CN101121944A - 类风湿性关节炎关节滑液标志物及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种类风湿性关节炎关节滑液标志物，由肽基精氨酸脱亚胺酶4(PADI4)组成。本发明还公开了所述类风湿性关节炎关节液标志物在制备检测类风湿性关节炎的临床诊断试剂中的应用。利用本发明提出的类风湿性关节炎特异性抗原性标志物PADI4蛋白制备的类风湿性关节炎的临床诊断试剂，可为医院风湿科提供方便、快捷、灵敏的检测手段，具有极大的实用价值和广阔的推广应用前景。

Description

类风湿性关节炎关节滑液标志物及其应用

技术领域

本发明涉及一种类风湿性关节炎关节滑液，尤其是一种类风湿性关节炎关节滑液标志物及其应用。

背景技术

类风湿性关节炎(Rheumatoid arthritis，RA)是一种病因尚完全未明了的慢性系统性炎症，多发于手、腕、足等小关节，呈对称分布，反复发作。该病早期表现为关节红、肿、热、痛和功能障碍，晚期关节出现不同程度的僵硬、畸形，并伴有骨骼肌的萎缩，极易致残。在组织病理学方面，类风湿性关节炎主要发生在关节滑膜，并累及关节软骨、骨组织、关节韧带和肌腱。类风湿性关节炎是一种自身免疫疾病，临床诊断该病时通常都是检测患者血液和关节液中是否含有自身免疫抗体，包括类风湿因子，抗微丝蛋白抗体，抗角蛋白抗体，抗核周因子和抗环瓜氨酸抗体。但是，自身免疫抗体的产生往往缺乏特异性，同时灵敏性也不高，比如类风湿因子在类风湿患者中的检出率只有70％多，且类风湿因子在全身性红斑性狼疮、干燥症、硬皮症和皮肌炎等病人的血液中也普遍存在，也经常出现于其它慢性炎症病人血液中，包括慢性肝炎、肿瘤、结核病、亚急性细菌性心内膜炎等。因此，发现新的类风湿性关节炎特异性标志物尤其是抗原性标志物，对及时有效地诊断该病有重要意义。

申请人的研究以及其它许多研究都发现肽基精氨酸脱亚胺酶4(Peptidylargininedeiminase 4，PAD4或PADI4)是类风湿性关节炎的关联基因，其编码的酶在该病发病过程发挥非常重要的作用。PADI4可以在钙离子存在的情况下对其它一些蛋白进行翻译后修饰，将肽中精氨酸转化成瓜氨酸(citrulline)，此过程称之为瓜氨酸化(citrullination)。申请人以前的研究曾证实：①PADI4在类风湿性关节炎滑膜组织里大量表达，②并可能通过瓜氨酸化纤维连接蛋白和抗凝血酶刺激滑膜组织毛细血管增生和纤维蛋白大量沉淀，③瓜氨酸化纤维连接蛋白和抗凝血酶特异地存在于类风湿性关节炎患者血清中。该研究结果发表在包括《自然》、《风湿病学》等国际著名杂志上(见参考文献1-5)，瓜氨酸化抗凝血酶和瓜氨酸化纤维连接蛋白作为类风湿性关节炎抗原性标记物及其测定方法已申请日本和中国国家发明专利(见参考文献6-8)。上述发现对及时有效地诊断类风湿性关节炎具有重要意义。临床医生通过检测类风湿性关节炎患者血液中瓜氨酸化纤维连接蛋白表达水平和瓜氨酸化抗凝血酶表达，可以快速、方便地实现对类风湿性关节炎的准确诊断，同时有效地弥补了类风湿因子等自我免疫抗体疾病特异性低的缺陷。

但是，以上工作未明确表明瓜氨酸化抗凝血酶和瓜氨酸化纤维连接蛋白是否存在于类风湿性关节炎关节滑液中，而临床上为了早期诊断或明确诊断该病经常需要检测关节滑液，因此有必要建立一种利用类风湿性关节炎关节滑液实现对类风湿性关节炎快速、有效诊断的方法，在方法建立中类风湿性关节炎关节液标志物的确立是关键，鉴于我们以前已发现PADI4在类风湿性关节炎关节滑膜组织中有大量表达，是不是PADI4在该病关节滑液中也有表达？若有PADI4表达，该表达是否具有类风湿性关节炎特异性？PADI4表达又能否确立为类风湿性关节炎关节滑液标志物？经检索，还未见相关的报道。

发明内容

针对类风湿性关节炎现有常用诊断技术的不足，本发明要解决的问题是：在研究肽基精氨酸脱亚胺酶4(PADI4)对类风湿性关节炎病理作用及作用机制的基础上提出一种类风湿性关节炎关节滑液标志物及其在制备检测类风湿性关节炎的临床诊断试剂或试剂盒中的应用。

本发明所述的类风湿性关节炎关节滑液标志物，由肽基精氨酸脱亚胺酶4(Peptidylarginine deiminase 4，PAD4或PADI4)组成。

确定和支持上述类风湿性关节炎关节液标志物是肽基精氨酸脱亚胺酶4(PADI4)的实验证据：

申请人用酶联免疫吸附分析(ELISA)方法对类风湿性关节炎、骨关节炎、强直性脊柱炎和健康人关节液进行了分析。与骨关节炎、强直性脊柱炎和健康人关节液相比较，申请人发现PADI4在类风湿性关节炎关节液中表达水平明显增高，但该基因在骨关节炎和强直性脊柱炎患者关节化液中的表达与健康人的相比无显著变化(附图1)。尽管PADI4已被证明是类风湿性关节炎的关联基因并在该病滑膜组织中呈现高表达状态，但申请人发现类风湿关节炎患者、骨关节炎、强直性脊柱炎患者血清中的PADI4表达水平与健康人的表达相近(附图2)。我们也将73个类风湿性关节炎、102个骨关节炎、14个强直性脊柱炎和18个银屑病关节炎关节滑液中的PADI4表达水平与这些标本的类风湿因子表达水平进行了比较。为了加强比较结果的可靠性，我们让山东省一家大型医院的检验科利用其先进设备，按标准检查方法检测了我们提供标本的类风湿因子表达水平。我们发现PADI4只在类风湿性关节炎中特异地高水平表达，并且与其中类风湿因子的表达水平相关联(附图3)。但是，类风湿因子通常只在60％左右的类风湿性关节炎中表达，那些不表达类风湿因子的类风湿性关节炎医学上称为类风湿因子阴性类风湿性关节炎。综上所述，肽基精氨酸脱亚胺酶4(PADI4)可以确定为一种类风湿性关节炎关节化液标志物。

以上发现对临床上及时、有效地诊断类风湿性关节炎，研发该病诊断试剂具有潜在的重要意义。由于PADI4特异地存在于类风湿性关节炎关节液中，临床医生可以通过检测关节液中PADI4的表达来早期判断类风湿性关节炎发病与否。由于PADI4是一种酶蛋白而非抗体性物质，检测该抗原性标志物可以有效地避免类风湿因子等自我免疫抗体在检测时出现的特异性不高的问题。更重要的是，PADI4作为类风湿性关节炎关节化滑液标志物可以检测范围涵盖类风湿因子阴性和类风湿因子阴性的类风湿性关节炎，弥补了当前医院使用类风湿因子检测类风湿性关节炎时的局限性。

上述类风湿性关节炎关节滑液标志物在制备检测类风湿性关节炎的临床诊断试剂中的应用：

根据以上发现及抗原抗体特异性结合的原理，本领域技术人员可以制备抗肽基精氨酸脱亚胺酶4抗体，并以抗PADI4抗体为中心研发临床诊断试剂或试剂盒，建立检测肽基精氨酸脱亚胺酶4的定性或定量方法，用于诊断类风湿性关节炎。例如，以ELISA法为基础制备类风湿性关节炎检测试剂盒只需要抗PADI4抗体和ELISA平板及简单的配套试剂。所以，利用本发明提出的类风湿性关节炎特异性抗原性标志物-PADI4蛋白制备的类风湿性关节炎临床诊断试剂，可为医院风湿科提供方便、快捷、灵敏的检测手段，具有极大的实用价值和广阔的推广应用前景。当前医院检查类风湿性关节炎通常使用的类风湿因子和抗CCP均为国外生产，价格昂贵，而且中国无知识产权。

附图说明

图1.用ELISA方法检测PADI4在类风湿性关节炎、骨关节炎、强直性脊柱炎和健康人关节液中的表达水平。

ELISA实验采用兔抗PADI4多克隆抗体为第一抗体，碱性磷酸酶标记的鼠抗兔免疫球蛋白抗体为第二抗体，对硝基苯磷酸二钠盐(p-Nitrophenyl phosphate，pNpp)为显色剂，在405nm下测定吸收峰值(O.D.)，峰值代表PADI4表达水平。与骨关节炎、强直性脊柱炎和健康人关节滑液相比较，PADI4在类风湿性关节炎患者关节滑液中的表达水平明显增高。柱状图中的每个柱代表关节液中PADI4在405nm下的吸收值。

其中：■为类风湿性关节炎患者滑膜液、■为骨关节炎患者滑膜液、

强直性脊柱炎患者滑膜液、□为健康人滑膜液；X轴表示患者滑液标本，Y轴为PADI4在405纳米吸收值，表示PADI4相对表达水平。

图2.用ELISA方法检测PADI4在类风湿性关节炎、骨关节炎、强直性脊柱炎和健康人血清中的表达水平。结果表明，类风湿关节炎患者、骨关节炎、强直性脊柱炎患者血清中的PADI4表达水平与健康人的表达相近。

其中：■为类风湿性关节炎患者滑膜液、■为骨关节炎患者滑膜液、

强直性脊柱炎患者滑膜液、□为健康人滑膜液；X轴表示患者血浆标本，Y轴为PADI4在405纳米吸收值，表示PADI4相对表达水平。

图3.PADI4与类风湿因子(RF因子)在类风湿性关节炎、骨关节炎、强直性脊柱炎和银屑病关节炎关节滑液中表达。

其中：3.1-1、3.2-1、3.3-1和3.4-1分别为PADI4在类风湿性关节炎、骨关节炎、强直性脊柱炎和银屑病关节炎关节滑液中表达；3.1-2、3.2-2、3.3-2和3.4-2分别为RF在类风湿性关节炎、骨关节炎、强直性脊柱炎和银屑病关节炎关节滑液中表达。

在此实验中，PADI4在类风湿性关节炎、骨关节炎、强直性脊柱炎和银屑病关节炎关节滑液中表达的平均值分别为0.38，0.15，0.1和0.18。这样的结果表明，PADI4只在类风湿性关节炎中特异地高水平表达，而且其表达水平与其中类风湿因子的表达水平相关联。通常情况下，临床医生界定类风湿因子高于30的为类风湿因子阳性。类风湿因子通常只在60％左右的类风湿性关节炎中表达。

具体实施方式

实施例1.酶联免疫吸附实验(ELISA)测定PADI4在关节滑液中的表达

1.试剂准备

(1)0.05M碳酸盐缓冲液(Carbonate-bicarbonate buffer)包被稀释液，pH9.6：

碳酸钠(Na₂CO₃)1.59g，碳酸氢钠(NaHCO₃)2.93g，叠氮化钠(sodium azide)0.2g，加水至1000毫升，pH调至9.6。

(2)PBS缓冲液(pH7.4-7.6)：

氯化钠(NaCl)8g，无水磷酸氢二钠(Na₂HPO₄)1.15g，磷酸二氢钾(KH₂PO₄)0.2g，氯化钾(KCl)0.2g，加水至1升。

(3)封闭液：

100毫升PBS缓冲液(pH7.4)溶液加脱脂奶粉3g。

(4)PBS-Tween buffer(PBST)洗涤液，pH7.4：

以上PBS缓冲液(pH7.4)溶液1升加吐温20(Tween-20)0.5毫升，加水至1升，pH调至7.4。

2.实验按常规ELISA步骤进行，具体步骤如下：

(1)将关节滑液用包被稀释液稀释100倍，向酶标板每孔中加入稀释样品100ul。酶标板摄氏4度下放在湿盒里过夜，此步骤将关节滑液蛋白吸附在酶标板孔上。

(2)弃去样品液，向每孔中加入PBST 200ul，然后弃去PBST。同样方式洗酶标板三次。

(3)向每孔加入封闭液200ul，封闭蛋白非特异性吸附。酶标板室温下在湿盒中反应半小时。

(4)弃去封闭液，向每孔中加入PBS稀释的抗PADI4抗体100ul。酶标板室温下在湿盒中反应2小时，血液中PADI4抗原与抗PADI4抗体特异性结合。

(5)弃去第一抗体溶液，用PBST洗酶标板三次。

(6)向每孔中加入PBS稀释的碱性磷酸酶标记的抗兔IgG抗体(即抗抗体或二抗，如goatAP-conjugated anti-rabbit IgG，Sigma，A3687)100ul。酶标板室温湿盒中反应1小时。

(7)弃去抗抗体溶液，用PBST洗酶标板三次。

(8)向酶标板每孔加入显色剂对硝基苯磷酸二钠盐(如Alkaline Phosphatase YellowpNpp Liquid Substrate System for ELISA，Sigma，A3469)100ul，在摄氏37下进行发色反应。

(9)用酶标仪检测反应结果，在405nm下测定吸收值。吸收值代表血液中PADI4表达水平。

实施例2：制备ELISA(直接法)检测关节滑液PADI4试剂盒关节滑液PADI4检测试剂盒包含：

(1)酶标板(条)；

(2)0.05M碳酸盐缓冲液样本包被稀释液，pH9.6；

(3)封闭液：PBS缓冲液(pH7.4)含3％脱脂奶粉；

(4)抗PADI4抗体，抗体用辣根过氧化物酶常规标记；

(5)PBS抗体稀释液：PBS缓冲液含2％BSA；

(6)洗涤液：PBS缓冲液含0.05％Tween-20(PBST)；

(7)显色剂：0.4％四甲基联苯胺(TMB)；

(8)终止液：2％H₂SO₄；

(9)阳性和阴性对照样本，或PADI4重组蛋白做标准曲线用。

实施例3：ELISA(直接法)检测关节液PADI4试剂盒的应用

(1)取所需用量的预包被板(条)，将待检关节液用样品稀释液稀释50-100倍加入酶标板孔中每孔100ul，酶标板摄氏4度下放在湿盒里过夜。

(2)弃去样品液，向每孔加入PBST 200ul，然后弃去PBST。用洗涤液洗酶标板3次。

(3)向每孔加入封闭液200ul，酶标板室温下在湿盒中反应半小时。

(4)弃去封闭液，向每孔加入抗PADI4抗体100ul。酶标板室温下在湿盒中反应2小时。

(5)弃去第一抗体溶液，用PBST洗酶标板三次。

(6)向每孔中加入显色剂100ul，在摄氏37下进行发色反应。

(7)每孔加终止液50ul。

(8)用酶标仪检测反应结果，在450nm下测定吸收值。

(9)根据各孔吸光度值大小，与对照样本的吸光度值比较，计算结果。

实施例4：ELISA(双抗体夹心法)检测关节液PADI4

(1)包被：用0.05M pH9.6碳酸盐包被缓冲液将抗PADI4单克隆抗体稀释至蛋白质含量为1～10μg/ml。在每个聚苯乙烯酶标板的反应孔中加100ul，4℃过夜。

(2)弃去孔内溶液，用PBST洗涤缓冲液洗3次。

(3)加PBS稀释50-100倍的待检关节液样本100ul于上述已包被酶标板的反应孔中。置酶标板于37℃孵育1小时。同时做空白孔，阴性对照孔及阳性对照孔。

(4)弃去孔内溶液，用PBST洗涤缓冲液洗3次。

(5)加100ul酶标兔抗PADI4抗体于各反应孔中。用辣根过氧化物酶常规标记兔抗PADI4抗体。酶标板于37℃孵育0.5～1小时。

(6)弃去孔内溶液，用PBST洗涤缓冲液洗3次。

(7)加100ul底物液显色TMB溶液于各反应孔中，发色反应37℃下进行10～30分钟。

(8)于各反应孔中加50ul 2M硫酸终止发色反应。

(8)用酶标仪检测反应结果，在450nm下测定吸收值。

(9)根据各孔吸光度值大小，与对照样本吸光度值比较，计算结果。

实施例5：检测PADI4金标试纸的制备及金标法快速检测关节液中PADI4表达水平金标试纸采用双抗原夹心法免疫测定原理。

制备时可以先将胶体金与抗PADI4单克隆抗体结合，同时将兔抗PADI4抗体和羊抗鼠IgG抗体分别点样于硝酸纤维素膜检测区和质控区。

当待检关节液标本中含有PADI4蛋白时，金标记抗体与PADI4抗原抗体结合，形成金标-抗体-抗原-复合物。由于层析作用，反应复合物沿硝酸纤维膜向前移动。当遇到兔抗PADI4抗体时，形成金标抗PADI4单克隆抗体-PADI4抗原-兔抗PADI4多克隆抗体复合物，产生红色金颗粒沉淀线。在检测时，将制备好的样本滴入试纸样品检测端，样本向检测区及质控区移动。如果样本中含PADI4，它就会和金标抗体组成抗原抗体复合物形成紫红色的色带。如果样本中无PADI4抗原，检测区中就不会有色带出现。在任何情况下，质控区都应出现色带。

本发明背景技术中引用参考文献目录：

1.Suzuki A，Yamada R，Chang X，ect.Functional haplotypes of PADI4，encodingcitrullinating enzyme peptidylarginine deiminase 4，are associated withrheumatoid arthritis.Nat.Genet.2003；34：395-402.

2.Chang X，Yamada R，Suzuki A，Sawada T，Yoshino S，Tokuhiro S，Yamamoto K.Localization of peptidylarginine deiminase 4(PADI4)and citrullinatedprotein in synovial tissue of rheumatoid arthritis.Rheumatology(Oxford)2005；44：40-50.

3.Chang X，Yamada R，Sawada T，Suzuki A，Kochi，O and Yamamoto K.2005.Citrullination of fibronectin in synovial tissue of rheumatoid arthritis.Rheumatology(Oxford).2005；44：1374-1382.

4.Chang X，Yamada R，Sawada T，Suzuki A，Kochi Y，Yamamoto K.The inhibitionof antithrombin by peptidylarginine deiminase 4 may contribute topathogenesis of rheumatoid arthritis.Rheumatology(Oxford)2005；44：293-298.

5.Chang X，Yamada R，Yamamoto K.Inhibition of antithrombin by hyaluronic acidmay be involved in the pathogenesis of rheumatoid arthritis.Arthritis ResTher.2005；7：R268-273.

6.リウマチにぉけゐアンチスロンビン3のシトルリン化亢進とシトルリン化にゐアンチスロンビン3活性の抑制(类风湿性关节炎病人血浆中含高浓度的瓜氨酸化抗凝血酶).

发明人：常晓天、山田亮、山本一彦、鈴木亜香里.

专利授权国：日本

专利号：2004-325252.

专利公布日期：2005年7月

7.瓜氨酸化纤维连接蛋白的检测方法和相关试剂盒

发明人：常晓天、朱有名、韩金祥.

专利授权国：中国.

专利申请号：200510044080.1.

8.类风湿关节炎特异性抗原性标记物及其应用

发明人：常晓天、朱有名、韩金祥.

专利授权国：中国.

专利申请号：200510044046.4.

Claims (4)

1.一种类风湿性关节炎关节滑液标志物，由肽基精氨酸脱亚胺酶4组成。

2.权利要求1所述类风湿性关节炎关节滑液标志物在制备检测类风湿性关节炎的临床诊断试剂中的应用。

3.如权利要求2所述类风湿性关节炎关节滑液标志物的应用，其特征是，以常规方法制备抗肽基精氨酸脱亚胺酶4抗体，建立检测肽基精氨酸脱亚胺酶4的定性或定量方法。

4.如权利要求3所述类风湿性关节炎关节滑液标志物的应用，其特征是，以抗肽基精氨酸脱亚胺酶4抗体为中心，以常规方法制备临床诊断试剂或试剂盒。

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