아미노산 잔기가 결실, 삽입, 비보전적 또는 보전적 치환 또는 이들의 조합에 의하여 상이한 서열을 가지는 것을 의미한다. 예를 들면, IgG Fc의 경우 결합에 중요하다고 알려진 214 내지 238, 297 내지 299, 318 내지 322 또는 327 내지 331번 아미노산 잔기들이 변형을 위해 적당한 부위로서 이용될 수 있다. 또한, 이황화 결합을 형성할 수 있는 부위가 제거되거나, 천연형 Fc에서 N-말단의 몇몇 아미노산이 제거되거나 또는 천연형 Fc의 N-말단에 메티오닌 잔기가 부가될 수도 있는 등 다양한 종류의 유도체가 가능하다. 또한, 이펙터 기능을 없애기 위해 보체결합부위, 예로 C1q 결합부위가 제거될 수도 있고, ADCC(antibody dependent cell mediated cytotoxicity) 부위가 제거될 수도 있다. 이러한 면역글로불린 Fc 영역의 서열 유도체를 제조하는 기술은 국제특허공개 제WO 97/34631호, 국제특허공개 제96/32478호 등에 개시되어 있다.
분자의 활성을 전체적으로 변경시키지 않는 단백질 및 펩타이드에서의 아미노산 교환은 당해 분야에 공지되어 있다(H.Neurath, R.L.Hill, The Proteins, Academic Press, New York,197 9). 가장 통상적으로 일어나는 교환은 아미노산 잔기 Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Thy/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu, Asp/Gly 간의 교환이다.
경우에 따라서는 인산화(phosphorylation), 황화(sulfation), 아크릴화(acrylation), 당화(glycosylation), 메틸화(methylation), 파네실화(farnesylation), 아세틸화(acetylation) 및 아밀화(amidation) 등으로 수식(modification)될 수도있다.
상기 기술한 Fc 유도체는 본 발명의 Fc 영역과 동일한 생물학적 활성을 나타내나 Fc 영역의 열, pH 등에 대한 구조적 안정성을 증대시킨 유도체다.
또한, 이러한 Fc 영역은 인간 및 소, 염소, 돼지, 마우스, 래빗, 햄스터, 랫트, 기니아 픽 등의 동물의 생체 내에서 분리한 천연형으로부터 얻어질 수도 있고, 형질전환된 동물세포 또는 미생물로부터 얻어진 재조합형 또는 이의 유도체 일 수 있다. 여기서, 천연형으로부터 획득하는 방법은 전체 면역글로불린을 인간 또는 동물의 생체로부터 분리한 후, 단백질 분해효소를 처리하여 얻을 수 있다. 파파인을 처리할 경우에는 Fab 및 Fc로 절단되고, 펩신을 처리할 경우에는 pF'c 및 F(ab)2로 절단된다. 이를 크기 배제 크로마토그래피(size-exclusion chromatography) 등을 이용하여 Fc 또는 pF'c를 분리할 수 있다.
바람직하게는 인간 유래의 Fc 영역을 미생물로부터 수득한 재조합형 면역글로불린 Fc 영역이다.
또한, 면역글로불린 Fc 영역은 천연형 당쇄, 천연형에 비해 증가된 당쇄, 천연형에 비해 감소한 당쇄 또는 당쇄가 제거된 형태일 수 있다. 이러한 면역글로불린 Fc 당쇄의 증감 또는 제거에는 화학적 방법, 효소학적 방법 및 미생물을 이용한 유전 공학적 방법과 같은 통상적인 방법이 이용될 수 있다. 여기서, Fc에서 당쇄가 제거된 면역글로불린 Fc 영역은 보체(c1q)의 결합력이 현저히 저하되고, 항체-의존성 세포독성 또는 보체-의존성 세포독성이 감소 또는 제거되므로, 생체 내에서 불필요한 면역반응을 유발하지 않는다. 이런 점에서 약물의 캐리어로서의 본래의 목적에 보다 부합하는 형태는 당쇄가 제거되거나 비당쇄화된 면역글로불린 Fc 영역이라 할 것이다.
본 발명에서 당쇄의 제거(Deglycosylation)는 효소로 당을 제거한 Fc 영역을 말하며, 비당쇄화(Aglycosylation)"는 원핵동물, 바람직하게는 대장균에서 생산하여 당쇄화되지 않은 Fc 영역을 의미한다.
한편, 면역글로불린 Fc 영역은 인간 또는 소, 염소, 돼지, 마우스, 래빗, 햄스터, 랫트, 기니아 픽 등의 동물기원일 수 있으며, 바람직하게는 인간기원이다. 또한, 면역글로불린 Fc 영역은 IgG, IgA, IgD, IgE, IgM 유래 또는 이들의 조합(combination) 또는 이들의 혼성(hybrid)에 의한 Fc 영역일 수 있다. 바람직하게는 인간 혈액에 가장 풍부한 IgG 또는 IgM유래이며 가장 바람직하게는 리간드 결합 단백질의 반감기를 향상시키는 것으로 공지된 IgG 유래이다.
한편, 본 발명에서 조합(combination)이란 이량체 또는 다량체를 형성할 때, 동일 기원 단쇄 면역글로불린 Fc 영역을 암호화하는 폴리펩타이드가 상이한 기원의 단쇄 폴리펩타이드와 결합을 형성하는 것을 의미한다. 즉, IgG Fc, IgA Fc, IgM Fc, IgD Fc 및 IgE의 Fc 단편으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 2개 이상의 단편으로부터 이량체 또는 다량체의 제조가 가능하다.
본 발명에서 "하이브리드(hybrid)"란 단쇄의 면역글로불린 Fc 영역 내에 2개 이상의 상이한 기원의 면역글로불린 Fc 단편에 해당하는 서열이 존재함을 의미하는 용어이다. 본 발명의 경우 여러 형태의 하이브리드가 가능하다. 즉, IgG Fc, IgM Fc, IgA Fc, IgE Fc 및 IgD Fc의 CH1, CH2, CH3 및 CH4로 이루어진 그룹으로부터 1개 내지 4개 도메인으로 이루어진 도메인의 하이브리드가 가능하며, 힌지를 포함할 수 있다.
한편, IgG 역시 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4의 서브클래스로 나눌 수 있고 본 발명에서는 이들의 조합 또는 이들의 혼성화도 가능하다. 바람직하게는 IgG2 및 IgG4 서브클래스이며, 가장 바람직하게는 보체 의존적 독성(CDC, Complementdependent cytotoxicity)과 같은 이펙터 기능(effector function)이 거의 없는 IgG4의 Fc 영역이다.
즉, 가장 바람직한 본 발명의 약물의 캐리어용 면역글로불린 Fc 영역은, 인간 IgG4 유래의 비-당쇄화된 Fc 영역이다. 인간 유래의 Fc 영역은 인간 생체에서 항원으로 작용하여 이에 대한 새로운 항체를 생성하는 등의 바람직하지 않은 면역 반응을 일으킬 수 있는 비-인간 유래의 Fc 영역에 비하여 바람직하다.
본 발명에서 비펩타이드성 중합체는 반복 단위가 2개 이상 결합된 생체 적합성 중합체를 의미하며, 상기 반복 단위들은 펩타이드 결합이 아닌 임의의 공유결합을 통해 서로 연결된다.
본 발명에 사용가능한 비펩타이드성 중합체는 폴리에틸렌 글리콜, 폴리프로필렌 글리콜, 에틸렌 글리콜과 프로필렌 글리콜의 공중합체, 폴리옥시 에틸화 폴리올, 폴리비닐 알콜, 폴리사카라이드, 덱스트란, 폴리비닐 에틸 에테르, PLA(폴리락트산, polylactic acid) 및 PLGA(폴리락틱-글리콜산, polylactic-glycolic acid)와 같은 생분해성 고분자, 지질 중합체, 키틴류, 히아루론산 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택될 수 있으며, 바람직하게는 폴리에틸렌글리콜이다. 당해 분야에 이미 알려진 이들의 유도체 및 당해 분야의 기술 수준에서 용이하게 제조할 수 있는 유도체들도 본 발명의 범위에 포함된다.
기존 인프레임 퓨전(inframe fusion) 방법으로 제조된 융합단백질에서 사용된 펩타이드성 링커의 단점은 생체내에서 단백질분해효소에 의해 쉽게 절단되어 캐리어에 의한 활성약물의 혈중반감기 증가 효과를 기대만큼 얻을 수 없다는 것이다. 그러나, 본 발명에서는 단백질분해효소에 저항성있는 중합체를 사용하여 캐리어와 유사하게 펩타이드의 혈중반감기를 유지할 수 있다. 그러므로, 본 발명에서 사용될 수 있는 비펩타이드성 중합체는 상기와 같은 역할, 즉 생체 내 단백질분해효소에 저항성 있는 중합체이면 제한없이 사용될 수 있다. 비펩타이드성 중합체의 분자량은 1 내지 100 kDa 범위, 바람직하게는 1 내지 20 kDa 범위이다. 또한, 상기 면역글로불린 Fc 영역과 결합되는 본 발명의 비펩타이드성 중합체는 한 종류의 중합체뿐만 아니라 상이한 종류의 중합체들의 조합이 사용될 수도 있다.
본 발명에 사용되는 비펩타이드성 중합체는 면역글로불린 Fc 영역 및 단백질 약물과 결합될 수 있는 반응기를 가진다.
상기 비 펩타이드성 중합체의 양 말단 반응기는 반응 알데히드 그룹, 프로피 온 알테히드 그룹, 부틸 알테히드 그룹, 말레이미드(maleimide) 그룹 및 석시니미드(succinimide) 유도체로 이루어진 군으로부터 선택되는 것이 바람직하다. 상기에서, 석시니미드 유도체로는 석시니미딜 프로피오네이트, 히드록시 석시니미딜, 석시니미딜 카르복시메틸 또는 석시니미딜 카보네이트가 이용될 수 있다. 특히, 상기 비펩타이드성 중합체가 양 말단에 반응 알데히드 그룹의 반응기를 갖는 경우, 비특이적 반응을 최소화하고, 비펩타이드성 중합체의 양 말단에서 생리활성 폴리펩타이드 및 면역글로불린과 각각 결합하는데 효과적이다. 알데히드 결합에 의한 환원성 알킬화로 생성된 최종 산물은 아미드 결합으로 연결된 것보다 훨씬 안정적이다. 알데히드 반응기는 낮은 pH에서 N-말단에 선택적으로 반응하며, 높은 pH, 예를 들어 pH9.0 조건에서는 라이신 잔기와 공유결합을 형성할 수 있다.
상기 비펩타이드성 중합체의 양 말단 반응기는 서로 같거나 다를 수 있다. 예를 들어, 한쪽 말단에는 말레이미드 그룹을, 다른 쪽 말단에는 알데히드 그룹, 프로피온 알데히드 그룹, 또는 부틸 알데히드 그룹을 가질 수 있다. 양쪽 말단에 히드록시 반응기를 갖는 폴리에틸렌 글리콜을 비펩타이드성 중합체로 이용하는 경우에는 공지의 화학반응에 의해 상기 히드록시기를 상기 다양한 반응기로 활성화하거나, 상업적으로 입수 가능한 변형된 반응기를 갖는 폴리에틸렌 글리콜을 이용하여 본 발명의 인슐린 분비 펩타이드 결합체를 제조할 수 있다.
이러한 본 발명의 인슐린 분비 펩타이드 결합체는 인슐린 합성 및 분비 촉 진, 식욕억제, 체중감소, 베타 세포 혈중 글루코스 민감도 증가, 베타 세포 증식(beta cell proliferation) 촉진, gastric emptying 지연, 글루카곤 억제와 같은 기존의 인슐린 분비 펩타이드의 생체 내 활성이 유지될 뿐만 아니라 인슐린 분비 펩타이드의 혈중 반감기 및 이로 인한 상기 펩타이드의 생체 내 효력 지속 효과가 획기적으로 증가하게 하므로, 당뇨, 비만, 급성 관상동맥증후군(Acute coronary syndrome) 또는 다낭성 난소 증후군(Polycystic ovary syndrome) 치료에 유용하다.
또한, 본 발명의 또 다른 양태로서, 본 발명은
(1) 양 말단에 알데히드, 말레이미드, 또는 석시니미드 유도체 반응기를 갖는 비펩타이드성 중합체를 사용하여 인슐린분비 펩타이드의 아민 그룹 또는 티올 그룹에 공유결합으로 연결하는 단계;
(2) 상기 (1)의 반응 혼합물로부터 N-말단 이외의 위치에 비펩타이드성 중합체가 공유결합된 인슐린분비 펩타이드를 포함하는 연결체를 분리하는 단계; 및
(3) 분리된 연결체의 비펩타이드성 중합체의 다른 쪽 말단에 면역글로불린 Fc 영역을 공유결합으로 연결하여 비펩타이드성 중합체의 양쪽 말단이 각각 면역글로불린 Fc 영역 및 인슐린분비 펩타이드와 결합된 펩타이드 결합체를 생성하는 단계를 포함하는 인슐린분비 펩타이드 결합체의 제조방법을 제공한다.
본 발명에서 용어 "연결체"란 비펩타이드성 중합체와 인슐린 분비 펩타이드만이 공유결합으로 연결된 중간체로서, 이후 이 연결체에 있는 비펩타이드성 중합체의 인슐린 분비 펩타이드가 연결되지 않은 다른 쪽 말단에 면역글로불린 Fc 영역 을 결합시키게 된다.
또한, 바람직한 일 양태로서 본 발명은
(1) 양 말단에 알데히드 반응기를 갖는 비펩타이드성 중합체를 인슐린 분비 펩타이드의 라이신 잔기에 공유결합으로 연결시키는 단계; (2) (1)의 반응 혼합물로부터 라이신잔기에 비펩타이드성 중합체가 공유결합된 인슐린 분비 펩타이드를 포함하는 연결체를 분리하는 단계; 및 (3) 분리된 연결체의 비펩타이드성 중합체의 다른 쪽 말단에 면역글로불린 Fc 영역을 공유결합으로 연결하여 비펩타이드성 중합체의 양쪽 말단이 각각 면역글로불린 Fc 영역 및 인슐린 분비 펩타이드와 결합된 단백질 결합체를 생성하는 단계를 포함하는 제조방법을 제공한다. 더욱 바람직하게는 (1)의 비펩타이드성 중합체 및 인슐린 분비 펩타이드의 라이신 잔기는 pH 7.5 이상에서 연결된다.
또한, 본 발명의 또 다른 양태로서, 본 발명의 인슐린분비 펩타이드 결합체를 포함하는 당뇨병 치료용 약제학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 결합체를 포함한 약제학적 조성물은 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함할 수 있다. 약제학적으로 허용되는 담체는 경구투여시에는 결합제, 활택제, 붕해제, 부형제, 가용화제, 분산제, 안정화제, 현탁화제, 색소 및 향료 등을 사용할 수 있으며, 주사제의 경우에는 완충제, 보존제, 무통화제, 가용화제, 등장화제 및 안정화제 등을 혼합하여 사용할 수 있으며, 국소투여용의 경우에는 기제, 부형제, 윤활제 및 보존제 등을 사용할 수 있다. 본 발명의 약제학적 조성물의 제형은 상술한 바와 같은 약제학적으로 허용되는 담체와 혼합하여 다양하게 제조될 수 있다. 예를 들어, 경구 투여시에는 정제, 트로키, 캡슐, 엘릭서, 서스펜션, 시럽 및 웨이퍼 등의 형태로 제조할 수 있으며, 주사제의 경우에는 단위 투약 앰플 또는 다수회 투약 형태로 제조할 수 있다. 기타, 용액, 현탁액, 정제, 환약, 캡슐 및 서방형 제제 등으로 제형화 할 수 있다.
한편, 제제화에 적합한 담체, 부형제 및 희석제의 예로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로즈, 폴리비닐피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 또는 광물유 등이 사용될 수 있다. 또한, 충진제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료 및 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 결합체는 당뇨, 비만, 급성 관상동맥증후군(Acute coronary syndrome) 또는 다낭성 난소 증후군(Polycystic ovary syndrome) 치료에 유용한바, 이를 포함하는 약제학적 조성물을 투여함으로써, 상기 질환의 치료를 도모할 수 있다.
본 발명에서 "투여"는, 어떠한 적절한 방법으로 환자에게 소정의 물질을 도 입하는 것을 의미하며, 상기 결합체의 투여 경로는 약물이 목적 조직에 도달할 수 있는 한 어떠한 일반적인 경로를 통하여 투여될 수 있다. 복강 내 투여, 정맥내 투여, 근육내 투여, 피하 투여, 피내 투여, 경구 투여, 국소 투여, 비내 투여, 폐내 투여 및 직장 내 투여 등이 될 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 그러나 경구 투여시, 펩타이드는 소화가 되기 때문에 경구용 조성물은 활성 약제를 코팅하거나 위에서의 분해로부터 보호되도록 제형화 하는 것이 바람직하다. 바람직하게는 주사제 형태로 투여될 수 있다. 또한, 약제학적 조성물은 활성 물질이 표적 세포로 이동할 수 있는 임의의 장치에 의해 투여될 수 있다.
또한, 본 발명의 약제학적 조성물은 치료할 질환, 투여 경로, 환자의 연령, 성별 및 체중 및 질환의 중등도 등의 여러 관련 인자와 함께, 활성성분인 약물의 종류에 따라 결정된다. 본 발명의 약제학적 조성물은 생체 내 지속성 및 역가가 우수하므로, 본 발명의 약제학적 제제의 투여 횟수 및 빈도를 현저하게 감소시킬 수 있다.
이하, 하기 실시예에 의하여 본 발명을 보다 상세하게 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐 본 발명의 범위가 이들로 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 엑센딘 -4 페길화(Pegylation)와 위치이성질체 분리
3.4K PropionALD(2) PEG(프로피온알데히드기를 2개 가지고 있는 PEG, IDB Inc., 한국)를 천연형 엑센딘-4(AP, 미국)의 N-말단에 페길화시키기 위하여 펩타이드와 PEG의 몰비를 1 : 15, 펩타이드의 농도를 3mg/ml로 하여 4℃에서 90분간 반응하였다. 이 때 반응은 pH 4.0인 100mM 농도의 NaOAc 완충액 내에서 이루어졌으며, 환원제인 20mM SCB(NaCNBH3)를 첨가하여 반응시켰다. 3.4K PropionALD(2) PEG를 엑센딘-4의 라이신(Lys) 잔기에 페길화시키기 위하여 펩타이드와 PEG의 몰비 1 : 30, 펩타이드 농도 3mg/ml로 4℃에서 3시간 동안 반응하였다. 이때 반응은 pH 9.0인 100mM 농도의 Na-Phosphate 완충액 내에서 이루어졌으며 환원제인 20mM SCB를 첨가하여 반응하였다. 각 반응액은 SOURCE Q(XK 16ml, 아머샴 바이오사이언스)를 통하여 일차적으로 모노-페길화된(Mono-pegylated) 펩타이드를 정제하였으며, SOURCE S(XK 16ml,아머샴 바이오사이언스)를 통하여 이성질체를 분리하였다. N-말단이 페길화된 피크(N-term pegylated 피크)가 가장 앞쪽에 나오고 그 뒤쪽으로 차례로 2개의 라이신이 페길화된 피크(Lys Pegylated 피크)가 나옴을 알 수 있었다. 용출된 피크는 펩타이드 매핑(mapping) 방법으로 페길화된 위치를 확인할 수 있었다. Lys12 페길화된 결합체가 먼저 용출되고, Lys27 페길화된 결합체는 가장 뒤쪽에서 용출되며 N-말단 위치이성체 및 Lys12 위치이성체와 완벽한 피크분리가 가능하였다.
Column : SOURCE Q (XK 16ml, 아머샴 바이오사이언스)
유속 : 2.0ml/분
구배 : A 0 →40% 80분 B (A: 20mM 트리스 pH8.5, B: A + 0.5M NaCl )
Column : SOURCE S (XK 16ml, 아머샴 바이오사이언스)
유속 : 2.0ml/분
구배 : A 0 →100% 50분 B (A : 20mM 구연산 pH3.0,B : A + 0.5M KCl)
실시예 2. 엑센딘 -4(N)- PEG - 면역글로블린 Fc 결합체 제조
실시예 1.의 방법을 이용하여 3.4K PropionALD(2) PEG를 엑센딘-4의 N-term과 반응시킨 후 N-말단 이성질체만을 정제하여 면역글로블린 Fc 와 커플링시켰다. 펩타이드와 면역글로블린 Fc 몰비를 1 : 8, 전체단백질농도를 50mg/ml로 하여 4℃에서 17시간 반응하였다. 반응액은 100mM K-P pH6.0이며 환원제인 20mM SCB를 첨가하였다. 커플링 반응액은 두 개의 정제 컬럼을 거쳐 정제된다. 먼저 커플링 반응에 참여하지 않은 다량의 면역글로블린 Fc를 제거하기 위하여 SOURCE Q(XK 16ml, 아머샴 바이오사이언스)이용하였다. 20mM Tris(pH7.5)에서 1M NaCl을 사용하여 Salt gradient를 주면 상대적으로 결합력이 약한 면역글로블린 Fc가 먼저 용츌되고 바로 뒤이어 엑센딘-4-면역글로블린 Fc 가 용출된다. 일차 정제를 통하여 어느 정도 면역글로블린 Fc가 제거되지만 I이온교환컬럼에서 면역글로블린 Fc 와 엑센딘-4-면역글로블린 Fc의 결합력 차이가 크지 않아 완전히 분리되지는 않는다. 따라서 두 물질의 소수성(Hydrophobicity)을 이용하여 이차 정제를 하였다. SOURCE ISO(HR 16ml,아머샴 바이오사이언스)에 20mM Tris(pH7.5) 1.5M 황산암모늄을 이용하여 일차 정제된 시료를 결합시킨 후 차츰 황산암모늄 농도를 낮추면서 시료를 용출시킨다. HIC 컬럼에 결합력이 약한 면역글로블린 Fc 가 먼저 용출되고 결합력이 강한 엑센딘-4-면역글로블린 Fc 시료가 뒤쪽으로 용출된다. 이들의 소수성 차이가 커 이온교환컬럼보다 훨씬 분리가 용이하다. 하지만 몰 비 차이로 인한 과량의 면역글로블린 Fc가 반응에 투입되기 때문에 HIC 컬럼만 사용해서는 고순도 결합체를 얻을 수 없다. HPLC 역상분석결과 순도 91.6%를 나타내었다. (도 1)
Column : SOURCE Q(XK16ml, 아머샴 바이오사이언스)
유속 : 2.0ml/분
구배 : A 0 →25% 70분 B (A: 20mM 트리스 pH7.5, B: A + 1M NaCl )
Column : SOURCE ISO(HR16ml, 아머샴 바이오사이언스)
유속 : 7.0ml/분
구배 :B 100 →0% 60분 B (A: 20mM 트리스 pH7.5, B: A + 1.5M 황산암모늄)
실시예 3. 엑센딘-4(Lys27)-PEG-면역글로블린 Fc 결합체 제조
실시예 1의 방법을 이용하여 3.4K PropionALD(2) PEG를 엑센딘-4의 Lys과 반응시킨 후 Lys 이성질체만을 정제하여 면역글로블린 Fc 와 커플링시켰다. 두 개의 Lys 이성질체 피크 중 반응이 많이 가고 N-말단 이성질체와 확연히 구분되는 가장 뒤쪽의 이성질체 피크(Lys27 위치이성질체)를 이용하여 커플링을 진행하였다. 펩타이드와 면역글로블린 Fc 몰비를 1 : 8, 전체단백질농도를 50mg/ml로 하여 4℃에서 16시간 반응하였다. 반응액은 100mM K-P pH6.0이며 환원제인 20mM SCB를 첨가하였다. 커플링 반응 후 SOURCE Q 16ml과 SOURCE ISO 16ml을 이용한 2단계 정제방법은 실시예 2와 동일하다. HPLC 역상분석결과 순도 91.7%를 나타내었다. (도 2)
실시예 4. 데스-아미노-히스티딜(des-amino-histidyl) 엑센딘-4(Lys27)-PEG-면역글로블린 Fc 결합체 제조
3.4K PropionALD(2) PEG를 데스-아미노-히스티딜-엑센딘-4(DA 엑센딘-4, AP, 미국)의 Lys과 페길화시키기 위하여 펩타이드와 3.4K PropionALD(2)의 몰비를 1 : 30, 펩타이드 농도 3mg/ml로 하여 4℃에서 12시간 반응하였다. 반응액은 100mM Na-phosphate pH7.5이며 환원제인 20mM SCB를 첨가하였다. SOURCE Q(XK 16ml, 아머샴 바이오사이언스)와 SOURCE S(XK16ml, 아머샴 바이오사이언스)를 이용하여 2단계 정제하였다. 이성질체 정제과정에서 두 개의 Lys 이성질체 피크 중 반응이 많이 가고 N-말단 이성질체와 확연히 구분되는 가장 뒤쪽의 이성질체 피크(Lys27 위치이성체)를 이용하여 커플링을 진행하였다. 펩타이드와 면역글로블린 Fc 몰비를 1 : 8, 전체단백질농도를 60mg/ml로 하여 4℃에서 20시간 반응하였다. 반응액은 100mM K-P pH6.0이며 환원제인 20mM SCB를 첨가하였다. 커플링 반응 후 SOURCE Q 16ml과 SOURCE ISO 16ml을 이용한 2단계 정제방법은 실시예 2와 동일하다. HPLC 역상분석결과 순도 95.8%를 나타내었다. (도 3)
Column : SOURCE Q (XK 16ml, 아머샴 바이오사이언스)
유속 : 2.0ml/분
구배 : A 0 →20% 70분 B (A: 20mM 트리스 pH9.0, B: A + 1M NaCl )
Column : SOURCE S (XK 16ml, 아머샴 바이오사이언스)
유속 : 2.0ml/분
구배 : A 0 →50% 50분 B (A : 20mM 구연산 pH 3.0, B : A + 1M KCl)
실시예 5. 베타-히드록시-이미다조-프로피오닐(Hydroxy-imidazo-propionyl) 엑센딘-4(Lys27)-PEG-면역글로블린 Fc 결합체 제조
베타-히드록시-이미다조-프로피오닐 엑센딘-4(HY 엑센딘-4, AP, 미국)를 이용하여 실시예 4.과 동일한 방법으로 3.4K PropionALD(2) PEG를 HY 엑센딘-4의 Lys과 반응시킨 후, 두 개의 Lys 이성질체 피크 중 반응이 많이 가고 N-말단 이성질체와 확연히 구분되는 가장 뒤쪽의 이성질체 피크(Lys27 위치이성체)를 이용하여 커플링을 진행하였다. 펩타이드와 면역글로블린 Fc 몰비를 1 : 8, 전체단백질농도를 60mg/ml로 하여 4℃에서 20시간 반응하였다. 반응액은 100mM K-P pH6.0이며 환원제인 20mM SCB를 첨가하였다. 커플링 반응 후 SOURCE Q 16ml과 SOURCE ISO 16ml을 이용한 2단계 정제방법은 실시예 2와 동일하다. HPLC 역상분석결과 순도 93.9%를 나타내었다. (도 4)
실시예 6. 이미다조-아세틸(Imidazo-acetyl) 엑센딘-4(Lys27)-PEG-면역글로블린 Fc 결합체 제조
이미다조-아세틸 엑센딘-4(CA 엑센딘-4, AP, 미국)를 이용하여 실시예 4와 동일한 방법으로 3.4K PropionALD(2) PEG를 CA 엑센딘-4의 Lys과 반응시킨 후, 두 개의 Lys 이성질체 피크 중 반응이 많이 가고 N-말단 이성질체와 확연히 구분되는 가장 뒤쪽의 이성질체 피크(Lys27 위치이성체)를 이용하여 커플링을 진행하였다. 펩타이드와 면역글로블린 Fc 몰비를 1 : 8, 전체단백질농도를 60mg/ml로 하여 4℃에서 20시간 반응하였다. 반응액은 100mM K-P pH6.0이며 환원제인 20mM SCB를 첨가하였다. 커플링 반응 후 SOURCE Q 16ml과 SOURCE ISO 16ml을 이용한 2단계 정제방법은 실시예 2와 동일하다. HPLC 역상분석결과 순도 95.8%를 나타내었다. (도 5)
실시예 7. Ser12 변이된(mutated) DA 엑센딘-4(Lys27)-PEG-면역글로블린 Fc 결합체 제조
3.4K PropionALD(2) PEG를 Ser12 변이된 DA 엑센딘-4(AP, 미국)의 Lys과 페길화시키기 위하여 펩타이드와 3.4K PropionALD(2)의 몰비를 1 : 30, 펩타이드 농도3mg/ml로 하여 25℃에서 3시간 반응하였다. 반응액은 100mM Na-phosphate pH7.5 이며 환원제인 20mM SCB를 첨가하였다. SOURCE S(XK16ml, 아머샴 바이오사이언스) 이용한 이성질체 정제과정 없이 SOURCE Q(XK 16ml, 아머샴 바이오사이언스)를 이용하여 모노-페길화된(Mono-pegylated) 펩타이드 정제과정만 실시예 4와 동일하게 시행하였다. 펩타이드와 면역글로블린 Fc 몰비를 1 : 8, 전체단백질농도를 60mg/ml로 하여 4℃에서 20시간 반응하였다. 반응액은 100mM K-P pH6.0이며 환원제인 20mM SCB를 첨가하였다. Ser12 mutated DA 엑센딘-4은 다른 펩타이드들에 비해 더욱 강한 음이온 성질을 나타내어 SOURCE Q 컬럼 정제과정만으로도 효과적으로 반응에 참여하지 않은 면역글로블린 Fc를 제거할 수 있었다. 따라서 SOURCE ISO 컬럼정제는 생략되었으며, SOURCE Q 컬럼 정제 조건은 실시예 2.와 동일하다. HPLC 역상분석결과 순도 92.5%를 나타내었다. (도 6)
실시예 8. Arg12 변이된(mutated) DA 엑센딘-4(Lys27)-PEG-면역글로블린 Fc 결합체 제조
Arg12 변이된 DA 엑센딘-4(AP, 미국)를 이용하여 실시예 7과 동일한 방법으로 3.4K PropionALD(2) PEG를 Arg12 변이된 DA 엑센딘-4의 Lys과 반응 및 정제하여 커플링을 진행하였다. 펩타이드와 면역글로블린 Fc 몰비를 1 : 8, 전체단백질농도를 60mg/ml로 하여 4℃에서 20시간 반응하였다. 반응액은 100mM K-P pH6.0이며 환원제인 20mM SCB를 첨가하였다. 커플링 반응 후 SOURCE Q 16ml과 SOURCE ISO 16ml을 이용한 2단계 정제방법은 실시예 2와 동일하다. HPLC 역상분석결과 순도 99.2%를 나타내었다. (도 7)
실시예 9. 데스-아미노-히스티딜(des-amino-histidyl) 엑센딘-4(Lys27)-PEG-알부민 결합체 제조
3.4K PropionALD(2) PEG를 데스-아미노-히스티딜-엑센딘-4(DA-엑센딘-4, AP., 미국)의 Lys과 페길화시키기 위하여 실시예 4.와 동일한 방법으로 반응 및 정제하였다. 펩타이드와 캐리어로서 인간혈액유래 알부민(녹십자, 한국) 몰비를 1 : 7, 전체단백질농도를 50mg/ml로 하여 4℃에서 24시간 반응하였다. 반응액은 100mM K-P pH6.0이며 환원제인 20mM SCB를 첨가하였다. 커플링 반응 후 SOURCE Q 16ml과 SOURCE ISO 16ml을 이용한 2단계 정제방법은 실시예 2.와 동일하다. HPLC 역상분석결과 순도 90.3%를 나타내었다. (도 8)
실시예 10. 디메틸-히스티딜-엑센딘-4(Lys27)-PEG-면역글로블린 Fc 결합체 제조
디메틸-히스티딜-엑센딘-4(DM 엑센딘-4, AP, 미국)를 이용하여 실시예 4.와 동일한 방법으로 디메틸-히스티딜-엑센딘-4(Lys27)-면역글로블린 Fc 결합체를 제조하였다. HPLC 역상분석결과 순도 96.4%를 나타내었다. [도9]
실시예 11. GLP-1(N)-PEG-면역글로블린 Fc 결합체 제조
3.4K ButyrALD(2) PEG(부틸알데히드기를 2개 가지고 있는 PEG, Nektar, 미국)를 GLP-1(AP, 미국)의 N-말단에 페길화시키기 위하여 펩타이드와 PEG의 몰비를 1 : 5, 펩타이드의 농도를 3mg/ml로 하여 4℃에서 90분간 반응하였다. 이때 반응 은 pH 6.0 인 100mM 농도의 K-P 완충액 내에서 이루어졌으며, 환원제인 20mM SCB(NaCNBH3)를 첨가하여 반응시켰다. 펩타이드와 면역글로블린 Fc 몰비를 1 : 10, 전체단백질농도를 50mg/ml로 하여 4℃에서 16시간 반응하였다. 반응액은 100mM K-P pH6.0이며 환원제인 20mM SCB를 첨가하였다. 커플링 반응 후 SOURCE Q 16ml과 SOURCE ISO 16ml을 이용한 2단계 정제방법은 실시예 2와 동일하다. HPLC 역상분석결과 순도 91%를 나타내었다. (도 10)
실시예 12. 데스-아미노-히스티딜(Des-amino-histidyl)-GLP-1(Lys)-PEG-면역글로블린 Fc 결합체 제조
3.4K PropionALD(2) PEG를 데스-아미노-히스티딜-GLP-1(AP., 미국)의 Lys과 페길화시키기 위하여 펩타이드와 3.4K PropionALD(2)의 몰비를 1 : 30, 펩타이드 농도3mg/ml로 하여 4℃에서 4시간 반응하였다. 반응액은 100mM Na-phosphate pH7.5이며 환원제인 20mM SCB를 첨가하였다. SOURCE Q(XK 16ml, 아머샴 바이오사이언스)를 이용하여 Mono-pegylated 펩타이드만 정제하였다. 펩타이드와 면역글로블린 Fc 몰비를 1 : 6, 전체단백질농도를 60mg/ml로 하여 4℃에서 16시간 반응하였다. 반응액은 100mM K-P pH6.0이며 환원제인 20mM SCB를 첨가하였다. 커플링 반응 후 SOURCE Q 16ml과 SOURCE ISO 16ml을 이용한 2단계 정제방법은 실시예 2와 동일하다. 하지만 GLP-1-면역글로블린 Fc 결합체는 엑센딘-4-면역글로블린 Fc 결합체 보다 면역글로블린 Fc와의 소수성 차이가 적어 SOURCE ISO 16ml 컬럼에서의 분리능 이 떨어진다. 그로 인해 SOURCE　ISO 16ml 컬럼 정제를 한번 더 반복하였다. HPLC 역상분석결과 순도 91.9%를 나타내었다. (도 11)
실시예 13. ButyrALD 링커 PEG 사용한 결합체 제조
3.4K ButyrALD(2) PEG (부틸알데히드기를 2개 가지고 있는 PEG, Nektar, 미국)를 사용하여 실시예 1과 동일한 방법으로 3.4K-엑센딘-4를 제조하였다. 이후 실시예 3과 동일한 방법으로 면역글로블린 Fc 와 커플링 하였다. HPLC 역상분석결과 순도 92.3%를 나타내었다. (도 12)
실시예 14. 지속형 엑센딘 -4의 인 비트로 활성 측정
엑센딘-4 지속형제제의 효력을 측정하는 방법으로 인 비트로 세포 활성을 측정하는 방법을 이용하였다. 보통 GLP-1의 in-vitro 활성의 측정방법으로는, 인슐린종 세포(insulinoma cell) 또는 랑게르한스 섬(islet of Langerhans)을 분리하여 GLP-1 처리에 따른 세포 내의 cAMP 증가 여부를 측정하는 시험으로 진행된다.
본 시험에서 사용된 인 비트로 활성 측정 방법은 RIN-m5F(ATCC.)이며 이 세포는 래트의 인슐린종 세포로 알려져 있으며 GLP-1 수용체를 가지고 있어 GLP-1 계통의 인 비트로 활성을 측정하는 방법으로 많이 이용되고 있다. RIN-m5F에 GLP-1, 엑센딘-4와 시험물질을 농도별로 처리하여 시험물질에 의한 세포 내의 신호전달 물질인 cAMP 발생 정도를 측정하여 EC50값을 측정하여 비교하는 시험으로 진행하였으 며 결과는 표 1에 정리하였다.
시험물질 혈중반감기 (시간) 인 비트로 역가 (%)
엑센딘-4 0.7 100
엑센딘-4(N)-PEG-Fc 62 <0.2
엑센딘-4(Lys27)-PEG-Fc 61 13.2
DM 엑센딘-4(Lys27)-PEG-Fc 69 2.6
DA 엑센딘-4(Lys27)-PEG-Fc 54 13.2
HY 엑센딘-4(Lys27)-PEG-Fc 52 7.6
CA 엑센딘-4(Lys27)-PEG-Fc 52 8.5
Ser12 DA 엑센딘-4(Lys27)-PEG-Fc N.D. 2.6
DA 엑센딘-4(Lys27)-PEG-알부민 2.0
DA GLP-1(Lys20,28)-PEG-Fc 27 2.0
DM 엑센딘-4 : 디메틸-히스티딜(dimethyl-histidyl) 엑센딘-4
DA 엑센딘-4 : 데스-아미노-히스티딜(des-amino-histidyl) 엑센딘-4
HY 엑센딘-4 : 베타-히드록시-이미다조-프로피오닐(beta-Hydroxy-imidazo-propionyl) 엑센딘-4
CA 엑센딘-4 : 이미다조-아세틸(Imidazo-acetyl) 엑센딘-4
Ser12 DA 엑센딘-4 : 12번 라이신 잔기가 Ser으로 치환된 DA 엑센딘-4
DA GLP-1 : 데스-아미노-히스티딜(des-amino-histidyl)-GLP-1
엑센딘-4(N)-PEG-Fc : 엑센딘-4의 N 말단과 Fc 영역이 PEG로 연결된 결합체.
엑센딘-4(Lys27)-PEG-Fc : 엑센딘-4의 27번 라이신 잔기와 Fc 영역이 PEG로 연결된 결합체.
DM 엑센딘-4(Lys27)-PEG-Fc : 디메틸-히스티딜 엑센딘-4의 27번 라이신 잔기와 Fc 영역이 PEG로 연결된 결합체.
DA 엑센딘-4(Lys27)-PEG-Fc : 데스-아미노-히스티딜 엑센딘-4의 27번 라이신 잔기와 Fc 영역이 PEG로 연결된 결합체.
HY 엑센딘-4(Lys27)-PEG-Fc : 베타-히드록시-이미다조-프로피오닐 엑센딘-4의 27번 라이신 잔기와 Fc 영역이 PEG로 연결된 결합체.
CA 엑센딘-4(Lys27)-PEG-Fc : 이미다조-아세틸 엑센딘-4의 27번 라이신 잔기와 Fc 영역이 PEG로 연결된 결합체.
Ser12 DA 엑센딘-4(Lys27)-PEG-Fc : 12번 라이신 잔기가 Ser으로 치환된 데스-아미노-히스티딜 엑센딘-4의 27번 라이신 잔기와 Fc 영역이 PEG로 연결된 결합체.
DA 엑센딘-4(Lys27)-PEG-알부민 : 데스-아미노-히스티딜 엑센딘-4의 27번 라이신 잔기와 알부민이 PEG로 연결된 결합체.
DA GLP-1(Lys20,28)-PEG-Fc : 데스-아미노-히스티딜 GLP-1의 라이신 잔기와 Fc 영역이 PEG로 연결된 결합체.
실시예 15. 지속형 엑센딘 -4의 인 비보 효력시험
엑센딘-4 지속형제제의 인 비보효력을 측정하기 위하여 당뇨모델 마우스인 db/db 마우스를 이용하여 혈당의 감소를 확인하였다. 약 6 - 7주령의 당뇨모델 마우스를 사료제한을 하지 않은 상태에서 2주 동안 지속형 제제를 100mcg/kg으로 단회투여하고 천연형 엑센딘-4는 매일 100mcg/kg 용량을 투여하였다. 시험물질을 투여한 후 매일 채혈하여 혈당의 변화를 측정하였으며 특히 천연형 엑센딘-4는 매일 투여 1시간 후에 혈당농도를 측정하였다 (도 14). 엑센딘-4 유도체의 결합체는 1회 투여로 10일 이상 혈중 글루코스 농도 감소효과가 유지된 반면, 천연형 엑센딘-4 결합체는 8일 이후부터 혈중 글루코스 농도 감소효과가 사라짐을 볼 수 있었다.
본 발명의 인슐린분비 펩타이드 결합체는 펩타이드의 생체 내 활성이 비교적 높게 유지되고, 혈중 반감기가 현저히 증가되어 다양한 펩타이드 약물의 지속형 제형 개발에 유용하게 이용될 수 있다.
도 1은 천연형 엑센딘-4(N)-PEG-면역글로블린 Fc 결합체 순도를 역상컬럼으로 분석한 결과이고,
도 2은 천연형 엑센딘-4(Lys)-PEG-면역글로블린 Fc 결합체 순도를 역상컬럼으로 분석한 결과이며,
도 3는 데스-아미노-히스티딜 엑센딘-4(Lys)-PEG-면역글로블린 Fc 결합체 순도를 역상컬럼으로분석한 결과이며,
도 4는 베타-히드록시-이미다조-프로피오닐, 즉, (2-Hydroxy-3-(1H-Imidazol-4-yl)propionyl) 엑센딘-4(Lys)-PEG-면역글로블린 Fc 결합체 순도를 역상컬럼으로 분석한 결과이며,
도 5는 이미다조-아세틸, 즉, (2-(1H-imidazole-4-yl)acetyl) 엑센딘-4(Lys)-PEG-면역글로블린 Fc 결합체 순도를 역상컬럼으로 분석한 결과이며,
도 6는 Ser12-변이된-데스-아미노-히스티딜 엑센딘-4(Lys)-PEG-면역글로블린 Fc 결합체 순도를 역상컬럼으로 분석한 결과이며,
도 7는 Arg12-변이된-데스-아미노-히스티딜 엑센딘-4(Lys)-PEG-면역글로블린 Fc 결합체 순도를 역상컬럼으로 분석한 결과이며,
도 8는 데스-아미노-히스티딜 엑센딘-4(Lys)-PEG-인간혈청알부민(HSA) 결합체 순도를 역상컬럼으로 분석한 결과이며,
도 9는 디메틸-히스티딜 엑센딘-4(Lys)-PEG-면역글로블린 Fc 결합체 순도를 역상컬럼으로 분석한 결과이며,
도 10은 GLP-1(N)-PEG-면역글로블린 Fc 결합체 순도를 역상컬럼으로 분석한 결과이며,
도 11는 데스-아미노-히스티딜 GLP-1(Lys)-PEG-면역글로블린 Fc 결합체 순도를 역상컬럼으로 분석한 결과이며,
도 12은 천연형 엑센딘-4(Lys)-PEG-면역글로블린 Fc 결합체 순도를 역상컬럼으로 분석한 결과이며,
도 13은 이미다조-아세틸, 즉, (2-(1H-imidazole-4-yl)acetyl) 엑센딘-4(Lys)-PEG-면역글로블린 Fc 결합체를 12% SDS-PAGE로 분석한 결과이며,
도 14는 데스-아미노-히스티딜 엑센딘-4(Lys)-PEG-면역글로블린 Fc 결합체의 혈중 글루코스 농도 감소효과를 측정한 결과이다. (Byetta는 천연형 엑센딘-4; HM11260A 는 엑센딘4-PEG-Fc 결합체; HM11260D 는 DA 엑센딘4-PEG-Fc 결합체; HM11260DM 은 DM 엑센딘4-PEG-Fc 결합체; HM11260S 는 Ser12 DA 엑센딘4-PEG-Fc 결합체; HM11260C 는 CA 엑센딘4-PEG-Fc 결합체; HM11260H 는 HY 엑센딘4-PEG-Fc 결합체)
<110> Hanmi Holdings Co., Ltd <120> An insulinotropic complex using an immunoglobulin fragment <130> PA070736KR <150> KR1020070001662 <151> 2007-01-05 <160> 2 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 38 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> insulinotropic peptide <400> 1 Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gln Met Glu Glu Glu 1 5 10 15 Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Asn Gly Gly Pro Ser Ser 20 25 30 Gly Ala Pro Pro Pro Ser 35 <210> 2 <211> 29 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> insulinotropic peptide <400> 2 Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gln Met Glu Glu Glu 1 5 10 15 Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Asn Gly Gly 20 25

Claims (33)

  1. 엑센딘-4의 N-말단 아민 그룹이 하이드록실 그룹으로 치환된 엑센딘-4 유도체, 엑센딘-4의 N-말단 아민 그룹이 디메틸기로 수식된 엑센딘-4 유도체, 및 엑센딘-4의 N-말단 히스티딘 잔기의 알파 탄소 및 알파 탄소에 결합된 N-말단 아민 그룹을 제거한 엑센딘-4 유도체로 구성된 군으로부터 선택되는 인슐린분비 펩타이드, 및 면역글로불린 Fc 영역이
    폴리에틸렌글리콜, 폴리프로필렌글리콜, 에틸렌 글리콜-프로필렌 글리콜 공중합체, 폴리옥시에틸화폴리올, 폴리비닐알콜, 폴리사카라이드, 덱스트란, 폴리비닐에틸에테르, 생분해성 고분자, 지질 중합체, 키틴, 히아루론산 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 비펩타이드성 중합체를 통해 연결된 인슐린분비 펩타이드 결합체.
  2. 제1항에 있어서, 비펩타이드성 중합체는 인슐린 분비 펩타이드의 N-말단 이외의 아미노산 잔기에 결합하여 연결된 인슐린 분비 펩타이드 결합체.
  3. 제2항에 있어서, 비펩타이드성 중합체는 인슐린 분비 펩타이드의 라이신 잔기에 결합하여 연결된 인슐린 분비 펩타이드 결합체.
  4. 삭제
  5. 삭제
  6. 삭제
  7. 삭제
  8. 삭제
  9. 삭제
  10. 삭제
  11. 삭제
  12. 삭제
  13. 하기 화학식 1의 아미노산 서열을 갖는 인슐린 분비 펩티드 결합체.
    R1-X-Y-Z-R2 <화학식 1>
    여기서, R1은 N-디메틸-히스티딜, 베타-히드록시 이미다조프로필 및 4-이미다조아세틸로 구성되는 군에서 선택되고;
    R2는 -NH2, -OH 및 -Lys으로 구성되는 군에서 선택되고;
    X는 Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser 또는 Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly이고;
    Y는 폴리에틸렌글리콜, 폴리프로필렌글리콜, 에틸렌 글리콜-프로필렌 글리콜 공중합체, 폴리옥시에틸화폴리올, 폴리비닐알콜, 폴리사카라이드, 덱스트란, 폴리비닐에틸에테르, 생분해성 고분자, 지질 중합체, 키틴, 히아루론산 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되며; 및
    Z는 면역글로불린 Fc 영역이다.
  14. 제1항에 있어서, 비펩타이드성 중합체의 양 말단이 각각 면역글로불린 Fc 영역 및 인슐린분비 펩타이드의 아민 그룹 또는 티올 그룹(Thiol group)에 결합된 인슐린분비 펩타이드 결합체.
  15. 제1항에 있어서, 면역글로불린 Fc 영역이 비당쇄화됨을 특징으로 하는 인슐린분비 펩타이드 결합체.
  16. 제1항에 있어서, 면역글로불린 Fc 영역이 CH1, CH2, CH3 및 CH4 도메인으로 이루어진 군으로부터 1개 내지 4개 선택되는 도메인으로 이루어진 인슐린분비 펩타이드 결합체.
  17. 제16항에 있어서, 면역글로불린 Fc 영역이 힌지영역을 추가로 포함하는 것인 인슐린분비 펩타이드 결합체.
  18. 제1항에 있어서, 면역글로불린 Fc 영역이 IgG, IgA, IgD, IgE 및 IgM로 구성되는 군으로부터 선택되는 면역글로불린에서 유래된 Fc 영역인 인슐린분비 펩타이드 결합체.
  19. 제18항에 있어서, 면역글로불린 Fc 영역의 각각의 도메인이 IgG, IgA, IgD, IgE 및 IgM로 이루어진 군에서 선택되는 면역글로불린에서 유래된 상이한 기원을 가진 도메인의 하이브리드인 인슐린분비 펩타이드 결합체.
  20. 제18항에 있어서, 면역글로불린 Fc 영역이 동일한 기원의 도메인으로 이루어진 단쇄 면역글로불린으로 구성된 이량체 또는 다량체(면역글로불린 Fc의 조합)인 인슐린분비 펩타이드 결합체.
  21. 제18항에 있어서, 면역글로불린 Fc 영역이 IgG4 Fc 영역인 인슐린분비 펩타이드 결합체.
  22. 제21항에 있어서, 면역글로불린 Fc 영역이 인간 비당쇄화 IgG4 Fc 영역인 인슐린분비 펩타이드 결합체.
  23. 제1항에 있어서, 비펩타이드성 중합체의 반응기가 알데히드 그룹, 프로피온 알데히드 그룹, 부틸 알데히드 그룹, 말레이미드 그룹 및 석시니미드 유도체로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 인슐린분비 펩타이드 결합체.
  24. 제23항에 있어서, 석시니미드 유도체가 석시니미딜 프로피오네이트, 석시니미딜 카르복시메틸, 히드록시 석시니미딜 및 석시니미딜 카보네이트로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 인슐린분비 펩타이드 결합체.
  25. 제23항에 있어서, 비펩타이드성 중합체가 양 말단에 알데히드 그룹의 반응기를 갖는 인슐린분비 펩타이드 결합체.
  26. 제25항에 있어서, 비펩타이드성 중합체가 폴리에틸렌글리콜인 인슐린분비 펩타이드 결합체.
  27. (1) 양 말단에 알데히드, 말레이미드 및 석시니미드 유도체 중에서 선택되는 반응기를 갖는 비펩타이드성 중합체를 인슐린분비 펩타이드에 공유결합시키는 단계;
    (2) 상기 (1)의 반응 혼합물로부터 비펩타이드성 중합체가 공유결합된 인슐린분비 펩타이드를 포함하는 연결체를 분리하는 단계; 및
    (3) 분리된 연결체의 비펩타이드성 중합체의 다른 쪽 말단에 면역글로불린 Fc 영역을 공유결합으로 연결하여, 비펩타이드성 중합체의 양쪽 말단이 각각 면역글로불린 Fc 영역 및 인슐린분비 펩타이드와 결합된 펩타이드 결합체를 생성하는 단계를 포함하는,
    상기 인슐린 분비 펩타이드가 엑센딘-4의 N-말단 아민 그룹이 하이드록실 그룹으로 치환된 엑센딘-4 유도체, 엑센딘-4의 N-말단 아민 그룹이 디메틸기로 수식된 엑센딘-4 유도체, 및 엑센딘-4의 N-말단 히스티딘 잔기의 알파 탄소 및 알파 탄소에 결합된 N-말단 아민 그룹을 제거한 엑센딘-4 유도체로 구성된 군으로부터 선택되는 인슐린분비 펩타이드 결합체의 제조방법.
  28. 제27항에 있어서, 비펩타이드성 중합체가 인슐린 분비 펩타이드의 N-말단 이외의 아미노산 잔기에 결합하여 연결되는 인슐린 분비 펩타이드 결합체의 제조방법.
  29. 제28항에 있어서, 비펩타이드성 중합체가 인슐린 분비 펩타이드의 라이신 잔기에 결합하여 연결되는 인슐린 분비 펩타이드 결합체의 제조방법.
  30. 제27항에 있어서, 비펩타이드성 중합체가 폴리에틸렌글리콜인 인슐린분비 펩타이드 결합체의 제조방법.
  31. 삭제
  32. 삭제
  33. 제1항 내지 제3항, 및 제13항 내지 제26항 중 어느 한 항의 인슐린분비 펩티드 결합체를 포함하는 당뇨, 비만, 급성 관상동맥증후군, 및 다낭성 난소 증후군으로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 질환 치료용 약제학적 조성물.
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