DE19646108A1 - Vektor zur bakteriellen Expression rekombinanter Fusionstoxine - Google Patents
Vektor zur bakteriellen Expression rekombinanter FusionstoxineInfo
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- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
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Description
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Vektor zur
bakteriellen Expression (E. coli) rekombinanter Fusionstoxine
gemäß Oberbegriff des Patentanspruchs 1.
Auf der Suche nach alternativen Krebstherapien wurde für
einen immuntherapeutischen Ansatz die bereits 1896 von Paul
Ehrlich formulierte Vision von "Zauberkugeln (magic bullets)"
aufgegriffen. Die heutigen Immuntoxine (ITs) werden durch
chemische Kopplung eines pflanzlichen oder bakteriellen
Toxins an einen tumorspezifischen Liganden hergestellt. Als
Liganden werden monoklonale Antikörper oder Fab'-Fragmente
verwendet. Die Entwicklung dieser Konstrukte begann vor etwa
15 Jahren mit dem Nachweis, daß ein IT gegen ein bestimmtes
Oberflächenantigen einer spezifischen Tumorzelle diese
selektiv zerstören kann. Seitdem wurde intensiv an der
Entwicklung von ITs für den klinischen Einsatz gearbeitet.
Im Laufe der letzten zehn Jahre wurden zunehmend rekombinante
Fusionstoxine konstruiert. Hierzu wird auf DNA-Ebene die
codierende Region der unspezifischen Eindungsdomäne des
eingesetzten zellulären Toxins durch Teile des Gens eines
Antikörpers oder eines Cytokins ersetzt. Dabei können z. E.
die variablen Regionen monoklonaler Antikörper nach
PCR-Amplifikation über einen synthetischen Linker (Gly4-Ser)3
miteinander verbunden werden. Es entsteht ein einzel
strängiges variables Fragment (scFv), das ähnliche Affinität
aufweisen kann wie der parentale Antikörper. Nach Ligation
mit der codierenden Region der katalytisch-aktiven Domäne
eines Giftstoffes wird ein einzelsträngiges chimäres Fusions
toxin exprimiert, das folgende Vorteile gegenüber chemisch
gekoppelten ITs besitzt: 1. einfache großtechnische Her
stellung, 2. Ermöglichung zielgerichteter Mutationen, 3.
bessere Tumorpenetration aufgrund der geringen Molekülgröße.
Nachteilig an den hier zur Verfügung stehenden Vektorsystemen
ist, daß diese nicht sauber induzierbar sind, d. h. auch ohne
Inhibition der Repressorsysteme Fremdprotein produzieren,
daß sie keine Möglichkeit des gerichteten Austauschs aller
relevanten Sequenzabschnitte (Promotor, Aufreinigungs-Tag,
Signalpeptid, Toxin) berücksichtigen und letztendlich keine
direkte Klonierung von scFv-Genen aus bestehenden Bakterio
phagensystemen ermöglichen.
Das der Erfindung zugrundeliegende technische Problem besteht
darin, ein Vektorsystem zur Verfügung zu stellen, welches
die oben beschriebenen Nachteile vermeidet.
Gelöst wird das der Erfindung zugrundeliegende technische
Problem durch einen Vektor mit den Merkmalen des Patent
anspruchs. Der erfindungsgemäße Vektor zur Expression re
kombinanter Fusionstoxine ist aufgrund seiner Variations
möglichkeiten vorteilhaft. Der Vektor eröffnet dadurch die
Möglichkeit zur bakteriellen Expression beliebiger V-Gen
fragmente in die MCS, die gleichzeitig kompatibel zu be
kannten Bakteriophagensystemen ist, so daß zusätzlich eine
direkte Klonierung der scFv daraus ermöglicht wird, und das
gekoppelt ist an entsprechend dieser MCS modifizierten
Toxine, welche die entsprechenden Restriktionsschnittstellen
der MCS nicht tragen.
Vorzugsweise wird ein Konstrukt verwendet, wie es in der
Figur dargestellt ist. Dieser Vektor ermöglicht die Pro
duktion von rekombinanten Fusionstoxinen in Escherichia coli.
Das Ausgangsplasmid für die Konstruktion des Vektors gemäß
Fig. 1 war das pET27b der Firma Novagen (Madison, USA). Der
beschriebene Vektor pEM1.1 ist ausgestattet mit mehreren
singulären Restriktionsschnittstellen, die den Einbau
variabler codierender Regionen ermöglichen.
- 1. Promoter (BgIII, XbaI), bspw. T7, lac, tac,
- 2. Signalpeptid (XbaI, NdeI), bspw. pelE, ompA, phoA,
- 3. Selektionsregion (NcoI, HindIII), bspw. Flag, His, Cal, Myc, E,
- 4. variable Ig-Regionen, (HindIII, EfrI und EcoRI, SacI),
- 5. scFv-Gene aus gängigen Bakteriophagensystemen (SfiI, NotI),
- 6. Toxine (SacI, CelII), bspw. ETA', Ricin, DT, EDN, Angiogenin.
Die in diesem Vektor verwendeten Toxine dürfen die singulären
Schnittstellen der MCS nicht aufweisen. Das inserierte ETA'
ist eine Deletionsmutante des Pseudomonas aeruginosa Exotoxin
A, dem die ursprüngliche (unspezifische) Bindungsdomäne
entfernt worden ist und dessen interne SfiI-Schnittstellen
ebenfalls zerstört wurden.
Das hier beschriebene Vektorsystem besitzt eine MCS, die sich
1. dadurch auszeichnet, daß sie mit Restriktionsschnitt
stellen versehen wird, die einerseits mit einer sehr geringen
Wahrscheinlichkeit in den amplifizierten V-Genen und anderer
seits nicht in der codierenden Region des Toxins vorhanden
sind.
"sticky end" Restriktionsenzyme die <10% der
untersuchten V-Gene schneiden*
"sticky end" Restriktionsenzyme die <10% der
untersuchten V-Gene schneiden*
Da die verwendete Deletionsmutante des Pseudomonas Exotoxin
A (ETA') nicht von den Enzymen HindIII, EfrI, EcoRI und SacI
geschnitten wird, wurden die Konsensussequenzen dieser
Restriktionsenzyme für den Aufbau der MCS verwendet. Um die
V-Genfragmente zu einem funktionellen scFv zusammensetzen
zu können, wurde noch ein (Gly4-Ser)3-Linker zwischen EfrI
und EcoRI eingefügt.
Als zweites Charakteristikum der MCS sind die Konsensus
sequenzen der Enzyme SfiI und NotI eingefügt, die eine
direkte Klonierung von scFv aus kommerziell verfügbaren
Bakteriophagensystemen ermöglicht.
Das verfügbare ETA' ist überraschenderweise mit zwei
SfiI-Schnittstellen bestückt, die eine direkte Klonierung der scFv
aus bekannten Phagmiden unmöglich machen. Deswegen wurden
diese Schnittstellen und zusätzlich eine XhoI-Schnittstelle
durch Mutagenese in entsprechenden Wobble-Basen, ohne Aus
wirkung auf die primäre Aminosäuresequenz verändert.
Sollten weiter zu verwendende Toxine ebenfalls interne
Restriktionsschnittstellen aufweisen, wie sie in der MCS
verwendet werden, kann letztere bezüglich der Tabelle
variiert werden; sollte sich eine Konsensussequenz für SfiI
oder NotI im Toxin befinden, so muß diese ebenfalls durch
Punktmutationen entfernt werden.
Die Konstruktion des beschriebenen Vektors erfolgt nach an
sich bekannten molekularbiologischen Verfahrensweisen.
Claims (1)
- Vektor zur Expression rekombinanter Fusionstoxine aus einem Toxin und einem Liganden, der für bestimmte Tumorzellen spezifisch ist, mit einer für einen Bereich eines Antikörpers und/oder Cytokins codierenden Region und einer für ein Toxin oder den katalytisch wirksamen Bereich eines Toxins codierenden Region, weiteren Abschnitten zum Nachweis und zur Charakterisierung der rekombinanten Proteine sowie singulären Schnittstellen für Restriktionsenzyme,
dadurch gekennzeichnet, daß- - der Vektor eine multiple Klonierungsstelle (MCS-multiple cloning site) zur Insertion von variablen Antikörperregionen aufweist und mit einem Linker (Gly4-Ser)3 versehen ist,
- - zu bekannten Bakteriophagensystemen (pCANTAE, pHEN) direkt kompatibel ist, mit der Maßgabe, daß die singulären Restriktionsschnittstellen der MCS in der codierenden Region des entsprechenden modifizierten Toxins nicht vorkommen.
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
DE1996146108 DE19646108A1 (de) | 1996-11-08 | 1996-11-08 | Vektor zur bakteriellen Expression rekombinanter Fusionstoxine |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
DE1996146108 DE19646108A1 (de) | 1996-11-08 | 1996-11-08 | Vektor zur bakteriellen Expression rekombinanter Fusionstoxine |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
DE19646108A1 true DE19646108A1 (de) | 1998-05-14 |
Family
ID=7811047
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
DE1996146108 Ceased DE19646108A1 (de) | 1996-11-08 | 1996-11-08 | Vektor zur bakteriellen Expression rekombinanter Fusionstoxine |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
DE (1) | DE19646108A1 (de) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN100457910C (zh) * | 2002-12-19 | 2009-02-04 | 中国人民解放军第二军医大学 | 新型噬菌粒展示载体pCANTAB5L |
Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US5571507A (en) * | 1992-02-25 | 1996-11-05 | Seragen, Inc. | Methods of treating diabetes |
-
1996
- 1996-11-08 DE DE1996146108 patent/DE19646108A1/de not_active Ceased
Patent Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US5571507A (en) * | 1992-02-25 | 1996-11-05 | Seragen, Inc. | Methods of treating diabetes |
Non-Patent Citations (3)
Title |
---|
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RIMM, D.L., POLLARD, T.D.: Gene 75(1989) 323-327 * |
SCHOEPFER, R.: Gene 124(1993) 83-85 * |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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CN100457910C (zh) * | 2002-12-19 | 2009-02-04 | 中国人民解放军第二军医大学 | 新型噬菌粒展示载体pCANTAB5L |
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