JPH09504432A - Ｍｈｃタンパク質の原核発現 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、グリコシル化されていない、原核的に発現されたＭＨＣポリペプチド、これらのポリペプチドを製造する方法、および単離されたＭＨＣ成分と、前記ＭＨＣ成分の抗原結合部位と連合した抗原性ペプチドとから本質的に成る複合体に関する。これらの複合体は、有害な免疫応答、例えば、自己免疫性の治療において有用である。

Description

【発明の詳細な説明】 ＭＨＣタンパク質の原核発現 本願は１９９３年１０月２５日提出の米国特許出願第０８／１４３，５７５号 の一部継続出願である。この全体の出願は、引用することによって本明細書の一 部とされる。 発明の背景 本発明は、例えば、自己免疫疾患、アレルギー応答、移植拒絶反応、および他 の免疫学的疾患の治療におけるＴ細胞の機能の変調のための組成物の製造法に関 する。特に、本発明は、主要な組織適合性複合体（ＭＨＣ）クラスＩおよびクラ スＩＩのタンパク質をコードするヌクレオチド配列で形質転換された原核生物に おいて、前記タンパク質を生産することに関する。ＭＨＣタンパク質は、Ｔ細胞 を標的とする複合体の製造のために有用である。複合体は、特定の疾患に関連す る抗原の断片を表すＭＨＣタンパク質およびペプチドを含んでなる。これらを複 合体は、診断の目的で放射性同位元素または他の標識に接合するか、または複合 体を治療上有用とするトキシンまたは他の物質に接合することができる。 不必要なＴ細胞の活性化を包含する多数の病理学的応答は知られている。例え ば、多数のアレルギー性疾患は特定のＭＨＣ対立遺伝子に関連するか、または自 己免疫成分を有することが疑われる。 他の有害なＴ細胞伝達応答は、同種異系宿主からの移植片として体の中に故意 に導入された外来細胞の破壊を包含する。このプロセスは、「異系移植片拒絶反 応」として知られており、宿主Ｔ細胞と外来ＭＨＣ分子との相互作用を包含する 。非常にしばしば、広い範 囲のＭＨＣ対立遺伝子は異系移植片に対する宿主の応答に関係する。 自己免疫疾患は有害な免疫応答の特定のクラスである。自己免疫疾患において 、自己耐性は喪失し、そして免疫系は「自己」組織をあたかもそれが外来標的で あるかのように攻撃する。３０より多い自己免疫疾患が現在知られている；これ らは多くの公衆の注目を受けている多数を包含し、重症筋無力症（ＭＧ）および 多発硬化症（ＭＳ）を包含する。 自己免疫疾患におけるＭＨＣクラスＩＩタンパク質の関与は動物モデルにおい て示された。ＭＨＣクラスＩＩタンパク質それら自体に対する抗体またはＭＨＣ クラスＩＩ抗原の発現を誘導する因子に対する抗体の投与は、これらをモデルの 系における自己免疫の症状の発生を妨害する。ヘルパーＴ細胞の役割は、また、 これらのモデルにおいて抗ＣＤ４モノクローナル抗体を使用して自己免疫系を中 和することによって証明された；ＣＤ４は特徴的なヘルパーＴ細胞のレセプター である（Ｓｈｉｚｕｒｕ、Ｊ．Ａ．ｅｔ ａｌ．、Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８８） ２４０；６５９−６６２）。 最近の実験は、ある種の環境下に、アネルギーまたは非応答性は自己反応性リ ンパ球において誘導することができることを示した（参照、Ｓｃｗａｒｔｚ、Ｃ ｅｌｌ（１９８９）１０７３−１０８１）。ｉｎ ｖｉｔｒｏ実験は、共刺激シ グナルの不存在においてＭＨＣクラスＩＩ分子による抗原提示が同系Ｔ細胞にお ける増殖非応答性の状態を誘導することを示唆する（Ｑｕｉｌｌ ｅｔ ａｌ． 、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９８７）１３８：３７０４−３７１２）。Ｓｈａｒ ｍａ ｅｔ ａｌ．（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９９ １）８８：１１４６５−１１４６９）が記載するように、アネルギーはｉｎ ｖ ｉｖｏで誘導することがで き、そして自己免疫疾患はこの方法において有効に治療することができる。 従って、ＭＨＣポリペプチドはいくつかの製薬上の用途を有する。しかしなが ら、これらを種類の治療の可能性を実現するために、豊富なＭＨＣポリペプチド 源が必要である。ＭＨＣポリペプチドは哺乳動物細胞の中で発現されてきている 。例えば、可溶性形態のマウスＩ−Ｅｋタンパク質はＣＨＯ細胞の中で発現され てきている（Ｗｅｔｔｓｔｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７ ４：２１９−２２８（１９９１））。しかしながら、哺乳動物系からの発現レベ ルは、商業的規模でＭＨＣポリペプチドを経済的に生産するためには不十分であ る。そのうえ、哺乳動物細胞はＭＨＣペプチドの結合ポケットに内因性ペプチド を負荷し、ＭＨＣからのペプチドの除去を必要とする。従って、先行技術は大量 の治療的に活性なＭＨＣポリペプチドを低い費用で生産する方法を欠如する。本 発明はこれらおよび他の要求を取り扱う。 発明の要約 本発明は、組換えＭＨＣポリペプチドが抗原性ペプチドに結合する、変更され たグリコシル化を有する組換えＭＨＣポリペプチドを含んでなる組成物を提供す る。トランスメンブレンドメインは、開示する組換え構築物のあるものから欠如 されている。ＭＨＣポリペプチドの組成物は、原核宿主細胞、例えば、大腸菌（ Ｅ．ｃｏｌｉ）において、ＭＨＣポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を 含有する発現ベクターを利用して発現される。α−およびβ−鎖を含む、ＭＨＣ クラスＩＩ組換えポリペプチドを開示する。多数の組換えＭＨＣポリペプチドを 必要に応じて連合して活性ＭＨＣ組成物を形成する。 本発明の方法は、工程：（ａ）ＭＨＣポリペプチドをコードするヌクレオチド 配列を含んでなる発現ベクターを含有する原核細胞を、前記ポリペプチドが発現 されるような条件下に、培養において増殖させ、そして（ｂ）前記ＭＨＣポリペ プチドを抽出および単離する、を含んでなるＭＨＣポリペプチドを生産する方法 を包含する。この方法は、単一の原核細胞の中で２つのＭＨＣポリペプチドを発 現し、ここでポリペプチドはヘテロダイマーを形成する。この方法による生産さ れる組成物は、また、本発明の主題である。 本発明は、さらに、原核プロモーター配列に作用可能に連鎖されたＭＨＣポリ ペプチドをコードするヌクレオチド配列を含んでなる原核発現ベクターを提供す る。ＭＨＣポリペプチド配列に作用可能に連鎖されたシグナル配列は必要に応じ てベクターの中に含まれる。ＭＨＣポリペプチドのヌクレオチド配列は切形ＭＨ Ｃポリペプチド、またはトランスメンブレンドメインを欠如するＭＨＣポリペプ チド、ならびに全長のＭＨＣポリペプチドおよび前記全長のＭＨＣポリペプチド から誘導された以外構築物をコードすることができる。このベクターを使用して 原核細胞、例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）を形質転換することができる。 本発明は、さらに、抗原性ペプチドと、変更されたグリコシル化および抗原結 合部位を有する単離された組換えＭＨＣ成分とから本質的に成り、抗原性ペプチ ドが抗原結合部位と連合されている、実質的に純粋なＭＨＣ−ペプチド複合体を 提供する。このペプチドは典型的には約８〜約３０アミノ酸であるが、これより 短いか、または長いことができる。このペプチドは抗原結合部位と非共有結合で 連合することができる。本発明は、自己抗原性であり、これにより自己免疫疾患 に関係づけられるペプチドを包含する。このペプチド上のエピトープは、例えば 、多発硬化症、慢性関節リウマチ、また は重症筋無力症に関係づけられる自己反応性Ｔ細胞により、認識されることがで きる。適当なペプチドは、ヒトＡＣｈＲαサブユニットの残基１３８−１６７、 ヒトＭＢＰの残基８４−１０２、またはヒトＭＢＰの残基１４８−１６２を含ん でなるペプチドを包含する。 また、製薬上許容される担体と、組換えＭＨＣペプチド複合体チド複合体とを 含んでなる医薬組成物が提供される。医薬組成物の１例は、ＭＨＣ−ペプチド複 合体がリポソームの中に埋め込まれた組成物を包含する。定義 「ＭＨＣポリペプチドをコードするヌクレオチド配列」は、細胞の中に存在す るとき、ＭＨＣポリペプチドを発現する下位配列または全長のポリヌクレオチド 配列である。組換え構築物の発現において、挿入されたポリヌクレオチド配列は 同一である必要はなく、そしてそれを誘導した遺伝子の配列と「実質的に同一」 であることができることを当業者は認識するであろう。以後説明するように、こ れらの変異型はこの用語に特別にカバーされる。 挿入されたポリヌクレオチド配列が転写されそして翻訳されて機能的ポリペプ チドを生成する場合、コドンの縮重のために、多数のポリヌクレオチド配列が同 一ポリペプチドをコードするであろうことを当業者は認識するであろう。さらに 、本発明のポリヌクレオチドに対する言及は、特別に、ＭＨＣ遺伝子配列と実質 的に同一であり（後述するように決定して）そしてＭＨＣポリペプチドの機能を 保持するタンパク質をコードする全長の配列を包含する。従って、本明細書にお いて記載するＭＨＣの単一のサブユニットをコードする配列の場合において、こ の用語は、本明細書において記載する配列と実質的に同一であり、そして抗原性 ペプチドに結合しかつＴ細 胞レセプターに結合することができるペプチドをコードする、変異型ポリヌクレ オチド配列を包含する。本発明のポリペプチドは、全長のＭＨＣサブユニット、 またはそれらの断片から成ることができる。 ２つの配列の中の、それぞれ、ヌクレオチド配列またはアミノ酸残基が、後述 するように最大の対応関係について整列させるとき、同一である場合、２つの核 酸配列またはポリペプチドは「同一」であるという。用語「に対して相補的」は 、本明細書おいて使用するとき、相補的配列が参照ポリヌクレオチド配列のすべ てまたは一部分に対して同一であることを意味する。 ２つ（またはそれ以上の）ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの間の配列の 比較は、典型的には、「比較ウィンドウ」にわたって２つの配列の配列を比較し て、配列の類似性の局所的領域を同定しかつ比較することによって実施される。 「比較ウィンドウ」は、本明細書おいて使用するとき、少なくとも約２０の隣接 位置、通常約５０〜約２００、より通常約１００〜約１５０のセグメントを意味 し、ここで２つの配列を最適に整列させた後、ある配列を同一数の隣接位置の参 照配列と比較することができる。 比較のための配列の最適な整列は、ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎ、Ａｄ ｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２（１９８１）の局所的相同性アルゴリズム 、ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｃｓｈ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４ ３（１９７０）の相同性整列アルゴリズム、ＰｅａｒｓｏｎおよびＬｉｐｍａｎ 、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）８５：２４４４（１９８ ８）の類似性の方法についてのサーチ、およびこれらのアルゴリズムのコンピュ ーター化実行により、実施することができる。典型的には、最高の百分率の同一 性を提供するプログラムを使用する。 「配列同一性の百分率」は、比較ウィンドウにわたって２つの最適に整列され た配列を比較することによって決定され、ここで比較ウィンドウにおけるポリヌ クレオチド配列の部分は、２つの配列の最適な整列のために、参照配列（付加ま たは欠失を含まない）に比較して、付加または欠失（すなわち、ギャップ）を含 むことができる。この百分率は、双方の配列の中に同一の核酸塩基またはアミノ 酸残基が存在する位置の数を決定して合致した位置の数を生成し、合致した位置 の数を比較ウィンドウの中の位置の合計の数で割り、そして１００を掛けて配列 の同一性の百分率を得ることによって、計算される。 ポリヌクレオチド配列の用語「実質的な同一性」は、標準のパラメーターを使 用する前述のプログラムにより、参照配列と比較して、少なくとも７０％、好ま しくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少 なくとも９５％の配列の同一性を含んでなるポリヌクレオチドを意味する。コド ンの縮重、アミノ酸の類似性、リーディングフレームの位置などを考慮すること によって、これらの値を適当に調節して２つのヌクレオチド配列によりコードさ れるタンパク質の対応する同一性を決定できることを当業者は認識するであろう 。これらの目的に対するアミノ酸配列の実質的な同一性は、通常、少なくとも７ ０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、最も好 ましくは少なくとも９５％の配列の同一性を意味する。 ヌクレオチド配列が実質的に同一であるという他の指示は、２つの分子がスト リンジェント条件下に互いにハイブリダイゼーションする場合である。ストリン ジェント条件は配列に依存し、そして異なる環境において異なるであろう。一般 に、ストリンジェント条件は、規定したイオン強度およびｐＨにおいて特定の配 列の熱的融点 （Ｔｍ）より約５℃低いように選択される。Ｔｍは標的配列の５０％が完全に合 致したプローブにハイブリダイゼーションする温度である（規定したイオン強度 およびｐＨにおける）。典型的には、ストリンジェント条件は、塩濃度がｐＨ７ において少なくとも約０．０２モルであり、そして温度が少なくとも約６０℃で ある条件である。 タンパク質配列が実質的に同一であるという他の指示は、１つのタンパク質が 他のタンパク質に対して発生させた抗体と免疫学的に反応性である場合である。 従って、本発明のタンパク質はＭＨＣポリペプチド対して発生させた抗体と免疫 学的に反応性であるタンパク質を包含する。 本明細書おいて使用するとき、用語「単離された」、「実質的に純粋な」およ び「実質的に均質な」は、天然にタンパク質をともなう成分から分離されたタン パク質を記載するために使用する。典型的には、モノマーのタンパク質は、試料 の少なくとも約６０〜７５％が単一のポリペプチドの主鎖を示すとき、実質的に 純粋である。少量の変異型または化学的修飾物は、典型的には同一のポリペプチ ド配列を共有する。実質的に精製されたタンパク質は、典型的には、質量または 分子数により、約８５〜９０％以上、より通常約９５％以上、そして好ましくは 約９９％以上の純度を含んでなるであろう。タンパク質の純度または均質性は、 この分野においてよく知られている多数の手段、例えば、タンパク質試料のポリ アクリルアミドゲル電気泳動、および引き続く染色時のポリアクリルアミドゲル 上の単一のポリペプチドのバンドにより、示すことができる。ある種の目的で、 高い分解能が必要であり、そしてＨＰＬＣまたは同様な手段が精製のために利用 されるであろう。 用語「ＭＨＣポリペプチド」は、本明細書おいて使用するとき、 その天然の状態以外である、例えば、通常ＭＨＣを発現する細胞の細胞膜と連合 していない、ＭＨＣ複合体（すなわち、１または２以上の抗原結合部位および適 当なＴ細胞レセプターによる認識のために必要な配列を含んでなるタンパク質） の有効な部分のすべてまたは一部分を構成することができる一本鎖ＭＨＣタンパ ク質（例えば、クラスＩＩ分子のαまたはβ鎖またはクラスＩ分子の重鎖）をい う。 用語「変更されたグリコシル化」は、ＭＨＣポリペプチドがグリコシル化され ていないか、または天然のポリペプチド上に見出されるものと異なるグリコシル 化パターンを有する、ＭＨＣポリペプチドのグリコシル化をいう。この出願にお ける変更されたグリコシル化はｉｎ ｖｉｖｏプロセスを通して達成されるグリ コシル化を意味するが、ｉｎ ｖｉｔｒｏプロセス、例えば、脱グリコシル化分 子を生成するために酵素または化学物質でＭＨＣポリペプチドを処理することを 意味しない。 「グリコシル化されていない組換えＭＨＣポリペプチド」は、実質的にすべて の天然に存在するグリコシル化を欠如するＭＨＣクラスＩまたはクラスＩＩのポ リペプチドである。典型的には、本発明のポリペプチドは、ＭＨＣポリペプチド をヒト細胞の中で生産したとき、約１０％より少ないグリコシル化を有するであ ろう。より好ましくは、リンタンパク質は約５％より少ない、最も好ましくは約 １より少ない、ヒト細胞において生産されたＭＨＣポリペプチドに結合した炭水 化物を有するであろう。 本発明のグリコシル化されていない組換えＭＨＣポリペプチドは、典型的には 、ＭＨＣポリペプチドをコードするヌクレオチド配列で形質転換された原核宿主 細胞により生産される。一般に、組換えＤＮＡ技術を使用して、遺伝子の発現を 制御するシグナルに、ＭＨ Ｃをコードするすべきでなくを連鎖する。原核宿主細胞の中で生産される結果、 真核細胞からのＭＨＣポリペプチド上に通常見出される炭水化物部分をＭＨＣポ リペプチドは欠如する。 図面の簡単な説明 第１図は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の中で発現された組換えＤＲ２鎖に結合す るペプチドの速度論を示す。 第２図は、組換えＤＲ２−ペプチド複合体の安定性を示す。 第３図は、精製された組換えＤＲ２ポリペプチド鎖へのＭＢＰタンパク質の最 大の結合のための最適ｐＨを示す。 第４図は、本発明の複合体と接触したＴ細胞におけるγＩＦＮの生産を示す。 第５図は、本発明の複合体と接触したＴ細胞におけるγＩＦＮの生産を示す。 第６図は、動物モデルにおける本発明の複合体の多発硬化症に対する効能を示 す。 好ましい態様の説明 本発明は、Ｔ細胞機能の調節に有用な複合体を形成するために使用できる組換 えＭＨＣポリペプチド、およびＭＨＣポリペプチドを生産する方法を提供する。 複合体は、抗原性ペプチドと複合化したＭＨＣポリペプチドから成り、有害なＴ 細胞伝達免疫応答、例えば、アレルギー応答、および自己免疫疾患、を抑制する ために使用できる。さらに、複合体は免疫応答を促進するために使用することが でき、そしてワクチンとして使用することができる。 本発明は、また、商業的に変動する規模でＭＨＣタンパク質を生産する方法を 提供する。本発明により提供される他の利点は、種々 の所望の用途ために有用である修飾されたＭＨＣポリペプチドを生産する容易に 適合可能な手段を本発明提供するということである。例えば、免疫応答を促進す るための複合体またはワクチンを使用するとき、ＭＨＣポリペプチドを修飾して 、Ｔ細胞の活性化の原因となる共刺激シグナルに関係するリガンドを有する競合 抗原提示細胞への結合を可能とすることが望ましい。また、Ｔ細胞の増殖が誘導 されるように、単離された共刺激リガンドにＭＨＣ複合体を連鎖することができ る。従って、Ｔ細胞は複合体により提示された抗原性ペプチドに対して応答し、 そして免疫応答は開始されるであろう。 本発明のグリコシル化されていないＭＨＣポリペプチドは、原核細胞、例えば 、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の中で生産される。本発明の原核細胞により生産され たＭＨＣポリペプチドは、グリコシル化された、天然のＭＨＣポリペプチドのそ れに類似する効率で抗原性ペプチドに結合する。 本発明によれば、所望のＭＨＣポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を 単離し、そして適当な原核宿主細胞の中に形質転換し、次いでこれらをＭＨＣポ リペプチドの発現を生ずる条件下に培養において増殖させる。次いで、ＭＨＣポ リペプチドを細胞または培養上澄みから単離し、そして適当な抗原性ペプチドと 連合させて本発明の複合体を形成する。医薬組成物を調製し、そして標準的技術 に従い投与する。このアプローチの一般的記述については、米国特許第５，１３ ０，２９７号および米国特許第５，１９４，４２５号を参照のこと。ＭＨＣポリペプチド ＭＨＣによりコードされるタンパク質はヒト系およびネズミ系の双方において 広範に研究されてきている。一般に、それらのタンパク質は下記のように分類さ れてきている：クラスＩタンパク質、こ れらはすべての細胞表面上に見出され、そして主として細胞障害性Ｔ細胞により 認識される；およびクラスＩＩタンパク質、これらはいくつかの細胞表面上に見 出され、アクセサリー細胞、例えば、マクロファージを包含し、そしてヘルパー Ｔ細胞に対する抗原の提示に関係する。組織適合性タンパク質のあるものは単離 され、そして特徴づけられてきている。ＭＨＣタンパク質の構造および機能の一 般的概観については、下記の文献を参照のこと：Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｉｍ ｍｕｎｏｌｏｇｙ、第２版、Ｗ．Ｅ．Ｐａｕｌ、編、Ｒａｖｅｎｓ Ｐｒｅｓｓ Ｎ．Ｙ．１９８９。 いくつかの型のＭＨＣ複合体が研究されてきている。ネズミＩ−ＡおよびＩ− Ｅ（クラスＩＩ）サブ領域によりコードされるＭＨＣ複合体は、２つの非共有結 合で連合されたペプチド鎖から成ることが示された：３２−３８ｋｄのアルファ 鎖および２６−２９ｋｄのベータ鎖。第３の不変の３１ｋｄのペプチドは細胞の 中でこれらの２つのペプチドと非共有結合で連合され、そして一般に解離して抗 原性ペプチドの負荷を可能とする。不変鎖の表面の発現は、ＭＨＣクラスＩＩ鎖 がペプチドに結合しそしてそれを提示する能力を阻害する。Ｉ−Ａ領域の７つの 対立遺伝子の変異型のアルファ鎖およびベータ鎖はクローニングされそして配列 決定された（Ｅａｔｅｅｓ ｅｔ ａｌ．、¨Ｔ ｃｅｌｌ Ｃｌｏｎｅｓ¨ｉ ｎ Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｅ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉ ｏｎ，Ｆｅｌｄｍａｎ ｅｔ ａｌ．、編（Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ １９８ ５）ｐｐ．３−１９。ネズミＩ−Ａ（クラスＩＩ）組織適合性タンパク質を精製 する方法は、Ｔｕｒｅｋｅｗｉｔｚ、Ａ．Ｐ．ｅｔ ａｌ．、Ｍｏｌｅｃｕｌａ ｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（１９８３）２０：１１３９−１１４７、に開示され た。これらの方法は、また、クラスＩ分子に適当であり、非イオン性洗浄剤、例 えば、ＮＰ−４０、ツイーン８０などを使用して、所望のＭＨＣ分子を含有する 細胞から可溶性膜抽出物を製造することを包含する。次いで、ＭＨＣ分子をアフ ィニティークロマトグラフィーにより、所望のＭＨＣ分子対して発生させた抗体 を含有するカラムを使用して精製する。溶離緩衝液の中の０．０２％のツイーン ８０の使用は、精製された分子の凝集を排除するために有効である。 また、ヒトクラスＩタンパク質が研究された。染色体６上のヒト（ＨＬＡ）の ＭＨＣは３つの遺伝子、ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、およびＨＬＡ−Ｃを有し、こ れらの２つは同種異系抗原をコードする多数の対立遺伝子を有する。これらは４ ４ｋｄのサブユニットおよびすべての抗原性特異性に対して共通の１２ｋｄのベ ータ２−マイクログロブリンサブユニットから成ることが発見された。これらの 洗浄剤可溶性ＨＬＡ抗原の単離は、下記の文献に記載された：Ｓｐｒｉｎｇｅｒ 、Ｔ．Ａ．、ｅｔ ａｌ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ ）（１９７６）７３：２４８１−２４８５；Ｃｌｅｍｎｔｓｏｎ、Ｋ．Ｊ．、ｅ ｔ ａｌ．、ｉｎ¨Ｍｅｍｂｒｅａｎｅ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ¨Ａｚｚｉ、Ａ．、 編；Ｂｊｏｒｋｍａｎ、Ｐ．、Ｐｈ．Ｄ．Ｔｈｅｓｉｓ Ｈａｒｖａｒｄ（１９ ８４）。 他の研究はＨＬＡ−Ａ２、クラスＩヒト抗原、の３−Ｄ構造の詳細な描写を生 じた。（Ｂｊｏｒｋｍａｎ、Ｐ．Ｊ．、ｅｔ ａｌ．、Ｎａｔｕｒｅ（１９８７ ）３２９：５０６−５１２、５１２−５１８。この描写において、β２−マイク ログロブリンタンパク質および重鎖の、アルファ3セグメントは連合している； 重鎖のアルファ1およびアルファ2領域は、ペプチドが結合する抗原結合部位を形 成するように思われる（Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８７）２３８：６１３−６１４、 Ｂｊｏｒｋｍａｎ、Ｐ．Ｊ．ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕ ｒｅ（前掲）。可溶性ＨＬＡ−Ａ２は、下記の文献に記載されているように、均 質性ヒトリンパ芽球細胞系Ｊ−Ｙからの原形質膜のパパイン消化により精製する ことができる：Ｔｕｎｅｒ、Ｍ．Ｊ．ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ． （１９７７）２５２：７５５５−７５６７。パパインはトランスメンブレン領域 に近接して４４ｋｄの鎖切断して、アルファ1、アルファ2、アルファ3、および β２マイクログロブリンから構成された分子を生ずる。 ヒトクラスＩＩＭＨＣ抗原の３次元構造は、また、決定され、そしてクラスＩ 分子のそれに類似する。抗原性ペプチドは解放末端の抗原結合みぞの中に結合さ れている。結合みぞは膜２層から延びる２つのクラスＩＩ鎖のＮ−末端部分から 形成される（Ｂｒｏｗｎ、ｅｔ ａｌ．、Ｎａｔｕｒｅ ３６４：３３−３９（ １９９３））。クラスＩＩ遺伝子のクローニング（Ｅｓｔｅｅｓ、前掲、に記載 されているように）は、後述するように、例えば、クラスＩＩＭＨＣの操作を可 能とする。ＭＨＣ遺伝子のクローニング クラスＩＩタンパク質の各々のアミノ酸配列は知られており、そして遺伝子ま たはｃＤＮＡはクローニングされてきている。従って、これらの核酸を使用して 、本明細書おいて記載するように、本発明に従い原核宿主細胞の中でＭＨＣポリ ペプチドを発現することができる。 所望のＭＨＣの遺伝子またはｃＤＮＡが入手可能でない場合、当業者に知られ ているクローニング法を使用して遺伝子を単離することができる。使用できる１ つのこのような方法は所望のＭＨＣポリペプチドを精製し、部分的アミノ酸配列 を獲得し、このアミノ酸配列に基づいてヌクレオチドのプローブを合成し、そし てこのプローブを使用して、ｃＤＮＡまたはゲノムライブラリーから所望の遺伝 子を収容するクローンを同定することである。 ＭＨＣポリペプチドはリンパ球から単離し、そして所望のペプチド抗原に結合 するそれらの能力についてスクリーニングすることができる。リンパ球は複合体 で処置される個体の種からのものである。例えば、リンパ球は標的とする自己免 疫疾患に悩まされる個体からのヒトＢ細胞から単離することができる。Ｂ細胞を 、まず、この分野において知られている技術を利用して、複製欠乏エプスタイン −バー−ウイルスで形質転換することによって免疫化することができる。 ＭＨＣポリペプチドは、パパインを使用する処理、３ＭのＫＣｌを使用する処 理、および洗浄剤を使用する処理による可溶化を包含する種々の技術により、多 数の細胞から単離された。好ましい方法において、リンパ球からのクラスＩＩタ ンパク質の洗浄剤による抽出、および引き続くアフィニティー精製を使用する。 次いで、洗浄剤を選択した方法、例えば、透析、により除去することができる。 ＭＨＣポリペプチドを精製する方法は、また、前節において論じられている。 酵素の単離後、部分的アミノ酸配列を決定し、そして所望の遺伝子にハイブリ ダイゼーションするように設計された、縮重オリゴヌクレオチドプローブを合成 する。例えば、下記の文献に記載されているような標準的技術に従い、アミノ酸 配列決定を実施し、そしてオリゴヌクレオチドプローブを合成する：Ｓａｍｂｒ ｏｏｋ ｅｔ ａｌ．、（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（第２版）、Ｖｏｌ．１−３、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ。 ゲノムまたはｃＤＮＡライブラリーを、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏ ｋ ｅｔ ａｌ．、前掲、に記載されているような標準的技術に従い、調製する 。ゲノムライブラリーを構築するために、ゲノムＤＮＡの大きいセグメントをラ ンダム断片化により発生させ、そしてベクターＤＮＡと結合して、適当なベクタ ーの中にパッケージできるコンカテマーを形成する。２種類のベクター。すなわ ち、バクテリオファージラムダベクターおよびコスミド、をこの目的に普通に使 用する。 ｃＤＮＡを調製するために、問題の生物からのｍＲＮＡをまず単離する。真核 性ｍＲＮＡは、ポリ−Ａテイルとして知られているアデニンヌクレオチド残基の ストリングを３’末端に有する。次いで、短鎖のオリゴｄ−Ｔを、酵素逆トラン スクリプターゼのプライマーとして働くポリ−Ａテイルとハイブリダイゼーショ ンさせる。この酵素は相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）鎖を合成するための鋳型として ＲＮＡを使用する。次いで、鋳型として第１ｃＤＮＡ鎖を使用して、第２ＤＮＡ 鎖を合成する。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の中で増殖のためにプラスミドまたはλ ファージベクターの中への挿入のために、リンカーを二本鎖ｃＤＮＡに添加する 。 核酸のハイブリダイゼーションにより、または発現ベクターを使用する場合、 コードされたタンパク質の免疫学的検出により、所望の核酸セグメントを収容す るゲノムまたはｃＤＮＡライブラリーの中のクローンの同定を実施する。次いで 細菌のコロニーは固体支持体、ニトロセルロースのフィルター、上にプレートさ れたレプリカである。細胞を溶解し、そして前述のオリゴヌクレオチドプローブ または所望のタンパク質に対する抗体でプロービングする。 また、他のこの分野においてよく知られている方法を使用して所望の遺伝子を 同定することができる。例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）のような増幅 技術を使用して、所望のヌクレオチド配 列を増幅することができる。米国特許第４，６８３，１９５号および米国特許第 ４，６８３，２０２号は、この方法を記載している。ＰＣＲにより増幅された配 列をアガロースゲルから精製し、そして標準的技術に従い適当なベクターの中に クローニングすることができる。ＭＨＣポリペプチドの原核発現 本発明に従い宿主細胞として有用である原核生物は、最も頻繁には、大腸菌（ Ｅ．ｃｏｌｉ）の種々の株により代表される。しかしながら、他の微生物株、例 えば、バシラス、例えば、バシラス・サチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉ ｌｉｓ）、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）の種々の種、または他の 細菌株、を使用することもできる。 本発明によれば、原核生物における遺伝子の発現を指令するシグナルに切形ま たは全長の核酸を作用可能に連鎖することによって、ＭＨＣポリペプチドはＭＨ Ｃポリペプチドをコードするするクローニングされたヌクレオチド配列からされ る。核酸は、それが他の核酸配列と機能的関係に配置されるとき、「作用可能に 連鎖される」。例えば、プロモーターまたはエンハンサーは、それが配列の転写 に影響を与える場合、コーディング配列に作用可能に連鎖される。一般に、作用 可能に連鎖されたという用語は、連鎖される核酸配列が隣接しそして、必要に応 じて、隣接させたかつリーディングフレームで、２つのタンパク質コーディング 領域を接合することを意味する。 ＭＨＣ分子をコードする遺伝子は、「発現ベクター」、「クローニングベクタ ー」、または「ベクター」の中に挿入することができ、これらの用語は本明細書 において互換的に使用され、そして通常選択した宿主細胞の中で複製することが できるプラスミドまたは他 の核酸分子を意味する。発現ベクターは自律的に複製することができるか、また はそれらは、この分野においてよく知られている方法により、宿主細胞のゲノム の中に挿入することによって複製することができる。自律的に複製するベクター は、複製起点、または選択した１または２以上の宿主細胞において機能的である 自律的複製配列（ＡＲＳ）を有するであろう。 複製部位および選択した宿主細胞と適合性の種から誘導された制御配列を含有 するプラスミドベクターを使用する。例えば、赤血球系細胞は典型的にはｐＢＲ ３２２の誘導体、すなわち、Ｂｏｌｉｖａｒ ｅｔ ａｌ．、Ｇｅｎｅ（１９７ ７）２：９５、により大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）種から誘導されたプラスミド、を 使用して形質転換される。しばしば、ベクターは２以上の宿主細胞において、例 えば、クローニングまたは構築のために大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）において、そし て発現のためにバシラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）細胞において、使用可能であるこ とが望ましい。 発現ベクターは、典型的には、宿主細胞におけるＭＨＣ分子をコードするＤＮ Ａの発現のために要求されるすべての要素を含有する、転写ユニットまたは発現 カセットを含有する。典型的な発現カセットは、ＭＨＣポリペプチドをコードす るＤＮＡ配列に作用可能に連鎖されたプロモーターおよびリボソーム結合部位を 含有する。プロモーターは、好ましくは、それがその天然のセッティングにおけ る転写開始部位からとほぼ同一距離において、異種転写開始部位から離れて位置 する。しかしながら、この分野において知られているように、この距離の多少変 動はプロモーターの機能を喪失しないで受け入れられることができる。停止領域 はプロモーター配列と同一であるか、または異なる遺伝子から得ることができる 。 普通に使用される原核性制御配列は、リボソーム結合部位の配列 と一緒に、必要に応じてオペレーターとともに、転写開始のためのプロモーター を包含すると本明細書において定義され、普通に使用されるプロモーター、例え ば、β−ラクタマーゼ（ペニシラーゼ）およびラクトース（ｌａｃ）プロモータ ー系（Ｃｈａｎｇｅ ｅｔ ａｌ．、Ｎａｔｕｒｅ（１９７７）１９８：１０５ ６）およびトリプトファン（ｔｒｐ）プロモーター系（Ｇｏｅｄｄｅｌ ｅｔ ａｌ．、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．（１９８０）８：４０５７）お よびラムダ由来ＰＬプロモーターおよびＮ−遺伝子リボソーム結合部位（Ｓｈｉ ｍａｔａｋｅ ｅｔ ａｌ．、Ｎａｔｕｒｅ（１９８１）２９２：１２８）を包 含する。原核生物において機能する任意の入手可能なプロモーター系を使用する ことができる。 構成的または調節されたプロモーターを本発明において使用することができる 。調節されたプロモーターは、ＭＨＣポリペプチドの発現が同誘導される前に、 宿主細胞が高い密度で増殖することができるので、有利であることがある。異種 タンパク質の高いレベルの発現は、ある場合において細胞増殖を遅延する。大腸 菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）において使用するために特に適当な調節されたプロモーター は、ハイブリッドｔｒｐ−ｌａｃプロモーター（Ａｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．、Ｇ ｅｎｅ（１９８３）２５：１６７；ｄｅ Ｂｏｅｒ ｅｔ ａｌ．、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９８３）８０：２１、およびバクテリ オファージＴ７プロモーター（Ｓｔｕｄｉｅｒ ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂ ｉｏｌ．（１９８６）：Ｔａｂｏｒ ｅｔ ａｌ．、（１９８５）を包含する。 これらのプロモーターおよびそれらの使用は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ． 、前掲、の中に論じられている。 大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）以外の原核細胞の中のＭＨＣポリペプチ ドの発現のために、特定の原核種において機能するプロモーターが要求される。 このようなプロモーターは、前記ｐＳＣからクローニングされた遺伝子から得る ことができるか、または異種プロモーターを使用することができる。例えば、ハ イブリッドｔｒｐ−ｌａｃプロモーターは大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に加えてバシ ラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）において機能する。 リボソーム結合部位（ＲＢＳ）は、また、原核生物におけるＭＨＣポリペプチ ドの発現のために必要である。例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）におけるＲＢＳ は、開始コドンから３〜１１ヌクレオチド上流に位置する長さ３〜９ヌクレオチ ドのヌクレオチド配列から成る（ＳｈｉｎｅおよびＤａｌｇａｒｎｏ、Ｎａｔｕ ｒｅ（１９７５）２５４：３４；Ｓｔｅｉｔｚ、ｉｎ Ｂｉｏｌｇｉｃａｌ ｒ ｅｇｕｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ：Ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅ ｓｓｉｏｎ（Ｒ．Ｆ．Ｇｏｌｄｂｅｒｇｅｒ編）、ｖｏｌ．１、ｐ．３４９、１ ９７９、Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ、ＮＹ）。 翻訳共役を使用して発現を増強することができる。この戦略は、プロモーター より下流に配置された、翻訳系に対して固有の高度に発現された遺伝子から誘導 された短い上流のオープンリーディングフレーム、および数アミノ酸コドンの後 に終止コドンが存在するリボソーム結合部位を使用する。終止コドンの直前に第 ２リボソーム結合部位が存在し、そして終止コドンの後に転写開始の開始コドン が存在する。この系はＲＮＡの二次構造を溶解し、翻訳の効率よい開始を可能と する。参照、Ｓｑｕｉｅｒｓ、ｅｔ ａｌ．（１９８８）、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈ ｅｍ．２６３：１６２９７−１６３０２。 ＭＨＣポリペプチドは細胞内において発現することができるか、 または細胞から分泌されることができる。細胞内発現はしばしば高い収量を生ず る。しかしながら、タンパク質のあるものは不溶性封入体の形態であることがあ る。本発明の細胞内で生産されたＭＨＣポリペプチドは細胞溶解後に収獲すると き活性であるが、可溶性の活性ＭＨＣポリペプチドの量はリフォルディング法を 実施することによって増加することができる（参照、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．、前掲；Ｍａｒｓｔｏｎ ｅｔ ａｌ．、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏ ｌｏｇｙ（１９８２）２：８００；Ｓｃｈｏｎｅｒ ｅｔ ａｌ．、Ｂｉｏ／Ｔ ｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（１９８５）３：１５１）。単一の発現ベクターの中に多数 の転写カセットを配置するか、またはクローニング戦略において使用される発現 ベクターの各々について異なる選択可能なマーカーを利用することによって、２ 以上のＭＨＣポリペプチドを単一の原核細胞において発現させることができる。 本発明のＭＨＣポリペプチドを発現させる第２アプローチは、細胞から、ペリ プラズムの中にまたは細胞外媒質の中に、ポリペプチドを分泌させることである 。ＭＨＣポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を切断可能なシグナルペプチド配 列に連鎖する。シグナル配列は細胞膜を通してＭＨＣポリペプチドのトランスロ ケーションを指令する。プロモーター−シグナル配列ユニットを含有する大腸菌 （Ｅ．ｃｏｌｉ）において使用するために適当なベクターの例はｐＴＡ１５２９ であり、これは大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ｐｈｏＡプロモーターおよびシグナル配 列を有する（参照、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．、前掲；Ｏｋａ ｅｔ ａ ｌ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９８５）８２：７２ １２；Ｔａｌｍａｄｇｅ ｅｔ ａｌ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ ｉ．ＵＳＡ（１９８０）７７：３９８８；Ｔａｋａｈａｒａ ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９８５）２６０：２６７０）。もう一 度、多数のポリペプチドをペリプラズムの連合のために単一の細胞の中の発現さ せることができる。 本発明のＭＨＣポリペプチドは、また、融合タンパク質として生産することが できる。このアプローチはしばしば高い収量を生ずる。なぜなら、通常の原核制 御配列は転写および翻訳を指令するからである。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）におい て、ｌａｃＺ融合をしばしば使用して異種タンパク質を発現させる。適当なベク ター、例えば、ｐＵＲ、ｐＥＸ、およびｐＭＲ１００系列は容易に入手可能であ る（参照、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．、前掲）。ある種の用途の ために、精製後、融合タンパク質から非ＭＨＣアミノ酸を切断することが望まし いことがある。これは臭化シアン、プロテアーゼ、または因子Ｘによる切断を包 含するこの分野において知られているいくつかの方法に任意のものにより達成す ることができる（参照、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．、前掲；Ｉｔ ａｋｕｒａ ｅｔ ａｌ．、Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９７７）１９８：１０５６；Ｇ ｏｅｄｄｅｌ ｅｔ ａｌ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ （１９７９）７６：１０６；Ｎａｇａｉ ｅｔ ａｌ．、Ｎａｔｕｒｅ（１９８ ４）３０９：８１０；Ｓｕｎｇ ｅｔ ａｌ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９８６）８３：５６１）。所望の切断点において融合タン パク質の遺伝子の中に切断部位を操作することができる。 大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）からＮ−末端の完全性維持する組換えタンパク質を得 るために好ましい系は、Ｍｉｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏ ｇｙ ７：６９８−７０４（１９８９）に記載された。この系において、問題の 遺伝子はペプチダーゼ切断部位を含有する酵母ユビキチン遺伝子の最初の７６残 基に対するＣ −末端の融合として生産される。２つの部分の接合における切断は、無傷の真性 のＮ−末端残基を有するタンパク質を生成する。 ＭＨＣポリペプチドをコードする核酸を含有するベクターを、発現のために原 核宿主細胞の中に形質転換する。「形質転換」は、よく知られている方法により 宿主細胞の中に問題の核酸を含有するベクターを直接導入することを意味する。 ＭＨＣポリペプチドの発現のために宿主細胞の中に遺伝物質を導入するために使 用される特定の手順は、特に決定的ではない。利用する特定の手順が、遺伝子を 発現できる宿主細胞の中に、少なくとも１つの遺伝子を首尾よく導入できること が必要であるだけである。 形質転換法は、宿主細胞の型に依存して変化し、エレクトロポレーション；塩 化カルシウム、塩化ルビジウム、リン酸カルシウム、または他の物質を使用する トランスフェクション；マイクロインジェクション体の衝撃；感染（ここでベク ターは感染因子である）；および他の方法を包含する。参照、一般に、Ｓａｍｂ ｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．（１９８９）前掲；およびＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏ ｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、前掲。前述の核酸が導 入された細胞に対する言及は、また、このような細胞の祖先を包含することを意 味する。ＭＨＣポリペプチドを発現するための発現ベクターを含有する形質転換 された原核細胞は、また、本発明に包含される。 標準的トランスフェクションまたは形質転換法を使用して大量のＭＨＣポリペ プチドを発現する原核細胞系を生産した後、ポリペプチドを次いで標準的技術を 使用して精製する。参照、例えば、Ｃｏｌｌｅｙ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｊ ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．６４：１７６１９−１７６２２；およびＭｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、¨Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒ ｉｆｉｃａｔｉｏｎ¨、Ｍ．Ｄｅｕｔｓｃｈｅｒ、編、Ｖｏｌ．１８２（１９９ ０）。組換え細胞を増殖し、そしてＭＨＣポリペプチドを発現させる。精製プロ トコールは、ＭＨＣポリペプチドを細胞内に、ペリプラズムの中に発現させるか 、または細胞から分泌させるかどうかに依存するであろう。細胞内の発現のため に、細胞を収獲し、溶解し、そしてＭＨＣポリペプチドを細胞リゼイトから回収 する（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．、前掲）。ペリプラズムＭＨＣポリペプ チドをペリプラズムから標準的技術により解放する（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．、前掲）。ＭＨＣポリペプチドが細胞から分泌される場合、分泌されたタ ンパク質の精製のために培地を収獲する。この培地は典型的には遠心または濾過 により清浄化して細胞および細胞の破片を除去する。 ＭＨＣポリペプチドを任意の適当な樹脂、例えば、ＣＤＰ−セファローズ、ア シアロプロトロンビン−セファローズ４Ｂ、またはＱセファローズに対する吸着 によるか、または硫酸アンモニウム分画、ポリエチレングリコール沈降の使用に よるか、または限外濾過により濃縮することができる。この分野において知られ ている他の手段は等しく適当であろう。 ＭＨＣポリペプチドのそれ以上の精製は、標準的技術、例えば、アフィニティ ークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、サイジングクロマトグ ラフィー、または均質性を得るために使用される他のタンパク質精製技術により 達成することができる。次いで、精製されたタンパク質は、後述するように、医 薬組成物の製造に使用される。修飾されたＭＨＣポリペプチド 宿主細胞をトランスフェクションするために使用するヌクレオチド配列を標準 的技術に従い修飾して、種々の所望の性質を有するＭ ＨＣポリペプチドを生ずることができる。本発明のＭＨＣポリペプチドは、種々 の組換えＤＮＡ技術を利用して容易に設計しそして製造することができる。多数 の技術は当業者によく知られており、そして引用した参考文献に記載されている 。例えば、ＭＨＣポリペプチドは、天然に存在する配列から、主要な構造レベル において、アミノ酸の挿入、置換、欠失などにより変化することができる。また 、新しい活性または活性の組み合わせをＭＨＣポリペプチドに付与することがで きるタンパク質の融合を利用することができる。これらの修飾を多数の組み合わ せで使用して、最終のＭＨＣポリペプチド鎖を生成することができる。 アミノ酸配列の変異型は、種々の意図する目的で、例えば、組換えポリペプチ ドの精製および製造を促進するために、製造することができる。修飾されたポリ ペプチドは、また、治療の半減期を変更し、治療効能を改良し、そして治療上の 使用の間の副作用の苛酷さまたは発生を減少するために有用である。アミノ酸配 列は通常天然に存在しない前以て決定した変異型であるが、天然の配列のＭＨＣ と同一のペプチドの結合およびＴ細胞の結合を示す。例えば、主要な構造のわず かに一部分（通常少なくとも約６０〜８０％、典型的には９０〜９５％）を含ん でなるポリペプチド断片を生成することができる。ある好ましい態様において、 ＭＨＣポリペプチドは全長のポリペプチドからのα1またはβ1ドメインから本質 的に成る。このような断片は、典型的には、約５０〜約１００、好ましくは約６ ０〜約９０、より好ましくは約７０〜約８０アミノ酸を含んでなる。また、合成 法を使用してポリペプチドを製造することができる。参照、例えば、Ｍｅｒｒｉ ｆｉｅｌｄ（１９８６）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３２：３４１−３４７；Ａｔｈｅｒ ｔｏｎ ｅｔ ａｌ．、Ｓｏｌｉｄ Ｐｈａｓｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈ ｅｓｉｓ： Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ、ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ、Ｏｘｆｏｒ ｄ）。 一般に、ＭＨＣポリペプチドをコードする配列の修飾は、種々のよく知られて いる技術、例えば、部位特異的突然変異誘発により容易に達成される（参照、Ｇ ｉｌｌｍａｎおよびＳｍｉｔｈ（１９７９）Ｇｅｎｅ ８：８１−９７、および Ｒｏｂｅｒｔｓ、Ｓ．ｅｔ ａｌ．（１９８７）Ｎａｔｕｒｅ ３２８：７３１ −７３４）。ほとんどの修飾は、所望の特性について適当なアッセイにおける日 常のスクリーニングにより評価される。例えば、ペプチドに結合するか、または Ｔ細胞の増殖に影響を与えるポリペプチドの能力についての種々の修飾の効果は 、後述するアッセイを使用して容易に決定することができる。他の性質、例えば 、レドックスまたは熱安定性，疎水性、タンパク質分解に対する感受性、または 凝集する傾向、の修飾のすべては、標準的技術に従いアッセイされる。 ある種の用途のために、ＭＨＣｃＤＮＡコーディング配列を修飾して、トラン スメンブレンドメインを欠失させ、そして生ずる可溶性ＭＨＣポリペプチドを発 現させる。ＭＨＣｃＤＮＡのトランケーションは、例えば、オリゴヌクレオチド 指令欠失突然変異誘発またはポリメラーゼ連鎖反応により実施することができる 。オリゴヌクレオチド指令ｉｎ ｖｉｔｒｏ突然変異誘発は、例えば、Ｋｕｎｋ ｅｌ ｅｔ ａｌ．（１９８７）Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５４：３６７− ３８２、に記載されている。参照、また、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ． 、Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃ ｉｅｎｃｅ、Ｎｅｗ Ｙｏｗｋ（１９８７および周期的補遺）。ＭＨＣポリペプチドの製薬上の用途 本発明のグリコシル化されていない、原核発現されたＭＨＣポリペプチドは、 例えば、自己免疫、異系移植片拒絶反応またはアレルギー応答に関連する抗原を 表すペプチドと複合体を形成するために使用できる。複合体の成分は、免疫系に 所望の効果を有するように選択される。ＭＨＣポリペプチドの有効な部分は、抗 原結合部位と、適当なＴ細胞レセプターによるＭＨＣ−ペプチド複合体の認識に 必要な配列とを含んでなる部分である。ＭＨＣ成分は、クラスＩまたはクラスＩ Ｉの分子であることができる。ペプチド抗原と、ＭＨＣタンパク質の抗原結合部 位との連合は、共有結合または非共有結合によることができる。 他の態様において、複合体は、また、一般にトキシンまたは標識であるエフェ クター成分を含有することができる。エフェクター部分は、ＭＨＣをコードする タンパク質または自己抗原性ペプチドに複合化することができる。複合体の生産 および使用は、米国特許第５，１３０，２９７号、前掲、の中に開示されている 。ペプチド抗原 本発明の複合体において使用する抗原性ペプチドは、少なくとも約８残基、通 常少なくとも約１０残基、より通常少なくとも約１２残基の長さである。通常、 最大長さは約３０残基、より通常約２５、そしてしばしば２０より小さい。しか しながら、ＭＨＣ分子に結合できるペプチドの長さは変化することができる。従 って、より大きい長さ、例えば、１００残基までの、ペプチドを、また、複合体 において使用することができる。通常、ペプチドは約５０より小さい、好ましく は約３０より小さい、残基の長さであろう。 多数の免疫病理学のための抗原性ペプチドまたは組織が知られている。例えば 、複合体はアレルギー応答を治療するために使用できる。このような症状の例は 、食物過敏症、例えば、セリアック病お よびクローン病、およびブタクサ、ホコリダニ、ネコ、ミツバチの毒液、および 草の花粉に対するアレルギー応答を包含する。本発明の方法を使用する治療に適 当なアレルギー疾患の概観については、Ｏ’Ｈｅｈｉｒ、ｅｔ ａｌ．、Ａｎｎ ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、９：６７−９５（１９９１）、を参照のこと。 実験的に誘導された自己免疫疾患において、病因に関係する抗原が特性決定さ れた：ラットおよびマウスにおける関節炎において天然のＩＩ型コラーゲンがコ ラーゲン誘導関節炎において同定され、そしてアジュバント関節炎においてミコ バクテリアの熱ショックタンパク質が同定された（Ｓｔｕａｒｔ ｅｔ ａｌ． （１９８４）、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２：１９９−２１８；ｖａｎ Ｅｄｅｎ ｅｔ ａｌ．（１９８８）、Ｎａｔｕｒｅ ３３１：１７１−１７ ３）；マウスにおける実験的アレルギー性甲状腺炎（ＥＡＴ）においてサイログ ロブリンが同定された（Ｍａｒｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９８８）、Ｊ．Ｅｘｐ． Ｍｅｄ．１５２：１１１５−１１２０）；実験的アレルギー性重症筋無力症（Ｅ ＡＭＧ）においてアセチルコリンレセプター（ＡＣｈＲ）が同定された（Ｌｉｎ ｄｓｔｒｏｍ ｅｔ ａｌ．（１９８８）、Ａｄｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．４２：２ ３３−２８４）；そしてマウスおよびラットにおける実験的アレルギー性脳脊髄 炎（ＥＡＥ）において骨髄塩基性タンパク質（ＭＢＰ）およびプロテオリピドタ ンパク質（ＰＬＰ）が同定された（参照、Ａｃｈａ−Ｏｒｂｅａ ｅｔ ａｌ． （１９８９）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．７：３７７−４０５）。さらに 、例えば、標的抗原がヒトにおいて同定された：ヒト慢性関節リウマチにおいて ＩＩ型コラーゲン（Ｈｏｌｏｓｈｉｔｚ ｅｔ ａｌ．（１９８６）Ｌａｎｃｅ ｔ ｉｉ：３０５−３０９）；および重症筋無力症においてアセチルコリンレセ プター（Ｌｉｎｄｓｔｒｏ ｍ ｅｔ ａｌ．（１９８８）前掲）。 抗原提示細胞（ＡＰＣｓ）の表面上のＭＨＣ糖タンパク質による抗原の提示は 抗原性ペプチドのより小さいペプチドユニットへの加水分解に引き続いて起こる と信じられる。抗原性ペプチド内のこれらをより小さいセグメントの位置は実験 的決定することができる。これらをセグメントは８〜１８残基の長さであると考 えられ、そしてアグレトープ（ａｇｒｅｔｏｐｅ）（ＭＨＣ分子により認識され る）およびエピトープ（Ｔヘルパー細胞上のＴ細胞レセプターにより認識される ）を含有する。このエピトープそれ自体は、Ｔヘルパー細胞の抗原特異的レセプ ターを認識する５〜６アミノ酸の隣接または非隣接配列である。アグレトープは 、ペプチドとＭＨＣタンパク質との連合の原因となる連続または非非隣接の配列 である。 関係する８〜１８アミノ酸サブユニットを決定する実験的方法は、骨格筋のア セチルコリンレセプターのアルファサブユニットを使用して例示される。重症筋 無力症（ＭＧ）において、自己免疫応答はこのサブユニットに対して向けられる 。神経筋接続部におけるシナプス後膜上のＡＣｈＲの喪失はＭＧ症候群を引き起 こす。 ＭＧにおいて、アセチルコリンレセプター（ＡＣｈＲ）のアルファサブユニッ トに対する自己抗体は、ＡＣｈＲに対して向けられた自己免疫応答に関係づけら れる。ＭＧ患者の８５％は、アルファサブユニットと反応性の自己抗体を有する 。これらのうちで、６０％は残基６０と８０との間に位置溶解主要な免疫原性領 域（ＭＩＲ）と呼ぶアルファサブユニットのペプチドセグメントに結合する抗体 を有する（ＴｚａｒｔｏｓおよびＬｉｎｄｓｔｒｏｍ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａ ｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９８０）７７：７５５）。自己反応性Ｔ細胞により 認識されるペプチドセグメントは、また、アルファサブユニット上に位置する（ Ｈｏｈｌｅｌｄ ｅｔ ａ ｌ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９８７）８４：５３ ７９−５３８３。これらのＴ細胞により認識されるエピトープは残基１−３０、 １２５−１４７、１６９−１８１、２５７−２７１および３５１−３６８の間に 存在する。さらに、ヒトにおいて、ＡＣｈＲペプチド１９５−２１２および２５ ７−２６９は、それぞれ、ＨＬＡ−ＤＲ５およびＨＬＡ−ＤＲ３、ＤＱｗ２ＭＨ Ｃハプロタイプの重症筋無力症の患者においてエピトープとして部分的に特性決 定された（参照、Ａｃｈａ−Ｏｒｂｅａ（１９８９）前掲）。 このレセプターのアルファサブユニットと連合したエピトープの提示を可能と するアグレトープを有するペプチドは、容易に決定される。例えば、マウスのモ デルにおける適当なペプチドの決定は下記のように実施する。 トルペド・カリフォルニクス（Ｔｏｒｐｅｄｏ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃｕｓ） ＡＣｈＲで免疫化したとき、ヒト重症筋無力症の特徴の多くををもつ疾患を発生 するマウスの系統をモデルとして使用する。レクチンおよびモノクローナル抗体 のアフィニティー支持体を使用して、この系統のマウスの脾細胞から、ＭＨＣク ラスＩＩ糖タンパク質を単離する。精製されたＭＨＣクラスＩＩタンパク質を、 洗浄剤透析によりリン脂質の小胞の中に組み込む。次いで、生ずる小胞をきれい なガラスカバーのスリップに融合して、各々の上にＭＨＣ分子を含有する平らな 脂質２層を生成する（ＢｒｉａｎおよびＭｃＣｏｎｎｅｌｌ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９８４）８１：６１５９。 付着性の平らな脂質膜の中に埋め込まれたＭＨＣクラスＩＩ分子を含有する１ 枚のカバースリップを、いくつかの２４ウェルのプレートの各ウェルの中に配置 する。アルファサブユニットの配列に対 応しそして１または２以上の放射性標識化アミノ酸残基（後述するように調製し た）を含有するほぼ４０のオーバーラップする２０残基の合成ペプチドを、カバ ースリップおよびＰＢＳを有するウェルの中に配置し、そして数日間インキュベ ートする。ＭＨＣクラスＩＩ糖タンパク質抗原結合部位の中のペプチドの結合の 程度を、カバースリップ上のＭＨＣクラスＩＩ−平らな脂質膜／平らな脂質膜単 独の中に組み込まれた放射能の量により測定する。放射能の組み込むの比は、平 らな脂質膜の中に存在するＭＨＣクラスＩＩ分子のいくつかの種の１つのアグレ トープ（ＭＨＣクラスＩＩペプチド結合部位）を結合ペプチドが含有することを 示す。このようにして、ＡＣｈＲのアルファサブユニットについてのアグレトー プの組が、ＡＣｈＲまたは精製されたアルファサブユニットで免疫化したときＭ Ｇの症状を表すマウスの系統について定められる。 次に、アグレトープを含有するアルファサブユニットの合成ペプチドのセグメ ントの各々を、カバースリップ上の平らな脂質膜の中に埋め込まれた、単離され たＭＨＣクラスＩＩタンパク質の抗原結合部位の中に再び組み込む。１つのカバ ースリップを２４ウェルの培養プレートの各ウェルに加え、そしてＡＣｈＲに対 して免疫化されたマウスから（および付着性クラスＩＩタンパク質を単離した系 統から）の脾細胞を各ウェルに添加する。ＤＮＡの中へのトリチウム化チミジン の吸収により測定した、Ｔ細胞ハイブリドーマの増殖は、ＭＨＣクラスＩＩタン パク質結合ペプチドがアグレトープおよびＴ細胞に結合するエピトープの双方を 含有することを示す。Ｔ細胞クローンの活性化は、ＩＬ−３産生の測定により決 定される（参照、Ｑｕｉｌｌ ｅｔ ａｌ．、前掲）。 急速多重ペプチド合成（ｒａｐｉｄ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｐｅｐｔｉｄｅ ｓ ｙｎｔｈｅｓｉｓ）（ＲＡＭＰＳ）のためにデュポン 社（ＤｕＰｏｎｔ）の装置および技術を使用して、トルペド・カリフォルニクス （Ｔｏｒｐｅｄｏ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃｕｓ）ＡＣｈＲのアルファサブユニッ トからオーバーラップする（１０残基のオーバーラップ）２０残基のペプチドの 構成員を合成する。１または２以上の放射性アミノ酸が各合成ペプチドの中に組 み込まれる。側鎖が保護されたＦＭＯＣアミノ酸のペンタフルオロフェニル活性 エステルを使用して、標準的段階的固相ペプチド合成法、次いで標準的側鎖の脱 保護および固体支持体からのペプチドアミドの同時解放を適用して、ペプチドを 合成する。 また、抗原性ペプチド、例えば、アセチルコリンレセプター、の８−１８アミ ノ酸の推定上のセグメントを包含するオーバーラッピング配列は、Ｇｅｙｓｅｎ 、Ｈ．Ｍ．、ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎ．Ｍｅｔｈ．（１９８７）１０２：２ ７４、の方法により合成することができる。合成された放射性標識化ペプチドは 、それらを個々に（プレート上で）前述したように脂質膜２層に配合した精製Ｍ ＨＣタンパク質とインキュベートすることによって試験する。 中枢神経系におけるミエリン鞘の破棄を生ずる多発硬化症（ＭＳ）において、 ミエリンの主要成分であるミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）は主な自己抗原 である。ＭＢＰタンパク質の関係するセグメントは、また、ウシミエリン塩基性 タンパク質で免疫化したとき、実験的アレルギー性脳炎（ＥＡＧ）を発生するマ ウスの系統を使用して、実験的に決定する。 全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）は複雑な症候を有するが、赤血球に対する 自己免疫応答から生ずる。この疾患の抗原性エフェクターであるペプチドは、赤 血球の表面上のタンパク質の中に見出される。 慢性関節リウマチ（ＲＡ）は、滑液の中に見出されるタンパク質 に対する免疫応答から生ずる慢性炎症性疾患である。 インスリン依存性糖尿病（ＩＤＤＭ）は、インスリンを分泌するランゲルハン ス島内のベータ細胞への自己免疫攻撃から生ずる。ランゲルハンス島の細胞表面 の抗原およびインスリンに対する循環する抗体は、ＩＤＤＭに先行することが知 られている。ＩＤＤＭにおける免疫応答を引き出すとき重大なペプチドは、イン スリン配列およびベータ細胞膜表面タンパク質の一部分であると信じられる。 関係する抗原性ペプチドのサブユニットは、比較的短いので、ペプチド合成の 標準的自動化法を使用して容易に合成することができる。この別法において、そ れらは単離されたまたは合成のＤＮＡ配列を使用して組み換え的に作ることがで きるが、これはこの長さのペプチドのための最も効率よいアプローチではない。 従って、要約すると、１組の標識化被験ペプチドを調製し、そしてＭＨＣタン パク質を含有する平らな脂質膜の中のＭＨＣに結合するものはアグレトープを含 有することが示される。 次いで、同定されたタンパク質を普通の固相合成により調製し、そして疾患誘 導性ヘルパーＴ細胞のクローンのためのエピトープを含有するサブセットは、候 補のペプチドをネズミ抗原提示細胞（ＡＰＣ）（または単離されたＭＨＣ複合体 ）および全長のタンパク質で免疫化されたマウスからの脾臓またはリンパ節のＴ 細胞とインキュベートすることによって決定される。有望な候補はこの系におい てＴ細胞の増殖を刺激するであろう。この第２の、より小さい、サブセットは適 当なペプチド成分を提示する。複合体の形成 複合体の要素は、米国特許第５，１３０，２９７号、前掲、に記載されている ように、この分野において知られている標準的手段により連合することができる 。抗原性ペプチドはＭＨＣタンパク質の ポケット部分と、例えば、２つの成分を混合することによって、非共有結合で連 合することができる。過剰のペプチドは多数の標準的手順の任意のもの、例えば 、限外濾過または透析、により除去することができる。ペプチドは、また、標準 的手順を使用して、例えば、フォトアフィニティーラベリングにより、共有結合 させることができる（参照、例えば、Ｈａｌｌ ｅｔ ａｌ．、Ｂｉｏｃｈｅｍ ｉｓｔｒｙ ２４：５７０２−５７１１（１９８５）。また、ペプチドは、単一 のポリヌクレオチド配列からペプチドおよびＭＨＣ成分を発現させることによっ て、ＭＨＣ成分に共有結合させることができる。例えば、ペプチドは柔軟なペプ チドリンカーを通してＭＨＣ成分に共有結合させることができる（参照、例えば 、Ｋｏｚｏｎｏ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ ３６９：１５１−１５４（１９９ ４））。複合体の評価 本発明のＭＨＣポリペプチドを使用して形成された複合体は、ｉｎ ｖｉｖｏ 系またはｉｎ ｖｉｖｏモデルを使用してアッセイすることができる。ｉｎ ｖ ｉｖｏ系において、複合体のペプチドに関係づけられる症状の原因となるタンパ ク質または抗体で免疫化するか、またはそれに対する免疫性を示す被検者からの 末梢血Ｔ細胞とペプチドをインキュベートする。有望な複合体は、同系Ｔ細胞に おいてアネルギーを誘導し、そして追加の抗原で刺激したときでさえＴ細胞の増 殖を防止する。 ｉｎ ｖｉｖｏ系において、単離されたエピトープに応答して、またはＡＰＣ の存在において全長の抗原に応答して増殖するＴ細胞をクローニングする。免疫 化されていない組織適合性動物の中にクローンを注射して、自己免疫疾患を誘導 する。関係する複合体はこの疾患の症状を軽減または排除すべきである。 複合体の型のいずれは、すなわち、エフェクターをもつか、またはもたない型 を使用することができる。１つのモードにおいて、治療は２倍である。抗原性ペ プチドの有効部分を含有する、原核発現された、ＭＨＣをコードする抗原提示タ ンパク質の複合体で個体を治療して、免疫系をダウンレギュレートする。原核発 現された、ＭＨＣをコードする抗原提示タンパク質、治療される自己免疫疾患に 対して特異的である抗原性ペプチドの有効部分、およびエフェクター成分を含む ３成分の複合体で治療することによって、それ以上のダウンレギュレーションを 達成する。さらに、複合体のパネルを治療のために使用できる。例えば、抗原の ２以上のペプチドが自己免疫応答に関係することが推測される場合、および／ま たは２以上の抗原がに関係すると推測される場合、適当な原核発現された、ＭＨ Ｃをコードする抗原提示ポリペプチドの有効部分、および抗原性ペプチドの有効 部分を含有するパネルから選択されたいくつかの複合体で個体を治療することが できる；これらはエフェクター成分を含むか、または含まないことができる。 標識化複合体の投与は、診断の応用において、疾患に関係する免疫系の部分の 同定を可能とする。治療および／または診断のためのＭＨＣ複合体の選択 特定の疾患について個体を診断または治療するとき使用すべきＭＨＣ複合体を 選択するために、抗原の提示に関係するＭＨＣ抗原の型を同定する。下記の論考 は自己免疫疾患に関連する抗原の同定を記載するが、同一の一般的アプローチを 他の疾患、例えば、アレルギー、について使用できることを当業者は認識するで あろう。 特定の自己免疫機能障害は特定のＭＨＣ型に関係付けられる。どの対立遺伝子 、引き続いてＭＨＣをコードするどのポリペプチドが自己免疫疾患に関連するか を同定する方法は、この分野において知 られている。欧州特許（ＥＰ）第２８６４４７号に記載されている方法は適当で ある。この方法において、いくつかのステップに従う。第１に、ＭＨＣ抗原と自 己免疫疾患との間の関連を遺伝の研究に基づいて決定する。これらの研究を実施 する方法は当業者に知られており、そしてヒトにおけるすべての既知のＨＬＡ疾 患についての情報はコペンハーゲンにおけるＨＬＡおよび疾患の記録所（ＨＬＡ ａｎｄ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｒｅｇｉｓｔｒｙ）に維持されている。疾患に関連 するポリペプチドをコードする遺伝子座は、疾患と最強の関連を有するものであ る。 第２に、ＭＨＣ抗原／ポリペプチドに関連する疾患をコードする対立遺伝子を 同定する。対立遺伝子の同定において、感受性対立遺伝子が優性であると仮定さ れる。対立遺伝子の同定は、疾患との特定のサブタイプの強い陽性の関連を決定 することによって達成される。これは多数の方法において達成することができ、 それらのすべては当業者に知られている。例えば、サブタイプの型別は混合した リンパ球の応答（ＭＬＲ）の型別およびプライムドリンパ球の試験（ＰＬＴ）に より達成することができる。両方の方法はＷｅｉｒおよびＢｌａｃｋｗｅｌｌ、 編、Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇ ｙ、に記載されている。それは、また、検査するＭＨＣ遺伝子座に対して特異的 であるＤＮＡプローブを使用して、ＤＮＡ制限断片長さの多形性（ＲＦＬＰ）を 分析することによって達成することができる。例えば、Ｎｅｐｏｍ（１９８６） Ａｎｎａｌｓ Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．４７５：１。ＭＨＣ遺伝子座のため のプローブの製造法はこの分野において知られている。参照、例えば、Ｇｒｅｇ ｅｒｓｅｎ ｅｔ ａｌ．（１９８６）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ ｉ．ＵＳＡ ７９：５９６６；Ｗｅｉｓｓｍａｎ ｅｔ ａｌ．ｉｎ Ｍｅｄｉ ｃｉｎｅ ｉｎ Ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ：ｔｈｅ Ｃｅｎｔｅｎｎｉａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｉｌｌｉｎｏｉｓ Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ（Ｅ．Ｐ．Ｃｏｈｅｎ、編、１９８１）。 疾患の感受性を付与するサブタイプの最も完全な同定は、遺伝子座のゲノムＤ ＮＡ、または遺伝子座内の転写されたｍＲＮＡのｃＤＮＡコピーの配列決定によ り達成される。配列決定されるＤＮＡは、ＭＨＣをコードしたポリペプチドの超 可変性領域をコードする区画を含む。プローブで特別に所望のＤＮＡを同定し、 所望の領域を増幅する方法はこの分野において知られており、そして、例えば、 ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）の技術を包含する。 特定の自己免疫疾患に対する感受性を付与する対立遺伝子がいったん同定され ると、対立遺伝子内のコードされたポリペプチドは、また、同定可能である、す なわち、ポリペプチド配列はそれをコードする対立遺伝子内のＤＮＡ配列から推 定することができる。診断および／または治療のために使用される本発明のＭＨ Ｃ抗原複合体は、自己免疫疾患に関連するＭＨＣ抗原の有効部分から、および同 一の疾患の症状に関連する自己免疫抗原から誘導される。 １例として、慢性関節リウマチ患者の９０％以上はＤＲ４（Ｄｗ４）、ＤＲ４ （Ｄｗ１４）またはＤＲ１のハプロタイプを有する。また、ヒト慢性関節リウマ チにおける標的抗原はＩＩ型コラーゲンであることが知られている。それゆえ、 慢性関節リウマチを有する個体の治療または診断のために使用する本発明の複合 体は、ＩＩ型コラーゲンの有効部分と複合化した、ＤＲ４（Ｄｗ４）、ＤＲ１お よび／またはＤＲ４（Ｄｗ１４）から誘導され、疾患の誘導のための抗原を提示 できるか、または疾患の抑制のための抗原を提示できない、ポリペプチドを含有 するものを包含する。 本明細書おいて使用するとき、用語「個体」はすべての哺乳動物および、基本 的に同等のＭＨＣ系を有する脊椎動物を包含する。処方および投与 ＭＨＣサブユニットのトランスメンブレン領域が含まれる場合、本発明の原核 発現されたＭＨＣポリペプチドを使用して形成された複合体は、脂質の１層また は２層の中に組み込まれた後、好都合に投与される。典型的には、リポソームを この目的に使用されるが、任意の形態の脂質膜、例えば、平らな脂質膜または細 胞の細胞膜（例えば、赤血球）を使用することができる。複合体は、また、ミセ ルの中に好都合に組み込まれる。下記の実施例２の中に表されているデータは、 二量体のＭＨＣ分子を含んでなるＭＨＣ−ペプチド複合体が主として凝集物とし て存在することを示す。 後述するように、標準的ＭＨＣｃＤＮＡに従いリポソーム製造することができ る。しかしながら、トランスメンブレン領域が欠失されている場合、複合体はペ プチドを含有する製剤に好都合に使用される方法で投与することができる。 投与は全身的であり、そして注射、好ましくは静脈内注射により実施された、 従って注射の投与ルートと適合性の処方物を使用することができる。適当な処方 物は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃ ｅｓ、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ、ペンシルベニア州フ ィラデルフィア、第１７版（１９８５）の中に見出される。本発明の複合体と、 製薬上有効な担体とを含んでなる種々の医薬組成物を製造することができる。医 薬組成物は種々の薬物送出し系において適当である。薬物送出しの現在の方法の 簡単な概観については、下記の文献を参照のこと：Ｌａｎｇｅｒ、Ｓｃｉｅｎｃ ｅ ２４９：１５２７−１５３３（１９９０）。 本発明の原核発現された、グリコシル化されていないＭＨＣポリペプチドを使 用する医薬組成物の製造において、本発明の複合体を修飾してそれらの薬物速度 論および生物内分布を変更することがしばしば望ましい。薬物速度論の一般的論 考について、下記の文献を参照のこと：Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａ ｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、前掲、第３７〜３９章。薬物速度論およ び生物内分布を変更する多数の方法がこの分野において知られている（参照、例 えば、Ｌａｎｇｅｒ、前掲）。例えば、可溶性高分子、例えば、タンパク質、多 糖類、または合成ポリマー、例えば、ポリエチレングリコール、に対する接合は 有効である。他の方法は、物質、例えば、タンパク質、脂質（例えば、リポソー ム）、炭水化物、または合成ポリマー、から構成された小胞の中の複合体の保護 を包含する。 本発明のリポソームは、典型的には、複合体がＴ細胞レセプターとの相互作用 のために利用可能であるような方法で、リポソームの表面上に位置するＭＨＣ− ペプチド複合体を含有する。トランスメンブレン領域を通常まず膜の形成時に膜 の中に組み込む。所望の薬物（例えば、トキシンまたは化学療法剤）を特定の自 己反応性Ｔ細胞にターゲティングするために、リポソームを使用することができ る。また、リポソームの中に埋め込まれた複合体をを使用して、標的とした細胞 においてアネルギーを誘導することができる。 例えば、Ｓｚｏｋａ ｅｔ ａｌ．、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｈｙｓ．Ｂｉｏ ｅｎｇ．９：４６７（１９８０）、米国特許第４，２３５，８７１号、米国特許 第４，５０１，７２８号および米国特許第４，８３７，０２８号に記載されてい るように、リポソームの製造のために種々の方法が利用可能である。 また、非極性領域を有する分子の可溶性を増加するために、ミセ ルがこの分野において普通に使用されている。従って、本発明の組成物において ミセルが有用であることを当業者は認識するであろう。本発明の複合体を含んで なるミセルは、薬学の分野においてよく知られている方法に従い製造する（参照 、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅ ｎｃｅｓ、前掲、第２０章）。本発明の複合体を含んでなるミセルは、典型的に は、標準的界面活性剤または洗浄剤を使用して製造される。 当業者によく知られている普通の界面活性剤を、本発明のミセルにおいて使用 することができる。適当な界面活性剤は、ラウリン酸ナトリウム、オレイン酸ナ トリウム、ラウリル硫酸ナトリウム、オクタオキシエチレングリコールモノドデ シルエーテル、オクトオキシノール９およびＰＬＵＲＯＮＩＣ Ｆ−１２７R（ Ｗｙａｎｄｏｔｔｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ Ｃｏｒｐ．）を包含する。好ましい 界面活性剤は、ＩＶ注射と適合性の非イオン性ポリオキシエチレンおよびポリオ キシプロピレン洗浄剤、例えば、ＴＷＥＥＮ−８０R、ＰＬＵＲＯＮＩＣ Ｆ− ６８R、ｎ−オクチル−β−Ｄ−グルコピラノシドなどである。さらに、リン脂 質、例えば、リポソームの製造における使用するために記載されているものを、 また、ミセルの形成のために使用できる。 本発明のＭＨＣサブユニットは脂質親和性トランスメンブレン領域と、比較的 親水性の細胞外ドメインを含んでなるので、普通の界面活性剤またはリン脂質お よびサブユニットの存在において混合ミセルが形成される。本発明の混合ミセル は、サブユニット、リン脂質および／または界面活性剤の任意の組み合わせを含 んでなることができる。従って、ミセルはサブユニットおよび洗浄剤、リン脂質 および洗浄剤の双方と組み合わせたサブユニット、またはサブユニットおよびリ ン脂質を含んでなることができる。 本発明の複合体を含んでなる医薬組成物について、投与量は、例えば、特定の 複合体、投与方法、治療する特定の疾患およびその程度、患者の全体の健康およ び症状、および処方する医師の判断、に従い変化するであろう。ネズミの被検体 についての投与レベルは、一般に、約１０μｇ〜約５００μｇである。約５０μ ｇ〜約３００μｇの合計の投与量は好ましい。例えば、疾患の過程にわたって提 供される治療において、３×２５μｇまたは１００μｇの投与量は有効である。 合計の投与量は約０．０１５〜約１５μｇ／ｋｇ、好ましくは約０．１５〜約１ ０μｇ／ｋｇの範囲である。 医薬組成物は、非経口、局所、経口、または局所的投与のために、例えば、エ ーロゾルまたは経皮により、予防および／または治療の処置のために意図される 。医薬組成物は、投与法に依存して種々の単位投与形態で投与することができる 。例えば、経口投与に適当な単位投与形態は、粉末、錠剤、丸剤、およびカプセ ル剤を包含する。 好ましくは、医薬組成物は静脈内に投与される。従って、本発明は、許容され る担体、好ましくは水性担体、の中に溶解または懸濁された複合体の溶液を含ん でなる、静脈内投与のための組成物を提供する。種々の水性担体、例えば、水、 緩衝化水、０．４％の生理食塩水などを使用することができる。例えば、リン酸 緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）は本発明の可溶性複合体の投与のために特に適当であ る。好ましい処方物は、０．０２％のＴＷＥＥＮ−８０を含有するＰＢＳである 。これらを組成物は、慣用のよく知られている技術により滅菌するか、または滅 菌濾過することができる。生ずる水溶液は使用するためにそのまま包装するか、 または凍結乾燥することができ、凍結乾燥した製剤は投与前に無菌の水溶液と組 み合わせる。組成物は必要に応じて薬学上許容される補助物質、例えば、ｐＨ調 節剤および緩衝剤、張度調節剤、湿潤剤など、例えば、酢酸ナトリウム、乳酸ナ トリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、ソルビタンモノラ ウレート、トリエタノールアミンオレエートなど、を含有して生理的状態に近似 させることができる。 複合体の濃度は、広く、すなわち、約０．０５重量％より低い濃度、通常約１ 重量％または少なくとも約１重量％から、１０〜３０重量％程度の高くまで変化 することができ、そして主として流体の体積、粘度などにより、選択した特定の 投与のモードに従い、選択されるであろう。静脈内投与のために好ましい濃度は 、ＰＢＳの中において約０．０２％〜約０．１％またはそれ以上である。 固体状組成物について、慣用の無毒のカチオンを使用するすることができ、こ れらは、例えば、製薬等級のマンニトール、ラクトース、澱粉、ステアリン酸マ グネシウム、ナトリウムサッカリン、タルク、セルロース、グルコース、スクロ ース、炭酸マグネシウムなどを包含する。経口投与のために、薬学上許容される 無毒の組成物は、任意の通常使用される賦形剤、例えば、前に列挙した担体と、 一般に１０〜９５％の活性成分とを混合することによって形成される。 エーロゾル投与のために、複合体は好ましくは微細な形態で、界面活性剤およ び噴射剤と一緒に供給される。界面活性剤は、もちろん、無毒であり、そして好 ましくは噴射剤の中に可溶性である。このような噴射剤の代表的例は、６〜２２ 個の炭素原子を含有する脂肪酸、例えば、カプロン酸、オクタン酸、ラウリン酸 、パルミチン酸、ステアリン酸、リノール酸、リノレン酸、オレステリン酸およ びオレイン酸と、脂肪族多価アルコールまたはその環状無水物、例えば、エチレ ングリコール、グリセロール、エリスリトール、マンニトール、ソルビトール、 ソルビトールから誘導されたヘキシトー ル無水物とのエステルまたは部分的エステル、およびこれらのエステルのポリオ キシエチレンおよびポリオキシプロピレンの誘導体である。混合エステル、例え ば、混合または天然のグリセリドを使用することができる。界面活性剤は組成物 の０．１〜２０重量％、好ましくは０．２５〜５重量％を構成する。組成物の残 部は通常噴射剤である。液化噴射剤は典型的には周囲条件下に気体であり、そし て圧力下に凝縮される。適当な液化噴射剤の例は、５個までの炭素原子を含有す る低級アルカン、例えば、ブタンおよびプロパン；および好ましくはフッ素化ま たはフルオロ塩素化アルカンである。前述の噴射剤の混合を使用することもでき る。エーロゾルの製造において、適当な弁を装備した容器に、微細な化合物およ び界面活性剤を含有する適当な噴射剤を充填する。このようにして、弁により解 放されるまで、成分は高い圧力に維持される。 複合体を含有する組成物は、治療、予防、または診断の用途のために投与する ことができる。治療の用途において、組成物は、前述したように、疾患に既に悩 まされている患者に、疾患およびその合併症の症状を治癒または少なくとも部分 的阻止するために十分な量で投与される。これを達成するために適切な量は、「 治療上有効な投与量」と定義される。この使用に有効な量は、疾患の程度および 患者の体重および一般的症状に依存するであろう。前述したように、これは典型 的には約０．５ｍｇ／ｋｇ〜約２５ｍｇ／ｋｇ、好ましくは約３ｍｇ／ｋｇ〜約 １５ｍｇ／ｋｇである。 予防の用途において、本発明の複合体は特定の疾患が疑われるか、またはそう でなければその危険にある患者に投与される。このような量は「予防上有効な投 与量」と定義される。この使用において、正確な量は再び患者の健康状態および 体重に依存する。投与量は一般に前述の範囲である。 診断の用途において、適当な複合体またはそのカクテルを含有する組成物を自 己免疫疾患を有することが疑われる患者に投与して、この疾患に関連する自己反 応性Ｔ細胞の存在を決定する。また、特定の治療の効能を監視することができる 。これを達成するために十分な量は、「診断上有効な投与量」と定義される。こ の使用において、正確な量は患者の健康状態などに依存するが、一般に０．０１ 〜１０００ｍｇ／投与量、特に１０〜約１００ｍｇ／患者である。 また、治療および診断の使用のためのキットを供給することができる。従って 、本発明の複合体は、通常容器の中の凍結乾燥された形態で提供することができ る。複合体は、標識またはトキシンに接合することができるか、または非接合で あることができ、緩衝剤、例えば、トリス、リン酸塩、炭酸塩など、安定剤、殺 微生物剤、不活性タンパク質、例えば、血清アルブミンなど、および１組の使用 説明書とともにキットの中に含められる。一般に、これらを物質は複合体の量に 基づいて約５重量％より少ない量で存在し、そして通常再びタンパク質濃度に基 づいて少なくとも０．００１重量％の合計量で存在する。しばしば、活性成分を 希釈するために不活性増量剤または賦形剤を含めることが望ましく、ここで賦形 剤は合計の組成物の約１〜９９重量％で存在することができる。複合体に結合す ることができる抗体をアッセイにおいて使用する場合、これは別々のバイアルの 中に通常存在するであろう。抗体は典型的には標識に接合されており、そしてこ の分野においてよく知られている技術に従い処方される。 特記しない限り、本明細書おいて使用するすべての技術および科学用語は、本 発明が属する当業者が普通に理解するのと同一の意味を有する。記載したものに 類似するか、または等しい方法および物質を本発明の実施および試験において使 用できるが、好ましい方法 および物質をここで記載する。 実施例１ＭＨＣクラスＩＩのための細菌の発現ベクターの構築戦略 。Ｓｑｕｉｒｅｓ ｅ ｔ ａｌ．（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９８８）２６３：１６２９７−１６ ３０２）が記載するものから誘導した発現ベクターを使用して、ＭＨＣクラスＩ Ｉ分子を大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の中の発現させた。挿入された遺伝子の発現を 推進するＴ７プロモーターを含有する修飾された発現ベクターの中に、ＭＨＣ遺 伝子を挿入した。全長および切形（△ＴＭ）の両方のＭＨＣ遺伝子を発現させた 。ＭＨＣポリペプチドのトランスメンブレンおよび細胞質的に暴露された領域を コードするヌクレオチド配列を△ＴＭ構築物において欠失した（参照、配列識別 番号：１１および１３）。配列識別番号：１１はＨＬＡ ＤＲ２−Ｄｗ２α−鎖 の成熟全長の形態に相当するＤＮＡ配列を示し、そして配列識別番号：１３はＨ ＬＡ ＤＲ２−Ｄｗ２β−鎖を示す。それぞれ、α−鎖の位置５７７−６９０の 間の領域およびβ−鎖の位置５９５−７１４の間の領域を欠失することによって 、△ＴＭ構築物を作った。 試薬および材料。オリゴヌクレオチドをアプライド・バイオシステムス（Ａｐ ｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）３９２ＤＮＡ合成装置によりβ−シアノエ チルホスホルアミダイト化学を使用して合成し、そしてアプライド・バイオシス テムスＯＰＣカートリッジを製造業者の使用説明書に従い使用して精製した。バ クテリオファージＴ７プロモーターを含有するプラスミドｐＥＴ３ａおよびｐＥ Ｔ１１ｂを、ノバゲン（Ｎｏｖａｇｅｎ）から購入した。プラスミドｐＵＣ１９ およびすべての制限酵素およびＤＮＡ修飾酵素は、ニュー・イングランド・バイ オラブス（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）から購入した。 大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｋ−１２株Ｗ３１１０は、ＡＴＣＣから入手した。細 胞系ＧＭＯ３１０７（ＭＨＣ配列源）は、コリエル・インスチチューチト・フォ ー・メディカル・リサーチ（Ｃｏｒｉｅｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｆｏｒ Ｍｅ ｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）におけるナショナル・インスチチュート・オブ ・ジェネラル・メディカル・サイエンシズ（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕ ｔｅ ｏｆ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）（ＮＩＧＭ Ｓ）寄託機関から入手した。ＧＭＯ３１０７は、その表面に高いレベルのＤＲ２ −Ｄｗ２ヘテロダイマーを発現するＥＢＶ形質転換ヒト細胞系である。 大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）発現プラスミドの構築。ＭＨＣクラスＩＩ分子のため の発現プラスミドを、下記のようにして、ｐＥＴ３ａから構築した。 ｐＥＴ３ａをＥｃｏＲＩで消化し、ＤＮＡポリメラーゼＩ（クレノー断片）で 平滑末端とし、そしてＥｃｏＲＶで消化した。このベクターを再環化し、双方の 制限部位を破壊して、プラスミドｐ２６４０４を発生させた。 プラスミドｐ２６４０５を、下記のようにして、ｐ２６４０４から誘導した。 まず、ｐ２６４０４をＢａｍＨＩで消化し、そして末端をＤＮＡポリメラーゼＩ （クレノー）で充填して平滑末端を発生させた。配列：５’．．．ＣＧＧＡＡＴ ＴＣＣＧ．．．３’（配列識別番号：１５）の合成リンカーを破壊したＢａｍＨ Ｉ部位の中に導入し、このようにしてそれを新しいＥｃｏＲＩ部位を置換した。 プラスミドｐ２６４０５をＮｄｅＩおよびＥｃｏＲＩで破壊し、そして下記の 配列の合成リンカーを挿入することによって、プラスミドｐ２６４１１を発生さ せた： このリンカーは、ｐｈｉ−１０オープンリーディングフレームの最初の１４コ ドン（カプラー）を提供し、そして挿入されたＭＨＣ遺伝子の引き続く発現のた めの適切なリーディングフレームの中に位置するＢａｍＨＩ部位を有する。Ｂａ ｍＨＩ部位の下流にＨｉｎｄＩＩＩクローニング部位が存在し、後者はＥｃｏＲ Ｉと一緒にインサートの方向的クローニングのための２つの下流の部位を提供す る。 クローニングを促進するために、ｐ２６４１１の中のＢａｍＨＩ部位の１つを 破壊してプラスミドｐ２７３０５を発生させた。ｐ２６４１１をＥｃｏＲＩ＋Ｐ ｓｔＩで消化し、そして３３８７ｂｐの断片を回収した。ｐ２６４１１をまたＢ ａｍＨＩおよびＰｓｔＩで消化し、そして８９１ｂｐの断片を回収した。配列： の合成リンカーを作り、そしてｐ２６４１１の２つの断片を結合してｐ２７３０ ５を発生させた。このリンカーは双方のＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩ粘着末端を 有するが、結合のときＥｃｏＲＩ部位のみを再生するであろう。さらに、それは 将来の下流の操作のためのＳｎａＢＩ（平滑）クローニング部位を有する。 プラスミドｐ２７３１３はｌａｃＩqリプレッサータンパク質をｐ２７３０５ 上に組み込んで、誘導前の標的遺伝子の望ましくない転写を抑制する。ｐ２７３ ０５をＢａｍＨＩおよびＰｓｔＩで消化し、そして９１７ｂｐの断片を回収した 。プラスミドｐＥＴ１１ｂ を同様に処理し、そして４６０８ｂｐの断片を回収した。２つの断片を結合する と、最終の形態の発現プラスミドｐ２７３１３が生じた。 ＤＲ２−Ｄｗ２アルファおよびベータ鎖の遺伝子の構築。製造業者の使用説明 書に従いファスト・トラック（Ｆａｓｔ Ｔｒａｃｋ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ）を使用して、５．０×１０7生活可能なＧＭＯ３１０７からポリ−Ａ+ｍＲＮＡ を調製した。 製造業者の使用説明書に従いクロンテク（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）第１鎖ｃＤＮＡ 合成キットを使用して、２５ｎｇのポリ−Ａ＋ｍＲＮＡからｃＤＮＡを調製した 。 ヒトＨＬＡＤＲ２−Ｄｗ２α（ｄｒａ）（Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．（１９８７） Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８４：４５９１−４５９７）お よびβ（ＤＲＢ５＊０１０１）（Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．（１９８４）Ｎａｔｕｒ ｅ ２９９：７５０−７５２）鎖の遺伝子についての配列情報は、遺伝子バンク のデータベースから入手した。成熟遺伝子産物または切形（△ＴＭ）形態の各鎖 のＰＣＲ増幅のために、プライマーを設計した。各鎖の「上部鎖」プライマーは 、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）発現系において使用した翻訳カプラーに相当するｐｈ ｉ−１０遺伝子の部分を含んだ。 ＤＲ２−アルファ鎖： 「上部鎖」 全長の「下部鎖」 切形（△ＴＭ）「下部鎖」 ＤＲ２−ベータ鎖： 「上部鎖」 全長の「下部鎖」 切形（△ＴＭ）「下部鎖」 増幅後、ＰＣＲ生成物をＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩで消化し、そして同様に 処理したプラスミドｐＵＣ９の中にサブクローニングした。組換えクローンを同 定しそして配列決定した。組換えα−およびβ−鎖の遺伝子を含有するプラスミ ドを、それぞれ、ｐ２６４１６およびｐ２６４１７と表示した。α鎖の配列分析 は発表された配列の塩基６４９における点突然変異（Ｇ→＞Ｔ）を明らかにした 。この突然変異は全長の成熟遺伝子産物の残基２１７におけるバリンからロイシ ンへの置換を生ずる。発表された配列からの偏りはβ−鎖において観察されなか った。 全長の発現構築物。プラスミドｐ２６４１６およびｐ２６４１７をＢａｍＨＩ およびＥｃｏＲＩで処理した。α−およびβ−鎖に相当する断片を発現ベクター ｐ２７３１３の中にサブクローニングした。組換えクローンを制限分析により同 定し、そして表示ｐ２７ ３１７（α−鎖）およびｐ２７３１６（β−鎖）を与えた。 △ＴＭ発現構築物。切形α−およびβ−鎖の遺伝子のＰＣＲ増幅を、前述のＰ ＣＲプライマー対を使用して実施した。プラスミドｐ２６４１６およびｐ２６４ １７を、それぞれ、α−およびβ−鎖のための標的ＤＮＡとして使用した。ＰＣ Ｒ生成物をＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩで消化し、そして同一酵素で処理して全 長のβ−鎖を除去したプラスミドｐ２７３１６の中に結合した。生ずるプラスミ ドをｐ２６４９５（α−△ＴＭ）およびｐ２６４９６（β−△ＴＭ）と表示した 。 実施例２ 大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）におけるＭＨＣクラスＩＩ分子の発現宿主株Ｗ３１１ ０／ＤＥ３の構築 。製造業者の使用説明書に従い、ノバゲンからＤＥ３溶原化キ ットを使用して、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株Ｗ３１１０をファージラムダ−ＤＥ ３（Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子のコピーを有する）について溶原性とした。 組換えクローンの誘導。プラスミドｐ２７３１６、ｐ２７３１７、ｐ２６４９ ５およびｐ２６４９６を宿主株Ｗ３１１０／ＤＥ３の中に形質転換した。 ０．４％のグルコースおよび１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有するＬＢ の中で３７℃において、培養物を増殖させた。細胞を対数中期成長においてイソ プロピル−β−ｂ−Ｄ−チオ−ガラクチピラノシド（ＩＰＴＧ）（０．４ｍＭの 最終濃度）の添加により誘導し、そして３７℃において増殖させた。周期的試料 を取り、そしてプロセシング前に氷上で冷却した。 細胞を５０００×ｇ、４℃において１０分間遠心することによって収獲した。 細胞をＴＥ（１０ｍＭのＴｒｉｓ−Ｃｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ８．０）の中 に０．０２ＯＤ600／μｌを生ずるため に適当な体積で再懸濁させた。等しい体積の細胞懸濁液および０．３Ｍの２−メ ルカプトエタノールを含有する２×ＳＤＳ−試料を添加し、そして５分間沸騰さ せることによって、還元試料を調製した。１０μｌの試料を１２％ＳＤＳ−ゲル に適用しそして、電気泳動後、タンパク質をクーマッシー・ブリリアント・ブル ーの染色により可視化した。 溶解度の試験のために、２００μｌの細胞懸濁液をマイクロ−チップで４の設定 において３×１０秒間氷上で超音波処理した。１２，０００×ｇ、４℃において １０分間遠心することによって、不溶性物質を可溶性物質から分離した。不溶性 物質（封入体）を１回５００μｌの冷ＴＥで洗浄し、そして再回転した。次いで ペレットを吸引し、そして０．３Ｍの２−メルカプトエタノールを含有する４０ ０μｌの１×ＳＤＳ−試料緩衝液の中に溶解し、そして沸騰させた。 ｒＤＲ２αおよびβ鎖の精製。トランスメンブレン領域をもつか、またはもた ない組換えＤＲ２αおよびβ鎖を、Ｐａｓｓｍｏｒｅ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｉｍｍ ｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．１５５：１９３−２００（１９９２）に一般的に記載され ているように、調製用電気溶出により精製した。８Ｍの尿素および１０ｍＭのＤ ＴＴの中の６ｍｇ／ｍｌの濃度の封入体調製物を同一緩衝液に対して１６時間透 析した：２５ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ６．８および０．２５％のＳＤＳ。 １３．５％の分離ゲルおよび４％のスタッキングゲルを含有するバイオ−ラド（ Ｂｉｏ−Ｒａｄ）プレプ・セル（Ｐｒｅｐ Ｃｅｌｌ）装置上に、２ｍｇの試料 を負荷した。溶出の間に電気泳動を４０ｍＡの一定電流において実施した。１ｍ ｌ／分の流速で３６０分に開始して、画分（３ｍｌ）を集めた。溶出した画分を １３．５％の非還元性ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび引き続く銀染色 により分析した。ポリアクリルアミドゲルの分析に基づいて、αおよびβモノマ ーをプールし、そしてアミコン・セントリプレプ（Ａｍｉｃｏｎ Ｃｅｎｔｒｉ ｐｒｅｐ）１０ｋ分子量カットオフ濾過系で濃縮した。最終のモノマー調製物を 、０．０１％のツイーン８０および０．０２％のアジドを含有するＰＢＳに対し て透析した。収率をロウリイ（Ｌｏｗｒｙ）アッセイにより計算し、典型的な回 収は負荷タンパク質の１５〜３０％の範囲であった。この方法により精製された ＭＨＣポリペプチドは検出可能な汚染物質を含有しなかった。 結果。ＤＲ２−Ｄｗ２の成熟全長のα−およびβ−鎖ならびに推定上のトラン スメンブレンおよび細胞質テイル領域を欠如する各々の切形形態のクローンを構 築し、そして大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）における発現のためのＴ７発現ベクターの 中に挿入した。 本明細書において使用したα鎖クローンは、発表された配列に比較して、塩基 ６４９においてヌクレオチドの置換を含有する。この差は、全長の産物のアミノ 酸２１７においてバリン残基の代わりにロイシン残基の置換を生ずる。この残基 は分子のトランスメンブレン部分内に存在し、従って△ＴＭ構築物の中に存在し ない。バリン置換についてロイシンの保存的特質、およびトランスメンブレン領 域内のその位置のために、突然変異はＴ細胞とのペプチドの結合および相互作用 に関するそれ以上の実験に対する有意な妨害と考えられなかった。 Ｗ３１１０／ＤＥ３における全長および切形の双方の構築物の誘導は、ＳＤＳ −ＰＡＧＥにより評価して期待した大きさまたはそれに近い大きさのタンパク質 の実質的な蓄積を生じた。評価した４つのタンパク質の各々についての長さおよ び期待した分子量の要約は、下記の通りである。 細胞の超音波処理および遠心による可溶性および不溶性画分の分離後、標的遺 伝子産物はすべての構築物において可溶性（封入体）の中に位置した。 ＤＲ２−Ｄｗ２アルファ鎖の全長および△ＴＭの産物の最初の５残基のＮＨ2 −末端のアミノ酸の配列決定は、多分大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）によるそのｉｎ ｖｉｖｏ除去のために、メチオニン残基が第１位置の中に見出された以外、天然 産物について予測されるアミノ酸配列と正確に合致した。２つのβ−鎖遺伝子産 物の最初の５残基のＮＨ2−末端の配列分析は、第１位置にメチオニンが存在し ないこの鎖について期待された成熟配列と正確に合致した。 大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）発現のα−およびβ−鎖は、ペプチドならびに天然由 来の物質の単離された鎖に結合する。従って、変性された単一の鎖は多少のレベ ルのコンフォメーション（複雑なリフォルディング手順を使用しないで）を達成 することができ、これによりそれらはペプチドに結合することができる。 複合体のリフォルディングの工程は必要であると思われないが、結合効率の改 良は一本鎖部分の制御された復元後に実現することができるであろう。 実施例３組換えＭＨＣポリペプチドへの抗原性ペプチドの結合 ２００μｇ／ｍｌの濃度の精製された鎖および４００μｇ／ｍｌ の濃度のＤＲ２二量体を、放射性標識化ＭＢＰ（８３−１０２）Ｙ83ペプチドま たはＭＢＰ（１−１４）ペプチドと、３７℃において９６時間インキュベートし た。３μｇの試料１３．５％のポリアクリルアミドＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で非還元 性条件下に分析した。ゲルを銀染色により染色し、オートラジオグラフィーに付 し、そして各鎖に関連する放射能を計数した。標識化ペプチドで占有された鎖の 百分率を、それぞれのペプチドの比活性から計算した。 第１図における結果は、ｒＤＲ２β（−ＴＭ）が最大のペプチドに結合し、次 いでｒＤＲ２α（＋ＴＭ）およびｒＤＲ２β（＋ＴＭ）であることを示す。ｒＤ Ｒ２α（−ＴＭ）は、ＭＢＰ（８３−１０２）Ｙ83ペプチドの有意な結合を示さ なかった。さらに、組換え鎖は、等モル量のＤＲ２天然ヘテロダイマーに比較し て、増加した結合を示した。これらの結果は４つの異なる実験において再現性が あった。同一のミエリン塩基性タンパク質ＭＢＰ（１−１４）からの同等量の他 のエピトープと鎖をインキュベートすることによって、ペプチドの結合の特異性 は証明された。すべての場合において、ＭＢＰ（１−１４）の結合は無意味であ った。 ｒＤＲ２鎖と放射性標識化ペプチドとの連合および解離の速度論。結合反応速 度を前述したように同様に測定した。２００μｇ／ｍｌの濃度の鎖を３７℃にお いて標識化ペプチドとインキュベートした。種々の時間において、１５μｌの試 料を取り出し、４℃に冷却し、そして１３．５％のＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で分析し た。ペプチドの占有％を前述したように比活性から計算した。鎖−ペプチド複合 体の安定性を０℃および３７℃において比較した（第２図）。一本鎖−ペプチド 複合体は、ヘテロダイマーの天然のＤＲ２−ペプチド複合体と同様に安定である ように思われた。 実施例４ビオチニル化抗原性ペプチドを使用するペプチド結合アッセイ 前述したように慣用の調製用クロマトグラフィー法により精製された、４つの 組換え鎖、ｒＤＲ２α（＋ＴＭ）、ｒＤＲ２α（−ＴＭ）、ｒＤＲ２β（＋ＴＭ ）、ｒＤＲ２β（−ＴＭ）を使用して、結合の研究をさらに実施した。ビオチニ ル化ＭＢＰ（８３−１０２）Ｙ83、ビオチニル化ＭＢＰ（１２４−１４３）およ びビオチニル化ＭＢＰ（１−１４）ペプチドを結合アッセイのために使用した。 ０．２ｍｇ／ｍｌの濃度の組換え鎖を５０倍モル過剰のビオチニル化ＭＢＰペプ チドとインキュベートした。ビオチニル化ペプチドで占有された鎖の百分率の定 量のために、生ずる複合体を酵素複合化アビジン系を使用するプレートアッセイ において分析した。１ｍｇ／５０ｍｌのアフィニティー精製したＬ２４３モノク ローナル抗体、ポリクローナル抗アルファおよびポリクローナル抗ベータを、９ ６ウェルのマイクロタイタープレート上で、それぞれ、ＤＲ２、αおよびβ鎖（ トランスメンブレン領域を含むか、または含まない）のためにコーティングした 。ポリクローナル抗αおよび抗β抗体を、免疫化ウサギから、抗原結合セファロ ーズ−４Ｂカラム上で精製した。アッセイの目盛り定めは、既知量のビオチニル 化ＢＳＡをコーティングすることによって達成した。複合体の捕捉後、結合しな いペプチドを洗浄により除去し、次いでアビジン−アルカリ性ホスファターゼと インキュベートした。結合しない複合体を洗浄により除去し、そして比色基質（ Ｓｉｇｍａ １０４）を４０５ｎｍの吸収を測定する酵素産物の検出に添加した 。 天然のＨＬＡ−ＤＲ２はペプチドＭＢＰ（８３−１０２）Ｙ83およびＭＢＰ（ １２４−１４３）に対して高い親和性を有するが、ＭＢＰ（１−１４）に対して 親和性をもたないことが示された。第３図に提示されている結果は、精製された 組換えポリペプチド鎖が、 天然のヘテロダイマーと同様に、ＭＢＰ（８３−１０２）Ｙ83およびＭＢＰ（１ ２４−１４３）の双方のペプチドに結合することができた。ＭＢＰ（１−１４） はいずれの精製鎖調製物に対しても有意な結合を示さなかった。最大の結合のた めに最適なｐＨはすべての場合において天然のＤＲ２と異なった。 実施例５Ｔ細胞レセプターの占有アッセイ ヘルペスウイルスｓａｉｍｉｒｉ（ＨＶＳ）形質転換ＳＳ８ＴヒトＴ細胞クロ ーン（Ｈ．Ｗｅｋｅｒｌｅ、Ｍａｘ Ｐｌａｎｋ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｆｏｒ Ｐｓｙｃｈｉａｔｙ、Ｍｕｎｉｃｈ Ｇｅｒｍａｎｙ、により提供された、参 照、Ｗｅｂｅｒ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：１１０４９−１１０５３（１９９３））（これはＤＲＢ５＊０１０１に 関してＭＢＰ（８３−１０２）Ｙ83を認識する）を、２ｍＭのＬ−グルタミン、 １００単位／ｍｌのペニシリン、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン、１０％ の胎仔ウシ血清（Ｈｙｃｌｏｎｅ）および５０単位／ｍｌのヒトＩＬ−２（ＡＢ Ｉ）を補充したＲＰＭＩ１６４０培地の中で３７℃において培養した。１日置き に、細胞を新しい培地に移した。実施例４に示す結果に基づいて、４つの精製さ れた組換え鎖とＭＢＰ（８３−１０２）Ｙ83およびＭＢＰ（１２４−１４３）ペ プチドとの複合体をｉｎ ｖｉｔｒｏ機能的アッセイにおいて使用するために調 製した。種々の複合体調製物をマイクロタイター組織培養プレートの中に１０％ ｖ／ｖの最終濃度で添加し、そして細胞をＩＬ−２を含まない２００μｌの培地 の中に２０，０００／ウェルの密度で添加した。３７℃において４８時間インキ ュベートした後、ガンマ−ＩＦＮレベルの増加について試験するために、上澄み を各ウェルから集めた。ガンマ−ＩＦＮの検出のた めに、ヌンク・マクシソーブ（Ｎｕｎｃ Ｍａｘｉｓｏｒｂ）の９６ウェルのプ レートを０．５μｇ／ウェルの濃度の抗ヒトガンマ−ＩＦＮモノクローナル抗体 でコーティングし、そして４℃において一夜インキュベートした。ウェルを０． １％のＢＳＡでブロックし、そして試料を室温において２時間インキュベートし た。１０００、５００、１００、５０、１０、５、１、０．５、０．１単位／ｍ ｌ（２７０単位／ｍｌ＝１０．７５ｎｇ／ｍｌ）の希釈範囲でガンマ−ＩＦＮを 使用することによって、標準曲線を発生させた。次いで、１μｇ／ｍｌの濃度の ウサギ抗ヒトガンマ−ＩＦＮを添加し、そしてプレートを室温においてさらに２ 時間インキュベートした。ウェルをよく洗浄し、そして８００ｎｇ／ｍｌの濃度 のＨＲＰ接合ヤギ抗ウサギと３７℃において１時間インキュベートした後、基質 としてＴＭＢを使用して発色させた。５分において２Ｎ硫酸で反応を停止させ、 そして吸収を４５０ｎｍにおいて測定した。 Ｔ細胞のガンマ−ＩＦＮ生産の増加は、特異的リガンドによるＴＣＲ占有後に 起こることが示された。天然のＤＲ２とＭＢＰ（８３−１０２）Ｙ83ペプチドと の複合体を、このアッセイにおいて陽性の対照として使用した。ガンマ−ＩＦＮ 生産の増加の特異性は、すべての実験において天然のＤＲ２または鎖と無関係の 高い親和性のＭＢＰ（１２４−１４３）ペプチドとの複合体により証明された。 同様に、ＤＲ３とＭＢＰ（８３−１０２）Ｙ83ペプチドとの複合体を使用して、 ＳＳ８ＴクローニングしたＴ細胞のＨＬＡ−ＤＲ２による制限を証明した。アル ファ鎖（Ｔｍを含むか、または含まない）およびベータ鎖（Ｔｍを含むか、また は含まない）の複合体を使用して得られた結果を、第４図および第５図に示す。 これらの結果が明瞭に示すように、ＭＨＣクラスＩＩ一本鎖−ペプチド複合体 は抗原性ペプチドと天然のヘテロダイマーとの複合体 と同様に機能する。 実施例６組換え的に生産されたＩ−ＡSα鎖を使用するＥＡＥの処理 この実施例は、ｉｎ ｖｉｖｏでアネルギーを誘導する本発明の組換え的に生 産された一本鎖複合体の能力を証明する。これらの実験は、ＳＪＬ／Ｊマウスに おけるＥＡＥの防止を証明する。本発明の方法を使用して、ＩＡSのα鎖を組換 え的に発現させた。簡単に述べると、ＰＣＲプライマーを遺伝子バンクにおいて 入手可能な遺伝子配列に基づいて調製して、マウス脾細胞から遺伝子を単離した 。前述したように、発現ベクターｐ２７３１３を使用して、生ずる遺伝子を発現 させた。 Ｓｈａｒｍａ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８：１１４６５−１１４６９（１９９１）に記載されているように、１×１ ０７のＭＢＰ（９１−１０３）反応性Ｔ細胞のアダプター的転移により、ＥＡＥ を誘導した。前述したように調製したＭＢＰ９１−１０３または１−１４と複合 化したＩＡSのα鎖を使用して、この実験を実施した。第０、２、４、および６ 日に、Ｓｈａｒｍａ ｅｔ ａｌ．に記載されているように４０μｇの複合体を 各マウスに与えた。本明細書において見られるように、ＰＢＳ単独または無関係 の複合体（ＭＢＰ（１−１４）と複合化したＩ−ＡS）を与えた動物は麻痺を示 したが、関係する複合体（ＭＢＰ（９１−１０３）と複合化したＩ−ＡS）を与 えた動物はそれを示さなかった。 実施例７大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）におけるＭＨＣの発現のためのユビキチン融合発現系 大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）における融合タンパク質の生産において ユビキチンをコードする酵母遺伝子を使用することは、Ｍｉｌｌｅｒ ｅｔ ａ ｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ７：６９８−７０４（１９８９）に記載され ている。この系において、ＵＰＰ切断部位を含有する酵母ユビキチン遺伝子の最 初の７６残基に対してＣ−末端の融合として、問題の遺伝子は生産される。２つ の部分の複合部における切断は、無傷の真性のＮ−末端の残基を有するタンパク 質を生成する。 このような切断部位の例は、酵母ユビキチンタンパク質ペプチダーゼ（ＵＰＰ ）およびユビキチン特異的プロテアーゼ（ＵＢＰＩ）により認識されるユビキチ ン配列である。ＵＰＰはＹＵＨ１遺伝子の産物であり、そして大腸菌（Ｅ．ｃｏ ｌｉ）の中で活性形態で発現させ、そして融合接合部においてユビキチン−タン パク質融合物をｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏで切断することができる （Ｍｉｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．、前掲）。ＵＰＰによる切断効率は、融合産物の 長さにより影響を受けることが示され、そして２０Ｋｄより大きい融合物の切断 はしばしば非効率的である。しかしながら、ＵＢＰ１はＴｏｂｉａｓおよびＶａ ｒｓｈａｖｓｋｙ、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６６：１２０２１（１９９１） によりＵＰＰの同一タンパク質分解性質を有することが示されたか、融合物の大 きさにより影響を受けない。 ユビキチン−ＤＲ２融合物の予測される大きさがＭr３０７３８であること、 およびＵＰＰによる切断がこの大きさのタンパク質では非効率的であるという発 見を考慮して、ＵＢＰ１はこの系のために好ましい。 大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）において「真性の」ＭＨＣクラスＩＩ鎖を生産するた めに、ユビキチン系を使用する２つのアプローチを用いることができる。第１に 、ＵＰＰまたはＵＢＰ１をクローニング しそして大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の中で発現させ、そして誘導された細胞からの 細胞抽出物をｉｎ ｖｉｔｒｏで使用して融合タンパク質（別々に作られるであ ろう）を切断することができるであろう。第２に、ＵＰＰ調製ＵＢＰ１をＭＨＣ ＩＩ鎖との同時発現のためにｉｎ ｖｉｖｏで融合して、粗細胞抽出物から直接 「真性の」ＭＨＣＩＩを生産することができるであろう。 ユビキチン融合ベクターｐ２７３４０の構築。ユビキチンのコーディング領域 の７６アミノ酸をコードする配列を、ＰＣＲにより酵母ゲノムＤＮＡから増幅し た。プライマーを遺伝子バンクにおけるＵｂｉ６に基づいて設計した。プライマ ーは下記の通りであった： Ｕｂｉ「上部」プライマー このプライマー配列はｐｈｉ−１０カプラー領域を含み、そして下線が引かれ ている配列は実際のユビキチン５’配列を表す。 Ｕｂｉ「逆」プライマー 融合クローニングのための制限部位をつくるように塩基配列を変更するが、こ の分子のアミノ酸配列を維持することによって、ユニークＳａｃＩＩ部位を発生 させる。 前述のｐ２７３１３をＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩで消化し、そ して５５００ｂｐの断片を同一酵素で消化した２５９ｂｐのｕｂｉ−７６ＰＣＲ 生成物と結合することによって、所望の融合産物の生産のための発現ベクターｐ ２７３４０を発生させた。 ｐ２７３４０を使用して任意の遺伝子をユビキチン遺伝子に融合して融合産物 を作ることができ、次いでこの融合産物を特別に切断して所望のＮ−末端のタン パク質を生成することができる。このベクターはアンピシリンで選択可能である 。 そのトランスメンブレン領域を欠如するＤＲアルファ鎖をコードする核酸をｐ ２７３４０の中でクローニングし、そして３０，７５８ダルトンの期待する分子 量の融合産物として発現させた。ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルは、プラスミドｐ２６４ ９５からの発現産物に類似する二重バンドの存在を示した。 ｐ２７３５１およびｐ２７３７３の構築。ＤＲアルファ鎖の配列をＰＣＲによ り増幅して、全長の配列ならびにトランスメンブレンドメインおよび細胞質ドメ インを欠如する配列を発生させた。ユビキチン７６配列にこれらの配列を融合さ せるために設計したＰＣＲプライマーは下記の通りであった： アルファ−ｕｂｉ７６プライマー（上部鎖） ＳａｃＩＩ部位を含んでなる配列は、ｕｂｉ−７６遺伝子に融合したとき、ユ ビキチン切断部位を再生する。下線が引かれている配列は、その開始メチオニン コドンをもたないＤＲアルファ鎖を表す。 アルファＦ／Ｌプライマー（下部鎖） アルファ△ＴＭプライマー（下部鎖） アルファ△ＴＭ−１０プライマー（下部鎖） ｐ２７３４０をＳａｃＩＩおよびＥｃｏＲＩで消化し、そして５７４０ｂｐの 断片を同一酵素で消化したＤＲ△ＴＭアルファＰＣＲ生成物の５８９ｂｐの断片 と結合することによって、ｐ２７３５１を発生させた。プラスミドｐ２７３７３ は、トランスメンブレンドメインを欠如しそしてユビキチン７６配列に融合した 細胞外ドメインからさらに１０残基を欠如するＤＲアルファを発現する。 ｐ３２９４１の構築。ｐ２７３１７のＰＣＲ増幅により、ＤＲアルファの全長 の配列を得た。ＰＣＲプライマーを制限酵素部位ＳａｃＩＩおよびＥｃｏＲＩを 含有するように設計し、そしてこれらを使用してＰＣＲ増幅断片をｐ２７３４０ の中にサブクローニングした。 このプラスミドを発現宿主Ｗ３１１０／ＤＥ３の中に形質転換した。増殖およ びＩＰＴＧ誘導後、期待した分子量Ｍr＝３４，６２５のユビキチン７６＋ＤＲ アルファＦ／Ｌの融合タンパク質の発現が観察された。 実施例８追加の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＭＨＣＩＩ発現プラスミド １０残基だけ短いＤＲアルファ△ＴＭ鎖の発現のためのｐ２８５２４の構築。 プラスミドｐ２６４９５はｐＥＴ発現系においてＤＲアルファ△ＴＭ鎖を発現す る。ＩＰＴＧ誘導すると、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルは期待した分子量の二重のバン ドを示す。これらのバンドを最初の５Ｎ−末端残基について配列決定し、そして 双方はアルファ鎖について正しい配列を与えた。プラスミドｐ２８５２４を構築 して、ＤＲアルファ△ＴＭ鎖のなおいっそう切形のバージョンを発生させた。こ の配列を下記のプライマーを使用してＰＣＲ増幅した。 上部鎖プライマー： 下部鎖プライマー： ＰＣＲ生成物をＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩで消化し、そして同一酵素で消化し たｐ２７３１３の中にクローニングした。 テトラサイクリン耐性を有する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）発現プラスミドの構築 。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）におけるＭＨＣクラスＩＩ一本鎖の発現のために、下 記のプライマーを構築した。前述のプラスミドｐ２６４９５、ｐ２６４９６、ｐ ２７３１６およびｐ２７３１７は、アンピシリン耐性の存在において△ＴＭおよ び全長のＤＲアルファおよびベータ鎖を発現する。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株の 培養の規模を大きくするために、アンピシリンはａｍｐ耐性プラスミドを含有す る細胞により分泌されるβ−ラクタマーゼのために急速に分解するので、それは 有効な抗生物質ではない。従って、テ トラサイクリン耐性遺伝子を上記プラスミドの中にクローニングして、プラスミ ドを発酵条件下にいっそう安定性とした。 ｐ２７３２９およびｐ２７３３０の構築。ｐＢＲ３２２を標的としてそして下 記のプライマーを使用してＰＣＲにより、テトラサイクリン耐性遺伝子を増幅し た： 上部鎖プライマー： 下部鎖プライマー： ｐ２７３１６をＡｖａＩで線状化しそして仔ウシ腸ホスファターゼで６２４５ ｂｐの断片をホスファターゼ化することによって、ｐ２７３２９を発生させた。 この断片をＡｖａＩで消化したテトラサイクリンＰＣＲ生成物に結合した。生ず るプラスミドは、アンピシリンおよびテトラサイクリンの双方のマーカーの存在 においてＤＲＢ５＊０１０１全長鎖を発現する。 ＡｖａＩ消化ｐ２７３１７を使用して出発しそしてテトラサイクリンＰＣＲ生 成物の中のクローニングする同様な操作により、ｐ２７３３０を発生させた。生 ずるプラスミドは、アンピシリンおよびテトラサイクリンの双方のマーカーの存 在においてＤＲアルファ全長鎖を発現する。 ｐ３２９１２９およびｐ３３４３５の構築。テトラサイクリン遺伝子を制限消 化によりｐ２８５２４およびｐ２６４９６の中にクローニングした。プラスミド ｐ２６４９５またはｐ２６４９６をＸｂａＩおよびＡｖａＩで消化した。生ずる ３７３６ｂｐの断片を、ＸｂａＩ＋ＡｖａＩ＋ＰｓｔＩでｐ２７３２９を消化し て発生した ３５０７ｂｐの断片に結合した。生ずるプラスミドは、アンピシリンおよびテト ラサイクリンの双方のマーカーの存在においてＤＲアルファおよびベータ△ＴＭ 鎖を発現する。 実施例９ＭＨＣクラスＩＩ一本鎖を発現する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株の発酵 １０リットルのマイクロファーム（ｍｉｃｒｏｆｅｒｍ）系をニュー・ブルス ウィック・サイエンティフィック（Ｎｅｗ Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ Ｓｃｉｅｎｔ ｉｆｉｃ）から購入した。この系は、ｐＨ、ｄＯ2、温度、および撹拌速度を監 視しかつ制御することができる特徴を含んでいた。さらに、この系に発酵ブロス への培地の連続的供給において使用するポンプを装備した。 大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）宿主Ｗ３１１０／ＤＥ３において発現されたすべての ＭＨＣクラスＩＩ一本鎖を、典型的には発酵条件下に発現させて、高い収量のタ ンパク質を得た。誘導はほぼ２０のＯＤ600において実施した。細胞を誘導後２ 時間に収獲し、そして封入体の製造のために処理した。典型的な発酵実験は５０ ０ｇの規模で湿潤細胞ペーストを発生し、これは−２０℃において凍結し、そし てバッチにおける溶解について処理した。 上記実験は本発明を例示するために提供され、本発明の範囲を限定しない。本 発明の他の態様は当業者にとって明らかであり、そして添付した請求の範囲の中 に包含される。本明細書において引用したすべての刊行物、患者、および特許出 願は引用することによって本明細書の一部とされる。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ Ａ６１Ｋ 39/385 ＡＢＪ 9356−4Ｈ Ｃ０７Ｋ 14/74 Ｃ０７Ｋ 14/74 7804−4Ｂ Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｎ 1/21 9637−4Ｂ Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ Ｃ１２Ｐ 21/02 9051−4Ｃ Ａ６１Ｋ 37/02 ＡＢＡ //(Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19）

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．抗原性ペプチドに結合しそして変更されたグリコシル化を有する組換えＭ ＨＣポリペプチドを含んでなる組成物。 ２．前記ＭＨＣポリペプチドがトランスメンブレンドメインを欠如する、請求 項１に記載の組成物。 ３．前記ＭＨＣポリペプチドがそれをコードするヌクレオチド配列を含有する 発現ベクターを含んでなる原核宿主細胞により発現される、請求項１に記載の組 成物。 ４．原核細胞が大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）である、請求項３に記載の組成物。 ５．前記ＭＨＣポリペプチドと連合した第２ＭＨＣポリペプチドをさらに含ん でなり、これによりヘテロダイマーＭＨＣ分子を形成する、請求項１に記載の組 成物。 ６．前記ポリペプチドがＭＨＣクラスＩＩ遺伝子からの配列によりコードされ る、請求項１に記載の組成物。 ７．前記ポリペプチドがＭＨＣクラスＩＩ分子のβサブユニットである、請求 項１に記載の組成物。 ８．ａ）ＭＨＣポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含んでなる発現 ベクターを含有する原核細胞を、前記ポリペプチドが発現されるような条件下に 、培養において増殖させ、そして ｂ）前記ＭＨＣポリペプチドを単離する、 ことを含んでなる、ＭＨＣポリペプチドを生産する方法。 ９．細胞が２つのＭＨＣポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含んで なる、請求項７に記載の方法。 １０．請求項８に記載の方法により生産された単離されたＭＨＣポリペプチド 。 １１．原核性プロモーター配列に作用可能に連鎖されたＭＨＣポリペプチドを コードするヌクレオチド配列を含んでなる原核発現ベクター。 １２．前記ＭＨＣポリペプチドをコードするヌクレオチド配列がシグナル配列 をコードするヌクレオチド配列に作用可能に連鎖されている、請求項１１に記載 のベクター。 １３．前記ヌクレオチド配列が切形ＭＨＣポリペプチドをコードする、請求項 １１に記載のベクター。 １４．前記ＭＨＣポリペプチドがトランスメンブレンドメインを欠如する、請 求項１３に記載のベクター。 １５．請求項１１に記載のベクターを含んでなる原核細胞。 １６．前記細胞が大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）である、請求項１５に記載の細胞。 １７．抗原性ペプチドと、請求項１に記載の単離された組換えＭＨＣポリペプ チドとから本質的に成るＭＨＣ−ペプチド複合体。 １８．前記抗原性ペプチドが前記ＭＨＣポリペプチドと非共有結合で連合され ている、請求項１７に記載の複合体。 １９．前記ＭＨＣポリペプチドが可溶性である、請求項１７に記載の複合体。 ２０．前記抗原性ペプチドが約８〜約１８アミノ酸から成る、請求項１７に記 載の複合体。 ２１．前記ペプチドが自己免疫疾患に関連する自己抗原性ペプチドである、請 求項１７に記載の複合体。 ２２．前記ペプチド上のエピトープが多発硬化症、慢性関節リウマチ、または 重症筋無力症に関連する自己反応性Ｔ細胞により認識される，請求項１７に記載 の複合体。 ２３．前記ペプチドがヒトＡＣｈＲαサブユニットの残基１３８ −１６７、ヒトＭＢＰの残基８４−１０２、またはヒトＭＢＰの残基１４８−１ ６２を含んでなる、請求項１７に記載の複合体。 ２４．前記ＭＨＣポリペプチドがクラスＩＩのＭＨＣである、請求項１７に記 載の複合体。 ２５．製薬上許容される担体と、請求項１７に記載のＭＨＣ−ペプチド複合体 とを含んでなる医薬組成物。 ２６．前記複合体がリポソームの中に埋め込まれている、請求項２５に記載の 医薬組成物。