DE19646108A1

DE19646108A1 - Vektor zur bakteriellen Expression rekombinanter Fusionstoxine

Info

Publication number: DE19646108A1
Application number: DE1996146108
Authority: DE
Original assignee: Barth Stefan Drrernat 50937 Koeln De
Current assignee: Barth Stefan Drrernat 50937 Koeln De
Priority date: 1996-11-08
Filing date: 1996-11-08
Publication date: 1998-05-14

Description

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Vektor zur bakteriellen Expression (E. coli) rekombinanter Fusionstoxine gemäß Oberbegriff des Patentanspruchs 1.

Auf der Suche nach alternativen Krebstherapien wurde für einen immuntherapeutischen Ansatz die bereits 1896 von Paul Ehrlich formulierte Vision von "Zauberkugeln (magic bullets)" aufgegriffen. Die heutigen Immuntoxine (ITs) werden durch chemische Kopplung eines pflanzlichen oder bakteriellen Toxins an einen tumorspezifischen Liganden hergestellt. Als Liganden werden monoklonale Antikörper oder Fab'-Fragmente verwendet. Die Entwicklung dieser Konstrukte begann vor etwa 15 Jahren mit dem Nachweis, daß ein IT gegen ein bestimmtes Oberflächenantigen einer spezifischen Tumorzelle diese selektiv zerstören kann. Seitdem wurde intensiv an der Entwicklung von ITs für den klinischen Einsatz gearbeitet.

Im Laufe der letzten zehn Jahre wurden zunehmend rekombinante Fusionstoxine konstruiert. Hierzu wird auf DNA-Ebene die codierende Region der unspezifischen Eindungsdomäne des eingesetzten zellulären Toxins durch Teile des Gens eines Antikörpers oder eines Cytokins ersetzt. Dabei können z. E. die variablen Regionen monoklonaler Antikörper nach PCR-Amplifikation über einen synthetischen Linker (Gly₄-Ser)₃ miteinander verbunden werden. Es entsteht ein einzel strängiges variables Fragment (scFv), das ähnliche Affinität aufweisen kann wie der parentale Antikörper. Nach Ligation mit der codierenden Region der katalytisch-aktiven Domäne eines Giftstoffes wird ein einzelsträngiges chimäres Fusions toxin exprimiert, das folgende Vorteile gegenüber chemisch gekoppelten ITs besitzt: 1. einfache großtechnische Her stellung, 2. Ermöglichung zielgerichteter Mutationen, 3. bessere Tumorpenetration aufgrund der geringen Molekülgröße.

Nachteilig an den hier zur Verfügung stehenden Vektorsystemen ist, daß diese nicht sauber induzierbar sind, d. h. auch ohne Inhibition der Repressorsysteme Fremdprotein produzieren, daß sie keine Möglichkeit des gerichteten Austauschs aller relevanten Sequenzabschnitte (Promotor, Aufreinigungs-Tag, Signalpeptid, Toxin) berücksichtigen und letztendlich keine direkte Klonierung von scFv-Genen aus bestehenden Bakterio phagensystemen ermöglichen.

Das der Erfindung zugrundeliegende technische Problem besteht darin, ein Vektorsystem zur Verfügung zu stellen, welches die oben beschriebenen Nachteile vermeidet.

Gelöst wird das der Erfindung zugrundeliegende technische Problem durch einen Vektor mit den Merkmalen des Patent anspruchs. Der erfindungsgemäße Vektor zur Expression re kombinanter Fusionstoxine ist aufgrund seiner Variations möglichkeiten vorteilhaft. Der Vektor eröffnet dadurch die Möglichkeit zur bakteriellen Expression beliebiger V-Gen fragmente in die MCS, die gleichzeitig kompatibel zu be kannten Bakteriophagensystemen ist, so daß zusätzlich eine direkte Klonierung der scFv daraus ermöglicht wird, und das gekoppelt ist an entsprechend dieser MCS modifizierten Toxine, welche die entsprechenden Restriktionsschnittstellen der MCS nicht tragen.

Vorzugsweise wird ein Konstrukt verwendet, wie es in der Figur dargestellt ist. Dieser Vektor ermöglicht die Pro duktion von rekombinanten Fusionstoxinen in Escherichia coli. Das Ausgangsplasmid für die Konstruktion des Vektors gemäß Fig. 1 war das pET27b der Firma Novagen (Madison, USA). Der beschriebene Vektor pEM1.1 ist ausgestattet mit mehreren singulären Restriktionsschnittstellen, die den Einbau variabler codierender Regionen ermöglichen.

1. Promoter (BgIII, XbaI), bspw. T7, lac, tac,
2. Signalpeptid (XbaI, NdeI), bspw. pelE, ompA, phoA,
3. Selektionsregion (NcoI, HindIII), bspw. Flag, His, Cal, Myc, E,
4. variable Ig-Regionen, (HindIII, EfrI und EcoRI, SacI),
5. scFv-Gene aus gängigen Bakteriophagensystemen (SfiI, NotI),
6. Toxine (SacI, CelII), bspw. ETA', Ricin, DT, EDN, Angiogenin.

Die in diesem Vektor verwendeten Toxine dürfen die singulären Schnittstellen der MCS nicht aufweisen. Das inserierte ETA' ist eine Deletionsmutante des Pseudomonas aeruginosa Exotoxin A, dem die ursprüngliche (unspezifische) Bindungsdomäne entfernt worden ist und dessen interne SfiI-Schnittstellen ebenfalls zerstört wurden.

Das hier beschriebene Vektorsystem besitzt eine MCS, die sich 1. dadurch auszeichnet, daß sie mit Restriktionsschnitt stellen versehen wird, die einerseits mit einer sehr geringen Wahrscheinlichkeit in den amplifizierten V-Genen und anderer seits nicht in der codierenden Region des Toxins vorhanden sind.

"sticky end" Restriktionsenzyme die <10% der untersuchten V-Gene schneiden*

Da die verwendete Deletionsmutante des Pseudomonas Exotoxin A (ETA') nicht von den Enzymen HindIII, EfrI, EcoRI und SacI geschnitten wird, wurden die Konsensussequenzen dieser Restriktionsenzyme für den Aufbau der MCS verwendet. Um die V-Genfragmente zu einem funktionellen scFv zusammensetzen zu können, wurde noch ein (Gly₄-Ser)₃-Linker zwischen EfrI und EcoRI eingefügt.

Als zweites Charakteristikum der MCS sind die Konsensus sequenzen der Enzyme SfiI und NotI eingefügt, die eine direkte Klonierung von scFv aus kommerziell verfügbaren Bakteriophagensystemen ermöglicht.

Das verfügbare ETA' ist überraschenderweise mit zwei SfiI-Schnittstellen bestückt, die eine direkte Klonierung der scFv aus bekannten Phagmiden unmöglich machen. Deswegen wurden diese Schnittstellen und zusätzlich eine XhoI-Schnittstelle durch Mutagenese in entsprechenden Wobble-Basen, ohne Aus wirkung auf die primäre Aminosäuresequenz verändert.

Sollten weiter zu verwendende Toxine ebenfalls interne Restriktionsschnittstellen aufweisen, wie sie in der MCS verwendet werden, kann letztere bezüglich der Tabelle variiert werden; sollte sich eine Konsensussequenz für SfiI oder NotI im Toxin befinden, so muß diese ebenfalls durch Punktmutationen entfernt werden.

Die Konstruktion des beschriebenen Vektors erfolgt nach an sich bekannten molekularbiologischen Verfahrensweisen.

Claims

Vektor zur Expression rekombinanter Fusionstoxine aus einem Toxin und einem Liganden, der für bestimmte Tumorzellen spezifisch ist, mit einer für einen Bereich eines Antikörpers und/oder Cytokins codierenden Region und einer für ein Toxin oder den katalytisch wirksamen Bereich eines Toxins codierenden Region, weiteren Abschnitten zum Nachweis und zur Charakterisierung der rekombinanten Proteine sowie singulären Schnittstellen für Restriktionsenzyme,
dadurch gekennzeichnet, daß
- - der Vektor eine multiple Klonierungsstelle (MCS-multiple cloning site) zur Insertion von variablen Antikörperregionen aufweist und mit einem Linker (Gly₄-Ser)₃ versehen ist,
- - zu bekannten Bakteriophagensystemen (pCANTAE, pHEN) direkt kompatibel ist, mit der Maßgabe, daß die singulären Restriktionsschnittstellen der MCS in der codierenden Region des entsprechenden modifizierten Toxins nicht vorkommen.