CN1737146A - 双特异性抗体n1m1及n2m2融合蛋白及其编码基因 - Google Patents

双特异性抗体n1m1及n2m2融合蛋白及其编码基因 Download PDF

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CN1737146A
CN1737146A CN 200410050266 CN200410050266A CN1737146A CN 1737146 A CN1737146 A CN 1737146A CN 200410050266 CN200410050266 CN 200410050266 CN 200410050266 A CN200410050266 A CN 200410050266A CN 1737146 A CN1737146 A CN 1737146A
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吴文芳
倪剑锋
孙静
吕安国
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Abstract

本发明属于制药领域，具体的说是一种新型的抗CD16/抗黑色素瘤双特异性抗体N1M1及N2M2融合蛋白及其编码基因(在大肠杆菌中的表达和应用)。双特异性抗体N1M1融合蛋白，具有序列表SEQ ID No：4中氨基酸序列；其编码基因具有序列表SEQ ID NO：3中的核苷酸序列。双特异性抗体N2M2融合蛋白，具有序列表SEQ ID No：8中氨基酸序列；其编码基因具有序列表SEQ ID NO：7中的核苷酸序列。本发明双特异性抗体融合蛋白特异性激活巨噬细胞和NK细胞等在黑色素瘤周围对该肿瘤产生杀伤作用；为肿瘤的免疫治疗提供了新的途径。

Description

双特异性抗体N1M1及N2M2融合蛋白及其编码基因
技术领域
本发明属于制药领域，具体的说是一种新型的抗CD16/抗黑色素瘤双特异性抗体N1M1及N2M2融合蛋白及其编码基因(在大肠杆菌中的表达和应用)。
背景技术
长期以来肿瘤的临床治疗一直受到3大难题的困扰：常规的放疗化疗方案选择性较差；肿瘤细胞产生耐药性；肿瘤发生微小转移。而肿瘤的免疫治疗无疑为解决这些问题提供了一条新的途径。
自20世纪70年代中期kohler和Milstein成功建立单克隆抗体技术之后，这一疗法得到了广泛的研究和探讨。但是用单抗治疗实体瘤疗效不明显。因此，能导向药物和介导免疫细胞的双特异性抗体(Bispecificantibody，BsAb)成为近年来抗癌治疗的热点之一。
双特异性抗体(BsAb)：BsAb是一类具有双亲嗜性的组合抗体，又称双功能抗体(bifunctional antibody)，是指能结合两种特异性抗原的抗体分子。通过BsAb，即能将效应细胞与靶细胞有效地连接起来，启动效应细胞的生物学活性。
所有的BsAb都是由两种不同特异性的抗体交叉连接而成的一个分子。根据抗体的来源和合成形式不同，BsAb分为以下几种类型和结构：
1.化学偶联法：化学偶联法是将两个不同抗体的Fab片端通过偶联剂，氧化其硫基使之相连接成同源F(ab’)2BsAb，研究结果表明：它们具有两种不同的抗原分子间结合的能力，在动物体内能动员效应细胞靶向杀灭肿瘤细胞。但是缺点是：新制备的BsAb在体内易被降解和消除。
2.杂交杂交瘤制备法：杂交杂交瘤法制备双特异性抗体是以传统的单克隆抗体技术为基础，将分泌两种抗体的杂交瘤细胞融合，使其能产生稳定分泌BsAb的杂交杂交瘤；该法制备的双抗生物活性高，抗体结构比较稳定，但是双杂交瘤细胞株在传代过程中稳定性较差，而且制备过程复杂，产量低，所表达的轻链、重链通过二硫键连接后组成十种抗体，其中只有一种为有生物学活性的BsAb，产物繁多，不易纯化。
3.基因技术制备
3.1基因工程抗体片段Fab’化学偶联成BsF(ab’)2；
3.2细菌或细胞直接表达有生物活性的BsAb。目前具有良好基因工程双特异抗体的形式有：单链双特异性抗体[12]、双特异性双体(diabody)[13]和双特异性微小抗体(miniantibady)[14]等。本实验室将抗神经节苷脂GD2的单链抗体和抗CD16(FcγRIIIA)分子的单链抗体连接，形成一新型的单链双特异性抗体。
神经节苷脂GD2是一类细胞膜上的糖鞘脂类化合物，其伸展于胞膜表面的糖基具有免疫原性抗原决定簇，能够诱发抗体反应。神经节苷脂对原发和转移的肿瘤有促进生长的作用。Liringston等(1987)指出黑色素瘤、成细胞纤维瘤、小细胞肺癌等肿瘤细胞表面大量存在神经节苷脂GD2。
抗黑色素瘤单链抗体：特异性结合黑色素瘤表面抗原-神经节苷质GD2的抗体，因此可以特异性识别黑色素瘤。
特异性单链抗体NM3E2能特异性识别巨噬细胞和自然杀伤细胞(NK)表面的表面分子CD16。
发明内容
本发明的目的是提供一种双特异性抗体N1M1及N2M2融合蛋白及其编码基因。
为实现上述目的，本发明采用基因技术的方法，将两种单链抗体(抗黑色素瘤单链抗体和抗CD16跨模型(FcγRIIIA)分子单链抗体)连接，制备了具有两种亲和性的BsAb，克服了化学偶联法杂交杂交瘤法的弊端，使大量生产有稳定生物学活性的双抗成为可能。
一种抗CD16分子的单链抗体基因NM3E2，经设计的两组引物扩增后分别具有序列表SEQ ID No：1 SEQ ID No：5中碱基序列。
抗黑色素瘤表面抗原GD2单链抗体基因M-ScFv(源于HB8759)经设计的两组引物扩增后分别具有序列表SEQ ID No：2及SEQ ID No：6中碱基序列。将两个基因通过重叠PCR法用Linker连接，所述融合蛋白基因具有序列表SEQ ID No：4；SEQ ID No：8中碱基序列。Linker相对应的肽分别为SerGly4Ser；(Gly4Ser)3。
所构建的双特异性抗体，其作用原理是：A)双抗首先结合黑色素瘤细胞，然后另一亲和效应NK细胞的臂抓住经过肿瘤表面的巨噬细胞和NK细胞，激活这两种细胞，对肿瘤产生杀伤作用。B)循环中的效应细胞：巨噬细胞和NK细胞首先与双抗结合，然后随血液游走到黑色素瘤表面与其结合，激活的效应细胞对肿瘤产生杀伤作用。为肿瘤的免疫治疗提供了新的途径。
本发明具有以下优点：
1.本发明利用重叠PCR(overlap-PCR)将抗GD2表面抗原GD2的单链抗体基因m-ScFv和抗CD16的单链抗体基因NM3E2融合在一起，得到新型的单链双特异性抗体基因n1m1、n2m2，双抗的联接肽序列分别为Ser Gly4Ser、(Gly4Ser)3，在肽连的C端引入了6×his以利于纯化。该双特异性抗体基因的序列经测序验证与设计相符后连接到表达载体pET-22b(+)上，然后导入大肠杆菌菌株BL21(DE3)，用1.0mmol/L IPTG进行诱导表达，凝胶成像系统扫描显示表达的外源融合蛋白约占菌体总蛋白的25％。表达蛋白分泌于胞质空间，经超声波破胞后收集上清，经Ni+亲和层析柱分离，纯度可达90％以上。经SDS-PAGE及Western blotting鉴定表达蛋白的分子量为54KD和53KD与预期的相符。构建的抗GD2/抗CD16单链双特异性抗体基因，为人工制备的新基因，属首次制得的融合基因。引入的连接肽片断不影响基因中可变区的结合作用。
2.引用本发明，可进一步提供直接用于生产N1M1及N2M2(NM3E2-M-ScFv)融合蛋白的工程菌株。
3.双特异性抗体融合蛋白特异性激活(识别)巨噬细胞和NK细胞(细胞表面上的CD16分子)等在黑色素瘤(表面抗原GD2分子)周围对该肿瘤产生杀伤作用(激活体内免疫系统，特异性杀伤黑色素瘤细胞)。为肿瘤的免疫治疗提供了新的途径。
4.融合蛋白的大小是抗体分子的1/3，克服了单克隆抗体不易渗透到肿瘤组织的不足，抗肿瘤的作用更为明显。
5克服了化学偶联法生产的双抗成本高、稳定性差、免疫原性强，而且分子量大不利于渗透到肿瘤部位等缺点。
6克服了杂交杂交瘤法的弊端(例如有8种产物，杂交瘤容易老化，产量不稳定，传代操作复杂等)，生产双特异性抗体过程不会引入其他的副产物，便于分离纯化。
7单链双特异性抗体是在DNA水平上将不同的的单链抗体片段的基因通过一段链间连接肽连接起来，直接表达成单链的双特异性抗体分子。由于不同特异性的抗体片段之间是共价连接，单链双特异性分子易于在各种表达系统中表达，且其稳定性好于其它的基因工程双特异性抗体，并且没有单体等副产物存在，更易于分离。
附图说明
图1为双特异性抗体N1M1(NM3E2-M-ScFv)的测序图谱之一；
图2为双特异性抗体N1M1(NM3E2-M-ScFv)的测序图谱之二；
图3为双特异性抗体N2M2(NM3E2-M-ScFv)的测序图谱；
图4为双特异性抗体N1M1(NM3E2-M-ScFv)N2M2(NM3E2-M-ScFv)融合基因在大肠杆菌中的表达电泳图(SDS-PAGE图)；图中：1-2为pET-22b/BL21(DE3)空白对照，3-4为n1m1/pET-22b/BL21(DE3)诱导表达，5-6为n2m2/pET-22b/BL21(DE3)诱导表达，7蛋白质分子量标准。
具体实施方式
一.N1M1的置备
实施例1
一种人源性抗CD16分子的单链抗体基因NM3E2，经引物扩增后具有序列表SEQ ID No：1中碱基序列。
TAACCATGGAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGTGTGGTACGGCCTGGGGGGTCCCTGAG
ACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTTGATGATTATGGCATGAGCTGGGTCCGCCAAGCT
CCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTCTCTGGTATTAATTGGAATGGTGGTAGCACAGGTTATGCAG
ACTCTGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAACGCCAAGAACTCCCTGTATCTGCAAAT
GAACAGTCTGAGAGCCGAGGACACGGCCGTGTATTACTGTGCAAGAGGGAGGTCTCTGCTTTTT
GACTATTGGGGCCAAGGTACCCTGGTCACCGTCTCTAGAGGTGGAGGCGGTTCAGGCGGAGGTG
GCTCTGGCGGTGGCGGATCGTCTGAGCTGACTCAGGACCCTGCTGTGTCTGTGGCCTTGGGACA
GACAGTCAGGATCACATGCCAAGGAGACAGCCTCAGAAGCTATTATGCAAGCTGGTACCAGCAG
AAGCCAGGACAGGCCCCTGTACTTGTCATCTATGGTAAAAACAACCGGCCCTCAGGGATCCCAG
ACCGATTCTCTGGCTCCAGCTCAGGAAACACAGCTTCCTTGACCATCACTGGGGCTCAGGCGGA
AGATGAGGCTGACTATTACTGTAACTCCCGGGACAGCAGTGGTAACCATGAGGTATTCGGCGGA
GGGACCAAGCTGACCGTCCTA GGTTCAGGTGGAGGCGGTTCT
(1)SEQ ID No：1的信息(参见序列表)
(a)序列特征
*长度：746碱基对；*类型：核酸；*链型：双链；*拓扑结构：线性
(b)分子类型：cDNA
(c)假设：否
(d)反义：否
(e)最初来源：人源性抗CD16分子的单链抗体基因NM3E2
(2)人源性抗CD16分子的单链抗体基因NM3E2的制备
Primer for(N1-M1)：5’-TAA  CCA TGG AGG TGC AGC TGG TGG AGT CT-3’
                      NcoI酶切位点
Primer back(N1-M2，Linker Back)：5’-AGA ACC GCC TCC ACC TGA
ACC TAG GAC GGT CAG CTT GGT CCC-3’
扩增条件：以含NM3E2(N)的质粒为模板，以Pfu酶进行扩增。PCR体系中加入5％甘油，5％二甲基亚砜。
反应条件：95℃变性2分钟；95℃30秒，68℃30秒，72℃1分45秒，30个循环；72℃延伸10分钟。PCR产物回收：按上海华舜试剂盒使用说明书
实施例2
一种鼠源性抗黑色素瘤表面抗原GD2单链抗体基因M-ScFv，来源于杂交瘤HB8759，引物扩增后具有序列表SEQ ID No：2中碱基序列。
TCAGGTGGAGGCGGTTCTTCAGGAGGAGGCTTGGTGCAACCTGGAGGATCCATGAAACTCTCCT
GTGTTGTCTCTGGATTCACTTTCAGTAATTACTGGATGAACTGGGTCCGCCAGTCTCCAGAGAA
GGGGCTTGAGTGGATTGCAGAAATTAGATTGAAATCCAATAATTTTGCAAGATATTATGCGGAG
TCTGTGAAAGGGAGGTTCACCATCTCAAGAGATGATTCCAAAGGTAGTGTCTACCTGCAAATGA
TCAACCTAAGAGCTGAAGATACTGGCATTTATTACTGTACCAGTTATGGTAACTACGTTGGGCA
CTATTTTGACCACTGGGGCCAAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCAGGTGGAGGCGGTTCAGGC
GGAGGTGGCTCTGGCGGTGGCGGATCGGACATTGAGCTCACCCAGTCTCCAAAATTCATGTCCA
CATCAGTAGGAGACAGGGTCAGCGTCACCTGCAAGGCCAGTCAGAATGTGGATACTAATGTAGC
CTGGTATCAACAAAAACCAGGGCAATCTCCTGAACCACTGCTTTTCTCGGCATCCTACCGTTAC
ACTGGAGTCCCTGATCGCTTCACAGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCA
ATGTGCAGTCTGAAGACTTGGCAGAGTATTTCTGTCAGCAATATAACAGCTATCCTCTGACGTT
CGGTGGAGGCACCAAGCTGGAAATCAAACGG CATCATCATCACCACTGAAAGCTTGAC
(1)SEQ ID No：2的信息(参见序列表)
(A)序列特征
*长度：759碱基对；*类型：核酸；*链型：双链；*拓扑结构：线性
(b)分子类型：cDNA
(c)假设：否
(d)反义：否
(e)最初来源：鼠源性抗黑色素瘤表面抗原GD2单链抗体基因M-ScFv，源于杂交瘤HB8759
(2)黑色素瘤表面抗原GD2单链抗体基因M-ScFv的制备
以含有M-ScFv基因的质粒pCAS1为模板，以Pfu酶进行扩增。扩增引物和条件如下：
M1扩增引物：
Primer For(N1-M3，linker for)：5’-TCA GGT GGA GGC GGT TCT CAG GTGAAG CTG CAG GAG TCA GG-3’
Primer back(N1-M4)：5’-GTC  AAG CTT TCA GTG GTG ATG ATG ATG CCG TTT GAT
                        HindIII酶切位点
TTC CAG CTT GGT GCC T-3’引入6His序列，HindIII酶切位点及终止子。
反应条件：95℃变性2分钟；95℃30秒，68℃30秒，72℃1分45秒，30个循环；72℃延伸10分钟。PCR产物回收：按上海华舜试剂盒使用说明书。
实施例3
双特异性抗体N1M1融合基因具有序列表SEQ ID No：3的碱基序列
ATGGAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGTGTGGTACGGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCT
CCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTTGATGATTATGGCATGAGCTGGGTCCGCCAAGCTCCAGG
GAAGGGGCTGGAGTGGGTCTCTGGTATTAATTGGAATGGTGGTAGCACAGGTTATGCAGACTCT
GTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAACGCCAAGAACTCCCTGTATCTGCAAATGAACA
GTCTGAGAGCCGAGGACACGGCCGTGTATTACTGTGCAAGAGGGAGGTCTCTGCTTTTTGACTA
TTGGGGCCAAGGTACCCTGGTCACCGTCTCTAGAGGTGGAGGCGGTTCAGGCGGAGGTGGCTCT
GGCGGTGGCGGATCGTCTGAGCTGACTCAGGACCCTGCTGTGTCTGTGGCCTTGGGACAGACAG
TCAGGATCACATGCCAAGGAGACAGCCTCAGAAGCTATTATGCAAGCTGGTACCAGCAGAAGCC
AGGACAGGCCCCTGTACTTGTCATCTATGGTAAAAACAACCGGCCCTCAGGGATCCCAGACCGA
TTCTCTGGCTCCAGCTCAGGAAACACAGCTTCCTTGACCATCACTGGGGCTCAGGCGGAAGATG
AGGCTGACTATTACTGTAACTCCCGGGACAGCAGTGGTAACCATGAGGTATTCGGCGGAGGGAC
CAAGCTGACCGTCCTAGGTTCAGGTGGAGGCGGTTCTCAGGTGAAGCTGCAGGAGTCAGGAGGA
GGCTTGGTGCAACCTGGAGGATCCATGAAACTCTCCTGTGTTGTCTCTGGATTCACTTTCAGTA
ATTACTGGATGAACTGGGTCCGCCAGTCTCCAGAGAAGGGGCTTGAGTGGATTGCAGAAATTAG
ATTGAAATCCAATAATTTTGCAAGATATTATGCGGAGTCTGTGAAAGGGAGGTTCACCATCTCA
AGAGATGATTCCAAAGGTAGTGTCTACCTGCAAATGATCAACCTAAGAGCTGAAGATACTGGCA
TTTATTACTGTACCAGTTATGGTAACTACGTTGGGCACTATTTTGACCACTGGGGCCAAGGGAC
CACGGTCACCGTCTCCTCAGGTGGAGGCGGTTCAGGCGGAGGTGGCTCTGGCGGTGGCGGATCG
GACATTGAGCTCACCCAGTCTCCAAAATTCATGTCCACATCAGTAGGAGACAGGGTCAGCGTCA
CCTGCAAGGCCAGTCAGAATGTGGATACTAATGTAGCCTGGTATCAACAAAAACCAGGGCAATC
TCCTGAACCACTGCTTTTCTCGGCATCCTACCGTTACACTGGAGTCCCTGATCGCTTCACAGGC
AGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAATGTGCAGTCTGAAGACTTGGCAGAGT
ATTTCTGTCAGCAATATAACAGCTATCCTCTGACGTTCGGTGGAGGCACCAAGCTGGAAATCAA
ACGGCATCACCATCATCACCACTGAAAGCTTGAC
(1)SEQ ID No：3的信息(参见序列表)
(A)序列特征
*长度：1503碱基对(其中GAC为终止子没有计算在内)；*类型：核酸；*链型：双链；*拓扑结构：线性
(b)分子类型：CDNA
(C)假设：否
(d)反义：否
(2)将两个抗体基因通过PCR法用Linkerl连接。
Linkerl：翻译后为SerGly4Ser
Primer for(N1-M1)：5’-TAA  CCA TGG AG GTG CAG CTG GTG GAG TCT-3’
                        NcoI酶切位点
Primer back(N1-M4)：5’-GTC  AAG CTT TCA GTG GTG ATG ATG ATG CCG TTT GAT
                        HindIII酶切位点
TTC CAG CTT GGT GCC T-3’
扩增条件：以N1和M1的PCR回收产物等摩尔混合作为模板，LA TaG酶进行扩增。
反应条件：94℃变性5分钟；94℃30秒，58℃45秒，72℃1分45秒，5个循环；加入引物后，94℃30秒，65℃45秒，72℃1分45秒，30个循环；72℃延伸10分钟。PCR产物进行胶回收：按上海华舜试剂盒使用说明书。
构建成功双抗N1-M1，该基因连接到pMD18载体中，篮白筛选，挑取白色菌落，接种于LB液体培养基，提取质粒，NCoI，HindIII双酶切验证及PCR验证后测序，测序结果与预期的结果相符。
提取质粒pMD18-N1-M1，NCoI、HindIII，双酶切，胶回收约1500bp目标片断，连接双酶切胶回收后的pET-22b(+)载体，16度过夜，pET-22b(+)-N1M1转化JM109，菌体电泳选择有滞后质粒的菌株，提取质粒后双酶切及PCR验证。将验证正确的质粒转化BL21(DE3)菌株，挑取转化子单菌落，接种于含Amp(100ug/ml)的LB液体培养基，37度过夜培养，次日1％转种量转于新鲜的含Amp的LB培养基中，当OD560达到0.6-0.8时用1.0mmol/LIPTG诱导表达。于37度诱导表达5小时。取1ml发酵液离心，菌体沉淀用1ml蒸馏水洗涤，离心后悬于1倍的上样缓冲液中，沸水浴煮10分钟，12000g离心两分钟。取10ul进行SDS-PAGE电泳，考马斯亮蓝染色，用紫外凝胶成像系统进行扫描检测蛋白的表达。
结果：在工程菌的细胞全蛋白电泳中有一条明显的表达带，诱导蛋白如图2所示。分子量约为53000dalton；紫外凝胶成像系统扫描显示此蛋白占菌体中蛋白的25％。
该双特异性抗体N1M1融合蛋白具有序列表SEQ ID NO：4中的碱基序列：
MEVQlVESGGGVVRPGGSlRlSCAASGFTFDDYGMSWVRQAPGKGlEWVSGINWNGGSTGYADS
VKGRFTISRDNAKNSlYlQMNSlRAEDTAVYYCARGRSllFDYWGQGTlVTVSRGGGGSGGGGS
GGGGSSElTQDPAVSVAlGQTVRITCQGDSlRSYYASWYQQKPGQAPVlVIYGKNNRPSGIPDR
FSGSSSGNTASlTITGAQAEDEADYYCNSRDSSGNhEVFGGGTKlTVlGSGGGGSQVKlQESGG
GlVQPGGSMKlSCVVSGFTFSNYWMNWVRQSPEKGlEWIAEIRlKSNNFARYYAESVKGRFTIS
RDDSKGSVYlQMINlRAEDTGIYYCTSYGNYVGhYFDhWGQGTTVTVSSGGGGSGGGGSGGGGS
DIElTQSPKFMSTSVGDRVSVTCKASQNVDTNVAWYQQKPGQSPEPllFSASYRYTGVPDRFTG
SGSGTDFTlTISNVQSEDlAEYFCQQYNSYPlTFGGGTKlEIKRHHHHHH
(1)SEQ ID No：4的信息(参见序列表)
(A)序列特征
*长度：501个核苷酸；*类型：氨基酸
(b)分子类型：aa
(C)假设：否
二.N2M2的置备
实施例5
一种人源性抗CD16分子的单链抗体基因NM3E2，经引物扩增后具有序列表SEQ ID No：5中碱基序列。
TAACCATGGAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGTGTGGTACGGCCTGGGGGGTCCCTGAG
ACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTTGATGATTATGGCATGAGCTGGGTCCGCCAAGCT
CCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTCTCTGGTATTAATTGGAATGGTGGTAGCACAGGTTATGCAG
ACTCTGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAACGCCAAGAACTCCCTGTATCTGCAAAT
GAACAGTCTGAGAGCCGAGGACACGGCCGTGTATTACTGTGCAAGAGGGAGGTCTCTGCTTTTT
GACTATTGGGGCCAAGGTACCCTGGTCACCGTCTCTAGAGGTGGAGGCGGTTCAGGCGGAGGTG
GCTCTGGCGGTGGCGGATCGTCTGAGCTGACTCAGGACCCTGCTGTGTCTGTGGCCTTGGGACA
GACAGTCAGGATCACATGCCAAGGAGACAGCCTCAGAAGCTATTATGCAAGCTGGTACCAGCAG
AAGCCAGGACAGGCCCCTGTACTTGTCATCTATGGTAAAAACAACCGGCCCTCAGGGATCCCAG
ACCGATTCTCTGGCTCCAGCTCAGGAAACACAGCTTCCTTGACCATCACTGGGGCTCAGGCGGA
AGATGAGGCTGACTATTACTGTAACTCCCGGGACAGCAGTGGTAACCATGAGGTATTCGGCGGA
GGGACCAAGCTGACCGTCCTAGGT
GGTGGAGGCGGTTCAGGCGGAGGTGGCTCTGGCGGTGGCGGATCG
(1)SEQ ID No：5的信息(参见序列表)
(a)序列特征
*长度：773碱基对；*类型：核酸；*链型：双链；*拓扑结构：线性
(b)分子类型：cDNA
(c)假设：否
(d)反义：否
(e)最初来源：人源性抗CD16分子的单链抗体基因NM3E2
(2)人源性抗CD16分子的单链抗体基因NM3E2的制备
Primer for(N1-M1)：5’-TAA  CCA TGG AGG TGC AGC TGG TGG AGT CT-3’
                       NcoI酶切位点
引入了NcoI酶切位点及ATG起始密码子
Primer back(N1-M2’，含linkeR)：5’-CGA TCC GCC ACC GCC AGAGCC ACCTCC GCC TGA ACC GCC TCC ACC ACC TAG GAC GGT CAG CTT GGT CCC T-3’
扩增条件：以含NM3E2(N)的质粒PUC19为模板，以Pfu酶进行扩增。反应条件：95℃变性2分钟；95℃30秒，68℃30秒，72C1分45秒，30个循环；72℃延伸10分钟。PCR产物回收：按上海华舜试剂盒使用说明书
实施例5
一种鼠源性抗黑色素瘤表面抗原GD2单链抗体基因M-ScFv，来源于杂交瘤HB8759，经设计的引物扩增后具有序列表SEQ ID No：6中碱基序列。
GGTGGAGGCGGTTCAGGCGGAGGTGGCTCTGGCGGTGGCGGATCGCAGGTGAAGCTGCAGGAGT
CAGGAGGAGGCTTGGTGCAACCTGGAGGATCCATGAAACTCTCCTGTGTTGTCTCTGGATTCAC
TTTCAGTAATTACTGGATGAACTGGGTCCGCCAGTCTCCAGAGAAGGGGCTTGAGTGGATTGCA
GAAATTAGATTGAAATCCAATAATTTTGCAAGATATTATGCGGAGTCTGTGAAAGGGAGGTTCA
CCATCTCAAGAGATGATTCCAAAGGTAGTGTCTACCTGCAAATGATCAACCTAAGAGCTGAAGA
TACTGGCATTTATTACTGTACCAGTTATGGTAACTACGTTGGGCACTATTTTGACCACTGGGGC
CAAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCAGGTGGAGGCGGTTCAGGCGGAGGTGGCTCTGGCGGTG
GCGGATCGGACATTGAGCTCACCCAGTCTCCAAAATTCATGTCCACATCAGTAGGAGACAGGGT
CAGCGTCACCTGCAAGGCCAGTCAGAATGTGGATACTAATGTAGCCTGGTATCAACAAAAACCA
GGGCAATCTCCTGAACCACTGCTTTTCTCGGCATCCTACCGTTACACTGGAGTCCCTGATCGCT
TCACAGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAATGTGCAGTCTGAAGACTT
GGCAGAGTATTTCTGTCAGCAATATAACAGCTATCCTCTGACGTTCGGTGGAGGCACCAAGCTG
GAAATCAAACGGCATCATCATCACCACTGA AAGCTTGAC
(1)SEQ ID No：6的信息(参见序列表)
(A)序列特征
*长度：804碱基对(其中GAC为终止子没有计算在内)；*类型：核酸；*链型：双链；*拓扑结构：线性
(b)分子类型：cDNA
(c)假设：否
(d)反义：否
(e)最初来源：鼠源性抗黑色素瘤表面抗原GD2单链抗体基因M-ScFv，源于杂交瘤HB8759
(2)黑色素瘤表面抗原GD2单链抗体基因M-ScFv的制备
以含有M-ScFv基因的质粒pCAS1为模板，以Pfu酶进行扩增。扩增引物和条件如下：
M1扩增引物：
Primer for(N1-M3’，含linkeR)：5’-GGT GGA GGC GGT TCA GGC GGA GGTGGC TCT GGC GGT GGC GGA TCG CAG GTG AAG CTG CAG GAG TCA GGA-3’
PRimeR back(N1-M4)：5’-GTC AAG CTT TCA GTG GTG ATG ATG ATG CCG TTT GAT TTC CAGCTT GGT GCC T-3’引入6His序列，HindIII酶切位点及终止子。
反应条件：95℃变性2分钟；95℃30秒，68℃30秒，72℃1分45秒，30个循环；72℃延伸10分钟。PCR产物回收：按上海华舜试剂盒使用说明书。
实施例6
双特异性抗体N2M2融合基因具有序列表SEQ ID No：7的碱基序列
ATGGAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGTGTGGTACGGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCT
CCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTTGATGATTATGGCATGAGCTGGGTCCGCCAAGCTCCAGG
GAAGGGGCTGGAGTGGGTCTCTGGTATTAATTGGAATGGTGGTAGCACAGGTTATGCAGACTCT
GTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAACGCCAAGAACTCCCTGTATCTGCAAATGAACA
GTCTGAGAGCCGAGGACACGGCCGTGTATTACTGTGCAAGAGGGAGGTCTCTGCTTTTTGACTA
TTGGGGCCAAGGTACCCTGGTCACCGTCTCTAGAGGTGGAGGCGGTTCAGGCGGAGGTGGCTCT
GGCGGTGGCGGATCGTCTGAGCTGACTCAGGACCCTGCTGTGTCTGTGGCCTTGGGACAGACAG
TCAGGATCACATGCCAAGGAGACAGCCTCAGAAGCTATTATGCAAGCTGGTACCAGCAGAAGCC
AGGACAGGCCCCTGTACTTGTCATCTATGGTAAAAACAACCGGCCCTCAGGGATCCCAGACCGA
TTCTCTGGCTCCAGCTCAGGAAACACAGCTTCCTTGACCATCACTGGGGCTCAGGCGGAAGATG
AGGCTGACTATTACTGTAACTCCCGGGACAGCAGTGGTAACCATGAGGTATTCGGCGGAGGGAC
CAAGCTGACCGTCCTAGGTGGTGGAGGCGGTTCAGGCGGAGGTGGCTCTGGCGGTGGCGGATCG
CAGGTGAAGCTGCAGGAGTCAGGAGGAGGCTTGGTGCAACCTGGAGGATCCATGAAACTCTCCT
GTGTTGTCTCTGGATTCACTTTCAGTAATTACTGGATGAACTGGGTCCGCCAGTCTCCAGAGAA
GGGGCTTGAGTGGATTGCAGAAATTAGATTGAAATCCAATAATTTTGCAAGATATTATGCGGAG
TCTGTGAAAGGGAGGTTCACCATCTCAAGAGATGATTCCAAAGGTAGTGTCTACCTGCAAATGA
TCAACCTAAGAGCTGAAGATACTGGCATTTATTACTGTACCAGTTATGGTAACTACGTTGGGCA
CTATTTTGACCACTGGGGCCAAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCAGGTGGAGGCGGTTCAGGC
GGAGGTGGCTCTGGCGGTGGCGGATCGGACATTGAGCTCACCCAGTCTCCAAAATTCATGTCCA
CATCAGTAGGAGACAGGGTCAGCGTCACCTGCAAGGCCAGTCAGAATGTGGATACTAATGTAGC
CTGGTATCAACAAAAACCAGGGCAATCTCCTGAACCACTGCTTTTCTCGGCATCCTACCGTTAC
ACTGGAGTCCCTGATCGCTTCACAGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCA
ATGTGCAGTCTGAAGACTTGGCAGAGTATTTCTGTCAGCAATATAACAGCTATCCTCTGACGTT
CGGTGGAGGCACCAAGCTGGAAATCAAACGGCATCACCATCATCACCACTGAAAGCTTGAC
(1)SEQ ID No：7的信息(参见序列表)
(A)序列特征
*长度：1530碱基对(其中GAC为终止子没有计算在内)；*类型：核酸；*链型：双链；*拓扑结构：线性
(b)分子类型：cDNA
(c)假设：否
(d)反义：否
(2)将两个抗体基因通过PCR法用LiNkeR2连接。
LiNkeR2：翻译后为(GlY4SeR)3
Primer for(N1-M1)：5’-TAA  CCA TGG AGG TGC AGC TGG TGG AGT CT-3’
                       NcoI酶切位点
Primer baCk(N1-M4)：5’-GTC  AAG CTT TCA GTG GTG ATG ATG ATG CCG TTT GAT
                       HindIII酶切位点
扩增条件：以N1和M1的PCR回收产物等摩尔混合作为模板，LA TaG酶进行扩增。
反应条件：94℃变性5分钟；94℃30秒，58℃45秒，72℃1分45秒，5个循环；加入引物后，94℃30秒，65℃45秒，72℃1分45秒，30个循环；72℃延伸30分钟。PCR产物进行胶回收：按上海华舜试剂盒使用说明书。
提取质粒pMD18-N2-M2，NCoI、HindIII，双酶切，胶回收约1500bp目标片断，连接双酶切胶回收后的pET-22b(+)载体，16度过夜，pET-22b(+)-N1M1转化JM109，菌体电泳选择有滞后质粒的菌株，提取质粒后双酶切及PCR验证。将验证正确的质粒转化BL21(DE3)菌株，挑取转化子单菌落，接种于含Amp(100ug/ml)的LB液体培养基，37度过夜培养，次日1％转种量转于新鲜的含Amp的LB培养基中，当OD560达到0.6-0.8时用1.0mmol/LIPTG诱导表达。于37度诱导表达10小时。取1ml发酵液离心，菌体沉淀用1ml蒸馏水洗涤，离心后悬于1倍的上样缓冲液中，沸水浴煮10分钟，12000g离心两分钟。取10ul进行SDS-PAGE电泳，考马斯亮蓝染色，用紫外凝胶成像系统进行扫描检测蛋白的表达。
结果：在工程菌的细胞全蛋白电泳中有一条明显的表达带，诱导蛋白如图2所示。分子量约为54000daltoN；紫外凝胶成像系统扫描显示此蛋白占菌体中蛋白的25％。
双特异性抗体N2M2融合蛋白具有序列表SEQ ID No：8中氨基酸序列：
MEVQLVESGGGVVRPGGSLRLSCAASGFTFDDYGMSWVRQAPGKGLEWVSGINWNGGSTGYADS
VKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGRSLLFDYWGQGTLVTVSRGGGGSGGGGS
GGGGSSELTQDPAVSVALGQTVRITCQGDSLRSYYASWYQQKPGQAPVLVIYGKNNRPSGIPDR
FSGSSSGNTASLTITGAQAEDEADYYCNSRDSSGNHEVFGGGTKLTVLGGGGGSGGGGSGGGGS
QVKLQESGGGLVQPGGSMKLSCVVSGFTFSNYWMNWVRQSPEKGLEWIAEIRLKSNNFARYYAE
SVKGRFTISRDDSKGSVYLQMINLRAEDTGIYYCTSYGNYVGHYFDHWGQGTTVTVSSGGGGSG
GGGSGGGGSDIELTQSPKFMSTSVGDRVSVTCKASQNVDTNVAWYQQKPGQSPEPLLFSASYRY
TGVPDRFTGSGSGTDFTLTISNVQSEDLAEYFCQQYNSYPLTFGGGTKLEIKRHHHHHH
(1)SEQ ID No：8的信息(参见序列表)
(A)序列特征
*长度：510个核苷酸；*类型：氨基酸
(b)分子类型：AA
(C)假设：否
                                N1M1
                SEQUENCE LISTING
<110>中国科学院沈阳应用生态研究所
<120>双特异性抗体N1M1及N2M2融合蛋白及其编码基因
<130>
<160>8
<170>PatentIn version 3.1
<210>1
<211>746
<212>DNA
<213>人源性抗CD16分子的单链抗体基因NM3E2
<220>
<221>old_sequence
<222>(1)..(746)
<223>
<400>1
taaccatgga ggtgcagctg gtggagtctg ggggaggtgt ggtacggcct ggggggtccc     60
tgagactctc ctgtgcagcc tctggattca cctttgatga ttatggcatg agctgggtcc    120
gccaagctcc agggaagggg ctggagtggg tctctggtat taattggaat ggtggtagca    180
caggttatgc agactctgtg aagggccgat tcaccatctc cagagacaac gccaagaact    240
ccctgtatct gcaaatgaac agtctgagag ccgaggacac ggccgtgtat tactgtgcaa    300
gagggaggtc tctgcttttt gactattggg gccaaggtac cctggtcacc gtctctagag    360
gtggaggcgg ttcaggcgga ggtggctctg gcggtggcgg atcgtctgag ctgactcagg    420
accctgctgt gtctgtggcc ttgggacaga cagtcaggat cacatgccaa ggagacagcc    480
tcagaagcta ttatgcaagc tggtaccagc agaagccagg acaggcccct gtacttgtca    540
tctatggtaa aaacaaccgg ccctcaggga tcccagaccg attctctggc tccagctcag    600
                                N1M1
gaaacacagc ttccttgacc atcactgggg ctcaggcgga agatgaggct gactattact    660
gtaactcccg ggacagcagt ggtaaccatg aggtattcgg cggagggacc aagctgaccg    720
tcctaggttc aggtggaggc ggttct                                         746
<210>2
<211>762
<212>DNA
<213>杂交瘤细胞株(hybridoma cell)
<220>
<221>V_region
<222>(1)..(759)
<223>
<400>2
tcaggtggag gcggttcttc aggaggaggc ttggtgcaac ctggaggatc catgaaactc     60
tcctgtgttg tctctggatt cactttcagt aattactgga tgaactgggt ccgccagtct    120
ccagagaagg ggcttgagtg gattgcagaa attagattga aatccaataa ttttgcaaga    180
tattatgcgg agtctgtgaa agggaggttc accatctcaa gagatgattc caaaggtagt    240
gtctacctgc aaatgatcaa cctaagagct gaagatactg gcatttatta ctgtaccagt    300
tatggtaact acgttgggca ctattttgac cactggggcc aagggaccac ggtcaccgtc    360
tcctcaggtg gaggcggttc aggcggaggt ggctctggcg gtggcggatc ggacattgag    420
ctcacccagt ctccaaaatt catgtccaca tcagtaggag acagggtcag cgtcacctgc    480
aaggccagtc agaatgtgga tactaatgta gcctggtatc aacaaaaacc agggcaatct    540
cctgaaccac tgcttttctc ggcatcctac cgttacactg gagtccctga tcgcttcaca    600
ggcagtggat ctgggacaga tttcactctc accatcagca atgtgcagtc tgaagacttg    660
gcagagtatt tctgtcagca atataacagc tatcctctga cgttcggtgg aggcaccaag    720
ctggaaatca aacggcatca tcatcaccac tgaaagcttg ac                       762
<210>3
<211>1506
<212>DNA
<213>融合基因
                            N1M1
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(1494)
<223>
<400>3
atg gag gtg cag ctg gtg gag tct ggg gga ggt gtg gta cgg cct ggg     48
Met Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Arg Pro Gly
1               5                   10                  15
ggg tcc ctg aga ctc tcc tgt gca gcc tct gga ttc acc ttt gat gat     96
Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp
            20                  25                  30
tat ggc atg agc tgg gtc cgc caa gct cca ggg aag ggg ctg gag tgg    144
Tyr Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp
        35                  40                  45
gtc tct ggt att aat tgg aat ggt ggt agc aca ggt tat gca gac tct    192
Val Ser Gly Ile Asn Trp Asn Gly Gly Ser Thr Gly Tyr Ala Asp Ser
    50                  55                  60
gtg aag ggc cga ttc acc atc tcc aga gac aac gcc aag aac tcc ctg    240
Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu
65                  70                  75                  80
tat ctg caa atg aac agt ctg aga gcc gag gac acg gcc gtg tat tac    288
Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr
                85                  90                  95
tgt gca aga ggg agg tct ctg ctt ttt gac tat tgg ggc caa ggt acc    336
Cys Ala Arg Gly Arg Ser Leu Leu Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
            100                 105                 110
ctg gtc acc gtc tct aga ggt gga ggc ggt tca ggc gga ggt ggc tct    384
Leu Val Thr Val Ser Arg Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
        115                 120                 125
ggc ggt ggc gga tcg tct gag ctg act cag gac cct gct gtg tct gtg    432
Gly Gly Gly Gly Ser Ser Glu Leu Thr Gln Asp Pro Ala Val Ser Val
    130                 135                 140
gcc ttg gga cag aca gtc agg atc aca tgc caa gga gac agc ctc aga    480
Ala Leu Gly Gln Thr Val Arg Ile Thr Cys Gln Gly Asp Ser Leu Arg
145                 150                 155                 160
agc tat tat gca agc tgg tac cag cag aag cca gga cag gcc cct gta    528
Ser Tyr Tyr Ala Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val
                165                 170                 175
ctt gtc atc tat ggt aaa aac aac cgg ccc tca ggg atc cca gac cga    576
Leu Val Ile Tyr Gly Lys Asn Asn Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg
            180                 185                 190
ttc tct ggc tcc agc tca gga aac aca gct tcc ttg acc atc act ggg    624
Phe Ser Gly Ser Ser Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Thr Gly
        195                 200                 205
                                    N1M1
gct cag gcg gaa gat gag gct gac tat tac tgt aac tcc cgg gac agc     672
Ala Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Asn Ser Arg Asp Ser
    210                 215                 220
agt ggt aac cat gag gta ttc ggc gga ggg acc aag ctg acc gtc cta     720
Ser Gly Asn His Glu Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
225                 230                 235                 240
ggt tca ggt gga ggc ggt tct cag gtg aag ctg cag gag tca gga gga     768
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val Lys Leu Gln Glu Ser Gly Gly
                245                 250                 255
ggc ttg gtg caa cct gga gga tcc atg aaa ctc tcc tgt gtt gtc tct     816
Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Met Lys Leu Ser Cys Val Val Ser
            260                 265                 270
gga ttc act ttc agt aat tac tgg atg aac tgg gtc cgc cag tct cca     864
Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ser Pro
        275                 280                 285
gag aag ggg ctt gag tgg att gca gaa att aga ttg aaa tcc aat aat     912
Glu Lys Gly Leu Glu Trp Ile Ala Glu Ile Arg Leu Lys Ser Asn Asn
    290                 295                 300
ttt gca aga tat tat gcg gag tct gtg aaa ggg agg ttc acc atc tca     960
Phe Ala Arg Tyr Tyr Ala Glu Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser
305                 310                 315                 320
aga gat gat tcc aaa ggt agt gtc tac ctg caa atg atc aac cta aga    1008
Arg Asp Asp Ser Lys Gly Ser Val Tyr Leu Gln Met Ile Asn Leu Arg
                325                 330                 335
gct gaa gat act ggc att tat tac tgt acc agt tat ggt aac tac gtt    1056
Ala Glu Asp Thr Gly Ile Tyr Tyr Cys Thr Ser Tyr Gly Asn Tyr Val
            340                 345                 350
ggg cac tat ttt gac cac tgg ggc caa ggg acc acg gtc acc gtc tcc    1104
Gly His Tyr Phe Asp His Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser
        355                 360                 365
tca ggt gga ggc ggt tca ggc gga ggt ggc tct ggc ggt ggc gga tcg    1152
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
    370                 375                 380
gac att gag ctc acc cag tct cca aaa ttc atg tcc aca tca gta gga    1200
Asp Ile Glu Leu Thr Gln Ser Pro Lys Phe Met Ser Thr Ser Val Gly
385                 390                 395                 400
gac agg gtc agc gtc acc tgc aag gcc agt cag aat gtg gat act aat    1248
Asp Arg Val Ser Val Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asn Val Asp Thr Asn
                405                 410                 415
gta gcc tgg tat caa caa aaa cca ggg caa tct cct gaa cca ctg ctt    1296
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Glu Pro Leu Leu
            420                 425                 430
ttc tcg gca tcc tac cgt tac act gga gtc cct gat cgc ttc aca ggc    1344
Phe Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly
        435                 440                 445
agt gga tct ggg aca gat ttc act ctc acc atc agc aat gtg cag tct    1392
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asn Val Gln Ser
    450                 455                 460
                                    N1M1
gaa gac ttg gca gag tat ttc tgt cag caa tat aac agc tat cct ctg    1440
Glu Asp Leu Ala Glu Tyr Phe Cys Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Pro Leu
465                 470                 475                 480
acg ttc ggt gga ggc acc aag ctg gaa atc aaa cgg cat cac cat cat    1488
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg His His His His
                485                 490                 495
cgc cac tgaaagcttg ac                                              1506
His His
<210>4
<211>498
<212>PRT
<213>融合基因
<400>4
Met Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Arg Pro Gly
1               5                   10                  15
Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp
            20                  25                  30
Tyr Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp
        35                  40                  45
Val Ser Gly Ile Asn Trp Asn Gly Gly Ser Thr Gly Tyr Ala Asp Ser
    50                  55                  60
Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu
65                  70                  75                  80
Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr
                85                  90                  95
Cys Ala Arg Gly Arg Ser Leu Leu Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
            100                 105                 110
Leu Val Thr Val Ser Arg Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
        115                 120                 125
Gly Gly Gly Gly Ser Ser Glu Leu Thr Gln Asp Pro Ala Val Ser Val
    130                 135                 140
Ala Leu Gly Gln Thr Val Arg Ile Thr Cys Gln Gly Asp Ser Leu Arg
145                 150                 155                 160
                              N1M1
Ser Tyr Tyr Ala Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val
                165                 170                 175
Leu Val Ile Tyr Gly Lys Asn Asn Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg
            180                 185                 190
Phe Ser Gly Ser Ser Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Thr Gly
        195                 200                 205
Ala Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Asn Ser Arg Asp Ser
    210                 215                 220
Ser Gly Asn His Glu Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
225                 230                 235                 240
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val Lys Leu Gln Glu Ser Gly Gly
                245                 250                 255
Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Met Lys Leu Ser Cys Val Val Ser
            260                 265                 270
Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ser Pro
        275                 280                 285
Glu Lys Gly Leu Glu Trp Ile Ala Glu Ile Arg Leu Lys Ser Asn Asn
    290                 295                 300
Phe Ala Arg Tyr Tyr Ala Glu Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser
305                 310                 315                 320
Arg Asp Asp Ser Lys Gly Ser Val Tyr Leu Gln Met Ile Asn Leu Arg
                325                 330                 335
Ala Glu Asp Thr Gly Ile Tyr Tyr Cys Thr Ser Tyr Gly Asn Tyr Val
            340                 345                 350
Gly His Tyr Phe Asp His Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser
        355                 360                 365
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
    370                 375                 380
Asp Ile Glu Leu Thr Gln Ser Pro Lys Phe Met Ser Thr Ser Val Gly
385                 390                 395                 400
Asp Arg Val Ser Val Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asn Val Asp Thr Asn
                405                 410                 415
                               N1M1
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Glu Pro Leu Leu
            420                 425                 430
Phe Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly
        435                 440                 445
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asn Val Gln Ser
    450                 455                 460
Glu Asp Leu Ala Glu Tyr Phe Cys Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Pro Leu
465                 470                 475                 480
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg His His His His
                485                 490                 495
His His
<210>5
<211>773
<212>DNA
<213>人源性抗CD16分子的单链抗体基因NM3E2
<220>
<221>old_sequence
<222>(1)..(773)
<223>
<400>5
taaccatgga ggtgcagctg gtggagtctg ggggaggtgt ggtacggcct ggggggtccc    60
tgagactctc ctgtgcagcc tctggattca cctttgatga ttatggcatg agctgggtcc   120
gccaagctcc agggaagggg ctggagtggg tctctggtat taattggaat ggtggtagca   180
caggttatgc agactctgtg aagggccgat tcaccatctc cagagacaac gccaagaact   240
ccctgtatct gcaaatgaac agtctgagag ccgaggacac ggccgtgtat tactgtgcaa   300
gagggaggtc tctgcttttt gactattggg gccaaggtac cctggtcacc gtctctagag   360
gtggaggcgg ttcaggcgga ggtggctctg gcggtggcgg atcgtctgag ctgactcagg   420
accctgctgt gtctgtggcc ttgggacaga cagtcaggat cacatgccaa ggagacagcc   480
tcagaagcta ttatgcaagc tggtaccagc agaagccagg acaggcccct gtacttgtca   540
                                N1M1
tctatggtaa aaacaaccgg ccctcaggga tcccagaccg attctctggc tccagctcag    600
gaaacacagc ttccttgacc atcactgggg ctcaggcgga agatgaggct gactattact    660
gtaactcccg ggacagcagt ggtaaccatg aggtattcgg cggagggacc aagctgaccg    720
tcctaggtgg tggaggcggt tcaggcggag gtggctctgg cggtggcgga tcg           773
<210>6
<211>807
<212>DNA
<213>杂交瘤细胞株(hybridoma cell)
<220>
<221>V_region
<222>(1)..(804)
<223>
<400>6
ggtggaggcg gttcaggcgg aggtggctct ggcggtggcg gatcgcaggt gaagctgcag     60
gagtcaggag gaggcttggt gcaacctgga ggatccatga aactctcctg tgttgtctct    120
ggattcactt tcagtaatta ctggatgaac tgggtccgcc agtctccaga gaaggggctt    180
gagtggattg cagaaattag attgaaatcc aataattttg caagatatta tgcggagtct    240
gtgaaaggga ggttcaccat ctcaagagat gattccaaag gtagtgtcta cctgcaaatg    300
atcaacctaa gagctgaaga tactggcatt tattactgta ccagttatgg taactacgtt    360
gggcactatt ttgaccactg gggccaaggg accacggtca ccgtctcctc aggtggaggc    420
ggttcaggcg gaggtggctc tggcggtggc ggatcggaca ttgagctcac ccagtctcca    480
aaattcatgt ccacatcagt aggagacagg gtcagcgtca cctgcaaggc cagtcagaat    540
gtggatacta atgtagcctg gtatcaacaa aaaccagggc aatctcctga accactgctt    600
ttctcggcat cctaccgtta cactggagtc cctgatcgct tcacaggcag tggatctggg    660
acagatttca ctctcaccat cagcaatgtg cagtctgaag acttggcaga gtatttctgt    720
cagcaatata acagctatcc tctgacgttc ggtggaggca ccaagctgga aatcaaacgg    780
catcatcatc accactgaaa gcttgac                                        807
<210>7
<211>1533
                                 N1M1
<212>DNA
<213>融合基因
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(1521)
<223>
<400>7
atg gag gtg cag ctg gtg gag tct ggg gga ggt gtg gta cgg cct ggg       48
Met Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Arg Pro Gly
1               5                   10                  15
ggg tcc ctg aga ctc tcc tgt gca gcc tct gga ttc acc ttt gat gat       96
Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp
            20                  25                  30
tat ggc atg agc tgg gtc cgc caa gct cca ggg aag ggg ctg gag tgg      144
Tyr Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp
        35                  40                  45
gtc tct ggt att aat tgg aat ggt ggt agc aca ggt tat gca gac tct      192
Val Ser Gly Ile Asn Trp Asn Gly Gly Ser Thr Gly Tyr Ala Asp Ser
    50                  55                  60
gtg aag ggc cga ttc acc atc tcc aga gac aac gcc aag aac tcc ctg      240
Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu
65                  70                  75                  80
tat ctg caa atg aac agt ctg aga gcc gag gac acg gcc gtg tat tac      288
Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr
                85                  90                  95
tgt gca aga ggg agg tct ctg ctt ttt gac tat tgg ggc caa ggt acc      336
Cys Ala Arg Gly Arg Ser Leu Leu Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
            100                 105                 110
ctg gtc acc gtc tct aga ggt gga ggc ggt tca ggc gga ggt ggc tct      384
Leu Val Thr Val Ser Arg Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
        115                 120                 125
ggc ggt ggc gga tcg tct gag ctg act cag gac cct gct gtg tct gtg      432
Gly Gly Gly Gly Ser Ser Glu Leu Thr Gln Asp Pro Ala Val Ser Val
    130                 135                 140
gcc ttg gga cag aca gtc agg atc aca tgc caa gga gac agc ctc aga      480
Ala Leu Gly Gln Thr Val Arg Ile Thr Cys Gln Gly Asp Ser Leu Arg
145                 150                 155                 160
agc tat tat gca agc tgg tac cag cag aag cca gga cag gcc cct gta      528
Ser Tyr Tyr Ala Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val
                165                 170                 175
ctt gtc atc tat ggt aaa aac aac cgg ccc tca ggg atc cca gac cga      576
Leu Val Ile Tyr Gly Lys Asn Asn Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg
            180                 185                 190
                                    N1M1
ttc tct ggc tcc agc tca gga aac aca gct tcc ttg acc atc act ggg    624
Phe Ser Gly Ser Ser Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Thr Gly
        195                 200                 205
gct cag gcg gaa gat gag gct gac tat tac tgt aac tcc cgg gac agc    672
Ala Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Asn Ser Arg Asp Ser
    210                 215                 220
agt ggt aac cat gag gta ttc ggc gga ggg acc aag ctg acc gtc cta    720
Ser Gly Asn His Glu Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
225                 230                 235                 240
ggt ggt gga ggc ggt tca ggc gga ggt ggc tct ggc ggt ggc gga tcg    768
Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
                245                 250                 255
cag gtg aag ctg cag gag tca gga gga ggc ttg gtg caa cct gga gga    816
Gln Val Lys Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
            260                 265                 270
tcc atg aaa ctc tcc tgt gtt gtc tct gga ttc act ttc agt aat tac    864
Ser Met Lys Leu Ser Cys Val Val Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr
        275                 280                 285
tgg atg aac tgg gtc cgc cag tct cca gag aag ggg ctt gag tgg att    912
Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ser Pro Glu Lys Gly Leu Glu Trp Ile
    290                 295                 300
gca gaa att aga ttg aaa tcc aat aat ttt gca aga tat tat gcg gag    960
Ala Glu Ile Arg Leu Lys Ser Asn Asn Phe Ala Arg Tyr Tyr Ala Glu
305                 310                 315                 320
tct gtg aaa ggg agg ttc acc atc tca aga gat gat tcc aaa ggt agt    1008
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Gly Ser
                325                 330                 335
gtc tac ctg caa atg atc aac cta aga gct gaa gat act ggc att tat    1056
Val Tyr Leu Gln Met Ile Asn Leu Arg Ala Glu Asp Thr Gly Ile Tyr
            340                 345                 350
tac tgt acc agt tat ggt aac tac gtt ggg cac tat ttt gac cac tgg    1104
Tyr Cys Thr Ser Tyr Gly Asn Tyr Val Gly His Tyr Phe Asp His Trp
        355                 360                 365
ggc caa ggg acc acg gtc acc gtc tcc tca ggt gga ggc ggt tca ggc    1152
Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
    370                 375                 380
gga ggt ggc tct ggc ggt ggc gga tcg gac att gag ctc acc cag tct    1200
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Glu Leu Thr Gln Ser
385                 390                 395                 400
cca aaa ttc atg tcc aca tca gta gga gac agg gtc agc gtc acc tgc    1248
Pro Lys Phe Met Ser Thr Ser Val Gly Asp Arg Val Ser Val Thr Cys
                405                 410                 415
aag gcc agt cag aat gtg gat act aat gta gcc tgg tat caa caa aaa    1296
Lys Ala Ser Gln Asn Val Asp Thr Asn Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys
            420                 425                 430
cca ggg caa tct cct gaa cca ctg ctt ttc tcg gca tcc tac cgt tac    1344
Pro Gly Gln Ser Pro Glu Pro Leu Leu Phe Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr
        435                 440                 445
                                 N1M1
act gga gtc cct gat cgc ttc aca ggc agt gga tct ggg aca gat ttc    1392
Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe
    450                 455                 460
act ctc acc atc agc aat gtg cag tct gaa gac ttg gca gag tat ttc    1440
Thr Leu Thr Ile Ser Asn Val Gln Ser Glu Asp Leu Ala Glu Tyr Phe
465                 470                 475                 480
tgt cag caa tat aac agc tat cct ctg acg ttc ggt gga ggc acc aag    1488
Cys Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys
                485                 490                 495
ctg gaa atc aaa cgg cat cac cat cat cac cac tgaaagcttg ac          1533
Leu Glu Ile Lys Arg His His His His His His
            500                 505
<210>8
<211>507
<212>PRT
<213>融合基因
<400>8
Met Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Arg Pro Gly
1               5                   10                  15
Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp
            20                  25                  30
Tyr Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp
        35                  40                  45
Val Ser Gly Ile Asn Trp Asn Gly Gly Ser Thr Gly Tyr Ala Asp Ser
    50                  55                  60
Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu
65                  70                  75                  80
Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr
                85                  90                  95
Cys Ala Arg Gly Arg Ser Leu Leu Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
            100                 105                 110
Leu Val Thr Val Ser Arg Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
        115                 120                 125
Gly Gly Gly Gly Ser Ser Glu Leu Thr Gln Asp Pro Ala Val Ser Val
    130                 135                 140
                             N1M1
Ala Leu Gly Gln Thr Val Arg Ile Thr Cys Gln Gly Asp Ser Leu Arg
145                 150                 155                 160
Ser Tyr Tyr Ala Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val
                165                 170                 175
Leu Val Ile Tyr Gly Lys Asn Asn Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg
            180                 185                 190
Phe Ser Gly Ser Ser Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Thr Gly
        195                 200                 205
Ala Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Asn Ser Arg Asp Ser
    210                 215                 220
Ser Gly Asn His Glu Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
225                 230                 235                 240
Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
                245                 250                 255
Gln Val Lys Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
            260                 265                 270
Ser Met Lys Leu Ser Cys Val Val Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr
        275                 280                 285
Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ser Pro Glu Lys Gly Leu Glu Trp Ile
    290                 295                 300
Ala Glu Ile Arg Leu Lys Ser Asn Asn Phe Ala Arg Tyr Tyr Ala Glu
305                 310                 315                 320
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Gly Ser
                325                 330                 335
Val Tyr Leu Gln Met Ile Asn Leu Arg Ala Glu Asp Thr Gly Ile Tyr
            340                 345                 350
Tyr Cys Thr Ser Tyr Gly Asn Tyr Val Gly His Tyr Phe Asp His Trp
        355                 360                 365
Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
    370                 375                 380
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Glu Leu Thr Gln Ser
385                 390                 395                 400
                            N1M1
Pro Lys Phe Met Ser Thr Ser Val Gly Asp Arg Val Ser Val Thr Cys
                405                 410                 415
Lys Ala Ser Gln Asn Val Asp Thr Asn Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys
            420                 425                 430
Pro Gly Gln Ser Pro Glu Pro Leu Leu Phe Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr
        435                 440                 445
Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe
    450                 455                 460
Thr Leu Thr Ile Ser Asn Val Gln Ser Glu Asp Leu Ala Glu Tyr Phe
465                 470                 475                 480
Cys Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys
                485                 490                 495
Leu Glu Ile Lys Arg His His His His His His
            500                 505

Claims (4)

1.一种双特异性抗体N1M1融合蛋白，其特征在于：具有序列表SEQ IDNo：4中氨基酸序列。
2.一种权利要求1所述双特异性抗体N1M1融合蛋白的编码基因，其特征在于：具有序列表SEQ ID NO：3中的核苷酸序列。
3.一种双特异性抗体N2M2融合蛋白，其特征在于：具有序列表SEQ IDNo：8中氨基酸序列。
4.一种权利要求3所述双特异性抗体N1M1融合蛋白的编码基因，其特征在于：具有序列表SEQ ID NO：7中的核苷酸序列。
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CN104818295A (zh) * 2015-02-03 2015-08-05 武汉友芝友生物制药有限公司 制备和筛选表达双特异性抗体细胞株的方法

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