CN106596924A

CN106596924A - 磁微粒化学发光免疫检测试剂盒及其检测方法

Info

Publication number: CN106596924A
Application number: CN201610980451.5A
Authority: CN
Inventors: 张念林
Original assignee: Beijing Long Feng Run Tatsu Biological Technology Co Ltd
Current assignee: Beijing Long Feng Run Tatsu Biological Technology Co Ltd
Priority date: 2016-11-08
Filing date: 2016-11-08
Publication date: 2017-04-26

Abstract

本发明磁微粒化学发光免疫检测试剂盒及其检测方法，涉及一种免疫检测试剂盒及其检测方法。其目的是为了提供一种磁微粒化学发光免疫检测试剂盒及其检测方法，该方法综合采用了悬浮磁微粒载体技术和化学发光检测技术，使系统能够充分满足临床对检测结果的要求。本发明所述试剂盒包括荧光素标记的抗原、碱性磷酸酶标记的抗体和包被有抗所述荧光素的抗体的磁微粒。本发明的检测方法包括：待测样品与荧光素标记的抗原；然后与包被有抗荧光素的抗体的磁微粒混合；分离磁微粒；清洗后加入碱性磷酸酶标记的抗体；分离磁微粒；洗涤；加入发光底物，测定吸光度。本发明的检测方法准确性好、精密度高、灵敏度高，操作简单省时，检测范围宽。

Description

磁微粒化学发光免疫检测试剂盒及其检测方法

技术领域

本发明涉及一种借助于生物特有的结合方法来测定或分析材料的试剂盒及其测定方法，特别是涉及一种免疫检测试剂盒及其检测方法。

背景技术

自身免疫性疾病是自身免疫反应达到一定程度而导致的疾病。免疫系统最基本的功能是认识自身和识别异体，达到保护自身和排斥异体的目的。正常人体血清中可存在多种针对自身抗原的抗体，但它们的水平极低，不足以破坏自身成分，可清除衰老退变的自身组织，这就是自身免疫反应。当这种反应过强，导致严重组织损伤，表现出临床症状时，就称为自身免疫病。这类自身免疫疾病指标包括但不限于以下所列：AMA M2,P0,His,nucl,dsDNA,PCNA,CENP B,Jo-1,PM-Scl,Scl-70,SSB,SSA,Sm,nRNP,GBM,MPO,PR3,SAL/LP,GP210,SP100,LC-1,LKM等。

对于这些指标的检测可以作为辅助疾病诊断的参考，但是单独一种指标的检测并不能直接得出疾病诊断的结果，必须综合临床症状等多种指标才能得出疾病诊断的结论。

常见的自身免疫病有以下几种：

系统性红斑狼疮

系统性红斑狼疮是一种与自身免疫系统密切相关的慢性、多脏器受累的炎症性疾病。该病往往在女性人群中高发。常见的临床表现包括游走性关节疼痛和关节炎、面颊和其它皮肤部位的发疹、胸膜炎和心包炎、肾脏或中枢神经系统的病变以及血液系统中的血细胞减少等。临床对于SLE的诊断需要密切结合临床表现和血清学检测结果。对于处于活动期症状严重的患者临床通常使用皮质类固醇、羟化氯喹和一些免疫抑制剂进行治疗。

约70-90％的患者为女性(以育龄期女性为主)。SLE在黑人和亚洲人中的发病率要高于白人。该病可以在任何年龄段发病，包括新生儿。由于临床医生对于SLE的诊断越来越重视，因此每年报道的病例数持续上升。在一些国家，SLE的发病率甚至超过类风湿关节炎(RA)。环境因素引起的自身免疫反应，是遗传易感人群发病的一个主要因素。

由于SLE的临床表现具有多脏器累及的特点，因此临床往往混淆SLE与其它风湿性疾病的诊断。例如：早期具备明显关节症状的SLE患者，可能被误诊为类风湿关节炎。可能与SLE发生误诊的疾病还包括，混合结缔组织病(MCTD)、风湿样多关节炎，多发性肌炎/皮肌炎、结节病和副瘤性综合征等。值得注意的是，一些感染性疾病(例如细菌性心内膜炎和组织胞浆菌病等)也可能误诊为SLE，从而导致不必要的免疫抑制治疗。因此，实验室血清学抗体检测是区分SLE与其它临床疾患的重要依据。临床实验室针对SLE患者的检测主要包括：血清抗核抗体(ANA)检测；全血细胞计数(CBC)；尿液分析；和肝肾器官生化指标的检测。综合所有这些指标，才能得出诊断结果。

干燥综合征

干燥综合征是一种表现为眼干和口干的自身免疫性疾病。该病最大的特点是在产生泪液和唾液的泪腺和腮腺腺体部位出现明显的炎症，而上述部位的炎症直接导致口干和眼干等临床症状和表现。干燥综合征根据临床表现，可分为原发性干燥综合征和继发性干燥综合征两种。前者仅有口干和眼干症状，而后者则合并有其它混合结缔组织病，例如：类风湿关节炎、系统性红斑狼疮或硬皮病等。

临床针对干燥综合征的诊断包括眼干和口干检测。目前，在眼科中眼科医生已经有更加先进的检测方法可以完成眼部干燥的检测。干燥综合征患者的唾液腺部位可能肿大变硬。唾液腺炎症的检查可以通过放射性核医学扫描完成。同时，唾液腺分泌唾液量的减少还可以通过唾液流动测试完成。而唾液腺组织活检结果对于干燥综合征具有更高的诊断价值。

干燥综合征患者的一个典型临床表现是在体内产生多种自身抗体，这些自身抗体可以通过血清学方法完成检测。其中尤其以SSA和SSB抗体、类风湿因子、抗甲状腺抗体等最为典型，这些抗体在大部分干燥综合征患者体内均可检测到。另外，干燥综合征患者还可能出现血细胞减少(贫血)和血沉加快等临床表现。

混合结缔组织病

混合结缔组织病最早报道于1972年。由于该病患者在临床上同时具备系统性红斑狼疮、硬皮病和多发性肌炎等三种疾病的临床表现，因此该病在当时被认为是上述三种疾病的重叠征。该病的一个典型临床表现是患者血清中可以检测到高滴度的抗核抗体和抗RNP抗体。

目前，对于混合结缔组织病的明确诊断主要通过临床症状表现，并结合高滴度的抗核抗体和抗RNP抗体。在MCTD患者体内很少出现与系统性红斑狼疮高度特异的抗dsDNA和与硬皮病高度特异的抗Scl-70抗体。

硬皮病

硬皮病，又称系统性硬化症，是以局限性或弥漫性皮肤及内脏器官结缔组织纤维化、硬化及萎缩为特点的结缔组织病，其主要特点为皮肤、滑膜、骨骼肌、血管和食道出现纤维化或硬化。有些内脏器官，如肺、心脏、肾脏和大小动脉也可有类似的病变。本病的严重程度不等，轻者只有手指和脸部皮肤受累(局限型)，早期表现为面部、手和(或)足肿胀，皮肤发紧，不能提起，状如腊肠，又称腊肠样指，皮肤逐渐增厚，皮纹和皱折消失，晚期皮肤变硬萎缩，面部皮肤菲薄，表情呆板，鼻子变尖，耳轮变薄，张口受限，像个面具—样。大多数病人常以雷诺现象为本病最先出现的症状，有些病人在雷诺现象10余年后才有皮肤改变。1/3的病人可有关节痛和关节发僵，少数有肯定的关节炎。另外有些病人表现为严重的肌肉乏力，与肌炎不易鉴别。部分病人病情逐渐进展，往往经过很长时间，有人长达数十年，才出现特殊内脏受累的临床表现。严重的硬皮病病人可有广泛的皮肤改变，累及胸腹部和背部(弥漫型)。弥漫型硬皮病病人可有内脏受累，部分病人发现患病时已有肾脏、心脏等重要器官受累，病情进展凶险，甚至危及生命。

多发性肌炎/皮肌炎

多发性肌炎和皮肌炎是一种自身免疫性结缔组织疾病。因为是非化脓性炎性肌病，所以抗生素治疗无效。多发性肌炎主要表现为肢体近端如胯部、大腿、肩、颈等部位的肌痛及肌无力。肌炎病人如同时伴有特征性皮疹，则称为皮肌炎。其实多发性肌炎和皮肌炎的损害并不仅限于皮肤和肌肉，也可损及内脏系统。该病属少见病。在英美国家发病率为0.1/10万～0.6/10万，日本约为0.5/10万。皮肌炎男女之比约为1：21，多发性肌炎约为1：25，在伴有其他结缔组织病的多发性肌炎或皮肌炎患者中，男女之比为1：8，可见该病好发于女性。该病可发生在任何年龄，发病率年龄分布呈双峰型，前峰10～14岁，后峰在50岁左右，伴发恶性肿瘤的病人年龄在60岁左右，也就是说老年多发性肌炎或皮肌炎病人应警惕肿瘤。这也就是为什么老年性肌炎或皮肌炎病人住院各项检查众多的原因所在。合并有系统性红斑狼疮、类风湿关节炎和硬皮病的多发性肌炎或皮肌炎病人年龄多在35岁左右。本病散发，无传染性，一家中多人发病的情况很少见。

癌胚抗原(CEA)是一种分子量为180-200kDa的多糖蛋白复合物。它存在2～6月龄的胎儿胃肠道组织和直、结肠癌细胞组织中，胃癌、胰腺癌、卵巢癌、食道癌等组织中也有存在。通常CEA被认为是一种广谱的肿瘤标志物。CEA最常用于消化系统的癌症，如结肠、直肠、胃、肝脏和胰腺等器官。此外，还用于乳癌、肺癌和前列腺癌。测定血清中的CEA含量，对恶性消化道肿瘤治疗前、后和定期连续性的动态含量变化的观察及判断预后具有一定的参考价值。CEA含量与肿瘤大小、有无转移存在一定关系，当发生肝转移时，CEA的升高尤为明显。此外，CEA轻度增加也见于某些良性消化道疾病如肠梗阻、胆道梗阻、胰腺炎、肝硬化、结肠息肉、溃疡性结肠炎以及吸烟者和老年人。从检测角度上来说，目前临床上用于测定CEA的方法主要有放免法、ELISA法、化学发光法等。

目前用于检测自身免疫疾病的免疫分析方法主要有膜条法，酶联免疫分析法、化学发光免疫分析法等。膜条法是定性检测，酶联免疫分析法存在灵敏度低，线性范围窄、不易实现全自动化等方法学限制因素。化学发光免疫分析法是在酶联免疫分析法基础上发展起来的一种免疫检测技术，具有灵敏度高、检测线性范围宽、操作简便，自动化程度高等优势。目前化学发光免疫分析技术因其有上述诸多有点得到了广泛的应用。

然而，在实际的免疫检测中，由于待测样品中所含的杂质成分较多，一定程度上影响了检测灵敏度和准确性，所以从复杂的样品基质中快速分离、纯化出目的待测物，是临床检验工作者面临的难题之一。因此，需要一种更加简便准确的检测方法来满足检测的需要。

发明内容

本发明是为了解决以上技术问题，而提供的一种磁微粒化学发光免疫检测试剂盒及其检测方法，该方法综合采用了悬浮磁微粒载体技术和化学发光检测技术，使系统能够充分满足临床对检测结果的要求，其准确性好、精密度高、灵敏度高，操作简单省时，检测范围宽。

本发明涉及一种磁微粒化学发光免疫检测试剂盒，所述试剂盒包括荧光素标记的抗原、碱性磷酸酶标记的抗体和包被有抗所述荧光素的抗体的磁微粒；

其中，所述碱性磷酸酶标记的抗体为碱性磷酸酶标记的抗人IgG抗体、碱性磷酸酶标记的抗人IgM抗体或碱性磷酸酶标记的抗人IgA抗体。

优选地，所述荧光素为FITC(异硫氰酸荧光素)。

优选地，所述抗原为自身免疫疾病抗原或肿瘤相关抗原。

优选地，所述自身免疫疾病抗原为SS-A、核糖体P蛋白、SS-B、nRNP/Sm、Sm、着丝点、scl-70、Jo-1、双链DNA、组蛋白、核小体、线粒体2型(M2)、环瓜氨酸肽(CCP)、髓过氧化物酶(MPO)、蛋白酶3(PR3)、肾小球基底膜(GBM)、抗肝肾微粒体1型(LKM-1)、肝细胞溶质抗原1(LC-1)、可溶性肝抗原(SLA/LP)、PM-SCL、增殖细胞核抗原(PCNA)和类风湿因子中的一种。

优选地，所述荧光素标记的抗原为液体，且所述碱性磷酸酶标记的抗人IgG抗体、所述碱性磷酸酶标记的抗人IgM抗体和所述碱性磷酸酶标记的抗人IgA抗体均为液体。

本发明还涉及一种磁微粒化学发光免疫检测方法，所述方法包括以下步骤：

a.将待测样品与荧光素标记的抗原混合并使其充分结合，得到第一混合物；

b.将第一混合物与包被有抗所述荧光素的抗体的磁微粒混合，温育后得到第二混合物；

c.将第二混合物置于磁场中，使所述磁微粒在磁场中沉降，去除上清并洗涤磁微粒；

d.向洗涤后的磁微粒中加入碱性磷酸酶标记的抗人IgG抗体、碱性磷酸酶标记的抗人IgM抗体或碱性磷酸酶标记的抗人IgA抗体，温育使其充分结合；

e.利用磁场分离结合后的磁微粒，洗涤；

f.向洗涤后的磁微粒中加入发光底物；然后测定发光反应后的吸光度。

优选地，所述荧光素为FITC。

优选地，所述抗原为自身免疫疾病抗原或肿瘤相关抗原。

本发明磁微粒化学发光免疫检测试剂盒及其检测方法与现有技术不同之处在于：

1.检测范围宽：表面巨大的磁微粒免疫反应载体、灵敏稳定的碱性磷酸酶底物化学发光体系保证了宽的线性范围。

2.灵敏度高：悬浮磁微粒表面积大，可有效捕获样品中的痕量待测物，提高检测的灵敏度。

3.快速准确：悬浮磁微粒作为反应载体，可发挥液相免疫反应的优点，保证免疫反应和发光反应迅速达到平衡，无需耗时等待。

下面结合附图对本发明的磁微粒化学发光免疫检测试剂盒及其检测方法作进一步说明。

附图说明

图1为对本发明方法灵敏度的测定结果图。

具体实施方式

本发明的磁微粒化学发光免疫检测试剂盒的试剂组成和试剂主要成分包括：

试剂1(R1)：含荧光素(FITC)标记的自身免疫抗原的溶液；

试剂2(R2)：含碱性磷酸酶(ALP)标记的抗人IgG抗体的溶液；

磁分离试剂：含包被着抗FITC抗体的磁微粒的悬浊液。

其中，

试剂1按以下步骤制备：将自身免疫抗原与FITC按分子比1:20-1:200比例在0.1-0.2mol/LPH9.0-10.0的碳酸缓冲液内混合，室温反应超过12h。用G-25凝胶柱将抗原-FITC连接物与游离FITC分离，获得偶联有FITC分子的抗原浓溶液，然后将该溶液用缓冲液稀释到工作浓度，完成试剂1的制备。

磁分离试剂按以下步骤制备：用碳二亚胺(EDC)作偶联剂,将抗FITC抗体共价连接在含羧基(COOH)活性集团磁微粒的表面，然后用缓冲液稀释到工作浓度，完成磁分离试剂的制备。

试剂2按以下步骤制备:将抗人IgG抗体与ALP用SMCC、2IT作为交联剂进行连接。抗人IgG抗体与ALP分子比为1:1-1:3。交联后用凝胶层析的方法纯化，获得连接抗体浓溶液，将该溶液用缓冲液稀释到工作浓度完成试剂2的制备。

I、以双链DNA为靶标

实施例I-1

抗FITC抗体与磁微粒偶联，制备磁分离试剂。

材料与仪器

1.磁微粒：含羧基(COOH)活性集团，每克(g)磁微粒(干重)羧基含量不低于0.4毫摩尔(mmol)，具有超顺磁性，直径在0.5-2μm之间。

2.抗FITC抗体：可以是多克隆抗体，也可以是单克隆抗体，纯度应超过90％，稀释效价应超过1:100万。

3.2-吗啉乙磺酸(MES)、碳二亚胺(EDC)、TRIS和其他试剂应达到化学纯。

操作步骤

1.取100mg磁微粒，磁分离去上清，用0.05mol/L,PH4.5-5MES缓冲液10ml重悬；

2.加入2-4mg的抗FITC抗体，室温混悬30-60min；

3.加入0.5-1ml，新鲜配制的10mg/ml，EDC水溶液，室温混悬2-12h；

4.磁分离，去上清，用含0.5％牛血清白蛋白(BSA)PH8.0的0.1mol/L的TRIS缓冲液重悬到1mg/ml，完成磁分离试剂的制备。

实施例I-2

FITC与自身免疫抗原连接，制备试剂1。

材料与仪器

1.自身免疫抗原，购买者Sigma，纯度超过95％，浓度超过1mg/ml,以磷酸盐缓冲液保存；

2.异硫氰酸荧光素(FITC)，碳酸钠等试剂应达到化学纯，

3.G-25凝胶纯化柱采购自GE公司。

操作步骤

1.用0.1-0.2mol/L PH9.0-10.0的碳酸缓冲液配制0.5mg/ml的FITC溶液；

2.按照自身免疫抗原与FITC分子比1:20-1:200比例在抗原溶液中加入FITC溶液，混合均匀，室温静置超过12h；

3.用G-25凝胶柱将抗原FITC连接物与游离FITC分离，获得偶联有FITC分子的抗原浓溶液，将该溶液用含0.5％牛血清白蛋白(BSA)PH8.0的0.1mol/L的TRIS缓冲液稀释到0.5-1μg/ml，完成试剂1的制备。

实施例I-3

ALP与抗人IgG抗体连接，制备试剂2。

材料与仪器

1.抗人IgG抗体，购买自Sigma公司，纯度超过95％，浓度超过1mg/ml,以磷酸盐缓冲液保存；

2.碱性磷酸酶纯度应超过95％，比活性应超过1000U/mg，浓度超过5mg/ml；

3.偶联剂SMCC,2-IT购自THERMO公司,TRIS等化学试剂应达到化学纯；

4.AKTA-purifier蛋白纯化仪和Supperdex200凝胶纯化柱为GE公司产品。

操作步骤

1.取1mg抗人IgG抗体，加入10mg/ml的偶联剂2-IT溶液2-4μl，室温静置20min，加入0.1mol/L的甘氨酸溶液10μl，室温静置5min。用G-25凝胶柱除盐，收集活化后抗体，2-8℃保存备用；

2.取1.5mg的ALP溶液，加入5mg/ml的SMCC溶液10-20μl，室温静置30min，用G-25凝胶柱除盐，收集活化后抗体，2-8℃保存备用；

3.将上述活化的F-hCGβ抗体2与活化的ALP混合，2-8℃条件下静置12-24h，用Supperdex200凝胶纯化柱纯化偶联物，获得连接物浓溶液，2-8℃保存备用。

4.将抗体-ALP连接物浓溶液用含0.5％牛血清白蛋白(BSA)PH8.0的0.1mol/L的TRIS缓冲液稀释到0.5-1μg/ml，完成试剂2的制备。

实施例I-4

检测的实施和检测效果的评价。

材料与仪器

1.自身免疫抗体(dsDNA)试剂1，试剂2和磁分离试剂，由上述实施例1、2、3制备。

2.自身免疫抗体(dsDNA)校准品、自身免疫抗体(dsDNA)质控品、发光底物、清洗液、自身免疫抗体(dsDNA)测定试剂盒(化学发光法)由INOVA公司生产。

检测实施

下述检测步骤由全自动化学发光分析仪自动完成，也可手工操作完成。

1.在检测管中加入10μl待测样本(血清或血浆)原液，然后加入50μl试剂1，混匀，37±1℃条件下温育10min；

2.加入50μl磁分离试剂，混匀，37±1℃条件下温育5min；

3.使磁微粒在磁场中沉降，去除上清，加入600μl的清洗液，去除磁场，震荡使磁微粒充分混悬。重复此操作，共操作3次。

4.加入100μl试剂2，混匀，37±1℃条件下温育10min；

5.使磁微粒在磁场中沉降，去除上清，加入600μl的清洗液，去除磁场，震荡使磁微粒充分混悬。重复此操作，共操作3次。

6.将磁微粒在磁场中沉降，去除上清，加入100μl的发光底物，去除磁场，充分混悬后检测1秒内相对发光强度值(RLU)。

灵敏度评价

检测“0”浓度样本，重复检测20次，计算相对发光强度(RLU)的平均值(M)和标准差(SD)，并计算M+2SD值,根据零浓度校准品和相邻校准品之间的浓度-RLU进行两点回归拟合得出一次方程，将M+2SD值带入上述方程中，求出对应的浓度值，即为最低检测限。本发明方法的灵敏度不大于1Iu/mL。

(1)A点发光值

A点发光均值X＝1397

SD＝80

X+2SD＝1557

(2)B点发光值

dsDNA-STD-B(RLU)
	18653
18856

B点发光均值X＝18755

(3)A,B点连点拟合曲线，参见图1。

(4)灵敏度＝0.4IU/mL

精密度评价

(1)分析内精密度

将实施例1中制备的试剂盒一批，分别测定低、中、高三种不同浓度的血清，10孔平行测定，得出批内变异系数为4.67％～5.58％。

表I-1分析内精密度测试

测定血清浓度(IU/mL)	测定次数	分析内CV(％)
			6.32	10	5.58
41.01	10	4.67
			101.57	10	4.99

(2)分析间精密度

将实施例1中制备的试剂盒取三批，每批试剂盒均测定低、中、高三种不同浓度的血清，10孔平行测定。每份血清得到30个浓度测值，统计分析间变异系数为5.30％～7.21％。

表I-2分析间精密度测试

测定血清浓度(IU/mL)	测定次数	分析内CV(％)
			6.32	30	6.53
41.01	30	7.21
			101.57	30	5.30

准确度评价

在2例混合血清样本中添加不同量人dsDNA标准品，形成3个浓度水平的血清添加样本，添加物体积小于总体积的10％。检测样本浓度，按下述公式计算回收率。本方法血清基质回收率在90-110％之间。数据参见表I-1。

R：回收率；

V：加入标准溶液的体积；

V0：人源样品的体积；

C：人源样品加入标准溶液后的检测浓度；

C0：人源样品的检测浓度；

Cs：标准溶液的浓度。

表I-3准确度评价——添加回收实验数据

试剂盒特异性评价

对实施例1的试剂盒特异性检验是选取与人IgG同为免疫球蛋白的IgA，IgM，IgE，IgD，配制成大于生理浓度的样本，以本方法进行测定，并计算交叉反应率。结果见表I-4，本法与IgA，IgM，IgE，IgD的交叉反应率均小于0.02％

表I-4特异性实验

交叉反应物	实验浓度(IU/ml)	F-hCGβ测定浓度(IU/mL)
			IgA	5000	＜1
IgM	5000	＜1
			IgE	5000	＜1
IgD	5000	＜1

相关性评价

用实施例1制备得的试剂盒和INOVA公司生产的dsDNA化学发光法试剂盒对100份人血清样品同时进行检测。以本发明方法的测的人双链DNA抗体浓度为横坐标，以INOVA试剂盒测定的结果为纵坐标作回归分析，相关方程为：y＝0.02707+0.9974x，相关系数为：0.9962。经统计学处理结果表明，本方法同国外试剂盒临床样本测值相关性良好。

热稳定性评价

对实施例1的试剂盒分别进行4℃12个月和37℃7天的稳定性实验，结果表明试剂盒标准品发光强度的变化、批内和批间精密度、准确性等指标均在正常范围之内，试剂盒有效期可达12个月。

II、以癌胚抗原为靶标

一种癌胚抗原(CEA)的定量测定试剂盒，其包含的试剂有CEA磁分离试剂，酶反应物，反应增强剂，稀释液，标准品、质控品，清洗液浓缩液以及底物溶液。

磁分离试剂含有标记有抗CEA单克隆抗体的磁性微球。

酶反应物是含有碱性磷酸酶标记的抗CEA单克隆抗体。

反应增强剂是含有Tris的缓冲液。

稀释液是含有BSA溶液。

标准品及质控品是含有一定量的CEA抗原的BSA蛋白溶液。

清洗液浓缩液是含有TWEEN-20和Proclin-300的缓冲液。

底物溶液为酶促化学发光底物溶液。

本发明癌胚抗原(CEA)的定量测定试剂盒的制备方法，包括下述步骤：

第一步：磁分离试剂的制备过程

一、磁珠缓冲液配制操作步骤，配制1L：

1、称取TRIS 4.58g和NaCl6.81g于1L容器中，称取0.96g TWEEN-20于20ml容器中加适量水使其完全溶解后，倒入上述容器中；

2、用移液器将Proclin-300量取0.2ml于10ml纯化水的烧杯中完全溶解后，倒入上述1L容器中，然后在上述1L容器中加入800ml纯化水，充分搅拌；

3、调节PH计测量其PH值，调PH，控制PH在7.95－8.05之间；

4、称取BSA 3g倒入上述1L容器中；

5、最后定容至1000ml，用0.2um滤器过滤；过滤完后贴好标签于2-8℃冷库贮存。

二、磁分离试剂的制备过程

1、将1.0mg辛二酸二琥珀酰亚胺酯溶于50ul DMSO中，取2mg抗CEA单克隆抗体溶于PH 9.5的0.1mol/L PB缓冲液中至总体积为1ml；

2、确定辛二酸二琥珀酰亚胺酯的投入量，用移液枪吸取辛二酸二琥珀酰亚胺酯加入到步骤1的抗体溶液中，置室温90min；

3、将步骤2抗体溶液加入到Centricon-10浓缩管中然后放入到高速冷冻离心机中在3000g下浓缩30min至体积为0.5ml；

4、取0.5ml磁珠，加入5ml反应杯中，放入专用试管架，经磁铁吸附2分钟后吸取上清；

5、每次加入1.5ml PH9.5 0.1mol/L PB，混匀30秒，上架，去上清，重复操作3次；将步骤4获得的抗体溶液加入到上述磁珠中，混匀后室温反应4小时；

6、加入0.3ml 1mol/L的TRIS溶液37℃15分钟；

7、每次加入1.5ml PH 7.2 0.1mol/L PB清洗已经标记的磁珠，混匀30秒，上架，去上清，重复操作3次；

8、用100ml磁珠保存液将磁珠转入125ml玻璃瓶，即为0.05％的CEA磁分离试剂；磁珠保存液配方为0.1％BSA，0.05％吐温-20，0.02％NaN3，20％乙醇，4℃保存。

9、将步骤9获得的磁分离试剂用磁珠缓冲液按照1：1的比例混匀，即得本发明试剂盒中磁分离试剂。

第二步：酶反应物制备过程

一、酶反应物稀释液配制操作步骤，配制1L：

1、取Tris 6.06g、NaCl 13.0g、Zncl2 0.05g、Proclin-300 0.2ml和MgCl2 0.05g于烧瓶中，然后在烧瓶中加入800ml纯化水，充分搅拌，使试剂完全溶解；

2、调PH，控制PH在7.35-7.45范围内；

3、称取BSA 3g倒入上述烧杯中；

4、最后定容至1000ml，用0.2um滤器过滤即得。

二、碱性磷酸酶ALP与抗CEA单克隆抗体的偶联

1、取10mgALP加入5ml生理盐水中，加入到浓缩管中，3000RPM离心20分钟，浓缩至1毫升；

2、向步骤1获得浓缩液中加入0.2ml的0.1M NaIO 4溶液，室温下避光搅拌20分钟，然后装入透析袋中，用1mM PH4.4的醋酸钠缓冲液透析，4℃过夜，收集保留液；

3、向步骤3获得保留液中加入0.2M PH9.5碳酸盐缓冲液，使PH升高到9.0，然后立即加入2.5mg抗CEA单克隆抗体，室温避光轻轻搅拌2小时，再加入0.1ml的4mg/ml NaBH4溶液，混匀，置4℃下2小时；

4、将上述液装入透析袋中，对0.15M PH7.4PBS透析，4℃过夜，收集保留液；

5、向步骤4获得保留液中逐滴加入等体积饱和硫酸铵，置4℃1小时，然后3000rpm离心半小时，弃上清，沉淀物用半饱和硫酸铵洗二次，最后沉淀物溶于20ml的0.15M PH7.4的PBS中；

6、将步骤5获得的溶液装入透析袋中，用0.15M PH7.4的PB缓冲盐水透析5个小时去除铵离子，收集保留液后10,000rpm离心30分钟去除沉淀，收集上清液，按照体积比为1：100的比例添加1M MgCl2溶液，即得碱性磷酸酶(ALP)与CEA单克隆抗体的偶联物，最后将收集到的碱性磷酸酶(ALP)与CEA单克隆抗体的偶联物用上述酶反应物稀释液以1：1000的体积比混合均匀，即得酶反应物。

第三步：

反应增强剂配制步骤，配制1L：

1、称取TRIS1.56g和NaCl 4.23g于1L容器中；用移液器将Proclin-300量取0.2ml于10ml纯化水的烧杯中完全溶解后，倒入上述1L容器中；

2、用量筒量取800ml纯化水于上述1L容器中，充分搅拌，直至完全溶解调PH，控制PH在7.35－7.45之间；

3、称取Mak33 0.9g于上述1L容器中；最后定容1000ml，完全溶解后，用0.2um滤器过滤。

第四步：

稀释液配制步骤，配制1L：

1、称取NaCl9.0g和BSA 60g于1L的容器中；

2、用移液器将Proclin-300量取0.5ml加10ml纯化水溶解，倒入上述1L的容器中；

3、最后定容1000ml，完全溶解后，用0.2um滤器过滤，贴好标签于2-8℃冷库贮存，有效期为12个月。

第五步：

校准品和质控品的配制：

校准品浓度分别为5、15、30、80、160ng/ml；质控品浓度分别为15、80ng/ml。

第六步：

清洗浓缩液配制步骤，配制1L：

1、称取TRIS 12.54g和NaCl 325.6g于1L容器中；

2、称取5g Tween-20于100ml容器中加20ml水使其完全溶解后，倒入上述1L容器中；

3、用移液器将Proclin-300量取0.2ml于盛有10ml纯化水的烧杯中完全溶解后，倒入上述1L容器中；

4、用量筒量取800ml纯化水于上述1L容器中，充分搅拌，直至完全溶解；

5、调PH，控制其范围在7.35－7.45之间；

6、最后定容1000ml，完全溶解后用0.2um滤器过滤即得。

第七步：

底物溶液配制步骤，配制1L：

1、称取TRIS 2.35g、NaCl 6.41g、Na2SO3 0.002g和Proclin-300 0.2ml于1L烧杯中；

2、用量筒量取600ml纯化水于1L烧杯中，充分搅拌，直至完全溶解，调PH，控制其范围在7.95－8.05之间；

3、加入250ml Lumi-Phos 480后，用0.2um滤器过滤收集滤液，用纯化水定容至1000ml，混匀后即得。

实施例II-1

一、磁珠缓冲液配制操作规程：配方见表II-1，以配制1L为例：

2、用移液器将Proclin-300量取0.2ml于少量纯化水的烧杯中完全溶解后，倒入上述1L容器中；然后在1L容器中加入800ml纯化水，充分搅拌，使试剂完全溶解；

3、调节PH计测量其PH值；用HCl或NaOH调PH，测量其PH在7.95－8.05之间即符合要求；

4、称取BSA(牛血清白蛋白)3g倒入上述容器中；

5、最后定容至1000ml，测PH值，范围在7.95－8.05之间即符合要求，用0.2um滤器过滤；

过滤完后贴好标签于2-8℃冷库贮存,磁珠缓冲液有效期为12个月。

表II-1磁珠缓冲液原料及量

二、磁分离试剂的制备过程

1、将1.0mg DSS(辛二酸二琥珀酰亚胺酯)溶于50ul DMSO中，即浓度为20mg/ml；取2mg抗CEA单克隆抗体(天健生物制药(天津)有限公司，浓度为2.14mg/ml)溶于PH 9.5的0.1mol/L PB缓冲液中至总体积为1ml；

2、计算DSS的投入量，按照以下公式计算：(抗体质量/16000)×10×368/CDSS)，其中CDSS指代DSS的物质的量浓度mol/L；

3、用移液枪吸取相应体积的DSS加入到步骤1的抗体溶液中，置室温90min；

4、将步骤3抗体溶液加入到Centricon-10浓缩管中然后放入到sigma2-16k高速冷冻离心机中在3000g的离心力下浓缩约30min至体积为0.5ml；

5、取0.5ml磁珠，磁珠浓度为0.5g/ml，所述的磁珠直径在0.9μm之间，加入5ml反应杯中，放入专用试管架，经磁铁吸附2分钟后吸取上清；

6、每次加入1.5ml PH9.5 0.1mol/L PB，混匀30秒，上架，去上清，重复操作3次；将步骤4获得的抗体溶液加入到磁珠中，混匀后室温反应4小时，保持混匀状态；

7、加入0.3ml 1mol/L的TRIS溶液37度15分钟，其中TRIS的加样量为1mg抗体加0.15mlTRIS；

8、每次加入1.5ml PH 7.2 0.1mol/L PB清洗已经标记的磁珠，混匀30秒，上架，去上清，重复操作3次；

9、用100ml磁珠保存液将磁珠转入125ml玻璃瓶，即为0.05％的CEA磁分离试剂；磁珠保存液配方为0.1％BSA，0.05％吐温-20，0.02％NaN3，20％乙醇，4℃保存。

10、将步骤9获得的磁分离试剂用磁珠缓冲液按照1：1的比例混匀；

11、贴好标签于2-8℃冷库贮存,磁分离试剂有效期为12个月。

实施例II-2

一、酶反应物稀释液配制操作规程：配方见表II-2，以配制1L为例：

1、取Tris 6.06g、NaCl 13.0g、Zncl2 0.05g、Proclin-300 0.2ml和MgCl2 0.05g于烧瓶中；然后在烧瓶中加入800ml纯化水，充分搅拌，使试剂完全溶解；

2、用HCl或NaOH调PH，测量使PH在7.35-7.45范围内；

3、称取BSA3g倒入上述容器中；

4、最后定容至1000ml，测PH值，范围在7.35-7.45之间即符合要求，用0.2um滤器过滤；

过滤完后，贴好标签于2-8℃冷库贮存，有效期为12个月.

表II-2酶反应物稀释液的原料及量

二、碱性磷酸酶(ALP)与抗CEA单克隆抗体的偶联

1、取10mgALP加入5ml生理盐水中，加入到Centriprep YM10浓缩管中，3000RPM离心大约20分钟，浓缩至1毫升。

3、向步骤2获得保留液中加入0.2M PH9.5碳酸盐缓冲液，使PH升高到9.0～9.5，然后立即加入2.5mg抗CEA单克隆抗体(天健生物制药(天津)有限公司，浓度为2.14mg/ml)，室温避光轻轻搅拌2小时，再加入0.1ml的4mg/ml NaBH 4(硼氢化钠)溶液，混匀，再置4℃下2小时；

5、向步骤4获得保留液中逐滴加入等体积饱和硫酸铵，置4℃1小时，然后3000rpm离心半小时，弃上清，沉淀物用半饱和硫酸铵洗二次，最后沉淀物溶于少量0.15M PH7.4的PBS中；

6、将步骤5获得的溶液装入透析袋中，用0.15M PH7.4的PB缓冲盐水透析约5个小时去除铵离子，收集保留液后10,000rpm离心30分钟去除沉淀，收集上清液，按照体积比为1：100的比例添加1M Mgcl2溶液，即得碱性磷酸酶(ALP)与CEA单克隆抗体的偶联物，最后将收集到的碱性磷酸酶(ALP)与CEA单克隆抗体的偶联物用上述酶反应物稀释液以1：1000的体积比混合均匀，即得酶反应物。

实施例II-3

反应增强剂配制操作规程：配方见(表3)，以配制1L为例：

1、称取TRIS(三羟甲基氨基甲烷，分子式:(HOCH2)3CNH2)1.56g和NaCl 4.23g于1L容器中；用移液器将Proclin-300量取0.2ml于少量纯化水的烧杯中完全溶解后，倒入上述1L容器中；

2、用量筒量取800ml纯化水于1L容器中，充分搅拌，直至完全溶解；用HCL或NaOH调PH，测量其范围在7.35－7.45之间；

3、称取Mak33 0.9g于上述1L容器中；

4、最后定容1000ml，完全溶解后，测PH值，范围在7.35－7.45之间即符合要求，用0.2um滤器过滤；过滤完后，贴好标签于2-8℃冷库贮存，有效期为12个月。

表II-3反应增强剂的原料及量

实施例II-4

稀释液配方见(表II-4)，以配制1L为例：

1、称取NaCl9.0g和BSA 60g于1L的容器中；

3、最后定容1000ml，完全溶解后，用0.2um滤器过滤，贴好标签于2-8℃冷库贮存，有效期为12个月

表II-4稀释液的原料及量

实施例II-5

校准品和质控品的配制：

1、最高点：最高浓度点为X，目标点浓度为A,B,C,D,E,F，配制V体积的溶液时，需加入原料的体积为分别如表II-5所示。

表II-5校准品和质控品的原料及量

浓度	加入标准品稀释液体积	加入X体积
			A	V-A*V/X	A*V/X
B	V-B*V/X	B*V/X
			C	V-C*V/X	C*V/X
D	V-D*V/X	D*V/X
			E	V-E*V/X	E*V/X
0F	V-F*V/X	F*V/X

2、癌胚抗原(CEA)定量测定试剂盒CEA校准品原料(购于PPS公司，浓度为5.7mg/ml)用稀释液(具体配方见实施例4)配制成浓度点为5、15、30、80、160ng/ml；质控品用稀释液配制的浓度点为15、80ng/ml。

3、完全溶解后，贴好标签于2-8℃冷库贮存，有效期为12个月。

实施例II-6：

清洗浓缩液配制操作规程：配方见(表6)，以配制1L为例：

1、称取TRIS 12.54g和NaCl 325.6g于1L容器中；

2、称取5g Tween-20于100ml容器中加适量水使其完全溶解后，倒入上述容器中；

5、用HCL或NaOH调PH，测量其范围在7.35－7.45之间；

6、最后定容1000ml，测PH值，范围在7.35-7.45之间即符合要求，完全溶解后用0.2um滤器过滤；过滤完后，贴好标签于2-8℃冷库贮存，有效期为12个月。

表II-6清洗浓缩液的原料及量

实施例II-7

底物溶液配制操作规程：配方见(表II-7)，以配制1L为例：

2、用量筒量取600ml纯化水于1L烧杯中，充分搅拌，直至完全溶解；用HCl或NaOH调PH，测量其范围在7.95－8.05之间；

3、加入250ml Lumi-Phos 480后，用0.2um滤器过滤收集滤液，用纯化水定容至1000ml，混匀后，贴好标签于2-8℃冷库贮存，有效期为12个月。

表II-7化学发光底物的原料及量

本发明的测试方法如下

1、加15μl CEA标准品、质控品、待测标本至对应试管底部。

2、加45μl酶反应物至每一试管中。

3、加45μl反应增强剂至每一试管中。

4、加30μl磁分离试剂至每一试管中。

5、用塑料薄膜覆盖试管，多管混匀器轻轻振荡试管架30s后，置37℃水浴30分钟。

6、试管连架放至磁分离器上，确保每支试管都与分离器表面接触，沉淀2分钟。缓慢的倒转分离器倒出上清液，把倒转的试管连同分离器一起放在滤纸上，用力拍击分离器底部以除去粘在管壁上的所有液滴。

7、清洗液浓缩液用纯化水稀释20倍后，加200μl稀释后的清洗液至每一试管中，置多管混匀器上轻轻振荡混匀30s。加样时应避免加样力度过大而导致磁珠溅出。混匀要彻底。

8、重复步骤6、7、6一遍。

9、加200μl底物溶液至试管中混匀3秒，迅速用准备好的发光检测仪进行检测。

10、如遇到高值HOOK样本，为了避免出现高值HOOK效应，建议临床医师根据其余测试指标选择合适的稀释倍数对样品进行稀释。

临床试验：

1、检测数据

标本采自1000例正常体检、供血者。样本体检结果均无肝、脑、肾、消化道疾病，半年内无输血和大手术史，妇女不在妊娠期和哺乳期。将测值进行统计学分析，得出正常血清参考范围：不吸烟者:<6.00ng/ml；吸烟者:<7.00ng/ml。与国外知名公司生产的试剂盒的检测结果相比，本发明试剂盒更加精确，精确到小数点后两位。

本数据仅供参考，不同地区、不同个体以及采用不同方法进行检测，所测得的CEA水平也会有所不同，建议各实验室建立自己的正常值范围。不可仅凭本方法得出的CEA值作出诊断，仅作为中间数据参考作用，应结合临床其他资料分析结果，包括病人的具体情况和治疗状况。通过其他方法得到的样品中的CEA浓度值与本试剂盒测定结果不具有直接的可比性。超出试剂盒测定范围的样本，系统将无法给出确切的数值。如欲测定其确切的结果，建议稀释后再进行测定。本试剂盒的检测结果仅供临床参考，不能单独作为确诊或排除病例的依据，为达到诊断目的，此检测结果要与临床检查、病史和其它的检查结合使用。本品可用于血清样本的测定，用于其他体液样本中CEA浓度测定的可靠性未得到充分确认。

2、本发明试剂盒性能指标

分析灵敏度定义为：对20次零标准品的测定，取其2倍的平均偏差，其在标准曲线上所对应的浓度即为分析灵敏度；

分析灵敏度：0.50ng/ml

精密性：批内变异CV％≦10.0％；批间变异CV％≦15.0％

线性系数：r≥0.9900

线性范围：0.50-160ng/ml

特异性：测定1000μg/L的AFP，干扰度＜0.05％

测定100μg/L的PSA，干扰度＜1％。

以上所述的实施例仅仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案作出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

Claims

1.一种磁微粒化学发光免疫检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括荧光素标记的抗原、碱性磷酸酶标记的抗体和包被有抗所述荧光素的抗体的磁微粒；

2.根据权利要求1所述的磁微粒化学发光免疫检测试剂盒，其特征在于：所述荧光素为FITC。

3.根据权利要求1或2所述的磁微粒化学发光免疫检测试剂盒，其特征在于：所述抗原为自身免疫疾病抗原或肿瘤相关抗原。

4.根据权利要求3所述的磁微粒化学发光免疫检测试剂盒，其特征在于：所述自身免疫疾病抗原为SS-A、核糖体P蛋白、SS-B、nRNP/Sm、Sm、着丝点、scl-70、Jo-1、双链DNA、组蛋白、核小体、线粒体2型、环瓜氨酸肽、髓过氧化物酶、蛋白酶3、肾小球基底膜、抗肝肾微粒体1型、肝细胞溶质抗原1、可溶性肝抗原、PM-SCL、PCNA和类风湿因子中的一种。

5.根据权利要求1所述的磁微粒化学发光免疫检测试剂盒，其特征在于：所述荧光素标记的抗原为液体，且所述碱性磷酸酶标记的抗人IgG抗体、所述碱性磷酸酶标记的抗人IgM抗体和所述碱性磷酸酶标记的抗人IgA抗体均为液体。

6.一种磁微粒化学发光免疫检测方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

e.利用磁场分离结合后的磁微粒，洗涤；

7.根据权利要求6所述的磁微粒化学发光免疫检测方法，其特征在于：所述荧光素为FITC。

8.根据权利要求6所述的磁微粒化学发光免疫检测方法，其特征在于：所述抗原为自身免疫疾病抗原或肿瘤相关抗原。

9.根据权利要求8所述的磁微粒化学发光免疫检测方法，其特征在于：所述自身免疫疾病抗原为SS-A、核糖体P蛋白、SS-B、nRNP/Sm、Sm、着丝点、scl-70、Jo-1、双链DNA、组蛋白、核小体、线粒体2型、环瓜氨酸肽、髓过氧化物酶、蛋白酶3、肾小球基底膜、抗肝肾微粒体1型、肝细胞溶质抗原1、可溶性肝抗原、PM-SCL、PCNA和类风湿因子中的一种。