CN101724024B - 与免疫抗体相结合的多肽及其应用 - Google Patents

与免疫抗体相结合的多肽及其应用 Download PDF

Info

Publication number
CN101724024B
CN101724024B CN2008102010318A CN200810201031A CN101724024B CN 101724024 B CN101724024 B CN 101724024B CN 2008102010318 A CN2008102010318 A CN 2008102010318A CN 200810201031 A CN200810201031 A CN 200810201031A CN 101724024 B CN101724024 B CN 101724024B
Authority
CN
China
Prior art keywords
delta
carbamylornithine
synthetic
seq
xaa
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN2008102010318A
Other languages
English (en)
Other versions
CN101724024A (zh
Inventor
王绍成
朱绍荣
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Shanghai Rongsheng Biological Pharmaceutical Co.,Ltd.
Original Assignee
Shanghai Rongsheng Biological Pharmaceutical Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Shanghai Rongsheng Biological Pharmaceutical Co Ltd filed Critical Shanghai Rongsheng Biological Pharmaceutical Co Ltd
Priority to CN2008102010318A priority Critical patent/CN101724024B/zh
Publication of CN101724024A publication Critical patent/CN101724024A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN101724024B publication Critical patent/CN101724024B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Abstract

本发明公开了一种多肽，其序列中至少有一精氨酸侧链被修饰为电中性或电负性氨基酸。通过序列上两个不相邻的半胱氨酸侧链巯基形成二硫键的方式，产生环状的多肽。这类多肽不仅能与类风湿关节炎自身免疫抗体相结合，同时还能对HLA—DR具有高亲和力。经过实验验证，该类多肽与类风湿关节炎自身免疫抗体相结合的专一性大于95％，对类风湿关节炎自身免疫抗体的检测灵敏度大于75％。与市场上销售的同类产品相比，其灵敏度得到显著提高，更有利于类风湿关节炎自身免疫抗体的体外检测。

Description

与免疫抗体相结合的多肽及其应用
技术领域
本发明涉及与免疫抗体结合的多肽，尤其涉及与类风湿关节炎免疫抗体相结合的多肽，更具体的是涉及一种至少有一个精氨酸被修饰的与类风湿关节炎自身免疫抗体相结合的多肽。
背景技术
临床上自身免疫疾病主要有系统性红斑狼疮、类风湿关节炎、干燥综合征、皮肌炎、多发性肌炎、系统(多发)性硬化症、硬皮病等，这些疾病曾被命名为“结缔组织病”，后来国外和国内均将它们归为风湿性疾病。
类风湿关节炎(rheumatoid arthritis，RA)是一种较常见的以慢性多关节炎症为主要表现的系统性自身免疫疾病，其病程长，多反复，且对组织损伤是不可逆的，给患者造成很大痛苦；该病的发病率在世界范围内为0.5—1％，中国的发病率约为0.36％。患者发病年龄多在20～50岁，女性多于男性，男女之比为1∶3。最近流行病学统计有逐年增加趋势，其突出的早期临床表现为对称性关节红肿热痛，常见四肢小关节，指间近端关节肿胀，掌指、腕、肘、踝等关节肿痛及活动困难，晨间关节僵硬，午后逐渐减轻，关节外症状约有20％患者可出现皮下结节；长久不愈的晚期症状，则有不同程度的关节畸形和强直，关节功能丧失等，可损伤脏器、多组织器官，造成骨头缺血性坏死，对人体消耗大，致残率高。
由于类风湿关节炎病因至今尚不十分清楚，且早期临床表现也不典型。在国内外临床实践中，该疾病的常用诊断工具是美国风湿学学会(American College of Rheumatology，ACR)在1987年制定的类风湿分类标准(Arthritis Rheum 1988，31，315—24)，该标准更依赖于类风湿关节炎所表现出的临床病症。在该疾病早期，这些临床指标通常是不易操作的。因此，目前普遍认为这一标准不能较好适应于早期类风湿关节炎诊断(Arthritis Rheum 2001，44，2485-91；Neth J Med 2002，60，383—8)。而目前使用的治疗类风湿关节炎的方法主要是采用消炎方法，但这种方法虽能使得关节肿胀(swelling)和侵蚀(erosive)的程度得以减慢，却无法使疾病得到治愈。当前人们共同的观点是，在该疾病早期采用多种方法治疗能得到最佳的治疗效果(Autoimmunity Reviews 2006，6，37-41)。由此，具有高专一性(Specificity)和高灵敏度(Sensitivity)的血清学检测标记对于类风湿关节炎在骨关节遭受损伤之前的早期诊断就显得尤为必要(ClinApplied Immunol Rev 2004，4，239—62)。
研究发现一些自身免疫抗体虽然与类风湿关节炎疾病相联系，如：抗calpastatin抗体(Proc Natl Acad Sci USA 1995，92，7267-71)，抗中性粒细胞胞质抗体(anti-neutrophil cytoplasmic antibodies，ANCA)(Int ArchAllergy Immunol 1996；109:201-6)，核抗原抗体(anti—nuclear antigens，ANA)(Scand J Rheumatol 1986，15，185-92)，抗II型胶原抗体(anti-collagentype II)(J Immunol Methods 2001，247，191-203)和抗葡萄糖6磷酸异构酶(anti-glucose-6-phosphate isomerase，anti-GPI)(Nat Immunol2001，2，746-53)等也都能在患有其它自身免疫疾病的病人中，甚至于在健康个体中检测出来(Clin Applied Immunol Rev 2004，4，239—62)。其中的某些抗体虽然能应用于风湿性疾病的识别，而且筛选这些抗体也有助于疾病监测和预测，但由于其对类风湿关节炎缺乏专一性，这些抗体中的绝大多数都很少应用于类风湿关节炎早期诊断(Clinica Chimica Acta 2004，350，17-34)。
对于类风湿关节炎早期诊断的理想标记(Marker)应当至少满足4个标准：(1)高灵敏度，能检测的病人达到高百分比；(2)高专一性，尽可能地限制错误阳性结果的发生；(3)能适用于早期诊断；(4)能预见到某些病人会发展成侵蚀性疾病(erosive disease)(AutoimmunityReviews 2006，6，37-41；MEDICINE 2006，34，441-4)。
类风湿因子(rheumatoid factor，RF)抗体是应用于ACR标准中的血清学检测，被公认为是IgG分子上Fc结构域的直接抗体。但其对于类风湿关节炎的专一性也比较一般，为60％，灵敏度范围可以达到60—80％。RF还可以在其它患有自身免疫疾病的病人中、患有感染性疾病的病人中以及3—5％健康人群中(其中10—30％的老年人)检测到(Ann Rheum Dis2003，62，261-3)。
抗BiP(p68)，抗Sa和抗环状胍氨酸化蛋白抗体(APF，AKA，抗filaggrin，抗CCP)则对类风湿关节炎有更好的专一性。64％的类风湿关节炎病人能产生直接针对BiP的抗体，还有报道称其对该疾病具有高度的专一性，目前没有数据支持BiP在预测类风湿关节炎方面具有作用，而且这些报道的BiP抗体则需要等待进一步通过独立的临床研究来确认(Clinica ChimicaActa 2004，350，17-34)。另有研究揭示Sa抗原对于类风湿关节炎的专一性可以高达92—99％，但其灵敏度则显得一般，仅为30—40％(J Rheumatol1994，21，1027-33；J Rheumatol 1999；26:7-13)。
抗核周因子(antiperinuclear factor，APF)首次披露于1964年。经研究这些自身免疫抗体对类风湿关节炎具有专一性，并能通过以人颊粘膜细胞为抗原底物的免疫荧光法间接测得(Ann Rheum Dis 1964；23，302-5)。
1979年研究者描述了一种类风湿关节炎专一性角质蛋白抗体，它能直接抑制角质层上皮细胞角质化，并将这类抗体的名称暂定为抗角质蛋白抗体(anti-keratin andtibody，AKA)(Young BJ et al BMJ 1979，2，97-9)。之后的研究证实了，虽然AKA和APF的发现是互相独立的，但是两者所直接对应的抗原是一致的(Sebbag M et al J.Clin.Invest 1995，95，2672—9)。许多研究进一步表明AKA和APF具有许多共同的特性。Filaggrin(filament aggregating protein)是一种互相交联的角蛋白丝状体，作用是形成非常坚固的细胞骨架结构，其也是AKA和APF的常见抗原(ClinApplied Immunol Rev 2004，4，239—62)。
虽然AKA和APF对于类风湿关节炎具有专一性，但其缺陷也很突出。这两种抗体的检测灵敏度严重依赖于filaggrin的纯化方法。实践中，由于难以分离得到纯的且胍基含量具有可重复性的抗原，再加上其检测手段不简便，以及荧光免疫需要耗费较大的工作量，从而使得实验室间难以形成标准化，导致AKA和APF没有成为类风湿关节炎检测的主流方法(ClinApplied Immunol Rev 2004，4，239—62)。
基于filaggrin和profilaggrin是AKA和APF抗体靶点的知识，人们合成了含有瓜氨酸的多肽以检测类风湿关节炎血清中AKA和APF抗体的活性。由于瓜氨酸不是基本氨基酸而无法在蛋白质翻译中加入，因此通常的方法是通过肽精氨酸脱亚胺酶(peptidylargnine deiminine，PAD，EC3.5.3.15)催化精氨酸残基脱氨基得到。根据这些事实，一些从filaggrin序列中衍生出来的精氨酸侧链经修饰的，尤其是含有瓜氨酸的多肽被合成出来，并用于类风湿关节炎抗体的体外检测(US6,858,438)。在用酶联免疫吸附(Enzyme—Linked immunosorbent Assay，ELISA)方法检测实验中，这一方法合成的含有瓜氨酸直线性多肽能从类风湿关节炎患者血清中检测出抗瓜氨酸肽抗体，在保持高专一性(大于90％)的情况下，大大提高检测的灵敏度(达到63％)。实验还证明，只有含有瓜氨酸的多肽才能实现该反应，若将多肽中的瓜氨酸用其它氨基酸代替则完全没有反应发生。这些结果表明，瓜氨酸部分是决定能被AKA和APF抗体识别的抗原决定因子(J Clin Invest 1998，101，273-81)。
其它研究者发现将含有瓜氨酸的直线性多肽通过二硫键(S-S键)形成环形结构的方式能模拟类似β—转角结构，从而模仿最初抗原决定簇的β-转角结构，并可增加多肽—抗体的亲和力(FASEB J 1995，9，37-42；Mol Immunol 1985，22，1255-64)。由此，一种环状肽，即第一代环瓜氨酸肽(the first generation cyclic citrullinated peptide，CCP1)被人工合成出来(Schellekens GA et al Arthritis Rheum 2000，43，155—63)。研究者将一条由19个氨基酸残基组成的瓜氨酸肽中两个丝氨酸替换为半胱氨酸形成与β—转角具有相似结构的二硫键，得到人工合成CCP，并将CCP1与直线肽的检测结果作了比较。结果显示，采用CCP1为抗原的多肽用ELISA法检测RA患者的抗CCP抗体，灵敏度较用直线性瓜氨酸肽为抗原有明显提高，分别为68％和49％，二者专一性相似。
在含有不同瓜氨酸多肽的反应模式中，类风湿关节炎血清检测表现出巨大的可变性。类风湿关节炎患者的血清/血浆中除了filaggrin精氨酸残基被瓜氨酸化外，Sa抗原、胶原蛋白(I和II型)、组蛋白、髓磷脂碱蛋白、纤维连接蛋白等也出现瓜氨酸化，并产生抗CCP抗体。深入研究表明，瓜氨酸化的自身抗原中并非所有精氨酸脱氨基转化为瓜氨酸；已瓜氨酸化的瓜氨酸也不完全参与形成抗原表位，即产生抗CCP抗体。综上，抗瓜氨酸抗体的产生与瓜氨酸密切相关，并且瓜氨酸的侧翼序列对抗瓜氨酸抗体的产生起重要作用，这一事实暗示着瓜氨酸残基的周边氨基酸对于抗原表位(antigen episode)具有重要作用，以及抗瓜氨酸化蛋白(如：AKA和APF抗体)活性是多克隆反应(J Clin Invest 1998，101，273-81)。基于filaggrin的属性，它被认为是模拟瓜氨酸抗原表位的天然库藏(ClinApplied Immunol Rev 2004，4，239—62)。
第二代CCP(CCP2)检测方法产生于2002年，通过将含有瓜氨酸的多肽库与类风湿关节炎血清筛选得到与filaggrin无关的第二代CCP，其具有更有利于抗体检测的表位(Report on the 5th Dresden symposium onautoantibodies.Lengerich，Germany：Pabst Science Publishers；2000.p.140-5)。将CCP1和CCP2经同一组病人测试后表明，CCP2不仅保持了较高专一性(96％)，而且其分析灵敏度也有显著的提高(Ann.Rheum.Dis.2005，64，1510—2)。许多研究者在最近5年的研究证明，抗含瓜氨酸多肽的测试的灵敏度具有较高的可变性，范围在40％—94％(Clin.ExpRheumatol.2005，23(Suppl39)，569-76；Ann.Rheum.Dis.2006，65，845—51)。CCP2在类风湿关节炎自身免疫抗体体外检测中得到应用说明了在该领域的检测抗原的筛选并不需要仅仅依赖filaggrin，也说明与filaggrin不同的结合表位能更有利于体外检测。
Bizzaro N等人(Clin Chem 2007，53，1527—33)和Lutteri L等人(ClinicaChimica Acta 2007，386，76-81)分别针对现在市场上使用的第二代和第三代CCP试剂盒进行了比较，结果发现，伊诺瓦诊断(Inova Diagnostics)公司开发的三种检测方法中，其CCP3试剂盒与使用CCP2为抗原的方法相比仅仅略有改善，各自的灵敏度分别为67％和64％。相反地，用于抗IgG的CCP3.0与即能检测IgG又能检测IgA的CCP3.1的检测方法相比后发现，两者竟然没有丝毫差别。可见，同时检测IgG和IgA抗体的方法并没有象看上去那样有显著改进。他们的结论是由于测试的诊断试剂盒灵敏度可能与胍基化精氨酸残基的位置和数量有关，而专一性则可能受到蛋白质或杂多肽序列的影响，因此，对此二者而言，抗原的种类显得更为重要。两者综合考虑，实验数据表明抗原的制备是决定测定方法优劣的最重要的可变因素。
Lutteri L等人(Clinica Chimica Acta 2007，386，76-81)的研究还发现了抗CCP的另一个价值，他们指出，IgM-RF是最灵敏的标记，能在77.9％的类风湿关节炎患者中发现。必须注意的是ACR标准中的RF，其类风湿关节炎诊断中灵敏度不能直接与那些没有包括在诊断标准中的其它方法相比较。IgM-RF被认为在疾病专一性方面略有欠缺。使用IgM-RF检测类风湿关节炎患者，其中有13—19％的人为RF阴性，与之相比，当这些患者使用抗CCP方法检测时均为阳性。
类风湿关节炎的遗传因素会影响瓜氨酸化蛋白的出现和产生，也会影响针对这些修饰蛋白的抗体产物(Clinica Chimica Acta 2004，350，17—34)。一系列相关研究表明，类风湿关节炎与某些HLA—DR等位基因有密切联系，尤其是HLA—DRB1*0401和HLA—DRB1*0404(Cell1996，85，307—10)。这不同地区的人群中，这些等位基因也略有不同。DRB1*0401主要出现在北欧和北美地区的人群中，有证据表明该基因与类风湿关节炎所导致的“特大关节”表征(extraarticular manifestations)有联系，在DRB1*0401/DRB1*0404杂合基因型中尤为突出。DRB1*0403、DRB1*0406和DRB1*0407与DRB1*0401、*0404或*0101基因组合后会增加类风湿关节炎病情的发展可能。DRB1*0404与DRB1*0408只要存在于白色人种中。DRB1*0405很少在北欧人群中，但在亚洲和还地中海沿岸国家的人群中极其普遍。DRB1*0101主要存在于北欧和北美人群中。美洲印第安人群中则为DRB1*1402和*1406(Hum Immuno 2000，61，1254—1261)。虽然这些与类风湿关节炎相关的基因在各地区人群中各有不同，但研究发现在DRB1的第三高度可变区(HV3)具有共享表位(sharedepitope，SE)，在70—74位氨基酸残基都为QKRAA、QRRAA或RRRAA(Clinica Chimica Acta 2004，350，17-34)。
将一群有几个共享表位基因型的类风湿关节炎患者与具有抗CCP2抗体的患者比较研究表明，一种共享表位等位基因与抗CCP2抗体的产生具有密切的内在联系(Arthritis Rheum 2000，50，2113—21；Arthritis ResTher 2004，6，R303—8)。经证实，这一关联是由于MHC分子共享表位β链的70—74位氨基酸残基(Q/R，K/R，R，A，A)形成第4个锚定袋(P4)，其与电中性或负电荷氨基酸具有高度亲和性(J Immuno 2003，171，538—541)。当带正电荷精氨酸在PAD酶作用下转换成电中性的瓜氨酸后，得到的翻译后修饰蛋白/多肽亲和力远远大于精氨酸与P4的亲和力，并能够激活CD4+T细胞，这些“瓜氨酸特异T细胞”可有助于抗瓜氨酸蛋白(多肽)抗体的产生(J Immuno 2003，171，538—541；Arthritis Rheum1987，30，1205-13；Rheum Dis Clin North Am 1992，18，741-59；ArthritisRheum 2005，52，1063—68)。这些结果表明具有共享表位的DBR1等位基因能激活类风湿关节炎患者自身免疫反应。
发明内容
本发明的一个目的在于提供一种与免疫抗体相结合的多肽。
本发明的另一个目的在于提供一种与类风湿关节炎自身免疫抗体相结合的多肽。
本发明的又一个目的在于提供一种既能与类风湿关节炎自身免疫抗体相结合的多肽，同时该肽还能与HLA—DR具有高亲和力。
本发明的再一个目的在于提供一种用于类风湿关节炎疾病自身免疫抗体的体外检测的多肽。
本发明所述的多肽包含有如下氨基酸序列：
His—Gln—Cys—Xaa1—Xaa2—Phe—Xaa3—Xaa4—Xaa5—Xaa6—Xaa7—Xaa8—Xaa9—Xaa10—Xaa1l—Cys—Gly，
其中，Xaa1为His或Ala；Xaa2为Gln或Arg；Xaa3为Arg或Gln；Xaa4为Phe或Met；Xaa5为Arg；Xaa6为Gly或His；Xaa7为Arg；Xaa8为Ser或Arg；Xaa9为Arg或Leu；Xaa10为Ala或Ile；Xaa11为Ala或Arg，其中至少有一个精氨酸被修饰。
进一步地说，所述的多肽具体包含有如下氨基酸序列：
His—Gln—Cys—Xaa1—Xaa2—Phe—Xaa3—Xaa4—Xaa5—Xaa6—Xaa7—Xaa8—Xaa9—Xaa10—Xaa11—Cys—Gly，
其中，Xaa1为His或Ala；Xaa2为Gln或Arg；Xaa3为Arg或Gln；Xaa4为Phe或Met；Xaa5为mArg(修饰的精氨酸)或Arg；Xaa6为Gly或His；Xaa7为mArg；Xaa8为Ser或Arg；Xaa9为Arg或Leu；Xaa10为Ala或Ile；Xaa11为Ala或Arg。
更进一步地说，所述的多肽包含如下具体氨基酸序列如下：
His—Gln—Cys—Xaa1—Xaa2—Phe—Xaa3—Xaa4—Xaa5—Xaa6—Xaa7—Xaa8—Xaa9—Xaa10—Xaa11—Cys—Gly，
其中，Xaa1为His或Ala；Xaa2为Gln或Arg；Xaa3为Arg或Gln；Xaa4为Phe或Met；Xaa5为mArg(修饰的精氨酸)或Arg；Xaa6为Gly或His；Xaa7为mArg；Xaa8为Ser或Arg；Xaa9为Arg或Leu；Xaa10为Ala或Ile；Xaa11为Ala或Arg。
进一步地说，所述的mArg为侧链修饰的Arg，具有通式(I)所述的结构。
          式I
其中G1为O、NH或CH2；G2为NH2、CH3、NHCH3或N(CH3)2；G3为O、NH、NHCH3、NHCH3；n为2、3或4；
其中当G1为NH，G2为NH2时，G3不为NH。
更进一步地说，所述的mArg为瓜氨酸(Cit)，即当G1为NH，G2为NH2，G3为O，及n为3。
进一步地说，所述多肽能与自身免疫抗体相结合，形成抗原—抗体复合物(Complex)。
进一步地说，所述多肽能与HLA—DR分子具有高亲和力，与HLA—DR相结合形成HLA—DR—多肽复合物。
进一步地说，所述的多肽是通过序列中的不相邻的两个Cys之间形成二硫键。所形成的二硫键能使该多肽具有环状结构并能模拟β—转角结构，使得该多肽不仅具有与HLA—DR分子具有高亲和力，与HLA—DR相结合形成HLA—DR—多肽复合物；还能与抗CCP抗体高效结合，形成抗原—抗体复合物。
具体地说，所述多肽的包含的氨基酸序列为SEQ ID No 1—261。
进一步地说，所述多肽的包含氨基酸序列为His—Gln—Cys—His—Gln—Phe—Arg—Phe—mArg—Gly—mArg—Ser—Arg—Ala—Ala—Cys—Gly，其第三位Cys与第十六位Cys之间形成二硫键。
具体地说，所述的多肽为SEQ.ID No 1—118，其第三位Cys与第十六位Cys之间形成二硫键。
进一步地说，所述多肽的包含氨基酸序列为His—Gln—Cys—Ala—Arg—Phe—Gln—Met—Arg—His—mArg—Arg—Leu—Ile—Arg—Cys—Gly，其第三位Cys与第十六位Cys之间形成二硫键。
具体地说，所述的多肽为SEQ.ID No 120—261，其第三位Cys与第十六位Cys之间形成二硫键。
本发明所述的多肽为通过化学方法直接合成或先通过化学合成或基因工程方法，即将从表达载体中分离纯化得到的的多肽再经过修饰精氨酸侧链的步骤得到。
具体地说，所述的多肽通过化学方法直接合成，或先通过化学方法合成后，再由PAD酶修饰精氨酸侧链得到。
本发明所述的多肽能与类风湿关节炎自身免疫抗体相结合。
进一步地说，所述的多肽与类风湿关节炎自身免疫抗体相结合的专一性大于90％。
更进一步的，所述的多肽与类风湿关节炎自身免疫抗体相结合的专一性大于95％。
进一步地说，所述的多肽对类风湿关节炎自身免疫抗体的灵敏度大于70％。
更进一步的，所述的多肽对类风湿关节炎自身免疫抗体的灵敏度大于75％。
本发明所述的多肽对HLA—DR具有高亲和力，与HLA—DR相结合形成HLA—DR—多肽复合物。
本发明所述的多肽能应用于类风湿关节炎疾病自身免疫抗体的体外检测。
本发明所述的类风湿关节炎疾病自身免疫抗体的体外检测的应用，其一般方法为将待测血清(serums)与包含有上述的多肽(即抗原)试剂混合，检测所述多肽与血清中抗体所形成的复合物。检测结果呈阳性表明，该血清中具有类风湿关节炎疾病自身免疫抗体。
具体地说，所述的体外检测中应用为ELISA检测。
所述应用于ELISA检测方法中的多肽，具体选择经生物素标记的多肽，其能与亲和素或链霉亲和素非共价结合。所述的亲和素(Avidin)是一种相对分子质量为68,000Da，pI为10.5的一种碱性糖蛋白，又称卵白素，在鸡蛋清中含量比较丰富，一般从蛋白清中提取。所述的链霉亲和素(Streptavidin)是一种从链霉菌(Streptomyces avidinii)培养物中提取的蛋白质，相对分子质量60,000Da，不具有糖链。其特性与亲和素一样，也具有4个生物素结合位点，与生物素具有高亲和力。
所述的多肽与生物素标记相结合的方法可以通过先由固相合成或基因工程表达并纯化，所得多肽再与生物素连接并纯化(如申请号为200310108264.0中国发明专利所公开的技术方案)。
所述的多肽与生物素标记相结合的方法还可以在多肽的固相合成过程中先与生物素连接再纯化的方式(Pept.Res.1989，2，189—194)。
具体地说，所述的结合有生物素的多肽，其上生物素与多肽的N末端相结合。
所述的ELISA检测方法具体的实验步骤可以参见US6,858,438中关于ELISA检测的相应部分。
其基本原理是：多肽(抗原)包被在酶标板表面，将稀释后的待检血清/血浆和对照物加入反应板孔中，如果被检血清/血浆中存在抗CCP抗体，经温育后，则血清/血浆中特异性抗体与反应板孔中的CCP抗原多肽结合，形成固相抗原-抗体复合物，洗去未结合的血清/血浆中其它成分，加入酶标记的抗人IgG抗体，温育，固相CCP抗原(多肽)结合的抗CCP抗体再与酶标记的抗人IgG抗体结合，洗去未结合的酶标记抗体成分，加入酶底物，并被催化成为有色产物，最后加入终止液终止反应。根据试剂盒内的对照物，可对抗CCP抗体进行定量或定性测定。
本发明所述的抗人IgG抗体为辣根过氧化物酶(horseradishperoxidase，HRP)标记的抗人IgG抗体其具体配制方式为，取20μL储存液，加800ml抗体稀释液作1：40000稀释，混匀，分装标准小瓶，每瓶15ml，2～8℃下保存。
其中HRP标记的抗人IgG抗体底物A配制方式为：称取柠檬酸17.9g和Na2HPO4·122O 4.67g溶解于400ml去离子水中，然后缓慢加入30％H2O2330μL，搅拌均匀后，加水至500ml，2～8℃下保存。
其中HRP标记的抗人IgG抗体底物B配制方式为：称取四甲基联苯氨(tetramethyl benzidine，TMB)0.1g于100ml去离子水中，加入二甲基亚砜(DMSO)2.5ml，在搅拌的同时，缓慢加入0.5ml 6M HCL，直至完全溶解，最后加水至500ml，2～8℃下保存。
其中HRP标记的抗人IgG抗体底物反应终止液的配制方式：分别量取55ml98％H2SO4和去离子水445ml，然后将浓硫酸缓慢加入到去离子水中，混匀，2～8℃下保存。
酶标仪测定波长设定在450nm，30分钟内测定各孔OD450值。
本发明所述的多肽，其上序列至少有一精氨酸侧链经修饰后呈现电中性或电负性，并优先选择瓜氨酸。通过序列上两个不相邻的半胱氨酸侧链巯基形成二硫键的方式，产生环状的多肽。这类多肽不仅能与类风湿关节炎自身免疫抗体相结合，同时还能对HLA—DR具有高亲和力。经过实验验证，该类多肽与类风湿关节炎自身免疫抗体相结合的专一性大于95％，对类风湿关节炎自身免疫抗体的检测灵敏度大于75％。与市场上销售的同类产品相比，其灵敏度得到显著提高，更有利于类风湿关节炎自身免疫抗体的体外检测。
附图说明
图1：RP-HPLC检测的多肽1纯度色谱图，横轴表示时间，单位：分钟(min)，纵轴表示电压，单位：毫伏(mv)；
图2：RP-HPLC检测的多肽2纯度色谱图；
图3：ESI检测的多肽1质谱图，横轴表示质/核比(m/z)；
图4：ESI检测的多肽2质谱图。
图5：RP-HPLC检测的生物素—多肽1纯度色谱图；
图6：RP-HPLC检测的生物素—多肽2纯度色谱图；
图7：ESI检测的生物素—多肽1质谱图；
图8：ESI检测的生物素—多肽2质谱图。
具体实施方式
以下结合附图详细描述本发明的技术方案。本发明实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围中。
本发明所用的试剂若未明确指明，则均购自西格玛—奥德里奇(Sigma—Aldrich)。
实施例1 多肽的合成
多肽采用Fmoc化学方法，通过固相合成技术合成。该方法的具体步骤参见Eur.J.Immunol.1994，24，3188—3193；J.Org.Chem.1972，37，3404—3409；黄惟德，陈常庆多肽合成，北京：科学出版社，1985。
二硫键的形成方法及其步骤可以参见文献：黄惟德，陈常庆多肽合成，北京：科学出版社，1985，p85；Michael W.Pennington Peptide SynthesisProtocols(Methods in Molecular Biology)，Humana Press，1994，p91-169
通过上述步骤，合成多肽的具体序列为：
多肽1：His—Glu—Cys—His—Glu—Phe—Arg—Phe—Cit—Gly—Cit—Ser—Arg—Ala—Ala—Cys—Glu(SEQ ID No 1)，其上第三位和第十六位Cys通过巯基形成二硫键，并使多肽形成环状结构，并能模拟β—转角结构。
多肽2：His—Glu—Cys—Ala—Arg—Phe—Glu—Met—Arg—His—Cit—Arg—Leu—Ile—Arg—Cys—Glu(SEQ ID No 119)，其上第三位和第十六位Cys通过巯基形成二硫键，并使多肽形成环状结构，并能模拟β—转角结构。
实施例2 多肽的纯化
先将蛋白质或多肽末端的保护基在二甲基酰胺(DMF)溶剂中脱保护，中和。再用氟化氢将多肽从合成树脂上切下，得到的粗产物经过反相色谱C18或C8柱(如：5μm，250×4.6mm)，以流动相A(0.1％(v/v)三氟乙酸乙腈溶液)和流动相B(0.1％(v/v)三氟乙酸水溶液)为梯度洗脱溶剂。在45分钟内，流动相A占A、B两相总体积0％(v/v)变化到100％(v/v)收集得到目标多肽，通过脱盐色谱柱(GE Healthcare)或旋转蒸发去除有机溶剂，目标多肽可以通过LC—MS连用或将收集得到的多肽直接进样的方式通过ESI质谱得到的分子量来确定。(参见：中国分析化学2002，30，1126—9)
实施例3 多肽的纯度与分子量检测
上述合成出的多肽1和多肽2分别通过反相色谱(RP-HPLC)测定，其具体方法为：
4.6×250mm 5μm C18分析柱(Kromasil)；
流动相A为三氟乙酸(trifluoroacetic，TFA)加入100％乙腈(acetonitrile，ACN)中，使得TFA浓度为0.1％(v/v)；
流动相B为TFA加入100％水中，使得TFA浓度为0.1％(v/v)；
流速为1.0ml/min；
检测波长为220nm；
洗脱梯度：以流动相A占A、B两项总体积15％(v/v)的比例平衡，进样后，采用线性梯度洗脱(Gradient Elution)，在25分钟内流动相A占A、B两项总体积从15％(v/v)改变至50％(v/v)的比例，之后以100％(v/v)流动相A平衡5分钟。
多肽1的保留时间(Retention Time)为12.5(图1)，其纯度大于95％。
多肽2的保留时间(Retention Time)为13.2(图2)，其纯度大于95％。
通过ESI质谱分别测定多肽1(图3)和多肽2的分子量(图4)，其具体条件为：
质谱(Probe)                             ESI
质谱电压(Probe bias)                    +4.5kv
喷雾器流速(Nebulizer Gas Flow)          1.5L/min
检测器(Detector)                        1.5kv
样品电离化装置(CDL)                     -20.0v
流动相流速(T.Flow)                             0.2ml/min
CDL温度(CDL Temp)                              250℃
缓冲液浓度(B.conc)                             50％H2O，50％ACN
加热块温度(Block Temp)                         200℃
多肽1分子量为2017.26Da；多肽2分子量为2167.59Da。
实施例4 多肽的生物素标记
生物素—多肽1(SEQ ID No 1)和生物素—多肽2(SEQ ID No 119)均采用在固相合成过程中先与生物素连接再纯化的方式分别进行，其具体方式参见Deibel，M.R.，Jr.，Lobl，T.J.and Yem，A.W.，A technique for rapidpurification of low yield products：Biotinylation of chemically synthesizedproteins on-resin.Pept.Res.1989，2，189—194。
当生物素通过缩合剂在多肽合成时直接缩合后，使用Kaiser test检测缩合反应是否完全。该反应的详细说明请参见Sigma—Aldrich 60017产品说明(60017 Data Sheet)，该方法可不仅应用于定性(Analytical Biochemistry1970，34，595)，还能进行定量(Analytical Biochemistry 1981，117，147)检测。
通过实施例1公开的二硫键形成方法，在多肽第三位和第十六位Cys通过巯基形成二硫键，并使多肽形成环状结构。
实施例5 多肽与生物素结合后的分离和纯化
在树脂上进行生物素标记。首先，蛋白质或多肽末端在二甲基酰胺(DMF)溶剂中脱保护，中和；然后与N-羟基琥珀酰亚胺生物素反应(即生物素化)，反应条件为45℃24小时；再用氟化氢将标记有生物素的多肽切下，得到的粗产物经过亲和素偶联琼脂的亲和层析柱(GEHealthcare)，用磷酸盐缓冲液洗涤，去除未结合的成分，最后用0.1M的甘氨酸溶液(pH2.0)洗脱，得到生物素化的蛋白质或多肽。
实施例6多肽(SEQ.ID No 2—118，SEQ.ID No 120—261)的合成与生物素标记
如实施例1的同样方法可以得到环形多肽(SEQ.ID No 2—118，SEQ.ID No 120—261)。
如实施例4的同样方法可以得到经生物素标记的多肽(SEQ.ID No 2—118，SEQ.ID No 120—261)。
实施例7 生物素—多肽的纯度与分子量检测
上述合成出的环形生物素—多肽1和环形生物素—多肽2分别通过反相色谱(RP-HPLC)测定，其具体方法为：
4.6×250mm 5μm C18分析柱(Kromasil)；
流动相A为三氟乙酸(trifluoroacetic，TFA)加入100％乙腈(acetonitrile，ACN)中，使得TFA浓度为0.1％(v/v)；
流动相B为TFA加入100％水中，使得TFA浓度为0.1％(v/v)；
流速为1.0ml/min；
检测波长为220nm；
洗脱梯度：以流动相A占A、B两项总体积15％(v/v)的比例平衡，进样后，采用线性梯度洗脱(Gradient Elution)，在25分钟内流动相A占A、B两项总体积从15％(v/v)改变至50％(v/v)的比例，之后以100％(v/v)流动相A平衡5分钟。
环形生物素—多肽1的保留时间(Retention Time)为8.4(图1)，其纯度大于95％。
环形生物素—多肽2的保留时间(Retention Time)为13.5(图2)，其纯度大于95％。
通过ESI质谱分别测定多肽1和多肽2的分子量，其具体条件为：
质谱(Probe)                               ESI
质谱电压(Probe bias)                      +4.5kv
喷雾器流速(Nebulizer Gas Flow)            1.5L/min
检测器(Detector)                          1.5kv
样品电离化装置(CDL)                       -20.0v
流动相流速(T.Flow)                        0.2ml/min
CDL温度(CDL Temp)                         250℃
缓冲液浓度(B.conc)                        50％H2O，50％ACN
加热块温度(Block Temp)                    200℃
根据峰值和其所带的电荷来计算，生物素—多肽1实测分子量为，748.80峰值的[M+3H+]3+，计算为748.80×3—3＝2243.40Da；生物素—多肽2中实测分子量为，599.20峰值的[M+4H+]4+，计算为599.20×4—4＝2392.80Da。
该数值与生物素—多肽1(Mw＝2243.56Da)和生物素—多肽2(Mw＝2393.86Da)的理论分子量一致。
实施例8 类风湿关节炎抗体的体外检测
使用ELISA方法检测类风湿关节炎患者的血清中自身免疫抗体，具体的实验步骤可以参见US6,858,438中关于ELISA检测的相应部分。
其基本原理是：多肽(抗原)包被在酶标板表面，将稀释后的待检血清/血浆和对照物加入反应板孔中，如果被检血清/血浆中存在抗CCP抗体，经温育后，则血清/血浆中特异性抗体与反应板孔中的CCP抗原多肽结合，形成固相抗原-抗体复合物，洗去未结合的血清/血浆中其它成分，加入酶标记的抗人IgG抗体，温育，固相CCP抗原(多肽)结合的抗CCP抗体再与酶标记的抗人IgG抗体结合，洗去未结合的酶标记抗体成分，加入酶底物，并被催化成为有色产物，最后加入终止液终止反应。根据试剂盒内的对照物，可对抗CCP抗体进行定量或定性测定。
本发明所述的抗人IgG抗体为HRP标记的兔抗人IgG抗体采购于武汉博士德生物工程有限公司(货号：BA1070)。其具体配制方式为，取20μL储存液，加800ml抗体稀释液作1：40000稀释，混匀，分装标准小瓶，每瓶15ml，2～8℃下保存。抗体稀释液购自Pierce公司(货号：37552)。
HRP标记的抗人IgG抗体底物A配制：称取柠檬酸17.9g和Na2HPO4·122O 4.67g溶解于400ml去离子水中，然后缓慢加入30％H2O2330μL，搅拌均匀后，加水至500ml，2～8℃下保存。
HRP标记的抗人IgG抗体底物B配制：称取四甲基联苯氨(tetramethylbenzidine，TMB)0.1g于100ml去离子水中，加入二甲基亚砜(DMSO)2.5ml，在搅拌的同时，缓慢加入0.5ml 6M HCl，直至完全溶解，最后加水至500ml，2～8℃下保存。
HRP标记的抗人IgG抗体底物反应终止液的配制：分别量取55ml98％H2SO4和去离子水445ml，然后将浓硫酸缓慢加入到去离子水中，混匀，2～8℃下保存。
酶标仪测定波长设定在450nm，30分钟内测定各孔OD450值。
将实施例1中合成的两种环形多肽分别与类风湿关节炎患者血清进行实验。
Figure G2008102010318D00171
多肽1敏感性＝真阳性/(真阳性+假阴性)＝107/147＝72.79％
多肽2敏感性＝真阳性/(真阳性+假阴性)＝103/147＝70.01％
将实施例1中合成的两种环形多肽分别与非类风湿关节炎患者血清进行实验。
Figure G2008102010318D00172
多肽1专一性＝真阴性/(真阴性+假阳性)＝151/156＝96.79％
多肽1专一性＝真阴性/(真阴性+假阳性)＝149/156＝95.51％
实施例9 生物素标记多肽用于类风湿关节炎抗体的体外检测
加有0.05％(v/v)Tween-20的pH7.4磷酸缓冲盐溶液(PBST)稀释链霉亲和素，使其浓度为5μg/ml。然后加入到酶标板各孔中，4℃过夜，取出酶标板，去除包被液，用pH7.4的PBST溶液洗2次，然后加入PBST稀释的生物素标记的多肽，室温孵育1小时(在脱色摇床上混匀)，洗板，备用。
将稀释后的待检血清/血浆和对照物加入反应板孔中，如果被检血清/血浆中存在抗CCP抗体，经温育后，则血清/血浆中特异性抗体与反应板孔中的CCP抗原多肽结合，形成固相抗原-抗体复合物，洗去未结合的血清/血浆中其它成分，加入酶标记的抗人IgG抗体，温育，固相CCP抗原(多肽)结合的抗CCP抗体再与酶标记的抗人IgG抗体结合，洗去未结合的酶标记抗体成分，加入酶底物，并被催化成为有色产物，最后加入终止液终止反应。根据试剂盒内的对照物，可对抗CCP抗体进行定量或定性测定。
后续操作及所用试剂与实施例8记载相一致。
将使用实施例1和4中公开的方法合成的两种环形生物素—多肽(生物素—多肽1和生物素—多肽2)分别与类风湿关节炎患者血清进行实验。
Figure G2008102010318D00181
多肽1敏感性＝真阳性/(真阳性+假阴性)＝47/61＝77.0％
多肽2敏感性＝真阳性/(真阳性+假阴性)＝43/61＝70.5％
将使用实施例1和4中公开的方法合成的两种环形生物素—多肽分别与非类风湿关节炎患者血清进行实验。
Figure G2008102010318D00182
多肽1专一性＝真阴性/(真阴性+假阳性)＝91/95＝95.8％
多肽1专一性＝真阴性/(真阴性+假阳性)＝94/95＝98.9％
序列表
<110>上海荣盛生物药业有限公司
<120>与免疫抗体相结合的多肽及其应用
<130>0811448
<160>261
<170>PatentIn version 3.3
<210>SEQ ID No 1
<211>17
<212>PRT
<213>人工合成
<223>Xaa为瓜氨酸
<400>1
Figure G2008102010318D00191
<210>SEQ ID No 2
<211>17
<212>PRT
<213>人工合成
<223>Xaa为瓜氨酸
<400>2
Figure G2008102010318D00192
<210>SEQ ID No 3
<211>17
<212>PRT
<213>人工合成
<223>Xaa为瓜氨酸
<400>3
Figure G2008102010318D00193
<210>SEQ ID No 4
<211>17
<212>PRT
<213>人工合成
<223>Xaa为瓜氨酸
<400>4
Figure G2008102010318D00201
<210>SEQ ID No 5
<211>17
<212>PRT
<213>人工合成
<223>Xaa为瓜氨酸
<400>5
Figure G2008102010318D00202
<210>SEQ ID No 6
<211>17
<212>PRT
<213>人工合成
<223>Xaa为瓜氨酸
<400>6
Figure G2008102010318D00203
<210>SEQ ID No 7
<211>17
<212>PRT
<213>人工合成
<223>Xaa为瓜氨酸
<400>7
Figure G2008102010318D00204
<210>SEQ ID No 8
<211>17
<212>PRT
<213>人工合成
<223>Xaa为瓜氨酸
<400>8
Figure G2008102010318D00205
Figure G2008102010318D00211
<210>SEQ ID No 9
<211>17
<212>PRT
<213>人工合成
<223>Xaa为瓜氨酸
<400>9
Figure G2008102010318D00212
<210>SEQ ID No 10
<211>17
<212>PRT
<213>人工合成
<223>Xaa为瓜氨酸
<400>10
Figure G2008102010318D00213
<210>SEQ ID No 11
<211>17
<212>PRT
<213>人工合成
<223>Xaa为瓜氨酸
<400>11
Figure G2008102010318D00214
<210>SEQ ID No 12
<211>17
<212>PRT
<213>人工合成
<223>Xaa为瓜氨酸
<400>12
Figure G2008102010318D00215
<210>SEQ ID No 13
<211>17
<212>PRT
<213>人工合成
<223>Xaa为瓜氨酸
<400>13
<210>SEQ ID No 14
<211>17
<212>PRT
<213>人工合成
<223>Xaa为瓜氨酸
<400>14
<210>SEQ ID No 15
<211>17
<212>PRT
<213>人工合成
<223>Xaa为瓜氨酸
<400>15
Figure G2008102010318D00223
<210>SEQ ID No 16
<211>17
<212>PRT
<213>人工合成
<223>Xaa为瓜氨酸
<400>16
<210>SEQ ID No 17
<211>17
<212>PRT
<213>人工合成
<223>Xaa为瓜氨酸
<400>17
Figure G2008102010318D00231
<210>SEQ ID No 18
<211>17
<212>PRT
<213>人工合成
<223>Xaa为瓜氨酸
<400>18
Figure G2008102010318D00232
<210>SEQ ID No 19
<211>17
<212>PRT
<213>人工合成
<223>Xaa为瓜氨酸
<400>19
Figure G2008102010318D00233
<210>SEQ ID No 20
<211>17
<212>PRT
<213>人工合成
<223>Xaa为瓜氨酸
<400>20
Figure G2008102010318D00234
<210>SEQ ID No 21
<211>17
<212>PRT
<213>人工合成
<223>Xaa为瓜氨酸
<400>21
Figure G2008102010318D00241
<210>SEQ ID No 22
<211>17
<212>PRT
<213>人工合成
<223>Xaa为瓜氨酸
<400>22
<210>SEQ ID No 22
<211>17
<212>PRT
<213>人工合成
<223>Xaa为瓜氨酸
<400>22
Figure G2008102010318D00244
<210>SEQ ID No 24
<211>17
<212>PRT
<213>人工合成
<223>Xaa为瓜氨酸
<400>24
Figure G2008102010318D00245
<210>SEQ ID No 25
<211>17
<212>PRT
<213>人工合成
<223>Xaa为瓜氨酸
<400>25
Figure G2008102010318D00246
Figure G2008102010318D00251
<210>SEQ ID No 26
<211>17
<212>PRT
<213>人工合成
<223>Xaa为瓜氨酸
<400>26
<210>SEQ ID No 27
<211>17
<212>PRT
<213>人工合成
<223>Xaa为瓜氨酸
<400>27
<210>SEQ ID No 28
<211>17
<212>PRT
<213>人工合成
<223>Xaa为瓜氨酸
<400>28
Figure G2008102010318D00254
<210>SEQ ID No 29
<211>17
<212>PRT
<213>人工合成
<223>Xaa为瓜氨酸
<400>29
Figure G2008102010318D00255
<210>SEQ ID No 30
<211>17
<212>PRT
<213>人工合成
<223>Xaa为瓜氨酸
<400>30
Figure G2008102010318D00261
<210>SEQ ID No 31
<211>17
<212>PRT
<213>人工合成
<223>Xaa为瓜氨酸
<400>31
<210>SEQ ID No 32
<211>17
<212>PRT
<213>人工合成
<223>Xaa为瓜氨酸
<400>32
Figure G2008102010318D00263
<210>SEQ ID No 33
<211>17
<212>PRT
<213>人工合成
<223>Xaa为瓜氨酸
<400>33
Figure G2008102010318D00264
<210>SEQ ID No 34
<211>17
<212>PRT
<213>人工合成
<223>Xaa为瓜氨酸
<400>34
<210>SEQ ID No 35
<211>17
<212>PRT
<213>人工合成
<223>Xaa为瓜氨酸
<400>35
Figure G2008102010318D00272
<210>SEQ ID No 36
<211>17
<212>PRT
<213>人工合成
<223>Xaa为瓜氨酸
<400>36
<210>SEQ ID No 37
<211>17
<212>PRT
<213>人工合成
<223>Xaa为瓜氨酸
<400>37
Figure G2008102010318D00274
<210>SEQ ID No 38
<211>17
<212>PRT
<213>人工合成
<223>Xaa为瓜氨酸
<400>38
Figure G2008102010318D00281
<210>SEQ ID No 39
<211>17
<212>PRT
<213>人工合成
<223>Xaa为瓜氨酸
<400>39
Figure G2008102010318D00282
<210>SEQ ID No 40
<211>17
<212>PRT
<213>人工合成
<223>Xaa为瓜氨酸
<400>40
Figure G2008102010318D00283
<210>SEQ ID No 41
<211>17
<212>PRT
<213>人工合成
<223>Xaa为瓜氨酸
<400>41
Figure G2008102010318D00284
<210>SEQ ID No 42
<211>17
<212>PRT
<213>人工合成
<223>Xaa为瓜氨酸
<400>42
Figure G2008102010318D00291
<210>SEQ ID No 43
<211>17
<212>PRT
<213>人工合成
<223>Xaa为瓜氨酸
<400>43
<210>SEQ ID No 44
<211>17
<212>PRT
<213>人工合成
<223>Xaa为瓜氨酸
<400>44
Figure G2008102010318D00293
<210>SEQ ID No 45
<211>17
<212>PRT
<213>人工合成
<223>Xaa为瓜氨酸
<400>45
Figure G2008102010318D00294
<210>SEQ ID No 46
<211>17
<212>PRT
<213>人工合成
<223>Xaa为瓜氨酸
<400>46
Figure G2008102010318D00295
Figure G2008102010318D00301
<210>SEQ ID No 47
<211>17
<212>PRT
<213>人工合成
<223>Xaa为瓜氨酸
<400>47
Figure G2008102010318D00302
<210>SEQ ID No 48
<211>17
<212>PRT
<213>人工合成
<223>Xaa为瓜氨酸
<400>48
Figure G2008102010318D00303
<210>SEQ ID No 49
<211>17
<212>PRT
<213>人工合成
<223>Xaa为瓜氨酸
<400>49
Figure G2008102010318D00304
<210>SEQ ID No 50
<211>17
<212>PRT
<213>人工合成
<223>Xaa为瓜氨酸
<400>50
Figure G2008102010318D00305
<210>SEQ ID No 51
<211>17
<212>PRT
<213>人工合成
<223>Xaa为瓜氨酸
<400>51
Figure G2008102010318D00311
<210>SEQ ID No 52
<211>17
<212>PRT
<213>人工合成
<223>Xaa为瓜氨酸
<400>52
Figure G2008102010318D00312
<210>SEQ ID No 53
<211>17
<212>PRT
<213>人工合成
<223>Xaa为瓜氨酸
<400>53
Figure G2008102010318D00313
<210>SEQ ID No 54
<211>17
<212>PRT
<213>人工合成
<223>Xaa为瓜氨酸
<400>54
Figure G2008102010318D00314
<210>SEQ ID No 55
<211>17
<212>PRT
<213>人工合成
<223>Xaa为瓜氨酸
<400>55
Figure G2008102010318D00321
<210>SEQ ID No 56
<211>17
<212>PRT
<213>人工合成
<223>Xaa为瓜氨酸
<400>56
Figure G2008102010318D00322
<210>SEQ ID No 57
<211>17
<212>PRT
<213>人工合成
<223>Xaa为瓜氨酸
<400>57
Figure G2008102010318D00323
<210>SEQ ID No 58
<211>17
<212>PRT
<213>人工合成
<223>Xaa为瓜氨酸
<400>58
Figure G2008102010318D00324
<210>SEQ ID No 59
<211>17
<212>PRT
<213>人工合成
<223>Xaa为瓜氨酸
<400>59
Figure G2008102010318D00331
<210>SEQ ID No 60
<211>17
<212>PRT
<213>人工合成
<223>Xaa为瓜氨酸
<400>60
Figure G2008102010318D00332
<210>SEQ ID No 61
<211>17
<212>PRT
<213>人工合成
<223>Xaa为瓜氨酸
<400>61
Figure G2008102010318D00333
<210>SEQ ID No 62
<211>17
<212>PRT
<213>人工合成
<223>Xaa为瓜氨酸
<400>62
Figure G2008102010318D00334
<210>SEQ ID No 63
<211>17
<212>PRT
<213>人工合成
<223>Xaa为瓜氨酸
<400>63
Figure G2008102010318D00335
Figure G2008102010318D0034142350QIETU
<210>SEQ ID No 64
<211>17
<212>PRT
<213>人工合成
<223>Xaa为瓜氨酸
<400>64
Figure G2008102010318D00341
<210>SEQ ID No 65
<211>17
<212>PRT
<213>人工合成
<223>Xaa为瓜氨酸
<400>65
Figure G2008102010318D00342
<210>SEQ ID No 66
<211>17
<212>PRT
<213>人工合成
<223>Xaa为瓜氨酸
<400>66
Figure G2008102010318D00343
<210>SEQ ID No 67
<211>17
<212>PRT
<213>人工合成
<223>Xaa为瓜氨酸
<400>67
Figure G2008102010318D00344
<210>SEQ ID No 68
<211>17
<212>PRT
<213>人工合成
<223>Xaa为瓜氨酸
<400>68
Figure G2008102010318D00351
<210>SEQ ID No 69
<211>17
<212>PRT
<213>人工合成
<223>Xaa为瓜氨酸
<400>69
Figure G2008102010318D00352
<210>SEQ ID No 70
<211>17
<212>PRT
<213>人工合成
<223>Xaa为瓜氨酸
<400>70
Figure G2008102010318D00353
<210>SEQ ID No 71
<211>17
<212>PRT
<213>人工合成
<223>Xaa为瓜氨酸
<400>71
Figure G2008102010318D00354
<210>SEQ ID No 72
<211>17
<212>PRT
<213>人工合成
<223>Xaa为瓜氨酸
<400>72
Figure G2008102010318D00361
<210>SEQ ID No 73
<211>17
<212>PRT
<213>人工合成
<223>Xaa为瓜氨酸
<400>73
<210>SEQ ID No 74
<211>17
<212>PRT
<213>人工合成
<223>Xaa为瓜氨酸
<400>74
<210>SEQ ID No 75
<211>17
<212>PRT
<213>人工合成
<223>Xaa为瓜氨酸
<400>75
Figure G2008102010318D00364
<210>SEQ ID No 76
<211>17
<212>PRT
<213>人工合成
<223>Xaa为瓜氨酸
<400>76
Figure G2008102010318D00371
<210>SEQ ID No 77
<211>17
<212>PRT
<213>人工合成
<223>Xaa为瓜氨酸
<400>77
Figure G2008102010318D00372
<210>SEQ ID No 78
<211>17
<212>PRT
<213>人工合成
<223>Xaa为瓜氨酸
<400>78
Figure G2008102010318D00373
<210>SEQ ID No 79
<211>17
<212>PRT
<213>人工合成
<223>Xaa为瓜氨酸
<400>79
Figure G2008102010318D00374
<210>SEQ ID No 80
<211>17
<212>PRT
<213>人工合成
<223>Xaa为瓜氨酸
<400>80
Figure G2008102010318D00375
Figure G2008102010318D00381
<210>SEQ ID No 81
<211>17
<212>PRT
<213>人工合成
<223>Xaa为瓜氨酸
<400>81
Figure G2008102010318D00382
<210>SEQ ID No 82
<211>17
<212>PRT
<213>人工合成
<223>Xaa为瓜氨酸
<400>82
<210>SEQ ID No 83
<211>17
<212>PRT
<213>人工合成
<223>Xaa为瓜氨酸
<400>83
Figure G2008102010318D00384
<210>SEQ ID No 84
<211>17
<212>PRT
<213>人工合成
<223>Xaa为瓜氨酸
<400>84
Figure G2008102010318D00385
<210>SEQ ID No 85
<211>17
<212>PRT
<213>人工合成
<223>Xaa为瓜氨酸
<400>85
Figure G2008102010318D00391
<210>SEQ ID No 86
<211>17
<212>PRT
<213>人工合成
<223>Xaa为瓜氨酸
<400>86
Figure G2008102010318D00392
<210>SEQ ID No 87
<211>17
<212>PRT
<213>人工合成
<223>Xaa为瓜氨酸
<400>87
<210>SEQ ID No 88
<211>17
<212>PRT
<213>人工合成
<223>Xaa为瓜氨酸
<400>88
Figure G2008102010318D00394
<210>SEQ ID No 89
<211>17
<212>PRT
<213>人工合成
<223>Xaa为瓜氨酸
<400>89
<210>SEQ ID No 90
<211>17
<212>PRT
<213>人工合成
<223>Xaa为瓜氨酸
<400>90
Figure G2008102010318D00402
<210>SEQ ID No 91
<211>17
<212>PRT
<213>人工合成
<223>Xaa为瓜氨酸
<400>91
Figure G2008102010318D00403
<210>SEQ ID No 92
<211>17
<212>PRT
<213>人工合成
<223>Xaa为瓜氨酸
<400>92
Figure G2008102010318D00404
<210>SEQ ID No 93
<211>17
<212>PRT
<213>人工合成
<223>Xaa为瓜氨酸
<400>93
Figure G2008102010318D00411
<210>SEQ ID No 94
<211>17
<212>PRT
<213>人工合成
<223>Xaa为瓜氨酸
<400>94
Figure G2008102010318D00412
<210>SEQ ID No 95
<211>17
<212>PRT
<213>人工合成
<223>Xaa为瓜氨酸
<400>95
Figure G2008102010318D00413
<210>SEQ ID No 96
<211>17
<212>PRT
<213>人工合成
<223>Xaa为瓜氨酸
<400>96
Figure G2008102010318D00414
<210>SEQ ID No 97
<211>17
<212>PRT
<213>人工合成
<223>Xaa为瓜氨酸
<400>97
Figure G2008102010318D00421
<210>SEQ ID No 98
<211>17
<212>PRT
<213>人工合成
<223>Xaa为瓜氨酸
<400>98
Figure G2008102010318D00422
<210>SEQ ID No 99
<211>17
<212>PRT
<213>人工合成
<223>Xaa为瓜氨酸
<400>99
Figure G2008102010318D00423
<210>SEQ ID No 100
<211>17
<212>PRT
<213>人工合成
<223>Xaa为瓜氨酸
<400>100
Figure G2008102010318D00424
<210>SEQ ID No 101
<211>17
<212>PRT
<213>人工合成
<223>Xaa为瓜氨酸
<400>101
Figure G2008102010318D00431
<210>SEQ ID No 102
<211>17
<212>PRT
<213>人工合成
<223>Xaa为瓜氨酸
<400>102
Figure G2008102010318D00432
<210>SEQ ID No 103
<211>17
<212>PRT
<213>人工合成
<223>Xaa为瓜氨酸
<400>103
Figure G2008102010318D00433
<210>SEQ ID No 104
<211>17
<212>PRT
<213>人工合成
<223>Xaa为瓜氨酸
<400>1
Figure G2008102010318D00434
<210>SEQ ID No 105
<211>17
<212>PRT
<213>人工合成
<223>Xaa为瓜氨酸
<400>105
Figure G2008102010318D00435
<210>SEQ ID No 106
<211>17
<212>PRT
<213>人工合成
<223>Xaa为瓜氨酸
<400>106
Figure G2008102010318D00441
<210>SEQ ID No 107
<211>17
<212>PRT
<213>人工合成
<223>Xaa为瓜氨酸
<400>107
Figure G2008102010318D00442
<210>SEQ ID No 108
<211>17
<212>PRT
<213>人工合成
<223>Xaa为瓜氨酸
<400>108
Figure G2008102010318D00443
<210>SEQ ID No 109
<211>17
<212>PRT
<213>人工合成
<223>Xaa为瓜氨酸
<400>109
Figure G2008102010318D00444
<210>SEQ ID No 110
<211>17
<212>PRT
<213>人工合成
<223>Xaa为瓜氨酸
<400>110
Figure G2008102010318D00451
<210>SEQ ID No 111
<211>17
<212>PRT
<213>人工合成
<223>Xaa为瓜氨酸
<400>111
Figure G2008102010318D00452
<210>SEQ ID No 112
<211>17
<212>PRT
<213>人工合成
<223>Xaa为瓜氨酸
<400>112
Figure G2008102010318D00453
<210>SEQ ID No 113
<211>17
<212>PRT
<213>人工合成
<223>Xaa为瓜氨酸
<400>113
Figure G2008102010318D00454
<210>SEQ ID No 114
<211>17
<212>PRT
<213>人工合成
<223>Xaa为瓜氨酸
<400>114
Figure G2008102010318D00461
<210>SEQ ID No 115
<211>17
<212>PRT
<213>人工合成
<223>Xaa为瓜氨酸
<400>115
Figure G2008102010318D00462
<210>SEQ ID No 116
<211>17
<212>PRT
<213>人工合成
<223>Xaa为瓜氨酸
<400>116
Figure G2008102010318D00463
<210>SEQ ID No 117
<211>17
<212>PRT
<213>人工合成
<223>Xaa为瓜氨酸
<400>117
Figure G2008102010318D00464
<210>SEQ ID No 118
<211>17
<212>PRT
<213>人工合成
<223>Xaa为瓜氨酸
<400>118
Figure G2008102010318D00465
Figure G2008102010318D00471
<210>SEQ ID No 119
<211>17
<212>PRT
<213>人工合成
<223>Xaa为瓜氨酸
<400>119
Figure G2008102010318D00472
<210>SEQ ID No 120
<211>17
<212>PRT
<213>人工合成
<223>Xaa为瓜氨酸
<400>120
Figure G2008102010318D00473
<210>SEQ ID No 121
<211>17
<212>PRT
<213>人工合成
<223>Xaa为瓜氨酸
<400>121
Figure G2008102010318D00474
<210>SEQ ID No 122
<211>17
<212>PRT
<213>人工合成
<223>Xaa为瓜氨酸
<400>122
Figure G2008102010318D00475
<210>SEQ ID No 123
<211>17
<212>PRT
<213>人工合成
<223>Xaa为瓜氨酸
<400>35
Figure G2008102010318D00481
<210>SEQ ID No 124
<211>17
<212>PRT
<213>人工合成
<223>Xaa为瓜氨酸
<400>36
Figure G2008102010318D00482
<210>SEQ ID No 125
<211>17
<212>PRT
<213>人工合成
<223>Xaa为瓜氨酸
<400>125
<210>SEQ ID No 126
<211>17
<212>PRT
<213>人工合成
<223>Xaa为瓜氨酸
<400>126
Figure G2008102010318D00484
<210>SEQ ID No 127
<211>17
<212>PRT
<213>人工合成
<223>Xaa为瓜氨酸
<400>127
Figure G2008102010318D00491
<210>SEQ ID No 128
<211>17
<212>PRT
<213>人工合成
<223>Xaa为瓜氨酸
<400>128
Figure G2008102010318D00492
<210>SEQ ID No 129
<211>17
<212>PRT
<213>人工合成
<223>Xaa为瓜氨酸
<400>129
<210>SEQ ID No 130
<211>17
<212>PRT
<213>人工合成
<223>Xaa为瓜氨酸
<400>131
Figure G2008102010318D00494
<210>SEQ ID No 132
<211>17
<212>PRT
<213>人工合成
<223>Xaa为瓜氨酸
<400>132
Figure G2008102010318D00501
<210>SEQ ID No 133
<211>17
<212>PRT
<213>人工合成
<223>Xaa为瓜氨酸
<400>133
<210>SEQ ID No 134
<211>17
<212>PRT
<213>人工合成
<223>Xaa为瓜氨酸
<400>134
Figure G2008102010318D00503
<210>SEQ ID No 135
<211>17
<212>PRT
<213>人工合成
<223>Xaa为瓜氨酸
<400>135
<210>SEQ ID No 136
<211>17
<212>PRT
<213>人工合成
<223>Xaa为瓜氨酸
<400>136
Figure G2008102010318D00511
<210>SEQ ID No 137
<211>17
<212>PRT
<213>人工合成
<223>Xaa为瓜氨酸
<400>137
Figure G2008102010318D00512
<210>SEQ ID No 138
<211>17
<212>PRT
<213>人工合成
<223>Xaa为瓜氨酸
<400>138
Figure G2008102010318D00513
<210>SEQ ID No 139
<211>17
<212>PRT
<213>人工合成
<223>Xaa为瓜氨酸
<400>139
Figure G2008102010318D00514
<210>SEQ ID No 140
<211>17
<212>PRT
<213>人工合成
<223>Xaa为瓜氨酸
<400>140
Figure G2008102010318D00515
<210>SEQ ID No 141
<211>17
<212>PRT
<213>人工合成
<223>Xaa为瓜氨酸
<400>141
Figure G2008102010318D00521
<210>SEQ ID No 142
<211>17
<212>PRT
<213>人工合成
<223>Xaa为瓜氨酸
<400>142
<210>SEQ ID No 143
<211>17
<212>PRT
<213>人工合成
<223>Xaa为瓜氨酸
<400>143
Figure G2008102010318D00523
<210>SEQ ID No 144
<211>17
<212>PRT
<213>人工合成
<223>Xaa为瓜氨酸
<400>144
Figure G2008102010318D00524
<210>SEQ ID No 145
<211>17
<212>PRT
<213>人工合成
<223>Xaa为瓜氨酸
<400>145
Figure G2008102010318D00531
<210>SEQ ID No 146
<211>17
<212>PRT
<213>人工合成
<223>Xaa为瓜氨酸
<400>146
<210>SEQ ID No 147
<211>17
<212>PRT
<213>人工合成
<223>Xaa为瓜氨酸
<400>147
<210>SEQ ID No 148
<211>17
<212>PRT
<213>人工合成
<223>Xaa为瓜氨酸
<400>148
Figure G2008102010318D00534
<210>SEQ ID No 149
<211>17
<212>PRT
<213>人工合成
<223>Xaa为瓜氨酸
<400>149
<210>SEQ ID No 150
<211>17
<212>PRT
<213>人工合成
<223>Xaa为瓜氨酸
<400>150
Figure G2008102010318D00542
<210>SEQ ID No 151
<211>17
<212>PRT
<213>人工合成
<223>Xaa为瓜氨酸
<400>151
Figure G2008102010318D00543
<210>SEQ ID No 152
<211>17
<212>PRT
<213>人工合成
<223>Xaa为瓜氨酸
<400>152
<210>SEQ ID No 153
<211>17
<212>PRT
<213>人工合成
<223>Xaa为瓜氨酸
<400>153
Figure G2008102010318D00551
<210>SEQ ID No 154
<211>17
<212>PRT
<213>人工合成
<223>Xaa为瓜氨酸
<400>154
Figure G2008102010318D00552
<210>SEQ ID No 155
<211>17
<212>PRT
<213>人工合成
<223>Xaa为瓜氨酸
<400>155
<210>SEQ ID No 156
<211>17
<212>PRT
<213>人工合成
<223>Xaa为瓜氨酸
<400>156
Figure G2008102010318D00554
<210>SEQ ID No 157
<211>17
<212>PRT
<213>人工合成
<223>Xaa为瓜氨酸
<400>157
Figure G2008102010318D00555
Figure G2008102010318D00561
<210>SEQ ID No 158
<211>17
<212>PRT
<213>人工合成
<223>Xaa为瓜氨酸
<400>158
Figure G2008102010318D00562
<210>SEQ ID No 159
<211>17
<212>PRT
<213>人工合成
<223>Xaa为瓜氨酸
<400>159
Figure G2008102010318D00563
<210>SEQ ID No 160
<211>17
<212>PRT
<213>人工合成
<223>Xaa为瓜氨酸
<400>160
Figure G2008102010318D00564
<210>SEQ ID No 161
<211>17
<212>PRT
<213>人工合成
<223>Xaa为瓜氨酸
<400>161
Figure G2008102010318D00565
<210>SEQ ID No 162
<211>17
<212>PRT
<213>人工合成
<223>Xaa为瓜氨酸
<400>162
Figure G2008102010318D00571
<210>SEQ ID No 163
<211>17
<212>PRT
<213>人工合成
<223>Xaa为瓜氨酸
<400>163
Figure G2008102010318D00572
<210>SEQ ID No 164
<211>17
<212>PRT
<213>人工合成
<223>Xaa为瓜氨酸
<400>164
Figure G2008102010318D00573
<210>SEQ ID No 165
<211>17
<212>PRT
<213>人工合成
<223>Xaa为瓜氨酸
<400>165
<210>SEQ ID No 166
<211>17
<212>PRT
<213>人工合成
<223>Xaa为瓜氨酸
<400>166
Figure G2008102010318D00581
<210>SEQ ID No 167
<211>17
<212>PRT
<213>人工合成
<223>Xaa为瓜氨酸
<400>167
Figure G2008102010318D00582
<210>SEQ ID No 168
<211>17
<212>PRT
<213>人工合成
<223>Xaa为瓜氨酸
<400>168
Figure G2008102010318D00583
<210>SEQ ID No 169
<211>17
<212>PRT
<213>人工合成
<223>Xaa为瓜氨酸
<400>169
Figure G2008102010318D00584
<210>SEQ ID No 170
<211>17
<212>PRT
<213>人工合成
<223>Xaa为瓜氨酸
<400>170
Figure G2008102010318D00591
<210>SEQ ID No 171
<211>17
<212>PRT
<213>人工合成
<223>Xaa为瓜氨酸
<400>171
Figure G2008102010318D00592
<210>SEQ ID No 172
<211>17
<212>PRT
<213>人工合成
<223>Xaa为瓜氨酸
<400>172
Figure G2008102010318D00593
<210>SEQ ID No 173
<211>17
<212>PRT
<213>人工合成
<223>Xaa为瓜氨酸
<400>173
Figure G2008102010318D00594
<210>SEQ ID No 174
<211>17
<212>PRT
<213>人工合成
<223>Xaa为瓜氨酸
<400>174
Figure G2008102010318D00595
Figure G2008102010318D00601
<210>SEQ ID No 175
<211>17
<212>PRT
<213>人工合成
<223>Xaa为瓜氨酸
<400>175
Figure G2008102010318D00602
<210>SEQ ID No 176
<211>17
<212>PRT
<213>人工合成
<223>Xaa为瓜氨酸
<400>176
Figure G2008102010318D00603
<210>SEQ ID No 177
<211>17
<212>PRT
<213>人工合成
<223>Xaa为瓜氨酸
<400>177
Figure G2008102010318D00604
<210>SEQ ID No 178
<211>17
<212>PRT
<213>人工合成
<223>Xaa为瓜氨酸
<400>178
Figure G2008102010318D00605
<210>SEQ ID No 179
<211>17
<212>PRT
<213>人工合成
<223>Xaa为瓜氨酸
<400>179
Figure G2008102010318D00611
<210>SEQ ID No 180
<211>17
<212>PRT
<213>人工合成
<223>Xaa为瓜氨酸
<400>180
Figure G2008102010318D00612
<210>SEQ ID No 181
<211>17
<212>PRT
<213>人工合成
<223>Xaa为瓜氨酸
<400>181
Figure G2008102010318D00613
<210>SEQ ID No 182
<211>17
<212>PRT
<213>人工合成
<223>Xaa为瓜氨酸
<400>182
Figure G2008102010318D00614
<210>SEQ ID No 183
<211>17
<212>PRT
<213>人工合成
<223>Xaa为瓜氨酸
<400>183
<210>SEQ ID No 184
<211>17
<212>PRT
<213>人工合成
<223>Xaa为瓜氨酸
<400>184
Figure G2008102010318D00622
<210>SEQ ID No 185
<211>17
<212>PRT
<213>人工合成
<223>Xaa为瓜氨酸
<400>185
Figure G2008102010318D00623
<210>SEQ ID No 186
<211>17
<212>PRT
<213>人工合成
<223>Xaa为瓜氨酸
<400>186
Figure G2008102010318D00624
<210>SEQ ID No 187
<211>17
<212>PRT
<213>人工合成
<223>Xaa为瓜氨酸
<400>187
Figure G2008102010318D00631
<210>SEQ ID No 188
<211>17
<212>PRT
<213>人工合成
<223>Xaa为瓜氨酸
<400>188
<210>SEQ ID No 189
<211>17
<212>PRT
<213>人工合成
<223>Xaa为瓜氨酸
<400>189
Figure G2008102010318D00633
<210>SEQ ID No 190
<211>17
<212>PRT
<213>人工合成
<223>Xaa为瓜氨酸
<400>190
Figure G2008102010318D00634
<210>SEQ ID No 191
<211>17
<212>PRT
<213>人工合成
<223>Xaa为瓜氨酸
<400>191
Figure G2008102010318D00635
<210>SEQ ID No 192
<211>17
<212>PRT
<213>人工合成
<223>Xaa为瓜氨酸
<400>192
Figure G2008102010318D00642
<210>SEQ ID No 193
<211>17
<212>PRT
<213>人工合成
<223>Xaa为瓜氨酸
<400>193
Figure G2008102010318D00643
<210>SEQ ID No 194
<211>17
<212>PRT
<213>人工合成
<223>Xaa为瓜氨酸
<400>1
<210>SEQ ID No 195
<211>17
<212>PRT
<213>人工合成
<223>Xaa为瓜氨酸
<400>195
Figure G2008102010318D00645
<210>SEQ ID No 196
<211>17
<212>PRT
<213>人工合成
<223>Xaa为瓜氨酸
<400>196
Figure G2008102010318D00651
<210>SEQ ID No 197
<211>17
<212>PRT
<213>人工合成
<223>Xaa为瓜氨酸
<400>197
Figure G2008102010318D00652
<210>SEQ ID No 198
<211>17
<212>PRT
<213>人工合成
<223>Xaa为瓜氨酸
<400>198
Figure G2008102010318D00653
<210>SEQ ID No 199
<211>17
<212>PRT
<213>人工合成
<223>Xaa为瓜氨酸
<400>199
Figure G2008102010318D00654
<210>SEQ ID No 200
<211>17
<212>PRT
<213>人工合成
<223>Xaa为瓜氨酸
<400>200
Figure G2008102010318D00661
<210>SEQ ID No 201
<211>17
<212>PRT
<213>人工合成
<223>Xaa为瓜氨酸
<400>201
Figure G2008102010318D00662
<210>SEQ ID No 202
<211>17
<212>PRT
<213>人工合成
<223>Xaa为瓜氨酸
<400>202
<210>SEQ ID No 203
<211>17
<212>PRT
<213>人工合成
<223>Xaa为瓜氨酸
<400>203
Figure G2008102010318D00664
<210>SEQ ID No 204
<211>17
<212>PRT
<213>人工合成
<223>Xaa为瓜氨酸
<400>204
Figure G2008102010318D00671
<210>SEQ ID No 205
<211>17
<212>PRT
<213>人工合成
<223>Xaa为瓜氨酸
<400>205
<210>SEQ ID No 206
<211>17
<212>PRT
<213>人工合成
<223>Xaa为瓜氨酸
<400>206
Figure G2008102010318D00673
<210>SEQ ID No 207
<211>17
<212>PRT
<213>人工合成
<223>Xaa为瓜氨酸
<400>207
Figure G2008102010318D00674
<210>SEQ ID No 208
<211>17
<212>PRT
<213>人工合成
<223>Xaa为瓜氨酸
<400>208
Figure G2008102010318D00681
<210>SEQ ID No 209
<211>17
<212>PRT
<213>人工合成
<223>Xaa为瓜氨酸
<400>209
Figure G2008102010318D00682
<210>SEQ ID No 210
<211>17
<212>PRT
<213>人工合成
<223>Xaa为瓜氨酸
<400>210
<210>SEQ ID No 211
<211>17
<212>PRT
<213>人工合成
<223>Xaa为瓜氨酸
<400>211
Figure G2008102010318D00684
<210>SEQ ID No 212
<211>17
<212>PRT
<213>人工合成
<223>Xaa为瓜氨酸
<400>212
Figure G2008102010318D00685
Figure G2008102010318D00691
<210>SEQ ID No 213
<211>17
<212>PRT
<213>人工合成
<223>Xaa为瓜氨酸
<400>213
Figure G2008102010318D00692
<210>SEQ ID No 214
<211>17
<212>PRT
<213>人工合成
<223>Xaa为瓜氨酸
<400>214
Figure G2008102010318D00693
<210>SEQ ID No 215
<211>17
<212>PRT
<213>人工合成
<223>Xaa为瓜氨酸
<400>215
Figure G2008102010318D00694
<210>SEQ ID No 216
<211>17
<212>PRT
<213>人工合成
<223>Xaa为瓜氨酸
<400>216
Figure G2008102010318D00695
<210>SEQ ID No 217
<211>17
<212>PRT
<213>人工合成
<223>Xaa为瓜氨酸
<400>217
Figure G2008102010318D00701
<210>SEQ ID No 218
<211>17
<212>PRT
<213>人工合成
<223>Xaa为瓜氨酸
<400>218
Figure G2008102010318D00702
<210>SEQ ID No 219
<211>17
<212>PRT
<213>人工合成
<223>Xaa为瓜氨酸
<400>219
<210>SEQ ID No 220
<211>17
<212>PRT
<213>人工合成
<223>Xaa为瓜氨酸
<400>220
Figure G2008102010318D00704
<210>SEQ ID No 221
<211>17
<212>PRT
<213>人工合成
<223>Xaa为瓜氨酸
<400>221
Figure G2008102010318D00711
<210>SEQ ID No 222
<211>17
<212>PRT
<213>人工合成
<223>Xaa为瓜氨酸
<400>222
<210>SEQ ID No 223
<211>17
<212>PRT
<213>人工合成
<223>Xaa为瓜氨酸
<400>223
Figure G2008102010318D00713
<210>SEQ ID No 224
<211>17
<212>PRT
<213>人工合成
<223>Xaa为瓜氨酸
<400>224
Figure G2008102010318D00714
<210>SEQ ID No 225
<211>17
<212>PRT
<213>人工合成
<223>Xaa为瓜氨酸
<400>225
<210>SEQ ID No 226
<211>17
<212>PRT
<213>人工合成
<223>Xaa为瓜氨酸
<400>226
Figure G2008102010318D00722
<210>SEQ ID No 227
<211>17
<212>PRT
<213>人工合成
<223>Xaa为瓜氨酸
<400>227
Figure G2008102010318D00723
<210>SEQ ID No 228
<211>17
<212>PRT
<213>人工合成
<223>Xaa为瓜氨酸
<400>228
Figure G2008102010318D0072143130QIETU
<210>SEQ ID No 229
<211>17
<212>PRT
<213>人工合成
<223>Xaa为瓜氨酸
<400>229
Figure G2008102010318D00724
Figure G2008102010318D00731
<210>SEQ ID No 230
<211>17
<212>PRT
<213>人工合成
<223>Xaa为瓜氨酸
<400>230
Figure G2008102010318D00732
<210>SEQ ID No 231
<211>17
<212>PRT
<213>人工合成
<223>Xaa为瓜氨酸
<400>231
Figure G2008102010318D00733
<210>SEQ ID No 232
<211>17
<212>PRT
<213>人工合成
<223>Xaa为瓜氨酸
<400>232
Figure G2008102010318D00734
<210>SEQ ID No 233
<211>17
<212>PRT
<213>人工合成
<223>Xaa为瓜氨酸
<400>233
Figure G2008102010318D00735
<210>SEQ ID No 234
<211>17
<212>PRT
<213>人工合成
<223>Xaa为瓜氨酸
<400>234
Figure G2008102010318D00741
<210>SEQ ID No 235
<211>17
<212>PRT
<213>人工合成
<223>Xaa为瓜氨酸
<400>235
Figure G2008102010318D00742
<210>SEQ ID No 236
<211>17
<212>PRT
<213>人工合成
<223>Xaa为瓜氨酸
<400>236
<210>SEQ ID No 237
<211>17
<212>PRT
<213>人工合成
<223>Xaa为瓜氨酸
<400>237
<210>SEQ ID No 238
<211>17
<212>PRT
<213>人工合成
<223>Xaa为瓜氨酸
<400>238
Figure G2008102010318D00751
<210>SEQ ID No 239
<211>17
<212>PRT
<213>人工合成
<223>Xaa为瓜氨酸
<400>239
Figure G2008102010318D00752
<210>SEQ ID No 240
<211>17
<212>PRT
<213>人工合成
<223>Xaa为瓜氨酸
<400>240
Figure G2008102010318D00753
<210>SEQ ID No 241
<211>17
<212>PRT
<213>人工合成
<223>Xaa为瓜氨酸
<400>241
<210>SEQ ID No 242
<211>17
<212>PRT
<213>人工合成
<223>Xaa为瓜氨酸
<400>242
Figure G2008102010318D00761
<210>SEQ ID No 243
<211>17
<212>PRT
<213>人工合成
<223>Xaa为瓜氨酸
<400>243
Figure G2008102010318D00762
<210>SEQ ID No 244
<211>17
<212>PRT
<213>人工合成
<223>Xaa为瓜氨酸
<400>244
<210>SEQ ID No 245
<211>17
<212>PRT
<213>人工合成
<223>Xaa为瓜氨酸
<400>245
Figure G2008102010318D00764
<210>SEQ ID No 246
<211>17
<212>PRT
<213>人工合成
<223>Xaa为瓜氨酸
<400>246
Figure G2008102010318D00765
Figure G2008102010318D00771
<210>SEQ ID No 247
<211>17
<212>PRT
<213>人工合成
<223>Xaa为瓜氨酸
<400>247
Figure G2008102010318D00772
<210>SEQ ID No 248
<211>17
<212>PRT
<213>人工合成
<223>Xaa为瓜氨酸
<400>248
Figure G2008102010318D00773
<210>SEQ ID No 249
<211>17
<212>PRT
<213>人工合成
<223>Xaa为瓜氨酸
<400>249
Figure G2008102010318D00774
<210>SEQ ID No 250
<211>17
<212>PRT
<213>人工合成
<223>Xaa为瓜氨酸
<400>250
Figure G2008102010318D00775
<210>SEQ ID No 251
<211>17
<212>PRT
<213>人工合成
<223>Xaa为瓜氨酸
<400>251
Figure G2008102010318D00781
<210>SEQ ID No 252
<211>17
<212>PRT
<213>人工合成
<223>Xaa为瓜氨酸
<400>252
Figure G2008102010318D00782
<210>SEQ ID No 253
<211>17
<212>PRT
<213>人工合成
<223>Xaa为瓜氨酸
<400>253
Figure G2008102010318D00783
<210>SEQ ID No 254
<211>17
<212>PRT
<213>人工合成
<223>Xaa为瓜氨酸
<400>47
Figure G2008102010318D00784
<210>SEQ ID No 255
<211>17
<212>PRT
<213>人工合成
<223>Xaa为瓜氨酸
<400>255
Figure G2008102010318D00791
<210>SEQ ID No 256
<211>17
<212>PRT
<213>人工合成
<223>Xaa为瓜氨酸
<400>256
Figure G2008102010318D00792
<210>SEQ ID No 257
<211>17
<212>PRT
<213>人工合成
<223>Xaa为瓜氨酸
<400>257
Figure G2008102010318D00793
<210>SEQ ID No 258
<211>17
<212>PRT
<213>人工合成
<223>Xaa为瓜氨酸
<400>258
<210>SEQ ID No 259
<211>17
<212>PRT
<213>人工合成
<223>Xaa为瓜氨酸
<400>259
Figure G2008102010318D00801
<210>SEQ ID No 260
<211>17
<212>PRT
<213>人工合成
<223>Xaa为瓜氨酸
<400>260
Figure G2008102010318D00802
<210>SEQ ID No 261
<211>17
<212>PRT
<213>人工合成
<223>Xaa为瓜氨酸
<400>261
Figure G2008102010318D00803

Claims (7)

1.一种类风湿关节炎抗体体外检测的多肽，其特征在于氨基酸序列如下：
His-Gln-Cys-His-Gln-Phe-Arg-Phe-Cit-Gly-Cit-Ser-Arg-Ala-Ala-Cys-Gly，其上第三位和第十六位Cys通过巯基形成二硫键，而使多肽成环状结构；或
His-Gln-Cys-Ala-Arg-Phe-Gln-Met-Arg-His-Cit-Arg-Leu-Ile-Arg-Cys-Gly，其上第三位和第十六位Cys通过巯基形成二硫键，而使多肽成环状结构。
2.如权利要求1所述的类风湿关节炎抗体体外检测的多肽，其特征在于能与类风湿关节炎免疫抗体结合，形成抗原-抗体复合物。
3.如权利要求1所述的类风湿关节炎抗体体外检测的多肽，其特征在于所述的多肽结合有生物素标记。
4.如权利要求1所述的类风湿关节炎抗体体外检测的多肽，其特征在于所述的多肽N末端结合有生物素标记。
5.如权利要求3所述的类风湿关节炎抗体体外检测的多肽，其特征在于所述的结合有生物素的多肽与亲和素或链霉亲和素非共价结合。
6.如权利要求1-5之一所述的类风湿关节炎抗体体外检测的多肽，其特征在于所述的多肽与HLA-DR相结合形成HLA-DR-多肽复合物。
7.如权利要求1-5之一所述的类风湿关节炎抗体体外检测的多肽，其特征在于所述的多肽在类风湿关节炎自身免疫抗体体外ELISA检测中的应用。
CN2008102010318A 2008-10-10 2008-10-10 与免疫抗体相结合的多肽及其应用 Active CN101724024B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN2008102010318A CN101724024B (zh) 2008-10-10 2008-10-10 与免疫抗体相结合的多肽及其应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN2008102010318A CN101724024B (zh) 2008-10-10 2008-10-10 与免疫抗体相结合的多肽及其应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN101724024A CN101724024A (zh) 2010-06-09
CN101724024B true CN101724024B (zh) 2012-07-18

Family

ID=42445637

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN2008102010318A Active CN101724024B (zh) 2008-10-10 2008-10-10 与免疫抗体相结合的多肽及其应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN101724024B (zh)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106442999A (zh) * 2016-08-31 2017-02-22 杨世东 一种多抗体检测类风湿关节炎的试剂盒及其制备方法

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1712964A (zh) * 2005-07-18 2005-12-28 山东省医药生物技术研究中心 类风湿性关节炎特异性抗原性标志物及其应用

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1712964A (zh) * 2005-07-18 2005-12-28 山东省医药生物技术研究中心 类风湿性关节炎特异性抗原性标志物及其应用

Non-Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Research)》.2008,第59卷(第6期),762-784. *
Rheumatism (Arthritis Care &amp *
RHEUMATISM》.2000,第43卷(第1期),155-163. *
SAAG KG.,et al..American College of Rheumatology 2008 Recommendations for the Use of Nonbiologic and Biologic Disease-Modifying Antirheumatic Drugs in Rheumatoid Arthritis.《Arthritis & Rheumatism (Arthritis Care & Research)》.2008,第59卷(第6期),762-784.
SAAG KG.,et al..American College of Rheumatology 2008 Recommendations for the Use of Nonbiologic and Biologic Disease-Modifying Antirheumatic Drugs in Rheumatoid Arthritis.《Arthritis &amp *
SCHELLEKENS GA.,et al..THE DIAGNOSTIC PROPERTIES OF RHEUMATOID ARTHRITIS ANTIBODIES RECOGNIZING A CYCLIC CITRULLINATED PEPTIDE.《ARTHRITIS & RHEUMATISM》.2000,第43卷(第1期),155-163.
SCHELLEKENS GA.,et al..THE DIAGNOSTIC PROPERTIES OF RHEUMATOID ARTHRITIS ANTIBODIES RECOGNIZING A CYCLIC CITRULLINATED PEPTIDE.《ARTHRITIS &amp *

Also Published As

Publication number Publication date
CN101724024A (zh) 2010-06-09

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Schellekens et al. Citrulline is an essential constituent of antigenic determinants recognized by rheumatoid arthritis-specific autoantibodies.
Driscoll et al. Skeletal muscle proteasome can degrade proteins in an ATP-dependent process that does not require ubiquitin.
Zeng et al. Diagnostic value of anti-cyclic citrullinated Peptide antibody in patients with rheumatoid arthritis.
Shuai et al. The fingerprint of antimitochondrial antibodies and the etiology of primary biliary cholangitis
Mirzaei et al. Identification and quantification of protein carbonylation using light and heavy isotope labeled Girard's P reagent
Tu et al. Protein-peptide affinity determination using an h/d exchange dilution strategy: application to antigen-antibody interactions
CN109929009A (zh) Ccp肽段、包含其的抗原、试剂、试剂盒及应用
CN101819201B (zh) 用于类风湿关节炎免疫抗体体外检测的多肽组合物
US20100216173A1 (en) Citrullinated fibrin-filaggrin chimeric polypeptide capable of detecting the antibodies generated in rheumatoid arthritis
Matthews et al. Muscle-specific receptor tyrosine kinase autoantibodies—a new immunoprecipitation assay
Rojsajjakul et al. Multi-state unfolding of the alpha subunit of tryptophan synthase, a TIM barrel protein: insights into the secondary structure of the stable equilibrium intermediates by hydrogen exchange mass spectrometry
CN101726588B (zh) 体外检测类风湿关节炎抗体的组合物及其应用
CN101724024B (zh) 与免疫抗体相结合的多肽及其应用
Staes et al. Protease substrate profiling by N-terminal COFRADIC
CN101865913A (zh) 用于侧向层析检测类风湿关节炎免疫抗体的组合物
CN101812119B (zh) 与免疫抗体相结合的多肽及其应用
CN104231052B (zh) 人Lp‑PLA2抗原表位肽、抗原、抗体、用途及试剂盒
Hahne et al. Evaluation of substrate and inhibitor binding to yeast and human isoprenylcysteine carboxyl methyltransferases (Icmts) using biotinylated benzophenone-containing photoaffinity probes
CN101995463B (zh) 用于斑点金免疫渗滤法检测类风湿关节炎免疫抗体的组合物
US4740588A (en) Novel substrate peptides
CN102004154B (zh) 斑点金免疫渗滤法检测类风湿关节炎免疫抗体的组合物
CN102012431B (zh) 斑点金免疫渗滤法检测类风湿关节炎免疫抗体的ccp肽
US4709012A (en) Novel inhibitor peptides
US4778878A (en) Novel inhibitor peptides I
Pinilla et al. Mapping the detailed specificity of a calcium-dependent monoclonal antibody through the use of soluble positional scanning combinatorial libraries: identification of potent calcium-independent antigens

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C14 Grant of patent or utility model
GR01 Patent grant
CP01 Change in the name or title of a patent holder

Address after: 201108 No. 888 Xiangyang Road, Shanghai, Minhang District

Patentee after: Shanghai Rongsheng Biological Pharmaceutical Co.,Ltd.

Address before: 201108 No. 888 Xiangyang Road, Shanghai, Minhang District

Patentee before: SHANGHAI RONGSHENG BIOTECH CO.,LTD.

CP01 Change in the name or title of a patent holder