CN111521777A - 一种降低自身免疫抗体检测中非特异性吸附的处理方法及其试剂盒 - Google Patents

一种降低自身免疫抗体检测中非特异性吸附的处理方法及其试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明属于免疫检测技术领域，公开了一种降低自身免疫抗体检测中非特异性吸附的处理方法及其试剂盒。本发明提供的该降低自身免疫抗体检测的试剂盒，该试剂盒包括聚合物颗粒、磁微粒偶联抗原、AP‑标记抗人IgG和自身抗体IgG抗体与Tris缓冲液互溶后组合而成。该降低自身免疫抗体检测试剂盒是通过加入了聚合物颗粒与试剂盒内磁微粒对于检测目标物呈现竞争结合非特异性物质，进而减少磁微粒表面磁珠的非特异性吸附能力，显著地降低了检测试剂盒在自身免疫抗体检测过程中由于非特异性吸附性而造成的假阳概率，减弱了非特异性物质对临床样本测试结果的影响，提高了检测试剂盒的检出率、检测结果的有效性和稳定性。

Description

一种降低自身免疫抗体检测中非特异性吸附的处理方法及其 试剂盒
技术领域
本发明属于免疫检测技术领域，具体涉及一种降低自身免疫抗体检测中非特异性吸附的处理方法及其试剂盒。
背景技术
化学发光免疫分析(chemiluminescenceimmunoassay,CLIA)技术是上世纪70年代建立起来的一种免疫检测技术,是将高特异性的免疫反应和高灵敏度的化学发光测定技术相结合，用于各种抗原、半抗原、抗体、激素、酶、脂肪酸、维生素和药物等的检测分析技术。是继放免分析、酶免分析、荧光免疫分析和时间分辨荧光免疫分析之后发展起来的一项最新免疫测定技术。具有精确度高，无污染，检测速度快等特点。
纳米磁微粒作为一项新型载体，广泛用于诊断、食品安全等领域，磁性微球具有磁含量高、表面积大等优点，磁微粒表面附着大量的表面基团和修饰蛋白。不同类型的磁微粒大小直径一般在50nm-5um之间，较高的磁含量和适中的密度保证了微球在磁场的作用下具有良好的磁场相应速度和良好重悬性。磁珠分散均匀，具有超顺磁性，磁响应时间＜30s，溶液中有很强的运动能力，使偶联至磁珠的抗体抗原可与溶液中的待检测物质持续进行相互作用。目前市场用应用于体外诊断的的磁珠表面基团主要有链霉亲和素基团、羧基基团、甲苯磺酰基等，针对不同蛋白质，或者不同的体系，可以选择不同的表面基团的磁微粒。
自身免疫性疾病(autoimmune diseases)，是指机体对自身抗原发生免疫反应而导致自身组织损害所引起的疾病，就是正常的免疫能力下降，而异常的免疫能力却突显的一种问题。病人血清中常可检出高浓度自身抗体。主要表现为器官特异性自身免疫病、系统性自身免疫病。组织器官的病理损害和功能障碍仅限于抗体或致敏淋巴细胞所针对的某一器官。主要有慢性淋巴细胞性甲状腺炎、甲状腺功能亢进、胰岛素依赖型糖尿病、重症肌无力、溃疡性结肠炎、恶性贫血伴慢性萎缩性胃炎、肺出血肾炎综合征、寻常天疱疮、类天疱疮、原发性胆汁性肝硬化、多发性脑脊髓硬化症、急性特发性多神经炎等，其中常见者将分别于各系统疾病中叙述由于抗原抗体复合物广泛沉积于血管壁等原因导致全身多器官损害，称系统性自。身免疫病。习惯上又称之为胶原病或结缔组织病，这是由于免疫损伤导致血管壁及间质的纤维素样坏死性炎症及随后产生多器官的胶原纤维增生所致，常见的自身免疫病有以下几种：系统性红斑狼疮(SLE)、类风湿关节炎(RF)、系统性血管炎、干燥症(SS)、硬皮病(PSS)、皮肌炎(DM)、混合性结缔组织病(MCTD)、甲状腺自身免疫病等。例如在系统性红斑狼疮(SLE)患者中：抗Sm抗体、抗核抗体、抗P蛋白抗体(P0)抗体、抗核小体抗体(AnuA)、抗双链DNA抗体(dsDNA)、抗SSA60抗体的抗体滴度比健康群体要高很多。在类风湿患者中RF-IgG，RF-IgM，抗CCP抗体、抗RA33抗体等，抗体滴度含量比健康人群体含量高很多。自身免疫抗体检测抗体主要是间接法或者捕获法原理。
磁微粒对血清样本中蛋白的非特异性吸附会造成检测灵敏度降低，更甚至会造成检测结果假阳，影响检测结果。在实际检测中，非特异性吸附无法避免，样本中含有多种蛋白，很容易造成非特异性吸附。造成非特异性吸附的主要原因是疏水作用和静电作用；目前主要从三个方面减少非特异性吸附，1、利用封闭剂对磁微粒表面非特异性位点进行封闭，阻碍了非特异性吸附、常用的蛋白封闭剂有BSA、酪蛋白、以及不同厂家的生物阻断剂等；2、对磁微粒表面进行改性，目前不同厂家磁微粒进行了改良，降低非特异性吸附的表面修饰，但是由于不同血清样本，蛋白种类有一定差异，也不能从根本解决问题。
发明内容
为了解决现有技术存在的上述问题，本发明目的在于提供一种降低自身免疫抗体检测中非特异性吸附的处理方法及其试剂盒。
本发明所采用的技术方案为：一种降低自身免疫抗体检测中非特异性吸附的处理方法，该处理方法包括：采用含有聚合物颗粒的试剂，在检测时，聚合物颗粒和磁微粒与目标检测物中的蛋白非特异性竞争结合。
优选地，采用含有聚合物颗粒的试剂中，聚合物颗粒在试剂中的浓度为5-50ug/mL。
优选地，聚合物颗粒包括聚合物空心颗粒。
优选地，磁微粒包括磁核，磁核外包覆有聚合物壳层，聚合物壳层的表面设有多个表面功能基团。
优选地，磁核包括Fe3O4。
优选地，磁微粒壳层的材质与聚合物颗粒的材质相同。
优选地，聚合物颗粒的材质包括聚丙乙烯。
优选地，表面功能基团包括链霉亲和素基团、羧基基团和甲苯磺酰基团中的任意一种。
一种降低自身免疫抗体检测中非特异性吸附的处理方法的试剂盒，试剂盒包括下列试剂：聚合物颗粒、磁微粒偶联抗原、AP-标记抗人IgG和自身抗体IgG抗体；
优选地，磁微粒偶联抗原包括磁微粒偶联Sm抗原、磁微粒偶联P蛋白抗原、磁微粒偶联核小体抗原、磁微粒偶联双链DNA抗原、磁微粒偶联SSA60抗原、磁微粒偶联Jo-1抗原、磁微粒偶联Ro-52抗原、磁微粒偶联RF-IgG抗原、磁微粒偶联RF-IgM抗原、磁微粒偶联CCP抗原和磁微粒偶联RA33抗原中的一种或多种；
优选地，自身抗体IgG抗体包括自身抗体Anti-SmIgG抗体、自身抗体Anti-P蛋白IgG抗体、自身抗体Anti-核小体IgG抗体、自身抗体Anti-双链DNAIgG抗体、自身抗体Anti-SSA60IgG抗体、自身抗体Anti-Jo-1IgG抗体、自身抗体Anti-Ro-52IgG抗体、自身抗体Anti-RF-IgGIgG抗体、自身抗体Anti-RF-IgMIgG抗体、自身抗体Anti-CCPIgG抗体和自身抗体Anti-RA33IgG抗体中的一种或多种。
优选地，检测试剂盒中的试剂还包括缓冲液。
本发明的有益效果为：
本发明提供的该降低自身免疫抗体检测试剂盒，该试剂盒包括聚合物颗粒、磁微粒偶联抗原、AP-标记抗人IgG和自身抗体IgG抗体与Tris缓冲液互溶后组合而成。该降低自身免疫抗体检测试剂盒是通过加入了聚合物颗粒与试剂盒内磁微粒对于检测目标物呈现竞争结合非特异性物质，进而减少磁微粒表面磁珠的非特异性吸附能力，显著地降低了检测试剂盒在自身免疫抗体检测过程中由于非特异性吸附性而造成的假阳概率，减弱了非特异性物质对临床样本测试结果的影响，提高了检测试剂盒的检出率、检测结果的有效性和稳定性。
附图说明：
图1是本发明试剂盒实施例3中磁微粒的一种具体实施方式结构示意图；
图2是本发明中试剂盒实施例3中壳层聚合物颗粒的一种具体实施方式结构示意图；
图3是本发明实施例3中检测试剂盒在全自动仪器上对健康人样本进行检测样本浓度值。
图中：1-壳层聚合物颗粒；2-核层：Fe2O3；3-功能基团。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步阐释。本领域技术人员将会理解，下列所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例，仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件进行。所用试剂均为可以通过市售购买获得的常规产品。
上述提供的该降低自身免疫抗体检测试剂盒通过利用以抗dsDNAIgG抗体检测为具体实施方式进行阐述，对于上述提供的所有抗原及其对应的抗体均具有相应的功能及作用，同时该抗体检测试剂盒并不仅限于上述列举，所有符合自身免疫疾病的抗原、抗体均属于本发明的保护范围。
实施例1：
该降低自身免疫抗体检测试剂盒在具体实施过程中，采用间接法原理测定人血清、血浆样本中特异性自身免疫抗体IgG的含量。
本试剂盒含有M、R1、R2、校准品以及配套使用样本稀释液、清洗液、底物液。M、R1、R2、校准品以及配套使用样本稀释液、清洗液具体的其中一种配比方式如表1所示。
表1dsDNA试剂组分
Figure BDA0002474707700000051
Figure BDA0002474707700000061
注：上述dsDNA试剂组分表中，将磁珠壳层聚合物加到试剂R1组分中。
磁珠壳层聚合物颗粒可以加入到R1、M、R2、样本稀释液任一一种溶液中，加入浓度5ug～50ug/mL，具有相同作用。
该试剂盒的具体检测流程如下：
将20-50uL的R1试剂组分与20-50uL的待检测样本及20-50uL的M试剂组分和磁微粒混合，在37℃的反应杯中反应10-15min；经洗涤后加入碱性磷酸酶标记的抗人IgG(100-150uL)37℃反应10-15min，形成固相抗原-抗体-酶标二抗复合物，通过洗涤，未被结合的酶标抗体以及其它物质被去除。加入化学发光底物3-(2-螺旋金刚烷)-4-甲氧基-4-(3-磷氧酰)-苯基-1,2-二氧环乙烷二钠盐(AMPPD)200uL，37℃反应5min，发光底物在碱性磷酸酶的催化下发射出光子，所产生的光子数与样本中IgG抗体的浓度成正比。
实施例2：
上述提供的该试剂盒中各试剂组分的配比方式：
①R1试剂组分：0.1M Tris(pH 7.4,含1％BSA)。
②M试剂组分：磁微粒偶联dsDNA抗原，包括生物素化抗原偶联表面含有亲和素的磁微粒、抗原直接偶联表面含有羧基、氨基、甲苯磺酰基的磁微粒。
具体方法：以生物素化抗原偶联亲和素磁珠为例
将生物素化抗原和磁微粒比例可以为1-20ug/1mg。将亲和素磁珠母液用含有1％BSA的0.01M PBS缓冲液清洗3-5次，定容到5mg/mL,将生物素化抗原加入到磁微粒溶液中，在血清混匀器中反应30min(25℃±3℃)，用0.01M PBS(含有1％BSA)清洗三次，用0.1MTris定容到磁微粒工作浓度为0.05-0.4mg/mL。
③R2试剂组分：AP-标记抗人IgG溶于0.1M Tris(pH 8.0)缓冲液中。
1％BSA，是指BSA溶液，主要由氯化钠、氯化钾、磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、BSA配置得到。在100ml溶液里溶解1g BSA。溶液包括：做ELISA用BSA包被的话，就用包被液(常用碳酸盐缓冲液)溶解，如果做IFA，WB等，用PBS或TBS溶解。
BSA：牛血清白蛋白溶液；IFA：间接免疫荧光试验；WB：蛋白质免疫印迹；TBS：TBS缓冲液是生物学中常使用的等渗缓冲盐溶液，主要用于免疫组化和原位杂交，酶联免疫等实验中，清洗免疫印迹实验中非特异性结合的抗体等。由Tris-HCl构成稳定的PH缓冲体系，NaCl提供等渗条件。索莱宝的TBS缓冲液为20×浓缩液，稀释后使用。
具体方法如下：
将抗人IgG抗体用脱盐组进行清洗三次，在经过处理后的抗体中加入SMCC/Traut’s Reagent，在血清混匀器上混匀25℃反应30-60min，反应后再用脱盐柱，清洗三次，回收抗体。将AP用脱盐柱进行清洗三次，在经过处理的AP中加入Traut’s Reagent/SMCC，在血清混匀器上混匀25℃反应30-60min，反应后在用脱盐柱，清洗三次，回收碱性磷酸酶AP。将回收抗体和碱性磷酸酶按照质量比1:1到1:3混匀反应，在血清混匀器上混匀25℃反应30-60min，加入封闭剂。用0.1M Tris(pH 8.0)缓冲液按照一定比例稀释AP-标记抗人IgG，配制为工作液。
④校准品：将质控品用0.1M Tris按照一定比例稀释。
实施例3：
如图1和图2所示，上述试剂盒中是通过设计了一种壳层聚合物颗粒1，其和磁微粒表面形成竞争作用。该壳层聚合物颗粒1和磁微粒具有相同或者相似物质。磁微粒包括壳层聚合物颗粒1、核层Fe2O3 2和磁微粒表面功能基团3。
该壳层聚合物颗粒1是去除磁微粒核层Fe2O3 2和磁微粒表面功能基团3聚合物。
如图3所示，该降低自身免疫抗体检测试剂盒在全自动仪器上对健康人样本进行检测，通过检测样本浓度值。
上述试剂是通过前期首先制备双份对照组试剂盒，之后在任意一个具有相同试剂配比及反应环境的试剂盒中加入壳层聚合物颗粒后，继续利用全自动仪器对健康人样本进行检测，进而得到如图3所示的柱状结果图。
结果分析，在试剂盒组分R1、M、R2、样本稀释液任一组分中加入壳层聚合物颗粒，能够显著降低自身抗体检测过程中样本的非特异新吸附。
上述对于全自动仪器可选全自动化学发光仪，雷杜生命科学股份有限公司型号：Lumiray 1200或Lumiray 1600，或者重庆科斯迈6500等全自动化学发光仪。对于上述全自动仪器的选取并不仅限于上述选择，凡是能够达到上述功能的均属于本发明的保护范围。
本发明提供的该降低自身免疫抗体检测试剂盒，该试剂盒包括聚合物颗粒、磁微粒偶联抗原、AP-标记抗人IgG和自身抗体IgG抗体与Tris缓冲液互溶后组合而成。该降低自身免疫抗体检测试剂盒是通过加入了聚合物颗粒与试剂盒内磁微粒对于检测目标物呈现竞争结合非特异性物质，进而减少磁微粒表面磁珠的非特异性吸附能力，显著地降低了检测试剂盒在自身免疫抗体检测过程中由于非特异性吸附性而造成的假阳概率，减弱了非特异性物质对临床样本测试结果的影响，提高了检测试剂盒的检出率、检测结果的有效性和稳定性。
尽管已用具体实施例来说明和描述了本发明，然而应意识到，本发明不局限于上述可选的实施方式，任何人在本发明的启示下都可得出其他各种形式的产品。上述具体实施方式不应理解成对本发明的保护范围的限制，本领域的普通技术人员应当理解，在不背离本发明的精神和范围的情况下，可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换，与此同时这些修改或者替换，并不会使相应的技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围；本发明的保护范围应当以权利要求书中界定的为准，并且说明书可以用于解释权利要求书。

Claims (10)

1.一种降低自身免疫抗体检测中非特异性吸附的处理方法，其特征在于，所述处理方法包括：采用含有聚合物颗粒的试剂，在检测时，所述聚合物颗粒和磁微粒与目标检测物中的蛋白非特异性竞争结合。
2.根据权利要求1所述的一种降低自身免疫抗体检测中非特异性吸附的处理方法，其特征在于，所述采用含有聚合物颗粒的试剂中，聚合物颗粒在试剂中的浓度为5-50ug/mL。
3.根据权利要求1所述的一种降低自身免疫抗体检测中非特异性吸附的处理方法，其特征在于，所述聚合物颗粒包括聚合物空心颗粒。
4.根据权利要求1所述的一种降低自身免疫抗体检测中非特异性吸附的处理方法，其特征在于，所述磁微粒包括磁核，磁核外包覆有聚合物壳层，聚合物壳层的表面设有多个表面功能基团。
5.根据权利要求4所述的一种降低自身免疫抗体检测中非特异性吸附的处理方法，其特征在于，所述磁核包括Fe3O4。
6.根据权利要求4所述的一种降低自身免疫抗体检测中非特异性吸附的处理方法，其特征在于，所述磁微粒壳层的材质与聚合物颗粒的材质相同。
7.根据权利要求6所述的一种降低自身免疫抗体检测中非特异性吸附的处理方法，其特征在于，所述聚合物颗粒的材质包括聚丙乙烯。
8.根据权利要求4所述的一种降低自身免疫抗体检测中非特异性吸附的处理方法，其特征在于，所述表面功能基团包括链霉亲和素基团、羧基基团和甲苯磺酰基团中的任意一种。
9.采用权利要求书1-8任一所述的一种降低自身免疫抗体检测中非特异性吸附的处理方法的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括下列试剂：聚合物颗粒、磁微粒偶联抗原、AP-标记抗人IgG和自身抗体IgG抗体；
优选地，所述磁微粒偶联抗原包括磁微粒偶联Sm抗原、磁微粒偶联P蛋白抗原、磁微粒偶联核小体抗原、磁微粒偶联双链DNA抗原、磁微粒偶联SSA60抗原、磁微粒偶联Jo-1抗原、磁微粒偶联Ro-52抗原、磁微粒偶联RF-IgG抗原、磁微粒偶联RF-IgM抗原、磁微粒偶联CCP抗原和磁微粒偶联RA33抗原中的一种或多种；
优选地，所述自身抗体IgG抗体包括自身抗体Anti-SmIgG抗体、自身抗体Anti-P蛋白IgG抗体、自身抗体Anti-核小体IgG抗体、自身抗体Anti-双链DNAIgG抗体、自身抗体Anti-SSA60IgG抗体、自身抗体Anti-Jo-1IgG抗体、自身抗体Anti-Ro-52IgG抗体、自身抗体Anti-RF-IgGIgG抗体、自身抗体Anti-RF-IgMIgG抗体、自身抗体Anti-CCPIgG抗体和自身抗体Anti-RA33IgG抗体中的一种或多种。
10.根据权利要求9所述的一种降低自身免疫抗体检测中非特异性吸附的处理方法的试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒中的试剂还包括缓冲液。
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