CN101580540B

CN101580540B - 与mhc-ⅰ类分子结合的鼠ⅲ型肝炎病毒多肽表位及应用

Info

Publication number: CN101580540B
Application number: CN2009101041328A
Authority: CN
Inventors: 朱波; 龙海霞; 林治华; 陈正堂
Original assignee: Second Affiliated Hospital of TMMU
Current assignee: Second Affiliated Hospital of TMMU
Priority date: 2009-06-19
Filing date: 2009-06-19
Publication date: 2012-05-23
Anticipated expiration: 2029-06-19
Also published as: CN101580540A

Abstract

本发明涉及与细胞膜表面主要组织相容性复合物I类分子结合的鼠III型肝炎病毒多肽表位，以及编码这些多肽表位的DNA序列，这些多肽表位通过与MHC-I类分子结合，从而产生鼠III型肝炎病毒特异性细胞毒性T淋巴细胞，对小鼠的MHV感染起到免疫保护及免疫治疗效果，从而预防鼠类MHV感染及治疗小鼠肝炎，因此可作为多肽药物疫苗来治疗小鼠肝炎。

Description

与MHC-Ⅰ类分子结合的鼠Ⅲ型肝炎病毒多肽表位及应用

技术领域

本发明涉及生物医药工程技术领域，包括筛选获得与主要组织相容性复合物I(MHC-I)类分子结合的鼠III型肝炎病毒多肽表位，以及编码这些多肽的DNA、RNA，由于这些多肽与MHC-I类分子的结合位点进行结合，可激活特异性的细胞毒性T淋巴细胞(CTL细胞)；因此，本发明还涉及所述与MHC-I类分子结合的鼠III型肝炎病毒多肽表位在药学上的用途。

背景技术

目前的研究表明，CD8⁺T细胞所识别的靶抗原先经抗原提呈细胞处理，之后以“抗原肽-MHC I类分子”复合物的形式呈现在抗原提呈细胞或靶细胞表面，相应的与MHC-I类分子结合的抗原肽即为CTL表位。

小鼠肝炎是由小鼠肝炎病毒(MHV)所致的一种特有的传染病，它广泛分布于世界各国的实验小鼠群中，鼠群中动物的感染率可为20％-100％，是实验小鼠群中最常见和最重要的病毒之一，多呈潜伏性感染和慢性感染，发病小鼠主要表现为肝炎、脑炎和肠炎，严重影响实验小鼠质量，干扰各种动物实验的进行，影响实验结果的准确性和重复性，是对实验小鼠危害最为严重的病毒病之一。目前尚没有治疗MHV感染的办法，控制MHV感染也非常困难，被MHV感染的小鼠只有处死，以防止鼠间的大量传播，使得实验成本增高及实验进度受到影响，可能导致一些珍贵实验动物的濒危。小鼠肝炎病毒(MHV)最早于1949年发现，此后研究者们先后从小鼠和新生鼠中分离到MHV。MHV是冠状病毒科最大的病毒，是目前已知基因组最大的RNA病毒。MHV有三个主要结构蛋白，分别为核心蛋白、跨膜糖蛋白和表面蛋白。MHV个毒株间S蛋白的抗原性差异很大，S蛋白能够形成三聚体结合敏感细胞受体，诱导病毒包膜和细胞膜之间的膜融合，刺激机体产生中和性抗体和介导细胞免疫应答，且目前普遍认为MHV组织亲嗜性在很大程度上取决于S蛋白，所以对于病毒感染及防治具有重要意义。Kou L等通过基因重组技术建立了一株变异的小鼠肝炎病毒，这株小鼠肝炎病毒的S蛋白被猫腹膜炎病毒(一种以猫为宿主的冠状病毒)的高交叉的S蛋白取代，它具有了感染猫细胞的能力，同时它丧失了感染鼠细胞的能力，这种通过取代外周S蛋白能跨越宿主细胞间种间屏障的现象，有力证明了冠状病毒感染宿主细胞范围最主要是由S蛋白与病毒受体的相互作用水平有关。不同的MHV病毒株能够表现出不同的组织亲嗜性，主要分为嗜肝性和非嗜肝性两类。MHV-A59及MHV-3为嗜肝性病毒，感染小鼠后多发展为急性或慢性肝炎。用T1寡合氨酸图解发现MHV-3和MHV-A59的基因组序列中仅有少数几处差异，这种基因组序列上的差异构成了MHV-3较MHV-A59更具嗜肝性。综上所述，MHV-3的S蛋白与小鼠肝炎的发生发展密切相关，若将MHV病毒的S蛋白作为抗原，采用生物信息学手段，研究其CTL表位，并将其作为免疫治疗的一个新靶点，对小鼠的MHV感染起到免疫保护及免疫治疗效果，从而预防鼠类MHV感染及治疗小鼠肝炎。到目前为止，该方面研究未见有文献报道。

随着对免疫应答分子机制研究的深入，人们已逐渐认识到机体的免疫细胞并不是对应于各种各样的病原体或天然抗原的整体分子，而是针对各种各样抗原分子的抗原表位。蛋白质抗原是通过其表位来体现其免疫特异性。

发明内容

本发明的目的是提供能与MHC-I类分子的结合位点进行结合、可激发特异性细胞毒性T淋巴细胞的鼠III型肝炎病毒多肽表位。

本发明的另一目的是提供所述多肽表位在制备用于鼠类肝炎病毒治疗药物和治疗或检测疫苗中的用途。

本发明根据抗原肽与MHC-I分子相互作用的机理，从鼠III型肝炎病毒S蛋白全长基因序列中筛选出候选多肽表位，最终得到能有效与MHC-I类分子结合并能激发特异性T淋巴细胞的多肽表位，该多肽表位长度仅8个氨基酸序列，体外容易合成，方便临床应用。

为实现本发明第一目的而采用的技术方案是这样的，既能与人MHC-I类分子的结合位点进行结合，可激发特异性的细胞毒性T淋巴细胞的多肽表位，筛选自序列号为：SEQ NO.1的鼠III型肝炎病毒S蛋白，为与SEQ NO.1的鼠III型肝炎病毒具有同源性的下列氨基酸序列，包括：

SEQ NO.2：Tyr Glu Leu Ser Gly Tyr Thr Val；

SEQ NO.3：Ile Glu Pro Tyr Asn Gly Val Ile；

SEQ NO.4：Phe Ser Val Tyr Ile Gly Asp Ile；

SEQ NO.14：Asn Asp Gly Ile Phe Ala Lys Val。

本发明涉及的多肽表位，还可以为选自SEQ NO.2、SEQ NO.3、SEQ NO.4、SEQ NO.14中的游离型多肽、融合型多肽和嵌合型多肽；以及以所述4条多肽之一为单体的各种形式的聚合体。

本发明所涉及的多肽表位与功能或性质已知的蛋白质融合或嵌合，即这些蛋白质分子或嵌合分子包含了本发明所涉及的多肽氨基酸序列，具有这些多肽的相同或相似活性。

本发明包括但不限于上述多肽表位，还包括编码这些多肽表位的DNA序列。

实现发明第二目的是上述多肽表位在制备用于鼠类肝炎病毒治疗药物和治疗或检测疫苗中的用途。

还包括所述的DNA序列在制备用于鼠类肝炎病毒治疗药物和治疗或检测疫苗中的用途。

与本发明有关的多肽序列，可通过任何已有的体外多肽合成设备和不同的技术原理人工合成。其获得方法主要有以下步骤，包括多肽的合成，纯化以及最后产品的收集，这样技术已经成熟并程式化，在相关领域被广泛应用。

本发明的积极效果：本发明使用计算机模拟技术与实验相结合的方法，进一步提高了预测多肽表位的准确性，不单纯考虑分子结合位点对多肽表位的预测影响，同时从空间构象上，预测了多肽表位，而且本发明的多肽物质，仅为8肽的短肽，体外容易合成，经静脉给药后容易被机体吸收，因此具有非常大的商业产业化价值。

附图说明

图1为SEQ NO.2多肽表位的空间结构模拟图；

图2为SEQ NO.2多肽表位和MHC分子结合的空间结构模拟图；

图3为SEQ NO.3多肽表位的空间结构模拟图；

图4为SEQ NO.3多肽表位和MHC分子结合的空间结构模拟图；

图5为SEQ NO.4多肽表位的空间结构模拟图；

图6为SEQ NO.4多肽表位和MHC分子结合的空间结构模拟图；

图7为SEQ NO.14多肽表位的空间结构模拟图；

图8为SEQ NO.14多肽表位和MHC分子结合的空间结构模拟图；

图9为SEQ NO.2多肽表位的质谱分析图；

图10为SEQ NO.3多肽表位的质谱分析图；

图11为SEQ NO.4多肽表位的质谱分析图；

图12为SEQ NO.14多肽表位的质谱分析图。

图13为4个筛选出的多肽对靶细胞杀伤效果图。

具体实施方式

实施例1多肽表位的筛选方法

本发明所获得的多肽序列是通过超基序、量化基序及人工神经网络方案相结合的方法，从肽库中直接调取，保持了与MHC-I类分子结合特性。

1、鼠III型肝炎病毒S蛋白氨基酸序列的获得

自国际开放共享基因库NCBI GeneBank中查找出天然鼠III型肝炎病毒S蛋白的全长氨基酸序列(共330个氨基酸)表示为：SEQ NO.1。

2、多肽表位预测的超基序的获得

超基序是基于在同一白细胞抗原(HLA)家族，甚至是不同家族的HLA同种异型分子接纳的抗原肽具有相同和相似的锚点残基构成的肽基序。易与H-2K^K结合的8肽序列，其锚定残基主要位于肽链第二位(P2)氨基酸残基及羧基末端第八位(P8)氨基酸残基。当P2为谷氨酸(E)或天冬氨酸(D)，P8为异亮氨酸(I)或缬氨酸(V)时，与H-2K^K分子有较高的亲和力。这些氨基酸的特定序列是多肽分子与MHC分子结合的活性位点或关键性氨基酸，决定了与MHC-I类分子结合多肽的活性特征。超基序预测CTL表位虽然克服了以往采用简单继续法易产生的假阴性结果，但由于此预测法与基序法具有相同的弱点，即在预测中仅仅考虑了锚点残基的影响而忽略了其他位点残基结合情况，易出现假阳性结果，故应联合量化基序法及人工神经网络提高CTL表位预测的准确性。

应用(http://www.syfpeithi.de/Script s/MHCServer.dll/EpitopePrediction.htm)提供的分析软件对上述鼠III型肝炎病毒S蛋白序列进行分析，选择得分较高的15个超基序：SEQNO.2-SEQNO.16：Tyr Glu Leu Ser Gly Tyr Thr Val(306-313)，Ile Glu Pro Tyr AsnGly Val Ile(141-148)，Phe Ser Val Tyr Ile Gly Asp Ile(228-235)，Asn Thr Asn GlyAsn Lys Leu Ile(168-175)，Thr Phe Leu Phe Ser Val Tyr Ile(225-232)，Ser Glu IleLys Cys Lys Thr Gln(290-297)，Ser Met Leu Pro Ser Thr Gly Val(298-305)，Thr ValGln Pro Val Gly Val Val(312-319)，Tyr Ile Gly Asp Phe Arg Cys Ile(15-22)，Thr GluThr Val Asp Val Ser Gln(39-46)，Phe Gly Tyr Thr Ser Tyr Thr Val(132-139)，Lys ArgAsn Phe Thr Leu Asn Val(190-197)，Asn Asp Gly Ile Phe Ala Lys Val(101-108)，AspIle Leu Thr Gln Tyr Tyr Val(2 34-241)，Asn Phe Asn Gln Lys Gly Val Ile(271-278)。

3、CTL表位预测的量化基序方案

量化基序法是基于非依赖性侧链结合(IBS)假设，即在抗原肽与MHC分子的结合中，抗原肽的侧链效应(锚定、抑制或中性)主要依赖与相应的氨基酸残基在肽中所处的位置受相邻的氨基酸残基影响较小。这在一定的范围内可以假设在一个多肽序列中，每个氨基酸残基相互独立且影响整个肽与MHC I类分子的结合，而该抗原肽的结合能就是每个位置氨基酸残基结合能的综合。在此假设的基础上根据实验获得的数据，对多肽分子在肽结合槽内特定位点某个氨基酸出现的频率用统计学方法进行分析，得到反应该型MHC分子结合特性的统计学矩阵，并借助数学和计算机学编制成可用于表位预测的程序。由于量化基序法在预测中充分考虑到每一种氨基酸在MHC结合槽特定位点出现的可能性，所以预测的精度高，是目前最为成熟的预测方案。

应用(http://www-bimas.cit.nih.gov/cgi-bin/molbio/ken_parker_comboform)提供的分析软件对超基序预测出的CTL表位进一步采用量化基序法进行验证，以寻求结合最好的表位。超基序中得分较高的15个超基序，同时在量化基序分析中得分也较高基序有4个，即包括以下多肽表位：

SEQ NO.2：Tyr Glu Leu Ser Gly Tyr Thr Val，该序列位于鼠III型肝炎病毒S蛋白序列中第306位与第313位之间。

SEQ NO.3：Ile Glu Pro Tyr Asn Gly Val Ile，该序列位于鼠III型肝炎病毒S蛋白序列中第141位与第148位之间。

SEQ NO.4：Phe Ser Val Tyr Ile Gly Asp Ile，该序列位于鼠III型肝炎病毒S蛋白序列中第228位与第235位之间。

SEQ NO.14：Asn Asp Gly Ile Phe Ala Lys Val，该序列位于鼠III型肝炎病毒S蛋白序列中第101位与第108位之间。

实施例2多肽表位与MHC-I结合的三维结构分析和分子动力学模拟分析

对上述所得多肽表位用Silicon graphics工作站及Insight II软件建立预测多肽与H-2K^K结合的三维结构并进行分子动力学模拟，包括以下方法：①分子模型构建，运用InsightII软件包中的Discover3.0模块(采用CVFF力场)，对来自鼠III型肝炎病毒S蛋白的八肽与H-2K^K分子的复合物进行分子动力学模拟。H-2K^K的初始坐标来自于蛋白质结构数据库(PDB编号1ZT1)，各八肽运用Bioploymer模块对1ZT1中的多肽分子进行氨基酸替换而得。模拟过程如下：首先，将H-2K^K与β2m固定，运用最陡下降法对八肽进行2000步优化计算，然后用共轭梯度法优化，直到能量RMS小于0.1kal/mol.

第二步，在复合物周围加一层7.5

的水分子，并固定H-2K^K复合物对水分子进行2000步能量优化，以消除水分子之间以及水分子与蛋白质之间的不合理接触；第三步，对溶液状态下的复合物进行能量最小化计算，非键相互作用采用9.5

的截断值，先后运用最陡下降法和共轭梯度法优化，直到能量RMS小于0.1kal/mol.

第四步，在298K的恒定温度下进行20PS的分子动力学计算；最后，对动力学优化得到的最后构象进行分子力学优化5000步，得到H-2K^K与八肽复合物的最终构象。通过分子动力学模拟，以已知的H-2K^K限制性CTL表位八肽为基础，分析出MHC-肽复合物的可能结构，构建并分析H-2K^K限制性CTL表位多肽的三维模型，可发现大部分H-2K^K限制性CTL表位多肽的两个锚点残基间的距离为15-19符合这些条件的多肽与H-2K^K分子间有较好的亲和力。②结合特征参数计算，借助Homology模块，计算MHV-3S蛋白的几个多肽表位中各残基的溶液可及性表面积、锚点间距及氢键个数等结合特征参数。在对各残基溶剂可及性表面积的计算中，我们选择水分子作为探针分子，溶剂半径选为0.14nm。分子的溶剂可及性表面积是指蛋白质分子暴露到溶剂中的面积，将其定义为溶剂球(又称探针分子)中心在蛋白质分子表面滚过的面积。上述4条多肽的空间构象图可参见图1、3、5、7。而上述4条多肽与MHC-I类分子结合模拟图可参见图2、4、6、8。分子动力学结合特征参数计算结果如下所示：

MHC-肽复合物模型中多肽各残基的溶剂可及性表面积(SAS of anchor Residue/

)直观反映了肽与MHC分子的嵌合情况，各残基尤其是锚点的溶剂可及性表面积越小，说明两者嵌合越紧密。抗原肽与MHC分子之间主要通过疏水作用、氢键(H-bond number)、盐键等弱相互作用进行分子间的识别。这些非键作用越强，相应分子间的非键作用能就越低，结合则越紧密。从以上表格可以看出，上述4条多肽的锚点残基距离均在15-19

之间，4条多肽均能与MHC-I类分子的很好的结合。

实施例3本发明多肽表位的获得

(1)多肽的合成

多肽采用标准的Fmoc方案，精氨酸采用两次偶联，按照多肽序列使肽链从羧基端向氨基端延伸。多肽合成后，选用相应的切割酶进行切割，同时去除多肽保护基团得到多肽粗品。

(2)多肽表位的纯化和分子量分析

将上述获得的多肽表位通过RP-HPLC纯化和分析，RP-HPLC测定合成的4条多肽纯度均在95％以上。质谱分析结果显示，各肽的相对分子质量测定值与理论值基本相符，可用于后继试验研究。多肽的合成、纯化、分析及鉴定均由深圳瀚宇药业有限公司完成。质谱图见附图9-图12。

(3)多肽产品的溶解

合成的肽冻干粉，按1mg/ml的浓度，根据其溶解特性分别溶于超纯水或DMSO中，置于-20℃保存、备用。

实施例4本发明多肽表位与MHC-I亲和力检测

1、细胞株及单克隆抗体

TAP缺陷的T2细胞购于ATCC，在T2细胞中转染H-2K^K分子获得TAP缺陷H-2K^K阳性的T2KK细胞系，T2KK细胞培养于含10％胎牛血清的IMDM培养液中，培养条件为37℃、5％CO₂、饱和湿度，每隔2-3天传代1次。FITC标记的大鼠抗小鼠H-2K^K抗体，购于Biolegend公司，培养液及血清均购于Sigma公司。

2、多肽表位与MHC-I分子结合力的检测

本实施例为利用T2KK细胞系特点，检测多肽表位的亲和力的实验。T2KK细胞表面空载的H-2K^K分子表达极不稳定，递呈后很快降解。抗原肽与之结合后稳定了H-2K^K的表达，抗原肽与H-2K^K的结合力越强，则T2KK细胞表面H-2K^K分子的表达量就越高。因T2KK细胞的内源性抗原递呈途径中必须得抗原多肽转运蛋白(TAP)缺陷，所以T2KK表面H-2K^K分子表达量的增加直观地反应了外来抗原肽与H-2K^K的结合力，能够进一步证明本发明的多肽的有效性。利用FITC标记的大鼠抗小鼠H-2K^K的单克隆抗体，直接荧光检测法检测H-2K^K的表达量，结果以平均荧光强度为检测指标，以荧光系数(FI)为衡量指标。

实施例中，采用流式细胞仪检测T2KK细胞表面的H-2K^K分子：T2KK细胞经PBS洗涤2次后，以1×10⁶/孔接种于12孔培养板中，以100μg/ml的浓度加入各表位候选肽，并设置空白对照孔。T2KK细胞在37℃、5％CO₂、饱和湿度条件下培养18h后，收集细胞作流式细胞术检测；孵育好的T2KK细胞用1000rpm离心5min后，PBS洗涤，同样条件离心后，加入100μl PBS重悬，在细胞沉淀中加入0.5μl FITC标记的大鼠抗小鼠H-2K^K抗体溶液，4℃避光孵育1h，用PBS洗涤3次后，在流式细胞仪上检测平均荧光强度，波长488nm。

结果以FI作为衡量指标，计算公式为：荧光系数(FI)＝(样本平均荧光强度-背景平均荧光强度)/背景平均荧光强度。判断标准：FI＞1.5视为多肽与H-2K^K分子结合力高，1.0＜FI＜1.5为中等结合力，1.0＞FI＞0.5为低结合力。

亲和力实验结果如下所示：

实验结果表明：SEQ NO.2与SEQ NO.3多肽表位与MHC-I分子呈中等结合力结合，而SEQNO.4与SEQ NO.14与MHC-I类分子的结合力差。

实施例5多肽表位体内诱导鼠III型肝炎病毒特异性CTL的杀伤活性检测

采用乳酸脱氢酶(LDH)释放法进行。

1、效应细胞的制备：将免疫(100μg多肽+福式不完全佐剂，每周一次，共三次)后的小鼠脾脏淋巴细胞与100μg/ml多肽，及20U/ml rmIL-2共培养与24孔板中，体外培养7d后作为效应细胞。福式不完全佐剂购于Sigma公司，rmIL-2购于Biolegend公司。

2、靶细胞的制备：L929购于ATCC，培养于含10％FBS的RPMI1640培养基中。10μg/ml表位肽室温孵育1h，洗涤后作为靶细胞。

3、LDH释放实验：采用标准的LDH释放试验，将靶细胞浓度以2×10⁴个/100μL加入96孔板，各靶细胞孔中加入不同稀释度的效应细胞，每孔100μL，使相应的效/靶比分别为20∶1、40∶1和80∶1，同时设自然释放孔和最大释放孔，每组设立3个复孔。于37℃、5％CO₂孵育3h，分别加入LDH补充液及裂解液后，继续孵育1h。以1000rpm离心10min，各取上清液50μL，加入LDH反应液及显色液，室温避光孵育30min后，加入LDH终止液，用酶标仪检测吸光值(A)。其中LDH检测试剂盒购于上海杰美基因医药科技有限公司。

特异性杀伤率按一下公式计算：特异性杀伤细胞率(％)＝(实验孔A值-自然释放孔A值)/(最大释放孔A值-自然释放孔A值)×100％。

4条多肽对靶细胞的杀伤作用如下：

实验结果表明：SEQ NO.2与SEQ NO.3多肽表位对靶细胞的杀伤作用最强。比较结果参见附图13。

与本方面有关的序列表

<110>中国人民解放军第三军医大学第二附属医院

<120>与MHC-I类分子结合的鼠III型肝炎病毒多肽表位及应用

<160>5

<210>1

<211>330

<212>amino acids

<213>鼠III型肝炎病毒S蛋白(spike protein[Murine hepatitis virus 3])

<221>mat_peptide

<400>1

Met Leu Phe Val Phe Ile Leu Phe Leu Pro Ser Cys Leu Gly Tyr Ile Gly Asp Phe Arg Cys Ile Gln

1 5 10 15 20

Leu Val Asn Ser Asn Gly Ala Asn Val Ser Ala Pro Ser Ile Ser Thr Glu Thr Val Asp Val Ser Gln Gly

25 30 35 40 45

Leu Gly Thr Val Tyr Val Leu Asp Arg Val Tyr Leu Asn Ala Thr Leu Leu Leu Thr Gly Tyr Tyr

50 55 60 65

Pro Val Asp Gly Ser Lys Phe Arg Asn Leu Ala Leu Thr Gly Thr Asn Ser Val Ser Leu Ser Trp Phe

70 75 80 85 90

Gln Pro Pro Tyr Leu Ser Gln Phe Asn Asp Gly Ile Phe Ala Lys Val Gln Asn Leu Lys Thr Ser Thr

95 100 105 110 115

Pro Ser Gly Ala Thr Ala Tyr Phe Pro Thr Ile Val Ile Gly Ser Leu Phe Gly Tyr Thr Ser Tyr Thr Val

120 125 130 135

Val Ile Glu Pro Tyr Asn Gly Val Ile Met Ala Ser Val Cys Gln Tyr Thr Ile Cys Gln Leu Pro Tyr Thr

140 145 150 155 160

Asp Cys Lys Pro Asn Thr Asn Gly Asn Lys Leu Ile Gly Phe Trp Hi s Thr Asp Val Lys Pro Pro Ile

165 170 175 180 185

Cys Val Leu Lys Arg Asn Phe Thr Leu Asn Val Asn Ala Asp Ala Phe Tyr Phe His Phe Tyr Gln Hi s

190 195 200 205

Gly Gly Thr Phe Tyr Ala Tyr Tyr Ala Asp Lys Pro Ser Ala Thr Thr Phe Leu Phe Ser Val Tyr Ile

210 215 220 225 230

Gly Asp Ile Leu Thr Gln Tyr Tyr Val Leu Pro Phe Ile Cys Asn Pro Thr Ala Gly Ser Thr Phe Arg

235 240 245 250 255

Pro Arg Tyr Trp Val Thr Pro Leu Val Lys Arg Gln Tyr Leu Phe Asn Phe Asn Gln Lys Gly Val Ile

260 265 270 275

Thr Ser Ala Val Asp Cys Ala Ser Ser Tyr Thr Ser Glu Ile Lys Cys Lys Thr Gln Ser Met Leu Pro

280 285 290 295 300

Ser Thr Gly Val Thr Glu Leu Ser Gly Tyr Thr Val Gln Pro Val Gly Val Val Tyr Arg Arg Val Ala

305 310 315 320

Asn Leu Pro Ala Cys Asn

325 330

<210>2

<211>8

<212>amino acids

<213>鼠III型肝炎病毒S蛋白(spike protein[Murine hepatitis virus 3])

<400>2

Tyr Glu Leu Ser Gly Tyr Thr Val

1 5

<210>3

<211>8

<212>amino acids

<213>鼠III型肝炎病毒S蛋白(spike protein[Murine hepatitis virus 3])

<400>3

Ile Glu Pro Tyr Asn Gly Val Ile

1 5

<210>4

<211>8

<212>amino acids

<213>鼠III型肝炎病毒S蛋白(spike protein[Murine hepatitis virus 3])

<400>4

Phe Ser Val Tyr Ile Gly Asp Ile

1 5

<210>5

<211>8

<212>amino acids

<213>鼠III型肝炎病毒S蛋白(spike protein[Murine hepatitis virus 3])

<400>5

Asn Asp Gly Ile Phe Ala Lys Val

1 5

Claims

1.能与MHC-I类分子的结合位点进行结合、可激活特异性的细胞毒性T淋巴细胞的多肽表位，为筛选自序列号为：SEQ NO.1的鼠III型肝炎病毒S蛋白，且与SEQ NO.1的的鼠III型肝炎病毒S蛋白具有同源性的下列氨基酸序列：

SEQ NO.2：Tyr Glu Leu Ser Gly Tyr Thr Val。

2.权利要求1中的多肽表位，其特征是：所述的多肽表位通过原核细胞或真核细胞表达纯化获得，或人工合成。

3.编码权利要求1所述多肽表位的DNA。

4.权利要求1所述的多肽表位在制备用于鼠类肝炎MHV-3病毒治疗药物和治疗或检测疫苗中的用途。

5.权利要求3所述的DNA序列在制备用于鼠类肝炎MHV-3病毒治疗药物和治疗或检测疫苗中的用途。