KR20120010146A - 신규한 지속형 글루카곤 결합체 및 이를 포함하는 비만 예방 및 치료용 약학적 조성물 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 글루카곤 또는 그의 유도체가 비펩타이드 링커에 의해 중합체 캐리어에 공유적으로 연결된 신규한 지속형 글루카곤 결합체 및 이를 유효성분으로 포함하는 비만 예방 및 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다. 본 발명에 따른 지속형 글루카곤 결합체는 생체 내 지속성 및 안정성이 향상되어 항비만 약물과의 병용 투여 시 투여량을 획기적으로 줄이면서 혈당의 요동이 없는 개선된 복약순응도를 나타내므로 비만의 예방 및 치료에 매우 유용하게 사용될 수 있다.

Description

신규한 지속형 글루카곤 결합체 및 이를 포함하는 비만 예방 및 치료용 약학적 조성물{Novel long-acting glucagon conjugate and pharmaceutical composition comprising the same for the prevention and treatment of obesity}
본 발명은 신규한 지속형 글루카곤 결합체(long-acting glucagon conjugate) 및 이를 포함하는 비만 예방 및 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다. 구체적으로, 본 발명은 글루카곤 또는 그의 유도체가 비펩타이드 링커(non-peptide linker)에 의해 중합체 캐리어(polymer carrier)에 공유적으로 연결된 신규한 지속형 글루카곤 결합체 및 이를 유효성분으로 포함하는 비만 예방 및 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다. 본 발명에 따른 지속형 글루카곤 결합체는 생체 내 지속성 및 안정성이 현저히 향상되어 항비만 약물과의 병용 투여시 약물 투여량을 획기적으로 줄이면서 혈당의 요동이 없는 개선된 복약순응도를 나타내므로 비만의 예방 및 치료에 매우 유용하게 사용될 수 있다.
최근 경제성장과 생활방식의 변화에 따라 식습관에도 많은 변화가 있다. 특히, 바쁜 현대인들은 패스트푸드 등의 고열량 식이와 적은 운동량으로 인하여 과체중 및 비만이 증가하고 있다. 국제보건기구(World Health Organisation, WHO)에 따르면, 전 세계적으로 10억 이상의 성인이 과체중이고, 그 중 적어도 300만 명 이상이 임상적으로 비만이며, 매년 25,000명 이상이 과체중과 관련된 질환에 의해 사망하는 것으로 보고되었다(World Health Organization, Global Strategy on Diet, Physical Activity and Health, 2004).
과체중 및 비만은 혈압과 콜레스테롤 수치를 높여 심장 질환, 당뇨, 관절염 등 각종 질환의 원인이 되기도 하고, 다양한 성인병의 발병을 증가시키고 있다. 뿐만 아니라, 과체중 및 비만은 성인뿐만 아니라 어린이나 청소년들에서도 동맥경화, 고혈압, 고지혈증 또는 심장질환 등과 같은 성인병의 발병을 증가시키는 한 요인이 되고 있다.
이와 같이 비만은 전 세계적인 질병으로서 각종 질환의 원인이 되기도 하는 심각한 질병이지만 쉽게 치료할 수 없는 질병이다. 의학 전문가들 사이에서 비만은 복잡하고 다양한 요소에 기인하며, 단순한 자제력의 문제가 아니라 식욕의 조절과 에너지 대사가 관련된 복잡한 질환이라는 인식이 확산되고 있다. 그러나, 일반적으로 비만은 소비 에너지에 비해 섭취 에너지가 지속적으로 과도하기 때문에 유발되는 질환으로, 이를 예방 또는 치료하기 위한 장기적 관점에서 식이요법, 운동과 병행하여 사용될 수 있는 효과적이고 안전한 의약품의 개발이 요구되고 있는 실정이다.
최근 비만과 관련한 연구에서 주목되는 의약품은 옥신토모듈린(oxyntomodulin)이라는 펩타이드이다. 옥신토모듈린은 전구체인 프리-글루카곤(pre-glucagon)으로부터 생성되는 것으로서, 프리-글루카곤을 전구체로 하는 GLP-1과 글루카곤의 두 펩타이드의 수용체에 모두 결합할 수 있다. 이러한 옥신토모듈린 펩타이드의 이중 기능성(dual function)에 근거하여 비만 치료 목적의 의약품을 개발하기 위한 연구가 활발하게 진행 중에 있다.
글루카곤-유사 펩티드-1(glucagon-like peptide-1, 이하 'GLP-1')은 당뇨 환자의 고혈당증을 감소시키는 치료제로 개발 중인 물질로서, 인슐린 합성과 분비 촉진, 글루카곤의 분비 저해, 위공복 억제, 글루코오스 사용 증진과 더불어 음식물 섭취를 저해하는 기능을 가진다. GLP-1과 대략 50% 아미노산 상동성을 가지는, 도마뱀 독액(lizard venom)으로부터 생성되는 엑센딘(exendin)-4 또한 GLP-1 수용체를 활성화시켜 당뇨 환자의 고혈당증을 감소시키는 것으로 알려져 있다.
글루카곤은 약물 치료 또는 질병, 호르몬이나 효소 결핍 등의 원인으로 혈당이 저하되기 시작하면 췌장(pancreas)에서 생산된다. 글루카곤은 간에서 글리코겐(glycogen)을 분해하여 글루코오스를 방출하도록 신호하고, 혈당 수준을 정상 수준까지 높이는 역할을 한다.
따라서, GLP-1 수용체와 글루카곤 수용체 모두에 작용제(agonist)로 작용하는 옥신토모듈린은 GLP-1의 음식물 섭취 저해 기능과 글루카곤의 글리코겐 분해 기능을 보여 항비만 치료제로서의 가능성을 높이고 있다.
이러한 옥신토모듈린의 유도체로는 현재 임상 1상 진행 중인 듀얼 작용제(Dual agonist, Merck)와 전임상 시험 진행 중인 ZP2929(Zealand, WO200/8152403 A1) 등이 있다. 듀얼 작용제 옥신토모듈린(Merck)은 옥신토모듈린의 2번째 아미노산 L-Ser을 D-Ser으로 치환하여 다이펩티딜 펩티다제 IV(dipeptidyl peptidase-Ⅳ, 이하 'DPP-Ⅳ')에 대한 저항성을 높이는 동시에 C-말단에 콜레스테롤 모이어티를 붙여 혈중 반감기를 증가시킨 것이다. ZP2929(Zealand)는 옥신토모듈린의 2번째 아미노산 L-Ser을 D-Ser으로 치환하여 DPP-Ⅳ에 대한 저항성을 높이고 17번째 아미노산 Arg을 Ala로 치환하여 프로테아제에 대한 저항성을 높인 것이다. 또한, 27번째 아미노산 Met를 Lys으로 치환하여 산화적 안정성을 증가시키고, 20번째와 24번째 아미노산 Gln과 28번째 아미노산 Asn을 각각 Asp, Ala 및 Ser로 치환하여 탈아미드화 안정성(deamidation stability)을 증가시켰다.
이와 같이, 옥신토모듈린은 GLP-1 수용체와 글루카곤 수용체에 동시에 작용하여 항비만 치료제로서의 개발 가능성을 가지나 반감기가 8 내지 12분으로 매우 짧은 단점이 있다. 반감기를 증가시킨 듀얼 작용제 옥신토모듈린 역시 천연형 옥신토모듈린의 반감기보다는 길어졌지만 여전히 1.7시간으로 생체 내 반감기가 매우 짧으며, 약물의 투여 용량 또한 수 mg/kg으로 매우 높은 수준이다. 따라서, 옥신토모듈린 또는 그의 유도체는 짧은 반감기와 낮은 약효로 인해 과량의 약물을 매일 투여해야 한다는 단점이 있다. 이는 상기와 같은 펩타이드를 약리성분으로 포함하는 단백질 의약품의 경우 혈중 농도 및 역가를 유지하기 위해 약물을 주사 형태로 자주 투여해야 하므로, 환자에게 엄청난 고통을 야기하게 되어 매우 큰 부담이 아닐 수 없다. 따라서, 생체 내 약물 농도를 오랫동안 지속시키고 약효를 극대화하는 것은 장기적이고 효과적인 항비만 치료제의 개발에 있어 선결 과제이다.
한편, 단백질 약물의 혈중 안정성을 증가시키고 혈중 약물 농도를 오랫동안 높게 지속시켜 약효를 극대화하려는 노력이 계속되어 왔다. 단백질을 안정화시키고 단백질 가수분해효소와의 접촉 및 신장 소실을 억제하기 위해 PEG와 같은 고분자를 단백질 약물 표면에 화학적으로 부가하였으나, PEG의 분자량이 증가할수록 단백질과의 반응성이 낮아져 수율이 감소하는 문제가 있었다. 다른 방법으로, 유전자 재조합에 의해 알부민이나 면역글로불린 Fc 단편과 같은 혈중 안정성이 높은 단백질 유전자와 생리활성 단백질 유전자를 연결하여 융합단백질 형태로 생산하는 방법이 개발되었다(미국특허 제6,277,375호, 제6,410,008호, 제6,444,792호 등). 그러나, 상기 방법 역시 목적단백질과 면역글로불린 Fc 단편을 대장균에서 동시에 생산하므로 천연형에 당쇄가 있는 목적단백질에는 적용하기 어렵고 미스폴딩(misfolding) 확률이 매우 높다는 문제점이 있었다.
이에 본 발명자들은 상기와 같은 문제점을 해결하기 위해 단백질 약물의 활성 감소를 최소화하고 안정성 향상을 동시에 달성하는 기술로서, 종래 생리활성 폴리펩타이드와 면역글로불린 Fc 단편을 비펩타이드 링커를 이용하여 상호 공유결합에 의해 연결시킨 지속형 단백질 결합체를 제안한바 있다(대한민국 등록특허 제10-0725315호). 특히, 인슐린분비 펩타이드 중 엑센딘-4 및 그의 유도체가 면역글로불린 Fc 단편에 비펩타이드 링커를 통해 연결된 지속형 엑센딘-4 결합체가 획기적으로 증가한 생체 내 효력 지속효과를 나타냄을 확인한바 있다(대한민국 특허출원 공개 제10-2008-0064750호).
나아가 본 발명자들은 상기와 같은 기술을 항비만 치료제 개발에 접목하여 생체 내 지속성 및 안정성이 증가한 항비만 치료제를 개발하고자, GLP-1 수용체와 글루카곤 수용체를 동시에 자극하도록 상기 지속형 엑센딘-4 결합체(주 1회)와 천연형 글루카곤(매일 1회)의 병용 투여를 시도하였다. 그 결과, 지속형 엑센딘-4 결합체의 단독 투여 시와 비교하여 천연형 글루카곤 펩타이드와의 병용 투여 시에 획기적인 체중감소 효과를 확인할 수 있었으나, 예상치 못한 혈당의 심한 요동으로 인해 시험 동물에서 독성이 나타나는 문제점을 관찰하였다.
이에, 본 발명자들은 천연형 글루카곤 펩타이드의 혈중 반감기 증가 및 생체 내 활성 유지를 동시에 극대화할 수 있는 방법으로서 글루카곤 또는 그의 유도체에 비펩타이드 링커를 이용해 면역글로불린 Fc 단편과 같은 중합체 캐리어를 공유적으로 연결한 신규한 지속형 글루카곤 결합체를 제조하고, 이의 생체 내 효력 지속효과가 획기적으로 증가함을 확인하였다. 나아가, 본 발명에 따른 지속형 글루카곤 결합체를 항비만 약물과 함께 사용할 경우 생체 내 지속성 및 안정성이 향상되고 투여 용량을 획기적으로 줄이면서도 혈당의 요동이 없는 복약순응도가 개선됨을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명의 목적은 생체 내 지속성 및 안정성이 향상된 지속형 글루카곤 결합체를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 지속형 글루카곤 결합체의 제조방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 지속형 글루카곤 결합체를 유효성분으로 함유하는 비만의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 약학적 조성물을 이를 필요로 하는 대상에게 투여하는 단계를 포함하는, 비만을 예방 또는 치료하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 지속형 글루카곤 결합체를 비만의 예방 또는 치료를 위한 약제의 제조에 사용하는 용도를 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위한 하나의 양태로서, 본 발명은 글루카곤 또는 그의 유도체가 비펩타이드 링커에 의해 중합체 캐리어에 공유적으로 연결된 신규한 지속형 글루카곤 결합체를 제공한다.
본 발명에서 용어, "글루카곤"은 췌장 섬 알파세포(pancreatic alpha cell)에서 분비되는 분자량 8,000 내지 20,000의 프로글루칸(proglucagon) 단편을 포함하는 전구체(glucagon preproprotein, GenBank Accession No. NP_002045.1)로부터 생성되며, 서열번호: 1로 기재되는 29개 아미노산으로 이루어진 폴리펩타이드 호르몬이다. 글루카곤은 간에서 글리코겐(glycogen)을 분해하여 글루코오스를 방출하도록 신호하고, 인슐린 분비를 자극하는 역할을 하여 인슐린-의존적 조직에 의해 글루코오스가 이용되도록 한다. 따라서, 글루카곤과 인슐린은 피드백 시스템을 이루어 혈당을 적정 수준으로 유지시키는 역할을 한다.
본 발명에서 용어, "글루카곤 유도체"는 글루카곤의 생체 내 수용체에 결합하여 글루카곤과 동일한 생물학적 활성을 나타내는 물질을 의미하며, 천연형 글루카곤과 비교 시 아미노산 서열에서 최소한 80% 이상의 상동성을 보이며, 아미노산 잔기의 일부 그룹이 화학적으로 치환(substitution), 제거(deletion) 또는 수식(modification)된 형태일 수 있다. 본 발명에서, 글루카곤 유도체는 천연형 글루카곤의 작용제(agonist), 유도체(derivative), 단편(fragment), 변이체(variant) 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다.
본 발명에서 용어, "글루카곤 작용제"는 글루카곤의 구조와 상관없이 글루카곤의 생체 내 수용체에 결합하여 글루카곤과 동일한 생물학적 활성을 나타내는 물질을 의미한다.
본 발명에서 용어, "글루카곤 유도체"는 천연형 글루카곤과 비교 시 아미노산 서열에서 최소한 80% 이상 상동성을 보이며, 아미노산 잔기의 일부 그룹이 화학적으로 치환(예; alpha-methylation, alpha-hydroxylation), 제거(예; deamination) 또는 수식(예; N-methylation)된 형태일 수 있고, 글루카곤 활성을 보유한 펩타이드를 의미한다.
본 발명에서 용어, "글루카곤 단편"은 천연형 글루카곤의 N-말단 또는 C-말단에 하나 또는 그 이상 아미노산이 추가 또는 삭제된 형태를 의미하며, 천연에 존재하지 않는 아미노산(예: D-형 아미노산)의 추가도 가능할 수 있고, 이러한 글루카곤 단편은 글루카곤 활성을 보유한다.
본 발명에서 용어, "글루카곤 변이체"는 천연형 글루카곤과 아미노산 서열이 하나 이상 다른 펩타이드로서, 글루카곤 활성을 보유한 펩타이드를 의미한다.
바람직하게는, 본 발명의 글루카곤 유도체는 천연형 글루카곤 N-말단의 치환, 제거 및 수식 중에 선택된 어느 하나의 방법에 의해 제조되고, 글루카곤의 기능을 보유하는 펩타이드, 이들의 단편 및 이들의 변이체로 구성되는 군으로부터 선택될 수 있다. 더욱 바람직하게는, 천연형 글루카곤의 N-말단의 첫 번째 아미노산인 히스티딘 잔기의 알파 카본에 결합된 알파 아민기 또는 알파 카본을 치환 또는 제거한 유도체일 수 있다. 더욱 더 바람직하게는, 본 발명의 글루카곤 유도체는 천연형 글루카곤의 N-말단 아민기가 제거되거나, 그의 N-말단 아민기가 히드록실기(hydroxyl group)로 치환되거나, 그의 N-말단 아민기가 2개의 메틸기로 수식되거나, 그의 N-말단 히스티딘 잔기의 알파 카본 및 알파 카본에 결합된 아민기가 제거된 유도체일 수 있다.
상기 글루카곤 유도체는 하기 화학식 1 내지 4로 표시될 수 있다.
Figure pat00001
Figure pat00002
Figure pat00003
Figure pat00004
상기 화학식 1 내지 4에서, "Peptide"는 천연형 글루카곤이다.
상기 화학식 1의 글루카곤 유도체는 글루카곤의 N-말단 아민기가 제거된 데스-아미노-히스티딜 글루카곤(des-amino-histidyl glucagon, 이하 'DA-글루카곤')이고,
화학식 2의 글루카곤 유도체는 글루카곤의 N-말단 아민기가 히드록실기로 치환된 베타-히드록시-이미다조프로피오닐 글루카곤(beta-hydroxyimidazopropionyl glucagon, 이하 'HY-글루카곤')이고,
화학식 3의 글루카곤 유도체는 글루카곤의 N-말단 아민기가 두 개의 메틸기로 수식된 다이메틸히스티딜 글루카곤(dimethyl histidyl glucagon, 이하 'DM-글루카곤')이고,
화학식 4의 글루카곤 유도체는 글루카곤의 N-말단 히스티딘 잔기의 알파 카본 및 알파 카본에 결합된 아민기가 제거된 이미다조아세틸 글루카곤(imidazoacetyl glucagon, 이하 'CA-글루카곤')이다.
본 발명에서 용어, "지속형 글루카곤 결합체(long-acting glucagon conjugate)"는 글루카곤 또는 그의 유도체가 비펩타이드 링커에 의해 중합체 캐리어에 공유결합으로 연결되어 있는 형태로, 글루카곤 또는 그의 유도체의 혈중 반감기를 증가시키고 생체 내 활성 유지를 극대화한 결합체를 의미한다. 본 발명의 지속형 글루카곤 결합체는 천연형 글루카곤 또는 그의 유도체에 비해 10% 이상, 바람직하게는 50% 이상 증가된 혈중 반감기를 나타낸다.
본 발명에서 용어, "비펩타이드 링커"는 반복 단위가 2개 이상 결합된 생체적합성(biocompatible) 중합체를 의미하며, 상기 반복 단위들은 펩타이드 결합이 아닌 임의의 공유결합을 통해 서로 연결된다. 본 발명에서 비펩타이드 링커는 양 말단에 반응기를 보유하고 있어 한쪽 말단에는 글루카곤 또는 그의 유도체가 공유적으로 연결되고 다른 한쪽 말단에는 중합체 캐리어가 공유적으로 연결될 수 있다.
본 발명에 적합한 비펩타이드 링커에는 폴리에틸렌글리콜(polyethylene glycol, PEG), 폴리프로필렌글리콜, 에틸렌글리콜과 프로필렌글리콜의 공중합체, 폴리옥시에틸화폴리올, 폴리비닐알콜, 폴리사카라이드, 덱스트란, 폴리비닐에틸에테르, 폴리락트산(polylactic acid, PLA) 및 폴리락틱-글리콜산(polylactic-glycolic acid, PLGA)와 같은 생분해성(biodegradable) 고분자, 지질 중합체, 키틴, 히아루론산 등이 포함될 수 있으나, 이들로 제한되는 것은 아니다.
기존 틀-내 융합(inframe fusion) 방법으로 제조된 융합단백질에 사용되는 펩타이드 링커는 생체 내에서 프로테아제(protease)에 의해 쉽게 절단되어 캐리어에 의한 활성 약물의 혈중 반감기 증가효과를 기대만큼 얻을 수 없다는 단점이 있다. 그러나 본 발명에서는 프로테아제에 내성을 갖는 비펩타이드 링커를 사용하여 캐리어와 유사하게 펩타이드의 혈중 반감기를 유지할 수 있다. 따라서, 본 발명에 사용될 수 있는 비펩타이드 링커는 상기와 같은 역할, 즉 생체 내 프로테아제에 내성을 나타내는 것이라면 제한 없이 사용될 수 있다. 본 발명에서 비펩타이드 링커는 분자량이 1 내지 100 kDa 범위, 바람직하게는 1 내지 20 kDa 범위인 것이 바람직하다. 또한, 본 발명에서 비펩타이드 링커는 한 종류의 링커뿐만 아니라 상이한 종류의 링커들의 조합으로 사용될 수도 있다.
본 발명에 적합한 비펩타이드 링커는 양 말단에 반응기를 갖는다. 비펩타이드 링커의 양 말단 반응기는 알데히드기, 프로피온알데히드기, 부틸알데히드기, 말레이미드(maleimide)기 및 석시니미드(succinimide) 유도체로 이루어진 군으로부터 선택되는 것이 바람직하다. 상기에서, 석시니미드 유도체로는 석시니미딜 프로피오네이트, 히드록시 석시니미딜, 석시니미딜 카르복시메틸 또는 석시니미딜 카보네이트가 이용될 수 있다. 특히, 비펩타이드 링커가 양 말단에 알데히드기를 갖는 경우, 비특이적 반응을 최소화하면서 비펩타이드 링커의 양 말단에 글루카곤 또는 그의 유도체 및 중합체 캐리어가 각각 결합하는데 효과적이다. 알데히드 결합에 의한 환원성 알킬화로 생성된 최종 산물은 아미드 결합으로 연결된 것보다 훨씬 안정적이다.
상기 비펩타이드 링커의 양 말단 반응기는 서로 같거나 다를 수 있다. 예를 들어, 한쪽 말단에는 말레이미드기를, 다른 쪽 말단에는 알데히드기, 프로피온알데히드기 또는 부틸알데히드기를 가질 수 있다. 양 말단에 히드록시기를 갖는 PEG를 비펩타이드 링커로 사용하는 경우에는 공지의 화학반응에 의해 히드록시기를 전술한 다양한 반응기로 활성화하거나, 상업적으로 입수가능한 변형된 반응기를 갖는 PEG를 사용하여 본 발명에 따른 지속형 글루카곤 결합체를 제조할 수 있다.
본 발명에서 비펩타이드 링커는 글루카곤 또는 그의 유도체의 다양한 부위에 결합될 수 있으며, 결합 부위에 따라 활성 차이를 나타낼 수 있다. 예를 들어, N-말단과 C-말단을 포함한 N-말단 이외 부위들에 각각 결합하여 생체 외(in vitro) 활성의 차이를 확인할 수 있다. 비펩타이드 링커의 알데히드는 낮은 pH에서는 글루카곤 또는 그의 유도체의 N-말단에 선택적으로 반응하며, 높은 pH, 예컨대 pH 9.0에서는 글루카곤 또는 그의 유도체의 라이신 잔기에 공유결합을 형성할 수 있다. 반응 pH를 달리하며 페길화(pegylation) 반응을 진행한 후, 이온-교환 칼럼을 사용하여 반응 혼합물로부터 위치이성질체를 분리할 수 있다.
생체 내 활성에 중요한 부위인 N-말단 이외의 위치에 결합할 경우, 천연형 아미노산 서열에서 수식하고자 하는 아미노산 잔기 위치에 반응성 티올기를 도입하여 비펩타이드 링커의 말레이미드기와 공유결합을 형성할 수 있다.
생체 내 활성에 중요한 부위인 N-말단 이외의 위치에 커플링할 경우, 천연형 아미노산 서열에서 수식하고자 하는 아미노산 잔기 위치에 반응성 아민기를 도입하여 비펩타이드 링커의 알데히드기와 공유결합을 형성할 수 있다.
비펩타이드 링커의 알데히드기는 글루카곤의 N-말단과 라이신 잔기에 있는 아민기와 반응할 수 있으며, 선택적으로 반응 수율을 향상시키기 위해 변형된 형태의 펩타이드를 사용할 수 있다. 예를 들어, N-말단을 차단(blocking)하는 방법, 라이신 잔기를 치환하는 방법, 카르복시 말단에 아민기를 도입하는 방법 등을 사용하여 아민기를 원하는 위치에 하나만 유지할 수 있고, 이를 통해 페길화 및 결합 수율을 향상시킬 수 있다. N-말단의 차단은 다양한 알킬화(alkylation) 방법, 예컨대, 이들로 제한되는 것은 아니나, 다이메틸화(dimethylation), 메틸화(methylation), 탈아미노화(deamination) 또는 아세틸화(acetylation) 방법에 의해 가능하다.
발명의 바람직한 실시양태로서, 본 발명의 지속형 글루카곤 결합체는 글루카곤 또는 그의 유도체의 N-말단 이외의 아민기에 비펩타이드 링커를 통해 중합체 캐리어가 공유적으로 연결된 형태로, 글루카곤 수용체에 결합능이 있는 결합체이다.
본 발명에서 용어, "중합체 캐리어"는 약물에 결합되어 약물의 생리활성을 증감시키거나 제거하는 물질을 의미한다. 그러나, 본 발명에서의 중합체 캐리어는 본 발명의 목적상 결합되는 글루카곤 또는 그의 유도체의 생리활성 감소를 최소화하면서 동시에 이들의 생체 내 안정성을 증가시키기 위한 것이다. 본 발명에 적합한 중합체 캐리어로는 폴리에틸렌글리콜(PEG), 폴리아미노산, 알부민, 젤라틴, 면역글로불린 단편, 덱스트란, 지방산, 폴리사카라이드, 고분자 중합체 등이 포함될 수 있으나, 이들로 제한되는 것은 아니다. 본 발명은 결합되는 글루카곤 또는 그의 유도체의 생체 내 지속성 증진과 생체 내 활성 감소의 최소화를 위한 중합체 캐리어로 바람직하게는 면역글로불린 Fc 단편을 사용한다.
면역글로불린 Fc 단편은 생체 내에서 대사되는 생분해성 폴리펩타이드이기 때문에, 약물의 캐리어로 사용하기에 안전하다. 또한, 면역글로불린 Fc 단편은 면역글로불린 전체 분자에 비해 상대적으로 분자량이 적기 때문에 결합체의 제조, 정제 및 수율 면에서 유리하다. 뿐만 아니라, 아미노산 서열이 항체마다 다르기 때문에 높은 비균질성을 나타내는 Fab 부분을 제거함으로써 물질의 동질성이 크게 증가되고 혈중 항원성의 유발 가능성도 낮아지는 효과를 기대할 수 있다.
본 발명에서 용어, "면역글로불린 Fc 단편"은 면역글로불린의 중쇄와 경쇄 가변영역, 중쇄 불변영역 1(CH1)과 경쇄 불변영역(CL1)을 제외한, 중쇄 불변영역 2(CH2) 및 중쇄 불변영역 3(CH3) 부분을 의미하며, 중쇄 불변영역에 힌지(hinge) 부분을 포함하기도 한다. 또한, 본 발명의 면역글로불린 Fc 단편은 천연형과 실질적으로 동등하거나 향상된 효과를 갖는 한, 면역글로불린의 중쇄와 경쇄 가변영역만을 제외하고, 일부 또는 전체 CH1 및/또는 CL1을 포함하는 확장된 Fc 단편일 수 있다. 또한, CH2 및/또는 CH3에 해당하는 상당히 긴 일부 아미노산 서열이 제거된 단편일 수도 있다. 즉, 본 발명의 면역글로불린 Fc 단편은 1) CH1 도메인, CH2 도메인, CH3 도메인 및 CH4 도메인, 2) CH1 도메인 및 CH2 도메인, 3) CH1 도메인 및 CH3 도메인, 4) CH2 도메인 및 CH3 도메인, 5) 1개 또는 2개 이상의 상기 도메인과 면역글로불린 힌지 영역(또는 힌지 영역의 일부)의 조합, 및 6) 중쇄 불변영역 각 도메인과 경쇄 불변영역의 이량체일 수 있다.
또한, 본 발명의 면역글로불린 Fc 단편은 천연형 아미노산 서열뿐만 아니라 이의 서열 유도체(mutant)를 포함한다. "아미노산 서열 유도체"란 천연 아미노산 서열 중의 하나 이상의 아미노산 잔기가 결실, 삽입, 비보전적 또는 보전적 치환 또는 이들의 조합에 의하여 상이한 서열을 가지는 것을 의미한다. 예를 들면, IgG Fc의 경우 결합에 중요하다고 알려진 214 내지 238, 297 내지 299, 318 내지 322 또는 327 내지 331번 아미노산 잔기들이 변형을 위해 적당한 부위로서 이용될 수 있다. 또한, 이황화 결합을 형성할 수 있는 부위가 제거되거나, 천연형 Fc에서 N-말단의 몇몇 아미노산이 제거되거나 또는 천연형 Fc의 N-말단에 메티오닌 잔기가 부가될 수도 있는 등 다양한 종류의 유도체가 가능하다. 또한, 이펙터 기능을 제거하기 위해 보체결합부위, 예로 C1q 결합부위가 제거될 수도 있고, ADCC(antibody dependent cell mediated cytotoxicity) 부위가 제거될 수도 있다. 이러한 면역글로불린 Fc 단편의 서열 유도체를 제조하는 기술은 국제특허공개 제WO 97/34631호, 국제특허공개 제96/32478호 등에 개시되어 있다.
단백질 및 펩타이드에서 분자의 활성을 전체적으로 변경시키지 않는 아미노산 교환이 당해 분야에 공지되어 있다(H. Neurath, R.L. Hill, The Proteins, Academic Press, New York, 1979). 가장 통상적으로 일어나는 교환은 아미노산 잔기 Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Thy/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu, Asp/Gly 사이의 교환이다.
경우에 따라서는 인산화(phosphorylation), 황화(sulfation), 아크릴화(acrylation), 당화(glycosylation), 메틸화(methylation), 파네실화(farnesylation), 아세틸화(acetylation), 아밀화(amidation) 등으로 수식(modification)될 수도 있다.
상기 기술한 Fc 유도체는 본 발명의 Fc 단편과 동일한 생물학적 활성을 나타내지만 Fc 단편의 열, pH 등에 대한 구조적 안정성을 증대시킨 유도체이다.
또한, 이러한 Fc 단편은 인간 및 소, 염소, 돼지, 마우스, 토끼, 햄스터, 랫트, 기니아 픽과 같은 동물의 생체 내에서 분리한 천연형으로부터 얻어질 수도 있고, 형질전환된 동물세포 또는 미생물로부터 얻어진 재조합형 또는 이의 유도체일 수 있다. 여기서, 천연형으로부터 획득하는 방법은 전체 면역글로불린을 인간 또는 동물의 생체로부터 분리한 후, 프로테아제를 처리하여 얻을 수 있다. 파파인을 처리한 경우에는 Fab 및 Fc로 절단되고, 펩신을 처리한 경우에는 pF'c 및 F(ab)2로 절단된다. 절단된 단편들을 크기-배제 크로마토그래피(size-exclusion chromatography) 등을 이용하여 분리할 수 있다. 바람직하게는 인간 유래의 면역글로불린 Fc 단편을 미생물로부터 수득한 재조합형 면역글로불린 Fc 단편을 사용할 수 있다.
또한, 면역글로불린 Fc 단편은 천연형 당쇄, 천연형에 비해 증가된 당쇄, 천연형에 비해 감소된 당쇄 또는 당쇄가 제거된 형태일 수 있다. 이러한 면역글로불린 Fc 당쇄의 증감 또는 제거에는 화학적 방법, 효소학적 방법 및 미생물을 이용한 유전공학적 방법과 같은 통상적인 방법이 이용될 수 있다. 여기서, 당쇄가 제거된 면역글로불린 Fc 단편은 보체(c1q)의 결합력이 현저히 저하되고, 항체-의존적 세포독성 또는 보체-의존적 세포독성이 감소 또는 제거되므로, 생체 내에서 불필요한 면역반응을 유발하지 않는다. 이런 점에서 약물의 캐리어로서의 본래의 목적에 보다 부합하는 형태는 당쇄가 제거되거나 비당쇄화된 면역글로불린 Fc 단편이다.
본 발명에서 용어, "당쇄 제거(deglycosylation)"는 효소로 당을 제거한 Fc 단편을 말하며, "비당쇄화(aglycosylation)"는 원핵동물, 바람직하게는 대장균에서 생산하여 당쇄화되지 않은 Fc 단편을 의미한다.
한편, 면역글로불린 Fc 단편은 인간 또는 소, 염소, 돼지, 마우스, 토끼, 햄스터, 랫트, 기니아 픽 등의 동물 기원일 수 있으며, 바람직하게는 인간 기원이다. 또한, 면역글로불린 Fc 단편은 IgG, IgA, IgD, IgE, IgM 유래 또는 이들의 조합(combination) 또는 이들의 혼성체(hybrid)에 의한 Fc 단편일 수 있다. 바람직하게는 인간 혈액에 가장 풍부한 IgG 또는 IgM 유래이며, 가장 바람직하게는 리간드 결합 단백질의 반감기를 향상시키는 것으로 공지된 IgG 유래이다.
본 발명에서 용어, "조합(combination)"이란 이량체 또는 다량체를 형성할 때, 동일 기원 단쇄 면역글로불린 Fc 단편을 암호화하는 폴리펩타이드가 상이한 기원의 단쇄 폴리펩타이드와 결합을 형성하는 것을 의미한다. 즉, IgG Fc, IgA Fc, IgM Fc, IgD Fc 및 IgE Fc 단편으로 이루어진 군으로부터 선택된 2개 이상의 단편으로부터 이량체 또는 다량체의 제조가 가능하다.
본 발명에서 용어, "혼성체(hybrid)"란 단쇄의 면역글로불린 Fc 단편 내에 2개 이상의 상이한 기원의 면역글로불린 Fc 단편에 해당하는 서열이 존재함을 의미한다. 본 발명의 경우, 여러 형태의 혼성체가 가능하다. 즉, IgG Fc, IgM Fc, IgA Fc, IgE Fc 및 IgD Fc의 CH1, CH2, CH3 및 CH4로 구성된 군으로부터 선택된 1개 내지 4개 도메인으로 이루어진 도메인의 혼성체가 가능하며, 힌지를 포함할 수 있다.
한편, IgG 역시 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4의 서브클래스로 나눌 수 있고 본 발명에서는 이들의 조합 또는 이들의 혼성체도 가능하다. 바람직하게는 IgG2 및 IgG4 서브클래스이며, 가장 바람직하게는 보체-의존적 세포독성(CDC)과 같은 이펙터 기능(effector function)이 거의 없는 IgG4 Fc 단편이다.
즉, 가장 바람직한 본 발명의 중합체 캐리어용 면역글로불린 Fc 단편은, 인간 IgG4 유래의 비-당쇄화된 Fc 단편이다. 비-인간 유래의 Fc 단편과는 달리, 인간 유래의 Fc 단편은 인간 생체에서 항원으로 작용하여 이에 대한 새로운 항체를 생성하는 등의 면역반응을 유발하지 않아 바람직하다.
구체적인 실시양태에서, 본 발명에 따른 지속형 글루카곤 결합체는 하기 화학식 5로 표시되는 결합체일 수 있다.
<화학식 5>
R1-X-Y-Z-R2
상기 식에서, R1은 히스티딘(His), 데스-아미노-히스티딜, N-다이메틸-히스티딜, 베타-히드록시 이미다조프로필 및 4-이미다조아세틸로 구성된 군으로부터 선택되고;
R2는 -NH2, -OH 및 -라이신(Lys)으로 구성된 군으로부터 선택되고;
X는 SQGTFTSDYSKYLDSRRAQDFVQWLMNT이고;
Y는 폴리에틸렌글리콜(PEG)이고;
Z는 면역글로불린 Fc 단편이다.
바람직한 실시양태에서, 본 발명에 따른 지속형 글루카곤 결합체는 비펩타이드 링커로 PEG의 양 말단이 CA-글루카곤(즉, 상기 화학식 5에서 R1이 4-이미다조아세틸인 경우)의 12번째 라이신(Lys12)과 면역글로불린 Fc 단편의 N-말단에 상호 공유적으로 연결된 것이다.
발명의 다른 양태로서, 본 발명은 상기 지속형 글루카곤 결합체의 제조방법을 제공한다.
본 발명에 따른 제조방법은
1) 글루카곤 또는 그의 유도체를 양 말단에 반응기를 갖는 비펩타이드 링커와 반응시키는 단계;
2) 단계 1)의 반응 혼합물로부터 비펩타이드 링커의 한쪽 말단에 글루카곤 또는 그의 유도체가 공유적으로 연결된 복합체를 분리하는 단계;
3) 단계 2)에서 분리된 복합체를 중합체 캐리어와 반응시키는 단계; 및
4) 단계 3)의 반응 혼합물로부터 비펩타이드 링커의 한쪽 말단에는 글루카곤 또는 그의 유도체가, 다른 쪽 말단에는 중합체 캐리어가 공유적으로 연결된 지속형 글루카곤 결합체를 분리하는 단계를 포함할 수 있다.
본 발명에서 용어, "복합체(complex)"란 비펩타이드 링커의 한쪽 말단에 글루카곤 또는 그의 유도체가 공유적으로 연결된 중간체로서, 이후 상기 복합체 내 비펩타이드 링커의 다른 쪽 말단에 중합체 캐리어가 연결된다.
단계 1)은 비펩타이드 링커와 글루카곤 또는 그의 유도체의 복합체를 형성하는 단계로, 서열번호: 1의 아미노산 서열을 갖는 천연형 글루카곤 또는 그의 N-말단 변이체, 예컨대 글루카곤의 N-말단 아민기가 제거된 화학식 1의 DA-글루카곤, 글루카곤의 N-말단 아민기가 히드록실기로 치환된 화학식 2의 HY-글루카곤, 글루카곤의 N-말단 아민기가 두 개의 메틸기로 수식된 화학식 3의 DM-글루카곤, 글루카곤의 N-말단 히스티딘 잔기의 알파 카본 및 알파 카본에 결합된 아민기가 제거된 화학식 4의 CA-글루카곤이 사용될 수 있다.
단계 1)에서 비펩타이드 링커는 양 말단에 각각 알데히드기, 프로피온알데히드기, 부틸알데히드기, 말레이미드기 및 석시니미드 유도체로 이루어진 군으로부터 선택되는 반응기를 갖는 것이 바람직하다. 본 발명에 적합한 석시니미드 유도체로는 석시니미딜 프로피오네이트, 히드록시 석시니미딜, 석시니미딜 카르복시메틸 또는 석시니미딜 카보네이트가 이용될 수 있다. 상기 비펩타이드 링커의 양 말단 반응기는 서로 같거나 다를 수 있다. 바람직하게는, 비펩타이드 링커로 양 말단에 알데히드기를 갖는 PEG를 사용한다. 알데히드기는 비특이적 반응을 최소화하면서, 비펩타이드 링커의 양 말단에 글루카곤 또는 그의 유도체 및 중합체 캐리어가 각각 결합하는데 효과적이다. 또한, 알데히드 결합에 의한 환원성 알킬화로 생성된 최종 산물은 아미드 결합으로 연결된 것보다 훨씬 안정적이다.
단계 1)에서 비펩타이드 링커가 글루카곤 또는 그의 유도체의 N-말단 이외의 아미노산 잔기, 바람직하게는 12번째 라이신 잔기에 공유적으로 연결된다. 단계 1)에서 N-말단 이외의 아미노산 잔기, 특히 12번째 라이신 잔기에서 비펩타이드 링커의 선택적 결합을 위해, 글루카곤 또는 그의 유도체와 비펩타이드 링커를 pH 7.5 내지 10.0, 바람직하게는 pH 9.0의 조건에서 반응시킨다. 이때, 글루카곤 또는 그의 유도체와 비펩타이드 링커의 반응 몰비는 1:5 내지 1:50의 범위, 바람직하게는 1:20 내지 1:30의 범위일 수 있다. 단계 1)에서 N-말단의 제거 또는 보호된 형태의 글루카곤 유도체의 사용은 비펩타이드 링커가 글루카곤 유도체의 N-말단에 결합하는 것을 미연에 방지할 수 있다.
단계 1)의 반응은, 반응에 참가하는 비펩타이드 링커의 양쪽 말단 반응기의 종류를 고려하여 필요에 따라 환원제의 존재 하에서 수행될 수 있다. 바람직한 환원제로는 나트륨 시아노 보로하이드라이드(NaCNBH3), 수소화붕소나트륨, 다이메틸아민 붕산염 또는 피리딘 붕산염 등이 사용될 수 있다.
단계 2)는 단계 1)의 반응 혼합물로부터 비펩타이드 링커의 한쪽 말단에 글루카곤 또는 그의 유도체가 공유적으로 연결된 글루카곤-비펩타이드 링커 복합체를 분리하는 단계이다. 이 단계에서는 요구되는 순도 및 생성된 산물의 분자량 및 전하량과 같은 특성을 고려하여, 단백질의 분리에 사용되는 통상의 방법들 중에서 필요에 따라 적절히 선택하여 수행할 수 있다. 예를 들어, 크기 배제 크로마토그래피 또는 이온 교환 크로마토그래피를 포함하는 다양한 공지의 방법들을 적용할 수 있으며, 필요에 따라서는 보다 높은 순도로 정제하기 위해 복수개의 서로 다른 방법을 조합하여 사용할 수 있다.
단계 3)은 단계 2)에서 분리된 글루카곤-비펩타이드 링커 복합체를 중합체 캐리어와 반응시켜 비펩타이드 링커의 다른 쪽 말단에 중합체 캐리어를 공유결합으로 연결하는 단계이다. 이 단계에 적합한 중합체 캐리어는 폴리에틸렌글리콜(PEG), 폴리아미노산, 알부민, 젤라틴, 면역글로불린 단편, 덱스트란, 지방산, 폴리사카라이드 및 고분자 중합체로 구성된 군으로부터 선택될 수 있고, 바람직하게는 면역글로불린 Fc 단편이다.
이 단계에서, 글루카곤-비펩타이드 링커 복합체와 중합체 캐리어의 반응은 1:2 내지 1:10, 바람직하게는 1:4 내지 1:8의 반응 몰비로, pH 5.0 내지 8.0, 바람직하게는 pH 6.0의 조건에서 수행될 수 있다. 이때, 반응에 참가하는 비펩타이드 링커의 양쪽 말단 반응기의 종류를 고려하여 필요에 따라 환원제의 존재 하에서 수행될 수 있다. 바람직한 환원제로는 나트륨 시아노 보로하이드라이드(NaCNBH3), 수소화붕소나트륨, 다이메틸아민 붕산염 또는 피리딘 붕산염 등이 사용될 수 있다.
단계 4)는 단계 3)의 반응 혼합물로부터 비펩타이드 링커의 한쪽 말단에는 글루카곤 또는 그의 유도체가, 다른 쪽 말단에는 중합체 캐리어가 공유적으로 연결된 글루카곤-비펩타이드 링커-중합체 캐리어 구조의 지속형 글루카곤 결합체를 분리하는 단계이다. 이 단계에서는, 요구되는 순도 및 생성된 산물의 분자량 및 전하량과 같은 특성을 고려하여, 단백질의 분리에 사용되는 통상의 방법들 중에서 필요에 따라 적절히 선택하여 수행할 수 있다. 예를 들어, 크기 배제 크로마토그래피 또는 이온 교환 크로마토그래피를 포함하는 다양한 공지의 방법들을 적용할 수 있으며, 필요에 따라서는 더 높은 순도로 정제하기 위해 복수 개의 서로 다른 방법을 조합하여 사용할 수 있다.
바람직한 일 실시양태로서, 본 발명에 따른 제조방법은
1) 천연형 글루카곤의 N-말단 알파 카본 및 알파 카본에 결합된 아민기가 제거된 글루카곤 유도체를 양 말단에 알데히드를 갖는 PEG와 pH 9.0에서 반응시키는 단계;
2) 단계 1)의 반응 혼합물로부터 글루카곤 유도체의 12번째 라이신 잔기에 PEG의 한쪽 말단이 공유적으로 연결된 글루카곤-PEG 복합체를 분리하는 단계;
3) 단계 2)에서 분리된 글루카곤-PEG 복합체를 면역글로불린 Fc 단편과 반응시키는 단계; 및
4) 단계 3)의 반응 혼합물로부터 PEG의 한쪽 말단에는 글루카곤 유도체가, 다른 쪽 말단에는 면역글로불린 Fc 단편이 공유적으로 연결된 지속형 글루카곤 결합체를 분리하는 단계를 포함할 수 있다.
발명의 다른 양태로서, 본 발명은 상기 지속형 글루카곤 결합체를 유효성분으로 포함하는 비만의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명에서 용어, "비만(obesity)"은 에너지 불균형에 의하여 과다한 체지방을 가진 상태(condition) 또는 질환(disease)을 의미한다. 본 발명에 따른 약학적 조성물을 개체에 투여함으로써 체중을 감량하고 식이 섭취를 줄여 비만을 예방 또는 치료할 수 있다.
본 발명에서 용어, "예방"이란 본 발명에 따른 약학적 조성물의 투여로 비만의 발병을 억제 또는 지연시키는 모든 행위를 의미한다.
본 발명에서 용어, "치료"란 본 발명에 따른 약학적 조성물의 투여로 비만의 증세가 호전되거나 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미한다.
본 발명의 약학적 조성물은 혈중 반감기가 증가하고 생체 내 지속성 및 안정성이 향상된 본 발명에 따른 지속형 글루카곤 결합체를 유효성분으로 포함하기 때문에, 약물의 투여 용량을 획기적으로 줄이면서도 혈당의 요동이 없는 개선된 복약순응도를 나타내어 비만의 예방 및 치료에 유용하게 사용될 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 유효성분으로 본 발명에 따른 지속형 글루카곤 결합체 이외에 항비만 약물을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명에 따라 지속형 글루카곤 결합체와 병용 투여하기에 적합한 항비만 약물에는 GLP-1 작용제, 렙틴(Leptin) 작용제, DPP-IV 저해제, Y5 수용체 길항제(antagonist), 멜라닌-농축 호르몬(melanin-concentrating hormone, MCH) 길항제, Y2/3 작용제, MC3/4 작용제, 위/췌장 리파아제(gastric/pancreatic lipase) 저해제, 5HT2c 작용제, β3A 작용제, 아밀린(amylin) 작용제, 그랠린(ghrelin) 길항제 등이 포함되나, 이들로 제한되는 것은 아니다.
바람직하게는, 본 발명에 따른 약학적 조성물은 항비만 약물로 대한민국 특허출원 공개 제10-2008-0064750호에 개시된 지속형 엑센딘-4 결합체를 포함할 수 있다. 상기 지속형 엑센딘-4 결합체는 서열번호: 2의 아미노산 서열을 갖는 엑센딘-4(GenBacnk Accession No. AAB22006) 또는 그의 유도체가 비펩타이드 링커를 통해 면역글로불린 Fc 단편과 공유적으로 연결된 결합체이다. 더욱 바람직하게는, 이들로 제한되는 것은 아니나, 엑센딘-4의 N-말단 아민기가 제거된 유도체(DA-엑센딘-4), 엑센딘-4의 N-말단 아민기가 히드록실기로 치환된 유도체(HY-엑센딘-4), 엑센딘-4의 N-말단 아민기가 다이메틸기로 수식된 유도체(DM-엑센딘-4) 및 엑센딘-4의 N-말단 히스티딘 잔기의 알파 카본 및 알파 카본에 결합된 아민기가 제거된 유도체(CA-엑센딘-4)로부터 선택되는 엑센딘-4 유도체가 비펩타이드 링커를 통해 면역글로불린 Fc 단편과 공유적으로 연결된 결합체이다.
본 발명의 지속형 글루카곤 결합체를 항비만 약물과 병용 투여하는 경우 이들의 단독 투여에 비해 체중 감소 및 식이 섭취 감소에 상승적 효과(synergic effect)가 나타난다. 구체적으로, 본 발명의 지속형 글루카곤 결합체를 지속형 엑센딘-4 결합체와 같은 항비만 약물과 병용 투여하면, 본 발명의 지속형 글루카곤 결합체가 글루카곤 수용체에 작용함과 동시에 항비만 약물이 GLP-1 수용체에 작용하기 때문에 더욱 효과적으로 체중을 감소시키고 식이 섭취를 줄일 수 있다. 상기 지속형 펩타이드 결합체들의 병용 투여는 획기적으로 증가된 혈중 반감기 및 생체 내 효력 지속효과를 나타내고 더욱 안정적인 혈당 변화 추이를 보일 뿐만 아니라, 투여량을 획기적으로 줄일 수 있어 개선된 복약순응도를 나타내므로, 본 발명의 약학적 조성물은 비만의 예방 또는 치료에 유용하게 사용될 수 있다.
구체적인 일 실시양태에 따르면, 식이성-유도 비만(Diet-Induced Obesity, DIO) 마우스에 지속형 글루카곤 결합체와 지속형 엑센딘-4 결합체를 병용 투여한 후 체중, 사료 섭취량, 혈당의 변화 추이를 관찰한 결과, 상기 약물의 단독 투여에 비해 병용 투여한 경우에 현저한 체중 감소 및 사료섭취 억제효과가 나타났으며, 혈당 변화 또한 안정적인 추이를 보였다(도 1 내지 3 참조). 이에 반해, DIO 마우스에 천연형 글루카곤과 지속형 엑센딘-4 결합체를 병용 투여한 경우에는 체중은 감소하였으나, 혈당이 심하게 요동치면서 변화하는 양상을 보였다(도 4 및 5 참조). 이러한 결과를 통해, 글루카곤과 엑센딘-4 모두 지속형 결합체일 때, 혈당의 요동과 같은 부작용이 없는 안정적인 체중 감소 및 식이섭취 감소의 상승적 효과를 기대할 수 있으며, 생체 내 지속된 효과로 투여 용량을 획기적으로 줄일 수 있음을 확인하였다.
본 발명의 약학적 조성물은 각각의 사용 목적에 맞게 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁제, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구 제형, 멸균 주사용액의 주사제 등 다양한 형태로 제형화하여 사용할 수 있으며, 경구 투여하거나 정맥내, 복강내, 피하, 직장, 국소 투여 등을 포함한 다양한 경로를 통해 투여될 수 있다. 이러한 조성물에 포함될 수 있는 약학적으로 허용가능한 담체, 부형제 또는 희석제의 예로는 락토오스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리쓰리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로스, 메틸 셀룰로스, 비정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸하이드록시벤조에이트, 프로필하이드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유 등을 들 수 있다. 본 발명의 조성물은 충전제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제, 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다.
경구 투여를 위한 고형 제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형 제제는 상기 조성물에 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면 전분, 탄산칼슘, 수크로스, 락토오스, 젤라틴 등을 혼합하여 제형화한다. 또한, 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크와 같은 윤활제가 사용될 수 있다.
경구용 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 예시될 수 있으며, 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 액체 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다.
비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액제, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제, 좌제 등을 예시할 수 있다. 비수성용제, 현탁제에는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 포함될 수 있다. 주사제에는 용해제, 등장화제, 현탁화제, 유화제, 안정화제, 방부제 등과 같은 종래의 첨가제가 포함될 수 있다.
본 발명의 조성물은 약제학적으로 유효한 양으로 투여한다. 본 발명에서, "약제학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 환자의 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료 기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명의 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고, 종래의 치료제와 순차적으로 또는 동시에 투여될 수 있으며, 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기한 요소들을 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
구체적으로, 본 발명의 조성물에서 유효성분의 유효량은 환자의 나이, 성별, 체중에 따라 달라질 수 있는데, 병용 투여 시 10 내지 4000 ㎍/㎏, 바람직하게는 50 내지 2000 ㎍/㎏의 지속형 글루카곤 결합체 + 5 내지 100 ㎍/㎏, 바람직하게는 10 내지 50 ㎍/㎏의 지속형 엑센딘-4 결합체를 매주 투여할 수 있다. 그러나, 투여 경로, 질병의 중증도, 성별, 체중, 연령 등에 따라서 증감될 수 있으므로 상기 투여량이 어떠한 방법으로도 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다. 또한, 본 발명의 약학적 조성물은 생체 내 지속성 및 역가가 우수하므로, 투여 횟수 및 빈도를 현저하게 감소시킬 수 있다.
발명의 또 다른 양태로서, 본 발명은 치료학적으로 유효한 양의 지속형 글루카곤 결합체를 이를 필요로 하는 대상에게 투여하는 것을 포함하는, 대상에게서 비만을 예방 또는 치료하는 방법을 제공한다. 이때, 지속형 글루카곤 결합체와 함께 항비만 약물을 병용 투여할 수 있다.
병용 투여될 수 있는 항비만 약물은 바람직하게는 대한민국 특허출원 공개 제10-2008-0064750호에 개시된 지속형 엑센딘-4 결합체이다. 상기 지속형 엑센딘-4 결합체는 엑센딘-4 또는 그의 유도체가 비펩타이드 링커를 통해 면역글로불린 Fc 단편과 공유적으로 연결된 결합체이다. 더욱 바람직하게는, 이들로 제한되는 것은 아니나, 엑센딘-4의 N-말단 아민기가 제거된 유도체(DA-엑센딘-4), 엑센딘-4의 N-말단 아민기가 히드록실기로 치환된 유도체(HY-엑센딘-4), 엑센딘-4의 N-말단 아민기가 다이메틸기로 수식된 유도체(DM-엑센딘-4) 및 엑센딘-4의 N-말단 히스티딘 잔기의 알파 카본 및 알파 카본에 결합된 아민기가 제거된 유도체(CA-엑센딘-4)로부터 선택되는 엑센딘-4 유도체가 비펩타이드 링커를 통해 면역글로불린 Fc 단편과 공유적으로 연결된 결합체가 병용 투여될 수 있다.
본 발명에서 "투여"는 어떠한 적절한 방법으로 환자에게 소정의 유효성분을 도입하는 것을 의미하며, 투여 경로는 유효성분이 목적 조직에 도달할 수 있는 한 소정의 일반적인 경로를 통하여 투여될 수 있다. 복강내 투여, 정맥내 투여, 근육내 투여, 피하 투여, 피내 투여, 경구 투여, 국소 투여, 비강내 투여, 폐내 투여, 직장내 투여 등이 될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 그러나 경구 투여 시, 펩타이드는 소화되기 때문에 경구용 조성물은 유효성분을 코팅하거나 위에서의 분해로부터 보호되도록 제형화하는 것이 바람직하다. 바람직하게는 주사제 형태로 투여될 수 있다. 또한, 지속성 제제는 유효성분을 표적세포로 전달할 수 있는 임의의 장치를 이용해 투여될 수 있다.
본 발명에서 "대상"은 인간, 원숭이, 소, 말, 양, 돼지, 닭, 칠면조, 메추라기, 고양이, 개, 마우스, 쥐, 또끼 또는 기니아 피그를 포함하나 이에 한정되지 아니하는 동물을 의미하고, 일 실시예에서는 포유류를, 또 다른 실시예에서는 인간을 의미한다.
본 발명에서 유효성분과 결합하여 사용된 "치료학적으로 유효한 양"이란 용어는 대상 질환, 즉 비만을 치료 또는 예방하는데 유효한 지속형 글루키곤 결합체의 양을 의미한다.
본 발명의 방법에 따라 비만 환자에게 지속형 글루카곤 결합체와 함께 지속형 엑센딘-4 결합체와 같은 항비만 약물을 병용 투여하는 경우, 지속형 글루카곤 결합체는 글루카곤 수용체에 작용하고 이와 동시에 항비만 약물은 GLP-1 수용체에 작용하여 더욱 효과적으로 체중을 감소시키고 식이 섭취를 줄일 수 있다. 본 발명에 따른 지속형 글루카곤 결합체와 항비만 약물의 병용 투여는 개선된 생체 내 지속성으로 인해 더욱 안정적인 혈당 변화 추이를 보일 뿐만 아니라, 투여량을 획기적으로 줄일 수 있어 개선된 복약순응도를 나타내므로, 환자에게 빈번한 투여로 인한 고통을 유발하지 않으면서 비만을 더욱 효과적으로 예방 또는 치료할 수 있다.
본 발명의 글루카곤 또는 이의 유도체의 지속형 결합체는 획기적으로 증가된 생체 내 효력 지속효과를 나타내어, 항비만 약물과의 병용 투여 시 생체 내 지속성 및 안정성이 향상되고 투여 용량을 획기적으로 줄이면서도 혈당의 요동이 없고 복약순응도가 개선되어 비만의 예방 및 치료에 우수한 효능을 나타낸다.
도 1은 DIO(Diet-Induced Obesity) 마우스에 지속형 CA-글루카곤 결합체와 지속형 CA-엑센딘-4 결합체를 병용 투여한 후, 8일간 체중 변화 추이를 나타낸 그래프이다.
도 2는 DIO 마우스에 지속형 CA-글루카곤 결합체와 지속형 CA-엑센딘-4 결합체를 병용 투여한 후, 8일간 사료 섭취량 변화 추이를 나타낸 그래프이다.
도 3은 DIO 마우스에 지속형 CA-글루카곤 결합체와 지속형 CA-엑센딘-4 결합체를 병용 투여한 후, 8일간 혈당 변화 추이를 나타낸 그래프이다.
도 4는 DIO 마우스에 천연형 글루카곤 펩타이드와 지속형 CA 엑센딘-4 결합체를 병용 투여한 후, 12일간 체중 변화 추이를 나타낸 그래프이다.
도 5는 DIO 마우스에 천연형 글루카곤 펩타이드와 지속형 CA 엑센딘-4 결합체를 병용 투여한 후, 12일간 혈당 변화 추이를 나타낸 그래프이다.
이하, 하기 실시예에 의하여 본 발명을 보다 상세하게 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐 본 발명의 범위가 이들로 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 이미다조-아세틸 글루카곤-면역글로불린 Fc 결합체의 제조
3.4K PropionALD(2) PEG(양 말단에 프로피온알데히드기를 갖는 PEG, IDB Inc., 대한민국)를 이미다조-아세틸(imidazo-acetyl) 글루카곤(CA-글루카곤, AP, 미국)의 12번째 라이신(Lys12) 잔기에 페길화시키기 위하여, CA-글루카곤과 3.4K PropionALD(2) PEG의 몰비를 1:30, 펩타이드의 농도를 3 mg/ml로 하여 실온에서 3시간 동안 반응시켰다. 이때, 반응은 환원제로 20 mM SCB의 존재 하에서 pH 9.0인 100 mM 붕산나트륨(Na-borate) 완충액 중에서 수행되었다. 반응이 종결된 후, 하기 조건에서 SOURCE S 칼럼(XK 16 ml, GE Healthcare)을 이용한 크로마토그래피를 수행하여 반응액을 정제하였다.
이로부터 수득된 CA-글루카곤-PEG 복합체를 면역글로불린 Fc 단편(대한민국 특허등록 제10-725315호에 따라 제조)과 1:8의 몰비로 혼합하고, 전체 펩타이드 농도를 20 mg/ml로 하여 4℃에서 20시간 동안 반응시켰다. 이때, 반응은 환원제로 20 mM SCB의 존재 하에서 pH 6.0인 100 mM K-P 완충액 중에서 수행되었다. 반응이 종결된 후, 하기 조건에서 SOURCE Phe 칼럼(HR 16 ml, GE Healthcare)과 SOURCE Q 칼럼(XK 16 ml, GE Healthcare)을 이용한 2단계 크로마토그래피를 수행하여 반응액을 정제하였다.
먼저 결합반응에 참여하지 않은 다량의 면역글로블린 Fc를 제거하기 위하여, SOURCE Phe 칼럼을 이용하였다. 20 mM Tris(pH 7.5)에서 1 M NaCl을 사용하여 염 구배를 주어 상대적으로 결합력이 약한 면역글로블린 Fc 단편을 먼저 용출시키고 바로 뒤이어 CA-글루카곤-PEG-Fc 결합체를 용출시켰다. 일차 정제를 통해 어느 정도 면역글로블린 Fc 단편이 제거되지만 이온교환 칼럼에서 면역글로블린 Fc 단편과 CA-글루카곤-PEG-Fc 결합체의 결합력 차이가 크지 않아 완전한 분리가 어려웠다. 이에 두 물질의 소수성(hydrophobicity)을 이용하여 이차 정제를 수행하였다. SOURCE Q 칼럼에 20 mM Tris(pH 9.0)를 이용하여 일차 정제된 시료를 결합시킨 후 차츰 1 M NaCl로 염 구배를 주면서 시료를 용출하였다. SOURCE Q 칼럼에 결합력이 약한 면역글로블린 Fc 단편이 먼저 용출되고 결합력이 강한 CA-글루카곤-PEG-Fc 복합체가 뒤이어 용출되었다. 용출된 CA-글루카곤-PEG-Fc 복합체를 역상 HPLC로 분석한 결과, 95.8% 순도를 나타내는 것으로 확인되었다.
칼럼: SOURCE S(XK 16 ml, GE Healthcare)
유속: 2.0 ml/분
구배: 용출액 A 0% → 용출액 B 50%(A: 20 mM 구연산, pH 3.0, B: A + 1 M KCl)로 50분간 용출
칼럼: SOURCE Phe(HR 16 ml, GE Healthcare)
유속: 7.0 ml/분
구배: 용출액 A 100% →0%(A: 20 mM 트리스, pH 7.5 + 2 M NaCl)로 60분간 용출
칼럼: SOURCE Q(XK 16 ml, GE Healthcare)
유속: 2.0 ml/분
구배: 용출액 A 0% → 용출액 B 20%(A: 20 mM 트리스, pH 9.0, B: A + 1 M NaCl)로 70분간 용출
실시예 2: 이미다조-아세틸 엑센딘-4-면역글로불린 Fc 결합체의 제조
3.4K PropionALD(2) PEG(양 말단에 프로피온알데히드기를 갖는 PEG, IDB Inc., 한국)를 이미다조-아세틸 엑센딘-4(CA-엑센딘-4, AP, 미국)의 27번째 라이신(Lys27)에 페길화시키기 위하여, CA-엑센딘-4와 3.4K PropionALD(2)의 몰비를 1:30, 펩타이드의 농도를 3 mg/ml로 하여 4℃에서 12시간 동안 반응시켰다. 이때, 반응은 환원제로 20 mM SCB의 존재 하에서 pH 7.5인 100 mM 인산나트륨(Na-phosphate) 완충액 중에서 수행되었다. 반응이 종결된 후, 하기 조건에서 SOURCE Q 칼럼(XK 16 ml, GE Healthcare)과 SOURCE S 칼럼(XK 16 ml, GE Healthcare)을 이용한 2단계 크로마토그래피를 수행하여 반응액을 정제하였다.
구체적으로, SOURCE Q 칼럼을 통해 일차적으로 모노-페길화된(monopegylated) 펩타이드를 정제하였으며, SOURCE S 칼럼을 통해 이성질체를 분리하였다. N-말단이 페길화된(N-term pegylated) 피크가 가장 먼저 용출되고 뒤이어 차례로 2개의 라이신이 페길화된(Lys-pegylated) 피크가 용출되었다. 펩타이드 매핑(mapping)으로 용출된 피크의 페길화된 위치를 분석한 결과, 먼저 용출된 분획이 12번째 라이신(Lys12)에 페길화된 복합체이고, 가장 나중에 용출된 분획이 27번째 라이신(Lys27)에 페길화된 복합체인 것을 확인하였다.
이로부터 분리된 Lys27 페길화된 CA-엑센딘-4 PEG 복합체를 면역글로불린 Fc 단편(대한민국 특허등록 제10-725315호에 따라 제조)과 1:8의 몰비, 전체 펩타이드 농도를 20 mg/ml로 하여 4℃에서 20시간 동안 반응시켰다. 이때, 반응은 환원제로 20 mM SCB의 존재 하에서 pH 6.0인 100 mM K-P 완충액 중에서 수행되었다. 반응이 종결된 후, 하기 조건에서 SOURCE Q 칼럼(XK 16 ml, GE Healthcare)과 SOURCE ISO 칼럼(HR 16 ml, GE Healthcare)을 이용한 2단계 크로마토그래피를 수행하여 반응액을 정제하였다.
구체적으로, 결합반응에 참여하지 않은 다량의 면역글로블린 Fc를 제거하기 위하여, SOURCE Q 칼럼을 이용하였다. 20 mM Tris(pH 7.5)에서 1 M NaCl을 사용하여 염 구배를 주어 상대적으로 결합력이 약한 면역글로블린 Fc 단편을 먼저 용출하고 바로 뒤이어 CA-엑센딘-4-PEG-Fc 결합체를 용출하였다. 일차 정제를 통해 어느 정도 면역글로블린 Fc 단편이 제거되지만 이온교환 칼럼에서는 면역글로블린 Fc 단편과 CA-엑센딘-4-PEG-Fc 결합체의 결합력 차이가 크지 않아 완전한 분리가 어려웠다. 이에 두 물질의 소수성을 이용하여 이차 정제를 수행하였다. SOURCE ISO 칼럼에 20 mM Tris(pH 7.5) 1.5M 황산암모늄을 이용하여 일차 정제된 시료를 결합시킨 후 차츰 황산암모늄 농도를 낮추면서 시료를 용출하였다. SOURCE ISO 칼럼에 결합력이 약한 면역글로블린 Fc 단편이 먼저 용출되고 결합력이 강한 CA-엑센딘-4-PEG-Fc 결합체는 나중에 용출되었다. 이들의 소수성 차이가 커 이온교환 칼럼보다 훨씬 분리가 용이하였다. 역상 HPLC로 분석한 결과, 분리된 CA-엑센딘-4-PEG-Fc 결합체는 91.6%의 순도를 나타내었다.
칼럼: SOURCE Q(XK 16ml, GE Healthcare)
유속: 2.0 ml/분
구배: 용출액 A 0% → 용출액 B 20%(A: 20 mM 트리스, pH 9.0, B: A + 1 M NaCl)로 70분간 용출
칼럼: SOURCE S(XK 16 ml, GE Healthcare)
유속: 2.0 ml/분
구배: 용출액 A 0% → 용출액 B 50%(A: 20 mM 구연산, pH 3.0, B: A + 1 M KCl)로 50분간 용출
칼럼: SOURCE ISO(HR 16 ml, GE Healthcare)
유속: 7.0 ml/분
구배: 용출액 A 100% → 0% 60분(A: 20 mM 트리스, pH 7.5 + 1.5 M 황산암모늄)로 60분간 용출
실시예 3: 지속형 글루카곤 결합체와 항비만 약물의 병용 투여에 의한 상승적 효과
실시예 1에서 제조된 지속형 글루카곤 결합체와 실시예 2에서 제조된 지속형 엑센딘-4 결합체의 병용 투여에 의한 상승적 효과를 확인하기 위하여, 식이성-유도 비만(Diet-Induced Obesity, DIO) 마우스를 이용하여 체중, 사료 섭취량 및 혈당 변화를 조사하였다.
5주령의 C57BL/6 마우스(오리엔트사, 대한민국)에 13주간 고지방식 다이어트를 실시하여 시험에 사용할 식이성으로 비만이 유도된 DIO 마우스를 얻었다. 구체적으로, 마우스를 체중에 따라 그룹당 5 마리씩 G1, G2, G3, G4 및 G5의 5개 그룹으로 분리한 후 고지방 사료(D12492, Research Diets, Inc. New Brunswick, NJ)를 매일 바꾸어 주면서 동물이 자유롭게 섭취할 수 있도록 하였다. 18주령(50 g/head)이 된 5개 그룹의 마우스에 각각 대조구로 담체(vehicle); CA-엑센딘-4-PEG-Fc 결합체(HM1 1260C); CA-엑센딘-4-PEG-Fc 결합체(HM1 1260C) + CA-글루카곤; 및 CA-엑센딘-4-PEG-Fc 결합체(HM1 1260C) + CA-글루카곤-PEG-Fc 결합체(LAPS CA-글루카곤)를 용량을 달리하여 약 2주간 투여하였다. 이때, G2 그룹에는 매주 20 ㎍/kg의 CA-엑센딘-4-PEG-Fc 결합체를, G3 그룹에는 매주 20 ㎍/kg의 CA-엑센딘-4-PEG-Fc 결합체 + 하루 2회씩 100 ㎍/kg의 CA-글루카곤을, G4 그룹에는 매주 20 ㎍/kg의 CA-엑센딘-4-PEG-Fc 결합체 + 매주 700 ㎍/kg의 CA-글루카곤-PEG-Fc 결합체를, G5 그룹에는 매주 20 ㎍/kg의 CA-엑센딘-4-PEG-Fc 결합체 + 매주 1400 ㎍/kg의 CA-글루카곤-PEG-Fc 결합체를 투여하였다. 상기 시험물질 투여 후 각 그룹에 대하여 매일 체중, 사료 섭취량 및 혈당의 변화를 측정하였다.
그 결과, 도 1 내지 3에 나타난 바와 같이, 지속형 글루카곤 결합체와 지속형 엑센딘-4 결합체를 병용 투여한 그룹에서 다른 그룹에 비해 확연한 체중 감소 및 사료 섭취량 감소 효과를 확인하였다. 특히, 혈당 변화의 경우, 천연형 글루카곤과 지속형 엑센딘-4 결합체를 병용 투여한 그룹에서 체중은 감소하였으나, 혈당이 심하게 요동치면서 변화하는 양상을 보인 반면, 지속형 글루카곤 결합체와 지속형 엑센딘-4 결합체를 병용 투여한 그룹은 안정적인 혈당 변화 추이를 보였다.
따라서, 글루카곤과 엑센딘-4가 모두 지속형 결합체일 때, 혈당의 요동과 같은 부작용이 없는 안정적인 체중 감소 및 식이섭취 감소 효과를 기대할 수 있으며, 생체 내 지속된 효과로 투여 용량을 획기적으로 줄일 수 있어 비만의 예방 및 치료에 더욱 효과적임을 확인하였다.
비교예 1: 천연형 글루카곤과 지속형 엑센딘-4 결합체의 병용 투여
천연형 글루카곤과 지속형 엑센딘-4 결합체의 병용 투여에 의한 효과를 확인하기 위하여, 실시예 3에서와 같이 DIO 마우스에 대조구로 담체(G1 그룹); 천연형 글루카곤 펩타 이드(G2 그룹); CA-엑센딘-4-PEG-Fc 결합체(HM1 1260C)(G3 그룹); 및 천연형 글루카곤 + CA-엑센딘-4-PEG-Fc 결합체(HM1 1260C)(G4 그룹)를 용량을 달리하여 약 2주간 투여하였다. 이때, G2 그룹에는 하루 2회씩 200 ㎍/kg의 천연형 글루카곤을, G3 그룹에는 매주 20 ㎍/kg의 CA-엑센딘-4-PEG-Fc 결합체를, G4 그룹에는 하루 2회씩 200 ㎍/kg의 천연형 글루카곤+ 매주 20 ㎍/kg의 CA-엑센딘-4-PEG-Fc 결합체를 투여하였다. 상기 시험물질 투여 후 각 그룹에 대하여 매일 체중, 사료 섭취량 및 혈당의 변화를 측정하였다.
그 결과, 도 4 및 5에 나타난 바와 같이, 다른 그룹에 비해 천연형 글루카곤과 지속형 엑센딘-4 결합체를 병용 투여한 그룹에서 증가된 체중 감소효과가 확인되었으나, 혈당이 심하게 요동치면서 변화하는 양상을 나타내어 시험 동물에게 독성을 유발하는 부작용이 관찰되었다.
<110> HANMI HONDINGS CO., LTD. <120> Novel long-acting glucagon conjugate and pharmaceutical composition comprising the same for the prevention and treatment of obesity <130> PA110485KR <150> KR10-2010-0070484 <151> 2010-07-21 <150> KR10-2010-0070485 <151> 2010-07-21 <160> 2 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 29 <212> PRT <213> wild-type glucagon <400> 1 His Ser Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Asp Ser 1 5 10 15 Arg Arg Ala Gln Asp Phe Val Gln Trp Leu Met Asn Thr 20 25 <210> 2 <211> 39 <212> PRT <213> wild-type exendin-4 <400> 2 His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gln Met Glu Glu 1 5 10 15 Glu Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Asn Gly Gly Pro Ser 20 25 30 Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser 35

Claims (48)

  1. 글루카곤 또는 그의 유도체가 비펩타이드 링커에 의해 중합체 캐리어에 공유적으로 연결된 지속형 글루카곤 결합체.
  2. 제1항에 있어서, 글루카곤 유도체가 천연형 글루카곤의 N-말단 첫 번째 아미노산인 히스티딘 잔기의 알파 카본 또는 그에 결합된 알파 아민기가 치환 또는 제거된 것인 지속형 글루카곤 결합체.
  3. 제2항에 있어서, 글루카곤 유도체가 천연형 글루카곤의 N-말단 아민기가 제거된 유도체, 그의 N-말단 아민기가 히드록실기(hydroxyl group)로 치환된 유도체, 그의 N-말단 아민기가 2개의 메틸기로 수식된 유도체 및 그의 N-말단 알파 카본 및 알파 카본에 결합된 아민기가 제거된 유도체로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 지속형 글루카곤 결합체.
  4. 제3항에 있어서, 글루카곤 유도체가 하기 화학식 1 내지 4로 표시되는 유도체로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 지속형 글루카곤 유도체:
    <화학식 1>
    Figure pat00005

    <화학식 2>
    Figure pat00006

    <화학식 3>
    Figure pat00007

    <화학식 4>
    Figure pat00008

    상기 화학식 1 내지 4에서, "Peptide"는 천연형 글루카곤임.
  5. 제1항에 있어서, 비펩타이드 링커의 양 말단이 각각 글루카곤 또는 그의 유도체 및 중합체 캐리어의 아민기 또는 티올기(thiol group)에 공유적으로 연결되는 것인 지속형 글루카곤 결합체.
  6. 제1항에 있어서, 비펩타이드 링커가 폴리에틸렌글리콜(polyethylene glycol, PEG), 폴리프로필렌글리콜, 에틸렌글리콜과 프로필렌글리콜의 공중합체, 폴리옥시에틸화폴리올, 폴리비닐알콜, 폴리사카라이드, 덱스트란, 폴리비닐에틸에테르, 생분해성 고분자, 지질 중합체, 키틴, 히아루론산 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 지속형 글루카곤 결합체.
  7. 제1항에 있어서, 비펩타이드 링커가 1 내지 100 kDa 범위의 분자량을 갖는 것인 지속형 글루카곤 결합체.
  8. 제1항에 있어서, 비펩타이드 링커가 양 말단에 각각 글루카곤 또는 그의 유도체 및 중합체 캐리어와 공유적으로 연결될 수 있는 반응기를 갖는 것인 지속형 글루카곤 결합체.
  9. 제8항에 있어서, 비펩타이드 링커가 양 말단에 알데히드기, 프로피온알데히드기, 부틸알데히드기, 말레이미드기, 석시니미딜 프로피오네이트, 히드록시 석시니미딜, 석시니미딜 카르복시메틸 및 석시니미딜 카보네이트로 구성된 군으로부터 선택되는 반응기를 갖는 것인 지속형 글루카곤 결합체.
  10. 제9항에 있어서, 비펩타이드 링커가 양 말단에 알데히드기를 갖는 것인 지속형 글루카곤 결합체.
  11. 제10항에 있어서, 비펩타이드 링커가 양 말단에 알데히드기를 갖는 폴리에틸렌글리콜(PEG)인 것인 지속형 글루카곤 결합체.
  12. 제1항에 있어서, 중합체 캐리어가 폴리에틸렌글리콜(PEG), 폴리아미노산, 알부민, 젤라틴, 면역글로불린 단편, 덱스트란, 지방산, 폴리사카라이드 및 고분자 중합체로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 지속형 글루카곤 결합체.
  13. 제12항에 있어서, 중합체 캐리어가 면역글로불린 Fc 단편인 것인 지속형 글루카곤 결합체.
  14. 제13항에 있어서, 면역글로불린 Fc 단편이 비당쇄화된 것인 지속형 글루카곤 결합체.
  15. 제13항에 있어서, 면역글로불린 Fc 단편이 CH1, CH2, CH3 및 CH4 도메인으로 구성된 군에서 선택되는 1개 내지 4개의 도메인으로 이루어진 것인 지속형 글루카곤 결합체.
  16. 제13항에 있어서, 면역글로불린 Fc 단편이 힌지영역을 추가로 포함하는 것인 지속형 글루카곤 결합체.
  17. 제13항에 있어서, 면역글로불린 Fc 단편이 IgG, IgA, IgD, IgE 및 IgM으로 구성된 군으로부터 선택된 면역글로불린에서 유래된 것인 지속형 글루카곤 결합체.
  18. 제17항에 있어서, 면역글로불린 Fc 단편이 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4로 구성된 군으로부터 선택되는 면역글로불린에서 유래된 것인 지속형 글루카곤 결합체.
  19. 제18항에 있어서, 면역글로불린 Fc 단편이 IgG4 Fc 단편인 것인 지속형 글루카곤 결합체.
  20. 제19항에 있어서, 면역글로불린 Fc 단편이 인간 비당쇄화 IgG4 Fc 단편인 것인 지속형 글루카곤 결합체.
  21. 제1항에 있어서, 하기 화학식 5로 표시되는 구조를 갖는 지속형 글루카곤 결합체:
    <화학식 5>
    R1-X-Y-Z-R2　
    상기 식에서, R1은 히스티딘(His), 데스-아미노-히스티딜, N-다이메틸-히스티딜, 베타-히드록시 이미다조프로필 및 4-이미다조아세틸로 구성된 군으로부터 선택되고;
    R2는 -NH2, -OH 및 -라이신(Lys)으로 구성된 군으로부터 선택되고;
    X는 SQGTFTSDYSKYLDSRRAQDFVQWLMNT이고;
    Y는 폴리에틸렌글리콜(PEG)이고;
    Z는 면역글로불린 Fc 단편임.
  22. 하기 단계를 포함하는 제1항에 따른 지속형 글루카곤 결합체의 제조방법:
    1) 글루카곤 또는 그의 유도체를 양 말단에 반응기를 갖는 비펩타이드 링커와 반응시키는 단계;
    2) 단계 1)의 반응 혼합물로부터 비펩타이드 링커의 한쪽 말단에 글루카곤 또는 그의 유도체가 공유적으로 연결된 복합체를 분리하는 단계;
    3) 단계 2)에서 분리된 복합체를 중합체 캐리어와 반응시키는 단계; 및
    4) 단계 3)의 반응 혼합물로부터 비펩타이드 링커의 한쪽 말단에는 글루카곤 또는 그의 유도체가, 다른 쪽 말단에는 중합체 캐리어가 공유적으로 연결된 지속형 글루카곤 결합체를 분리하는 단계.
  23. 제22항에 있어서, 단계 1)에서 글루카곤 또는 그의 유도체와 비펩타이드 링커의 반응이 1:5 내지 1:50의 반응 몰비로 pH 7.5 내지 10.0의 조건에서 수행되는 것인 제조방법.
  24. 제22항에 있어서, 단계 1)에서 글루카곤 또는 그의 유도체와 비펩타이드 링커의 반응이 환원제의 존재 하에서 수행되는 것인 제조방법.
  25. 제24항에 있어서, 환원제가 나트륨 시아노 보로하이드라이드(NaCNBH3), 수소화붕소나트륨, 다이메틸아민 붕산염 및 피리딘 붕산염으로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 제조방법.
  26. 제22항에 있어서, 단계 2)에서 분리된 복합체가 글루카곤 또는 그의 유도체의 N-말단 이외의 아미노산 잔기에 비펩타이드 링커의 한쪽 말단이 공유적으로 연결되어 글루카곤-비펩타이드 링커의 구조를 갖는 것인 제조방법.
  27. 제26항에 있어서, N-말단 이외의 아미노산 잔기가 글루카곤 또는 그의 유도체의 12번째 라이신 잔기인 것인 제조방법.
  28. 제22항에 있어서, 단계 3)에서 복합체와 중합체 캐리어의 반응이 1:2 내지 1:10의 반응 몰비로 pH 5.0 내지 8.0의 조건에서 수행되는 것인 제조방법.
  29. 제22항에 있어서, 단계 3)에서 복합체와 중합체 캐리어의 반응이 환원제의 존재 하에서 수행되는 것인 제조방법.
  30. 제29항에 있어서, 환원제가 나트륨 시아노 보로하이드라이드(NaCNBH3), 수소화붕소나트륨, 다이메틸아민 붕산염 및 피리딘 붕산염으로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 제조방법.
  31. 제22항에 있어서, 단계 4)에서 분리된 지속형 글루카곤 결합체가 글루카곤-비펩타이드 링커-중합체 캐리어의 구조를 갖는 것인 제조방법.
  32. 제22항에 있어서, 하기 단계를 포함하는 것인 제조방법:
    1) 천연형 글루카곤의 N-말단 알파 카본 및 알파 카본에 결합된 아민기가 제거된 글루카곤 유도체를 양 말단에 알데히드를 갖는 PEG와 pH 9.0에서 반응시키는 단계;
    2) 단계 1)의 반응 혼합물로부터 글루카곤 유도체의 12번째 라이신 잔기에 PEG의 한쪽 말단이 공유적으로 연결된 글루카곤-PEG 복합체를 분리하는 단계;
    3) 단계 2)에서 분리된 글루카곤-PEG 복합체를 면역글로불린 Fc 단편과 반응시키는 단계; 및
    4) 단계 3)의 반응 혼합물로부터 PEG의 한쪽 말단에는 글루카곤 유도체가, 다른 쪽 말단에는 면역글로불린 Fc 단편이 공유적으로 연결된 지속형 글루카곤 결합체를 분리하는 단계.
  33. 제1항에 따른 지속형 글루카곤 결합체를 유효성분으로 포함하고, 약학적으로 허용가능한 담체를 함유하는 비만의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  34. 제33항에 있어서, 항비만 약물을 추가로 포함하는 것인 약학적 조성물.
  35. 제34항에 있어서, 항비만 약물이 GLP-1 작용제, 렙틴(Leptin) 작용제, DPP-IV 저해제, Y5 수용체 길항제(antagonist), 멜라닌-농축 호르몬(melanin-concentrating hormone, MCH) 길항제, Y2/3 작용제, MC3/4 작용제, 위/췌장 리파아제(gastric/pancreatic lipase) 저해제, 5HT2c 작용제, β3A 작용제, 아밀린(amylin) 작용제, 그랠린(ghrelin) 길항제 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 약학적 조성물.
  36. 제35항에 있어서, GLP-1 작용제가 엑센딘-4, 엑센딘-4 유도체 또는 이들의 지속형 결합체인 것인 약학적 조성물.
  37. 제36항에 있어서, 엑센딘-4 유도체가 천연형 엑센딘-4의 N-말단 아민기가 제거된 유도체, 그의 N-말단 아민기가 히드록실기로 치환된 유도체, 그의 N-말단 아민기가 2개의 메틸기로 수식된 유도체 및 그의 N-말단 알파 카본 및 알파 카본에 결합된 아민기가 제거된 유도체로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 약학적 조성물.
  38. 제36항에 있어서, 지속형 엑센딘-4 결합체가 비펩타이드 링커를 통해 엑센딘-4 또는 그의 유도체와 면역글로불린 Fc 단편이 공유적으로 연결된 것인 약학적 조성물.
  39. 제38항에 있어서, 비펩타이드 링커가 폴리에틸렌글리콜(PEG)인 것인 약학적 조성물.
  40. 제39항에 있어서, 지속형 엑센딘-4 결합체가 PEG의 양 말단에 천연형 엑센딘-4의 N-말단 알파 카본 및 알파 카본에 결합된 아민기가 제거된 유도체와 면역글로불린 Fc 단편이 공유적으로 연결된 것인 약학적 조성물.
  41. 치료학적으로 유효한 양의 제1항에 따른 지속형 글루카곤 결합체를 이를 필요로 하는 대상에게 투여하는 단계를 포함하는, 대상에게서 비만을 예방 또는 치료하는 방법.
  42. 제41항에 있어서, 지속형 글루카곤 결합체와 함께 항비만 약물을 병용 투여하는 것인 방법.
  43. 제42항에 있어서, 항비만 약물이 GLP-1 작용제, 렙틴(Leptin) 작용제, DPP-IV 저해제, Y5 수용체 길항제(antagonist), 멜라닌-농축 호르몬(melanin-concentrating hormone, MCH) 길항제, Y2/3 작용제, MC3/4 작용제, 위/췌장 리파아제(gastric/pancreatic lipase) 저해제, 5HT2c 작용제, β3A 작용제, 아밀린(amylin) 작용제, 그랠린(ghrelin) 길항제 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상인 것인 방법.
  44. 제43항에 있어서, GLP-1 작용제가 엑센딘-4, 엑센딘-4 유도체 또는 이들의 지속형 결합체인 것인 방법.
  45. 제44항에 있어서, 엑센딘-4 유도체가 천연형 엑센딘-4의 N-말단 아민기가 제거된 유도체, 그의 N-말단 아민기가 히드록실기로 치환된 유도체, 그의 N-말단 아민기가 2개의 메틸기로 수식된 유도체 및 그의 N-말단 알파 카본 및 알파 카본에 결합된 아민기가 제거된 유도체로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  46. 제45항에 있어서, 지속형 엑센딘-4 결합체가 비펩타이드 링커를 통해 엑센딘-4 또는 그의 유도체와 면역글로불린 Fc 단편이 공유적으로 연결된 것인 방법.
  47. 제46항에 있어서, 비펩타이드 링커가 폴리에틸렌글리콜(PEG)인 것인 방법.
  48. 제47항에 있어서, 지속형 엑센딘-4 결합체가 PEG의 양 말단에 천연형 엑센딘-4의 N-말단 알파 카본 및 알파 카본에 결합된 아민기가 제거된 유도체와 면역글로불린 Fc 단편이 공유적으로 연결된 것인 방법.
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